CN102242165A

CN102242165A - 一种发酵生产高分子量透明质酸钠的方法及其所用的培养基

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Publication number: CN102242165A
Application number: CN2011101379859A
Authority: CN
Inventors: 荣绍丰; 管世敏; 侯永泰; 陈奕涵; 丁保妹
Original assignee: Shanghai Institute of Technology
Current assignee: Shanghai Haohai Biological Technology Co., Ltd.; Shanghai Institute of Technology
Priority date: 2011-05-26
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2011-11-16

Abstract

本发明公开了一种利用氨基酸复合液作为氮源发酵生产高分子量透明质酸钠的新方法。本发明所提供的生产高分子量透明质酸钠的方法是利用氨基酸复合液代替酵母膏或酵母粉作为兽疫链球菌的发酵氮源。通过发酵过程控制，得到分子量为2.2×10⁶D的HA-Na。将本发明应用到工业生产中，一方面可有效降低发酵液中杂蛋白和色素的含量，减少后期HA-Na提取的工序，降低对发酵液中HA-Na的分子量在提取过程中的物化损伤；另一方面可降低HA-Na生产成本，具有较高工业应用价值。通过此方法生产的HA-Na的分子量为2.0～2.2×10⁶D，糖醛酸含量为42.4～43.5%，特性粘度为3064～3115，蛋白含量<0.1%。

Description

一种发酵生产高分子量透明质酸钠的方法及其所用的培养基

技术领域

本发明涉及一种发酵生产高分子量透明质酸钠的方法及其所用的培养基。即利用复合氨基酸液为氮源的发酵培养基发酵生产高分子量透明质酸钠的方法。

背景技术

透明质酸（Hyaluronic acid，Hyaluronan，以下简称HA），又名玻璃酸，是由β-1,3和β-1,4糖苷键连接的（1→3）-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-葡萄糖（1→4）-O-β-D-葡萄糖醛酸双糖重复单位组成，其广泛存在于生物体的结缔组织中。在不同组织中HA的生理作用有所不同，如在皮肤中表现为保水作用；在关节滑液中主要为润滑作用；在血管壁中主要是调节通透性。另外，HA作为聚阴离子电解质，分子上所带的大量负电荷，可调节周围正负离子的浓度，抑制多种酶的活性，广泛应用于眼科粘性手术。治疗关节病、软组织修复和作为药物载体等，特别是在预防和减少外科手术后组织粘连中取得较大的进展。

目前，生产HA的方法主要有动物源组织提取法（如从鸡冠中提取）和微生物发酵法。但动物源生化产品在对人进行治疗时，可能产生跨种间毒菌交叉感染（cross-species viral infection）和其它风险性感染。目前发酵法制备的HA开始替代提取法生产的HA成为趋势。采用微生物发酵法生产透明质酸，大大拓展了HA的来源，推动了研究和应用。微生物发酵生产HA不仅降低了HA的生产成本，而且具有较高的质量和良好的品质。但微生物发酵法制备透明质酸也存在很多问题，工业上往往采用成分复杂的酵母粉或酵母膏作为培养基氮源，其成分复杂、杂质蛋白质含量较高。这为后期HA的提取纯化造成较大困难。工业生产中一般要通过繁琐、多种、多次的提取手段来对发酵液中的HA进行纯化。而在复杂的提取工艺中，HA分子会受到各种物化手段的影响，分子量受到很大程度的损失，直接影响HA的产量、质量和生产成本。

本发明在现有发酵工艺的基础上对发酵培养基成分进行了改进，用复合氨基酸液代替传统氮源酵母膏，从根源上降低了培养基中蛋白质和色素的含量，使后期对透明质酸发酵液中蛋白质和色素的去除工艺得到简化，较好地减少了提取过程中物化因素对透明质酸分子量的损伤,从而获得了分子量较高，产品品质较佳的HA-Na产品。

发明内容

本发明的目的之一是为了解决上述的问题而提出一种高分子量透明质酸钠。

本发明的目的之二是提供一种上述的高分子量透明质酸钠的发酵生产方法。

本发明的目的之三是提供一种上述的高分子量透明质酸钠的发酵生产方法中所用的发酵培养基。

本发明的技术方案

本发明采用复合氨基酸液培养基对兽疫链球菌进行发酵，之后通过酸法灭酶、离心去除菌体，活性炭吸附后硅藻土过滤去除杂蛋白和色素等手段对发酵液中HA-Na进行提纯，再通过95%乙醇沉淀、无水乙醇脱水干燥，制得成品HA-Na。经测定，成品分子量为2.0～2.2×10⁶D，糖醛酸含量为42.4～43.5%，特性粘度为3064～3115，蛋白含量<0.1%分子量。

上述的采用复合氨基酸液培养基对兽疫链球菌进行发酵生产透明质酸钠的方法，包括如下步骤：

1）、菌种

菌名：Streptococcus zooepidemicus ；购自ATCC（美国典型微生物菌种保藏中心）编号：35247；

2）、培养基成分配制如下：（注：以下培养基用水均为注射用水）

Ⅰ 菌种斜面培养基：（g/L）

酵母粉：5～15；葡萄糖：0.5～2；MgSO₄·7H₂O 1～3；琼脂 20

用10%NaOH溶液调节pH值至7.0于121℃灭菌15min；

Ⅱ 种子液培养基：

H组分：葡萄糖5～20g，MgSO₄·7H₂O 1～5g加50mL水溶解，121℃灭菌15min；

G组分：在500mL三角烧瓶中加酵母粉1～4g，KH₂PO₄ 0.1～0.8g，Na₂HPO₄ 0.04～0.3g，NaH₂PO₄ 0..02～0.2g，NaHCO₃ 0.02～0.1g，CaCO₃ 1～3g,生长液0.05～0.4mL加90mL水溶解，用10%NaOH溶液调节 pH值至7.0，121℃灭菌15min，备用；

接种前将H组分无菌分装于G组分中，各分装10mL；

所述的生长液配方（g/L）

NaCl 1.5～3 ；

CaCl₂ 0.02～0.06 ；

MnSO₄·H₂O 0.01～0.04；

NaH₂CO₃ 5～20；

CuSO₄·5H₂O 0.01～0.025；

Na₂HPO₄·12H₂O 16～36 ；

NaH₂PO₄·12H₂O 10～25；

Ⅲ 发酵培养基：

每升发酵液各组分的体积含量如下：

A组分 300mL

B组分 20ml

C组分 1～4mL

D组分 150mL

E组分 50mL

余量为水；

A组分：蔗糖50～85g，MgSO₄·7H₂O 2.0g，K₂SO₄ 0.3～1g，NaH₂PO₄ 1～2g，于300mL注射用水中溶解；

B组分：氨基酸复合液配方：（g/L）

丙氨酸 2.4～4.4

精氨酸 1.5～2.5

天冬氨酸 3.5～4.5

胱氨酸 0.35～0.55

谷氨酸 0.57～0.77

甘氨酸 1.3～3.3

组氨酸 0.7～1.7

异亮氨酸 1.3～3.3

酪氨酸 1.0～3.6

亮氨酸 1.5～4.5

赖氨酸 2.0～4.5

甲硫氨酸 0.2～1.3

苯丙氨酸 1.0～2.5

脯氨酸 1.0～2.5

苏氨酸 1.0～3.0

色氨酸 0.1～1.5

缬氨酸 1.0～3.5

丝氨酸 1.5～3.5

谷氨酰胺 0.3～1

尿嘧啶 0.2～1

天冬氨酸 0.2～1

C组分：生长液配方（g/L）

NaCl 1.5～3 ；

CaCl₂ 0.02～0.06 ；

MnSO₄·H₂O 0.01～0.04；

NaH₂CO₃ 5～20；

CuSO₄·5H₂O 0.01～0.025；

Na₂HPO₄·12H₂O 16～36 ；

NaH₂PO₄·12H₂O 10～25；

D组分：蔗糖10～30g加150mL水溶解

E组分：L-精氨酸盐酸盐0.05～0.2g加50mL水溶解，121℃灭菌15min。

将溶液A组分、C组分、D组分、E组分分别灭菌,B组分用0.22um无菌滤膜过滤除菌，后将各组分以无菌方式加入到发酵罐中，不足体积用注射用水补充。

3）、种子培养

所用的培养基为步骤（1）所述的斜面种子培养基，将保存-86℃的冰箱内的兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）的甘油管经梯度解冻，于无菌操作下挑取适量接种于斜面培养基上，37℃培养16h，最终得到斜面菌种兽疫链球菌；

将上述所得的斜面菌种兽疫链球菌挑取4～10环接种于步骤（1）所述的种子培养基中，30～40℃培养10-18h，转速为150～250rpm，得发酵用的种子液；

4）、发酵培养

将步骤（2）所得的发酵用种子液按5%～20%的量接种于步骤（1）所述的发酵培养基中进行发酵，发酵过程温度控制为30～40℃，用步骤（1）的发酵培养基中的F组分调节控制pH值为6.5～7.5，同时控制空气流量7L/min，转速为150～400rpm，发酵时间为20～40h；

发酵过程，约培养时间为16h时，用步骤（1）的发酵培养基中的D组分进行补料，补料方式为批补；

5）、分离提取透明质酸钠

取步骤（3）所得的发酵液，用浓度为50%的三氯乙酸调节pH为4.0～6.0，维持0.5～3h，后用浓度为10%的氢氧化钠溶液回调至ph5.0～7.0后于3000～6000r/min冷冻离心5～20min，收集上清液；

在上述上清液中加入1～5%的活性碳，震摇0.5～3h，除色素、杂蛋白后的上清液再用珍珠岩或硅藻土做助滤剂，用孔径为1.5～10μm的滤布进行抽滤，收集滤液；

所得的滤液加1～5倍95%的乙醇醇沉，收集沉淀，所得沉淀再用无水乙醇脱水处理1～3次，丙酮脱水1～3次，真空干燥，最终得透明质酸钠。

本发明的有益效果

本发明采用复合氨基酸液代替传统酵母粉或酵母膏作为发酵培养基的氮源，可有效降低培养基中蛋白质的含量，也减少了酵母粉或酵母膏自身及灭菌过程中产生的色素，同时减少了后期对发酵液中HA-Na提取纯化的工艺步骤，有效防止了HA-Na在提取过程中的产量和分子量的损失，并且有效地降低了工业生产中后期提取阶段的成本，最终得到的HA-Na的分子量为2.0～2.2×10⁶D，糖醛酸含量为42.4～43.5%，特性粘度为3064～3115，蛋白含量<0.1%分子量。

另外，此方法不仅在实验室中可以方便实施，而且由于其不需高要求的提取手段（如超滤），极易在工业上推广应用。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。

本发明的HA-Na产品的各指标的检测方法包括：糖醛酸含量测定、蛋白质含量测定、粘度测定、乙醇残留量测定等均参照国家医用透明质酸钠凝胶规定的标准执行，标准编号为：YY0308-2004；

本发明检测所用主要的仪器

紫外可见分光光度计 UV2100 上海尤尼柯科技有限公司

乌式粘度计 0.56mm 江苏海门玻璃仪器厂

恒温搅拌水浴锅 76-1 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂

气相色谱仪 AGLIENT 5890A

本发明所用的原料、试剂均采购于中国医药集团上海化学试剂有限公司。

实施例1

采用本发明的复合氨基酸液培养基500mL摇瓶进行发酵生产HA-Na：

培养基中氨基酸复合液配比为(g/L)

丙氨酸 3.4 精氨酸 2.0 天冬氨酸 4.0

胱氨酸 4.0 谷氨酸 0.4 甘氨酸 0.6

组氨酸 1.1 异亮氨酸 2.1 酪氨酸 2.2

亮氨酸 3.1 赖氨酸 3.2 甲硫氨酸 1.0

苯丙氨酸 1.8 脯氨酸 1.5 苏氨酸 2.0

色氨酸 0.8 缬氨酸 1.7 丝氨酸 2.1

谷氨酰胺 0.7 尿嘧啶 0.6 天冬氨酸 0.8

将保存-86℃的冰箱内的兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）的甘油管经梯度解冻，于无菌操作下挑取适量接种于斜面培养基上，37℃培养16h，最终得到斜面菌种兽疫链球菌；

将斜面菌种接种于种子培养基中，于35℃、300rpm培养10h后按接种量20%，接种于500ml三角摇瓶发酵培养基中，设置转速为350rpm，控制pH值在6.8～7.3之间，发酵时间达到30h，终止发酵。

将上述的500ml三角瓶的最终发酵液用50%三氯乙酸调整pH值至4.0，维持2h，后回调至7.5；将发酵液以4000rpm离心20min，取上清液；

在上清液中加入2%活性炭于低温下震摇2h，硅藻土抽滤，取滤液并向滤液中加入3倍体积95%乙醇沉淀HA-Na并收集；后无水乙醇浸泡HA-Na30min，再用无水丙酮浸泡HA-Na30min，后真空干燥12h，干燥后即为HA-Na产品。将所得到的HA-Na产品进行检查，其检测结果见下表。

实施例2

培养基中氨基酸复合液配比为(g/L):

丙氨酸 2.4 精氨酸 1.5 天冬氨酸 3.5

胱氨酸 0.35 谷氨酸 0.57 甘氨酸 1.3

组氨酸 0.7 异亮氨酸 1.3 酪氨酸 1.0

亮氨酸 1.5 赖氨酸 2.0 甲硫氨酸 0.2

苯丙氨酸 1.0 脯氨酸 1.0 苏氨酸 1.0

色氨酸 0.1 缬氨酸 1.0 丝氨酸 1.5

谷氨酰胺 0.3 尿嘧啶 0.2 天冬氨酸 0.2

培养及提取方法均与实施例1相同，对所得到HA-Na产品进行质量检测，结果见下表1。

实施例3

发酵培养基中氨基酸复合液配比为(g/L):

丙氨酸 4.4 精氨酸 2.5 天冬氨酸 4.5

胱氨酸 0.55 谷氨酸 0.77 甘氨酸 3.3

组氨酸 1.7 异亮氨酸 3.3 酪氨酸 3.6

亮氨酸 4.5 赖氨酸 4.5 甲硫氨酸 1.3

苯丙氨酸 2.5 脯氨酸 2.5 苏氨酸 3.0

色氨酸 1.5 缬氨酸 3.5 丝氨酸 3.5

谷氨酰胺 1.0 尿嘧啶 1.0 天冬氨酸 1.0

对照实施例1

采用传统发酵培养基500mL摇瓶进行发酵生产HA-Na：

培养方法与实施例1相同，不同之处在于发酵培养基中B组分氮源采用传统的氮源酵母膏。后期对发酵液的处理，在醇沉前将发酵液过陶瓷超滤膜（截留范围1×10⁵D），后向滤液中加入3倍体积95%乙醇沉淀HA-Na并收集；后无水乙醇浸泡HA-Na30min，再用无水丙酮浸泡HA-Na30min，后真空干燥12h，干燥后即为HA-Na成品，对所得到HA-Na产品进行质量检测，结果见下表1。

表1 透明质酸钠质量表

项目	实施例1	实施例2	实施例3	对照例1
					pH值	6.8	6.9	6.9	6.7
糖醛酸含量（%）	42.4%	43.5%	43%	41%
					特性粘度	3064.4	3115.4	3094.4	2390.4
蛋白含量（%）	<0.1%	<0.1%	<0.1%	<0.4%
					0.1%透光率（%）	98.9%	99.2%	99.4%	98.3%
重金属含量	<10ug/g	<10ug/g	<10ug/g	<10ug/g
					细菌内毒素含量	<0.05EU/mg	<0.05EU/mg	<0.05EU/mg	<0.05EU/mg
无菌检测	合格	合格	合格	合格
					乙醇残留	<400ug/g	<400ug/g	<400ug/g	<400ug/g
分子量	2.08×10⁶D	2.13×10⁶D	2.1×10⁶D	1.5×10⁶D

由对照实施例1与实施例1~3所得的HA-Na成品的检测结果对比可以看出，通过本发明工艺条件所得的HA-Na产品分子量更高，产品质量更好，且提取工艺更为简单，可有效降低生产成本。

实施例4

采用本发明的复合氨基酸液培养基5L发酵罐上进行发酵生产HA-Na：

将斜面菌种接种于种子培养基中，于35℃、300rpm培养10h，按接种量20%，接种于5L发酵罐中，控制pH值在6.8～7.3之间，通气量7L/min，发酵期间视培养基的粘稠度调整转速，控制范围为200rpm～500rpm；且在发酵期间，培养时间约16h时，批补加糖液100ml；发酵时间达到28h，终止发酵；提取方法与实施例1相同，最终得HA-Na成品26g，该产品经检测，HA分子量为2.2×10⁶D，蛋白含量为0.08%，醛酸含量43.6%、特性粘度为3180.4。

实施例5

采用本发明的复合氨基酸液培养基100L发酵罐上进行发酵生产HA-Na：

将斜面菌种接种于20L种子罐中，于35℃、200rpm培养10h，按接种量15%，接种于100L发酵罐中，控制pH值在6.8～7.3之间，通气量105L/min，发酵期间视培养基的粘稠度调整转速，控制范围为100rpm～400rpm，且在发酵期间，培养时间约16h时，补加糖液2L；发酵时间达到26h，终止发酵；提取方法与案例1相同，最终得HA-Na420g，该产品经检测，HA分子量为2.16×10⁶D，蛋白含量为0.07%，醛酸含量43%、特性粘度为3150.7。

通过上面的实施例1的摇瓶发酵，实施例2的5L发酵罐发酵，实施例3的100L发酵罐发酵所得的HA-Na产品的检测结果可以看出，本法发明的用于生产高分子量透明质酸钠的方法的发酵与提取工艺简单，生产周期短，可控制在30h以内，产品分子量较高，产品品质较高，满足医用级透明质酸钠要求，因此极易在工业上推广应用。

以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所做的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）发酵生产透明质酸钠所用的发酵培养基，包括A组分、C组分、D组分和E组分，其特征在于还包括B组分，其中每升发酵液含各组分的体积含量如下：

A组分 300mL

B组分 20ml

C组分 1～4mL

D组分 150mL

E组分 50mL

余量为水；

A组分：蔗糖50～85g，MgSO₄·7H₂O 2.0g，K₂SO₄ 0.3～1g，NaH₂PO₄ 1～2g，用300mL注射用水溶解；

B组分：氨基酸复合液配方（g/L）：以下成分均用注射用水溶解

丙氨酸 2.4～4.4

精氨酸 1.5～2.5

天冬氨酸 3.5～4.5

胱氨酸 0.35～0.55

谷氨酸 0.57～0.77

甘氨酸 1.3～3.3

组氨酸 0.7～1.7

异亮氨酸 1.3～3.3

酪氨酸 1.0～3.6

亮氨酸 1.5～4.5

赖氨酸 2.0～4.5

甲硫氨酸 0.2～1.3

苯丙氨酸 1.0～2.5

脯氨酸 1.0～2.5

苏氨酸 1.0～3.0

色氨酸 0.1～1.5

缬氨酸 1.0～3.5

丝氨酸 1.5～3.5

谷氨酰胺 0.3～1

尿嘧啶 0.2～1

天冬氨酸 0.2～1

C组分：生长液配方（g/L）：以下成分均用注射用水溶解；

NaCl 1.5～3 ；

CaCl₂ 0.02～0.06 ；

MnSO₄·H₂O 0.01～0.04；

NaH₂CO₃ 5～20；

CuSO₄·5H₂O 0.01～0.025；

Na₂HPO₄·12H₂O 16～36 ；

NaH₂PO₄·12H₂O 10～25；

D组分：蔗糖10～30g加150mL注射用水溶解；

E组分：L-精氨酸盐酸盐0.05～0.2g加50mL注射用水溶解。

2.利用如权利要求1所述的培养基进行发酵生产透明质酸钠的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）、培养基成分配制（注：以下培养基用水均为注射用水）

①、菌种斜面培养基：（g/L）

酵母粉 5～15

葡萄糖 0.5～2

MgSO₄·7H₂O 1～3

琼脂 20

用10% NaOH溶液调节pH值至7.0于121℃灭菌15min；

②、种子液培养基：

H组分：蔗糖5～20g，MgSO₄·7H₂O 1～5g加50mL水溶解，121℃灭菌15min；

接种前将H组分无菌分装于G组分中，各分装10mL；

所述的生长液配方（g/L）

NaCl 1.5～3 ；

CaCl₂ 0.02～0.06 ；

MnSO₄·H₂O 0.01～0.04；

NaH₂CO₃ 5～20；

CuSO₄·5H₂O 0.01～0.025；

Na₂HPO₄·12H₂O 16～36 ；

NaH₂PO₄·12H₂O 10～25；

③、发酵培养基：

每升发酵液含各组分的体积含量如下：

A组分 300mL

B组分 20mL

C组分 1～4mL

D组分 150mL

E组分 50mL

A组分:蔗糖50～85g，MgSO₄·7H₂O 2.0g，K₂SO₄ 0.3～1g，NaH₂PO₄ 1～2g，于300mL注射用水中溶解；

B组分:氨基酸复合液配方：（g/L）

丙氨酸 2.4～4.4

精氨酸 1.5～2.5

天冬氨酸 3.5～4.5

胱氨酸 0.35～0.55

谷氨酸 0.57～0.77

甘氨酸 1.3～3.3

组氨酸 0.7～1.7

异亮氨酸 1.3～3.3

酪氨酸 1.0～3.6

亮氨酸 1.5～4.5

赖氨酸 2.0～4.5

甲硫氨酸 0.2～1.3

苯丙氨酸 1.0～2.5

脯氨酸 1.0～2.5

苏氨酸 1.0～3.0

色氨酸 0.1～1.5

缬氨酸 1.0～3.5

丝氨酸 1.5～3.5

谷氨酰胺 0.3～1

尿嘧啶 0.2～1

天冬氨酸 0.2～1

C组分: 生长液配方（g/L）

NaCl 1.5～3 ；

CaCl₂ 0.02～0.06 ；

MnSO₄·H₂O 0.01～0.04；

NaH₂CO₃ 5～20；

CuSO₄·5H₂O 0.01～0.025；

Na₂HPO₄·12H₂O 16～36 ；

NaH₂PO₄·12H₂O 10～25；

D组分: 蔗糖10～30g加150mL水溶解

E组分: L-精氨酸盐酸盐0.05～0.2g加50mL水溶解，121℃灭菌15min

将溶液A组分、C组分、D组分、E组分分别灭菌,B组分用0.22um无菌滤膜过滤除菌，后将各组分以无菌方式加入到发酵罐中，不足体积用注射用水补充；

（2）、种子培养

斜面种子培养：所用的培养基为步骤（1）所述的斜面种子培养基，将保存-86℃的冰箱内的兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）的甘油管经梯度解冻，于无菌操作下挑取适量接种于斜面培养基上，37℃培养16h，最终得到斜面菌种兽疫链球菌；

（3）、发酵培养

（4）、分离提取透明质酸钠

取步骤（3）所得的发酵液，用浓度为50%的三氯乙酸调节pH为4.0～6.0，维持0.5～3h，后用浓度为10%的氢氧化钠溶液回调至ph5.0～7.0后于3000～6000r/min冷冻离心5～20min，收集上清液；再从上清液中提取透明质酸钠。

3.如权利要求2所述的发酵生产透明质酸钠的方法，其特征在于步骤（3）所述的发酵培养透明质酸钠的过程中，控制温度为30～40℃，pH值为6.5～7.5，空气流量为5～7L/min，转速为150～400rpm，发酵时间为20～40h。

4.如权利要求3所述的发酵生产透明质酸钠的方法，其特征在于步骤（3）所述的发酵培养透明质酸钠的过程中用NaOH水溶液调节控制pH值。

5.如权利要求4所述的发酵生产透明质酸钠的方法，其特征在于步骤（3）所述的发酵培养透明质酸钠的过程中优选用5mol/LNaOH水溶液调节控制pH值。

6.如权利要求2所述的发酵生产透明质酸钠的方法，其特征在于发酵过程，约培养时间为16h时，用步骤（1）的发酵培养基中的D组分进行补料，补料方式为批补。

7.如权利要求2所述的发酵生产透明质酸钠的方法，其特征在于步骤（4）所述的从上清液中提取透明质酸钠的过程如下：

向上清液中加入占其质量1～5%的活性碳，震摇0.5～3h，除色素、杂蛋白，再用珍珠岩或硅藻土做助滤剂，用孔径为1.5～10μm的滤布进行抽滤，收集滤液；

向所得的滤液中加1～5倍95%的乙醇醇沉，收集沉淀，沉淀用无水乙醇脱水处理1～3次，再用丙酮脱水1～3次，真空干燥，即得透明质酸钠产品。

8.如权利要求7所述的发酵生产透明质酸钠的方法，其特征在于所述的从上清液中提取透明质酸钠的过程的真空干燥，过程控制压力为-0.1MPa，温度为室温。

9.如权利要求2～8任一权利要求所述的发酵生产透明质酸钠的方法所得的透明质酸钠，其特征在于其分子量为2.0～2.2×10⁶D，糖醛酸含量为42.4～43.5%，特性粘度为3064～3115，蛋白含量<0.1%。