CN108753642A - 一株产褐藻胶裂解酶菌株约氏黄杆菌 - Google Patents

一株产褐藻胶裂解酶菌株约氏黄杆菌 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产褐藻胶裂解酶的约氏黄杆菌，属于生物技术领域。本发明从土壤及河水样品中分离出约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)WX‑11，即约氏黄杆菌CGMCC No.14444，该菌株营养要求简单，发酵时间短，应用于褐藻胶裂解酶生产中可显著缩短生产周期，降低生产成本。本发明还公开了利用此菌种制备褐藻胶裂解酶及对含有褐藻酸盐的高粘原料的降粘处理。本发明提供的约氏黄杆菌WX‑11所产的褐藻胶裂解酶可降解海藻酸钠，生成具有生物活性的褐藻寡糖，可广泛应用于农业、食品、饲料添加、医药及海藻加工等领域。

Description

一株产褐藻胶裂解酶菌株约氏黄杆菌
技术领域
本发明涉及一株产褐藻胶裂解酶菌株约氏黄杆菌，属于生物技术领域。
背景技术
我国海洋资源丰富，是世界上海洋藻类养殖及加工利用规模最大的国家，海藻产量约占世界总产量的60％，超过了1300万吨。而这丰富的藻类中含有大量的褐藻胶等多糖及糖醇类物质，使得海藻加工及其高值化利用成为我国海洋资源综合利用的重要领域。
研究发现，褐藻胶降解产物褐藻寡糖具有多种生物活性，包括促生长作用、增强免疫力抗肿瘤活性、神经保护作用等，因此，褐藻胶降解产物中的功能性寡糖的开发在国际上已成为一个研究热点。在用于制备褐藻寡糖的方法中，酶解法相较于化学法和物理法具有反应条件温和，产物均一，特异性强，对环境无污染等优点。目前，褐藻胶裂解酶已成为酶法制备褐藻低聚糖的主要工具酶。这类工具酶除了可以制备褐藻寡糖，还在诸多方面都具有重要的研究价值和应用价值，如原生质体的制备，肺囊性纤维化的辅助治疗等。所以，对于褐藻胶裂解酶的挖掘有广阔的前景。
褐藻胶裂解酶是一类多糖裂解酶，通过β消去反应能够降解大分子褐藻胶生成低分子量的褐藻寡糖或单糖。褐藻胶裂解酶按照底物专一性可分为三类：①特异性降解古洛糖醛酸片段(Poly G)的1，4-α-古洛糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.11)；②特异性降解甘露糖醛酸片段(Poly M)的1，4-β-甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3)；③可以同时降解古洛糖醛酸片段和甘露糖醛酸片段的裂解酶。目前已报道的褐藻胶裂解酶主要是PM内切酶，少部分是PG内切酶和双功能酶，PM外切酶和PG外切酶报道很少。
目前已发现上百种微生物可产生褐藻胶裂解酶，这些微生物大部分来源于细菌，如固氮菌、棒杆菌、交替假单胞菌及黄杆菌等。已有几十种褐藻胶裂解酶的基因已通过基因工程的手段被外源表达。然而，现有的褐藻胶裂解酶普遍存在酶活力较低、酶稳定性较差、酶与产物结合紧密、分离困难等问题，这些缺点限制了褐藻胶裂解酶的推广应用。Sigma公司提供了一种褐藻胶裂解酶制剂产品A1603，但价格昂贵，这极大地限制了褐藻胶裂解酶及酶系在食品、医药、工农业等领域的广泛应用。所以，探索新型的酶制备生产技术，提高酶的产量，创新酶的应用模式已成为必要。
发明内容
本发明首先提供一种产褐藻胶裂解酶的来源，即：约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)，约氏黄杆菌的保藏编号为CGMCC No.14444。
本发明提供的约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)WX-11在以海藻酸钠为唯一碳源的筛选培养基上形成的菌落呈黄色，菌苔湿润，菌落圆型，光滑，透明或半透明，稍凸起；革兰染色呈阴性，菌体呈杆状或球杆状，无芽孢。
本发明还提供一种用于诱导上述约氏黄杆菌WX-11发酵产褐藻胶裂解酶的培养基，以海藻酸和/或海藻酸盐为碳源；所述海藻酸盐可以是海藻酸钠。
本发明还提供一种应用所述约氏黄杆菌WX-11产褐藻胶裂解酶的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)活化约氏黄杆菌WX-11；具体地，可以取约氏黄杆菌WX-11接种于固体培养基中，在25～30℃的条件下，培养24h，制得活化菌株；所述固体培养基是在种子培养基中添加15～20g/L琼脂粉。
(2)制备种子液；具体地，取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在25～30℃，150～220r/min的条件下，培养8～12h，即得种子液；所述种子培养基可以是：海藻酸钠1-5g/L、蛋白胨1-5g/L、酵母粉1-5g/L、NaCl 0-10g/L、pH自然。
(3)发酵生产褐藻胶裂解酶；具体地，取步骤(2)的种子液，按体积比1～5％的比例接种于发酵培养基中，在25～30℃，150～220r/min条件下培养18～20h，即得菌体发酵液，将所得发酵液进行离心，然后收集上清液，即得到粗酶液；所述发酵培养基配方可以是：海藻酸钠1-5g/L、蛋白胨1-5g/L、酵母粉1-5g/L、NaCl 0-10g/L、pH自然。
本发明的有益效果：
本发明提供了一株新型的产褐藻胶裂解酶的菌株约氏黄杆菌(Flavobacteriumjohnsoniae)WX-11，它是一株极具潜力的褐藻胶裂解酶生产菌株，其优点主要体现在：与其他产褐藻胶裂解酶野生菌相比(如黄杆菌S20、假交替单胞菌属Pseudoalteromonas sp.L1、Bacillus weihaiensis Alg07等)，本发明中的约氏黄杆菌WX-11营养要求简单，发酵时间短，应用于褐藻胶裂解酶生产中可显著缩短生产周期，降低生产成本。
生物材料保藏
约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)，已于2017年07月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.14444。
附图说明
图1约氏黄杆菌WX-11的系统发育树。
图2约氏黄杆菌褐藻胶裂解酶降解海藻酸钠产物的薄层色谱图；图中，“C”代表聚合度1-6的褐藻寡糖混合标准样品，“1”代表约氏黄杆菌所产褐藻胶裂解酶对海藻酸钠酶解24h后的产物。
具体实施方式
本发明下述实施例中，褐藻胶裂解酶的1个酶活力单位(U)定义为：1mL的酶液每分钟产生1μg还原糖所需的酶量。酶活测定方法为DNS法。
实施例1：约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)WX-11的分离鉴定以及菌株的保存
(1)约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)WX-11的分离及筛选
于超市购买干海带，剪成块状后包在纱布中，分别放于装有江南大学校区河水、土壤或自来水的锥形瓶中，孵育2周后，取样。将取得的样品于加入磁珠的生理盐水中震荡2h，过夜静置，接种到以海藻酸钠为唯一碳源的液体培养基中，30℃，220r/min培养至块状海带降解后转接，连续传代5次。将连续驯化5代的培养液用生理盐水分别稀释10-7、10-8、10-9倍，涂布于唯一碳源筛选平以海藻酸钠为唯一碳源的固体培养基上，30℃培养3-5d，待平板上长出单菌落，随机挑取菌落形态各异的单菌落于以海藻酸钠为唯一碳源的固体培养基上划线。接入装有以海藻酸钠为唯一碳源的液体培养基的24孔板中，30℃，300r/min培养24-30h，待菌液浑浊对菌液进行保藏和复筛。将初筛得到的单菌落点种于以海藻酸钠为唯一碳源的固体培养基上，培养3天后CaCl2显色法观察透明圈大小；将单菌落接种于以海藻酸钠为唯一碳源的筛选培养基内，30℃培养2天，6000-8000r/min下离心10-30min，收集上清液，用DNS法测定酶活。
所述以海藻酸钠为唯一碳源的液体培养基的配方如下：海藻酸钠5g/L，硫酸铵5g/L，K2HPO4 2g/L，NaCl 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH自然。
所述以海藻酸钠为唯一碳源固体培养基的配方，是在以海藻酸钠为唯一碳源的液体培养基配方基础上增加琼脂。
(2)约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)WX-11的鉴定
对筛得的菌株(编号为HGJ002)进行生理生化鉴定：该菌株呈杆状或球杆状，无鞭毛，无芽胞，革兰染色呈阴性；在以海藻酸钠为唯一碳源的筛选平板上培养48h的菌落呈黄色，菌落较小，为圆型，菌苔湿润，光滑，透明或半透明，稍凸起。
对筛得的菌株(编号为HGJ002)进行16S rDNA测序，将序列在NCBI上比对后对其进行系统发育树的构建。由图1，判定该菌株为约氏黄杆菌，将其命名为约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)WX-11。
(3)菌株保存：挑取一环约氏黄杆菌WX-11菌株接种于种子培养基中，25～30℃，150～220r/min的条件下，培养12～24h后，取0.6mL的细胞培养液转入装有0.6mL的40％的甘油保藏管中，-20℃冷冻保藏。该菌2017年7月19日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No.14444。
实施例2：约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)WX-11制备褐藻胶裂解酶
实施例1所述的约氏黄杆菌WX-11生产褐藻胶裂解酶的方法，步骤如下：
(1)菌株活化：取约氏黄杆菌WX-11接种于固体培养基中，在25～30℃的条件下，培养24h，制得活化菌株；
(2)种子液制备：取步骤(1)制得的活化菌株，接种在装有50mL种子培养基的250mL锥形瓶中，在25～30℃，150～220r/min的条件下，培养8～12h，即得种子液；
(3)发酵液制备：取步骤(2)制得的种子液，按体积比1～5％的比例接种于发酵培养基中，在25～30℃，150～220r/min条件下培养18～20h，即得菌体发酵液。
种子培养基及发酵培养基配方均为：海藻酸钠1-5g/L、蛋白胨1-5g/L、酵母粉1-5g/L、NaCl 0-10g/L、pH自然。所述固体培养基是在种子培养基中添加15～20g/L琼脂粉。
(4)褐藻胶裂解酶粗酶液的制备：将步骤(3)的发酵液在6000-8000r/min下离心10-30min，收集上清液，即得到粗酶液，用DNS法测定酶活力，发酵液酶活可达125U/mL。
实施例1中还筛选得到其他几株能够产褐藻胶裂解酶的微生物，例如：黄杆菌S20、假交替单胞菌属Pseudoalteromonas sp.L1和Bacillus weihaiensis，采用上述步骤(1)、(3)记载的方法，利用黄杆菌S20、假交替单胞菌属Pseudoalteromonas sp.L1和Bacillusweihaiensis Alg07制备褐藻胶裂解酶，结果表明这些微生物的发酵上清液的酶活分别约为41.4～48.6U/mL、17.89U/mL和35U/mL(酶活定义一致，具体见表1)。由此可见，在筛得的野生菌中，本发明的约氏黄杆菌WX-11产酶水平相对较高。
表1几株产褐藻胶裂解酶的菌株的产酶情况
实施例3：利用约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)WX-11所产褐藻胶裂解酶降解产物分析
取1g海藻酸钠于I00mL 50mM(pH 7.0)的磷酸缓冲液中，加入约氏黄杆菌WX-11所产褐藻胶裂解酶粗酶液，于40℃水浴酶解24h后，通过薄层色谱法分析降解产物。结果显示(图2)，海藻酸钠经酶解后的产物主要是2～6糖，未检测到单糖，推测其为一种内切型褐藻胶裂解酶。
实施例4：褐藻胶裂解酶在海带液降粘及农业方面的应用
将新鲜海带或泡发海带粉碎后溶于去离子水，配制成海带液。在海带液中加入褐藻胶裂解酶粗酶液，40℃下进行酶解，50mL海带液中加入总酶量2000U，酶解大约2h至还原糖量不变，再加入总酶量为2000U的酶液，酶解约1h达到反应终点；在褐藻胶裂解酶水解彻底后，加入α-淀粉酶4000U，酶解2h至还原糖量不变，再加入总酶量为2000U的酶液，酶解约1h达到反应终点，将酶解液5000r/min离心10min后装入喷瓶中喷洒于植物根茎上，具有促进植物根生长的作用。
本发明选择籽粒饱满、大小均匀的玉米种子，用自来水冲洗掉表面杂质。将4层纱布分别用不同浓度(0、50、100、150、200、250mg/L)的酶解液浸泡后平铺于培养皿中，然后将玉米种子均匀摆放于纱布上，置于20℃培养箱中萌发，计算萌发率；种子萌发后，用相应的不同浓度(0、50、100、150、200、250mg/L)的酶解液每隔12小时喷洒5mL酶解液，连续喷洒一周后，测定根长。结果显示，利用不同浓度酶解液浸泡的玉米种子，萌发率分别为75％、77％、82％、81％、81％、78％，可见酶解液对种子萌发具有一定促进作用；相较于未喷洒酶解液(0mg/L)的玉米种子，经酶解液喷洒的种子平均相对根长分别增加了21.6％、19.5％、17.7％、16.3％、15.0％，显示经过酶解液浸泡的玉米生长速度加快，尤其100mg/L的酶解液对根的生长促进作用最为明显。由此结果，海带液酶解液在农业方面将有潜在的市场价值。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)，已于2017年07月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.14444。
2.应用权利要求1所述约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)制备褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)活化约氏黄杆菌WX-11；
(2)制备约氏黄杆菌WX-11的种子液；
(3)发酵生产褐藻胶裂解酶。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)，取约氏黄杆菌WX-11接种于固体培养基中，在25～30℃的条件下，培养得到活化后菌株。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)，取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在25～30℃，150～220r/min的条件下，培养8～12h，即得种子液。
5.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，步骤(3)，取步骤(2)的种子液，按体积比1～5％的比例接种于发酵培养基中，在25～30℃，150～220r/min条件下培养18～20h，即得菌体发酵液，将所得发酵液进行离心，然后收集上清液，即得到粗酶液。
6.根据权利要求2或3或4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的碳源包括褐藻酸或褐藻酸盐。
7.一种制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，以权利要求1所述约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)和/或其合成的褐藻胶裂解酶为催化剂，以聚甘露糖醛酸、聚古罗糖醛酸、褐藻胶或含有褐藻胶的物质为底物。
8.权利要求1所述约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)在降解褐藻酸盐中的应用，其特征在于：具有如下用途之一或两种以上；
(1)用于断裂褐藻酸盐或褐藻多糖的糖苷键，获得褐藻酸盐寡糖；
(2)用于含有褐藻酸盐的高粘原料的降粘处理。
9.权利要求1所述约氏黄杆菌(Flavobacterium johnsoniae)的代谢物在降解褐藻酸盐中的应用，其特征在于：具有如下用途之一或两种以上；
(1)用于断裂褐藻酸盐或褐藻多糖的糖苷键，获得褐藻酸盐寡糖；
(2)用于含有褐藻酸盐的高粘原料的降粘处理。
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