CN112608915A

CN112608915A - 一种低温、碱性蛋白酶njxd01及基因和应用

Info

Publication number: CN112608915A
Application number: CN202011519913.6A
Authority: CN
Inventors: 李刚
Original assignee: First Institute of Oceanography MNR
Current assignee: First Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2021-04-06
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112608915B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种低温、碱性蛋白酶NJXD01及基因和应用。本发明的低温、碱性蛋白酶NJXD01的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的低温、碱性蛋白酶NJXD01是从产蛋白酶的南极菌株中克隆获得的蛋白酶基因构建到合适的宿主中通过异源表达得到的。该蛋白酶NJXD01在低温条件下具有较强的血渍去除能力，为后续该酶在洗涤剂行业的应用提供优质的材料。

Description

一种低温、碱性蛋白酶NJXD01及基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种低温、碱性蛋白酶NJXD01及基因和应用。

背景技术

蛋白酶为水解蛋白质或肽类中肽键的一类酶的总称，广泛存在于动物的内脏或体液、植物的茎叶、果实或根部，而微生物也可分泌多种蛋白酶，蛋白酶是用途最广的酶制剂之一，占了世界酶类销售总额的60％左右。在食品、医药、纺织、制革、洗涤剂、化妆品、动植物蛋白以及废弃物的处理等行业都有着巨大的应用前景。

蛋白酶是洗涤剂工业中应用最广泛的酶制剂。蛋白酶可将蛋白质分解为易于溶解或分散于洗涤剂溶液中的肽链和氨基酸，用于洗涤剂配方中去除汗渍、血渍等，同时也减少了洗涤剂中表面活性剂及助洗剂的用量，减少环境污染。目前，常用的蛋白酶多为中温蛋白酶，这些酶在低于室温(25℃)条件下活性极低、因而去污效率显著下降；而在我国北方地区，特别是冬天，水温通常都在10℃以下，现有商用洗涤剂中添加的蛋白酶都难以有效发挥其应有的作用。因此，寻找低温蛋白酶对于开发新型洗涤剂具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低温、碱性蛋白酶NJXD01及基因和应用，本发明的碱性蛋白酶NJXD01在低温下的活性仍然很高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种低温、碱性蛋白酶NJXD01，所述蛋白酶NJXD01的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种编码低温、碱性蛋白酶NJXD01的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种所述的基因构建得到的重组表达载体，所述重组表达载体为含所述基因的重组质粒pCOLDⅠ。

本发明还提供了一种重组表达菌株，由所述基因或所述重组表达载体构建得到。

作为优选，所述菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明还提供了一种低温、碱性蛋白酶NJXD01的制备方法，由所述的重组表达菌株诱导表达得到的。

作为优选，所述诱导表达的诱导剂为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。

本发明还提供了一种低温、碱性蛋白酶NJXD01在洗涤剂中的应用。

作为优选，所述洗涤剂为去除血渍的洗涤剂。

本发明提供了一种低温、碱性蛋白酶NJXD01及基因和应用，本发明的低温、碱性蛋白酶NJXD01在低温条件下具有较强的血渍去除能力，为后续在洗涤剂领域的应用提供优质的蛋白酶材料。

附图说明

图1为标准曲线。

图2为蛋白酶NJXD01温度耐受性。

图3为蛋白酶NJXD01pH耐受性。

图4为蛋白酶NJXD01血渍清除效果。

具体实施方式

在本发明实施例中所公开的极地杆菌(Polarbacteria)QED-12，于2018年12月21日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.17023。

在本发明实施例中所用到的培养基的制备方法为：

所述Zobell 2216E海水培养基的制备方法为：按以下质量体积比称取4～6g/L蛋白胨，0.5～1.5g/L酵母粉，用过滤后的陈海水定容，121℃高压湿热灭菌15～25min；优选为蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，用过滤后的陈海水定容后，121℃下高压湿热灭菌20min。

所述分离平板培养基的制备方法为：称取质量体积比为4～6g/L蛋白胨，0.5～1.5g/L酵母粉，13～17g/L琼脂，用过滤后的陈海水定容，121℃下高压湿热灭菌15～25min；优选为蛋白胨5g/L，酵母粉1g/L，琼脂15g/L，用过滤后的陈海水定容后，121℃下高压湿热灭菌20min。

所述蛋白酶筛选培养基的制备方法为：称取质量体积比为8～12g/L蛋白胨，4～6g/L酵母粉，8～12g/L氯化钠，13～17g/L琼脂，13～17g/L脱脂奶粉，用水定容，121℃高压湿热灭菌15～25min；优选为10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，15g/L脱脂奶粉，用去离子水定容，121℃高压湿热灭菌20min。

所述LB液体培养基的制备方法为：称取质量体积比为8～12g/L蛋白胨，4～6g/L酵母粉，8～12g/L氯化钠，用水定容，121℃高压湿热灭菌15～25min；优选为10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，用去离子水定容，121℃高压湿热灭菌20min。

所述LB平板培养基的制备方法为：称取质量体积比为8～12g/L蛋白胨，4～6g/L酵母粉，8～12g/L氯化钠，13～17g/L琼脂，用水定容，121℃高压湿热灭菌15～25min；优选为10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，10g/L氯化钠，15g/L琼脂，用去离子水定容，121℃高压湿热灭菌20min。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1构建低温、碱性蛋白酶NJXD01南极菌株的基因组文库

(1)制备目的DNA片段

将极地杆菌(Polarbacteria)QED-12种子液接种于Zobell 2216E海水培养基中，于10℃、120rpm的振荡培养箱中培养48h后，用细菌基因组提取试剂盒(购自Tiangen公司，DP302-02)提取染色体DNA，检测其电泳DNA浓度。检测得到的DNA长度大于40kb，符合建库要求。

(2)基因组DNA的部分消化

极地杆菌(Polarbacteria)QED-12染色体DNA经Sau3AI内切酶部分消化，Sau3AI内切酶酶切60min后，制得插入片段。酶切60min后，染色体DNA刚好酶切完全，适用于构建基因组文库；当酶切时间超过80min后，酶切过度，各片段不是平均分布，而多为小片段，不利于建库。因此选酶切60min作为菌株QED-12染色体DNA的不完全酶切时间。

(3)基因组文库的构建

按照pCOLDⅠ载体和插入片段约1:3的摩尔比作连接反应。反应体系于16℃连接过夜，浓缩连接产物至3μl，分别取1μl转化感受态细胞E.coli DH5α，培养后涂布于含有氨苄青霉素(50μg/ml)、IPTG(20μg/ml)和X-Gal(40μg/ml)的分离平板培养基上，于37℃静置培养过夜至可见菌落，根据菌落蓝白斑反应筛选转化子。随机挑取约20000个菌落作为基因组文库的克隆保存，从平板中随机挑选16个白色单菌落，提取质粒，用BcaBEST Primer M13-47和BcaBEST Primer RV-M引物经PCR扩增目的片断，引物序列如下：BcaBEST Primer M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’BcaBEST Primer RV-M：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’。

PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸120s，30个循环；72℃延伸10min。

经检测每个克隆均有外源DNA，最小插入片段为800bp左右，最大插入片段6kb左右，平均插入片段大小约为4kb左右。

实施例2低温、碱性蛋白酶NJXD01全序列的获取

将从基因组文库中筛选获得的阳性克隆涂布于蛋白酶筛选培养基，于37℃培养24h，挑选水解圈较大的菌株提取重组质粒并测序，经对序列进行比对分析获得蛋白酶基因NJXD01完整的开放阅读框(ORF)。ORF的完整长度为1248bp，共编码415个氨基酸，计算其理论分子量为46kDal。

实施例3低温、碱性蛋白酶NJXD01重组表达载体和重组表达菌株的构建

设计扩增全基因的引物为：

上游引物F-GTCGTCGTCGACAAATCGAATTAATGGCGCCAG；

下游引物R-CATAAATCTAGATCCATTTCTTGAGCCCCAGT；

PCR扩增确认基因全长序列。结果显示设计引物能够扩增得到低温、碱性蛋白酶NJXD01的全基因组。

采用酶切克隆的方法构建表达质粒，即用BamHI内切酶和XbaI内切酶双酶切PCR产物，切胶回收酶切后的片段，和同样经过BamHI内切酶和XbaI内切酶双酶切的质粒pCOLDⅠ连接，转化到大肠杆菌TOP10中，氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒(购自Tiangen公司)提取阳性克隆的质粒，经检测，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，命名为NJXD01；该基因编码415氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

将上述制得的阳性克隆的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株中，构建表达重组菌株；具体过程如下：

取-80℃保存的BL21，于冰上融化，以预冷的移液管枪尖吸取10μl重组质粒，加入刚刚融化的BL21；轻摇混匀，冰浴放置30min，迅速转移到42℃水浴中，准确放置90秒；迅速转移到冰上，冷却2min；然后加入800μl LB液体培养基，于37℃，150rpm，45min；涂布含氨苄青霉素100μg/mL的LB平板培养基过夜培养。

实施例4利用重组表达菌株表达低温、碱性蛋白酶NJXD01

将实施例3构建好的表达重组菌株转接到100ml含有氨苄青霉素100μg/mL的LB液体培养基中，37℃扩大培养直至菌液OD600值达0.6时，16℃冷却30min，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使其终浓度为0.5mmol/L，16℃摇床培养24h。低温离心收集上清，浓缩冻干。然后进行Ni²⁺亲和层析，由于表达的重组蛋白N端含有6×His tag，能亲和吸附到层析柱中，经不同浓度的咪唑溶液梯度洗脱后，收集洗脱液。

实施例5低温、碱性蛋白酶NJXD01的活性检测和酶特性分析

利用福林酚(Folin)方法测定实施例4制得的低温、碱性蛋白酶NJXD01活性。具体操作如下：

用酪氨酸配制0～100μg/mL的标准溶液，取不同浓度的酪氨酸1mL与5mL 0.4mol/LNa₂CO₃、1mL Folin试剂混合，于30℃恒温水浴显色30min，在680nm波长下测OD值并绘制标准曲线。结果见图1。

经过检测，制得的低温、碱性蛋白酶NJXD01的活性为2000U/ml。

为测定蛋白酶NJXD01的温度耐受性，分别在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃进行酶促反应30min，福林酚法测定蛋白酶NJXD01的酶活。以酶活最高值为100％计算其相对酶活力。结果见图2。

为测定蛋白酶NJXD01的pH耐受性，分别用不同pH的PBS缓冲液(pH 5.0、6.0、7.0)、Tris–HCl缓冲液(pH 7.0、8.0、9.0)配制底物，30℃进行酶促反应30min用福林酚法测定蛋白酶NJXD01的酶活。以最高酶活力为100％计算其相对酶活力。结果见图3。

通过图2可以看出，低温、碱性蛋白酶NJXD01的最适反应温度为30℃，在温度为10℃的条件下，该酶仍具有80％左右的酶活，具有良好的低温耐受特性。图3显示，该蛋白酶的最适pH为8.0。

实施例6低温、碱性蛋白酶NJXD01血渍清除试验

将实施例4制得的低温、碱性蛋白酶NJXD01用来进行血渍清除试验。取白色棉布剪成5×5cm直径的大小，取鸡肝血0.1g滴于白色棉布上，然后将其置于烘箱中60℃、10min烘干备用。试验共设4个组：1)染血的棉布+100ml蒸馏水；2)染血的棉布+98ml蒸馏水+2ml本申请的蛋白酶酶液；3)染血的棉布+98ml蒸馏水+2ml商用洗涤剂(蓝月亮)。所有处理的染血棉布均置于10℃培养箱中，每间隔5分钟取出并用自来水进行冲洗，重复3次。反应结束后将棉布置于室温干燥并拍照。结果见图4。

图4显示，采用本申请的蛋白酶酶液组和蓝月亮组较仅用蒸馏水组清除棉布上的血渍的清除效果好，采用本申请的蛋白酶酶液对血渍的清除效果最优。

由以上实施例可知，本发明提供了一种低温、碱性蛋白酶NJXD01及基因和应用。本发明制备得到的低温、碱性蛋白酶NJXD01的酶活力能够达到2000U/ml，最适的反应温度为30℃，在温度为10℃的条件下，该酶仍具有80％左右的酶活，该蛋白酶最适pH为8.0。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 自然资源部第一海洋研究所

<120> 一种低温、碱性蛋白酶NJXD01及基因和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 415

<212> PRT

<213> 氨基酸序列(polarbacteria)

<400> 1

Met Gln Lys Ile Glu Leu Met Ala Pro Ala Gly Asn Phe Glu Ser Met

1 5 10 15

Gln Ala Ala Leu Asp Asn Gly Cys Asp Ser Ile Tyr Phe Gly Val Glu

20 25 30

Gln Leu Asn Met Arg Ala Arg Ala Ser Val Asn Phe Thr Leu Asp Asp

35 40 45

Leu Glu Glu Ile Ser Lys Arg Cys Ser Ala Lys Asn Val Arg Thr Tyr

50 55 60

Leu Thr Leu Asn Thr Ile Val Tyr Asp His Asp Leu Ser Ile Val Lys

65 70 75 80

Thr Leu Ile Lys Arg Ala Lys Glu Ala Asn Ile Thr Ala Val Ile Ala

85 90 95

Met Asp Gln Ala Val Ile Ser Met Ala Arg Glu Gln Gln Met Glu Val

100 105 110

His Ile Ser Thr Gln Ile Asn Ile Thr Asn Ile Glu Thr Val Lys Phe

115 120 125

Tyr Ala Leu Phe Ala Asp Thr Ile Val Leu Ser Arg Glu Leu Ser Leu

130 135 140

Arg Gln Val Lys Lys Ile Thr Glu Ala Ile Glu Lys Asp Gln Ile Lys

145 150 155 160

Gly Pro Ser Gly Arg Leu Val Glu Val Glu Ile Phe Gly His Gly Ala

165 170 175

Leu Cys Met Ala Val Ser Gly Lys Cys Tyr Met Ser Leu His Ser Ser

180 185 190

Asn Ser Ser Ala Asn Arg Gly Ala Cys Lys Gln Asn Cys Arg Lys Lys

195 200 205

Tyr Thr Val Ile Asp Gln Glu Thr Gly Phe Glu Met Glu Leu Asp Asn

210 215 220

Glu Tyr Ile Met Ser Pro Lys Asp Leu Cys Thr Ile Asp Phe Leu Asp

225 230 235 240

Gln Val Ala Asp Ala Gly Ile Lys Val Leu Lys Ile Glu Gly Arg Gly

245 250 255

Arg Ala Pro Glu Tyr Val Ala Lys Val Ile Lys Cys Tyr Arg Asp Ala

260 265 270

Ile Asp Ser Leu Ala Ala Glu Thr Tyr Asp Lys Glu Lys Val Ile Ser

275 280 285

Trp Met Gln Glu Leu Glu Lys Val Tyr Asn Arg Gly Phe Trp Asn Gly

290 295 300

Tyr Tyr Leu Gly Gln Lys Leu Gly Glu Trp Ser Lys Glu Ser Gly Ser

305 310 315 320

His Ala Thr Gln Lys Lys Val Tyr Leu Gly Lys Gly Glu His Tyr Phe

325 330 335

Asp Lys Ala Lys Ile Gly Gln Phe Lys Ile Asp Ala Tyr Asp Val Ala

340 345 350

Leu Gly Asp Thr Ile Leu Ile Thr Gly Pro Ser Thr Gly Ala Gln Glu

355 360 365

Met Glu Val Lys Gln Met Phe Val Asn Asp Val Pro Ala Glu Lys Ala

370 375 380

Thr Lys Gly Asp Glu Val Thr Met Lys Leu Asp Phe Lys Ile Arg Arg

385 390 395 400

Ser Asp Lys Leu Tyr Lys Ile Val Lys Thr Glu Phe Ala Glu Asn

405 410 415

<210> 2

<211> 1248

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcaaaaaa tcgaattaat ggcgccagct ggtaattttg aatctatgca agctgcttta 60

gataatggtt gcgattctat ttattttgga gtagagcaac ttaatatgag agcaagagct 120

tctgttaatt ttacgttaga tgatttagaa gagatttcta aaagatgttc agcaaaaaat 180

gtgagaacct atcttacatt aaatacaata gtttatgatc atgatttatc aatagtaaaa 240

acattgataa aacgtgcaaa agaagcaaat ataacagctg taattgccat ggatcaagca 300

gtgatttcta tggctagaga acagcaaatg gaagtccata tttctacaca aataaatatt 360

acaaatatag aaacggtaaa attctatgca ctttttgcag atactattgt tttaagtaga 420

gagttgagtt tacgacaagt aaaaaagatt acagaagcaa ttgagaaaga tcaaataaaa 480

ggaccttctg gtagattagt tgaagttgag atttttggtc atggtgcttt gtgtatggcg 540

gtttctggta aatgttatat gagcttacat tcatcaaatt catcagcaaa cagaggtgct 600

tgtaaacaaa attgcagaaa aaaatatacg gttatcgatc aggaaactgg ttttgaaatg 660

gagttagata atgaatatat tatgtctcca aaagacttgt gtactattga ctttttagac 720

caagttgcag atgctggaat taaagtttta aaaattgaag gtagaggaag agcaccagaa 780

tatgttgcca aagtaattaa atgttaccga gatgcaattg atagtttggc tgcagaaact 840

tacgataaag aaaaagtaat ttcttggatg caagaattag aaaaagtcta caatcgtggt 900

ttttggaatg gctattattt aggtcagaaa ttaggagaat ggagtaaaga gtctggttct 960

catgcaacac aaaagaaagt ctatttgggc aaaggagaac attattttga caaagctaaa 1020

attggtcagt ttaaaattga tgcgtacgat gttgctttag gcgatacaat tctaataact 1080

gggccttcaa ctggggctca agaaatggaa gtaaaacaaa tgtttgtaaa cgatgttcct 1140

gcagaaaaag caactaaagg agacgaagtt accatgaagt tagattttaa aataagaaga 1200

tcagataagt tatataaaat tgtaaaaacg gaattcgcag aaaactaa 1248

Claims

1.一种低温、碱性蛋白酶NJXD01，其特征在于，所述蛋白酶NJXD01的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的低温、碱性蛋白酶NJXD01的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种权利要求2所述的基因构建得到的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为含所述基因的重组质粒pCOLDⅠ。

4.一种重组表达菌株，其特征在于，由权利要求2所述基因或权利要求3所述重组表达载体构建得到。

5.根据权利要求4所述的重组表达菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。

6.权利要求1所述低温、碱性蛋白酶NJXD01的制备方法，其特征在于，由权利要求4或5所述的重组表达菌株诱导表达得到的。

7.根据权利要求6所述的一种低温、碱性蛋白酶NJXD01的制备方法，其特征在于，所述诱导表达的诱导剂为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷。

8.一种权利要求1所述的低温、碱性蛋白酶NJXD01在洗涤剂中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述洗涤剂为去除血渍的洗涤剂。