CN103798055A

CN103798055A - 一种液体深层发酵生产天麻伴生蜜环菌的方法

Info

Publication number: CN103798055A
Application number: CN201310198019.7A
Authority: CN
Inventors: 不公告发明人
Original assignee: Individual
Current assignee: Peng Jiahua
Priority date: 2013-05-26
Filing date: 2013-05-26
Publication date: 2014-05-21

Abstract

本发明涉及一种液体深层发酵生产天麻伴生蜜环菌的方法。其特征在于：天麻伴生蜜环菌液体深层发酵生产工艺分五个步骤：（1）蜜环菌菌种分离；（2）蜜环菌母种培养；（3）固体种子菌的制备；（4）进行液体发酵培养；（5）蜜环菌栽培种接种、培养。本发明的方法提供了蜜环菌的各种培养基，解决了蜜环菌菌种迅速退化生长缓慢、菌丝体产量低、菌种大小质量不一的问题，该生产工艺与传统固体发酵相比，大大缩短了蜜环菌栽培种成品的生长周期，同时提高了成品率，实现了天麻伴生优质蜜环菌的大规模工厂化生产。

Description

一种液体深层发酵生产天麻伴生蜜环菌的方法

技术领域

本发明涉及一种微生物技术领域，具体来说是一种液体深层发酵生产天麻伴生蜜环菌栽培种的方法。

背景技术

天麻Gastrodia elsta Bl.属兰科(Orchidaceae)，没有根和绿叶，不能进行光合作用，是异养型植物。天麻完成生活史的全过程是靠两种或两种以上的真菌供给营养，天麻种子萌发靠紫萁小菇等种子萌发菌供给营养，发芽后的原球茎靠同化蜜环菌才能正常生长。蜜环菌在生长过程中能够产生菌索，菌索能够从其提供营养物质的基物中伸出，并进入到另一个不支持其生长的基物中生长，蜜环菌的生长特性对天麻的产量和品质具有很大影响。为了保证乌天麻栽培的质量和产量，需要筛选出优势蜜环菌，优化蜜环菌的扩繁条件用于工厂化生产和推广。

蜜环菌栽培种生产方式有固体发酵和液体发酵两种。液体发酵技术存在以下优点：一、生长周期短，传统固体发酵生产蜜环菌栽培种至少需要4个月，而使用液体发酵技术可以缩短2个月时间；二、生产用菌种成本低，栽培种生长均匀、速度快；三、提高了栽培种的成品率，有利于大规模工厂化生产。随着液体发酵技术的不断进步和完善，其应用已经越来越广泛，但在蜜环菌发酵上存在在一些问题：一、菌种迅速退化生长缓慢；二、在需要大量扩繁菌丝体时，产量低；三、液体种子菌质量不一、菌种大小不均匀。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，通过优化天麻伴生蜜环菌液体深层发酵工艺各环节的培养基条件，解决了蜜环菌菌种迅速退化生长缓慢、菌丝体产量低、菌种大小质量不一的问题，提供一种可工厂化生产优质蜜环菌栽培种的方法。

本发明所采取的技术方案：在野外采集蜜环菌菌源分离纯化后，制备斜面母种和固体种子菌，将固体种子菌碎化后进行液体发酵培养得到大量菌丝体，接种至栽培瓶中。

实现本发明的具体步骤如下。

（1）蜜环菌菌种分离：在云南彝良小草坝乌天麻主产区，采集野生天麻生长周围的蜜环菌菌索进行分离纯化，菌株编号MHL-001，菌种保藏号：CGMCC No.6758。

（2）蜜环菌母种培养：配制试管斜面培养基，每升培养基包含以下成分：马铃薯100-300g、葡萄糖10-30g、麦麸5-30g、KH₂PO₄0.1-10g、MgSO₄0.1-5g、维生素10mg、琼脂10-30g、pH值5.5-8。将分离纯化后的蜜环菌菌种接种于试管斜面培养基上，放入培养箱，25℃培养至菌索长满培养基得到蜜环菌母种。

（3）固体种子菌的制备：阔叶树锯木屑和麦麸通过60目筛后，按配比混合均匀、装瓶、灭菌、冷却、接种蜜环菌母种，放入培养箱，25℃培养至蜜环菌长满。固体种子菌培养基配方重量比组分为：阔叶树锯木屑50-90%、麦麸5-30%、玉米粉0.1-15%、葡萄糖0.5-5%、KH₂PO₄0.05-0.5%、MgSO₄0.05-0.5%、石膏1-2%、pH值为6.5-7.5。

（4）液体发酵生产：液体发酵可以采用一级或分级进行扩繁生产。配制液体发酵培养液装入发酵罐中，灭菌冷却后，接种碎化后的固体种子菌，同时加入青霉素0.96-1.92g。液体发酵培养液的主要成分为：土豆50-200g/L、红糖5-20g/L、葡萄糖5-40g/L、麦麸10-60g/L、蛋白胨1-4g/L、胡萝卜0.5-2g/L、酵母膏1-4g/L、磷酸二氢钾0.5-4g/L、硫酸镁0.25-3g/L、维生素10mg/L、乙醇5-30g/L、pH值5.5-8。发酵条件为：培养温度24-27℃，罐压0.02-0.04Pa，通气量1:0.3-0.5v/v.m,培养时间72-96h培养液变粘稠。

（5）接种培养：发酵罐中蜜环菌培养液较粘稠时，在无菌环境下用接种枪将培养液接种至栽培种培养基上，接种量为10-20mL，25℃培养30-60天后即可使用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，但实施例并不是对本发明的限定。

实施例一

1．蜜环菌菌种分离：在云南彝良小草坝乌天麻主产区，采集野生天麻生长周围的蜜环菌菌索进行分离纯化，菌株编号MHL-001，菌种保藏号：CGMCC No.6758，分类命名：蜜环菌Armillaria sp.,保藏时间：2012年11月05日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所。

2．蜜环菌母种培养：配制试管斜面培养基，每升培养基包含以下成分：马铃薯200g、葡萄糖18g、麦麸15g、KH₂PO₄2g、MgSO₄1g、维生素10mg、琼脂15g、pH值7。将分离纯化后的蜜环菌菌种接种于试管斜面培养基上，放入培养箱，25℃培养至菌索长满培养基得到蜜环菌母种。

3．固体种子菌的制备：阔叶树锯木屑和麦麸通过60目筛后，按配比混合均匀、装瓶、灭菌、冷却、接种蜜环菌母种，放入培养箱，25℃培养至蜜环菌长满。固体种子菌培养基配方重量比组分为：阔叶树锯木屑75%、麦麸18%、玉米粉4%、葡萄糖1.7%、KH₂PO₄0.2%、MgSO₄0.1%、石膏1%、pH值为6.5-7.5。

4．液体发酵生产：配制液体发酵培养液装入发酵罐中，灭菌冷却后，接种碎化后的固体种子菌，同时加入青霉素1.44g。液体发酵培养液的主要成分为：土豆100g/L、红糖10g/L、葡萄糖20g/L、麦麸30g/L、蛋白胨2g/L、胡萝卜1g/L、酵母膏2g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸镁1g/L、维生素10mg/L、乙醇10g/L、pH值6-7。发酵条件为：培养温度25℃，罐压0.02MPa，通气量1:0.4v/v.m,培养时间96h培养液变粘稠。

5．接种培养：发酵罐中蜜环菌培养液较粘稠时，在无菌环境下用接种枪将培养液接种至栽培种培养基上，接种量为20mL，25℃培养30天后菌索长满菌种瓶，栽培昭通乌天麻后商品麻平均产量达4斤/穴。

以上所述仅为本发明的部分实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.本发明是一种液体深层发酵生产天麻伴生蜜环菌的方法，其特征在于包括以下五个步骤：（1）蜜环菌菌种分离；（2）蜜环菌母种培养；（3）固体种子菌的制备；（4）进行液体发酵培养；（5）蜜环菌栽培种接种、培养。

2.根据权利要求1所述的蜜环菌菌种分离，其特征在于：菌种分离源来自云南彝良小草坝乌天麻主产区野生天麻生长周围的蜜环菌菌索。

3.根据权利要求1所述的蜜环菌母种培养，其特征在于：母种培养基包含以下成分，马铃薯100-300g/L、葡萄糖10-30g/L、麦麸5-30g/L、KH₂PO₄0.1-10g/L、MgSO₄0.1-5g/L、维生素10mg/L、琼脂10-30g/L、pH值5.5-8。

4.根据权利要求1所述的固体种子菌，其特征在于：固体种子菌培养基配方重量比组分为阔叶树锯木屑50-90%、麦麸5-30%、玉米粉0.1-15%、葡萄糖0.5-5%、KH₂PO₄0.05-0.5%、MgSO₄0.05-0.5%、石膏1-2%、pH值为6.5-7.5。

5.根据权利要求1所述的液体发酵培养，其特征在于：液体发酵培养液的主要成分为土豆50-200g/L、红糖5-20g/L、葡萄糖5-40g/L、麦麸10-60g/L、蛋白胨1-4g/L、胡萝卜0.5-2g/L、酵母膏1-4g/L、磷酸二氢钾0.5-4g/L、硫酸镁0.25-3g/L、维生素10mg/L、乙醇5-30g/L、pH值5.5-8。