CN104195080A

CN104195080A - 一株产褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN104195080A
Application number: CN201410419795.XA
Authority: CN
Inventors: 孙媛霞; 朱玥明; 陈朋; 门燕; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2014-08-23
Filing date: 2014-08-23
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-08-23
Also published as: CN104195080B

Abstract

本发明提供一株产褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07，保藏编号为CGMCC No.9391。本发明的芽孢杆菌Alg07具有如下的优点：(1)营养要求简单，发酵时间短；(2)粗酶液制备简单，离心即可得到粗酶液；(3)该芽孢杆菌Alg07所产褐藻胶裂解酶酶活高，未经纯化的粗酶液比酶活可达20000-40000U/mg(563U/mL)；(4)本发明中芽孢杆菌Alg07所产的褐藻胶裂解酶稳定好，在40℃保存24h，酶活无明显变化，在pH 5.5-8.5酶活较高且稳定。所产的褐藻胶裂解酶可降解海藻酸钠，生成具有生物活性的褐藻寡糖。

Description

一株产褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于功能微生物筛选技术领域，具体涉及一株产褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用。

背景技术

褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(β-D-1,4-mannuronic acid，简称M)和其5位差向异构体α-L-古罗糖醛酸(α-L-1,4-guluronicacid，简称G)以C-1,4糖苷键非均聚形成的线性分子。研究发现褐藻胶的降解产物褐藻寡糖具有抗肿瘤、抗凝血、增强植物抗逆性、促进肠道内双歧杆菌生长等众多生理活性，其功能评价和开发研究得到不断深入，活性及药用价值研究已经成为新的热点。褐藻寡糖的制备有多种方法，如酸降解法、氧化降解法、超声降解法和酶降解法等。褐藻胶裂解酶作为工具酶酶解生产褐藻寡糖和低分子量多糖具有降解条件温和，过程可控，得率高等优点，已逐渐取代传统的酸解方法而成为褐藻寡糖生产的主要方式。此外，褐藻胶裂解酶可以作为工具酶用于褐藻胶精细结构的分析，海藻单细胞及原生质体的制备，治疗囊性纤维化(CF)患者的肺部感染及生产生物燃料等。褐藻胶裂解酶通过β-消除反应催化降解褐藻胶单体间的1,4糖苷键，在C4，C5之间形成不饱和双键，并伴随4-O-糖苷键的消除，且在还原端生成4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyl uronic acid。褐藻胶裂解酶按其降解褐藻多糖作用方式的不同在EC(Enzyme classification)数据库中被分为多聚β-D-1,4-甘露糖醛酸裂解酶(EC 4.2.2.3)和α-L-1，4-古洛糖醛酸裂解酶(EC4.2.2.11)。在自然界中能够产生褐藻胶裂解酶的生物分布广泛，已报到产褐藻胶裂解酶的物种有海洋软体动物、棘皮动物、细菌、真菌等,其中对细菌产褐藻胶裂解酶的研究最多。目前褐藻胶裂解酶的产品开发依然面临菌株不安全、酶活力较低、酶稳定性差、酶的底物谱窄等问题。因此，筛选酶活力高、酶活稳定、产酶量高的褐藻胶裂解酶产生菌具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株产褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌及其应用，从而弥补现有技术的不足。

本发明的第一个目的在于提供了一株新型的高产褐藻胶裂解酶的芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07，该菌株已于2014年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.9391。

本发明的芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07用于生产褐藻胶裂解酶。

本发明还提供一种用于诱导上述芽孢杆菌发酵产褐藻胶裂解酶的培养基，其中的碳源包含有海藻酸或海藻酸盐；其中海藻酸盐优选为海藻酸钠；

且培养基中添加有Ca²⁺离子，其添加浓度优选为0.4％(w/v)。

本发明的第二个目的是提供了一种芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCCNo.9391产褐藻胶裂解酶的方法，其步骤如下：

1)将芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCC No.9391进行活化，将活化后的菌液涂布到固体培养基上；

2)制备芽孢杆菌Alg07的种子液：挑取步骤1)的固体培养基上的芽孢杆菌接种于装有发酵产酶培养基的容器中，培养温度为20-30℃，置于转速为150-230r/min的摇床上培养12-16h至对数期后期，既得到菌株的种子液；

3)发酵培养：在装有发酵产酶培养基的容器中接入步骤2)制备的种子液，培养温度为20-30℃，置于转速为150-230r/min的摇床上培养24-48h，得到发酵液；

4)产物检测：将步骤(3)的发酵液在8000-12000r/min下离心5-20min，收集上清液，即得到粗酶液，用DNS法或紫外吸收法测定酶活力。

其中步骤1)所述固体培养基配方为：海藻酸钠3-5g/L,蛋白胨1-5g/L,酵母粉1-10g/L,NaCl 0-20g/L，MgSO₄·7H₂O 1-5g/L，KCl 3-6g/L，琼脂10-20g/L。

步骤2)、3)所述发酵产酶培养基，其一种具体组成为：海藻酸钠6-12g/L,蛋白胨0-1g/L,酵母粉1-10g/L,NaCl 0-20g/L，MgSO₄·7H₂O 1-5g/L，KCl 3-6g/L，CaCl₂3-5g/L。

本发明提供了一株新型的产褐藻胶裂解酶的菌株Bacillus sp.Alg07，其优点主要体现在：(1)本发明芽孢杆菌Alg07营养要求简单，发酵时间短；(2)粗酶液制备简单，离心即可得到粗酶液；(3)该芽孢杆菌Alg07所产褐藻胶裂解酶酶活较高，未经纯化的粗酶液比酶活可达20000-40000U/mg(563U/mL)；(4)本发明中芽孢杆菌Alg07所产的褐藻胶裂解酶稳定好，在40℃保存24h，酶活无明显变化，在pH 5.5-8.5酶活较高且稳定。

本发明所述的芽孢杆菌Alg07所产的褐藻胶裂解酶可降解海藻酸钠，生成具有生物活性的褐藻寡糖，该菌株所产的褐藻胶裂解酶活力高，底物转化率高，是一株极具潜力的褐藻胶裂解酶生产菌株。

附图说明

图1：芽孢杆菌Alg07革兰氏染色图；

图2：依据16S rDNA序列构建的芽孢杆菌Alg07及相关菌种的系统发育树；

图3：海藻酸钠浓度对芽孢杆菌Alg07产褐藻胶裂解酶的影响图；

图4：CaCl₂浓度对芽孢杆菌Alg07产褐藻胶裂解酶的影响图；

图5：培养温度对芽孢杆菌Alg07产褐藻胶裂解酶的影响图；

图6：芽孢杆菌Alg07的发酵产酶曲线图；

图7：芽孢杆菌Alg07所产褐藻胶裂解酶生产褐藻寡糖质谱检测图。

具体实施方式

下面的实施例给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是实现本发明的方法不限于下述的实施例的具体记载，本领域的技术人员可以从现有技术中进行常规的选择。

实施例1：芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07的筛选鉴定及保藏

(1)菌株的筛选

从威海青渔滩海珍品养殖场取得腐烂海带样品，取5g样品放入盛有50mL富集培养基的250mL三角瓶中，在30℃，180r/min条件下摇瓶发酵培养。培养48h后，取5mL培养液至另一盛有50mL新鲜富集培养基的250mL三角瓶中，连续传代5次。将连续驯化5代的培养液用无菌生理盐水按照10^-3到10^-7进行梯度稀释，取0.1mL的稀释液涂布于初筛固体平板上，30℃恒温培养48h后，将能够在初筛培养基上生长且能产生透明圈的单菌落用平板划线法进行菌株的分离纯化。将分离纯化的菌种接入装有5mL复筛培养基的30mL试管中，30℃，180r/min条件下发酵培养48h。4℃(12000rpm·min-1，15min)离心，取上清液用改良的3,5-二硝基水杨酸法测定发酵上清液中的酶活力。

所述富集培养基、初筛培养基的配方如下：

富集培养基配方：褐藻酸钠5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，NaCl 19.45g/L，MgCl₂·6H₂O 12.6g/L，MgSO₄·7H₂O 6.64g/L，KCl 0.55g/L，NaHCO₃0.16g/L，FeC₆H₅O₇(柠檬酸铁)0.1g/L，pH自然。

初筛培养基配方：褐藻酸钠5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，NaCl 19.45g/L，MgCl₂·6H₂O 12.6g/L，MgSO₄·7H₂O 6.64g，KCl 0.55g，NaHCO₃0.16g，FeC₆H₅O₇(柠檬酸铁)0.1g/L，琼脂15g/L，pH自然。

(2)芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07的鉴定

经过筛选获得高产褐藻胶裂解酶的新型菌株，该菌株在在初筛培养基上生长48h后，菌落呈圆形，淡黄色，菌落较大，中间不透明，边缘半透明，表面粗糙。在显微镜下为杆状，有荚膜和孢子，能运动。革兰氏染色阳性(图1)。其可在15℃-45℃、pH 5.5-10.5、NaCl浓度0％-12％范围内生长，最适生长温度为37℃、最适生长pH为8.5。接触酶、氧化酶、V.P试验和明胶液化试验均为阳性，M.R试验、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用和明胶液化实验均为阴性。能利用D-葡萄糖、D-甘露糖、D-甘露醇、D-果糖、麦芽糖、纤维二塘、乳糖、淀粉，不能利用L-山梨糖、D-阿拉伯糖、D-半乳糖、海藻糖、纤维素。其16S rDNA序列为SEQ ID NO:1，系统进化树如图2所示。依据该菌菌体形态、生理生化特征和16S rDNA基因序列分析，将该菌株鉴定为芽孢杆菌属，并将其命名为芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07。

芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCC No.9391菌株已于2014年06月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.9391。

芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCC No.9391在初筛培养基上生长48h后，菌落呈圆形，淡黄色，菌落较大，中间不透明，边缘半透明，表面粗糙。菌株在显微镜下为杆状，有荚膜和孢子，能运动,革兰氏染色阳性(图1)。菌株Alg07可在15℃-45℃、pH 5.5-10.5、NaCl浓度0％-12％范围内生长，最适生长温度为37℃、最适生长pH为8.5。其他生理生化特征见表1。

表1：芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCC No.9391的生化特性

注：+表示能够利用，-表示不能利用。

实施例2、芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCC No.9391生产褐藻胶裂解酶的培养基成分优化

在250mL三角瓶中装入50ml发酵培养基，121℃高温蒸汽灭菌30min，将培养至对数期后期的种子液无菌接种到三角瓶，接种量为2％，30℃、180r/min条件下培养48h，测定酶活，所有实验设计三次平行。前一步优化的结果用于后续实验。

(1)碳源对芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCC No.9391产酶的影响

选用0.5％的葡萄糖、乳糖、甘露糖、D-甘露醇、麦芽糖、淀粉和海藻酸钠作为唯一碳源配制发酵培养基，结果表明，菌株Alg07只有以海藻酸钠为唯一碳源时才产酶，说明该菌株产生的褐藻胶裂解酶为诱导酶。以海藻酸钠为唯一碳源，测定不同浓度的海藻酸钠对菌株Alg07产酶的影响，结果发现当海藻酸钠浓度为0.9％时，褐藻胶裂解酶的酶活最高(图3)。

(2)CaCl₂浓度对芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCC No.9391产酶的影响

在发酵培养基中添加0.1％的MgSO₄·7H₂O、KCl、CaCl₂与0.005％的ZnSO₄·7H₂O、MnSO₄·H₂O、CuSO₄·5H₂O、FeSO₄·7H₂O、FeCl₃·6H₂O、FeC₆H₅O₇(柠檬酸铁)，测定不同的金属离子对产酶的影响，结果发现Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺对菌株产酶有促进作用，其他金属离子对菌株产酶都有不同程度的抑制作用。此基础上，研究了不同浓度的Mg²⁺、K⁺、Ca²⁺对菌株Alg07产酶的影响。在发酵培养基中分别添加0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％的MgSO₄·7H₂O、KCl、CaCl₂，实验发现，不同浓度MgSO₄·7H₂O、KCl对菌株Alg07的产酶无明显的规律性，CaCl₂对菌株的产酶促进作用明显，当CaCl₂浓度为0.4％时，褐藻胶裂解酶的酶活最高(图4)

优化后的发酵培养基配方为：海藻酸钠6-12g/L,蛋白胨0-1g/L,酵母粉1-10g/L,NaCl 0-20g/L，MgSO₄·7H₂O 1-5g/L，KCl 3-6g/L，CaCl₂3-5/L，pH自然，121℃高压蒸汽下灭菌20min。

实施例3、芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCC No.9391生产褐藻胶裂解酶的发酵条件优化

用优化后的发酵培养基配方配制发酵培养基，通过单因素试验对菌株Alg07发酵生产褐藻胶裂解酶的最适条件进行优化所有实验设计三次平行。前一步优化的结果用于后续实验。

(1)培养温度对芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCC No.9391产酶影响

温度是影响菌株生长代谢的重要环境因子，在优化的培养基条件下分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃发酵培养菌株48h,检测发酵液中褐藻胶裂解酶活力,结果显示，温度在20℃到30℃时，酶活较高，且无明显差异(附图5)，考虑到实际生产过程中培养温度过低难以控制，因此培养温度选择30℃。

2)装液量对芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCC No.9391产酶的影响

在250mL三角瓶中，分别加入10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL发酵培养基，发酵培养菌种48h，研究装液量对菌株产酶的影响。结果显示，当装液量为40mL时，菌株Alg07产褐藻胶裂解酶的酶活最高。由于该菌是好氧菌，当装液量大于50mL时，培养基中溶氧较低，酶活迅速下降(附图6)。

(3)发酵时间对芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCC No.9391产酶影响

以优化后的培养基成分与培养条件发酵培养菌株Alg07，测定不同发酵时间的菌体生物量与发酵上清液酶活。结果显示，菌株Alg07在16小时生物量即达到最大值，24小时发酵上清液酶活力最高，为563U/mL(图7)。

实施例4、利用芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCC No.9391生产褐藻胶裂解酶

(1)芽孢杆菌Alg07的活化

将保藏于甘油管中的菌株Bacillus sp.Alg07接种至自制固体培养基平板中，培养24-48h，如此反复转接若干次进行活化，自制固体培养基按如下组成配制：海藻酸钠3-5g/L,蛋白胨1-5g/L,酵母1-10g/L,NaCl 0-20g/L，MgSO₄·7H₂O1-5g/L，KCl 3-6g/L，琼脂10-20g/L，pH自然，121℃高压蒸汽下灭菌20min。

(2)芽孢杆菌Alg07种子液的获得

挑取自制固体培养基上的芽孢杆菌Alg07一环，接种于装有20-50mL发酵产酶培养基的250mL三角瓶中，培养温度为20-30℃，置于转速为150-230r/min的摇床上培养12-16h至对数期后期，既得到菌株Alg07的种子液。发酵产酶培养基按如下组成配制：海藻酸钠6-12g/L,蛋白胨0-1g/L,酵母粉1-10g/L,NaCl0-20g/L，MgSO₄·7H₂O 1-5g/L，KCl 3-6g/L，CaCl₂3-5g/L，pH自然，121℃高压蒸汽下灭菌20min。

(3)芽孢杆菌Alg07摇瓶发酵

在装有20-50mL发酵产酶培养基250mL三角瓶中接入0.5％-3％种子液，培养温度为20-30℃，置于摇床转速为150-230r/min的摇床上培养24-48h，得到发酵液，其活力达到563U/mL。

实施例5、利用芽孢杆菌(Bacillus sp.)Alg07 CGMCC No.9391所产褐藻胶裂解酶生产褐藻寡糖

取10g褐藻胶溶于1000mL水，加入10mL(Bacillus sp.)Alg07所产褐藻胶裂解酶粗酶液于40℃水浴中，酶解24-48h，升温100℃，灭活一小时，膜过滤，浓缩，冷冻干燥，得8.5g聚合度2-10的褐藻寡糖，所得产物的质谱检测如图7所示。结果表明本发明筛选菌株所制备的褐藻胶裂解酶能够有效的降解褐藻胶来生产褐藻寡糖。

Claims

1.一种芽孢杆菌，其特征在于，所述的芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.9391。

2.权利要求1所述的芽孢杆菌在制备褐藻胶裂解酶中的应用。

3.一种用于诱导权利要求1所述的芽孢杆菌发酵产褐藻胶裂解酶的培养基，其特征在于，所述的培养基中的碳源包含有海藻酸或海藻酸盐。

4.如权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述的海藻酸盐为海藻酸钠。

5.权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述培养基中添加有Ca²⁺离子。

6.如权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述的Ca²⁺离子的添加质量体积百分比浓度为0.4％。

7.一种使用权利要求1所述的芽孢杆菌制备褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤：

1)将芽孢杆菌进行活化，将活化后的菌液涂布到固体培养基上；

2)制备芽孢杆菌的种子液：挑取步骤1)的固体培养基上的芽孢杆菌接种于装有发酵产酶培养基的容器中，培养温度为20-30℃，置于转速为150-230r/min的摇床上培养12-16h至对数期后期，既得到菌株的种子液；

4)产物检测：将步骤(3)的发酵液在8000-12000r/min下离心5-20min，收集上清液，即得到褐藻胶裂解酶粗酶液。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述的步骤1)中的固体培养基配方为：海藻酸钠3-5g/L,蛋白胨1-5g/L,酵母粉1-10g/L,NaCl 0-20g/L，MgSO₄·7H₂O 1-5g/L，KCl 3-6g/L，琼脂10-20g/L。

9.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述的步骤2)、3)中的发酵产酶培养基的配方为：海藻酸钠6-12g/L,蛋白胨0-1g/L,酵母粉1-10g/L,NaCl0-20g/L，MgSO₄·7H₂O 1-5g/L，KCl 3-6g/L，CaCl₂3-5g/L。