CN103828597A

CN103828597A - 一种榆黄菇液体菌种制作的方法

Info

Publication number: CN103828597A
Application number: CN201310267659.9A
Authority: CN
Inventors: 蔡德华
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Ludong University
Priority date: 2013-07-01
Filing date: 2013-07-01
Publication date: 2014-06-04

Abstract

一种榆黄菇液体菌种制作的方法，属于食用菌栽培学领域。我们通过对母种培养基配方和液体培养基配方的优化以及发现榆黄菇液体菌种生长的最适环境条件，系统的做出了榆黄菇液体菌种的制作方法，该技术可以大大缩短榆黄菇菌种的制种和栽培时间，提高菌种质量，降低菌种生产成本，提高子实体品质、产品质量和商品价值。

Description

一种榆黄菇液体菌种制作的方法

技术领域

一种榆黄菇液体菌种制作的方法，属于食用菌栽培学领域。

背景技术

榆黄菇（Pleurotus citrinopileatus Sing）又称金顶侧耳,属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属。其味道鲜美，含有十几种氨基酸及丰富的多糖及粗蛋白等生物活性成分，不仅营养价值高，还具有抗肿瘤、抗衰老、抗病毒及免疫增强和滋补强壮等多种药用功效，同时具有很高的经济价值，目前已经在国内广泛栽培，但其液体菌种生产技术尚不成熟。本研究着眼于把食用菌深层发酵技术与榆黄菇优质高产栽培结合起来，使食用菌液体菌种培养技术在榆黄菇的规模化生产上得到广泛的应用和推广。我们经过几年的研究、反复实验终于研究成功了液体规模化生产新技术，该技术不仅可以大大缩短榆黄菇菌种的制种和栽培时间，提高菌种质量，降低菌种生产成本，提高子实体品质、产品质量和商品价值等等，而且投资少，技术易掌握，适合我国国情，具有很高的推广价值。

发明内容

（一）榆黄菇液体菌种培养基筛选的研究

1 材料

1.1 菌种由烟台师范学院食用真菌研究所提供。

培养基

1.2.1斜面培养基（改良PDA）：土豆（去皮）20%、葡萄糖2%、蛋白胨0.25%、KH₂PO₄0.1%、MgSO₄0.1%、琼脂（2%）。

1.2.2液体培养基：土豆（去皮）20%、碳源2%、氮源0.2%、MgSO0.1%、KH₂PO₄0.1%。

1.2.3培养设备：HZQ-Q型震荡器(哈尔滨东联电子有限公司)、LS-B-50L型立式压力蒸汽灭菌锅（上海医用核子仪器厂）LRH-250-A型生化培养箱（广东医疗器械厂）FA2004型上皿电子天平（上海精科电子天平厂）

2 方法

2.1 工艺路线：榆黄菇保藏菌种 →斜面扩大培养→液体菌种制备（一级摇瓶）→液体培养（种子摇瓶）

2.2 液体菌种的制备：将斜面菌种接种于500ml（装液量为150ml）锥形瓶中,放入25℃恒温箱中静置24小时，然后在 25℃、180r/min 旋转式摇床震荡培养6d,制做液体菌种备用。

摇瓶培养工艺：在500ml锥形瓶中装入150ml受试培养基，将制备好的液体菌种按照10%的接种量进行接种，每项设5个重复，在25℃、180r/min 旋转式摇床震荡培5d，pH自然，观察记录菌球生长情况，测定菌丝干重、菌球密度和菌球直径。

菌丝体干重测量：发酵终止后，将每个摇瓶中的全部培养液用干燥的脱脂棉过滤，用蒸馏水多次冲洗后，放于60℃干燥箱内烘干至恒重，测定干重。

菌球密度的测量：将菌液置于100ml量筒中静置5min，测菌球占菌液体积的百分比。

菌球直径的测量：随机取10个菌球排成一条直线,测出其总长度再除以10，即得菌球的平均直径。

３结果与分析

3.1最适碳源的筛选

分别用２％的葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖作为液体培养基的碳源，0.2%的蛋白胨为氮源，观察菌丝体生长状况。菌丝体培养形状观察发现：以葡萄糖为碳源时培养液3天开始变澄清，菌球大小均一，呈淡黄色，菌球表面的毛刺（絮状绒毛）细长、多；以蔗糖为碳源时培养液3天开始变澄清，菌球大小均一，呈乳白色，菌球表面的毛刺粗短、少；以麦芽糖、乳糖为碳源时培养液4天开始变澄清，菌球大小不均一，呈淡黄色，菌球表面毛刺细、短、少。

表1 不同碳源对榆黄菇菌丝体生长的影响

结果表明：菌球密度大小依次为：葡萄糖＞玉米粉＞蔗糖＞麦芽糖＞乳糖。菌球直径长短依次为：葡萄糖＜蔗糖＜玉米粉＜乳糖＜麦芽糖。以葡萄糖为碳源时菌球密度大，单个菌球体积小，菌球数量最多，其次为玉米粉和蔗糖,而对麦芽糖、乳糖的利用相对较差。以葡萄糖为碳源时菌丝体干重最高，其他其次依次为玉米粉、蔗糖、麦芽糖，乳糖。方差分析表明各组之间差异有显著性意义（P＜0.05）。因此以葡萄糖和玉米粉、蔗糖作为碳源时菌丝体生长最好。

最适氮源的筛选

分别用0.2%的蛋白胨、酵母膏、麸皮、(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃作为液体培养基中的氮源，2%的葡萄糖为碳源，试验观察发现：用五种不同氮源培养后，培养液均呈淡黄色透明，菌球也为淡黄色，以酵母膏和麸皮为氮源时菌丝体萌发早，菌球生长非常快，菌球表面毛刺细、长、多成绒毛状；以蛋白胨为氮源时菌丝体生长慢，菌球表面毛刺细长较多，以(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃为氮源时生长非常缓慢，菌球表面的毛刺细、短，少。

表2 不同氮源对榆黄菇菌丝体生长的影响

酵母膏、麸皮和蛋白胨为氮源时菌球密度明显高于以(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃为氮源时的菌球密度。其中以酵母膏和为氮源时菌球密度最大。五种氮源的菌球直径长短依次为NH₄NO₃＞(NH₄)₂SO₄＞蛋白胨＞酵母膏＞麸皮。以酵母膏和麸皮为氮源时菌球密度大，总的菌球体积大，但单个菌球体积小，因此菌球数量最多，其次是蛋白胨，而(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃为氮源时菌球数较少。

方差分析表明各组菌丝体干重的差异有显著性意义（P＜0.05）。以酵母膏和麸皮作为氮源时菌丝体干重最大，其次为蛋白胨，(NH₄)₂SO₄、NH₄NO₃作为氮源时菌丝体产量很低。综上，适合榆黄菇菌丝体生长的氮源为酵母膏、麸皮和蛋白胨。

不同无机盐对榆黄菇液体发酵生长的影响

发酵终止时,菌球表面具刺毛状分枝,分支长度较均匀,约为菌球直径的1/5．按分枝多少的排列顺序为：ＫH₂PO₄ > MgSO₄ > NaCl > KCl。因为菌球表面分枝是将来转化为新菌球的基础，故菌球表面分枝多少与将来新菌球的生长量呈正比例关系。

表3 不同无机盐对榆黄菇菌丝体生长的影响

方差分析各组间菌丝体干重差异有显著性意义（P<0.05）。不同无机盐处理的菌球大小排列顺序为：KH₂PO₄〈MgSO₄〈KCl〈NaCl。

通过观察菌丝生长状态和测定不同无机盐处理的菌丝体干重，发现榆黄菇菌丝体最需要的无机盐为KH₂PO₄。培养液中MgSO₄、KCl和NaCl对菌丝体生长的影响相近。

正交试验筛选最适培养基

考虑到碳源和氮源的相互作用，分别选用二种适合液体培养榆黄菇菌丝体生长的碳源和氮源，各选用3个不用浓度，设计四因素，三个水平的正交试验，9个组合，5个重复，筛选出适用的碳源和氮源及各自的含量，结果如下：

表4 L ₉ (3 ⁴ )正交试验设计

表5 L ₉ (3 ⁴ )正交表榆黄菇液体菌种培养直观分析

由表5数据直观分析可知：最佳组合为A₁B₃C₃D₃。A因素R值最大，B因素和D因素R值较小，四个试验因素影响大小的主次顺序依次为A＞B ＞C＞D。说明在此培养条件下，葡萄糖浓度变化对菌丝体产量影响较为明显，玉米粉和酵母膏的浓度变化对菌丝体产量也有明显的影响，而麸皮在此试验浓度范围内的变化对菌丝体产量影响的差别相对较小，最后筛选出最适用的组合为A₂B₂C₃D₃，即2%的葡萄糖和1%的玉米粉、0.2%的酵母膏和1.5%麸皮。

3.5 不同碳氮比（C/N）对榆黄菇菌丝体生长的影响

不同碳氮比(C/N)对榆黄菇菌丝体生长的影响试验结果见表6和图8。

表6 不同碳氮比(C/N)对榆黄菇菌丝体生长的影响

葡萄糖/ g(100mL)^-1	硫酸铵/g(100mL)^-1	C/N	菌丝体干重(mg/mL)
				12	1.20	10	5.62
12	0.80	15	6.15
				12	0.60	20	7.80
12	0.48	25	8.19
				12	0.40	30	7.28
12	0.34	35	6.46
				12	0.30	40	5.12

碳氮比试验结果表明，不同碳氮比对榆黄菇菌丝体生长影响显著，在一定的碳氮比范围内，榆黄菇生长的较好，生物量较高，比例太低或者太高，都不利于菌丝的生长。可以看出，本试验条件下，当碳氮比为25:1时,菌丝体干重最大。

（二）榆黄菇液体菌种摇瓶培养最优条件的研究

1、材料

1.1菌株：烟台师范学院食用真菌研究所提供

1.2培养基

1.2.1斜面培养基：PDA

1.2.2液体培养基：土豆20% 、葡萄糖2%、玉米粉1%、酵母膏0.2%、麦麸1.5%、MgSO₄0.1%、KH₂PO₄0.2%。

1.2.3培养设备：HZQ-Q型震荡器(哈尔滨东联电子有限公司)、LS-B-50L型立式压力蒸汽灭菌锅（上海医用核子仪器厂）LRH-250-A型生化培养箱（广东医疗器械厂）FA2004型上皿电子天平（上海精科电子天平厂）电子分析天平、精密pH计（上海雷磁）。

方法

2.1工艺路线：榆黄菇保藏菌种→斜面扩大培养→液体菌种制备（一级摇瓶）→摇瓶培养条件研究（二级摇瓶）

2.2液体菌种的制备：将斜面菌种接种于500ml（装液量为150ml）锥形瓶中,放入25℃恒温箱中静置24小时，然后在 25℃、180r/min 旋转式摇床振荡培养6d,制作液体菌种备用。

摇瓶培养工艺：在500ml锥形瓶中装入150ml受试培养基，将制备好的液体菌种按照10%的接种量进行接种，每项设5个重复，在25℃、180r/min 旋转式摇床振荡培养5d，pH自然，观察记录菌球生长情况，测定菌丝干重、菌球密度。

菌丝体干重测量：发酵终止后，将每个摇瓶中的全部培养液用干燥的脱脂棉过滤，用蒸馏水多次冲洗后，放于60℃干燥箱内烘干至恒重，测定干重。

菌球密度的测量：将菌液置于100ml量筒中静置5min，测菌球占菌液体积的百分比。

菌球直径的测量：,随机取10个菌球排成一条直线,测出其总长度再除以10，即得菌球的平均直径。

结果与分析

3.1摇瓶培养最适初始pH的筛选：

将培养基配成溶液后，用稀碱和稀酸调pＨ5～8，结果（图1）表明：培养初始pH为6时，榆黄菇菌丝体生长较为理想。

摇瓶培养最适培养温度的筛选：

分别在22℃、25℃、28℃和31℃条件下进行培养，5天后终止发酵，测菌丝体干重和菌球密度，结果见图2：

在 25℃前，随温度的升高 ,菌丝量不断增加，但继续升温 ,菌丝量开始下降 ,温度超过30℃，菌丝数量明显降低，因而确定 25℃为最适发酵温度。

摇瓶培养最佳接种量的研究

为了选择最佳接种量，用 5%、10 %、15%、20 %四个接种量进行试验，观察不同接种量对菌丝体干重和菌球密度的影响，结果见图3：

从图3可看出，随着接种量增加，生物量也逐渐提高。当接种量由 5%增加到 10 %时，菌丝体干重升高显著，而接种量从 10 %增加到 20 %时，菌丝体产量比较平稳。菌球密度液也反映了这种变化趋势。考虑到经济效益，10 %为理想的接种量。

摇瓶培养发酵终点的研究

发酵96h 后 ,菌球增大 ,大部分表面变光滑 ,呈老化现象。发酵到120h时，菌液明显颜色变深，生物量有所下降，部分菌丝体出现空泡，开始自溶。因此，作为液体种子，应在第72-96h终止发酵为宜。结果见图4：

（三）榆黄菇液体菌种发酵罐深层培养的研究

1、材料

1.1菌株：烟台师范学院食用真菌研究所提供

1.2培养基

1.2.1斜面培养基：PDA

培养设备：HZQ-Q型震荡器(哈尔滨东联电子有限公司)、LS-B-50L型立式压力蒸汽灭菌锅（上海医用核子仪器厂）LRH-250-A型生化培养箱（广东医疗器械厂）FA2004型上皿电子天平（上海精科电子天平厂）电子分析天平、精密pH计（上海雷磁）、FMLT-52型5L台式发酵罐（上海国强生化工程装备有限公司）、100L种子罐。

方法

2.1工艺路线：榆黄菇保藏菌种→斜面扩大培养→液体菌种制备（一级摇瓶→二级摇瓶）→5L发酵罐(或100L种子罐)发酵研究

2.2液体菌种的制备：将斜面菌种接种于500ml（装液量为150ml）锥形瓶中,放入25℃恒温箱中静置24小时，然后在 25℃、180r/min 旋转式摇床振荡培养6d,制作液体菌种备用（一级摇瓶）。在500ml锥形瓶中装入150ml培养基，将制备好的一级摇瓶菌种按照10%的接种量进行接种，在25℃、180r/min 旋转式摇床振荡培养4d，制作液体菌种备用（二级摇瓶）。

发酵罐培养研究：

2.3.1（1）5L发酵罐培养：装液量4L，转速180 r/min，通气量6L/min，温度25℃，接二级摇瓶种,接种量10%,于25℃培养。每12小时取样检测。（2）100L种子罐培养：装入70L培养基，发酵罐内压力维持在0.02-0.03Mpa，温度为23-25℃，每12小时取样检测。

2.3.2 菌丝体干重测量：发酵终止后，将每个摇瓶中的全部培养液用干燥的脱脂棉过滤，用蒸馏水多次冲洗后，放于60℃干燥箱内烘干至恒重，测定干重。

2.3.3还原糖测定：菲林法测定

2.3.4 pH值、DO值测定：5L发酵罐自动监测。

结果与分析

根据摇瓶试验结果，进行发酵罐生产试验，以摇瓶种子按照10%的接种量接种于发酵罐进行培养，对发酵过程的pH、DO值和菌丝体产量及还原糖的变化进行定时取样观测，取后５批数据得平均值，绘制发酵生长曲线。

2.4.1 发酵罐培养菌丝生长曲线

0-36h为榆黄菇液体菌种生长的适应期，36-96h处于增殖生长期，菌丝体生长量显著增加，还原糖下降迅速，其后则进入稳定生长期。发酵96-120h，菌丝体干重可达到14.4mg/mL。

在培养过程中，榆黄菇菌丝体不断生长，形成菌丝球，不断消耗培养基中营养成分，菌丝体干重不断升高，在96小时达到最大，此时生物量最高，培养物呈粘稠状。继续发酵培养，菌丝体开始衰老，发生自溶，生物量开始下降。根据曲线分析，发酵终点应确定在时间为 84～96h。因为此时菌丝生物量虽然不是最大，但由于这段期间的菌丝正处于生命力极为旺盛的对数生长期，接种后，有利于菌丝生长。

2.4.2发酵过程中pH值的变化曲线

5L发酵罐培养，自动记录得pH变化曲线如图7 。

榆黄菇培养基灭菌过程使pH下降约0.5，由摇瓶实验可知，最适起始pH为6，因而在灭菌前，将培养基的pH值调至6.5。由曲线可知，菌丝生长初期由于菌体产生的蛋白酶水解培养基中的蛋白胨而生成铵离子，使pH上升，随着菌体量的增加铵离子的利用，以及葡萄糖利用过程中的有机酸的积累使pH下降，进入对数生长期降至最低点，随着基质的耗尽，菌体蛋白酶活性的增加，培养基中氨基氮增加，致使pH值又上升，此时菌丝趋于自容而代谢活动终止。由此可见，在适宜菌丝生长的环境下，菌丝本身具有一定调节pH值的能力，而使pH处于适宜状态。但是当外界条件变化过于剧烈如培养基的碳氮比、消泡油的加入量等不适宜，菌体就会失去调节pH的能力，培养基的pH 就会发生波动。pH 的变化会引起各种酶活力的改变，影响菌体的生长和产物的合成。因此通过发酵过程的pH变化曲线的观察，判断菌体是否处于适宜的生长环境，同时也表明在适合于菌丝生长的条件下无须在发酵过程中对发酵液的pH值进行控制。从而使液体菌种的培养可在简易发酵罐中进行。

2.4.3发酵过程中DO值的变化曲线

由图8看出，菌体生长初期，菌球密度耗氧少，溶氧值下降缓慢，随着菌球密度的增加，菌丝生长的需氧量也逐渐增大，溶氧值迅速下降，进入对数生长期DO值出现低谷。到发酵后期，由于菌体老化自溶，代谢速率降低，氧耗量减少，DO值又开始升高。了解菌体生长过程中溶氧变化的规律，一方面通过对溶氧变化的分析，在接近DO值低谷时期可以通过提高搅拌速度或加大通气量增加溶氧，使菌体生长所需溶氧量不低于其临界值。另一方面，溶氧可作为发酵异常的指标，当发酵中污染好气性杂菌时，溶氧会在较短时间内（2-5小时）跌到零附近，跌零后长时间不回升。溶氧浓度只是发酵参数之一，搅拌的程度，菌丝形态，泡沫的形成，二氧化碳的排除等都是影响发酵的因素。要综合考虑，通过溶氧参数的监测，摸索发酵中溶氧的变化规律以改变设备及工艺条件，达到控制生产的效果还需进一步实践。

附图说明

图1 初始pH对榆黄菇菌丝体干重和菌球密度的影响图；

图2 培养温度对榆黄菇菌丝体干重和菌球密度的影响图；

图3 不同接种量对榆黄菇菌丝体干重和菌球密度的影响图；

图4 培养时间对菌丝体干重和菌球密度的影响图；

图5 5L发酵罐发酵生长曲线图；

图6 100L种子罐发酵生长曲线图；

图7 pH变化曲线图；

图8 发酵时间与DO值的关系图。

Claims

1.一种榆黄菇液体菌种及优质高产的方法，其特征在于适合榆黄菇菌丝体生长的氮源为酵母膏、麸皮和蛋白胨；以葡萄糖和玉米粉、蔗糖作为碳源时菌丝体生长最好；不同无机盐处理的菌球大小排列顺序为：KH₂PO₄〈MgSO₄〈KCl〈NaCl。

2..如权利要求1所述的一种榆黄菇液体菌种及优质高产的方法，其特征在于最适液体培养基：土豆20% 、葡萄糖2%、玉米粉1%、酵母膏0.2%、麦麸1.5%、MgSO₄0.1%、KH₂PO₄0.2%。