CN108441489B

CN108441489B - 一种蛋白生产方法及高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌

Info

Publication number: CN108441489B
Application number: CN201810308672.7A
Authority: CN
Inventors: 黄亦钧; 张霞; 齐建; 石增秀
Original assignee: Weifang Kdn Biotech Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Weifang Kdn Biotech Co ltd; Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2018-04-09
Filing date: 2018-04-09
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2038-04-09
Also published as: CN108441489A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体提供了一种蛋白的生产方法，以及稳定、高效表达碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌工程菌株。所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M2018083，发酵酶活高达17240U/ml，而且传代10次后，发酵酶活没有明显降低，有利于提高碱性蛋白酶的产量，保持生产的稳定性，加快碱性蛋白酶的推广应用。

Description

一种蛋白生产方法及高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种蛋白的生产方法，并涉及一种高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌菌株。

背景技术

碱性蛋白酶（Alkaline protease）是指在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，1913年Rohm首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用，1945年瑞士Dr. Jaag等人在地衣芽孢杆菌（ Bacillus licheniformis）中发现了碱性蛋白酶。有数据显示，全世界工业用酶每年销售额大约为1亿美元，在所有的工业用酶制剂中75%是蛋白水解酶，而蛋白酶是工业用酶中占据比例最大的酶类，大约占全世界每年总销售量的60%左右。

碱性蛋白酶在食品、洗涤及制革等行业中有着广泛的用途。由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单、快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性，同时易于实现工业化生产。而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性且有一定的酯酶活力。因此，碱性蛋白酶研究成为蛋白酶研究的热点。

目前，国外碱性蛋白酶主要应用于洗涤及皮革等行业中，99%以上洗涤剂均添加了碱性蛋白酶，因此市场需求出现了供不应求的现象。相信随着碱性蛋白酶研究的进一步深入，该现象将会得到有效的缓解。当前国外碱性蛋白酶高产菌株的选育主要用基因工程技术和蛋白质工程手段进行工业微生物菌种的定向选育，目的性强，而且酶结构研究得也比较的深入。Tsuyoshi Nonaka等人研究了枯草杆菌抗氧化性稳定性并期望能应用于洗涤剂行业。Kunamneni Adinarayana等人研究了枯草芽孢杆菌PE-11的热稳定性。

碱性蛋白酶主要产生菌及研究对象有：地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜碱性芽孢杆菌(Bacillussp)和链霉菌(如灰色链霉菌、费氏链霉菌等)以及霉菌。其中芽孢杆菌是碱性蛋白酶生产应用最广泛的菌种之一。芽孢杆菌作为外源基因表达系统主要有以下几个优点：（1）芽孢杆菌是公认安全的微生物生产菌株（GRAS），具有非致病性和无毒性的特点；（2）分泌表达，生长快周期短，使下游回收和纯化蛋白处理较为简单和经济。尽管芽孢杆菌系统具有安全性好和环保等优点，但也存在一些缺点：（1）能够产生大量的胞外蛋白酶，往往造成表达产物的大量降解；（2）存在限制和修饰系统，使分子操作困难和质粒不稳定。

目前，已开发的商业化的枯草芽孢杆菌表达系统的缺点是：（1）选用游离质粒表达方法，大规模发酵生产时，游离质粒不稳定，存在丢失现象，造成目标蛋白产量降低，生产不稳定；（2）选用高拷贝整合表达方法，虽然可以克服质粒表达丢失的问题，提高目标蛋白的产量；但是在生产过程中会出现拷贝数越来越低，生产不稳定的现象；（3）选用单拷贝整合表达方法，虽然可以克服质粒表达丢失和拷贝数降低的问题，维持生产的稳定性；但单拷贝整合情况下，目标蛋白的产量普遍偏低，难以满足生产的需要。因此，如何提高碱性蛋白酶在芽孢杆菌中的产量，同时又能保持生产的稳定性是当前急需解决的问题。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种蛋白的生产方法，以及稳定、高效表达碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌，有利于提高碱性蛋白酶的产量，保持生产的稳定性，加快该酶的推广应用。

本发明一方面涉及一种蛋白的生产方法，包括：

1）将rrnO启动子有效连接至编码目的蛋白的核酸上；

2）将核酸转化入枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）宿主细胞中，构建得到枯草芽孢杆菌工程菌；

3）以枯草芽孢杆菌工程菌为菌种进行发酵。

步骤1）所述的rrnO启动子的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

步骤1）所述目的蛋白优选蛋白酶。

所述蛋白酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明进一步涉及一种枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis），所述菌株携带有表达上述蛋白酶基因的表达载体。

所述枯草芽孢杆菌命名为枯草芽孢杆菌VP-2（ Bacillus subtilis VP-2），已于2018年2月5日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2018083。

本发明还涉及所述枯草芽孢杆菌在碱性蛋白酶生产中的应用。

申请人通过对大量启动子进行筛选，发现采用rrnO启动子，可以实现碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的单拷贝整合型高效表达，获得的枯草芽孢杆菌VP-2的发酵酶活高达17240U/ml，略高于采用常规启动子构建的高拷贝整合表达工程菌，取得了意料不到的效果。而且传代10次后，枯草芽孢杆菌VP-2的发酵酶活没有明显降低，而采用常规启动子构建的高拷贝整合表达工程菌酶活降低了32.4%。从而说明，本发明利用rrnO启动子构建单拷贝整合型表达工程菌，不仅可以高效表达碱性蛋白酶，还有效解决了质粒丢失和拷贝数降低的问题，保持碱性蛋白酶产量的稳定性和生产批次的一致性，效果显著。

附图说明

图1 为大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭质粒pVBs-1图谱；

图2 为质粒pVBs-PrrnO图谱；

图3为表达载体pVBs-PrrnO-TamyE图谱；

图4为表达质粒pVBs-PrrnO图谱；

图5为碱性蛋白酶VP温度-相对酶活曲线图；

图6为碱性蛋白酶VP pH-相对酶活曲线图。

具体实施例

申请人为了实现碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌宿主细胞中的单拷贝整合型高效表达，进行了大量启动子的筛选。其中，有些启动子只能适用于游离质粒表达方法；有些启动子虽然适用于整合质粒表达方法，但在单拷贝情况下，碱性蛋白酶的产量非常低，必须提高拷贝数才有可能实现碱性蛋白酶的产业化，但拷贝数的增加又导致后续生产的不稳定性，这些均不符合要求。最终申请人发现启动子rrnO不仅可以适用于整合质粒表达方法，而且在单拷贝情况下，碱性蛋白酶的产量非常高，能够满足生产的需要，而且可以保持生产的稳定性。

以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

LB液体培养基：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%；

LB平板：胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，NaCl 1%，琼脂2%；

GM I配制方法为：1*最低盐溶液95.6ml，20%葡萄糖2.5 ml，5%水解酪蛋白0.4 ml，10%酵母粉汁1ml；其中1*最低盐溶液的配制方法为：K₂HPO₄ 14 g/L，KH₂PO₄ 6 g/L，（NH₄）₂SO₄ 2 g/L，柠檬酸三钠1 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.2 g/L，在蒸馏水中依次溶解；

GM II配制方法为：1*最低盐溶液96.98 ml，20%葡萄糖2.5 ml，5%水解酪蛋白0.08ml，10%酵母粉汁0.04 ml，1 M MgCl₂ 0.25 ml，1 M CaCl₂ 0.05 ml；

种子培养基：酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K₂HPO₄ 1.8%）；

发酵培养基：酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，CaCl₂0.1~0.5%，MgSO₄ 0.1~0.5%，K₂HPO₄0.5~2%）。

本发明实施中所述碱性蛋白酶的酶活测定方法可采用下述方法：

酶活测定方法：

蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液的吸光度。酶活力与吸光度成正比例，由此可以计算产品的酶活力。蛋白酶活力定义，即蛋白酶活力为蛋白酶活力单位表示，定义为1g固体酶粉（或1ml液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪蛋白产生1ug酪氨酸，即为1个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示。

试剂和溶液

（1）福林（Folin）试剂（福林︰水=1︰2）；（2）42.4g/L碳酸钠溶液；（3）0.5mol/L氢氧化钠溶液；（4）硼酸缓冲液（pH10.5）；（5）10.0g/L酪蛋白溶液；（6） 100ug/mL和1mg/ml的L-酪氨酸标准溶液；（7）6.54%三氯乙酸。

2. 酶活测定

（1）标准曲线的制定：配置浓度分别为0ug/mL，10ug/mL，20ug/mL，30ug/mL，40ug/mL和50ug/mL的L-酪氨酸标准溶液。分别取标准液各1.00ml，各加0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml、福林试剂使用液1.00ml，振荡均匀，置于40℃水浴中显色20min，取出用分光光度计于波长680nm，10mm比色皿，以不含酪氨酸的0管为空白，分别测定其吸光度。以吸光度A为纵坐标，酪氨酸的浓度C为横坐标，绘制标准曲线（此线应通过零点）。

（2）酶活测定

取预稀释适量酶液，然后加入等体积的40℃预热10%酪蛋白，40℃反应10min；然后加入与反应体系等体积三氯乙酸（浓度6.54%），混匀后室温静置10min以终止反应。取出1ml已终止的反应液，然后加入5ml42.4g/L碳酸钠溶液，接着加入1ml福林（Folin）试剂，40℃显色反应20min；最后测定OD608值。

（3）计算

从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力，单位为u/mL。样品的酶活力按下面的公式计算：

X=A×K×4/10×n=2/5×A×K×n

式中：X——样品的酶活力（u/g或u/ml）

A——样品平行试验的平均吸光度

K——吸光常数

4——反应试剂的总体积（ml）

10——反应时间10min，以1min计

n——稀释倍数。

实施例1组成型表达载体的构建

1.1 提取枯草芽孢杆菌的总基因组DNA

将本实验室保存的枯草芽孢杆菌过夜培养，各取1.5ml，12000rpm离心1分钟，除上清；加入200μl裂解缓冲液（60mM Tris-HCl，pH7.8, 20mM Na-Ac, 1mM EDTA, 1.5% SDS），用移液器剧烈吹打；加入66μl 5M高氯酸钠溶液混匀，12000rpm离心10分钟，取上清；加入等体积苯酚抽提一次，12000rpm离心2分钟，取上清；加入等体积异丙醇沉淀5分钟，12000rpm离心5分钟；70%乙醇洗涤两次；最后将干燥的DNA溶于ddH2O。还可以利用试剂盒提取基因组DNA。

启动子序列克隆

以实施例1.1中提取的基因组总DNA为模板，利用表1中所述引物进行PCR扩增，其中所有正向引物均加入了Kpn I酶切位点；而所有反向引物均引入了Xba I酶切位点（见表1）。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30s；50-55℃ 40s，72℃ 1min，30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。PCR回收产物经过限制性内切酶Xba I和Kpn I双酶切后，与已经过Xba I和Kpn I双酶切大肠杆菌/芽孢杆菌穿梭质粒pVBs-1（见图1）于室温连接4h，并转化枯草芽孢杆菌获得相应的质粒pVBs-PrrnO，质粒图谱见图2。

表1 启动子扩增所用引物

引物名称	引物序列
		rrnO-F	GACGTGTGCTTCTCTCAAAGCGACTAC
rrnO-R	CTCTGTTGCTACAGTAGCTTTAGTTGAG

1.3测序分析

采用质粒提取试剂盒，提取1.2所述的质粒pVBs-PrrnO，并送往青岛华大基因研究中心进行测序分析。测序结果显示：rrnO启动子的序列为SEQ ID NO: 1。

表达载体的构建

以实施例1.1中提取的枯草芽孢杆菌基因组总DNA为模板，利用表2中所述引物Ter-F1/Ter-R1进行PCR扩增，其中正向引物均引入Bam HI酶切位点，反向引物均引入HindⅢ酶切位点。PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30S；50-55℃ 40S，72℃ 1min，30个循环；72℃ 7min；利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，PCR产物经测序验证无误（其序列见SEQID NO: 1）。PCR回收产物经过限制性内切酶Bam HI和Hind Ⅲ双酶切后，克隆至已经过BamHI和Hind Ⅲ双酶切的质粒pVBs-PrrnO，获得相应的表达载体，命名为pVBs-PrrnO-TamyE（见图3）。

表2 终止子扩增所用引物

引物名称	引物序列
		Ter/amyE-F1	GTA CACACCGATGTACACGTCATC
Ter/amyE-R1	GAT GGGCAAGGCTAGACGGGACTTAC

实施例2 枯草芽孢杆菌工程菌的构建

2.1碱性蛋白酶基因的克隆

按照实施例1.1所述的方法，提取克劳氏芽孢杆菌（Bacillus clausii）的基因组DNA。以提取的克劳氏芽孢杆菌基因组DNA为模板，以引物VP-F1/ VP-R1（见表3）进行PCR扩增，PCR扩增条件为95℃ 4min；94℃ 30s；50-55℃ 40s，72℃ 70s，30个循环；72℃ 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，并进行测序。测序结果显示，所述PCR扩增产物的核酸序列为SEQ ID NO: 2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO: 3。将SEQ ID NO: 2进行NCBIBlast比对可知，该扩增产物为碱性蛋白酶基因片段，命名为VP。

表达质粒的构建

将实施例2.1中的PCR回收产物经过限制性内切酶Sal I和Bam HI双酶切后，与已经过Sal I和Bam HI双酶切的表达载体pVBs-PrrnO-TamyE连接过夜，然后转化枯草芽孢杆菌，获得携带碱性蛋白酶VP基因的表达质粒，命名为pVPrrnO-VP（见图4）。

枯草芽孢杆菌工程菌的构建

2.3.1 游离型表达质粒的转化

将表达质粒pVPrrnO-VP通过感受态方法转化宿主菌枯草芽孢杆菌，具体转化过程如下：将新鲜活化的枯草芽孢杆菌由LB平板接种到5 ml GMⅠ溶液，在30℃、125 rpm振荡培养过夜。第二天取2 ml转接到18 ml GMⅠ中，37℃、220 rpm培养3.5 h。再取2 ml上一步骤的培养液转接到18 ml GMⅡ溶液中，37℃、125 rpm培养90 min后，5000 g、10 min离心收集菌体。用2 ml GMⅠ溶液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞。然后取0.2 ml感受态细胞，加入适量pVPrrnO-VP质粒，于30℃、200 rpm振荡培养30 min后，涂布含2 μg/mL红霉素的LB平板，30℃培养24 h，次日检查和验证转化子。获得的阳性转化子中质粒pVPrrnO-VP是以游离状态存在。挑取其中一个阳性转化子命名为枯草芽孢杆菌VP-1（ Bacillus subtilis VP-1）。

游离表达质粒的整合与发酵筛选

首先将枯草芽孢杆菌VP-1中的游离质粒pVPrrnO-VP整合入枯草芽孢杆菌的基因组中，具体过程如下：将枯草芽孢杆菌VP-1接种于LB液体培养基中，42℃、200 rpm过夜振荡培养；将获得的菌液梯度稀释，分别涂布含2 μg/mL红霉素的LB平板，42℃过夜培养。

次日，随机挑取若干单菌落，分别点种于含2μg/mL红霉素和0.5%脱脂牛奶的LB平板，37℃培养4h后，平板上出现了明显的透明圈。挑选透明圈较大的20株菌，分别命名为枯草芽孢杆菌VP-1，VP-2，……, VP-20。

进一步通过摇瓶发酵筛选出碱性蛋白酶产量最高的菌株。将所述VP-1，VP-2，……, VP-20的单菌落分别接种于50 mL种子培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K2HPO4 1.8%）中，37℃、220 rpm振荡培养约8 h。然后分别取2.5 mL种子液接种到50mL发酵培养基（酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，CaCl2 0.1~0.5%，MgSO4 0.1~0.5%，K2HPO40.5~2%）中，34℃、220 rpm振荡培养72 h；离心取上清液测定碱性蛋白酶酶活。

结果显示，所述20株携带整合型表达质粒的枯草芽孢杆菌工程菌中碱性蛋白酶发酵酶活最高的达到17240U/ml，将该菌株命名为枯草芽孢杆菌VP-2（Bacillus subtilisVP-2）。

作为对照，申请人利用本领域内常用的枯草芽孢杆菌蛋白酶Subtilisin的启动子aprE（其核苷酸序列为SEQ ID NO:4），采用实施例1所述方法构建得到携带整合型表达质粒的枯草芽孢杆菌工程菌，并利用50ppm氯霉素筛选出携带高拷贝整合型表达质粒的工程菌，命名为枯草芽孢杆菌VPaprE-1。

将所述枯草芽孢杆菌VPaprE-1的单菌落接种于50 mL种子培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K2HPO4 1.8%）中，37℃、220 rpm振荡培养约8 h。然后分别取2.5mL种子液接种到50 mL发酵培养基（酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，CaCl2 0.1~0.5%，MgSO4 0.1~0.5%，K2HPO40.5~2%）中，34℃、220 rpm振荡培养72 h；离心取上清液测定碱性蛋白酶酶活。

结果显示，所述枯草芽孢杆菌VPaprE-1发酵上清液中碱性蛋白酶酶活为16358U/ml，与枯草芽孢杆菌VP-2基本相当。

实施例3 枯草芽孢杆菌VP-2产酶稳定性比较分析

将枯草芽孢杆菌VP-2和枯草芽孢杆菌VPaprE-1分别接种于LB液体培养基，连续传代培养10次后，在LB平板上划线，挑取单菌落。将单菌落分别接种于50 mL种子培养基（酵母浸粉0.5%，胰蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，K2HPO4 1.8%）中，37℃、220 rpm振荡培养约8 h。然后取2.5 mL种子液接种到50 mL发酵培养基（酵母粉1~2%，豆饼粉2~5%，麦芽糊精5~10%，柠檬酸钠0.1~0.5%，CaCl2 0.1~0.5%，MgSO4 0.1~0.5%，K2HPO40.5~2%）中，34℃、220 rpm振荡培养72 h；离心取上清液，分别测定酶活。

结果显示，传代培养10次后，枯草芽孢杆菌VP-2的发酵酶活仍超过17200 U/mL，与传代前相比，酶活没有明显降低。而对照菌枯草芽孢杆菌VPaprE-1的发酵酶活仅为11050U/ml，降低了32.4%。

从而说明，本发明利用rrnO启动子进行整合质粒表达，构建得到的单拷贝枯草芽孢杆菌工程菌，能有效维持碱性蛋白酶产量的稳定性；而采用常规启动子进行整合质粒表达，构建得到的高拷贝枯草芽孢杆菌工程菌，在多次传代后发酵酶活发生明显降低。经检测，所述高拷贝工程菌在传代过程中拷贝数出现明显的降低，因而导致蛋白酶产量不稳定。

实施例4 碱性蛋白酶VP的酶学性质分析

在pH10.5条件下，分别检测实施例3所述枯草芽孢杆菌VP-2发酵液在30、35、40、45、50、55、60、65、70℃条件下的碱性蛋白酶酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，并绘制酶活随温度变化的曲线。结果如图5所示，碱性蛋白酶VP的最适作用温度为55℃，且在50-60℃范围内能保持80%以上的相对酶活。

在55℃条件下，分别检测实施例3所述枯草芽孢杆菌VP-2发酵液在pH9.5，10.0，10.5，11.0，11.5，12.0，12.5，13.0条件下的碱性蛋白酶酶活，以最高酶活为100%，计算相对酶活，并绘制酶活随pH变化的曲线。结果如图6所示，碱性蛋白酶VP的最适作用pH为11.5，且在pH10-13范围内保持80%以上的相对酶活。

申请人已于2018年2月5日将枯草芽孢杆菌VP-2（ Bacillus subtilis VP-2），保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2018083。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种蛋白生产方法及高产碱性蛋白酶的枯草芽孢杆菌

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 268

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

tgttgctaca gtagctttag ttgagaaaaa cgaagaagat gagaatgaag aagaacaaga 60

agaagtgtga aaaaaagcgc agctgaaata gctgcgcttt tttgtgtcat aaccctttac 120

agtcataaaa attatggtat aatcatttct gttgtctttt taaagacaca agcatgacca 180

ttatgactag taaaaacttt ttcaaaaaag tattgaccta gttaactaaa aatgttacta 240

ttaagtagtc gctttgagag aagcacac 268

<210> 2

<211> 1143

<212> DNA

<213> 克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)

<400> 2

atgaagaaac cgttggggaa aattgtcgca agcaccgcac tactcatttc tgttgctttt 60

agttcatcga tcgcatcggc tgctgaagaa gcaaaagaaa aatatttaat tggctttaat 120

gagcaggaag ctgtcagtga gtttgtagaa caagtagagg caaatgacga ggtcgccatt 180

ctctctgagg aagaggaagt cgaaattgaa ttgcttcatg aatttgaaac gattcctgtt 240

ttatccgttg agttaagccc agaagatgtg gacgcgcttg aactcgatcc agcgatttct 300

tatattgaag aggatgcaga agtaacgaca atggcgcaat cagtgccatg gggaattagc 360

cgtgtgcaag ccccagctgc ccataaccgt ggattgacag gttctggtgt aaaagttgct 420

gtcctcgata caggtatttc cactcatcca gacttaaata ttcgtggtgg cgctagcttt 480

gtaccagggg aaccatccac tcaagatggg aatgggcatg gcacgcatgt ggccgggacg 540

attgctgctt taaacaattc gattggcgtt cttggcgtag cgccgagcgc ggaactatac 600

gctgttaaag tattaggggc gagcggttca ggttcggtca gctcgattgc ccaaggattg 660

gaatgggcag ggaacaatgg catgcacgtt gctaatttga gtttaggaag cccttcgcca 720

agtgccacac ttgagcaagc tgttaatagc gcgacttcta gaggcgttct tgttgtagcg 780

gcatctggga attcaggtgc aggctcaatc agctatccgg cccgttatgc gaacgcaatg 840

gcagtcggag ctactgacca aaacaacaac cgcgccagct tttcacagta tggcgcaggg 900

cttgacattg tcgcaccagg tgtaaacgtg cagagcacat acccaggttc aacgtatgcc 960

agcttaaacg gtacatcgat ggctactcct catgttgcag gtgcagcagc ccttgttaaa 1020

caaaagaacc catcttggtc caatgtacaa atccgcaatc atctaaagaa tacggcaacg 1080

agcttaggaa gcacgaactt gtatggaagc ggacttgtca atgcagaagc ggcaacacgc 1140

taa 1143

<210> 3

<211> 380

<212> PRT

<213> 克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)

<400> 3

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

1 5 10 15

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Glu Glu Ala Lys

20 25 30

Glu Lys Tyr Leu Ile Gly Phe Asn Glu Gln Glu Ala Val Ser Glu Phe

35 40 45

Val Glu Gln Val Glu Ala Asn Asp Glu Val Ala Ile Leu Ser Glu Glu

50 55 60

Glu Glu Val Glu Ile Glu Leu Leu His Glu Phe Glu Thr Ile Pro Val

65 70 75 80

Leu Ser Val Glu Leu Ser Pro Glu Asp Val Asp Ala Leu Glu Leu Asp

85 90 95

Pro Ala Ile Ser Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Glu Val Thr Thr Met Ala

100 105 110

Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala His

115 120 125

Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp Thr

130 135 140

Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser Phe

145 150 155 160

Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His

165 170 175

Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu Gly

180 185 190

Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala Ser

195 200 205

Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala Gly

210 215 220

Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser Pro

225 230 235 240

Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly Val

245 250 255

Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser Tyr

260 265 270

Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln Asn

275 280 285

Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile Val

290 295 300

Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr Ala

305 310 315 320

Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala

325 330 335

Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile Arg

340 345 350

Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu Tyr

355 360 365

Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg

370 375 380

<210> 4

<211> 808

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 4

gaattctcca ttttcttctg ctatcaaaat aacagactcg tgattttcca aacgagcttt 60

caaaaaagcc tctgcccctt gcaaatcgga tgcctgtcta taaaattccc gatattggtt 120

aaacagcggc gcaatggcgg ccgcatctga tgtctttgct tggcgaatgt tcatcttatt 180

tcttcctccc tctcaataat tttttcattc tatccctttt ctgtaaagtt tatttttcag 240

aatactttta tcatcatgct ttgaaaaaat atcacgataa tatccattgt tctcacggaa 300

gcacacgcag gtcatttgaa cgaatttttt cgacaggaat ttgccgggac tcaggagcat 360

ttaacctaaa aaagcatgac atttcagcat aatgaacatt tactcatgtc tattttcgtt 420

cttttctgta tgaaaatagt tatttcgagt ctctacggaa atagcgagag atgatatacc 480

taaatagaga taaaatcatc tcaaaaaaat gggtctacta aaatattatt ccatctatta 540

caataaattc acagaatagt cttttaagta agtctactct gaattttttt aaaaggagag 600

ggtaaagact tgccttccgg ttgtggtgct cagtctgaag tgttaaacat tttgccccgt 660

tttgccctgc ataatccttt gcggcagaaa gcagccggcc gccggctccc tttgtacgcg 720

catgaggaac gacaaataag tcatttaata tgtatatcct tttcattgac acagaagaaa 780

acgttggata gagctgggta aagcctat 808

Claims

1.一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌保藏编号为CCTCC NO:M2018083。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在碱性蛋白酶生产中的应用。