CN109266634B

CN109266634B - 耐辐射异常球菌角蛋白酶基因kerA的应用

Info

Publication number: CN109266634B
Application number: CN201811124474.1A
Authority: CN
Inventors: 林敏�; 周正富; 王劲; 耿秀秀; 张维; 陈明
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2038-09-26
Also published as: CN109266634A

Abstract

本发明从极端菌株耐辐射异常球菌中发现了一种具有降解复杂结构蛋白功能的基因KerA。本发明构建了含有该基因的重组载体，将其在原核宿主细胞大肠杆菌中表达。实验证明，所述基因在原核宿主细胞中表达后，能降解复杂结构蛋白质的功能，可用于蛋白酶催化生物降解及相关工业生产中。

Description

耐辐射异常球菌角蛋白酶基因kerA的应用

技术领域

本发明属于生物降解技术领域，涉及耐辐射异常球菌角蛋白酶KerA基因降解复杂结构的蛋白质、发挥碱性蛋白酶水解的功能。

背景技术

酶作为一种重要的生物催化剂，在生物化学反应中发挥十分重要的作用，较化学催化剂，酶的催化作用所需条件温和。无论在蛋白质工程、细胞工程、基因工程和发酵工程都需要各种酶的参与，酶工程技术己成为生物工程技术的重要组成部分。其中，蛋白酶在工业酶中用得最多，约占用酶总量的60％，而碱性蛋白酶占37％。

碱性蛋白酶是指在碱性条件下水解蛋白质肽键的一类蛋白酶的总称，属于丝氨酸蛋白水解酶类。微生物碱性蛋白酶一般在pH为7-11范围内有活性，最适pH多为9.5-10.5。多数微生物碱性蛋白酶不具有耐热性，在50-60℃维持较长时间便大量失活，只有少数菌株产生的碱性蛋白酶能够耐受70℃的高温。这些情况限制了碱性蛋白酶的使用范围，人们需要找到pH范围和温度范围更宽的碱性蛋白酶用于实际生产中。

发明内容

异常球菌属菌株分离于温泉、沙漠、冰山及南极等各种各样的环境，所有的异常球菌属物种均具有极强的胁迫逆境抗性及超强的环境适应性。在这种极端的环境下，这些微生物经过长期的选择压力下，进化出一系列适应该生境的基因种质资源。菌株基因组中丰富的功能酶编码基因值得进行更加深入的研究。

本发明的目的是从耐辐射异常球菌Deinococcus radiodurans中发掘鉴定了一种用于复杂结构蛋白降解的碱性蛋白酶基因。

通过如下研究，首次发掘鉴定了耐辐射异常球菌KerA基因(GeneID：RS01950；ProteinID：WP_027480084)可用于微生物催化的生物降解。具体研究工作如下：

1、获得了含有KerA基因的重组工程菌株

1)通过PCR从耐辐射异常球菌基因组扩增出KerA基因，基因序列号为：GeneID：RS01950。其大小为1599bp，该基因编码532个氨基酸，将其克隆于载体pJET上，构建了含有完整KerA基因的重组质粒pJET-KerA；

2)将KerA基因连接于pET22b质粒上，该质粒含诱导型T7启动子和前导肽pelB，可将诱导表达的靶标蛋白释放到培养液中。构建完成的重组质粒pET22-KerA；

3)将导入KerA基因的重组质粒pET22-KerA转入受体大肠杆菌BL21(DE3)中，获得工程菌株BL21-KerA(详见实施例1)；

2、含有KerA基因重组工程菌株的生物降解检测实验及蛋白酶活性测定分析

本发明进行了如下生物降解检测实验：

1)平板降解圈实验：实验结果显示，表达KerA蛋白酶的重组工程菌株在脱脂乳平板上能够生长并产生明显的降解圈。

2)羽毛降解实验：实验证实，并KerA蛋白酶具有降解鸡羽毛的活性(详见实施例2)。

结果说明，表达KerA的重组大肠杆菌工程菌株具有分泌蛋白酶的能力，该蛋白酶能够降解脱脂乳蛋白和鸡羽毛等复杂结构蛋白。

本发明还进行了蛋白酶活性测定分析。30℃诱导培养条件下，工程菌BL21-KerA在诱导8h后可以检测出胞外蛋白酶酶活，粗酶液酶活为137.1U/mg(详见实施例3)。羽毛降解发酵液中氨基酸种类与含量分析显示，降解产物主要产生精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸等21种氨基酸(详见实施例4)。

序列表信息

SEQ ID NO.1：KerA基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO.2：KerA的氨基酸序列。

附图说明：

图1工程菌株BL21-KerA与对照菌株BL21-22b的牛奶平板降解效果；

图2工程菌株BL21-KerA与对照菌株BL21-22b对羽毛底物的降解效果。

具体实施方式

以下实施例中所举的质粒、菌株以及微生物催化降解的对象只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下：

克隆载体pJET：为ThermoFisher公司市售产品；

穿梭质粒pET-22b：Novagen公司市售产品；

大肠杆菌BL21(DE3)：为北京全式金公司市售产品。

羽毛：为鸡羽毛采购于市场。

实施例1耐辐射异常球菌KerA基因序列在大肠杆菌中的表达

一、实验材料

大肠杆菌BL21(DE3)：为北京全式金公司市售产品。

PCR模板DNA：耐辐射异常球菌基因组DNA

二、实验方法

1.根据已公布的耐辐射异常球菌基因组中的KerA基因序列设计1对PCR特异性引物：

KerA-F：5′ACCGGATCCGATGAACGCACGTCTCGTTGC 3′

KerA-R：5′ACCCTCGAGCTTCGTTTCGGTCAGGCTGT 3′

2.通过PCR方法从耐辐射异常球菌基因组DNA中扩增出目的基因序列。

反应条件：94℃10min，[94℃30sec，58℃30sec，72℃1.5min]35个循环，72℃10min。

3.PCR产物经胶回收后，克隆于载体pJET上，命名为pJET-KerA，并测序验证；然后通过BamH I/Xho I双酶切获得含有粘性末端的KerA基因及含有T7启动子的pET-22b载体，将KerA基因连接于pET-22b载体上，构建大肠杆菌高表达载体pET22-KerA，将该表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)。

三、实验结果

利用PCR技术成功克隆了耐辐射异常球菌KerA基因，成功构建了表达KerA的重组大肠杆菌工程菌株。经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为BL21-KerA。含有pET-22b对照空质粒的E.coli BL21(DE3)命名为BL21-22b。

四、实验结论

完成表达KerA的重组大肠杆菌工程菌株的构建。

实施例2耐辐射异常球菌KerA蛋白酶活性初步分析

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的表达KerA基因的BL21-KerA菌株

对照菌株：实施例1所述含空质粒的BL21-22b菌株。

二、实验方法

1平板降解圈实验

1)挑去单克隆菌株接种于含Amp的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养过夜

2)将种子液转接于新的LB培养基，培养至对数生长期。制备含有1％脱脂乳的1％琼脂平板。将菌株在平板上进行点种，每隔12h测定水解圈直径及菌落直径，至稳定不变。

3)计算平板上水解圈直径与菌落直径的比值H/C，初步评估菌株产蛋白酶能力。

2羽毛降解实验

用清水冲洗鸡羽毛，烘干备用。以羽毛为唯一碳源和氮源加入50mL无机盐培养基，高温灭菌。无机盐培养基：NaCl 0.05％，K₂HPO₄ 0.1％，KH₂PO₄ 0.04％，MgCl₂·7H₂O0.01％，CaCl₂ 0.006％，pH7.5。

将菌株种子液转接于以羽毛为唯一碳源和氮源加入无机盐培养基中，37℃恒温摇床培养，每隔12h观测羽毛降解情况。

三、实验结果

平板降解圈实验结果显示，培养24h后表达KerA蛋白的菌株BL21-KerA在脱脂乳平板上能够生长并产生明显的降解圈，对照菌株BL21-22b未见降解圈(图1)。羽毛降解实验显示，菌株BL21-KerA培养24h开始降解羽毛，72h后羽毛完全降解。对照菌株BL21-22b培养液中羽毛未见降解发生(图2)。

四、实验结论

表达KerA的重组大肠杆菌工程菌株具有分泌蛋白酶的能力，该蛋白酶能够降解脱脂乳蛋白和羽毛。

实施例3耐辐射异常球菌KerA蛋白酶酶活测定实验

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的表达KerA基因的BL21-KerA菌株

二、实验方法

1蛋白表达与纯化

1)挑去单克隆接种至50mL含Amp的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养过夜

2)0.1％转接菌株种子液至新鲜LB培养基中，37℃恒温摇床培养到OD₆₀₀达0.6

3)向培养基中加入终浓度1mM的IPTG，30℃诱导培养8h

4)12000rpm离心收集菌体和培养液上清，上清液为粗酶液

5)加入上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE分析。

2蛋白酶酶活测定

采用Folin-酚法测定培养基中蛋白酶的酶活，具体步骤如下：

1)将离心所得粗酶液用pH 8.0，50mM Tris-HCl稀释至合适倍数

2)取稀释后上清100μL，加入2％酪蛋白底物100μL，在55℃孵育10min，加入200μL0.4M三氯乙酸终止反应10min。

3)12000rpm离心2min，取上清100μL，加入500μL 0.4M Na₂CO₃，100μL Folin试剂，混匀，在40℃显色20min后660nm测定吸光值。

4)每分钟催化酪蛋白水解生成1μg酪氨酸定义为一个酶活力单位(U)。利用不同浓度的酪氨酸对其在660nm吸光值作图制作到酪氨酸标准曲线。

三、实验结果

研究结果显示，30℃诱导培养条件下，工程菌BL21-KerA在诱导8h后可以检测出胞外蛋白酶酶活，粗酶液酶活为137.1U/mg。

四、实验结论

KerA蛋白酶在工程菌种成功表达，具有蛋白酶活性，胞外粗酶活为137.1U/mg。

实施例4耐辐射异常球菌KerA蛋白酶羽毛降解产物分析

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的表达KerA基因的BL21-KerA菌株

二、实验方法

1.将离心所得粗酶液用pH 8.0，50mM Tris-HCl稀释至合适倍数

2.取稀释后上清3mL，加入羽毛粉10mg，在40℃孵育60min，加入2mL 0.4M三氯乙酸终止反应10min。

3.12000rpm离心10min，取上清。对照组反应前即加入2mL 0.4M三氯乙酸

4.将5mL上清样品加入旋转蒸发仪中，蒸发至1mL，回收至EP管中，利用氨基酸分析仪进行降解产物的游离氨基酸含量分析。

三、实验结果

研究结果显示，如下：

结果显示，羽毛降解发酵液中氨基酸种类与含量分析显示，降解产物主要产生精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸等21种氨基酸。

四、实验结论

耐辐射异常球菌KerA蛋白的羽毛降解发酵液中氨基酸含量分析显示，降解产物主要产生精氨酸、酪氨酸、脯氨酸、胱氨酸等21种氨基酸。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 耐辐射异常球菌角蛋白酶基因kerA的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1599

<212> DNA

<213> 耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）

<400> 1

atgaacgcac gtctcgttgc cggcgccctt accctcaccc tgatcctcgc gtcctgcggt 60

tcgcagcaaa gcaccccggc ggccagcgcc cagcccgaca cggcggcgca gcgcacccgc 120

acccttgcgc cgctgctcgg caccgacaag cccgacgcca ttgccgggca gtacatcgtg 180

gtcttcagcg aaggggcgtc cagcggctcg ctcagtgctc aggacacggg ctctggccga 240

ctgagcagtc tcagcgctgg tcagcttgtg cgcgccctga acctcgaccc gcagggcgtg 300

accgttcaga acatctacaa ccaggccctt gaaggctttt cgggcaagct cagcgcccag 360

aacctgcaaa cgctgcgggc cgaccaccgc gtgaaataca tcgagcaaga cggcatgatg 420

tacgccagtg ccacccagtc gggggcgacc tggggcatcg accgcatcga ccagcgcagc 480

ctgccgctcg acagcagcta cacctatggc accaccggca gcggcgtgaa ggcgtacatc 540

atcgacaccg gcatcaacac tagtcatacg gcgttcggtg gccgcgccgt gtggggcacc 600

aaccagtcgg gcgacggcaa cgatagcgac tgcaacggcc acggcaccca cgtcgccggc 660

acggtgggca gcagcaccta cggcgtcgcc aagggcgtgt cgctgatcgc cgtcaaggtg 720

ctggcgtgcg acggctcggg cagcaactcg ggcgtgattg ccggcatcaa ctgggccgtg 780

ggcaacaagg gcagcgccgc cgccgtcgcc aacatgagcc tgggcggcgg ggccagtcag 840

gcggtggacg acgccgtgaa caacgccgcg tccaagaacc tcgtcatggc ggtggctgcg 900

ggcaacgaaa accagaacgc ctgcaacgtg tccccggcgc gcgccgtgaa cgccatcacg 960

gtgggcgcga ccaccaagac cgacagccgc gataccggct acagcaacta cgggagctgc 1020

ctcgacatct tcgcgcccgg caccaacatc accagcacct ggatcggctc gaccagcgcc 1080

accaacacca tcagcggcac cagcatggcg accccgcacg taacgggcgc ggtggccctc 1140

ctgattgccg agggcaacac caccaccagc gcggtgacga gcgccctgct caataacgcc 1200

accaccggca agctgagcag catcggcacc ggcagcccca accgcctgct ctacaccggc 1260

agcggcgcga ccactccggc accgacgccg acgcccgctc ccggcaccac gaccacctac 1320

agcggcagcg tgagcagggg cggcagcagc tacaagcccg gcagcagcgg cttttcctac 1380

gcgggcggca ccctgagcgc gcagctgagc ggccccggcg gcaccgactt cgacctctac 1440

ctccagaagt acaacggcag cacctgggcc gacgtggctg ccagcgaagc gagcggcagc 1500

agcgagacca tcagctacaa cgcgggcgcg ggcacctacc gctgggaggt ctacgcctac 1560

tccggcagcg gctcctacag cctgaccgaa acgaagtaa 1599

<210> 2

<211> 532

<212> PRT

<213> 耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）

<400> 2

MET Asn Ala Arg Leu Val Ala Gly Ala Leu Thr Leu Thr Leu Ile Leu

1 5 10 15

Ala Ser Cys Gly Ser Gln Gln Ser Thr Pro Ala Ala Ser Ala Gln Pro

20 25 30

Asp Thr Ala Ala Gln Arg Thr Arg Thr Leu Ala Pro Leu Leu Gly Thr

35 40 45

Asp Lys Pro Asp Ala Ile Ala Gly Gln Tyr Ile Val Val Phe Ser Glu

50 55 60

Gly Ala Ser Ser Gly Ser Leu Ser Ala Gln Asp Thr Gly Ser Gly Arg

65 70 75 80

Leu Ser Ser Leu Ser Ala Gly Gln Leu Val Arg Ala Leu Asn Leu Asp

85 90 95

Pro Gln Gly Val Thr Val Gln Asn Ile Tyr Asn Gln Ala Leu Glu Gly

100 105 110

Phe Ser Gly Lys Leu Ser Ala Gln Asn Leu Gln Thr Leu Arg Ala Asp

115 120 125

His Arg Val Lys Tyr Ile Glu Gln Asp Gly MET MET Tyr Ala Ser Ala

130 135 140

Thr Gln Ser Gly Ala Thr Trp Gly Ile Asp Arg Ile Asp Gln Arg Ser

145 150 155 160

Leu Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Thr Tyr Gly Thr Thr Gly Ser Gly Val

165 170 175

Lys Ala Tyr Ile Ile Asp Thr Gly Ile Asn Thr Ser His Thr Ala Phe

180 185 190

Gly Gly Arg Ala Val Trp Gly Thr Asn Gln Ser Gly Asp Gly Asn Asp

195 200 205

Ser Asp Cys Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Gly Ser

210 215 220

Ser Thr Tyr Gly Val Ala Lys Gly Val Ser Leu Ile Ala Val Lys Val

225 230 235 240

Leu Ala Cys Asp Gly Ser Gly Ser Asn Ser Gly Val Ile Ala Gly Ile

245 250 255

Asn Trp Ala Val Gly Asn Lys Gly Ser Ala Ala Ala Val Ala Asn MET

260 265 270

Ser Leu Gly Gly Gly Ala Ser Gln Ala Val Asp Asp Ala Val Asn Asn

275 280 285

Ala Ala Ser Lys Asn Leu Val MET Ala Val Ala Ala Gly Asn Glu Asn

290 295 300

Gln Asn Ala Cys Asn Val Ser Pro Ala Arg Ala Val Asn Ala Ile Thr

305 310 315 320

Val Gly Ala Thr Thr Lys Thr Asp Ser Arg Asp Thr Gly Tyr Ser Asn

325 330 335

Tyr Gly Ser Cys Leu Asp Ile Phe Ala Pro Gly Thr Asn Ile Thr Ser

340 345 350

Thr Trp Ile Gly Ser Thr Ser Ala Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser

355 360 365

MET Ala Thr Pro His Val Thr Gly Ala Val Ala Leu Leu Ile Ala Glu

370 375 380

Gly Asn Thr Thr Thr Ser Ala Val Thr Ser Ala Leu Leu Asn Asn Ala

385 390 395 400

Thr Thr Gly Lys Leu Ser Ser Ile Gly Thr Gly Ser Pro Asn Arg Leu

405 410 415

Leu Tyr Thr Gly Ser Gly Ala Thr Thr Pro Ala Pro Thr Pro Thr Pro

420 425 430

Ala Pro Gly Thr Thr Thr Thr Tyr Ser Gly Ser Val Ser Arg Gly Gly

435 440 445

Ser Ser Tyr Lys Pro Gly Ser Ser Gly Phe Ser Tyr Ala Gly Gly Thr

450 455 460

Leu Ser Ala Gln Leu Ser Gly Pro Gly Gly Thr Asp Phe Asp Leu Tyr

465 470 475 480

Leu Gln Lys Tyr Asn Gly Ser Thr Trp Ala Asp Val Ala Ala Ser Glu

485 490 495

Ala Ser Gly Ser Ser Glu Thr Ile Ser Tyr Asn Ala Gly Ala Gly Thr

500 505 510

Tyr Arg Trp Glu Val Tyr Ala Tyr Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Ser Leu

515 520 525

Thr Glu Thr Lys

530

Claims

1.SEQ ID NO:1 所示序列的基因在催化生物降解中的应用，所述的应用，是所述基因编码的蛋白酶在生物降解中用于复杂结构蛋白质的降解。

2.权利要求1所述的应用，所述的降解反应是将蛋白质降解为多肽或氨基酸的催化反应。

3.含有SEQ ID NO:1 所示序列基因的质粒在蛋白质降解中的应用。

4.含有SEQ ID NO:1 所示序列基因的重组工程菌株在蛋白质降解中的应用。