CN103789227B - 一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株保藏号为CCTCC NO：M2013626高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株，是在保藏号为CCTCC NO:M2012499的枯草芽孢杆菌AP1基础上，通过紫外诱变的方法筛选得到的突变株。所述突变株能显著提高碱性蛋白酶的产量，20L罐发酵酶活高达10132U/ml,较枯草芽孢杆菌AP1提高了12%，且突变株表达的碱性蛋白酶的酶学性质较枯草芽孢杆菌AP1没有发生改变，可广泛应用于洗涤剂领域。在相同酶活添加量的情况下，本发明突变株产碱性蛋白酶对国际污布EMPA116及EMPA117上的去污效果均显著优于竞争产品碱性蛋白酶，市场前景广阔。

Description

一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株

技术领域

本发明属于基因工程微生物构建筛选技术领域，具体涉及一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株。

背景技术

碱性蛋白酶(alkaline protease)是指在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，其主要成分是一种内切蛋白酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27kDa。国内工业生产蛋白酶的菌株多是经枯草芽孢杆菌2709选育而来，是通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶。碱性蛋白酶广泛应用于食品、医疗、酿造、丝绸、制革等行业，是工业用酶中占据比例最大的酶类，约占全世界每年总销售量的60%左右（Mala B.R.等，1998，Microbiology and Molecular BiologyReviews）。

碱性蛋白酶是目前市场上畅销的洗涤添加剂，能大幅度提高洗涤剂的去污效果，特别对血渍、汗渍、奶渍、油渍等蛋白类污垢具有独特的洗涤效果。但目前碱性蛋白酶产品普遍被诺维信和杰能科两大酶制剂国际公司垄断，其具有酶活水平高、溶解速度快以及与洗涤剂配伍时耐受性强的优点。国内酶制剂企业要扩大在洗涤酶领域的市场份额，除了加速开发出发酵酶活高的新型碱性蛋白酶外，也需要提高碱性蛋白酶的产量，从而降低生产成本。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株及其应用。本发明在枯草芽孢杆菌AP1（Bacillus subtilis AP1）（保藏号为CCTCC NO:M2012499）的基础上，通过紫外诱变的方法筛选出一株碱性蛋白酶高产菌株，该高产菌株能高效分泌表达碱性蛋白酶，为低成本、规模化生产碱性蛋白酶奠定了基础。

本发明一方面涉及一种枯草芽孢杆菌突变株，为枯草芽孢杆菌AP2（Bacillussubtilis AP2），已于2013年12月2日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏号为CCTCC NO：M2013626。

本发明另一方面涉及上述枯草芽孢杆菌突变株的应用，是用于生产碱性蛋白酶。

上述枯草芽孢杆菌突变株生产的碱性蛋白酶在洗涤剂中的应用。

本发明通过紫外诱变的方法获得了一株高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌突变株。所述突变株能显著提高碱性蛋白酶的产量，20L罐发酵酶活高达10132U/ml,较出发菌提高了12%，且突变株表达的碱性蛋白酶的酶学性质较出发菌没有发生改变，可广泛应用于洗涤剂领域。在相同酶活添加量的情况下，本发明突变株产碱性蛋白酶对国际污布EMPA116及EMPA117上的去污效果均显著优于竞争产品碱性蛋白酶，市场前景广阔。

附图说明

图1：枯草芽孢杆菌AP1、AP1-56、AP1-63和AP1-6920L罐发酵酶活比较图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。

对于本发明所涉及的术语及相关测定方法解释如下：

1、蛋白酶酶活测定方法：采用中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂测定方法（GB/T25327-2009）。

2、酶活单位的定义：1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，即为1个酶活力单位，以U/g(U/mL)表示。

3、碱性蛋白酶运用福林法测定蛋白酶的活力，使用到的溶液包括：福林使用溶液（一份市售福林溶液与两份水混合，摇匀），碳酸钠溶液（42.4g/L），三氯乙酸（65.4g/L），梯度pH值缓冲液，酪蛋白溶液（10.0g/L）。反应过程如下：试管中加入1mL酶液，40℃温浴2min，加入酪蛋白溶液1mL，摇匀后40℃温浴10min，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀（空白对照先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液）。取出静止10min，慢速定性滤纸过滤。取1mL滤液，加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液1mL，40℃显色20min，于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。

实施例1枯草芽孢杆菌AP1的紫外诱变与筛选

1.1确定诱变筛选标记

将枯草芽孢杆菌AP1（2012年12月5日保藏于中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2012499）在含25μg/mL卡那霉素的牛肉膏蛋白胨平板（牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，琼脂1.5%，pH7.2）上划线，37℃过夜培养。

挑取单菌落，接种至含有不同抗生素的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、220rpm过夜振荡培养。枯草芽孢杆菌AP1在不同抗生素中的生长情况如表1所示。

表1：枯草芽孢杆菌AP1抗性验证

注：+越多表示菌浓度越高，+-表示菌悬液略微变浑浊，-表示菌体在该培养基中不生长。

如表1所示，枯草芽孢杆菌AP1对5μg/mL新霉素和利福平比较敏感，且申请人在试验中发现，枯草芽孢杆菌AP1对利福平高度敏感，0.1μg/mL的利福平即可抑制枯草芽孢杆菌AP1的生长，所以申请人最终选择利福平（0.1μg/mL）作为诱变的筛选标记，用于富集筛选突变株，过滤掉未发生突变的野生型菌株，从而减少筛选的工作量。

1.2菌悬液制备

将枯草芽孢杆菌AP1在含25μg/mL卡那霉素的牛肉膏蛋白胨斜面（牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl0.5%，琼脂1.5%，pH7.2）上划线接种，37℃培养48h；加入5mL0.85%生理盐水，将斜面上的菌全部冲洗下来，转入无菌的含有玻璃珠的试管中；涡旋振荡10min，完全打成单细胞菌体；将菌悬液全部转入15mL离心管，6000rpm离心3min收集菌体；去上清，用10mL生理盐水悬浮菌体；洗涤细胞两次，最后调整细胞浓度至10⁸/mL。

1.3紫外诱变处理及诱变剂量确定

打开9W紫外灯开关，预热约30min。取直径9cm无菌平皿，加入上述细胞浓度为10⁸/mL的菌悬液10mL，放入一根无菌磁力搅拌器；打开磁力搅拌器，然后打开皿盖，在垂直距离为15cm处，分别搅拌照射1min、2min、3min、4min、5min；盖上皿盖，关闭紫外灯，黑暗中孵育30min。

将照射后的菌悬液用0.85%生理盐水10倍稀释法梯度稀释成10^-1～10^-6；取10^-4、10^-5、10^-6三个稀释度的菌悬液各100μL，涂布牛肉膏蛋白胨平板，每个稀释度涂布三个平板，用无菌玻璃棒均匀涂满整个平板表面；以同样的操作，取未经紫外线照射的菌液稀释涂平板作对照。将上述涂布均匀的平板，用黑布或报纸包好后，置37℃过夜培养。

统计不同照射时间时每个稀释度下平板上长出的单菌落数，若在某个稀释度下平板上长出的单菌落数在30～300个之间，则认为该稀释度合适。将该稀释度下三个平板上长出的单菌落数求平均值，按下列公式计算菌悬液浓度：

菌悬液浓度(CFU/mL)＝某个稀释度下的菌格平均数×稀释倍数×10

按下列公式计算某个紫外处理剂量下的致死率：

经计算，不同紫外诱变剂量下枯草芽孢杆菌AP1的致死率如表2所示。

表2：紫外线诱变致死率

从表2的数据可以看出，菌悬液经紫外照射1min后致死率达到95%以上，因此最终确定诱变时间为1min。

1.4利福平抗性平板初筛

紫外照射处理1min后，菌悬液中活细胞浓度约10⁶/mL；在每个牛肉膏蛋白胨平板（含利福平0.1μg/mL）上均匀涂布800μL上述菌悬液；用黑布或报纸包好，37℃培养72h；挑取平板上长出的单菌落，在含0.1μg/mL利福平、25μg/mL卡那霉素的牛肉膏蛋白胨平板上划线纯化；挑取单菌落，划线接种于含25μg/mL卡那霉素的牛肉膏蛋白胨斜面保种；共富集筛选到75株利福平抗性突变株。

1.5摇瓶复筛

将富集到的75株利福平抗性突变株（菌株命名为AP1-1、AP1-2、AP1-3……AP1-75）与出发菌株枯草芽孢杆菌AP1同时在发酵培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K₂HPO₄1.8%，卡那霉素25μg/mL）中摇瓶发酵，48h后测定蛋白酶酶活，共得到3株酶活较高的突变株，分别为枯草芽孢杆菌AP1-56、AP1-63和AP1-69。

将上述3株突变株在牛肉膏蛋白胨平板上传代5次后，再次挑取单菌落进行摇瓶发酵，酶活仍能提高50%以上，说明本发明获得的3株突变株多次传代后，还能保持遗传上的稳定性。

1.620L罐发酵筛选

分别挑取枯草芽孢杆菌AP1、AP1-56、AP1-63、AP1-69单菌落接种于0.6L种子培养基（胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl1%，卡那霉素25μg/mL）中，34℃、210rpm振荡培养8h；将0.6L种子培养液完全接种到含12L发酵培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K₂HPO₄1.8%）的20L发酵罐中，34℃发酵培养36h，然后分别检测发酵液酶活。结果如图1所示，枯草芽孢杆菌AP1-56和AP1-69的发酵酶活较出发菌株AP1略有下降，而枯草芽孢杆菌AP1-63的发酵酶活较出发菌AP1提高了12%，酶活高达10132U/ml。多次发酵试验也表明AP1-63株的产碱性蛋白酶的水平保持稳定。

将突变株AP1-63命名为枯草芽孢杆菌AP2（Bacillus subtilis AP2），并于2013年12月2日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏管理中心，保藏编号为CCTCC NO:M2013626。

实施例2枯草芽孢杆菌AP2产蛋白酶的酶学性质分析

2.1最适pH分析

分别用pH值为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0的缓冲液稀释枯草芽孢杆菌AP2发酵上清液，在40℃条件下测定发酵上清液的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果表明，本发明获得的突变株枯草芽孢杆菌AP2产碱性蛋白酶的最适作用pH值为12.0，与出发菌株AP1产碱性蛋白酶的最适作用pH值一致。

2.2最适温度分析

分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，pH10.5的条件下测定枯草芽孢杆菌AP2发酵上清液的酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果表明，本发明获得的突变株枯草芽孢杆菌AP2产碱性蛋白酶的最适作用温度为60℃，与出发菌株AP1产碱性蛋白酶的最适作用温度一致。

综上，本发明通过紫外诱变方法获得的突变株枯草芽孢杆菌AP2能显著提高碱性蛋白酶的产量，20L罐发酵酶活高达10132U/ml,较出发菌AP1提高了12%，且AP2产碱性蛋白酶的酶学性质较出发菌AP1没有发生改变。

实施例3枯草芽孢杆菌AP2产碱性蛋白酶在洗涤剂中的应用

取枯草芽孢杆菌AP2发酵上清液，按表3所述比例加入化学稳定剂、防腐剂等组分，在40℃温度下搅拌15-30min，充分溶解，混合均匀后，冷却至室温，即可制得一种稳定性较好的液体碱性蛋白酶制剂。用该液体碱性蛋白酶制剂和市场竞争产品进行同等酶活（1000U/mL）加量条件下的去污值比较（测试标准：国标GB/T13174-2008，《衣料用洗涤剂去污力及循环洗涤性能的测定》），结果如表4所示。

表3：液体碱性蛋白酶组分及含量

表4：不同液体碱性蛋白酶在市售洗衣液中的去污值测定数据

从表4的结果可以知道，在相同酶活添加量的情况下，本发明的液体碱性蛋白酶对国际污布EMPA116及EMPA117上的去污效果均显著优于竞争产品碱性蛋白酶。

综上，本发明通过紫外诱变获得的蛋白酶高产菌株AP2表达的碱性蛋白酶可广泛用于洗涤领域，显著提高洗涤剂的去污效果，市场前景广阔。

Claims (2)

1.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其特征在于，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO：M2013626。

2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌在生产碱性蛋白酶中的应用。