CN109161557B

CN109161557B - 耐辐射戈壁异常球菌碱性蛋白酶基因KerB的应用

Info

Publication number: CN109161557B
Application number: CN201811124487.9A
Authority: CN
Inventors: 林敏�; 王劲; 周正富; 耿秀秀; 张维; 陈明
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2018-09-26
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2038-09-26
Also published as: CN109161557A

Abstract

本发明从沙漠环境菌株中发现了一种具有降解复杂结构蛋白功能的基因KerB。本发明构建了含有该基因的重组载体，将其在原核宿主细胞大肠杆菌中表达。实验证明，所述基因在原核宿主细胞中表达后，能降解复杂结构蛋白质的功能，可用于蛋白酶催化生物降解及相关领域的工业生产中。

Description

耐辐射戈壁异常球菌碱性蛋白酶基因KerB的应用

技术领域

本发明属于生物降解技术领域，涉及KerB基因降解复杂结构的蛋白质、发挥碱性蛋白酶水解的功能。

背景技术

酶作为一种重要的生物催化剂具有重要的工业应用价值。目前，用于工业化生产的碱性蛋白酶主要来源于微生物。极端环境微生物经过长期的压力选择，进化出一系列适应该生境的生存机制，菌株基因组中丰富的功能酶编码基因资源更加值得进行深入的研究。碱性蛋白酶是指在碱性条件下水解蛋白质肽键的一类蛋白酶的总称，在饲料、织物处理、清洁剂、医药等行业具有广泛的应用价值。多数微生物碱性蛋白酶不具有耐热性，只有少数菌株产生的碱性蛋白酶能够耐受70℃的高温。因此，筛选获得具有优良性质的碱性蛋白酶基因、并进行高效表达、同时通过分子改良等方法提高蛋白酶降解效率一直都是人们关注和研究的热点。

发明内容

本发明的目的是从戈壁异常球菌Deinococcus gobiensis中发现一种用于复杂结构蛋白降解的碱性蛋白酶基因。

通过如下研究，首次发掘鉴定了戈壁异常球菌KerB基因(GeneID：RS03965；ProteinID：WP_014684195.1)可用于微生物催化的生物降解。具体研究工作如下：

1、获得了含有KerB基因的重组工程菌株；

1)通过PCR从戈壁异常球菌基因组扩增出KerB基因，基因序列号为：GeneID：RS03965。其大小为1599bp，该基因编码532个氨基酸，将其克隆于载体pJET上，构建了含有完整KerB基因的克隆质粒pJET-KerB；

2)将KerB基因连接于pET22b质粒上，该质粒含诱导型T7启动子和前导肽pelB，可将诱导表达的靶标蛋白释放到培养液中。构建完成的重组质粒pET22-KerB；

3)将导入KerB基因的重组质粒pET22-KerB转入受体大肠杆菌BL21(DE3)中，获得工程菌株BL21-KerB(详见实施例1)；

2、含有KerB基因重组工程菌株的生物降解检测实验及蛋白酶活性测定分析

本发明进行了如下生物降解检测实验：

1)平板降解圈实验：平板降解圈实验结果显示，表达KerB蛋白酶的重组工程菌株在脱脂乳平板上能够生长并产生明显的降解圈(图1)。

2)羽毛降解实验：实验显示，KerB蛋白酶具有降解鸡羽毛的活性(详见实施例2)。

说明，表达KerB的重组大肠杆菌工程菌株具有分泌蛋白酶的能力，该蛋白酶能够降解脱脂乳蛋白和鸡羽毛等复杂结构蛋白。

本发明还进行了蛋白酶活性测定分析。20℃诱导培养条件下，工程菌BL21-KerB在诱导16h后可以检测出胞外蛋白酶酶活，粗酶液酶活较高为239.13U/mg(详见实施例3)。羽毛降解发酵液中氨基酸种类与含量分析显示，降解产物主要产生酪氨酸、精氨酸、脯氨酸、胱氨酸、β丙氨酸等18种氨基酸(详见实施例4)。

序列表信息

SEQ ID NO.1：KerB基因的核苷酸序列。

SEQ ID NO.2：KerB的氨基酸序列。

附图说明：

图1工程菌株BL21-KerB与对照菌株BL21-22b的牛奶平板降解效果；

图2工程菌株BL21-KerB与对照菌株BL21-22b对羽毛底物的降解效果。

具体实施方式

以下实施例中所举的质粒、菌株以及微生物催化降解的对象只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下：

克隆载体pJET：为ThermoFisher公司市售产品；

穿梭质粒pET-22b：Novagen公司市售产品；

大肠杆菌BL21(DE3)：为北京全式金公司市售产品。

羽毛：为鸡羽毛采购于市场。

实施例1耐辐射异常球菌KerB基因序列在大肠杆菌中的表达

一、实验材料

大肠杆菌BL21(DE3)：为北京全式金公司市售产品。

PCR模板DNA：戈壁异常球菌基因组DNA

二、实验方法

1.根据已公布的戈壁异常球菌基因组中的KerB基因序列设计1对PCR特异性引物：

KerB-F：5′ACCGAGCTCCATGAACGTACGTGTCACTGC 3′

KerB-R：5′ACCCTCGAGCTTGCTTTCGGTCAGGGTGT 3′

2.通过PCR方法从戈壁异常球菌基因组DNA中扩增出目的基因序列。

反应条件：94℃10min，[94℃30sec，60℃30sec，72℃1.5min]35个循环，72℃10min。

3.PCR产物经胶回收后，克隆于载体pJET上，命名为pJET-KerB，并测序验证；然后通过Sac I/Xho I双酶切获得含有粘性末端的KerB基因及含有T7启动子的pET-22b载体，将KerB基因连接于pET-22b载体上，构建大肠杆菌高表达载体pET22-KerB，将该表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)。

三、实验结果

利用PCR技术成功克隆了戈壁异常球菌KerB基因，成功构建了表达KerB的重组大肠杆菌工程菌株。经PCR、酶切，测序验证插入序列正确，将该菌株命名为BL21-KerB。含有pET-22b对照空质粒的E.coli BL21(DE3)命名为BL21-22b。

四、实验结论

完成表达KerB的重组大肠杆菌工程菌株的构建。

实施例2戈壁异常球菌KerB蛋白酶活性初步分析

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的表达KerB基因的BL21-KerB菌株

对照菌株：实施例1所述含空质粒的BL21-22b菌株。

二、实验方法

1平板降解圈实验

1)挑去单克隆菌株接种于含Amp的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养过夜

2)将种子液转接于新的LB培养基，培养至对数生长期。制备含有1％脱脂乳的1％琼脂平板。将菌株在平板上进行点种，每隔12h测定水解圈直径及菌落直径，至稳定不变。

3)计算平板上水解圈直径与菌落直径的比值H/C，初步评估菌株产蛋白酶能力。

2羽毛降解实验

用清水冲洗鸡羽毛，烘干备用。以羽毛为唯一碳源和氮源加入50mL无机盐培养基，高温灭菌。无机盐培养基：NaCl 0.05％，K₂HPO₄ 0.1％，KH₂PO₄ 0.04％，MgCl₂·7H₂O0.01％，CaCl₂ 0.006％，pH7.5。

将菌株种子液转接于以羽毛为唯一碳源和氮源加入无机盐培养基中，37℃恒温摇床培养，每隔12h观测羽毛降解情况。

三、实验结果

平板降解圈实验结果显示表达KerB蛋白的菌株BL21-KerB在脱脂乳平板产生明显的降解圈，H/C为2.8，对照菌株BL21-22b未见降解圈(图1)。羽毛降解实验显示，菌株BL21-KerB培养24h开始降解羽毛，72h后羽毛几乎完全降解。对照菌株BL21-22b培养液中羽毛未见降解发生(图2)。

四、实验结论

表达KerB的重组大肠杆菌工程菌株具有分泌蛋白酶的能力，该蛋白酶能够降解脱脂乳蛋白和羽毛。

实施例3戈壁异常球菌KerB蛋白酶酶活测定实验

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的表达KerB基因的BL21-KerB菌株

二、实验方法

1蛋白表达与纯化

1)挑去单克隆接种至50mL含Amp的液体LB培养基中，37℃恒温摇床培养过夜

2)0.1％转接菌株种子液至新鲜LB培养基中，37℃恒温摇床培养到OD600达0.6

3)向培养基中加入终浓度1.0mM的IPTG，20℃诱导培养16h

4)12000rpm离心收集菌体和培养液上清，上清液为粗酶液

5)加入上样缓冲液，煮沸后进行SDS-PAGE分析。

2蛋白酶酶活测定

采用Folin-酚法测定培养基中蛋白酶的酶活，具体步骤如下：

1)将离心所得粗酶液用pH 8.0，50mM Tris-HCl稀释至合适倍数

2)取稀释后上清100μL，加入2％酪蛋白底物100μL，在55℃孵育10min，加入200μL0.4M三氯乙酸终止反应10min。

3)12000rpm离心2min，取上清100μL，加入500μL 0.4M Na2CO3，100μL Folin试剂，混匀，在40℃显色20min后660nm测定吸光值。

4)每分钟催化酪蛋白水解生成1μg酪氨酸定义为一个酶活力单位(U)。利用不同浓度的酪氨酸对其在660nm吸光值作图制作到酪氨酸标准曲线。

三、实验结果

研究结果显示，20℃诱导培养条件下，工程菌BL21-KerB在诱导16h后可以检测出胞外蛋白酶酶活，粗酶液酶活为239.13U/mg。

四、实验结论

KerB蛋白酶在工程菌种成功表达，具有蛋白酶活性，胞外粗酶活为239.13U/mg。

实施例4戈壁异常球菌KerB蛋白酶羽毛降解产物分析

一、实验材料

重组工程菌株：实施例1得到的表达KerB基因的BL21-KerB菌株

二、实验方法

1.将离心所得粗酶液用pH 8.0，50mM Tris-HCl稀释至合适倍数

2.取稀释后上清3mL，加入羽毛粉10mg，在40℃孵育60min，加入2mL 0.4M三氯乙酸终止反应10min。

3.12000rpm离心10min，取上清。对照组反应前即加入2mL 0.4M三氯乙酸

4.将5mL上清样品加入旋转蒸发仪中，蒸发至1mL，回收至EP管中，利用氨基酸分析仪进行降解产物的游离氨基酸含量分析。

三、实验结果

研究结果显示，如下：

结果显示，羽毛降解发酵液中氨基酸种类与含量分析显示，降解产物主要产生酪氨酸、精氨酸、脯氨酸、胱氨酸、β丙氨酸等18种氨基酸。

四、实验结论

KerB蛋白的羽毛降解发酵液中氨基酸含量分析显示，降解产物主要产生酪氨酸、精氨酸、脯氨酸、胱氨酸、β丙氨酸等18种氨基酸。

序列表

<110> 中国农业科学院生物技术研究所

<120> 耐辐射戈壁异常球菌碱性蛋白酶基因KerB的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1599

<212> DNA

<213> 戈壁射异常球菌（Deinococcus gobiensis）

<400> 1

atgaacgtac gtgtcactgc cgcgaccctg ggtctcactc ttcttctcgc cgcctgtggg 60

gagcagtccc ccaccgctca ggccgccccg ggcaccgggc tgcccaccgc cgctgcccgc 120

acgcaggcgc cgctgctggg tgccagcaat cccgacgcca tcgccggcca gtacatcgtc 180

gtgttcagcg acggagcgat gcccgacctc gcggcccaga gtgccggcgg cctgatcggt 240

cgcctgggcc tcgatccgca gggcatcacg gtgcagcaca tctacgccgc cgccctgaac 300

ggcttcgcgg cccggctcag tgcccagaac ctcgccaaac ttcaggcgga caggcgcgtg 360

aagtatgtcc agcaggacag cgtggtccgg gcgagcgcca cgcagtccgg cgcggtctgg 420

ggcctggacc gcatcgacca gcgcagcctg cccctcaacg gcagctacgt ctatgacacg 480

gccgccagta acgtgaaggt ctacatcatc gacaccggga tccgcatcac gcaccaggaa 540

ttcggcgggc gcgccacctg gggcaccaac cagacgggcg acggcaacaa cacggactgc 600

ggcgggcacg gcacccacgt ggccggcacg gtgggcagca gcacctacgg cgtcgccaag 660

agcgtgaaac tcgtggcggt caaggtgctc ggctgcaacg gctcgggctc caacagcggc 720

atcatcgccg gcatcaactg ggcggtgagc aacaagggca gcgccacggc catcgccaac 780

atgagcctcg ggggcgggcg cgatcaggcc tcgaacgacg cggtgaacac tgccgtcaac 840

aagggcctgt tcatcgccgt cgccgccggc aacgagaatc aggacgcctg caacgtgtcc 900

ccggccagcg ccgagaaggc cttgaccgtg ggggccacga ccaggagcga ccggcgcgcc 960

gatcccaacg actggggcta cacgcaggcg ggcagtcccc tgggcagcaa ctacggcagt 1020

tgcgtggacc tcttcgcgcc cggcaccggc atcaccagca cgctgagcac cggcgacacg 1080

gccgtcagcg gcgccacctg gaacggcacc tccatggcga ccccgcacgt ggcgggcgcg 1140

gcggccctca tcctggcggc caaccccagc tatacccccg accagatccg cgcggcgctg 1200

ctgaacagcg cgacgaccgg caagttgtcg aacctcggcg gcagcgtgga ccgcctgctc 1260

ttcacgaatc ccggcggcgg caccacggac ccggccccca cgccgaacac ccagacctac 1320

accggttccg tcgcggcagg ccagaacagc taccagccca acaccaccgg cttcaactac 1380

gcgggcggca ccctcaaggc gtccctgagc gggccagcgg gcacggactt cgacctctac 1440

ctctaccggt accagaacgg cgcctggagc gtcgtcgccc agagtgacgg cagcaccagc 1500

acggagggcg tcacctacac ggcggcggcc ggcacctaca tctggggaat ctacgcctac 1560

tcgggcagcg gcagctacac cctgaccgaa agcaagtaa 1599

<210> 2

<211> 532

<212> PRT

<213> 戈壁射异常球菌（Deinococcus gobiensis）

<400> 2

MET Asn Val Arg Val Thr Ala Ala Thr Leu Gly Leu Thr Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ala Ala Cys Gly Glu Gln Ser Pro Thr Ala Gln Ala Ala Pro Gly Thr

20 25 30

Gly Leu Pro Thr Ala Ala Ala Arg Thr Gln Ala Pro Leu Leu Gly Ala

35 40 45

Ser Asn Pro Asp Ala Ile Ala Gly Gln Tyr Ile Val Val Phe Ser Asp

50 55 60

Gly Ala MET Pro Asp Leu Ala Ala Gln Ser Ala Gly Gly Leu Ile Gly

65 70 75 80

Arg Leu Gly Leu Asp Pro Gln Gly Ile Thr Val Gln His Ile Tyr Ala

85 90 95

Ala Ala Leu Asn Gly Phe Ala Ala Arg Leu Ser Ala Gln Asn Leu Ala

100 105 110

Lys Leu Gln Ala Asp Arg Arg Val Lys Tyr Val Gln Gln Asp Ser Val

115 120 125

Val Arg Ala Ser Ala Thr Gln Ser Gly Ala Val Trp Gly Leu Asp Arg

130 135 140

Ile Asp Gln Arg Ser Leu Pro Leu Asn Gly Ser Tyr Val Tyr Asp Thr

145 150 155 160

Ala Ala Ser Asn Val Lys Val Tyr Ile Ile Asp Thr Gly Ile Arg Ile

165 170 175

Thr His Gln Glu Phe Gly Gly Arg Ala Thr Trp Gly Thr Asn Gln Thr

180 185 190

Gly Asp Gly Asn Asn Thr Asp Cys Gly Gly His Gly Thr His Val Ala

195 200 205

Gly Thr Val Gly Ser Ser Thr Tyr Gly Val Ala Lys Ser Val Lys Leu

210 215 220

Val Ala Val Lys Val Leu Gly Cys Asn Gly Ser Gly Ser Asn Ser Gly

225 230 235 240

Ile Ile Ala Gly Ile Asn Trp Ala Val Ser Asn Lys Gly Ser Ala Thr

245 250 255

Ala Ile Ala Asn MET Ser Leu Gly Gly Gly Arg Asp Gln Ala Ser Asn

260 265 270

Asp Ala Val Asn Thr Ala Val Asn Lys Gly Leu Phe Ile Ala Val Ala

275 280 285

Ala Gly Asn Glu Asn Gln Asp Ala Cys Asn Val Ser Pro Ala Ser Ala

290 295 300

Glu Lys Ala Leu Thr Val Gly Ala Thr Thr Arg Ser Asp Arg Arg Ala

305 310 315 320

Asp Pro Asn Asp Trp Gly Tyr Thr Gln Ala Gly Ser Pro Leu Gly Ser

325 330 335

Asn Tyr Gly Ser Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Thr Gly Ile Thr

340 345 350

Ser Thr Leu Ser Thr Gly Asp Thr Ala Val Ser Gly Ala Thr Trp Asn

355 360 365

Gly Thr Ser MET Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile

370 375 380

Leu Ala Ala Asn Pro Ser Tyr Thr Pro Asp Gln Ile Arg Ala Ala Leu

385 390 395 400

Leu Asn Ser Ala Thr Thr Gly Lys Leu Ser Asn Leu Gly Gly Ser Val

405 410 415

Asp Arg Leu Leu Phe Thr Asn Pro Gly Gly Gly Thr Thr Asp Pro Ala

420 425 430

Pro Thr Pro Asn Thr Gln Thr Tyr Thr Gly Ser Val Ala Ala Gly Gln

435 440 445

Asn Ser Tyr Gln Pro Asn Thr Thr Gly Phe Asn Tyr Ala Gly Gly Thr

450 455 460

Leu Lys Ala Ser Leu Ser Gly Pro Ala Gly Thr Asp Phe Asp Leu Tyr

465 470 475 480

Leu Tyr Arg Tyr Gln Asn Gly Ala Trp Ser Val Val Ala Gln Ser Asp

485 490 495

Gly Ser Thr Ser Thr Glu Gly Val Thr Tyr Thr Ala Ala Ala Gly Thr

500 505 510

Tyr Ile Trp Gly Ile Tyr Ala Tyr Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Thr Leu

515 520 525

Thr Glu Ser Lys

530

Claims

1.SEQ ID NO:1所示序列的基因在微生物催化生物降解中的应用，所述的应用，是所述基因编码的蛋白酶在生物降解中用于复杂结构蛋白质的降解。

2.权利要求1所述的应用，所述蛋白质的降解是将蛋白质降解为多肽或氨基酸的催化反应。

3.含有SEQ ID NO:1所示序列基因的质粒在蛋白质降解中的应用。

4.含有SEQ ID NO:1所示序列基因的重组工程菌株在蛋白质降解中的应用。