CN117535273A

CN117535273A - 温敏型碱性蛋白酶变体及其应用

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Publication number: CN117535273A
Application number: CN202311465806.3A
Authority: CN
Inventors: 冯速; 刘哲民; 吴冕; 唐伟; 曹林; 孙璞; 李靖; 贾远看
Original assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd
Current assignee: Nanjing Novozan Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-11-07
Filing date: 2023-11-07
Publication date: 2024-02-09
Anticipated expiration: 2043-11-07
Also published as: CN117535273B

Abstract

本公开利用易错PCR对野生型碱性蛋白酶进行突变，并通过高通量筛选，获得多个温敏型碱性蛋白酶变体，相较于野生型蛋白酶，其热稳定性显著降低，在60℃的环境中可快速失活。此外，本公开还提供了此类变体在水解蛋白质肽键、生成多肽或氨基酸中的应用。

Description

温敏型碱性蛋白酶变体及其应用

技术领域

本公开涉及基因工程和酶工程领域，特别是涉及一种新型的碱性蛋白酶变体。

发明背景

碱性蛋白酶(Alkaline protease)是在碱性条件下水解蛋白质肽键的一类酶，因其活性中心含丝氨酸，又称为丝氨酸蛋白酶，它不仅能水解肽键，还具有水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能，多用于洗涤、制革、纺织、饲料、医药、化妆品等生产中，显示出良好的使用性能和经济价值，其销量约占全球酶制剂总销量的60％。碱性蛋白酶广泛存在于微生物、植物和动物中，由于微生物蛋白酶大多属于胞外酶，与动植物相比，微生物来源的碱性蛋白酶具有分离纯化过程简单、生产周期短且产率高的显著特点，因此，利用微生物生产碱性蛋白酶受到越来越多的研究和关注。目前商业化生产的碱性蛋白酶主要来自于芽孢杆菌属微生物，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、嗜碱性芽孢杆菌(B.alcalophilus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)等。

目前市场上大多数碱性蛋白酶蛋白酶多属于耐高温碱性蛋白酶，而且在目前的研究当中，大多数研究都是针对较高温度下的碱性蛋白酶酶活和热稳定，少有从实际应用环境出发，开发温敏型碱性蛋白酶，这限制了碱性蛋白酶的广泛使用。例如，在化妆品领域中，可以利用碱性蛋白酶制剂将大分子量的胶原蛋白切割成人体易于吸收的混合短肽，切割反应完成后需要对碱性蛋白酶进行灭活处理，以避免其对人体皮肤造成损害；如果在较低温度条件下酶不易变性失活，会大大增加碱性蛋白酶在实际应用中的成本和可实施性，因为高温灭活(>80℃)会损伤胶原蛋白肽的结构活性。因此，开发温敏型碱性蛋白酶至关重要。

目前，改善蛋白酶性质的方法主要是合理设计和定向进化。与定向进化相比，合理设计是构建小而有效的突变库以改善酶特性的有效方法。然而，合理理性设计也存在缺点，它依赖于可靠的蛋白质结构和结构-功能关系，这使得它通常不能令人满意地改善酶的性质。与合理设计相比，定向进化是一种更现实的方法，通过使用容易出错的PCR或DNA改组构建包含随机突变的大型突变库来增强酶的酶性质，从而允许在没有详细结构信息的情况下通过有效筛选和选择突变文库来鉴定具有期望性能的突变体。

发明内容

本公开涉及一类温敏型碱性蛋白酶变体，所述变体包含至少一个选自88、103、124、157、243、267、281或337位置处的氨基酸取代，其中所述氨基酸位置对应SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的成熟肽段区域。

在一些实施方案中，该碱性蛋白酶变体包含至少一个选自V88Y、R103F、D124N、L157P、I243P、F267A、V281I或S337N的氨基酸取代。

在一些实施方案中，该碱性蛋白酶变体包含L157P的氨基酸取代，并且该变体与SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的成熟肽段区域具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或更高的序列一致性。在一些实施方案中，该碱性蛋白酶变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示序列的成熟肽段区域。

在一些实施方案中，该碱性蛋白酶变体包含V88Y和D124N的氨基酸取代，并且该变体与SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的成熟肽段区域具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或更高的序列一致性。在一些实施方案中，该碱性蛋白酶变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示序列的成熟肽段区域。

在一些实施方案中，该碱性蛋白酶变体包含I243P、F267A和S337N的氨基酸取代，并且该变体与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的成熟肽段区域具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或更高的序列一致性。在一些实施方案中，该碱性蛋白酶变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示序列的成熟肽段区域。

在一些实施方案中，该碱性蛋白酶变体包含V88Y、R103F、D124N、L157P、I243P和V281I的氨基酸取代，并且该变体与SEQ ID NO：9所示氨基酸序列的成熟肽段区域具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或更高的序列一致性。在一些实施方案中，该碱性蛋白酶变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：9所示序列的成熟肽段区域。

本公开所述的“成熟多肽”、“成熟肽段”、“成熟肽段区域”是指在翻译和任何翻译后修饰如N末端加工、C末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。其中，所述成熟肽段区域为SEQ ID NO：1、3、5、7或9所示氨基酸序列的第85-353位，共269个氨基酸长度。

本公开还涉及多核苷酸序列，包含编码上述任一变体成熟多肽的多核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述多核苷酸序列还包含信号肽编码序列，所述信号肽是指可参与成熟蛋白或前体蛋白的分泌或直接转运的氨基酸残基，可选内源性或外源性信号序列。

在一些实施方案中，所述多核苷酸序列还包含前导肽编码序列，所述前导肽序列是指位于信号肽与成熟多肽序列间的氨基酸序列，将其切除后能获得有活性的蛋白酶。

在一些实施方案中，所述多核苷酸序列还包含标签肽编码序列，所述的标签序列可用于蛋白质的纯化和示踪等。

在一些实施方案中，所述多核苷酸序列还包括标签肽编码序列和前导肽编码序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列还包括标签肽编码序列、前导肽编码序列及信号肽编码序列。

在一些实施方案中，所述多核苷酸序列与SEQ ID NO：2、4、6、8、或10有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或更高的序列一致性。在一些实施方案中，所述多核苷酸序列为SEQ ID NO：4、6、8、或10。

本公开还涉及基因工程菌，所述基因工程菌包含编码本公开碱性蛋白酶变体的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述基因工程菌可选革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。在一些实施方案中，所述基因工程菌为芽孢杆菌，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌的细胞；优选为枯草芽孢杆菌。

本公开还涉及制备具有蛋白水解活性的温敏型碱性蛋白酶变体的方法，包括：(1)培养如本公开所述的基因工程菌；(2)回收变体。

本公开还涉及上述碱性蛋白酶变体在水解蛋白质的肽键生成多肽或氨基酸中的应用。在一些实施方案中，所述应用是上述碱性蛋白酶变体在水解胶原蛋白肽生成胶原蛋白短肽中的应用。在一些实施方案中，所述胶原蛋白短肽的分子量小于等于1kD。

本公开还涉及上述碱性蛋白酶变体在蛋白质短肽制备中的应用。在一些实施方案中，所制备的短肽分子量小于等于1kD。

本公开还提供了上述碱性蛋白酶变体在化妆品或护肤品制备中的应用。

其他实施方案：

1、一种碱性蛋白酶变体，所述变体包含至少一个选自V88Y、R103F、D124N、L157P、I243P、F267A、V281I或S337N的氨基酸取代，其中，所述氨基酸位置对应SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的成熟肽段区域。

2、如第1项中所述的变体，包含选自下述任一氨基酸取代组：

L157P、

V88Y+D124N、

I243P+F267A+S337N、

V88Y+R103F+D124N+L157P+I243P+V281I。

3、如第1项中所述的变体，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQID NO：7或SEQ ID NO：9所示序列的成熟肽段区域。

4、编码如第1-3项中任一所述变体的多核苷酸序列。

5、如第4项中所述的多核苷酸序列，还包含前导肽编码序列及信号肽编码序列。

6、如第4项中所述的多核苷酸序列，如SEQ ID NO：4、6、8、或10所示。

7、基因工程菌，包含如第4-6项中任一所述的多核苷酸序列。

8、如第7项中所述的基因工程菌，所述工程菌为枯草芽孢杆菌。

9、制备如第1-3项中任一所述的变体的方法，包括：(1)培养如第7项中所述的基因工程菌；(2)回收变体。

10、如第1-3项中任一所述的变体在水解蛋白质肽键生成多肽或氨基酸中的应用。

11、如第1-3项中任一所述的变体在蛋白质短肽制备中的应用。

12、如第1-3项中任一所述变体在化妆品或护肤品制备中的应用。

有益效果

本公开对Alkalihalobacillus alcalophilus来源的碱性蛋白酶进行改良，筛选获得到温敏型碱性蛋白酶变体：BPAPR1，BPAPR2，BPAPR3和BPAPR4，其相较于野生型碱性蛋白酶BPAPR0，热稳定性显著下降，有助于提升碱性蛋白酶在蛋白短肽的温和制备、DNA提取及食品领域的应用效果，具有良好的市场应用前景和工业价值。

附图简述

图1是本公开蛋白酶及其变体在60℃水浴10min耐热性比较；

图2是本公开蛋白酶及其变体在30L发酵罐中的发酵情况；

图3是本公开蛋白酶及其变体对胶原蛋白的切割效果：图3A是液相检测结果，图3B是质谱检测结果；

其中，图中变体名称与氨基酸、核苷酸序列对应关系见下表。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步说明本公开的技术方案。但是，下述实施例仅仅是本公开的示例，并不代表或限制本公开的保护范围。本公开的保护范围以权利要求书为准。在以下实施例中，若无特别说明，所用试剂和耗材均购自本领域普通供应商，所用实验方法和技术手段均为本领域常规方法和手段。

LB液体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L。

LB固体培养基：酵母粉5.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、NaCl 10.0g/L、琼脂粉16g/L。

发酵培养基：蛋白胨20g/L、精致豆粕粉10g/L、葡萄糖40g/L、KH₂PO₄3g/L、Na₂HPO₄6g/L、MgSO₄0.3 g/L、卡那霉素50mg/L。

本公开实施例中碱性蛋白酶的酶活检测方法如下：

(1)碱性蛋白酶酶活的测定：取50μL适当稀释的发酵上清液，加入150μL，pH 10.0的50mM硼酸溶液作为缓冲液和100μL浓度为2.5％的酪蛋白(梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)作为底物，混匀后于40℃下反应10min；加入200μL，400mM的三氯乙酸(TCA)终止反应，室温，12000r/min离心2min。取上清200μL，加入1mL，5％(w/v)的Na₂CO₃和200μL的福林酚试剂，混匀后40℃下显色10min，使用0.5cm石英比色皿于660nm下测定清液吸光值；实验组3个平行，空白对照是在加入底物之前先加入反应终止剂TCA，其余操作同上。

(2)酶活的定义：在40℃，PH 10.5的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为1个酶活单位，以U表示。

实施例1碱性蛋白酶易错PCR突变体的构建

1、重组质粒pP43NMK-BPAPR0的构建

(1)化学合成核苷酸序列(如SEQ ID NO：2所示)并使用Clonexpress IIOne StepCloning Kit(Vazyme)将获得的基因与pP43NMK质粒(丰晖生物)进行连接，得到连接产物。

(2)将连接产物转化大肠杆菌JM109(Takara)，将转化产物涂布于LB固体培养基，于37℃培养12～14h，在LB固体培养基上挑取4个转化子，接入LB液体培养基培养，于37℃培养12h后提取质粒，将提取得到的质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组质粒pP43NMK-BPAPR0。

2、碱性蛋白酶易错PCR突变体的构建

(1)根据碱性蛋白酶的序列(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，氨基酸序列如SEQID NO：1所示)，分别设计突变引物，对携带碱性蛋白酶基因的重组质粒pP43NMK-BPAPR0进行易错PCR扩增，以扩增带有质粒载体同源臂的碱性蛋白酶成熟肽片段，同时对携带碱性蛋白酶基因的载体质粒pP43NMK进行扩增，以高保真扩增质粒pP43NMK及原始碱性蛋白酶酶信号肽和前肽。

其中，易错PCR扩增原始碱性蛋白酶成熟肽所用引物如下：

正向引物：5'-TTCAGCGATTCCGCGTCTGCT-3'

反向引物：5'-GATTACGCCAAGCTTTCATCATTATTGAGC-3'

PCR扩增质粒pP43NMK及原始酶信号肽和前肽所用引物如下：

正向引物：5'-TAATGATGAAAGCTTGGCGTAATCATGGT-3'

反向引物：5'-AGCAGACGCGGAATCGCTGAA-3'

(2)易错PCR反应：使用GeneMorph II Random Mutagenesis Kit(Stratagene)，反应体系为：10×Mutazyme II reactionbuffer 5μL，Mutazyme IIDNApolymerase1μL，dNTP(40mM)1μL，1ng/μL模板DNA 1μL，10μM正向引物2μL，10μM反向引物2μL，加入双蒸水至50μL；

扩增条件：94℃预变性3min；随后进行94℃30s，55℃30s，72℃2min，30个循环；最后72℃10min；

PCR反应体系：2×Phanta Max MasterMix 25μL(Vazyme，货号：P515)，10μM正向引物2μL，10μM反向引物2μL，1ng/μL模板DNA 1μL，dNTP(40mM)1μL，加入双蒸水至50μL；

PCR扩增条件：95℃预变性3min；随后进行95℃15s，61℃15s，72℃5min，30个循环；最后72℃10min；

PCR扩增产物均用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结束后，向50μL扩增产物中加入1μL甲基化模板消化酶(Dpn I)，枪头吹吸进行混匀，于37℃条件下反应1h，随后于70℃条件下灭活5min；得到Dpn I消化产物。

(3)Dpn I消化产物使用Fastpure Gel DNAExtractionMini Kit(Vazyme)进行纯化，向50μL消化产物中加入150μLBuffer GDP，枪头吹吸进行混匀后全部移入吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去吸附柱下方管内废液，随后向吸附柱中加入700μL Buffer GW，12000rpm离心1min，弃去吸附柱下方管内废液，重复两次，随后用40μL双蒸水洗脱纯化产物。

(4)将原始碱性蛋白酶成熟肽片段的纯化产物与质粒pP43NMK、原始酶信号肽片段和原始碱性蛋白酶前肽片段的纯化产物通过同源多聚PCR反应连接，形成线性多聚体连接产物；

其中同源多聚连接PCR反应体系为：2×Phanta Max Master Mix 25μL(Vazyme)，质粒pP43NMK、原始酶信号肽片段和原始碱性蛋白酶前肽片段2μL(15ng/μL)，2μL原始碱性蛋白酶成熟肽片段(250ng/μL)，加入双蒸水至50μL；

PCR扩增条件为：95℃预变性3min；随后进行95℃15s，61℃15s，72℃10min，30个循环；最后72℃10min。

(5)将线性多聚反应后的连接产物转化枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞(详见CN102492645A)，转化产物涂布于卡那霉素(终浓度50mg/L)的LB固体培养基，于37℃培养12h。

实施例2重组菌的构建与突变体的筛选

(1)分别将实施例1获得的大量单菌落接种到含有发酵培养基的96深孔板中，在37℃、220rpm培养24h，分别得到含有野生型碱性蛋白酶及其变体的发酵液；

(2)分别将步骤(1)获得的发酵液于4℃、4000rpm条件下离心20min后，分别获得发酵上清液；

(3)分别将步骤(2)得到的发酵上清液于40℃反应条件下，检测碱性蛋白酶酶活，保留酶活高于野生型碱性蛋白酶酶活相近的突变重组菌。

(4)将步骤(3)筛选出的重组菌株分别接种至50mL添加卡那霉素(终浓度50mg/L)的LB液体培养基中，以含有野生型碱性蛋白酶的重组菌株为对照，37℃、220rpm培养24h，分别得到发酵液。将发酵液于12000rpm条件下离心2min，后于40℃反应条件检测发酵上清液中的碱性蛋白蛋白酶酶活。检测结果见表2。

表2发酵上清液中野生型碱性蛋白酶及其变体的酶活

(5)将步骤(4)收集的细胞上清液用超滤管浓缩到同一酶活条件后(8kU/mL)，进行热处理(60℃水浴10min)，然后检测碱性蛋白酶的剩余活性。检测结果见图1，60℃处理10min后，BPAPR1，BPAPR2，BPAPR3和BPAPR4变体的残余活性分别为75.2％、49.0％、26.0％和0％；而野生型碱性蛋白酶BPAPR0还保持有98.2％的活性。

实施例3：蛋白酶突变体在30L发酵罐中发酵和制备

将表达上述实施例中的蛋白酶突变体BPAPR0、BPAPR1、BPAPR2、BPAPR3和BPAPR4的基因工程菌分别划线于含有卡那霉素抗性的(终浓度为50μg/mL)LB平板上，37℃培养至长出单菌落，挑取长势良好的单菌落继续在含有卡那霉素抗性的(终浓度为50μg/mL)LB平板上划线培养，如此活化三代得到的菌落接种于50mL含有卡那霉素终浓度为50μg/mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养24h。以5％的接种量接种到1L含有卡那霉素终浓度为50μg/mL的LB培养基中，37℃、200rpm培养至OD 600为5左右，用作种子液接种发酵罐。

发酵生产工艺：发酵培养基(pH 7.0)温度37℃、搅拌速率600rpm、通风量1.5(v/v)，溶氧控制在20％以上。发酵过程pH控制在7.0，发酵24h后开始测定酶活力，待发酵结束后(一般48h)，发酵液通过离心除菌，超滤浓缩获得酶浓缩液用于应用测试。

实施例4：蛋白酶突变体对胶原蛋白大分子的切割实验

(1)将BPAPR4与分子量为4500Da胶原蛋白按照40000U：1g的比例配置成混合溶液后，用氢氧化钠调节溶液PH至9.0；

(2)步骤(1)中得到的混合溶液在35℃条件下静置酶切24h，确保胶原蛋白充分切割，反应结束后过滤去除微生物，并在60℃水浴条件下孵育10min，确保BPAPR4完全失活；

(3)利用安捷伦高效液相色谱-质谱联用仪测试步骤(2)对BPAPR4切割胶原蛋白的反应混合溶液进行分析，根据出峰情况来评测碱性蛋白酶突变体BPAPR4对胶原蛋白的切割效果。

切割结果如图3所示，通过液相的出峰时间(图3A，其中，峰面积代表不同分子量胶原蛋白肽的相对含量，出峰时间代表不同分子量胶原蛋白肽的分布范围)以及质谱在相应时间段内对应的物质分子量的峰图(图3B，对应图3A中相应出峰时间段内出峰的胶原蛋白肽所对应的分子量，图注RT代表相对应的出峰时间段)进行分析可以发现添加碱性蛋白酶突变体BPAPR4可以将分子量为4500Da的胶原蛋白大分子充分切割成分子量主要集中在350Da和1000Da之间的的混合多肽，根据液相和质谱峰图结果进行估算，其中90％以上的混合多肽分子量在350Da和700Da之间，不到10％的混合多肽分子量在700Da和100Da，说明BPAPR4可以充分将4500Da的大分子量胶原蛋白切割成更利于人体吸收的混合多肽。

Claims

1.一种碱性蛋白酶变体，所述变体包含至少一个选自V88Y、R103F、D124N、L157P、I243P、F267A、V281I或S337N的氨基酸取代，其中，所述氨基酸位置对应SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的成熟肽段区域。

2.如权利要求1所述的变体，包含选自下述任一氨基酸取代组：

L157P、

V88Y+D124N、

I243P+F267A+S337N、

V88Y+R103F+D124N+L157P+I243P+V281I。

3.如权利要求1所述的变体，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：9所示序列的成熟肽段区域。

4.编码如权利要求1-3中任一项变体的多核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的多核苷酸序列，还包含前导肽编码序列及信号肽编码序列。

6.如权利要求4所述的多核苷酸序列，如SEQ ID NO：4、6、8、或10所示。

7.基因工程菌，包含如权利要求4-6任一项所述的多核苷酸序列。

8.如权利要求7所述的基因工程菌，所述工程菌为枯草芽孢杆菌。

9.制备如权利要求1-3任一项所述的变体的方法，包括：(1)培养如权利要求7所述的基因工程菌；(2)回收变体。

10.如权利要求1-3任一项所述的变体在水解蛋白质肽键生成多肽或氨基酸中的应用。

11.如权利要求1-3任一项所述的变体在蛋白质短肽制备中的应用。

12.如权利要求1-3任一项所述的变体在化妆品或护肤品制备中的应用。