CN103114063B - 一种岩藻聚糖硫酸酯酶的生产菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种岩藻聚糖硫酸酯酶的生产菌株，所述的菌株的保藏编号为CGMCC No.7089。本发明筛选的菌可用于降解岩藻聚糖硫酸酯。本发明筛选的具有岩藻聚糖硫酸酯酶生产能力的细菌，该菌株产酶活力高，达到230U/mL，具有在工业生产中的应用价值。

Description

一种岩藻聚糖硫酸酯酶的生产菌株及其应用

技术领域

本发明属于海洋微生物技术领域，具体涉及一种岩藻聚糖硫酸酯酶的生产菌株及其应用。

背景技术

岩藻聚糖硫酸酯（Fucoidan）是广泛存在于褐藻中的一种高分子量的硫酸杂多糖，主要由L-岩藻糖及硫酸酯基团组成，另外还含有半乳糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、鼠李糖、糖醛酸等。研究发现它具有多种生理活性，包括抗凝血、抗肿瘤、抗炎、抗血栓、提高免疫力、抗氧化、抗感染等，因此岩藻聚糖硫酸酯成为当今天然海洋活性物质的主攻重点。但由于岩藻聚糖硫酸酯的分子量巨大，从几万到几十万都有，严重影响了它的吸收效率，同时岩藻聚糖硫酸酯通常具有一定的粘性，也大大阻碍了它作为药物的应用。将大分子量的岩藻聚糖硫酸酯降解为小分子量的低聚糖，可以解决上述的应用难题，同时也是目前进行岩藻聚糖硫酸酯构效研究的重要手段。目前，降解岩藻聚糖硫酸酯的方法主要有化学降解法、物理降解法和酶降解法。化学降解法是非特异性降解，反应条件苛刻，水解较难控制，而且产物转化率低，功能性低。物理降解法虽然操作简单可控性好，但其降解效率普遍较低，很难得到符合一定分子量范围的产品。最好的方法就是酶解法，可以特异性地、选择性地切断岩藻聚糖链，反应过程容易控制，易于得到所需分子量范围的低聚糖产品，产物含量高，功能性强。

目前，国内外关于岩藻聚糖硫酸酯酶已有一些报道，但是商品化的酶制剂十分紧缺。主要由于产酶微生物的产酶能力满足不了商业化的要求，因此，寻找酶的高产菌株是解决岩藻聚糖硫酸酯应用问题的重要途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种岩藻聚糖硫酸酯酶的生产菌及其应用，本发明提供的菌能够高效的生产岩藻聚糖硫酸酯酶，从而有效降解岩藻聚糖硫酸酯，为岩藻聚糖硫酸酯的应用和构效研究提供了有效方法。

本发明筛选的岩藻聚糖硫酸酯酶生产菌LHD4（Algibacter sp.），已于2013年01月06日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.7089。

本发明筛选的菌可用于降解岩藻聚糖硫酸酯。

本发明的细菌LHD4的活菌用于制备菌液；所制得的菌液可以用于提取胞内酶，从而用于降解岩藻聚糖硫酸酯。

本发明所筛选的细菌用于制备岩藻聚糖硫酸酯酶。

本发明筛选的具有岩藻聚糖硫酸酯酶生产能力的细菌，该菌株产酶活力高，达到230U/mL，具有在工业生产中的应用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

一、菌株LHD4的筛选

对海带样品进行微生物富集、初筛、复筛，获得产酶菌。对产酶菌进行液体培养，提取胞内产物，获得岩藻聚糖硫酸酯酶。

具体技术方案如下：

（1）微生物富集培养：无菌条件下取适量海带样品，加入无菌海水捣碎，取样品2.5mL接入50mL富集培养基（Fucoidan0.2%，蛋白胨1%，硝酸铵1.6mg/mL，磷酸氢二钠8mg/mL，用过膜海水配制，pH自然。）进行培养，在25℃，150rpm的恒温培养摇床培养5天。培养结束后，取上述富集液2.5mL接入富集培养基重复富集两次。

（2）产酶微生物初筛：将富集培养液适当稀释后，涂布于选择性培养基（Fucoidan0.2%，蛋白胨0.2%，硝酸铵5mg/mL，琼脂2%，用过膜海水配制，pH自然）平板上，在25℃培养5天。将平板中所有形态不同的单菌落，进行纯化培养，再接入2216E琼脂斜面培养基，于25℃培养至长满斜面，置于4℃冰箱保存。

（3）产酶微生物复筛：将上述斜面菌种分别接种至15mL液体培养基（Fucoidan0.2%，蛋白胨1%，硝酸铵5mg/mL，用过膜海水配制，pH自然），于25℃，180rpm摇床培养，用次甲基蓝法测定Fucoidan含量。结果获得一株菌LHD4，培养48小时后岩藻聚糖硫酸酯含量下降最大，达到70%。

（4）产酶菌LHD4的形态、生理生化和分子生物学鉴定：将产酶菌划线接种于2216E琼脂平板，光学显微镜观察细菌形态和生理生化鉴定菌落特征为菌落呈深黄色，圆形隆起状，边缘整齐，有鞭毛，有运动性，细胞革兰氏染色阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，葡萄糖发酵产酸属发酵型，无盐条件下不生长，1%、3%、5%NaCl胨水刺激其生长，在海水中生长。16SrDNA分子生物学鉴定属于黄杆菌科（Flavobacteriaceae），Algibacter属，经过与黄杆菌科细菌RC2-3（保藏编号：CGMCC No.6932）的16SrDNA进行比对，二者相似度仅为89%，说明LHD4与RC2-3为不同属的细菌。菌株LHD4在2216E琼脂平板上25℃培养24h后，菌落呈深黄色，圆形隆起状，边缘整齐，有鞭毛，有运动性，细胞革兰氏染色阴性，接触酶阳性，氧化酶阳性，葡萄糖发酵产酸属发酵型，无盐条件下不生长，1%、3%、5%NaCl胨水刺激其生长，在海水中生长。该菌株已于2013年01月06日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.7089。

二、LHD4菌液的制备

将保藏编号为CGMCC No.7089的细菌LHD4接种于液体培养基（Fucoidan0.2%，牛肉膏1%，用过膜海水配制，pH自然）中，25℃、180rpm条件下培养12h，获得种子培养液，将种子培养液按10%接种量接种于新鲜的液体培养基，于25℃、150rpm条件下培养48h，即制得菌液。

三、LHD4胞内酶的信息

1、产酶菌LHD4胞内酶的制备

将LHD4的菌液于4℃、10000g离心5-10分钟，弃上清，取沉淀，用少量海水溶解沉淀，在冰浴保护下，500w条件进行超声波破碎细胞15min，于4℃离心10min，弃沉淀，上清液即为胞内酶。

2、LHD4产酶能力检测

取胞内酶与0.2%的Fucoidan（pH8.0、20mM的Tris-HCl溶解）等体积混合，于25°C、120rpm摇床振荡培养2小时，以Somogyi-Nelson法测定还原糖含量。1个酶活力单位定义为25°C、pH8.0条件下，每小时产生的1纳摩尔还原糖需要的酶量。经测定，菌株LHD4培养48h后的菌液产胞内酶活力达到230U/mL。

上述的实验结果表明，本发明筛选得到的产酶菌具有很高的产酶能力，所生成的酶能有效降解高分子量的岩藻聚糖硫酸酯，具有良好的市场推广前景。

Claims (4)

1.一种岩藻聚糖硫酸酯酶的生产菌株，其保藏编号为CGMCC No.7089。

2.权利要求1所述的岩藻聚糖硫酸酯酶的生产菌株在降解岩藻聚糖硫酸酯中的应用。

3.一种菌液，所述的菌液是用权利要求1所述的岩藻聚糖硫酸酯酶的生产菌株扩大培养制备的。

4.权利要求3所述菌液在制备用于降解岩藻聚糖硫酸酯的胞内酶中的应用。