CN104109636B - 杂色曲霉sd-3及其在制备甲壳素脱乙酰酶中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株杂色曲霉(Aspergillus？versicolor)SD-3及其在制备甲壳素脱乙酰酶中的应用；本发明的杂色曲霉SD-3营养要求简单、抗杂菌污染能力强、容易培养；杂色曲霉SD-3产生的甲壳素脱乙酰酶为胞外酶，分离除去菌体，即可获得甲壳素脱乙酰酶粗酶液，粗酶液可以直接应用，制备工艺简单；杂色曲霉SD-3产甲壳素脱乙酰酶活性高，在优选的条件下，未经分离纯化的粗酶液活力可达142.3U/mL；生产工艺不使用有毒有害原料，环保无污染。

Description

杂色曲霉SD-3及其在制备甲壳素脱乙酰酶中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种产甲壳素脱乙酰酶的杂色曲霉(Aspergillusversicolor)SD-3及其制备甲壳素脱乙酰酶中的应用。

(二)背景技术

甲壳素，又称几丁质(chitin)，是由N-乙酰氨基-D-葡萄糖单体通过β-1,4-糖苷键连接而成的多糖，广泛存在于许多无脊椎动物(如虾、蟹、昆虫等)的外壳或角质层，是自然界中仅次于纤维素的天然多糖。甲壳素分子结构因其分子内部的结晶结构和很强的氢键作用，很难溶于稀酸碱及一般的有机溶剂，因此应用范围不广。当甲壳素分子中的乙酰基部分或全部脱除后，则形成壳聚糖(chitosan)，由于具有无毒、可被生物降解、良好的生物相容性和成膜性等优良特性，在医药、食品、化工、化妆品和生物医学工程等诸多领域有着广泛的应用。

甲壳素脱乙酰化生产壳聚糖的方法常见的有化学法和酶法，目前基本都是采用浓碱热解法生产。浓碱法反应过程不易控制，常常会影响到产品的粘度和分子量，且其排放的污水对环境造成严重污染，壳聚糖产品的特性也存在不足，如脱乙酰度不均匀、分子量分布范围宽、乙酰基所在的位置不能固定等，使得产品的实际应用范围有限。相比之下，利用酶解法生产壳聚糖，既可以解决目前壳聚糖生产中的环境污染问题，又可以生产出高质量的壳聚糖产品，如乙酰化程度均匀、分子量分布范围窄，以及具有特定乙酰化位置的壳聚寡糖等，是一条既经济又行之有效的壳聚糖制备方法。

酶法生产壳聚糖需要的酶是甲壳素脱乙酰酶(chitindeacetylase，E.C.3.5.1.41)，它是一种催化甲壳素中N-乙酰氨基-D-葡萄糖胺的乙酰氨基水解的酶。甲壳素脱乙酰酶来源广泛，包括部分真菌、植物病原体和一些昆虫等，其中以真菌最多，也是获得该酶的最佳来源。虽然目前国内外对甲壳素脱乙酰酶的研究已经相当广泛和深入，甚至已经发展到了分子水平，但仍未见将其工业化生产并应用于壳聚糖生产的报道，工业化应用研究亟待加强。

我国沿海地区虾蟹类加工业发达，现有数十家甲壳素的生产企业，目前对甲壳素的进一步加工利用主要是通过高温强碱脱乙酰生产壳聚糖，以及对壳聚糖进一步高温强酸水解生产壳寡糖和氨基葡萄糖。但是由于生产过程耗能大且产生大量废液，导致产品能耗高，环境污染严重，许多甲壳素加工企业也因污染严重，无力治污而面临关闭。

因此，摒弃污染大的生产工艺，利用绿色环保的酶解法来生产壳聚糖，是甲壳素生产企业的必行之道。酶解法生产壳聚糖工艺过程并不复杂，但关键是要有酶活力高、活性稳定、价格低的甲壳素脱乙酰酶作保证。国内外有不少报道关于采用微生物制备甲壳素脱乙酰酶，但仍然存在微生物发酵周期长、酶活力低或发酵成本高等问题，至今未见产业化生产甲壳素脱乙酰酶的报道。即使有报道采用基因工程方法将甲壳素脱乙酰酶基因转入大肠杆菌中表达，也未能产业化应用。因此，获得产酶活力高、生长繁殖快、营养要求低的产甲壳素脱乙酰酶微生物菌株，以及发酵工艺简单、原料成本低等仍是该酶工业化应用的关键。

(三)发明内容

本发明目的是提供一株甲壳素脱乙酰酶产生菌——杂色曲霉(Aspergillusversicolor)SD-3，及其在制备甲壳素脱乙酰酶中的应用，较好地克服现有微生物发酵生产甲壳素脱乙酰酶的培养基成本高、发酵周期长和酶活性低的缺点，生产工艺具有成本低、工艺简单、效率高等优点。

本发明采用的技术方案是：

本发明涉及一株甲壳素脱乙酰酶产生菌—杂色曲霉(Aspergillusversicolor)SD-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCCNO：M2013328；保藏日期：2013年7月11日。

本发明所述杂色曲霉SD-3，是由甲壳素混入土壤经过自然富集和人工富集培养，从富集培养物中分离和筛选得到的优良野生菌株，再经紫外线照射诱变处理和筛选获得。

所述杂色曲霉SD-3的形态学特征如下：涂布或划线接种于马铃薯平板培养基上，生长迅速，28℃下培养3～4天菌丝便长满平板，并产生大量分生孢子。菌落呈絮状，正面灰绿色，反面黄褐色。分生孢子穗疏松放射状，顶囊近球形或梨形；分生孢子梗双层，无色，表面光滑；分生孢子球形或近球形，褐色，表面粗糙。

所述杂色曲霉SD-3的18srDNA的部分核苷酸序列如SEQIDNo.1所示：

GTACCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGGAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCCCCTCGGGGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGTAACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACGGGGCTCTTTTGGGTCTCGTAATTGGAATGAGTACAATCTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGTCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGAGTACTGGTCCGGCTGGACCTTTCCTTCTGGGGAATCCCATGGCCTTCACTGGCTGTGGGTGGAACCAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTTTGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCGTCAGTATTCAGCTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTGCTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTCGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGCGGCGTTTCTATGATGACCCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTTTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACAAGGCGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACAAAATAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATCTTTTGGATGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTCGGCCCTTAAATAGCCCGGTCCGCGTCCGCGGGCCGCTGGCTTCTTAGGGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTGCGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC

本发明还涉及所述的杂色曲霉SD-3在微生物发酵制备甲壳素脱乙酰酶中的应用，具体所述应用为：将杂色曲霉SD-3菌种孢子或经过扩大培养的种子液接种至产酶培养基中，28～32℃培养3～5天，获得发酵液，将发酵液经过离心或过滤除去菌丝体，所得上清液或滤液即为甲壳素脱乙酰酶粗酶液，将粗酶液分离提取，获得甲壳素脱乙酰酶；所述产酶培养基终浓度组成为：蔗糖5～10g/L，酵母浸出粉2～6g/L，(NH₄)₂SO₄2～4g/L，K₂HPO₄1～2g/L，KH₂PO₄1～2g/L，乙酸钠1～3g/L，玉米浆(玉米浆是玉米淀粉生产中的一种副产物，是配制微生物培养基的常用原料，市购)4～6mL/L，溶剂为自来水，pH4.5～6.5。

进一步，所述种子液的体积接种量为5～10％。

所述菌株在产酶培养前，通常需要先经斜面培养基活化培养，或经过种子扩大培养，然后用孢子或种子液接入产酶培养基进行产酶发酵。

具体的，所述活化、种子扩大培养、产酶培养和粗酶液的获得步骤如下：

(1)将保藏的杂色曲霉SD-3菌种孢子接种于斜面或平板培养基，于28～32℃培养2～3天，得到活化后的杂色曲霉菌种(即获得杂色曲霉SD-3菌种孢子)。所述的每升斜面或平板培养基制备方法为：马铃薯150～200g(马铃薯去皮切成小块，加4～5倍质量体积的自来水煮沸20～30min，纱布过滤留汁液)、蔗糖10～20g、琼脂15～20g，自来水补足至1000mL，pH5.0～6.0，高压蒸汽121℃灭菌20～30min。每升斜面或平板培养基组成优选：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，自来水1000mL，pH6.0。

(2)将步骤(1)活化培养后杂色曲霉SD-3孢子接种至种子培养基中，于28～32℃、150～250r/min振荡条件下培养2～3天，得到种子液；所述每升种子培养基制备方法为：蔗糖5～10g，酵母浸出粉2～6g，(NH₄)₂SO₄2～4g，K₂HPO₄1～2g，KH₂PO₄1～2g，乙酸钠1～3g，玉米浆4～6mL，加自来水至1000mL，pH4.5～6.5，高压蒸汽121℃灭菌20～30min。种子培养基组成优选为：蔗糖10g，酵母浸出粉6g，(NH₄)₂SO₄4g，K₂HPO₄2g，KH₂PO₄2g，乙酸钠3g，玉米浆6mL，加自来水至1000mL，pH6.0。

(3)将步骤(1)的杂色曲霉SD-3孢子，或步骤(2)制备的种子液以5％～10％的体积比移种到产酶培养基中，于28～32℃、150～250r/min振荡培养3～4天，得到含甲壳素脱乙酰酶的发酵液；所述产酶培养基组成同步骤(2)中的种子培养基。

将步骤(3)含甲壳素脱乙酰酶的发酵液用4层纱布过滤，或者4000～6000r/min离心5～10min，分离除去菌丝体，所得滤液或上清液即为甲壳素脱乙酰酶的粗酶液。所制备的甲壳素脱乙酰酶粗酶液，可以直接应用于水解甲壳素制备壳聚糖，也可以保存于4℃冰箱20天内使用；也可以经过冷冻干燥(-50℃)，制成粗酶粉保存于4℃冰箱长期使用。

本发明以甲壳素为唯一碳源，经过天然富集和人工富集培养，筛选获得一株产甲壳素脱乙酰酶活力较高的杂色曲霉野生菌株，经过紫外诱变和筛选后，获得一株产甲壳素脱乙酰酶活性高、传代稳定的突变株，经过产酶发酵工艺优化后，在最优的条件下，粗酶液活力达到了142.3U/mL，较现有的技术相比，技术优势显著，能够大幅度降低酶的生产成本。

本发明的有益效果主要体现在：(1)本发明的杂色曲霉SD-3营养要求简单、抗杂菌污染能力强、容易培养；(2)杂色曲霉SD-3产生的甲壳素脱乙酰酶为胞外酶，分离除去菌体，即可获得甲壳素脱乙酰酶粗酶液，粗酶液可以直接应用，制备工艺简单；(3)杂色曲霉SD-3产甲壳素脱乙酰酶活性高，在优选的条件下，未经分离纯化的粗酶液活力可达142.3U/mL；(4)生产工艺不使用有毒有害原料，环保无污染。

(四)附图说明

图1产甲壳素脱乙酰酶菌株平板筛选具变色圈的菌落照片；

图2杂色曲霉SD-3在平板培养基上的菌落照片。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：产甲壳素脱乙酰酶微生物的富集、分离和筛选

为了获得产酶活力较高的菌株，首先对产甲壳素脱乙酰酶微生物进行自然富集。方法是：初夏季节，在花坛土壤中埋入粉碎的蟹壳，洒水保持土壤湿润，2个月后采集此处土壤样品，作为甲壳素脱乙酰酶微生物的分离源。

采集自然富集的土壤，再进行产甲壳素脱乙酰酶微生物的人工培养富集，方法是：250mL三角瓶中加入45mL富集培养基，经灭菌后加入5g上述土样，三角瓶于28℃、200r/min振荡培养5天，取富集培养液5mL接种于另一只装有45mL富集培养基的三角瓶中，重复上述培养过程一次，使得能以甲壳素为唯一碳源生长的微生物数量增加。

将上述富集培养液用无菌水稀释后涂布于平板培养基上，培养皿于28℃的生化培养箱中培养至有变色圈的菌落出现。挑取颜色和形态不同的菌落用划线法接种到另一块筛选平板培养基上，28℃培养3天后，挑取单菌落转接斜面培养基，28℃培养3天，作进一步摇瓶筛选。

用接种环分别刮取各个菌株的新鲜斜面菌种孢子2环，接入产酶培养基中，30℃、200r/min振荡条件下发酵培养5天。发酵液于4500r/min、4℃条件下离心10min后，上清液即为甲壳素脱乙酰酶粗酶液。

测定不同菌株发酵所得粗酶液的甲壳素脱乙酰酶的活力，经过比较，一株编号为CR-3的菌株产酶活力最高，为41.6U/mL。

菌株CR-3形态学特征如下：涂布或划线接种于马铃薯平板培养基上，生长迅速，28℃下培养3～4天菌丝便长满平板，并产生大量分生孢子。菌落呈絮状，正面灰绿色，反面黄褐色。分生孢子穗疏松放射状，顶囊近球形或梨形；分生孢子梗双层，无色，表面光滑；分生孢子球形或近球形，褐色，表面粗糙。

依据菌株CR-3菌落形态、菌丝大小和孢子形态初步判断为曲霉(Aspergillus)，采用18SrDNA序列分析方法对菌株CR-3进行鉴定，确定其为一株杂色曲霉(Aspergillusversicolor)，命名为杂色曲霉(Aspergillusversicolor)CR-3。

所述的富集培养基组成为：甲壳素2.5g，K₂HPO₄0.7g，KH₂PO₄0.3g，MgSO₄0.5g，NaCl0.5g，加自来水至1000mL，pH6.0，高压蒸汽121℃灭菌20min。

所述的筛选平板培养基组成为：甲壳素200g，K₂HPO₄0.7g，KH₂PO₄0.3g，MgSO₄0.5g，NaCl0.5g，对硝基-N-乙酰苯胺0.2g，琼脂20g，加自来水至1000mL，pH6.0，高压蒸汽121℃灭菌20min。

所述的斜面培养基为马铃薯培养基(PDA)，组成为：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，自来水1000mL。制备方法为：将200g马铃薯去皮切碎，加自来水1000mL，煮沸30min后用纱布过滤留汁，再加入20g蔗糖和20g琼脂，补水至1000mL，pH6.0，高压蒸汽121℃灭菌20min。

所述的初始摇瓶筛选产酶培养基组成为：蔗糖5g，蛋白胨2.5g，(NH₄)₂SO₄2.5g，K₂HPO₄1g，KH₂PO₄1g，乙酸钠3g，玉米浆5mL，加自来水至1000mL，pH6.0，高压蒸汽121℃灭菌20min。

本发明中，测定甲壳素脱乙酰酶活力的方法是：比色管中加入50℃预保温、浓度为0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)3mL、200mg/L的对硝基-N-乙酰苯胺水溶液1mL和用Tris-HCl缓冲液(pH8.0、0.05mol/L)稀释1～4倍的粗酶液1mL(依据酶的活力大小情况，稀释1-4倍，酶活低时不需要稀释，酶活达到140U/mL以上是稀释4倍)，于50℃水浴反应15min，沸水浴终止酶促反应，用蒸馏水定容至10mL，摇匀，4000r/min离心10min；以经沸水灭活相应粗酶液的相同处理作为参比，测定上清液在波长400nm处的吸光度。由测定的吸光值，依据对硝基苯胺的浓度—吸光度标准曲线方程(Y＝0.0657X+0.003，Y为400nm处的吸光度，X为硝基苯胺的浓度)计算出反应体系中对硝基苯胺浓度，再按酶活力单位定义计算出甲壳素脱乙酰酶的活力。

甲壳素脱乙酰酶的酶活单位定义：在上述反应条件下每小时产生1μg对硝基苯胺所需要的酶量(mL)定义为一个酶活力单位(U)。

实施例2：甲壳素脱乙酰酶高产菌株的诱变育种

对实施例1筛选得到的野生杂色曲霉CR-3菌株用紫外线照射诱变，筛选产甲壳素脱乙酰酶活力有所提高的突变菌株。

紫外线照射诱变方法：将菌株CR-3斜面菌种活化培养后，刮取孢子到含50mL无菌生理盐水的三角瓶中，室温振荡30min，漏斗颈部放一棉花团过滤孢子悬液。在显微镜下用血球计数板对悬液中的孢子计数，用无菌生理盐水做适当倍数稀释，控制孢子数量在1×10⁸个/mL左右。在红光下，取2mL上述孢子悬液和一枚无菌回形针至直径6cm的培养皿中，将培养皿置于磁力搅拌器上，在预热20min的紫外灯下分别照射1～5min。取0.5mL上述照射处理后的孢子液，作适当倍数稀释后分别移取0.2mL涂布平板。以同样操作，做未经紫外线照射的孢子液稀释涂平板作为对照，以计算致死率。用黑布包裹所有培养皿，28℃培养3天，对平板上的菌落进行计数，计算致死率。挑取致死率在90％以上经紫外线照射处理后长出的菌落转接斜面，按实施例1所述的方法，对突变菌株进行筛选。

对野生杂色曲霉CR-3菌株进行了紫外照射诱变后，经过筛选，获得产酶活力显著提高的菌株SD-3，酶活达到78.3U/mL，较用野生菌株提高了88.2％。SD-3菌株经过转接传代5次，酶活力波动范围小于10％，说明该菌株产甲壳素脱乙酰酶遗传稳定性良好。将菌株SD-3命名为杂色曲霉(Aspergillusversicolor)SD-3，并提交中国典型培养物保藏中心保藏，编号：CCTCCNo：M2013328，保藏日期：2013年7月11日。

紫外线照射野生菌株诱变育种的条件为：紫外照射功率为15W，照射距离为30cm，照射时间为3～4min。

所述的平板培养基、斜面培养基和产酶培养基组成均与实施例1相同。

实施例3：杂色曲霉SD-3发酵制备甲壳素脱乙酰酶的方法1

以杂色曲霉SD-3为菌种，不经种子扩大培养，在50mL摇瓶规模下制备甲壳素脱乙酰酶的方法如下：

(1)将试管斜面保藏的杂色曲霉SD-3菌种接种于斜面培养基，斜面于28℃生化培养箱中培养3天。所述的斜面培养基组成及制备方法同实施例1。

(2)用接种环刮取步骤(1)活化培养后杂色曲霉SD-3孢子接种至产酶培养基，28℃、150r/min振荡条件下培养5天，得到含甲壳素脱乙酰酶的发酵液；所述的产酶培养基组成为：蔗糖5g，酵母浸出粉2.5g，(NH₄)₂SO₄2.5g，K₂HPO₄1g，KH₂PO₄1g，乙酸钠1g，玉米浆4mL，加自来水至1000mL，pH5.0。250mL的三角瓶装50mL产酶培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌30min。

(3)将步骤(2)的含甲壳素脱乙酰酶发酵液于5000r/min、4℃条件下离心5min，倾倒出上层清液，弃去沉淀物，所得清液即为甲壳素脱乙酰酶粗酶液，酶活力达到81.2U/mL。

实施例4：杂色曲霉SD-3发酵制备甲壳素脱乙酰酶的方法2

以杂色曲霉SD-3为菌种，经过种子制备方法、产酶培养基组成和发酵条件优化后，在50mL摇瓶规模下制备甲壳素脱乙酰酶的方法如下：

(1)将试管斜面保藏的杂色曲霉SD-3菌种接种于斜面培养基，斜面于28℃生化培养箱中培养3天。所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例1。

(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后杂色曲霉SD-3孢子至种子培养基中，于32℃、250r/min振荡条件下培养2天，得到种子液；所述种子培养基组成为：蔗糖10g，酵母浸出粉6g，(NH₄)₂SO₄4g，K₂HPO₄2g，KH₂PO₄2g，乙酸钠3g，玉米浆6mL，加自来水至1000mL，pH6.0，250mL的三角瓶装50mL种子培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(3)步骤(2)种子液以5％的体积比接种量接至产酶培养基，30℃、200r/min振荡条件下培养4天，得到含甲壳素脱乙酰酶的发酵液；所述的产酶培养基组成为：蔗糖10g，酵母浸出粉6g，(NH₄)₂SO₄4g，K₂HPO₄2g，KH₂PO₄2g，乙酸钠3g，玉米浆6mL，加自来水至1000mL，pH6.0，250-mL的三角瓶装50mL产酶培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。

(4)将步骤(3)的含甲壳素脱乙酰酶发酵液用4层纱布过滤，所得滤液即为甲壳素脱乙酰酶粗酶液，酶活力达到147.4U/mL。

实施例5：杂色曲霉SD-3发酵制备甲壳素脱乙酰酶的方法3

以杂色曲霉SD-3为菌种，经过种子制备方法、产酶培养基组成和发酵条件优化后，在500mL摇瓶制备甲壳素脱乙酰酶的方法如下：

(1)将试管斜面保藏的杂色曲霉SD-3菌种接种于斜面培养基，斜面于28℃生化培养箱中培养3天。所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例1。

(2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后杂色曲霉SD-3孢子至种子培养基中，于32℃、200r/min振荡条件下培养2天，得到种子液；所述种子培养基组成为：蔗糖5g，酵母浸出粉2g，(NH₄)₂SO₄2g，K₂HPO₄1g，KH₂PO₄1g，乙酸钠1g，玉米浆4mL，加自来水至1000mL，pH6.0，250mL的三角瓶装50mL种子培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20～30min。

(3)步骤(2)种子液以10％的体积比接种量接至产酶培养基，28℃、200r/min振荡条件下培养3天，得到含甲壳素脱乙酰酶的发酵液；所述的产酶培养基组成为：蔗糖10g，酵母浸出粉6g，(NH₄)₂SO₄4g，K₂HPO₄2g，KH₂PO₄2g，乙酸钠3g，玉米浆6mL，加自来水至1000mL，pH6.0，2L的三角瓶装500mL产酶培养基，八层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌30min。

(4)将步骤(3)的含甲壳素脱乙酰酶发酵液用4层纱布过滤，所得滤液即为甲壳素脱乙酰酶粗酶液，酶活力达到142.3U/mL。

实施例6：甲壳素脱乙酰酶的保存与冻干

实施例3～5制备的甲壳素脱乙酰酶粗酶液可应用于酶解甲壳素制备壳聚糖，可以立即使用，也可以密封保存于4℃冰箱中。由实施例5制备的酶活为142.3U/mL的甲壳素脱乙酰酶粗酶液，在4℃冰箱中密封保存20天后，酶活为121.4U/mL，活力损失为14.7％，可以用于酶解甲壳素制备壳聚糖。

实施例3～5制备的甲壳素脱乙酰酶粗酶液经-50℃冷冻干燥，制得干燥酶粉，可保存于4℃冰箱长期使用。由实施例5制备的酶活为142.3U/mL的甲壳素脱乙酰酶粗酶液，在-50℃的条件下冷冻干燥，制得干燥的酶粉，加等同原酶液体积的蒸馏水溶解，酶活力为115.8U/mL，活力损失为18.6％，可以用于酶解甲壳素制备壳聚糖。

Claims (6)

1.杂色曲霉(Aspergillusversicolor)SD-3，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCCNO：M2013328；保藏日期：2013年7月11日。

2.一种权利要求1所述杂色曲霉SD-3在微生物发酵制备甲壳素脱乙酰酶中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：将杂色曲霉SD-3菌种孢子或经过扩大培养的种子液接种至产酶培养基中，28～32℃培养3～5天，获得发酵液，将发酵液经过离心或过滤除去菌丝体，所得上清液或滤液即为甲壳素脱乙酰酶粗酶液，将粗酶液分离提取，获得甲壳素脱乙酰酶；所述产酶培养基终浓度组成为：蔗糖5～10g/L，酵母浸出粉2～6g/L，(NH₄)₂SO₄2～4g/L，K₂HPO₄1～2g/L，KH₂PO₄1～2g/L，乙酸钠1～3g/L，玉米浆4～6mL/L，溶剂为自来水，pH5.0～6.0。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述杂色曲霉SD-3菌种孢子按如下方法制备：将杂色曲霉SD-3接种于斜面或平板培养基，于28～32℃培养2～3天，得到杂色曲霉SD-3菌种孢子；所述斜面或平板培养基每升组成为：马铃薯150～200g、蔗糖10～20g、琼脂15～20g，自来水补足至1000mL，pH5.0～6.0。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述杂色曲霉SD-3种子液按如下步骤制备：(1)将杂色曲霉SD-3接种于斜面或平板培养基，于28～32℃培养2～3天，得到杂色曲霉SD-3菌种孢子；所述斜面或平板培养基每升组成为：马铃薯150～200g、蔗糖10～20g、琼脂15～20g，自来水补足至1000mL，pH5.0～6.0；(2)将步骤(1)杂色曲霉SD-3菌种孢子接种至种子培养基中，于28～32℃、150～250r/min振荡条件下培养2～3天，得到种子液；所述种子培养基每升组成为：蔗糖5～10g，酵母浸出粉2～6g，(NH₄)₂SO₄2～4g，K₂HPO₄1～2g，KH₂PO₄1～2g，乙酸钠1～3g，玉米浆4～6mL，加自来水至1000mL，pH4.5～6.5。

6.如权利要求3或5所述的应用，其特征在于所述种子液的体积接种量为5～10％。