CN102432359A - 一种培养真姬菇液体菌种的液体培养基及液体菌种的制备和栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种培养真姬菇液体菌种的液体培养基为红糖2％、蛋白胨0.2％、可溶性淀粉0.3％、马铃薯20％、pH自然、KH₂PO₄0.2％，MgSO₄0.1％，VB₁10mg/L。还公开了液体菌种的制备和栽培方法。本发明的培养基配方生产出来的菌球直径小、生长均匀、活性强，适宜做生产用液体菌种。液体菌种的发菌时间只需22～26d，比固体菌种缩短了一半，可缩短栽培种培养时间10～15d。能有效减少培养时间、降低生产成本。此外培养时间缩短，能降低污染概率。

Description

一种培养真姬菇液体菌种的液体培养基及液体菌种的制备和栽培方法

技术领域

本发明涉及一种培养真姬菇液体菌种的液体培养基及液体菌种的制备和栽培方法，属于食用菌的技术领域。

背景技术

真姬菇〔Hypsizigus marmoreus〕叉名玉蕈、斑玉蕈、蟹味菇、海鲜菇，在分类学上属于担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，白蘑科，玉蕈属，是一种极具发展前景的珍稀食用菌。真姬菇口感极佳，据分析，其可食部分含水92.5％，蛋白质21.1％，脂肪0.3％、糖3.7％、纤维0.7％、灰分0.7％，其提取物具有清除人体内自由基的作用，经常食用具有提高人体免疫力、预防衰老、延长寿命的功效，是一种高蛋白低热量低脂肪的现代保健食品近年来深受消费者青睐。由于食用菌深层培养可以在短时间内获得大量菌丝体及其发酵产物，而且具有周期短、产量高、成本低、工艺设备简单等优点，因此在食用菌生产中具有广泛的应用前景。目前真姬菇栽培菌种大多采用固体菌种，笔者通过摇瓶培养，探寻真姬菇液体菌种培养的条件和可行性，以期为工厂化生产真姬菇液体菌种提供理论依据。

发明内容

本发明就是为了解决上述问题，克服固体菌种的发菌时间长(需44～52d)，固体菌种栽培时间长的问题，提供一种真姬菇菌种液体培养基和制备方法及发酵液体菌种的栽培。该发明适用于真姬菇的工厂化生产。

本发明所需要解决的技术问题，可以通过以下技术方案来实现：

作为本发明的第一方面，一种培养真姬菇液体菌种的液体培养基，包括培养液体菌种的一级摇瓶培养基和二级摇瓶培养基；

所述一级摇瓶培养基包括：百分比为重量百分比，碳源2％、氮源0.2％，马铃薯20％、KH₂PO₄O.2％，MgSO₄0.1％，VB₁10mg/L，余量为水；

二级摇瓶培养基包括：马铃薯20％，麦麸滤液3％，葡萄糖1％，红糖1％，酵母粉0.25％，KH₂PO₄0.2％，MgSO₄0.1％，VB₁10mg/L，余量为水。

其中，所述麦麸滤液3％为取3克麸皮，置于装有100毫升水的三角瓶中，摇匀后，制得3％的麦麸滤液。

作为本发明的第二方面，一种液体菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)斜面菌种的活化：将斜面菌种接种于PDA培养基平板上，于22℃恒温培养15d，作为一级菌种；

(2)液体菌种制作与培养：将配制好的一级摇瓶培养基分装于250ml三角瓶中，每三角瓶装量120-130ml，在121℃压力下灭菌30分钟冷却；在无菌条件下挑取生长旺盛无污染一级菌种，该一级菌种用5mm直径打孔器切成小圆片，接种于一级摇瓶培养基中，每三角瓶接种5片，振荡培养；

(3)液体发酵：将配制好的二级摇瓶培养基分装于750ml培养瓶中，每培养瓶装量500ml，在121℃压力下灭菌30分钟冷却；接种已培养好液体菌种，接种量以重量百分比计，为培养基的10％；搅拌培养，制成菌丝体。

步骤(2)中，所述振荡培养为置于25℃，150r/min的回转式摇床培养多少时间制成液体菌种。

步骤(3)中，所述搅拌培养为置于恒温磁力搅拌器中22℃、120r/min下培养3-7d，制成菌丝体，菌丝体为球状，亦称为菌球。

进一步，所述搅拌培养为7d。

所述步骤(2)中，在250ml三角瓶装量120ml为适宜装液量。

作为本发明的第三发明，一种液体菌种的栽培方法，包括以下步骤，按照重量百分比计：

(1)栽种培养基原料的制备：

准备栽种培养基原料，所述原料由木屑20％，玉米芯35％，米糠26％，麸皮14％，玉米粉5％组成；

(2)栽种培养基的制备：

然后添加水分至原料含水量65％；搅拌30min，用750ml聚丙烯塑料瓶装瓶，每瓶湿料装瓶620～650g，在1.47×10⁵Pa下灭菌3.5h；

(3)接种：

每瓶接液体菌种30ml，再接种真姬菇的固体菌种原种。

进一步，所述固体菌种为斜面菌种。

进一步，所述固体菌种为一级菌种。

进一步，液体菌种的发菌时间为22～26d。

进一步，液体菌种接种后搔菌最适菌龄为65～70d。

本发明的有益效果：

本发明的培养基配方生产出来的菌球直径小、生长均匀、活性强，量较多，适宜做生产用液体菌种。

液体菌种的发菌时间只需22～26d，比固体菌种缩短了一半。此外，由于液体菌种菌丝满瓶时间短，相应地延长了菌丝后熟时间，因此可缩短栽培种培养时间10～15d。能有效减少培养时间、降低生产成本，能降低污染概率。

附图说明

以下结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明。

图1为真姬菇液体菌种培养生长曲线图。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体图示，进一步阐述本发明。

实施例本发明除非特别说明一般％指重量百分比。

1材料与方法

1.1供试菌种真姬菇〔Hypsizigus marmoreus〕菌种由上海丰科生物科技股份有限公司提供。

1.2供试培养基

1.2.1种子培养基PDA培养基。

1.2.2一级摇瓶培养基主要由各种碳氮源组成(具体见正交实验的表1和表2)，按照重量百分比，碳源2％、氮源0.2％，马铃薯20％、KH₂PO₄0.2％，MgSO₄0.1％，VB₁10mg/L，余量为水；

1.2.3二级摇瓶培养基马铃薯20％，麦麸滤液3％，葡萄糖1％，红糖1％，酵母粉0.25％，KH₂PO₄0.2％，MgSO₄0.1％，VB₁10mg/L，余量为水。

其中，麦麸滤液3％为取3克麸皮，置于装有100毫升水的三角瓶中，摇匀后，制得3％的麦麸滤液。

1.2.4栽种培养基：木屑20％，玉米芯35％，米糠26％，麸皮14％，玉米粉5％。备料，添加水分至含水量65％。

1.3实验方法

试验依次对配方、培养时间、培养基装量进行实验，每次优化实验结果进入下一试验中。

1.3.1斜面菌种的活化：将斜面菌种接种于PDA培养基平板上，于22℃恒温培养15d，作为下一步培养的一级菌种。

1.3.2液体菌种制作与培养：试验时将配制好的一级摇瓶培养基分装于250ml三角瓶中，每瓶装量130ml，在121℃压力下灭菌30分钟冷却；在无菌条件下挑取生长旺盛无污染一级菌种，该一级菌种用5mm直径打孔器切成小圆片，接种于一级摇瓶培养基中，每三角瓶接种5片，置于25℃，150r/min的回转式摇床培养22-26d制成液体菌种。

1.3.2液体发酵：试验时将配制好的二级摇瓶培养基分装于750ml培养瓶中，每培养瓶装量500ml，在121℃压力下灭菌30分钟冷却，接种已培养好液体菌种，接种量10％(本实施例为50ml)，置于恒温磁力搅拌器中22℃、120r/min下培养3d，制成菌丝体，菌丝体为球状，亦称为菌球。

1.3.3菌丝体生物量及菌球直径的测定。

1.3.3.1菌球直径：随机取二级摇瓶培养基中10个菌丝球，在培养皿中排成一列，测其总长度，求平均值，每次处理重复3次。

1.3.3.2菌球干重：取发酵结束后二级摇瓶培养基，以3000r/min离心10min，收集菌丝体，于80℃下烘至恒重，用电子天平称量。

1.3.4碳氮源最佳配方正交试验：

碳氮源选择蔗糖、红糖、葡萄糖、麸皮、酵母膏、蛋白胨、可溶性淀粉、黄豆粉、玉米粉等作为碳氮源，以碳源2％、氮源0.2％，另加马铃薯20％、KH₂PO₄0.2％，MgSO₄0.1％，VB₁10mg/L。采用正交实验确定最佳配方，实验因素与水平见下表：

表1正交实验因素与水平表

1.3.5培养时间试验：按1.3.2条件培养10d，分别于1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d、8d、9d、10d结束培养，取培养液以3000r/min离心20min，收集菌丝体，测量菌丝体干重。

1.3.6培养基装量试验：250mL三角瓶装液量分别为70mL、90mL、120mL、150mL和180mL，测定不同装液量对菌丝体生物量和菌球直径的影响。

1.3.7栽培试验：按照栽种培养基配方：木屑20％，玉米芯35％，米糠26％，麸皮14％，玉米粉5％。备料后添加水分至原料含水量65％；搅拌30min，用750ml聚丙烯塑料瓶装瓶，每瓶湿料装瓶620～650g，在1.47×10⁵Pa下灭菌3.5h。每瓶接液体菌种30ml，再接种真姬菇的固体菌种。并设真姬菇固体菌种做对照。

固体菌种为斜面菌种或一级菌种。

一级菌种用5mm直径打孔器切成小圆片，接种于一级摇瓶培养基中，每三角瓶接种5片.

2.结果与分析

2.1最佳配方正交试验结果

实验结果见表2。从极差分析中可以看出，真姬菇能利用各种碳氮源，各因素对真姬菇菌丝体干重的影响程度从大到小依次为A＞B＞C，最佳组合为A₂B₃C₁：即液体发酵培养基的最适碳氮源为红糖、蛋白胨、可溶性。

表2正交实验结果

2.2培养时间试验

图1为真姬菇液体菌种培养生长曲线图1，由图1所示，适应期为1～4d，指数期为4～7d，稳定期为7～10d，指数期微生物的各项生理指标均优于其他时期，同时微生物含量达到最适宜时期。因而种龄为7d的菌球培养生物量及活性明显优于其他种龄。因此，在此培养条件下，用作液体菌种的最佳种龄为7d。

2.3培养基装量实验

表3不同培养基装量与实验结果

由表3可知，随着培养基装量的增加，培养后菌丝体干重依次增加，但当装液量超过120ml时增长趋势有所下滑。同时在装液量为180ml时菌丝球个体数量较少但直径较大，因此重量未出现下降。个别配方在90ml时也出现类似情况。推测原因为装液量增大，使单位体积通气量减少，致使菌丝球数量降低同时直径增大，因而干重未出现减低。因此250ml三角瓶装量120ml为适宜装液量。

2.4栽培试验

表4不同菌龄与实验结果

真姬菇液体菌种接入栽培种培养基后，不仅发菌速度显著优于传统菌种，而且出菇正常。实验组22～26d发满，对照组30～35d发满。但两者的生物转化率差异不显著，单产分别为蟹味菇172.93g/瓶、对照169.50g/瓶。不同菌龄单产如表4，在60d、65d菌龄试验中搔菌后较多培养瓶出现隆起，吐黄水，现蕾少或者不现蕾情况。因此可得出，液体菌种接种后搔菌最适菌龄为65～70d。

3.讨论

3.1从实验结果看，真姬菇液体发酵对氮源需求量较大，可溶性淀粉，玉米粉、黄豆粉对菌丝体生物量的影响依次为可溶性淀粉＞玉米粉＞黄豆粉，原因可能为淀粉加热糊化后，增加了培养黏度有利于菌球的形成，使菌丝球个体不至于过大。真姬菇液体发酵适宜培养基为红糖2％、蛋白胨0.2％、可溶性淀粉0.3％、马铃薯20％、KH₂PO₄0.2％，MgSO₄0.1％，VB₁10mg/L。

3.2配方实验实验表明，采用适宜的培养基及合适的培养条件能使培养基产出的菌球大小适中、活性较强、数量较多。

3.3培养条件实验表明，①培养基PH自然，250ml三角瓶装液量120ml，25℃，150r/min回转式摇床培养7d。②培养基PH自然，750ml培养瓶装量500ml，接种量10％，22℃、120r/min下培养3d。能获得适宜生产用真姬菇液体菌种。

3.4栽培试验表明

液体菌种的发菌时间只需22～26d，比固体菌种缩短了一半，这是因为液体种子菌丝球个体小能渗透到培养料内部，使培养料表面和内部多面同时发菌，加快了菌丝生长速度。此外，由于液体菌种菌丝满瓶时间短，相应地延长了菌丝后熟时间，因此可缩短栽培种培养时间10～15d。能有效减少培养时间、降低生产成本。此外培养时间缩短，能降低污染概率，某种意义上这也降低了生产成本。

3.5实验分析讨论

液体菌种栽培相对于传统实验能有效缩短培养时间，同时产量维持不变。这样能从多方面降低生产成本，极具发展前景。但是由于液体菌种生产需要购置发酵生产设备，本实验仅接种液体菌种污染率较高，必须使用二次接种即在接种液体菌种后仍需接种固体原种，接种设备需再投资，因此一次投资成本相对普通菌种较高，但从长远考虑仍优于普通栽培方式。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (11)

1.一种培养真姬菇液体菌种的液体培养基，包括培养液体菌种的一级摇瓶培养基和二级摇瓶培养基；

所述一级摇瓶培养基包括：百分比为重量百分比，碳源2％、氮源0.2％，马铃薯20％、KH₂PO₄0.2％，MgSO₄0.1％，VB₁10mg/L，余量为水；

二级摇瓶培养基包括：马铃薯20％，麦麸滤液3％，葡萄糖1％，红糖1％，酵母粉0.25％，KH₂PO₄0.2％，MgSO₄0.1％，VB₁10mg/L，余量为水。

2.根据权利要求1所述的一种用于真姬菇菌种的液体培养基，其特征在于，所述麦麸滤液3％，为取3克麸皮，置于装有100毫升水的三角瓶中，摇匀后，制得3％的麦麸滤液。

3.一种如权利要求1所述的液体菌种的制备方法，包括以下步骤：

(1)斜面菌种的活化：将斜面菌种接种于PDA培养基平板上，于22℃恒温培养15d，作为一级菌种；

(2)液体菌种制作与培养：将配制好的一级摇瓶培养基分装于250ml三角瓶中，每三角瓶装量120-130ml，在121℃压力下灭菌30分钟冷却；在无菌条件下挑取生长旺盛无污染一级菌种，该一级菌种用5mm直径打孔器切成小圆片，接种于一级摇瓶培养基中，每三角瓶接种5片，振荡培养；

(3)液体发酵：将配制好的二级摇瓶培养基分装于750ml培养瓶中，每培养瓶装量500ml，在121℃压力下灭菌30分钟冷却；接种已培养好液体菌种，接种量以重量百分比计，为培养基的10％；搅拌培养，制成菌丝体。

4.根据权利要求3所述的液体菌种的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述振荡培养为置于25℃，150r/min的回转式摇床培养22-26d制成液体菌种。

5.根据权利要求3所述的液体菌种的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述搅拌培养为置于恒温磁力搅拌器中22℃、120r/min下培养3-7d，制成菌丝体。

6.根据权利要求5所述的液体菌种的制备方法，其特征在于，所述搅拌培养为7d。

7.一种如权利要求3所述的液体菌种的栽培方法，包括以下步骤，按照重量百分比计：

(1)栽种培养基原料的制备：

准备栽种培养基原料，所述原料由木屑20％，玉米芯35％，米糠26％，麸皮14％，玉米粉5％组成；

(2)栽种培养基的制备：

然后添加水分至原料含水量65％；搅拌30min，用750ml聚丙烯塑料瓶装瓶，每瓶湿料装瓶620～650g，在1.47×10⁵Pa下灭菌3.5h；

(3)接种：

每瓶接液体菌种30ml，再接种真姬菇的固体菌种原种。

8.根据权利要求7所述的液体菌种的栽培方法，其特征在于，所述固体菌种为斜面菌种。

9.根据权利要求7所述的液体菌种的栽培方法，其特征在于，所述固体菌种为一级菌种。

10.根据权利要求7所述的液体菌种的栽培方法，其特征在于，所述栽培方法还包括，液体菌种的发菌时间为22～26d。

11.根据权利要求7所述的液体菌种的栽培方法，其特征在于，所述栽培方法还包括，液体菌种接种后搔菌最适菌龄为65～70d。

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