CN102559547B - 产琼脂酶的类芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株经离子注入诱变得到的琼胶酶高产菌株——类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)WL-15，及其在微生物发酵制备琼胶酶中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M 2011357，保藏日期2011年10月19日。本发明的有益效果主要体现在：(1)采用低能N⁺离子注入的方法进行诱变产琼胶酶微生物，具有突变率高、操作简单等优点；(2)诱变选育得到的菌株产琼胶酶遗传稳定性良好，高产特性不易发生退化；(3)菌株具有产酶活力高、营养要求低和发酵周期短等优点，可应用于工业发酵制备琼胶酶，而琼胶酶在制备琼胶寡糖等领域有多种用途。

Description

产琼脂酶的类芽孢杆菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一株经离子注入诱变得到的琼胶酶高产菌株——类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)WL-15，及其在微生物发酵制备琼胶酶中的应用。

(二)背景技术

琼胶是一种从江篱、石花菜等红藻中提取出来的水溶性多糖，主要由琼胶糖和硫琼胶两部分组成，其中琼胶糖是由1，3连接的β-D-半乳吡喃糖和1，4连接的3，6-内醚-α-L-半乳吡喃糖残基反复交替连接的链状中性糖。近些年来的研究表明，琼胶糖的降解产物，2～10聚合度的寡糖具有多种生理活性，如抗氧化活性，降血脂活性，免疫调节活性，抗过敏活性、抑制糖苷酶活性等。琼胶酶就是能够降解琼胶为寡糖的酶，其在琼胶寡糖制备方面具有特异性强、得到寡糖活性高等优点，其在分子生物学等方面也多有应用，因此，对于琼胶酶的研究与开发具有重要的意义。

琼胶酶有两个来源，一个来源是微生物。能够产生琼胶酶的微生物主要是海洋细菌，如假单胞菌属(Pseudomonas)、别单胞菌属(Alteromonas)、类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)等；另一个来源是以海藻为食的海洋软体动物，如从海兔(Aplysia dactylomela)、鲍鱼(Haliotis coccinea)等。相比之下，微生物具有生长繁殖快，周期短，产酶活性高等特点，适合酶的大规模工业化生产，是获得琼胶酶的最佳来源。

微生物菌种是发酵工业的基础和关键，能否提高发酵工业的效率、降低产品成本，关键在于能否获得高产优良的菌种。从自然界分离的野生菌种，往往存在产量低、发酵性能差等不足，需要对野生型菌株进行选育后才能改善其不足。时至今日，多种微生物育种新技术发展已取得长足发展，但诱变育种仍是大多数工业微生物育种最重要、最有效的技术，其不仅可以提高有效产物的产量，改善生物学特性和创造新品种，而且对于研究有效产物代谢途径，绘制遗传图谱等方面都有一定的用途。

离子注入法是最初应用金属材料表面的改性，当被引进生物材料的诱变育种后，由于其具有较高的诱变频率和较好的诱变效果而备受关注，也得到了越来越多的应用。离子注入生物材料后进行诱变的方法，由于其集能量沉积、质量沉积、动量传递过程以及粒子注入和电荷交换过程的联合作用，引起强烈的生物学效应而能够取得较好的诱变效果。离子注入具有变异幅度大、突变频率较高、突变谱较广、突变体的遗传性能较稳定、回复突变率低的优点。

(三)发明内容

本发明目的是提供一株琼胶酶高产菌株——类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)WL-15，及其在制备琼胶寡糖中的应用，较好地克服现有微生物发酵制备琼胶酶中的发酵周期长和酶活性低的缺点。

本发明采用的技术方案是：

一株琼胶酶高产菌菌株——类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)WL-15，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC No：M 2011357，保藏日期：2011年10月19日。

类芽孢杆菌WL-15是以从我国东海浙江省温岭市近海海域海水中分离出的类芽孢杆菌WL为出发菌株，经低能N⁺离子注入诱变选育而获得，类芽孢杆菌WL菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNo：M 2010049，保藏日期2010年3月12日。

具体的，本发明所述的类芽孢杆菌WL-15采用以下步骤获得：

(1)将出发菌株的菌体用无菌人工海水制成细胞浓度为1×10⁷～1×10⁸个/mL的菌悬液，涂布于培养皿中，在超净工作台上风干，镜检细胞间无重叠后进行N⁺离子注入诱变。出发菌株为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)WL(CCTCC No：M 2010049)；

(2)对步骤(1)涂布于培养皿中的菌体，采用能量为10keV，剂量为23.4×10¹⁴ions/cm²的N⁺离子注入诱变，诱变后用无菌人工海水洗脱，经无菌人工海水稀释后，涂布于平板培养基上进行培养4～5天；

(3)挑选步骤(2)中平板培养基上形成凹陷较深的菌落，转接于斜面培养基培养24～36h，接种于产酶培养基培养24～36h后，测定发酵液的琼胶酶活力，与出发株进行比较，筛选获得酶活最高的菌株类芽孢杆菌WL-15；

(4)将步骤(3)筛选得到的类芽孢杆菌WL-15连续传代5代并发酵产酶，测得各代产酶的活力，其产酶活力没有下降，确定该菌株是产酶活力遗传稳定。

本发明类芽孢杆菌WL-15菌落具有以下特征：菌体经稀释后接种平板培养基，30℃条件下培养24～48h，可形成直径2～3mm的菌落，菌落呈灰白色、半透明、表面湿润、圆形、边缘整齐，菌落生长处，培养基明显凹陷(见附图1)。

所述的平板培养基组成为：琼脂15～25g/L，葡萄糖1～2g/L，酵母浸出粉3～5g/L，MgSO₄·7H₂O 4～5g/L，KCl 1～2g/L，FeSO₄·7H₂O0.01～0.03g/L，CaCl₂ 0.1～0.3g/L，NaH₂PO₄ 0.5～1.0g/L，溶剂为水，pH 7～8。

所述的产酶培养基组成为：琼胶1～3g/L，NaNO₃ 3～6g/L，NaCl 10～20g/L，MgSO₄·7H₂O 4～6g/L，KCl 1～2g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01～0.03g/L，CaCl₂0.1～0.3g/L，MnCl₂·4H₂O 0.1～0.2g/L，溶剂为水，pH 7～8。

本发明还涉及所述的类芽孢杆菌WL-15在微生物发酵制备琼胶酶中的应用。

所述的应用为：将所述类芽孢杆菌WL-15菌种接种至适用于类芽孢杆菌的发酵产酶培养基(常规发酵培养基添加1～3g/L琼胶即可)中，25～35℃培养24～36h，获得含有琼胶酶的发酵液。所得发酵液经过离心或过滤除去菌体的清液为粗酶液，可以直接应用于琼胶寡糖的制备；也可以按照常规生化方法进行酶的分离纯化，得到纯化后的琼胶酶应用于琼胶寡糖的制备。

优选的，所述发酵产酶培养基组成如下：琼胶1～3g/L，NaNO₃ 4～6g/L，NaCl 10～20g/L，MgSO₄·7H₂O 4～6g/L，KCl 1～2g/L，FeSO₄·7H₂O0.01～0.03g/L，CaCl₂ 0.1～0.3g/L，NaH₂PO₄ 0.5～1g/L，MnCl₂·4H₂O 0.1～0.2g/L，溶剂为水，pH 7～8。

本发明的有益效果主要体现在：(1)采用低能N⁺离子注入的方法进行诱变产琼胶酶微生物，具有突变率高、操作简单等优点；(2)诱变选育得到的菌株产琼胶酶遗传稳定性良好，高产特性不易发生退化；(3)菌株具有产酶活力高、营养要求低和发酵周期短等优点，可应用于工业发酵制备琼胶酶，而琼胶酶在制备琼胶寡糖等领域有多种用途。

(四)附图说明

图1为平板培养基上的类芽孢杆菌WL-15菌落形态照片。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：类芽孢杆菌WL的诱变和筛选

在对类芽孢杆菌WL诱变之前，首先要对其进行纯化。4℃冰箱保藏的类芽孢杆菌WL(CCTCC No：M 2010049)接种斜面培养基，于30℃恒温培养48h，再挑取上述斜面菌体少许于装有数十粒玻璃珠和50mL无菌人工海水的三角瓶中，三角瓶于室温下振荡10min，制得菌体悬液，细胞数为1×10⁸个/mL。酵母细胞悬液经稀释10⁶倍后，吸取0.2mL涂布平板培养基，平板于30℃恒温培养48h，待菌落长出后，挑取培养基凹陷较深处的菌落多个分别转接斜面培养基，斜面于25～30℃恒温培养36h。将不同斜面菌株转接产酶培养基中，经30℃、200r/min条件下进行产酶发酵24h。发酵结束后，将发酵液离心，测定上清液的琼胶酶活力，并以出发菌株作为对照，挑取活力最高的菌株作为N⁺低能离子注入诱变的出发菌株。

用接种环挑取少许出发菌株斜面菌体于装45mL人工海水的三角瓶中(装有少量玻璃珠)，充分摇匀以打散菌体。取0.1mL菌液均匀涂布于9cm平皿中，在超净台中风干成为菌膜，镜检细胞间无重叠后，进行N⁺离子注入诱变。注入能量为10keV，注入剂量为23.4×10¹⁴ion/cm²，之后，用1mL无菌人工海水冲洗平板得菌悬液。所述的离子注入剂为中国科学院等离子体物理研究所生产，型号为IBBe-III。

将上述菌悬液稀释10-10³倍后均匀涂布于平板培养基中，30℃下培养4～5d，挑选平板中凹陷较深的单菌落转接于斜面培养基上，30℃培养36h后挑取1环菌体直接接种到产酶培养基中，30℃、200r/min条件下进行产酶发酵24h。发酵结束后，将发酵液离心，测定上清液的琼胶酶活力，并以出发菌株作为对照。经过初筛和复筛两次比较，得到一株产琼胶酶活力为47.34U/mL的类芽孢杆菌WL-15菌株，较出发菌株提高了53.9％。

将类芽孢杆菌WL-15菌株在斜面培养基传代5次，每代进行产酶活力测定，结果表明各代产酶的活力相差不大，由此认为该菌株是优良的琼胶酶产生菌株。

将类芽孢杆菌WL-15递交中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC No：M 2011357，保藏日期2011年10月19日。

所述的斜面和平板培养基成分为：琼脂2g/L，酵母浸出粉10g/L，蛋白胨10g/L，NH₄Cl 1g/L，NaCl 20g/L，K₂HPO₄·3H₂O 1.3g/L，溶剂为水，pH7.0；

所述的产酶培养基成分为：琼脂2.5g/L，NaNO₃ 4g/L，NaCl 10g/L，MgSO₄·7H₂O 5g/L，KCl 1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.02，g/L，CaCl2 0.2g/L，NaH₂PO₄ 0.78g/L，MnCl₂·4H2O 0.15g/L，溶剂为水，pH 7.5。

所述的琼胶酶活力测定方法为：取1mL酶液，加入9mL浓度为2g/L琼脂水溶液中，45℃下水浴振荡酶解30min后，取1mL酶解液，用DNS法测定还原糖(以D-半乳糖为标准品绘制标准曲线)的含量。酶活定义为：以1min产生1μg还原糖所需的酶量(mL)作为一个酶活力单位(U)，以灭活的酶液作为空白对照。

实施例2：类芽孢杆菌WL-15发酵制备琼胶酶的方法

以类芽孢杆菌WL-15为菌种，优选的琼胶酶的制备方法如下：

(1)将冷冻干燥或试管斜面保藏的类芽孢杆菌WL-15菌种接种于斜面培养基，斜面于28℃生化培养箱中培养36h。所述的斜面培养基组成为：琼脂20g/L，葡萄糖1g/L，酵母浸出粉5g/L，NaCl 20g/L，MgSO₄·7H₂O 5g/L；KCl 1g/L，FeSO₄·7H₂O 0.02g/L，CaCl₂ 0.2g/L，NaH₂PO₄ 0.78g/L，溶剂为水，pH 7.5；

(3)用接种环挑取步骤(1)活化培养后的类芽孢杆菌WL-15菌体至液体种子培养基中，液体种子培养基于28℃、200r/min振荡条件下培养24h，得到种子液；所述液体种子培养基组成为：琼脂2g/L，酵母浸出粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 20g/L，FeSO₄·7H₂O 0.02g/L，NaH₂PO₄ 0.6g/L，溶剂为水，pH 7.0；

(3)步骤(3)种子液以9％的体积比接种量接至液体发酵培养基，30℃、250r/min振荡条件下培养24h，得到含琼胶酶的发酵液；所述液体发酵培养基组成为：琼胶2.5g/L，NaNO₃ 6g/L，NaCl 15g/L，NaH₂PO₄ 0.6g/L，MgSO₄·7H₂O 5g/L，KCl 1g/L，FeSO₄·7H₂O0.02g/L，CaCl₂ 0.2g/L，MnCl₂·4H₂O 0.15g/L，溶剂为水，pH 7.5；

(4)将步骤(3)的含琼胶酶发酵液于离心杯中，8000r/min、4℃条件下离心20min，倾倒出上层清液，弃去沉淀物，所得清液即为琼胶酶粗酶液，琼胶酶活力可达53.27U/mL。

实施例3：琼胶寡糖的制备

用pH＝7.0、浓度为0.2mol/L的Na₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液配制3g/L的琼胶底物溶液(加热溶解)，250mL三角瓶中装40mL琼胶底物溶液，加入5mL实施例2琼胶酶粗酶液，三角瓶用保鲜膜封口后于45℃、200r/min振荡条件下酶解反应120min，可得未经分离纯化的琼胶寡糖，寡糖的主要成分是新琼四糖和新琼六糖，寡糖的得率可达80％以上。

Claims (4)

1.类芽孢杆菌（Paenibacillus sp.）WL-15，其特征在于该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC No：M2011357，保藏日期：2011年10月19日。

2.如权利要求1所述类芽孢杆菌WL-15在微生物发酵制备琼胶酶中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于应用为：将所述类芽孢杆菌WL-15菌种接种至适用于类芽孢杆菌的发酵产酶培养基中，25~35℃培养24~36h，获得含有琼胶酶的发酵液。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵产酶培养基组成如下：琼胶1~3g/L，NaNO₃4~6g/L，NaCl10~20g/L，MgSO₄·7H₂O4~6g/L，KCl1~2g/L，FeSO₄·7H₂O0.01~0.03g/L，CaCl₂0.1~0.3g/L，NaH₂PO₄0.5~1g/L，MnCl₂·4H₂O0.1~0.2g/L，溶剂为水，pH7~8。

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