CN107653280A - 透明质酸发酵用的组合物、培养基和方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵领域,具体涉及一种透明质酸发酵用的组合物、培养基和方法及其应用。其中所述组合物包括N‑乙酰葡糖胺和天冬氨酸,还含有尿嘧啶及其衍生物中的一种或几种。所述培养基中添加N‑乙酰葡糖胺和天冬氨酸,还包括尿嘧啶及其衍生物中的一种或几种。本发明通过向培养基中补充HA合成的前体物质,可以有效的缓解HA合成过程中,由于竞争性前体物质缺乏导致的HA合成乏力的问题。而且研究结果表明,通过添加以上前体物质,HA产率可提高10%‑40%。解决了在发酵过程中,透明质酸产率低的问题。而且将成本控制在合理的范围内,为生产企业创造直接的生产效益。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域,具体涉及一种透明质酸发酵用的组合物、培养基和方法及其应用。
背景技术
透明质酸,即玻尿酸,简称HA,是一种酸性粘多糖,分子结构由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸两个单糖反复交替连接而成,被广泛应用于食品行业、化妆品行业、医药相关领域等。
目前工业上主要以微生物发酵法生产透明质酸,生产菌株为兽疫链球菌。兽疫链球菌是一种对营养苛刻的乳酸链球菌,其为某些氨基酸的营养缺陷型细菌,包括赖氨酸、谷氨酸、精氨酸、半胱氨酸等,另外对于自身代谢的一些基本营养物质,也不能充足供给。由于兽疫链球菌缺乏完整的三羧酸循环和电子传递链,细胞仅限于底物水平磷酸化(乳酸合成途径和乙酸合成途径),HA合成的能量供给受到限制。工业上,以兽疫链球菌为菌种生产透明质酸的培养基配方中,碳源主要以葡萄糖为主,为HA的合成提供碳骨架和能量,氮源主为谷氨酸,酵母浸粉和蛋白胨。其中,酵母浸粉为兽疫链球菌提供包括维生素,碱基的各种生长因子,以及主要的游离氨基酸;蛋白胨作为更为迟效的氮源,在发酵中后期,在蛋白酶的作用下,缓释氨基酸。
兽疫链球菌合成HA的途径,如图1所示,兽疫链球菌以葡萄糖为底物,分别以磷酸葡萄糖变异酶和磷酸葡萄糖异构酶的作用下,通过多步反应,生成两个HA的直接前体物质,尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖醛酸)和尿苷二磷酸-N-酰基-葡糖胺(UDP-N-酰基-葡糖胺)。研究结果表明,UDP-N-乙酰葡糖胺是决定HA分子量的关键前体物质。其中,UDP可被循环利用,同时参与了UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-酰基-氨基葡萄糖合成,而N-乙酰葡糖胺同时参与了细胞壁的合成。
在生物体中,嘧啶核苷酸的嘧啶环是由氨甲酰磷酸和天冬氨酸合成的,其它嘧啶核苷酸则由尿嘧啶核苷酸转化而成,这可能是发酵过程中,天冬氨酸快速被消耗的原因。当嘧啶核苷酸直接的合成原料,如天冬氨酸,被消耗后,外界的嘧啶及其衍生物可作为补救途径,参与到嘧啶核苷酸,及其它核苷酸的合成中。
中国发明专利CN102021213A公开了一种发酵生产透明质酸发酵液的方法,为了解决兽疫链球菌生产透明质酸过程中由于营养物质缺乏或各种营养物质之间调配不当而引起的透明质酸产量及质量下降的问题,发明人采用了向培养基中添加了微量元素液(氯化钙、氯化锌、硫酸锰、硫酸铜),以及用注射用水配制种子培养基和发酵培养基。该发明主要是从发酵培养基微量元素的角度进行优化,微量元素对透明质酸的合成有一定的促进作用,但并不是提高透明质酸产量的最关键因素。
中国专利申请CN103397062A中公开了一种提高透明质酸发酵产率的方法,发明人通过向发酵培养基中添加含有亚铁离子和铜离子的试剂,使透明质酸的发酵产率由1.05g/L提高到1.37-1.41g/L。该发明通过添加硫酸亚铁铵和硫酸铜铵,提高了电子传递链的效率,进而提高氧化磷酸化水平,满足透明质酸合成过程中对能量的需求。虽然该发明对透明质酸产量的提高有一定效果,但效果有限。
发明内容
本发明所解决的现有技术的问题是:现有的发酵生产透明质酸的培养基或者发酵方法,对于提高透明质酸产量的效果并不显著,而且成本较高。
为了解决上述问题,本发明人在锐意研究之后发现,通过在发酵培养基中添加透明质酸合成的竞争性前体物质,包括天冬氨酸和N-乙酰葡糖胺,同时还包括尿嘧啶、尿苷或者尿苷酸中的一种或几种,通过透明质酸合成前体物质各组分之间的复配和协同作用,可以显著提高发酵液中透明质酸的产量。
具体而言,本发明提供了如下技术方案:
一方面,本发明提供了一种透明质酸发酵用的组合物,所述组合物包括N-乙酰葡糖胺和天冬氨酸,还含有尿嘧啶及其衍生物中的一种或几种。
优选的,所述尿嘧啶及其衍生物包括尿嘧啶和尿嘧啶衍生物,尿嘧啶衍生物包括尿苷和/或尿苷酸。
优选的,所述尿苷酸包括尿苷一磷酸、尿苷二磷酸和尿苷三磷酸。
优选的,按重量份计,
所述N-乙酰葡糖胺为0.02-2重量份;
天冬氨酸为0.1-5重量份;
尿嘧啶及其衍生物为0.01-2.5重量份。
优选的,按重量份计,
所述N-乙酰葡糖胺为0.5-1重量份;
天冬氨酸为1-3重量份;
尿嘧啶及其衍生物为0.5-2重量份。
另一方面,本发明提供了一种透明质酸发酵用的培养基,所述培养基中添加N-乙酰葡糖胺和天冬氨酸,还包括尿嘧啶及其衍生物中的一种或几种。
优选的,所述尿嘧啶及其衍生物包括尿嘧啶和尿嘧啶衍生物,尿嘧啶衍生物包括尿苷和/或尿苷酸。
优选的,所述N-乙酰葡糖胺的浓度为0.02-2g/L;
天冬氨酸的浓度为0.1-5g/L;
尿嘧啶及其衍生物的浓度为0.01-2.5g/L。
优选的,所述N-乙酰葡糖胺的浓度为0.5-1g/L;
天冬氨酸的浓度为1-3g/L;
尿嘧啶及其衍生物的浓度为0.5-2g/L。
本发明还提供了一种发酵生产透明质酸的方法,包括如下步骤:
(1)菌种活化:将菌种接种于斜面培养基进行活化;
(2)种子培养:将菌种接种于种子培养基中培养,得到种子培养液;
(3)发酵培养:将种子培养液接种于发酵培养基中培养,所述发酵培养基含有N-乙酰葡糖胺和天冬氨酸,还含有尿嘧啶及其衍生物中的一种或几种。
优选的,步骤(1)中所述菌种为马链球菌兽瘟亚种。
优选的,步骤(2)中种子培养搅拌转速为100-300rpm,培养时间为10-18h,得到种子培养液。
优选的,步骤(3)中接种量为8%-20%(v/v),搅拌转速为300-800rpm,通气速度为1.0-2.0vvm。
同时,本发明还提供了以上任一项所述的组合物和/或以上任一项所述的培养基在透明质酸发酵领域中的应用。
本发明通过对透明质酸合成途径和发酵特性的分析,考察了HA合成前体物质,UDP、N-乙酰葡糖胺对HA合成的影响。进一步的,从UDP的生物合成角度,考察了尿嘧啶、UMP、UTP、天冬氨酸对HA合成的影响。天冬氨酸是尿嘧啶直接合成途径中的原料,尿嘧啶、UMP、UTP可以通过合成代谢或分解代谢生成UDP。通过向培养基中添加N-乙酰葡糖胺和天冬氨酸以及尿嘧啶或尿苷酸(UDP、UMP、UTP)中的一种或几种,可以有效缓解HA合成过程中由于前体不足导致的合成受阻,产率不高的问题。该发明通过培养基的简单营养强化,可为企业创造直接的经济效益。通过本发明经过试验,使用而证明可行,该发明通过小试、中试、大试,透明质酸的产量提高了10%-40%,甚至是44%,实验室小罐产量能最高能达到7.58g/L。
其中,本发明中的尿嘧啶及其衍生物包括尿嘧啶和尿嘧啶衍生物。尿嘧啶衍生物是指尿嘧啶结构中的氢原子或原子团被其他原子或原子团取代所形成的化合物,优选包括尿嘧啶核苷(即尿苷)和尿苷酸等,尿苷酸包括本领域常见的尿苷一磷酸(UMP)、尿苷二磷酸(UDP)、尿苷三磷酸(UMP)。
本发明所取得的有益效果是:
本发明通过向培养基中补充HA合成的前体物质,N-乙酰葡糖胺和天冬氨酸,以及尿嘧啶或尿苷酸(UMP,UDP,UTP)中的一种,可以有效的缓解HA合成过程中,由于竞争性前体物质缺乏导致的HA合成乏力的问题。而且研究结果表明,通过添加以上前体物质,HA产率可提高10%-40%。解决了在发酵过程中,透明质酸产率低的问题。通过向培养基中添加N-乙酰葡糖胺和天冬氨酸,尿嘧啶、尿苷或尿苷酸(UDP、UMP、UTP),能有效提高HA产量10%-40%,而且通过各种成分的重量配比,以及在培养基中的浓度配比,将发酵成本控制在合理的范围内,对工业生产具有重要的指导意义,为生产企业创造直接的生产效益。
附图说明
图1为透明质酸的生物合成途径。
具体实施方式
如上所述,本发明的目的在于提高微生物发酵中透明质酸的产量,提高经济效益,为此,本发明提供了一种发酵产透明质酸的培养基和发酵方法以及应用。
其中,在本发明的一种优选实施方式中,所述发酵培养基包括N-乙酰葡糖胺、天冬氨酸和尿嘧啶。
在本发明的另一种优选实施方式中,所述发酵培养基包括N-乙酰葡糖胺、天冬氨酸和尿苷酸。
在本发明的又一种优选实施方式中,所述发酵培养基包括N-乙酰葡糖胺、天冬氨酸和尿苷。
在本发明的又一种优选实施方式中,所述发酵用菌株为马链球菌兽瘟亚种(又称兽疫链球菌)。因为不同菌种,在碳通量代谢上,差别很大,因此发酵培养基中所添加的N-乙酰葡糖胺对不同菌种的透明质酸代谢途径的影响是完全不同的。同时由于N-乙酰葡糖胺的添加量过高,会导致碳通量的代谢流朝着细胞合成,而不是HA合成的方向移动,而且由于N-乙酰葡糖胺的价格不低,将N-乙酰葡糖胺的添加量控制在一定数值,还可以节省成本。
其中,本发明所用到的马链球菌兽疫亚种,又称兽疫链球菌,为本领域生产透明质酸的常用菌种,本领域技术人员可以通过购买得到,也可以通过制备或者其他方式获取。本发明实施例和对比例中所用到的菌株为马链球菌兽瘟亚种(又称兽疫链球菌,Streptococcus equi subsq.zooepidemicus),是商购的,购买自中国典型培养物保藏中心(CCTCC),菌株保藏编号为CCTCC AB204053,保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内,邮政编码:430072。
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
本发明实施例和对比例中所用的试剂和仪器信息如下:
表1实施例和对比例中所用试剂和仪器的信息
紫外可见光分光光度计,型号:754,厂商:上海光谱仪器有限公司
全自动发酵罐,型号BioFlo115型3L反应器,厂商:NewBrunswick ScientificCo.,Edison,NJ,USA
透明质酸含量测定:采用Bitter--Muir氏法。
硼砂硫酸液:称取四硼酸钠4.77g溶于500mL的浓硫酸(AR级)中。
咔唑试液:称取咔唑0.125g,溶于100mL的乙醇(AR级)中。
精密称取葡萄糖醛酸(AR级)20mg,置于100mL的容量瓶中,加水溶解到刻度,摇匀备用。精密量取标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL,分别加入10mL的容量瓶中,加水稀释至刻度,得10、20、30、40和50μg/mL浓度的对照品溶液,取6支具塞刻度试管分别加入硼砂硫酸溶液5mL置于冰浴中冷却至4℃左右。然后分别取空白溶液(去离子水)和不同浓度的标准品溶液各1.0mL于试管中,先轻轻震荡,再充分混匀,这些操作均在冰浴中进行。将试管置沸水中煮沸10min后,放入冷水中冷却至室温。加入咔唑试剂0.2mL,混匀,再在沸水中加热15min,冷却至室温。在530nm处测定吸光度。按照下列公式计算发酵液中HA的含量:
透明质酸含量(g/L)=(标准曲线计算的浓度×稀释倍数×2.067)/1000
实施例一
(一)菌株信息
本发明所用马链球菌兽瘟亚种(又称兽疫链球菌,Streptococcus equisubsq.zooepidemicus)是商购的,该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),菌株保藏编号为CCTCC AB 204053,保藏地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内,邮政编码:430072。
(二)生产方法
(1)斜面培养:将接种后的斜面置于37℃恒温培养箱中培养16h,然后进行摇瓶接种。
(2)种子培养:将培养好的斜面种子接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中培养,摇床转速200r/min,温度37℃,培养时间15h,pH在5.0-5.5左右接种。
(3)发酵培养:按10%(v/v)的接种量将种子培养基接入全自动发酵罐BioFlo115型3L反应器,罐中装发酵培养基1.5L,搅拌转速500r/min,通气速率1.5vvm,温度37℃,pH采用pH电极进行在线检测,通过自动加料泵流加5mol/L NaOH溶液进行调节以维持pH变化在7.0±0.2以内。溶氧电极在线检测溶氧浓度。于固定时间取样进行检测分析。取5mL培养液,加入约2倍体积的乙醇,然后在5000r/min下离心15min。沉淀经蒸馏水洗涤两次后溶于水中测定透明质酸含量。
其中斜面培养基(g/L)配方为:心脑浸粉(BHI)37,葡萄糖10,酵母浸粉10,琼脂粉20,pH 7.2。
其中种子培养基的配方为:葡萄糖20g/L,酵母浸粉20g/L,硫酸镁2g/L,四水硫酸锰0.1g/L,磷酸二氢钾2g/L,碳酸钙20g/L,微量元素1ml/L(氯化钙2g/L,氯化锌0.046g/L,五水硫酸铜0.019g/L),缓冲液磷酸氢二钠36.76g/L,磷酸二氢钠15.98g/L,碳酸氢钠12.5g/L,pH 7.0,种子培养10-12h左右,pH在5.0-5.5左右接种;
发酵培养基基本配方为:葡萄糖100g/L、酵母浸粉17g/L、MgSO4·7H2O2.0g/L、Na2HPO4 6.3g/L、K2SO4 7.0g/L,微量元素1mL/L(氯化钙2g/L,氯化锌0.046g/L,五水硫酸铜0.019g/L)
同时实施例一在以上发酵培养基基本配方的基础上添加N-乙酰葡糖胺、天冬氨酸和尿苷三磷酸,其中N-乙酰葡糖胺在发酵培养基中的浓度为0.5g/L,天冬氨酸的浓度为2g/L,尿苷三磷酸的浓度为1g/L,检测结果见表3。
实施例二
与实施例一的不同之处在于,在实施例一发酵培养基基本配方的基础上添加N-乙酰葡糖胺、天冬氨酸和尿苷二磷酸,见表2实施例二的配方。其中N-乙酰葡糖胺在发酵培养基中的浓度为1g/L,天冬氨酸的浓度为3g/L,尿苷二磷酸的浓度为0.5g/L。
其中,生产方法如下:
(1)斜面培养:将接种后的斜面置于37℃恒温培养箱中培养16h,然后进行摇瓶接种。
(2)种子培养:将培养好的斜面种子接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中培养,摇床转速300r/min,温度37℃,培养时间10h,pH在5.0-5.5左右接种。
(3)发酵培养:按20%(v/v)的接种量将种子培养基接入全自动发酵罐BioFlo115型3L反应器,罐中装发酵培养基1.5L,搅拌转速300r/min,通气速率1.0vvm,温度37℃,pH采用pH电极进行在线检测,通过自动加料泵流加5mol/L NaOH溶液进行调节以维持pH变化在7.0±0.2以内。溶氧电极在线检测溶氧浓度。于固定时间取样进行检测分析。取5mL培养液,加入约2倍体积的乙醇,然后在5000r/min下离心15min。沉淀经蒸馏水洗涤两次后溶于水中测定透明质酸含量。检测结果见表3。
实施例三
与实施例一的不同之处在于,在实施例一发酵培养基基本配方的基础上添加N-乙酰葡糖胺、天冬氨酸和尿嘧啶以及尿苷三磷酸,见表2实施例三的配方。其中N-乙酰葡糖胺在发酵培养基中的浓度为0.8g/L,天冬氨酸的浓度为1g/L,尿嘧啶的浓度为1g/L,尿苷三磷酸的浓度为1g/L。
其中,生产方法如下:
(1)斜面培养:将接种后的斜面置于37℃恒温培养箱中培养16h,然后进行摇瓶接种。
(2)种子培养:将培养好的斜面种子接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中培养,摇床转速100r/min,温度37℃,培养时间18h,pH在5.0-5.5左右接种。
(3)发酵培养:按8%(v/v)的接种量将种子培养基接入全自动发酵罐BioFlo115型3L反应器,罐中装发酵培养基1.5L,搅拌转速800r/min,通气速率2.0vvm,温度37℃,pH采用pH电极进行在线检测,通过自动加料泵流加5mol/L NaOH溶液进行调节以维持pH变化在7.0±0.2以内。溶氧电极在线检测溶氧浓度。于固定时间取样进行检测分析。取5mL培养液,加入约2倍体积的乙醇,然后在5000r/min下离心15min。沉淀经蒸馏水洗涤两次后溶于水中测定透明质酸含量。检测结果见表3。
实施例四
与实施例一的不同之处在于,在实施例一发酵培养基基本配方的基础上添加N-乙酰葡糖胺、天冬氨酸和尿苷一磷酸,见表2实施例四的配方。其中N-乙酰葡糖胺在发酵培养基中的浓度为2g/L,天冬氨酸的浓度为0.1g/L,尿嘧啶的浓度为1g/L,尿苷一磷酸的浓度为2.5g/L。
生产方法同实施例一,检测结果见表3。
实施例五
与实施例一的不同之处在于,在实施例一发酵培养基基本配方的基础上添加N-乙酰葡糖胺、天冬氨酸和尿苷,见表2实施例五的配方。其中N-乙酰葡糖胺在发酵培养基中的浓度为0.02g/L,天冬氨酸的浓度为5g/L,尿嘧啶的浓度为1g/L,尿苷浓度为0.01g/L。
生产方法同实施例一,检测结果见表3。
对比例一
与实施例一的不同之处在于:在实施例一发酵培养基基本配方的基础上仅添加N-乙酰葡糖胺,且N-乙酰葡糖胺的浓度为0.5g/L,见表2。
生产方法同实施例一,检测结果见表3。
对比例二
与实施例一的不同之处在于,在实施例一发酵培养基基本配方的基础上仅添加N-乙酰葡糖胺和天冬氨酸,且N-乙酰葡糖胺的浓度为3g/L,天冬氨酸的浓度为2g/L,见表2。
生产方法同实施例一,检测结果见表3。
对比例三
与实施例一的不同之处在于,在实施例一发酵培养基基本配方的基础上仅添加尿苷三磷酸,且尿苷三磷酸的浓度为1g/L,见表2。
发酵培养基中仅添加1%尿嘧啶,其它培养基成分同实施例一的发酵培养基。
生产方法同实施例一,检测结果见表3。
对比例四
与实施例一的不同之处在于,在实施例一发酵培养基基本配方的基础上添加N-乙酰葡糖胺和尿嘧啶,且N-乙酰葡糖胺的浓度为0.5g/L,尿嘧啶的浓度为1g/L,见表2。
生产方法同实施例一,检测结果见表3。
对比例五
与实施例一的不同之处在于,在实施例一发酵培养基基本配方的基础上添加N-乙酰葡糖胺和尿苷,且N-乙酰葡糖胺的浓度为0.5g/L,尿苷的浓度为3g/L,见表2。
生产方法同实施例一,检测结果见表3。
对比例六
对比例六作为空白对照组,采用实施例一的发酵培养基的基本配方,不添加其他成分。
生产方法同实施例一,检测结果见表3。
表2不同实施例和对比例中添加的原料的配方(g/L)
成分 | N-乙酰葡糖胺 | 天冬氨酸 | 尿嘧啶及其衍生物 |
实施例一 | 0.5 | 2 | UTP 1 |
实施例二 | 1 | 3 | UDP 0.5 |
实施例三 | 0.8 | 1 | 尿嘧啶1、UTP 1 |
实施例四 | 2 | 0.1 | UMP 2.5 |
实施例五 | 0.02 | 5 | 尿苷0.01 |
对比例一 | 0.5 | 0 | 0 |
对比例二 | 3 | 2 | 0 |
对比例三 | 0 | 0 | UTP 1 |
对比例四 | 0.5 | 0 | 尿嘧啶1 |
对比例五 | 0.5 | 0 | 尿苷3 |
对比例六 | 0 | 0 | 0 |
表3实施例和对比例不同时间HA产量(g/L)
从表3可以看出,实施例一到实施例五中同时添加了N-乙酰葡糖胺、天冬氨酸和尿嘧啶或尿苷或尿苷酸及其组合物,其发酵后在不同的时间点取样,HA的产量均要高于空白对照组(对比例六)。而且由于N-乙酰葡糖胺以及尿嘧啶衍生物都是高价原料,当含量加入过高时,会极大的提高生产成本,因此发明人创造性的研究了三种成分的配比,表现在三种成分均需要在特定的含量范围内,既提高的HA发酵的产量,缩短了发酵时间,而且还最大程度的控制了发酵成本。重要的是,三种成分(实施例一)的添加,相较于对比例二(两种成分,不含尿嘧啶),产量能够明显提高(16.3%);而且尿苷或者尿苷酸可以同尿嘧啶起到相同的效果。同时,即便是增大其中一种成分的含量,培养基中添加两种成分,其效果也不如添加三种成分后HA的产量提高的多。本发明通过三种成分的添加,较空白对照组可以缩短发酵周期,同时可以提高HA产量30%-40%左右,最大甚至达到44%。
以上所述仅为本发明较佳实施例,并不用于局限本发明,凡在本发明的精神和原则之内所做的修改、等同替换和改进等,均需要包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种透明质酸发酵用的组合物,其特征在于,所述组合物包括N-乙酰葡糖胺和天冬氨酸,还含有尿嘧啶及其衍生物中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于,所述尿嘧啶及其衍生物包括尿嘧啶和尿嘧啶衍生物,尿嘧啶衍生物包括尿苷和/或尿苷酸。
3.根据权利要求2所述的组合物,其特征在于,所述尿苷酸包括尿苷一磷酸、尿苷二磷酸和尿苷三磷酸。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物,其特征在于,按重量份计,所述N-乙酰葡糖胺为0.02-2重量份,优选为0.5-1重量份;
天冬氨酸为0.1-5重量份,优选为1-3重量份;
尿嘧啶及其衍生物为0.01-2.5重量份,优选为0.5-2重量份。
5.一种透明质酸发酵用的培养基,其特征在于,所述培养基中添加N-乙酰葡糖胺和天冬氨酸,还包括尿嘧啶及其衍生物中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述的培养基,其特征在于,所述尿嘧啶及其衍生物包括尿嘧啶和尿嘧啶衍生物,尿嘧啶衍生物包括尿苷和/或尿苷酸。
7.根据权利要求5或6所述的培养基,其特征在于,
所述N-乙酰葡糖胺的浓度为0.02-2g/L,优选为0.5-1g/L;
天冬氨酸的浓度为0.1-5g/L,优选为1-3g/L;
尿嘧啶及其衍生物的浓度为0.01-2.5g/L,优选为0.5-2g/L。
8.一种发酵生产透明质酸的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)菌种活化:将菌种接种于斜面培养基进行活化;
(2)种子培养:将菌种接种于种子培养基中培养,得到种子培养液;
(3)发酵培养:将种子培养液接种于发酵培养基中培养,所述发酵培养基含有N-乙酰葡糖胺和天冬氨酸,还含有尿嘧啶及其衍生物中的一种或几种。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤(1)中所述菌种为马链球菌兽瘟亚种。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于,步骤(2)中种子培养搅拌转速为100-300rpm,培养时间为10-18h,得到种子培养液。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法,其特征在于,步骤(3)中接种量为8%-20%(v/v),搅拌转速为300-800rpm,通气速度为1.0-2.0vvm。
12.权利要求1-4任一项所述的组合物和/或权利要求5-7任一项所述的培养基在透明质酸发酵领域中的应用。
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