CN103798056B - 一种天麻种子萌发菌的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种天麻种子萌发菌的生产方法。其特征在于：采用液体深层发酵工艺生产天麻种子萌发菌栽培种，生产工艺分六个步骤：（1）萌发菌菌种分离；（2）母种的制备；（3）液体种子菌的制备；（4）液体深层发酵生产；（5）栽培种培养基的制备；（6）接种培养。本发明的方法缩短了栽培种的生产周期，提高了栽培种的成品率，同时提供了天麻种子萌发菌的各种培养基，解决了萌发菌菌种质量不一、生长缓慢的问题，实现了天麻种子萌发菌的大规模工厂化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种微生物技术领域，具体来说是一种天麻种子萌发菌的生产方法。
背景技术
天麻(Gastrodia elata Blume)为名贵的传统中药，属兰科(Orchidaceae)多年生共生草本植物，无根无绿色叶片，不能进行光合作用营自养生活。天麻种子细小如粉尘，无胚乳及其他营养贮备，无外源营养供给，种子不能发芽，必需依靠萌发菌侵染后才能正常发芽，其后的生长又需要蜜环菌菌索的侵入提供营养才能继续生长完成其生活史。不同萌发菌所提供的营养对天麻种子萌发和种子发芽后形成的原球茎生长均有较大影响，因此生产优良的萌发菌栽培种，是天麻有性繁殖栽培成败的关键所在，对提高天麻种植过程中种子发芽率和天麻产量都有十分重要影响。
发明内容
本发明的目的在于通过改变天麻种子萌发菌生产工艺，缩短了萌发菌栽培种生产周期，实现了生产与种植环节的有效对接，解决萌发菌栽培种生长慢、成品率低、质量差的问题，提供一种可工厂化生产优质萌发菌栽培种的方法。
本发明所采取的技术方案：在野外采集萌发菌菌源分离纯化筛选后，制备斜面母种和液体种子菌，将种子菌碎化后进行液体发酵培养得到大量菌丝体，接种至栽培袋中。
实现本发明的具体步骤如下。
（1）菌种分离：在云南彝良小草坝乌天麻主产区，采集萌发菌菌源分离纯化筛选得到萌发菌菌株。
（2）母种的制备：配制试管斜面培养基，将萌发菌菌种接种于试管斜面培养基上，放入培养箱，25℃培养至菌丝长满培养基。每升试管斜面培养基包含以下成分：马铃薯100-300g、葡萄糖10-30g、玉米粉1-5g、磷酸氢二钾0.1-2g、磷酸二氢钾0.1-5g、硫酸镁0.1-5g、维生素10mg、琼脂10-30g、pH值5.5-8。
（3）液体种子菌的制备：熬制液体种子培养基后分装至1L的三角瓶中，湿热灭菌后冷却备用。在无菌操作台上接种萌发菌菌种块，置于25℃恒温摇床上培养4-8天，转速120r/min。每升液体种子培养基主要成分为：马铃薯100-300g、壳斗科树木的落叶10-50g、葡萄糖10-30g、麦麸5-30g、玉米粉0-10g、磷酸二氢钾0.1-10g、硫酸镁0.1-5g、pH值5.5-8。
（4）液体深层发酵生产：液体发酵可以采用一级或分级进行扩繁生产。配制液体发酵培养液装入发酵罐中，灭菌冷却后，接种碎化后的液体种子菌，同时加入青霉素0.96-1.92g。液体发酵培养液的主要成分为：马铃薯50-200g/L、红糖5-20g/L、葡萄糖5-30g/L、玉米粉1-30g/L、麦麸10-60g/L、蛋白胨1-4g/L、磷酸二氢钾0.5-4g/L、硫酸镁0.25-3g/L、维生素10mg/L、pH值5.5-8。发酵条件为：培养温度24-27℃，罐压0.02-0.04Pa，通气量1:0.3-0.5v/v.m,培养时间72-96h培养液变粘稠。
（5）栽培种培养基的准备：将基质按配比树叶40-80%、玉米秸秆粉0-20%、木屑8-35%、麦麸5-20%、石灰1-2%混合均匀pH值5.5-7，装入聚丙烯袋中，封口后121℃高压灭菌。
（6）接种培养：发酵罐中培养液较粘稠时，在无菌环境下用接种枪将培养液接种至栽培种培养基上，接种量为10-20mL，25℃培养30-45天后菌丝长满即可使用。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，但实施例并不是对本发明的限定。
实施例一
1．菌种分离：在在云南彝良小草坝乌天麻主产区，采集萌发菌菌源分离纯化筛选得到萌发菌菌株，菌株编号HL-001，菌种保藏号：CGMCC No.6759，分类命名：小菇Mycenasp.,保藏时间：2012年11月05日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。
2．母种的制备：配制试管斜面培养基，将萌发菌菌种接种于试管斜面培养基上，放入培养箱，25℃培养至菌丝长满培养基。每升试管斜面培养基包含以下成分：马铃薯200g、葡萄糖15g、玉米粉2g、磷酸氢二钾1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.5g、维生素10mg、琼脂15g、pH值7。
3．液体种子菌的制备：熬制液体种子培养基后分装至1L的三角瓶中，每瓶分装400mL，湿热灭菌后冷却备用。在无菌操作台上接种萌发菌菌种块，置于25℃恒温摇床上培养5天，转速120r/min。每升液体种子培养基主要成分为：马铃薯200g、壳斗科树木的落叶20g、葡萄糖18g、麦麸15g、玉米粉5g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁1g、pH值7。
4．液体深层发酵生产：配制液体发酵培养液装入发酵罐中，灭菌冷却后，接种碎化后的液体种子菌，同时加入青霉素0.96g。液体发酵培养液的主要成分为：马铃薯100g/L、红糖20g/L、葡萄糖20g/L、玉米粉5 g/L、麦麸20g/L、蛋白胨4g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁1g/L、维生素10mg/L、pH值6.5。发酵条件为：培养温度25℃，罐压0.02MPa，通气量1:0.4v/v.m,培养时间96h培养液变粘稠。
5．栽培种培养基的准备：将基质按配比树叶75%、玉米秸秆粉5%、木屑15%、麦麸5%、石灰1%混合均匀，pH值5.5-7，装入大小为30×15×0.05c的聚丙烯袋中，封口后121℃高压灭菌。
6．接种培养：发酵罐中蜜环菌培养液较粘稠时，在无菌环境下用接种枪将培养液接种至栽培种培养基上，接种量为20mL，25℃培养40天后菌丝长满。栽培种成品率达到98%，栽培昭通乌天麻后种子萌发率达到85%以上。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种液体深层发酵生产天麻种子萌发菌的方法，其特征在于包括以下六个步骤：（1）萌发菌菌种分离；（2）母种的制备；（3）液体种子菌的制备；（4）液体深层发酵生产；（5）栽培种培养基的制备 ；（6）接种培养；
所述的母种制备的母种培养基包含以下成分，马铃薯100-300g/L、葡萄糖 10-30g/L、玉米粉1-5g/L、磷酸氢二钾0.1-2g/L、磷酸二氢钾0.1-5g/ L、硫酸镁0.1-5g/L、维生素10mg/L、琼脂10-30g/L、pH值5.5-8。
2.根据权利要求 1 所述的液体深层发酵生产天麻种子萌发菌的方法，其特征在于：萌发菌菌种分离源来自云南彝良小草坝乌天麻主产区野生天麻种子萌发形成的原球茎。
3.根据权利要求 1 所述的液体深层发酵生产天麻种子萌发菌的方法，其特征在于：液体种子菌培养基包含以下成分， 马铃薯 100-300g/L、壳斗科树木的落叶 10-50g/L、葡萄糖 10-30g/L、麦麸 5-30g/L、玉米粉 0-10g/L、磷酸二氢钾 0.1-10g/L、硫酸镁 0.1-5g/L、pH 值 5.5-8。
4.根据权利要求 1 所述的液体深层发酵生产天麻种子萌发菌的方法，其特征在于：液体发酵培养液的主要成分为马铃薯50-200g/L、红糖5-20g/L、葡萄糖5-30g/L、麦麸10-60g/L、蛋白胨1-4g/L、磷酸 二氢钾 0.5-4g/L、硫酸镁 0.25-3g/L、维生素 10mg/L、pH 值 5.5-8。
5.根据权利要求 1 所述的液体深层发酵生产天麻种子萌发菌的方法，其特征在于：栽培种培养基的主要成分配比 为树叶 40-80%、玉米秸秆粉 0-20%、木屑 8-35%、麦麸 5-20%、石灰 1-2%，pH 值 5.5-7。
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