CN109957536B - 一种枯草芽孢杆菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌突变菌株及其在海藻酸裂解酶生产中的应用。所述突变菌株是通过紫外诱变方法筛选获得的，能显著提高海藻酸裂解酶的产量，摇瓶发酵酶活能达到1500U/ml，比出发菌株提高了30.4％；20L罐发酵酶活高达3600U/ml，比出发菌提高了32％。所述突变菌株将有利于降低海藻酸裂解酶的生产成本，市场前景广阔。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌突变菌株及其在海藻酸裂解酶生产中的应用。

背景技术

海藻酸是储量仅次于纤维素的海洋生物多糖。海藻酸存在于海藻的细胞壁和细胞间质中，在褐藻中的含量最为丰富，大多数巨型褐藻是海藻酸的潜在来源。但不同种类的褐藻，其所含海藻酸的性质不同，所以要根据褐藻的可用性及其海藻酸的性质来选择褐藻的来源。海藻酸主要的商业来源是泡叶藻、公牛藻、翅藻、海带、巨藻、马尾藻和喇叭藻，其中最重要的是海带、巨藻和泡叶藻。全球海藻酸的产地主要分布于沿海国家和地区，如挪威、美国、法国、中国、日本和韩国。

目前，海藻酸降解的方法可分为三大类：一类是化学降解法，目前广泛采用的是酸水解法，这种方法操作步骤繁琐，反应条件剧烈。此外，还有过氧化氢氧化降解法；第二类是物理降解法，例如超声降解海藻酸；第三类是海藻酸裂解酶酶解法，酶法降解海藻酸条件温和，过程可控，得率高，绿色安全，环境友好，作用机理明确，产物确定，可以根据具体目的产物要求选择单一或组合使用不同底物专一性的酶制剂。

海藻酸裂解酶通过β消去反应裂解海藻酸的4-O-糖基键，同时在C-4和C-5 之间形成双键，在产生的寡糖的非还原端产生4-deoxy-L-erythro-hex-4-ene pyranosyluronate在230-240mm有强吸收峰。按底物的特异性，海藻酸裂解酶分为三种：第一种是聚甘露糖醛酸裂解酶，对polyM有特异性；第二种是聚古罗糖醛酸裂解酶，对polyG有特异性；第三种是对polyMG有特异性的裂解酶。按作用方式又可分为内切海藻酸裂解酶和外切海藻酸裂解酶。

海藻酸裂解酶的来源广泛，主要有三大类，第一类是微生物，如海洋细菌、土壤细菌、真菌等；第二类是海洋软体动物和棘皮动物，如海螺、海参、鲍鱼等；第三类是植物，如巨藻、泡叶藻、海带等。

目前，海藻酸裂解酶的生产大多是依靠海藻酸分解菌。虽然野生型海藻酸分解菌能有效的获得定量的酶蛋白，但产量很低成本较高，难达到实际应用要求。因此，利用基因工程手段对海藻酸裂解酶基因进行异源表达是提高海藻酸裂解酶产量的最有效途径。研究主要集中在海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因的克隆和在大肠杆菌中过表达。目前，已有二十多种海藻酸分解菌的海藻酸裂解酶基因被克隆，而且其中大部分基因已成功地进行了异源表达。重组海藻酸裂解酶的表达量均高于野生菌株。1993年，Maki等研究人员，在大肠杆菌中表达了 Pseudomonas sp.OS-AIG-9的海藻酸裂解酶，其重组酶活性是野生菌株的53倍。

目前开发海藻酸裂解酶高产菌株仍是本领域的研究热点，对于降低海藻酸裂解酶的生产成本具有重要的意义。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种高产海藻酸裂解酶的枯草芽孢杆菌。所述菌株是通过紫外诱变的方法筛选获得的突变菌株，其海藻酸裂解酶产量得到明显提高，有利于大幅降低该酶的生产成本，市场前景广阔。

为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

本发明一方面提供了一株突变菌枯草芽孢杆菌ALY-38(Bacillus subtilis ALY-38)，已于2017年12月4日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017758。

所述的枯草芽孢杆菌工程菌，其携带有表达海藻酸裂解酶基因的重组载体。

所述海藻酸裂解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ IDNO:2。

本发明还提供了所述枯草芽孢杆菌在发酵生产海藻酸裂解酶中的应用。

本发明还提供了一种生产海藻酸裂解酶的发酵方法，是以所述枯草芽孢杆菌为发酵菌株。

本发明通过紫外诱变方法筛选获得的突变菌株枯草芽孢杆菌ALY-38能显著提高海藻酸裂解酶的产量，摇瓶发酵酶活能达到1500U/ml，比出发菌株提高了30.4％；20L罐发酵酶活高达3600U/ml，比出发菌提高了32％。多次发酵试验也证明突变菌ALY-38产海藻酸裂解酶的水平保持稳定。该突变菌株产海藻酸裂解酶的最适作用pH值为6.5，最适作用温度为60℃，较出发菌没有发生改变，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株将有利于降低海藻酸裂解酶的生产成本，市场前景广阔。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001) 和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。

一、本发明实施例中所述培养基中各组分及其含量分别为：

LB平板：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％，琼脂1.5％；

LB液体培养基：胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％；

1*最低盐溶液：K₂HPO₄ 14g/L，KH₂PO₄ 6g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，柠檬酸三钠 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2g/L；

GM I溶液：1*最低盐溶液95.6ml，20％葡萄糖2.5ml，5％水解酪蛋白0.4ml， 10％酵母粉汁1ml；

GM II溶液：1*最低盐溶液96.98ml，20％葡萄糖2.5ml，5％水解酪蛋白0.08ml，10％酵母粉汁0.04ml，1M MgCl₂ 0.25ml，1M CaCl₂ 0.05ml；

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5％，蛋白胨1％，NaCl 0.5％，琼脂1.5％，pH 7.2。

二、本发明实施例中所述海藻酸裂解酶酶活的测定方法如下：

1、酶活力单位定义

在40℃，pH为7.5条件下，在本方法规定反应体系下，每分钟降解底物海藻酸钠产生不饱和键，在235nm下，吸光度每增加0.1，为一个酶活单位U。

2、原理

海藻酸裂解酶可以通过β-消除反应切断海藻酸分子中的糖苷键，产生非还原性端具有不饱和双键，双键位于产物非还原末端C₄、C₅之间，并在235nm处产生最大紫外吸收。

3、测定方法

3.1液体样品：用缓冲液稀释至适当倍数，控制在吸光值OD₂₃₅在0.22-0.35之间，酶活约为0.5U/mL。

3.2测定步骤

酶反应：取三支15mm*150mm试管，加入1.8mL底物，40℃水浴预热5min，加入稀释好的酶液0.2mL，准确计时，涡旋震荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2mL磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。

空白：取15mm*150mm试管，加入1.8mL底物，40℃水浴预热5min，加入缓冲液0.2mL，涡旋震荡，40℃保温10min，将试管从水浴中取出并立即加入2mL 磷酸终止液，涡旋振荡，将试管放置在水浴锅外的试管架上。

比色：每个样品的空白和酶反应终止后，立即在235nm比色，并记录吸光值A₀和A_样。

备注：

8.计算

X＝(A₀－A_样)×2×N/(t×0.1)

式中：

X—酶活力，U/mL或U/g

2—加入2mL磷酸终止液的体积系数

t(min)—酶促反应时间(在酶反应的线性范围内)

0.1—体系系数，即将吸光值增长单位换算为0.1

N—稀释倍数

经简化：酶活力(U/mL)＝(A₀－A_样)×2×N。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1枯草芽孢杆菌表达载体的构建

1.1基因克隆

根据NCBI的公开报道，人工合成海藻酸裂解酶基因，并根据枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的密码子偏爱性进行优化。以合成的基因为模板，利用下述引物进行PCR扩增：

引物szx302-F：ggcgttcagcaacatgagcgcgcaggctcaggataaaaaatctaaatct；

引物szx302-R：ccgtcctctgttaacctcgagttattattaatgcgtcacctgaagacta；

PCR扩增条件为95℃4min；94℃30S，59℃40S，72℃1min 30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。

1.2测序分析

将1.1中回收的扩增产物连接到pSZX302质粒，获得重组质粒 ALY-pSZX302，并送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序结果显示，扩增得到的海藻酸裂解酶基因序列为SEQ ID NO:2，其编码氨基酸序列为SEQ ID NO:1，将该基因命名为AL。多个克隆的结果证明没有发生扩增错误。

实施例2转化与筛选

2.1转化

将测序正确的重组质粒ALY-pSZX302转化入宿主菌枯草芽孢杆菌F4 (Bacillussubtilis F4)，获得重组表达海藻酸裂解酶AL的枯草芽孢杆菌菌株，并将其命名为枯草芽孢杆菌F4-szx302(Bacillus subtilis F4-szx302)。

具体转化过程如下：将新鲜活化的枯草芽孢杆菌F4由LB平板接种到5ml GMⅠ溶液中，30℃、125rpm振荡培养过夜，得到培养液A；取2ml培养液A 转接到18ml GMⅠ溶液中，37℃、250rpm培养3.5h，得到培养液B；取10ml 培养液B转接到90ml GMⅡ溶液中，37℃、125rpm培养90min后，得到培养液C；5000g、10min离心收集培养液C中的菌体，用10ml GMⅡ溶液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。然后在0.5ml感受态细胞中加入适量实施例1扩增得到的海藻酸裂解酶DNA，37℃、200rpm振荡培养30min后涂LB平板(含5μg/mL氯霉素)，37℃培养过夜，次日检查和验证转化子。

2.2拷贝数扩增

将2.1中获得的重组菌株枯草芽孢杆菌F4-szx302进行拷贝数扩增。

具体过程如下：将枯草芽孢杆菌F4-szx302划线LB平板(含5μg/mL氯霉素)；挑取单个菌落到20mL LB液体培养基(含25μg/mL氯霉素)中，37℃、 250rpm培养24h，梯度稀释涂布LB平板(含25μg/mL氯霉素)；再次挑取多个单菌落到20mL LB液体培养基(含50μg/mL氯霉素)中，37℃、250rpm培养24h，梯度稀释涂布LB平板(含50μg/mL氯霉素)，平板上获得的即为高拷贝重组菌株，命名为枯草芽孢杆菌F4-szx302-G(Bacillus subtilis F4-szx302-G)。

2.3紫外诱变

将多拷贝重组菌株枯草芽孢杆菌F4-szx302-G在含50μg/mL氯霉素的牛肉膏蛋白胨斜面培养基上划线接种，37℃培养48h；用5mL 0.85％的生理盐水将斜面上的菌全部冲洗下来，转入无菌的含有玻璃珠的试管中；涡旋振荡10min，完全打成单细胞菌体；将菌悬液全部转入15mL离心管，6000rpm离心3min 收集菌体；去上清，用10mL 0.85％生理盐水悬浮菌体；洗涤细胞两次，最后调整细胞浓度至10⁸/mL。

打开9W紫外灯开关，预热约30min。取直径9cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为10⁸/mL的菌悬液10mL，放入一根无菌磁力搅拌器；打开磁力搅拌器，然后打开皿盖，在垂直距离为15cm处，搅拌照射1min，盖上皿盖，关闭紫外灯，黑暗中孵育30min。

将照射后的菌悬液用0.85％生理盐水10倍稀释法梯度稀释成10^-1～10^-6；取 10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的菌悬液各100μL，涂布牛肉膏蛋白胨平板，每个稀释度涂布三个平板，用无菌玻璃棒均匀涂满整个平板表面。将上述涂布均匀的平板，用黑布或报纸包好后，置37℃过夜培养。

挑取平板上长出的单菌落，在含50μg/mL氯霉素的牛肉膏蛋白胨平板上划线纯化；挑取单菌落，划线接种于含50μg/mL氯霉素的牛肉膏蛋白胨斜面保种；共富集筛选到75株突变菌株，分别命名为ALY-1、ALY-2、ALY-3……ALY-75。

2.4摇瓶初筛

将富集到的75株突变菌株与出发菌株枯草芽孢杆菌F4-szx302-G同时在发酵培养基(酵母浸粉0.5％，胰蛋白胨0.5％，葡萄糖1％，K₂HPO₄ 1.8％)中摇瓶发酵48h后，5000g、10min离心收集上清液，分别测定上清液中海藻酸裂解酶酶活。结果显示，发酵上清液中海藻酸裂解酶酶活最高的三株突变菌分别为ALY-4 1、ALY-38和ALY-73，其酶活分别为1442U/ml，1500U/ml和1410 U/ml，比出发菌枯草芽孢杆菌F4-szx302-G分别提高了25.4％，30.4％和22.6％。

2.5 20L罐发酵筛选

分别挑取突变菌株ALY-4、ALY-38和ALY-73单菌落接种于0.6L种子培养基(胰蛋白胨1％，酵母粉0.5％，NaCl 1％)中，34℃、210rpm振荡培养8h；将0.6L种子培养液完全接种到含12L发酵培养基(酵母浸粉0.5％，胰蛋白胨 0.5％，葡萄糖1％，K₂HPO₄ 1.8％)的20L发酵罐中，34℃发酵培养36h，然后分别检测发酵上清液的酶活。结果显示，突变菌ALY-4和ALY-73的发酵酶活较出发菌株仅提高了18.1％和20.2％，而突变菌ALY-38的发酵酶活比出发菌提高了32％，酶活高达3600U/ml，取得了意料不到的技术效果。多次发酵试验也证明突变菌ALY-38产海藻酸裂解酶的水平保持稳定。

实施例3枯草芽孢杆菌ALY-38产海藻酸裂解酶的酶学性质分析

3.1最适pH分析

分别用pH值为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液稀释枯草芽孢杆菌ALY-38发酵上清液，在40℃条件下测定发酵上清液的酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线，同时以出发菌枯草芽孢杆菌F4-szx302-G的发酵上清液作为对照组。结果显示，本发明获得的突变菌株枯草芽孢杆菌ALY-38产海藻酸裂解酶酶的最适作用pH值为6.5，与出发菌产海藻酸裂解酶的最适作用pH值一致。

3.2最适温度分析

分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃， pH 6.5的条件下测定枯草芽孢杆菌ALY-38发酵上清液的酶活，以最高酶活为 100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线，同时以出发菌枯草芽孢杆菌 F4-szx302-G的发酵上清液作为对照组。结果显示，本发明获得的突变菌株枯草芽孢杆菌ALY-38产海藻酸裂解酶的最适作用温度为60℃，与出发菌产海藻酸裂解酶的最适作用温度一致。

综上，本发明通过紫外诱变方法筛选获得的突变菌株枯草芽孢杆菌ALY-38 能显著提高海藻酸裂解酶的产量，20L罐发酵酶活高达3600U/ml,较出发菌提高了12％，且该突变菌株产海藻酸裂解酶的酶学性质较出发菌没有发生改变。

申请人将突变菌株ALY-38命名为枯草芽孢杆菌ALY-38(Bacillus subtilis ALY-38)，并已于2017年12月4日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017758。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

潍坊康地恩生物科技有限公司

<120> 一种枯草芽孢杆菌及其在海藻酸裂解酶生产中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Ile Gln Phe Ser Lys Ile Leu Leu Leu Thr Val Leu Ala Thr

1 5 10 15

Ala Thr Ile Ser Asn Ala Gln Asp Lys Lys Ser Lys Ser Lys Thr Ala

20 25 30

Lys Ile Asp Trp Ser His Trp Thr Val Thr Val Pro Glu Glu Asn Pro

35 40 45

Asp Lys Pro Gly Lys Pro Tyr Ser Leu Gly Tyr Pro Glu Ile Leu Asn

50 55 60

Tyr Ala Glu Asp Lys Ile Ala Ser Lys Tyr Met Tyr Asp Asp Pro Lys

65 70 75 80

Asp Lys Ser Val Val Phe Tyr Ala Phe Pro Ser Gly Val Thr Thr Ala

85 90 95

Asn Thr His Tyr Ser Arg Ser Glu Leu Arg Glu Thr Met Glu Thr Gly

100 105 110

Ser Asn Lys Val Asn Trp Thr Phe Ala Lys Gly Gly Lys Met Arg Gly

115 120 125

Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Ile Ser Lys Glu Pro Asp Gly Lys Tyr Ser

130 135 140

Arg Val Ile Ile Ala Gln Ile His Gly Val Leu Thr Asp Glu Gln Arg

145 150 155 160

Asp Leu Ile Gly Gln Lys Asp Asn Asn Ala Pro Pro Ile Leu Lys Val

165 170 175

Tyr Trp Asp Lys Gly Lys Ile Arg Val Lys Thr Lys Val Leu Lys Asp

180 185 190

Leu Asn Ala Pro Tyr Lys Glu Met Leu Leu Glu His Ala Trp Gly Asp

195 200 205

Asp Glu Gly Arg Asn Phe Lys Glu Lys Ile Asp Leu Asn Thr Arg Phe

210 215 220

Thr Leu Glu Val Lys Val Ser Asp Gly Arg Met Glu Val Ile Leu Asn

225 230 235 240

Asp Thr Glu Ser Leu Val Tyr Asp Asp Ile His Met Lys Lys Trp Gly

245 250 255

Ile Phe Glu Asn Tyr Phe Lys Ala Gly Asn Tyr Phe Gln Ser Lys Thr

260 265 270

Pro Gly Thr Phe Ala Lys Val Lys Ile Tyr Ser Leu Gln Val Thr His

275 280 285

<210> 2

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtctatcc agttttctaa aattctgtta cttacggtgc tggctacagc tacgattagc 60

aatgcacagg ataaaaaatc taaatctaaa acggcgaaaa tcgattggtc acattggacg 120

gtcacggtcc ctgaagaaaa tccggataaa ccgggcaaac cgtatagctt aggctatccg 180

gaaatcttga attatgcgga agataaaatt gcgagtaaat atatgtatga tgatccgaaa 240

gataaatcag ttgtctttta tgcgtttccg agcggcgtga cgacagcgaa tacgcattat 300

agccgctcag aacttcgcga aacaatggaa acaggaagca ataaagttaa ttggacattt 360

gctaaaggag gcaaaatgag aggcacgtat gcgatcgatg atattagcaa agaaccggat 420

ggcaaatatt ctcgggttat catcgcgcag attcatggag tgttgacgga tgaacaacgt 480

gatctgatcg gccagaaaga taataatgca cctcctatcc ttaaagtgta ttgggataaa 540

ggcaaaattc gcgtcaaaac gaaagtgctg aaagacctta atgcgccgta taaagaaatg 600

ttactggaac atgcgtgggg agatgatgaa ggacgtaatt ttaaagaaaa aatcgatttg 660

aatacacgct ttacgcttga agtcaaagtc tctgatggcc gcatggaagt catccttaat 720

gatacagaat cacttgtgta tgatgacata cacatgaaaa aatggggcat ctttgaaaat 780

tattttaaag cgggcaatta ttttcagagc aaaacacctg gcacgtttgc taaagtcaaa 840

atctattcac ttcaggtgac acat 864

Claims (3)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) ，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M2017758。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在发酵生产海藻酸裂解酶中的应用。

3.一种生产海藻酸裂解酶的发酵方法，其特征在于，所述的方法是以权利要求1所述的枯草芽孢杆菌为发酵菌株进行发酵来生产海藻酸裂解酶。