CN103409389B - 一种蜡蚧菌发酵生产海藻糖酶的培养基及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蜡蚧菌发酵生产海藻糖酶的培养基及方法。所述培养基的原料含有L-山梨糖2.5-20g/L,酵母浸粉2.5-20g/L,Zn2+0.008-0.065g/L,VE0.005-0.4g/L,土豆200g/L,KCl1g/L,KH2PO41g/L,MgSO45g/L,蛋白胨5g/L,可溶性淀粉10g/L,pH=6-9。该方法通过将发酵种子液按接种于培养基,250mL的三角瓶装液量为125mL,接种量为15mL,于26℃,转速160 r/min下培养。本发明的发酵方法有发酵周期短;条件温和,易于控制;提供的用于蜡蚧菌发酵生产海藻糖酶的培养基,具有海藻糖酶活力高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地,本发明涉及一种蜡蚧菌发酵生产海藻糖酶的培养基及方法。
背景技术
海藻糖水解酶(Trehalase, EC:3.2.1.28, 简称海藻糖酶) 于1893年首先在黑曲霉中发现,是唯一可以专一性地将海藻糖水解成为2分子葡萄糖单体的水解酶。在自然界中,海藻糖酶广泛存在于昆虫、哺乳动物、微生物和植物中。海藻糖酶在昆虫代谢系统中有十分重要的作用,是一种重要的代谢酶。在昆虫体内,侵入体内的真菌海藻糖酶能够加速海藻糖的分解而促进昆虫死亡,因此研究蜡蚧轮枝菌海藻糖酶的相关性质可以为新农药的创制提供科学依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜡蚧菌发酵生产海藻糖酶的培养基及方法。
一种蜡蚧菌发酵生产海藻糖酶的培养基,其特征在于所述培养基的原料含有L-山梨糖2.5-20g/L,酵母浸粉2.5-20g/L,Zn2+0.008-0.065g/L,VE0.005-0.4g/L,土豆200g/L,KCl 1g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4 5g/L,蛋白胨5g/L,可溶性淀粉10g/L,pH=6-9;所述的蜡蚧菌为蜡蚧轮枝菌L. lecanii FJ28。
所述培养基的原料按重量分数计优选为,含有L-山梨糖2.5g/L,酵母浸粉10g/L,Zn2+0.065g/L,VE 0.4g/L,土豆200g/L,KCl 1g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4 5g/L,蛋白胨5g/L,可溶性淀粉10g/L, pH=8。
一种蜡蚧菌发酵产海藻糖酶的方法,其特征在于,所述方法包含以下步骤:
(a)将蜡蚧轮枝菌接种种子培养基,制得发酵种子液;
(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于上述蜡蚧菌发酵生产海藻糖酶的培养基,250mL的三角瓶装液量为125mL,接种量为5-15mL,菌龄为3-11d,玻璃珠3-7颗,于26℃±1℃,转速160 r/min下培养,发酵周期为72h-120h。
所述种子培养基的原料含有按重量分数计,土豆200g/L,葡萄糖20.0g/L,KCl 1g/L,KH2PO41g/L,MgSO45g/L,蛋白胨5g/L,酵母浸粉5g/L,可溶性淀粉10g/L,pH=6。
所述步骤优选为:
(a)将蜡蚧轮枝菌接种种子培养基,制得发酵种子液;
(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液按接种于如权利要求1所述的培养基,250mL的三角瓶装液量为125mL,接种量为10mL,菌龄为11d,玻璃珠3颗,于26℃±1℃,转速160 r/min下培养,发酵周期为96h。
本发明采用的蜡蚧菌为蜡蚧轮枝菌L. lecanii FJ28(邱君志等,金属离子对蜡蚧菌几丁质酶活力的影响,激光生物学报,2009年2月)。
本发明的发酵方法有发酵周期短;条件温和,易于控制;提供的用于蜡蚧菌产海藻糖酶的培养基,具有海藻糖酶活力高的优点。
附图说明
图1 为葡萄糖标准曲线。
图2 为不同碳源对酶产量的影响。
图3 为不同氮源对酶产量的影响。
图4 为不同维生素对酶产量的影响。
图5 为不同pH对酶产量的影响。
图6 为不同金属离子对酶产量的影响。
具体实施方式
为了使本发明所述的内容更加便于理解,下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明,但是本发明不仅限于此。
以下实施例中所用菌种均为:蜡蚧菌L. lecanii FJ28
实施例1
(1) 发酵种子的制备
(A)菌种和培养基
菌种:蜡蚧菌L. lecanii FJ28
种子培养基:PDA培养基:在去皮土豆200.0g煮成的土豆汁中加入葡萄糖20.0g, KCl1.0 g,KH2PO41.0 g,MgSO45.0g,蛋白胨5.0g,酵母浸粉5.0g,可溶性淀粉10.0g,然后用蒸馏水定容到1000mL,调pH值至6.0,0.1MPa,灭菌20min。
(B)种子液制备
将平板上的纯种蜡蚧菌FJ28转接到多个250mL三角瓶中,其中装有100mL种子培养基,然后在26℃,在往复式震荡摇床转速160 r/min下培养培养11d后,菌丝生长健壮,菌液呈粘稠状时,说明种子已经生长好了,即得发酵种子液。
(2) 发酵培养
将上一步骤中制备的蜡蚧菌FJ28发酵种子液,接种量10mL接种于250mL三角瓶中,三角瓶中装有125mL发酵培养液。
发酵培养液按含有L-山梨糖2.5g/L,酵母浸粉10g/L,Zn2+0.065g/L,VE 0.4g/L,土豆200g/L,KCl1g/L,KH2PO41g/L,MgSO45g/L,蛋白胨5g/L,可溶性淀粉10g/L,培养基初始pH=8。
摇床温度:26℃±1℃,玻璃珠3颗;
发酵周期:96h。发酵后得发酵液。
(3) 海藻糖酶酶活测定
根据海藻糖酶酶活测定方法,取0.4mL发酵上清液加入0.4mL海藻糖,37℃水浴0.5h,加入1mL DNS试剂终止反应,沸水浴5min后冷却,在波长550nm处测定吸光值。另以超纯水代替原酶液为空白。酶活力单位的定义为在本实验测定条件下,以每分钟催化产生1μmol的对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活力单位(U)。酶活力(U/g或U/mL)=A×K×V×n/(t×m)(A为样品的吸光度;K为海藻糖对550 nm长紫外光的吸收能力即吸光常数,在550nm处海藻糖溶液的浓度为1 mol/L,光程为 1cm时的吸光度值;V为反应试剂的总体积;n为酶液的稀释倍数;t为反应时间;m为酶液质量或体积,g或mL)。
标准曲线的制作:精确配制葡萄糖10、20、30、40、50、60、70、80、90和100μg/mL标准溶液;取前述浓度的葡萄糖溶液各0.4mL分别与1mL DNS显色剂混合并沸水浴5min。反应体系为1.4mL(葡萄糖溶液0.4mL,DNS显色剂为1mL)。每个浓度做3平行实验,为空白对照。在波长550 nm处测定吸光值。以吸光值为横坐标,标准物质量为纵坐标,经统计处理得到的线性回归方程,y=0.1569x-0.1249,并且R2为0.9967,结果见图1。
按此方法测定,发酵产生结果蜡蚧菌FJ28产海藻糖酶为26U/mL以上。
实施例2
单因素实验确定培养基最优成分
(1)种子培养基配制:在去皮土豆200.0g煮成的土豆汁中加入葡萄糖20.0g, KCl1.0 g,KH2PO41.0 g, MgSO45.0g,蛋白胨5.0g,酵母浸粉5.0g,可溶性淀粉10.0g,然后用蒸馏水定容到1000mL,调pH至6.0,分装于250mL的三角瓶,每个三角瓶含150mL种子培养基。0.1MPa,灭菌20min。使用前可加入抗生素对培养基预处理。
(2)发酵种子的制作:将蜡蚧菌FJ28接种于马铃薯琼脂培养基上,于26℃下培养2d,待其产孢子,即活化;将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基,26℃,转速160 r/min下培养3d,即为发酵液。其中在发酵培养基的基础上添加各种单因素进行梯度试验从而得出最优培养基,在验证试验中利用最优培养基验证其酶活确实达到最高水平。
(3)酶液的制备:取步骤(2)下的发酵液在4℃下, 5000 r/min离心,15min,得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定在在波长550nm处测定吸光值。换算成酶活单位U/mL。
(4)海藻糖酶酶活测定方法:按实施例1中方法进行测定。
一.不同碳源、氮源、维生素、pH、金属离子对产海藻糖酶的影响
(a)碳源对酶产量的影响,在含有1 g/L KCl,1 g/L KH2PO4,5 g/LMgSO4 ,5g/L 蛋白胨,5g/L 酵母浸粉,10g/L 可溶性淀粉,pH6.0的培养基中分别添加2.5 g/L蔗糖、果糖、L-阿拉伯糖、L-山梨糖、可溶性淀粉、麦芽糖、葡萄糖,0.1MPa,灭菌20min(下同),接入相同的蜡蚧菌发酵种子液,在26℃、160r/min的摇床中培养72h检测酶活性,结果见图2。
(b)氮源对酶产量的影响,在含有1 g/L KCl,1 g/L KH2PO4,5 g/LMgSO4、pH6.0的培养基中分别添加10g/L的酵母浸粉、酵母浸膏、胰蛋白胨、NaNO3、(NH4)2HPO4、(NH4)2SO4、KNO3、酸水解酪蛋白,灭菌,接入相同的蜡蚧菌发酵种子液,在26℃、160r/min的摇床中培养72h检测酶活性,结果见图3。
(c)维生素对酶产量的影响,在含有1 g/L KCl,1 g/L KH2PO4,5 g/LMgSO4 ,5g/L 蛋白胨,5g/L 酵母浸粉,10g/L 可溶性淀粉,pH6.0的培养基中分别添加0.4g/L维生素VB1、VB2、VB6、VB,灭菌,接入相同的蜡蚧菌发酵种子液,在26℃、160r/min的摇床中培养72h检测酶活性,结果见图4。
(d)pH对酶产量的影响,在含有1 g/L KCl,1 g/L KH2PO4,5 g/LMgSO4 ,5g/L 蛋白胨,5g/L 酵母浸粉,10g/L 可溶性淀粉,调pH为5、6、7、8,灭菌,接入相同的蜡蚧菌发酵种子液,在26℃、160r/min的摇床中培养72h检测酶活性,结果见图5。
(e)金属离子对产酶的影响,在含有5g/L 蛋白胨,5g/L 酵母浸粉,10g/L 可溶性淀粉、pH6.0的培养基中分别添加10×10-4mol/L KCl、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、MnCl2·4H2O、ZnCl2、FeCl2·4H2O,灭菌,接入相同的蜡蚧菌发酵种子液,在26℃、160r/min的摇床中培养72h检测酶活性,结果见图6。
从图中可以得出最佳的培养基成分为L-山梨糖,酵母浸膏,VE,Zn2+,最适pH为8,接下来的正交实验将以此作为发酵培养基成分。
实施例3
正交实验确定最优发酵条件
(1)正交实验确定最佳培养基
从单因素实验确定的培养基的基础上,改变各成分的浓度,和pH值,配置不同的培养基,方法同实施例2中步骤(1)、(2)。见表1,将相同量的接种量(15ml)菌种接种于250mL,装有50mL培养液,在26℃,转速160 r/min下培养培养72h。然后按实施例1步骤(3)测定酶活,结果见表2。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号,进行验证实验,结果见表3。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。
注:Ij 为各因素水平1的所有酶活力之和,Ⅱj 为各因素水平2的所有酶活力之和,Ⅲj为各因素水平3的所有酶活力之和,Ⅳj为各因素水平4的所有酶活力之和,R为极差,酶活力的数字代表3次重复的平均值(mean)±标准差(S.D)。
正交结果分析表明:最佳因素组合是A2B3C4D1E2,即L-山梨糖2.5 g/L,酵母浸粉10g/L,Zn2+10×10-4mol/L,维生素E0.4g/L,pH=8,且结果与验证试验相符合。正交实验结果表明较好水平包括L-山梨糖2.5 g/L、酵母浸粉10g/L、Zn2+10×10-4mol/L、维生素E0.4g/L、pH=8,即A2B3C4D1E2。表2变化因子的极差值R分别为碳源(83.85)、氮源(21.15)、维生素(57.51)、pH(46.80)和金属离子(57.79),表明碳源、氮源、维生素、pH和金属离子的变化与蜡蚧菌FJ28产海藻糖酶培养基相关,尤其是碳源的变化对该菌产酶的影响更大。相对而言,氮源的改变对产酶的影响较小。
(2)正交实验确定最优培养条件
在从正交实验确定的最优培养基的基础上,通过设定不同接种量,玻璃珠数,菌龄,培养时间,在26℃,转速160 r/min下培养,各组号的培养时间以表4为准。然后按实施例1测定酶活。选取正交实验最优结果和其产酶量最高的实验组号,进行验证实验。为了避免累赘实施例中的培养基配法、粗酶液的制作、酶活测定方法均与实施例1的方法相同。
总结了4个因子(接种量、玻璃珠数、菌龄和培养时间)对蜡蚧菌FJ28产海藻糖酶产生的影响。表5中的R值表明玻璃珠数(113.19)是一个比其他培养条件更重要的因子,其次是接种量(73.56),然后是培养时间(72.89),对蜡蚧菌FJ28产海藻糖酶影响最小的因子是菌龄(67.05)。最优相应的实验条件应为A2B1C3D2 (接种量10 mL,玻璃珠3颗,菌龄11d,培养时间96h)。在培养该菌产的时候,要注意玻璃珠数,以提高产酶效率。
Claims (1)
1. 一种蜡蚧菌发酵生产海藻糖酶的方法,其特征在于:所述方法包含以下步骤:
(a)将蜡蚧轮枝菌接种种子培养基,制得发酵种子液;
(b)将步骤(a)中制得的发酵种子液接种于培养基,250mL的三角瓶装液量为125mL,接种量为10mL,菌龄为11d,玻璃珠3颗,于26℃±1℃,转速160 r/min下培养,发酵周期为96h;
所述的蜡蚧轮枝菌为蜡蚧轮枝菌L. lecanii FJ28;所述种子培养基的原料含有按重量分数计,土豆200g/L,葡萄糖20.0g/L,KCl 1g/L,KH2PO41g/L,MgSO45g/L,蛋白胨5g/L,酵母浸粉5g/L,可溶性淀粉10g/L,pH=6;
步骤(b)所述培养基的原料按重量分数计含有L-山梨糖2.5g/L,酵母浸粉10g/L,Zn2+0.065g/L,VE 0.4g/L,土豆200g/L,KCl 1g/L,KH2PO4 1g/L,MgSO4 5g/L,蛋白胨5g/L,可溶性淀粉10g/L, pH=8。
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