CN103937821A - 一种腈水解酶基因及其原核表达和固定化技术 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种腈水解酶基因及其原核表达和固定化技术，属于化工酶的原核表达及固定化技术领域。本发明利用PCR技术，以热纤梭菌的基因组为模板克隆到腈水解酶基因，通过大肠杆菌表达系统对该酶进行原核表达，得到含有该腈水解酶基因的重组质粒pET-28a-nit，转化到大肠杆菌BL21获得重组菌BL21(pET-28a-nit)，诱导重组菌表达获得重组腈水解酶；该腈水解酶基因与连接有孢子外衣壳蛋白基因cotG的高拷贝穿梭质粒连接，构建成用于表面展示的重组质粒pHS-cotG-nit，该质粒转入枯草芽孢杆菌菌株DB403获得重组菌DB403(pHS-cotG-nit)，诱导重组菌产生的重组芽孢表面展示有该腈水解酶。本发明首次通过孢子表面展示技术对腈水解酶进行固定化，该方法不仅可以使酶的结构更稳定，而且利于酶在催化后的回收再利用，只需要离心就可以把展示有腈水解酶的孢子回收再利用。
Description
技术领域
本发明涉及一种腈水解酶基因及其原核表达和固定化技术，属于化工酶的原核表达及固定化技术领域。
背景技术
腈水解酶是一类可以把腈物质水解为相应的羧酸和氨的酶。腈物质(R-CN)是指含有有机基团-CN的有机物。
腈物质是一类重要的化合物，在化工生产中常常作为中间体被广泛应用。自然界中的许多高等植物和微生物体内含有腈物质，现在已经报道的腈物质超过2000种，其中大部分是人工合成的（徐建妙，郑裕国，沈寅初。腈水解酶的来源、结构、作用机制及其应用。微生物学通报，2005，32（5）：141-146）。常用的腈合成方法为，在水或者与水化学性质类似的溶液中，通过氰化钾和卤代烷发生亲和取代反应合成。在有机合成中，常常需要引入羧基或其衍生基团，由于腈基相对于这些基团更易引入分子中，常常先引入腈基，在进一步的转化成羧基或其衍生基团，因此腈物质是有机合成中一类重要的中间体。腈基转化为羧基的传统方法为化学法，但反应条件苛刻，常常需要高温、高压、强酸、强碱等条件，而且反应伴随着大量的盐类副产物，给后续的提纯带来了困难，且该种方法会造成环境污染，因此，该种方法在工业上的应用受到了大大的限制（Mylerová V, Martínková L. Synthetic applications of nitrile-converting enzymes[J]. Current Organic Chemistry, 2003, 7(13): 1279-1295）。而用腈水解酶催化腈物质转化为羧酸的生物方法，相对于传统的化学法不仅具有高效性、专一性、反应条件温和，环境代价小，最重要的是具有立体选择性、区域选择性、化学选择性这些化学方法无法比拟的优点（王宁, 许铟, 陆大军. 生物酶在腈纶及涤纶改性中的应用[J]. 合成纤维工业, 2003, 26(4): 35-37.；张金文, 熊春蓉, 李静雯, 等. 臭鼻杆菌腈水解酶基因 (bxn) 的克隆及其在原核生物中的表达[J]. 草业学报, 2006, 15(6): 87-92.）。
腈水解酶在降解腈类农药方面也具有广泛的应用。有一类普遍应用的除草剂的主要成分为溴苯腈、碘苯腈或氯苯经，它们被喷洒到植物的叶片后被迅速吸收，然后通过抑制植物的光合作用使植物枯萎坏死。但是这些腈类物质是有毒的，而且在自然界被降解的周期比较长，所以能不能找到一个有效的降解残留的除草剂的方法，成为其能不能被推广应用的关键。把腈水解酶基因导入经济植物内，培育具有降解腈类物质的抗除草剂作物成了一个理性的解决方法。Strlker等从土壤里筛选到一株可以把溴苯腈降解成3，5-二溴-4-羟基苯甲腈的细菌K.ozaenae，从该细菌基因组里获得了腈水解酶基因，该基因被导入棉花获得了抗溴苯腈的转基因棉花。
腈水解酶在腈纶类织物性状改良方面有广泛的应用。腈纶主要是由丙烯腈单体聚合而成的高分子化合物，由于其末端为疏水基团，造成手感不好且不易染色，通过腈水解酶处理腈纶，在其的外部引入亲水基团，同时不破坏其内部分子键从而不影响其机械强度。东华大学王平等，通过培养红球菌产生腈水解酶和腈水合酶，以酶液处理腈纶织物，能够部分的转化腈纶纤维中的-CN为-COOH和-CONH2，酶改性后，织物的回潮率、阳离子染料和酸性染料的可染性都得到了提高，静电半衰期减小。
最早发现腈水解酶的为哈佛大学的Thimann和Mahadevan，他们1964年从大麦叶片中分离出一种能把吲哚乙腈水解为吲哚乙酸的酶，并命名为吲哚乙腈水解酶。深入的研究发现该酶可以把另外26种腈物质转化成相应的羧酸，而且在水解各种腈物质时表现出不同的活性，因此，Thimann和Mahadevan命名该种酶为腈水解酶。
现在已经有很多腈水解酶被发现，但是总体来说酶活都不是太高，稳定性不是太高，而且很难回收再利用，这就大大的限制了其工业化的应用。所以从自然界筛选高活性的腈水解酶成为当务之急。经检索，国内外还没有关于热纤梭菌基因组上腈水解酶原核表达的报道。
枯草芽孢杆菌孢子表面展示技术为解决游离酶和营养细胞催化中存在的问题提供了一种新的解决思路。
枯草芽孢杆菌的孢子展示外源蛋白是最近十几年新兴起的一门技术，孢子为内生，不需要要穿过细胞膜，而且胞内有一套完整的分子伴侣体系，在芽孢形成的时候可以帮助连接在衣壳蛋白上的外源蛋白正确的折叠。而且孢子具有独特的抗逆性，它可以抵抗高温、强酸、强碱、辐射等不良环境的影响而长时间存活。已经报道的常用来作为孢子表面展示的载体蛋白有CotB，CotC 和CotG。
枯草芽孢杆菌孢子表面展示技术已经在很多方面被广泛应用。
该技术最先被应用来制作口服疫苗，Rachele isticato等最先以CotB为载体蛋白把破伤风毒素碳末端（TTFC）的459个氨基酸片段展示在枯草芽孢杆菌孢子表面。以CotB-TTFC重组芽孢喂食小鼠或鼻腔注射后，可在小鼠血清内检验到抗TTFC IgG。
最近几年把酶展示在孢子表面，从而对酶进行固定化成为研究的热点。对于一些化工酶，如何在催化反应后进行回收再利用成为一个难题，而把酶固定在孢子表面后，不仅可以增加酶的稳定性，还可以通过离心回收孢子而对酶进行回收再利用，国内迄今为止还没有关于从孢子表面展示技术固定化工酶的报道，倒是有几例通过该技术队酶进行固定化的报道。Kwon S J等以CotG为蛋白载体把具有活性的大肠杆菌β-半乳糖苷酶展示在孢子表面，大肠杆菌β-半乳糖苷酶为大分子量的酶，每个亚基的分子量为116 kDa，而且只有在四聚体的时候才具有活性。从而证明该孢子表面展示系统也适用于多亚基的大分子量酶。王楠等证明CotC也可以用来展示具有活性的酶，家蚕乙醇脱氢酶连接在CotC碳端，获得展示在孢子上的融合蛋白CotC-BmADH，且具有很高的活性。（Duc L H, Hong H A, Fairweather N, et al. Bacterial spores as vaccine vehicles[J]. Infection and immunity, 2003, 71(5): 2810-2818.；Kwon S J, Jung H C, Pan J G. ；Transgalactosylation in a water-solvent biphasic reaction system with β-galactosidase displayed on the surfaces of Bacillus subtilis spores[J]. Applied and environmental microbiology, 2007, 73(7): 2251-2256.；Wang N, Chang C, Yao Q, et al. Display of Bombyx mori alcohol dehydrogenases on the Bacillus subtilis spore surface to enhance enzymatic activity under adverse conditions[J]. PloS one, 2011, 6(6): e21454.）
为了克服热纤梭菌腈水解酶在游离状态下催化底物时活性不稳定、不易回收再利用等问题。把其展示在孢子的表面，对其进行固定化，再以孢子催化底物，反应结束后可以通过离心把孢子和反应物分离开，回收的孢子还可以再次利用。
发明内容
本发明的主要内容是提供一种克隆自热纤梭菌的腈水解酶基因、含有该基因的重组质粒、含有该重组质粒的可以表达腈水解酶的重组大肠杆菌、原核表达获得的重组酶在催化腈类物质中的应用、还提供一种通过把腈水解酶展示在枯草芽孢杆菌孢子表面从而对其进行固定化的方法。
本发明的具体的技术方案为：
(1)一种腈水解酶基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
该腈水解酶基因由如下方法得到：利用PCR技术，在以下引物对的作用下，引物Pnit-up1：（CGCGGATCCATGAGAGCTGCATTATACCA）下划线部分为限制性酶切位点Bam HI，下游引物Pnit-down2：(CCGCTCGAGTTAAAATAAAGTTTTATAAAGC)下划线部分为限制性酶切位点Xho I，以NCBI检索到的热纤梭菌基因组DNA为模板克隆到长约770 bp的腈水解酶基因片段。具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。其翻译生成的氨基酸序列跟十种已经被证明具有酶活的腈水解酶的氨基酸序列进行比对，发现具有很大的相似性，与来自Rhodococcus rhodochrous的腈水解酶的氨基酸相似度达到56%，与来自Nicotiana tabacum的腈水解酶的氨基酸相似度达到62%。在遗传学上进一步确定其为腈水解酶基因，而且具有活性的可能性很大。该腈水解酶基因核苷酸序列为：
atgagagctg cattatacca aatggagata gcatgggaag acaaggagaa aaactataaa
aagctggagg gtgtatcaga agaggtaaaa aagcatggcg cggacctgct tttattgccg
gaaatgagct ttacgggttt ttcaatgaac acaaagctta ctaaagaata caatgatgaa
agcaaagaca gggtaaagat gatttgcaaa agccatcaaa ttagtattgg cttcggctgg
gtaaaggctg cgggggaaaa agcggaaaac cattatacaa taattaacga aaaaggtgat
gaaatttcag attatgtaaa aattcaccca tttagcatgg caggtgagga aaagtatttt
gtgaaaggga acaagttatc gacttgtaag ttgcaaggga gggagattgc tacttttatt
tgctatgatt tacgctttcc agctgtcttt caggcccttg gagatgaaac cgaaattgtg
gttgttgctg caaactggcc taaaaaacga agagaacatt ggaagtgttt gcttcaggca
cgggcaattg aaaaccaggt ttacattttg ggcgtaaatt gtgtgggtaa tatgggcgga
cttgagtatt cgggggacag ctgtgtaata aatcccaatg gagaaataat tgaaataatt
gaagacaaag aaggagttat atatgcagac attgagcagg atgtaaagaa aattagagac
agctttccgc tgcgtttgga cagacgaacg gagctttata aaactttatt ttaa
该腈水解酶基因编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列:
MRAALYQMEIAWEDKEKNYKKLEGVSEEVKKHGADLLLLPEMSF TGFSMNTKLTKEYNDESKDRVKMICKSHQISIGFGWVKAAGEKAENHYTIINEKGDEISDYVKIHPFSMAGEEKYFVKGNKLSTCKLQGREIATFICYDLRFPAVFQALGDETEIVVVAANWPKKRREHWKCLLQARAIENQVYILGVNCVGNMGGLEYSGDSCVINPNGEIIEIIEDKEGVIYADIEQDVKKIRDSFPLRLDRRTELYKTLF
（2） 一种含有（1）所得腈水解酶基因的重组质粒pET-28a-nit的构建：
将克隆到长约770bp的腈水解酶基因片段通过琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化后用Bam HI和Xho I双酶切，同时用这两种酶对pET-28a(购自novagen)进行双酶切，两个酶切产物通过琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化后用T4 DNA 聚合酶在16 ℃条件下过夜连接，连接产物转化DH5ɑ感受态((购自GeneCopoeia))，通过含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板筛选转化子，得到重组菌DH5ɑ（pET-28a-nit），对重组菌扩大培养后提取得到重组质粒pET-28a-nit。
（3）含有（2）所得重组质粒pET-28a-nit的用于原核表达的重组菌及重组腈水解酶的获得：
用重组质粒pET-28a-nit转化用于原核表达的大肠杆菌BL21(购自GeneCopoeia)，获得重组菌BL21（pET-28a-nit），异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组菌产生重组腈水解酶。超声破碎诱导表达后的重组菌，离心分离沉淀和上清，通过SDS-PAGE检验上清和沉淀，发现过表达的重组腈水解酶全部在上清里，说明表达产物为可溶性蛋白。由于该可溶性蛋白的N端带有由六个组氨酸组成的标签，其可以与镍离子特异结合，通过Ni-NTA对上清内的腈水解酶进行纯化。
（4）纯化后的腈水解酶用于催化3-氰基吡啶生成烟酸：
该腈水解酶在pH 7.4、45 ℃时催化活性最高，其催化活力达到8.22单位酶活/mg重组酶。
（5）一种通过把腈水解酶展示在枯草芽孢杆菌孢子表面从而对其进行固定化的方法：
为了解决游离状态酶不稳定、不易回收再利用的问题，把腈水解酶展示在枯草芽孢杆菌孢子的表面，从而以孢子为全细胞催化3-氰基吡啶，催化结束后只需要离心就可以回收芽孢。回收后的芽孢还可以重复再利用。
把腈水解酶展示在孢子的表面的步骤包括：重组质粒转入DB403构建重组菌DB403（pHS-cotG-nit），诱导重组菌DB403（pHS-cotG-nit）形成孢子，以制备的孢子悬液作为转化反应的芽孢催化剂，利用所述表面展示有腈水解酶的重组芽孢催化3-氰基吡啶，测定重组孢子的腈水解酶活性。
A．用于孢子表面展示的重组质粒pHS-cotG-nit的构建：
用于孢子表面展示的重组质粒pHS-cotG-nit是基于pLJ质粒(Yang Ming-Ming, Zhang Wei-Wei,Zhang Xi-Feng, Cen Pei-Lin,. Construction and characterization of a novel maltoseinducible expression vector in Bacillus subtilis. Biotechnol Lett (2006) 28:1713–1718)构建而成，具体的方法是，通过PCR的方法，以pLJ为模板，用上游引物Phs-up:CCGGAATTCACTGAGCGTC AGACCCCGTA（下划线部分为Eco RI酶切位点）、下游引物：Phs-down:CCGGAATTCCTG CAGCCCGGGGGAT（下划线部分为Eco RI酶切位点），扩增获得一条不含有乳糖诱导调控序列Pglv-inframe的质粒骨架片段，且在扩增时在片段的两端同时引入Eco RI酶切位点，对片段进行酶切后会在两端产生两个相同的粘性末端，在T4 DNA连接酶的作用下进行自环化，该质粒即为pHS。再在pHS的多克隆位点Xma I和Spe I之间插入芽孢外衣壳蛋白基因cotG，在Spe I和Xba I之间插入腈水解酶基因，得到孢子表面展示载体pHS-cotG-nit。
其中cotG由1043个核苷酸组成，它含有完整的诱导调控序列，可以编码生成23.9 KDa的多肽；腈水解酶基因（nit）由774个核苷酸序列组成，可以编码257个氨基酸；在cotG和腈水解酶基因（nit）之间连接有一段由18个核苷酸组成的序列，其可翻译生成一段由六个氨基酸组成的接头蛋白（Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser），其有利于展示在孢子表面的腈水解酶基因折叠成具有活性的构象，接头蛋白的引入方法为，在扩增cotG时，在其下游引物的5'端按顺序加入编码接头蛋白的18个核苷酸。
B. 重组质粒转入DB403构建重组菌DB403（pHS-cotG-nit）：
把重组质粒pHS-cotG-nit转化进入来源于枯草芽孢杆菌168的、有四个蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌感受态的菌株DB403（王丽影,叶勤,张宏,张嗣良,. 基因工程枯草杆菌生产中性蛋白酶的研究.华东理工大学学报.1995-12,Vol.21,No.6），经过筛选获得重组枯草芽孢杆菌DB403（pHS-cotG-nit）。
C. 重组芽孢的形成：把重组菌在DSM培养基里耗竭法培养48小时，诱导芽孢形成。
（6）以表面展示有腈水解酶的孢子悬液作为孢子催化剂催化3-氰基吡啶
重组菌株接种在DSM培养基中，采用耗竭法培养36小时诱导宿主形成芽孢后，取培养物进行处理。
培养物离心后收集菌体，重悬于含2 mg/mL溶菌酶的GTE Buffer中，37 ℃水浴作用30 min以破坏营养细胞，离心回收孢子，再用pH 7.4的PBS缓冲液洗两遍，最后菌体重悬于pH 7.4的PBS缓冲液中，得到表面展示有腈水解酶的孢子催化剂。以重组孢子悬液催化3-氰基吡啶，在pH 7.4、45 ℃时其活性最高，其催化活力达到6.34单位酶活/mg重组酶。
相对于原核表达的腈水解酶，展示在孢子表面的腈水解酶更加稳定，其对pH和温度的耐受范围更广，而且通过离心可以对孢子进行回收，回收后的孢子还可以再次利用。
应用本发明所述的腈水解酶及展示有腈水解酶的孢子催化剂催化腈类物质降解为相应的酸，具有以下特点，具体为：
（1）本发明原核表达了一个新的腈水解酶，来自热纤梭菌的腈水解酶，其可以高效的降解3-氰基吡啶。
（2）本发明使用高拷贝穿梭载体构建了高效表面展示系统，相对与整合到基因组上的表面展示系统，效率大大提高。
（3）本发明首次通过孢子表面展示技术对腈水解酶进行固定化，该方法不仅可以使酶的结构更稳定，而且利于酶在催化后的回收再利用，只需要离心就可以把展示有腈水解酶的孢子回收再利用。
（4）本发明使用的芽孢外衣壳蛋白基因cotG上游含有本身完整的启动子序列，在重组菌在逆境环境条件下，cotG上游的启动子可以被RNA聚合酶识别从而起始表达，连接在cotG下游的腈水解酶基因随着cotG的表达而共表达，从而展示在孢子的表面。
（5）本发明所使用的宿主菌为具有缺失四个蛋白酶的DB403，可以有效降低重组蛋白在形成的过程中被自身蛋白酶降解，从而提高重组蛋白展示在孢子表面的成功率和重组蛋白的量。
（6）本发明所述的展示在孢子表面的融合蛋白CotG-NIT之间，有一个由六个氨基酸残基（Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser）组成的接头蛋白 ，其可以有效降低连接在孢子衣壳蛋白后面的外源蛋白受到的空间位阻，有助于其折叠成正确的具有活性的构象。
附图说明
图1为用于原核表达的重组质粒pET-28a-nit物理图谱。
图2为pET-28a和pET-28a-nit被Bam HI酶切后的琼脂糖凝胶电泳图。
图3为SDS-PAGE图，其中1泳道为BL21（pET-28a）、2泳道为BL21（pET-28a-nit）、3泳道为纯化后的重组腈水解酶。
图4为NI-NTA亲和层析纯化重组蛋白SDS-PAGE电泳图。泳道1至泳道8分别为：上样滤出液、10 mmol/L咪唑洗脱液、20 mmol/L咪唑洗脱液、50 mmol/L咪唑洗脱液、100 mmol/L咪唑洗脱液、200 mmol/L咪唑洗脱液、300 mmol/L咪唑洗脱液、400 mmol/L咪唑洗脱液。
图5为浓度为0.2 mg/mL溶于pH 7.4的PBS缓冲液中的重组腈水解酶在45 ℃反应1小时催化2 mg/mL的3-氰基吡啶后的高效液相色谱图。
图6为含有乳糖调控序列的高拷贝穿梭质粒pLJ的物理图谱。
图7为组成型表达高拷贝穿梭质粒pHS的物理图谱。
图8为重组质粒pHS-cotG的物理图谱。
图9为重组质粒pHS-cotG-nit的物理图谱。
图10为琼脂糖凝胶电泳图，其中泳道1为pLJ，泳道2为pHS，泳道3为pHS-cotG，泳道4为pHS-cotG-nit。
图11为SDS-PAGE图，泳道1为DB403孢子、泳道2为DB403（pHS-cotG-nit）孢子。
图12为westren blotting图，泳道1为DB403（pHS-cotG-nit）孢子、泳道2为DB403孢子。
图13为pH 7.4的条件下，重组腈水解酶在不同温度下的活性。
图14为45 ℃的条件下，重组腈水解酶在不同pH条件下的活性。
图15为分别用0.1%的胰蛋白酶和蛋白酶K处理芽孢，其酶活变化曲线图。
图16为重组芽孢催化四次后的相对酶活变化情况图。
具体实施方式
下面的实施实例是为了使本领域的技术人员理解本发明，但不以任何方式限定本发明。
下面结合具体实例对本发明作进一步的说明。
实施例1：原核表达质粒pET28a-nit的构建。
以提取基因组试剂盒提取热纤梭菌(购于日本JCM菌种保藏中心, http://www.jcm.riken.go.jp/ )基因组DNA，以该基因组为模板，在上游引物Pnit-up：CGCGGATCCATGAGAGCTGCATTATACCA（下划线为Bam HI限制性酶切位点）、下游引物Pnit-down：CCGCTCGAGTTAAAATAAAGTTTTATAAAGC（下划线为Xho I限制性酶切位点）的作用下进行PCR扩增腈水解酶基因。PCR体系各成份含量如下（总反应体积为50 μL）：5×prime STAR DNA Polymerase Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP mixture 4 μL，10 mmol/L Pnit-up 1 μL，10 mmol/L Pnit-down 1 μL，热纤梭菌基因组0.5 μL，prime STAR DNA Polymerase 0.5 μL，灭菌双蒸水33.5 μL。
采用long gene的PCR仪，PCR反应条件为：预变性3min，然后进入一个3温度梯度循环，94 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，共30个循环，最后再在72 ℃继续反应10 min。取5 μL PCR反应液通过1%琼脂糖凝胶电泳检验，看到在770 bp左右有一条明亮单一的条带，通过琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化。
用Bam HI和Xho I分别对纯化回收后的腈水解酶基因（nit）和原核表达质粒pET-28a进行酶切。腈水解酶基因（nit）酶切体系为（总反应体积为50 μL）：10×FastDigest Buffer 5 μL，Bam HI 5 μL，Xho I5 μL，nit 20 μL，灭菌双蒸水15 μL。pET-28a酶切体系为（总反应体积为50 μL）：10×FastDigest Buffer 5 μL，Bam HI 5 μL，Xho I5μL，pET-28a 10 μL，灭菌双蒸水25 μL。
酶切反应条件为37℃水浴1小时。通过琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化。通过1%琼脂糖凝胶电泳检验酶切后的腈水解酶（nit）和pET-28a的浓度。
在T4 DNA酶作用下把酶切后的腈水解酶（nit）和pET-28a连接起来。连接体系为：10×DNA ligase Buffer 2 μL，DNA ligase 1 μL，nit 13 μL，pET-28a 4 μL。反应条件为16 ℃过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态，通过含50 mg/L 卡那霉素的LB平板筛选转化子。随机挑取克隆至LB液体培养基中扩增后提取质粒，命名该重组质粒为pET-28a-nit，对质粒酶切鉴定。鉴定结果见图2。并送重组质粒测序。
实施例2：重组腈水解酶的表达及纯化。
将重组质粒pET-28a-nit转化至大肠杆菌BL21中，构建成用于原核表达的重组大肠杆菌BL21（pET-28a-nit）。挑取重组大肠杆菌BL21（pET-28a-nit）单菌落到含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37 ℃、220 rpm培养12小时，再取1 mL加到100 mL LB液体培养基中，培养至菌体浓度OD600为0.6左右，向LB液体培养基中中加入IPTG至终浓度为0.1 mmol/L，37 ℃、140 rpm培养6小时，4 ℃、8000 rpm离心10 min回收菌体。
回收的菌体PBS洗两次后，没6 g菌体沉淀用20 ml PBS缓冲液悬浮，冰浴中超声破碎细胞，超声条件为：破碎10 s，间隔10 s，反复破碎30次。4 ℃ 、8000 rpm离心30 min将上清和沉淀分开。取上清通过SDS-PAGE鉴定（图3）。
由于重组腈水解酶的上游含有由6个组氨酸组成的标签，其可与镍吸附，通过镍柱可以对重组腈水解酶进行纯化。纯化过程中的滤出液通过SDS-PAGE鉴定，在洗脱液咪唑浓度为200 mmol/L时重组蛋白从镍柱上洗脱下来（图4）。
实施例3：重组腈水解酶的活力。
把实施方案2中获得的溶于200 mmol/L咪唑的重组腈水解酶蛋白加入滤过最大分子量为10 KDa的超滤管中，4 ℃、4000 rpm离心到超滤管中溶液为原体积的十分之一时加入pH 7.4的PBS，至与原体积相等。重复之前的步骤三次，最后达到除去溶液中咪唑，使重组腈水解酶溶于PBS中的目的，通过超滤管对重组腈水解酶进行浓缩，使其浓素为2 mg/mL。
取100 μL浓度为2 mg/mL的腈水解酶加入0.8 mL pH 7.4的PBS中，再向上述体系中加入0.1 mL浓素为20 mg/mL的3-氰基吡啶，使重组腈水解酶终浓素为0.2 mg/mL，底物终浓度为2 mg/mL。设置七个温度梯度，分别是20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃，每个温度设置三组重复实验，在恒温摇床里培养1个小时。
向反应液里分别加入400 μL 乙酸乙酯，充分颠倒摇晃，使水相和有机相充分接触，通过离心使水相和有机相充分分开，离心条件为10000 rpm、10 min，使水相和有机相充分分开，小心取200 μL上层乙酸乙酯转移到另一离心管中，在超净工作台使乙酸乙酯挥发完后，再向各个离心管中分别加100 μL水，50 ℃水浴充分溶解后经过0.22 μm滤膜过滤，滤过液进行高效液相色谱（HPLC）分析。在 45℃时腈水解酶催化3-氰基吡啶的能力最强，可以把10.0189%的3-氰基吡啶转化成烟酸。其高效液相色谱图如图5所示，其中烟酸在2.490 min出峰，3-氰基吡啶在9.407 min出峰。以不同温度时重组腈水解酶催化3-氰基吡啶的活力绘制成曲线（图13）。
再设置6个pH梯度，分别为pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH 10，反应体系的配制如前所述，反应温度为45 ℃，反应结束以后以高效液相色谱检测生成烟酸的量，当pH在7和8之间时，重组酶表现出较高的活性（图14）。
结果表明：当重组腈水解酶在pH 7.4、45 ℃时催化活性最高，反应1个小时后可以把大约10%的3-氰基吡啶分解成烟酸。其高效液相图（图5）。
其上所述的高效液相色谱（HPLC）的所用的柱子为Agilent XDB-C18柱，流动相为水和甲醇，其体积比为80:20，流速为1 mL/min，检测波长为230 nm。
实施例4：重组质粒pHS的构建
pHS是基于诱导型穿梭质粒pLJ去除乳糖诱导调控序列Pglv-inframe构建而成的，pLJ质粒是高拷贝大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒，其既含有在大肠杆菌里复制的调控序列Rep，又含有在枯草芽孢杆菌复制的调控序列CoEI，还含有乳糖诱导调控序列Pglv-inframe，含有完整表达调控序列的抗氯霉素基因，以及含有六个酶切位点的多克隆位点，六个酶切位点分别是Eco RI，Xma I，Sma I，Bam HI，Spe I，Xba I。
具体的策略为，以pLJ为模板，用上游引物Phs-up:CCGGAATTCACTGAGCGTC AGACCCCGTA（下划线部分为Eco RI酶切位点）、下游引物：Phs-down:CCGGAATTCCTG CAGCCCGGGGGAT（下划线部分为Eco RI酶切位点）扩增获得一个不含有乳糖诱导调控序列Pglv-inframe的质粒骨架。
PCR体系各成份含量如下（总反应体积为50 μL）：5×prime STAR DNA Polymerase Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP mixture 4 μL，10 mmol/L Phs-up 1 μL，10 mmol/L Phs-down 1 μL，pLJ 0.5 μL，prime STAR DNA Polymerase 0.5 μL，灭菌双蒸水33.5 μL。
PCR反应条件为：预变性1 min，然后进入一个3温度梯度循环，94 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 4 min，共30个循环，最后再在72 ℃继续反应10 min。取5 μLPCR反应液通过1%琼脂糖凝胶电泳检验，看到在3400 bp左右有一条明亮单一的条带，通过琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化。
用Eco RI对纯化后的酶切，酶切反应体系为（总反应体积为50μL）：10×FastDigest Buffer 5 μL，Eco RI 5 μL，线型pHS 20 μL，灭菌双蒸水15 μL。酶切反应条件为37 ℃水浴1小时。通过琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化。
由于线型pHS两端均含有Eco RI酶切位点，酶切后会产生两个可以互补配对的粘性末端，通过T4 DNA 连接酶可以把线型pHS连接成环状质粒。连接体系为：10×DNA ligase Buffer 2 μL，DNA ligase 1 μL，线型pHS 17 μL。反应条件为16 ℃过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态，通过含7.5 μg/mL氯霉素的LB平板筛选转化子。挑取单菌落至含7.5 μg/mL氯霉素LB液体培养基中，过夜培养，用质粒提取试剂盒提取质粒。该质粒命名为pHS。送该质粒测序。
实施例5. 重组质粒pHS-cotG-nit的构建
1.芽孢外衣壳蛋白CotG基因（cotG）的克隆
以基因组提取试剂盒提取枯草芽孢杆菌168的基因组DNA，以该基因组为模板，在上游引物：PcotG-up:TAGCCCGGGAGTGTCCCTAGCTCCGAG（下划线部分为Xma I酶切位点）、下游引物PcotG-down:CGGACTAGT TGAACCCCCACCTCCTTTGTATTTCTTT TTGA C TA（下划线部分为Spe I酶切位点，斜体部分为一段编码接头蛋白的基因，该接头蛋白由六个氨基酸残基Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser构成，其有助连接在孢子衣壳蛋白CotG下游的蛋白折叠成正确的构象）的作用下扩增cotG，
PCR体系各成份含量如下（总反应体积为50 μL）：5×prime STAR DNA Polymerase Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTP mixture 4 μL，10 mmol/L PcotG-up 1 μL，10 mmol/L PcotG-down 1 μL，枯草芽孢杆菌168的基因组DNA 1 μL，prime STAR DNA Polymerase 0.5 μL，灭菌双蒸水33 μL。
PCR反应条件为：预变性3 min，然后进入一个3温度梯度循环，94 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，共30个循环，最后再在72 ℃继续反应10 min。取5 μLPCR反应液通过1%琼脂糖凝胶电泳检验，看到在1100 bp左右有一条明亮单一的条带，通过琼脂糖凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化.
2.用于表达展示的穿梭质粒pHS-cotG的构建。
用Xma I和Spe I分别对纯化回收后的cotG和穿梭质粒pHS进行酶切。cotG的酶切体系为（总反应体积为50 μL）：10×FastDigest Buffer 5μL，Xma I 5μL，Spe I 5μL，cotG 20 μL，灭菌双蒸水15 μL。pHS酶切体系为（总反应体积为50 μL）：10×FastDigest Buffer 5 μL，Xma I 5 μL，Spe I 5μL，pHS 10 μL，灭菌双蒸水25 μL。
酶切反应条件为37 ℃水浴1小时。通过琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化。通过1%琼脂糖凝胶电泳检验酶切后的cotG和穿梭质粒pHS的浓度。
在T4 DNA酶作用下把酶切后的cotG和穿梭质粒pHS连接起来。连接体系为：10×DNA ligase Buffer 2 μL，DNA ligase 1 μL，cotG 13 μL，pHS 4 μL。反应条件为16 ℃过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态。通过含7.5 μg/mL氯霉素的LB平板筛选转化子。挑取单菌落至含7.5 μg/mL 氯霉素LB液体培养基中，过夜培养，用质粒提取试剂盒提取质粒。该质粒命名为pHS-cotG。送该质粒测序。
3.用于表达展示腈水解酶的穿梭表达质粒pHS-cotG-nit的构建
用Spe I和Xba I分别对纯化回收后的nit和穿梭质粒pHS进行酶切。nit的酶切体系为（总反应体积为50 μL）：10×FastDigest Buffer 5 μL，Spe I 5 μL，Xba I 5 μL，nit 20 μL，灭菌双蒸水15 μL。pHS酶切体系为（总反应体积为50 μL）：10×FastDigest Buffer 5 μL，Spe I5 μL，Xba I 5 μL，pHS 10 μL，灭菌双蒸水25 μL。
酶切反应条件为37 ℃水浴1小时。通过琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切产物进行纯化。通过1%琼脂糖凝胶电泳检验酶切后的nit 和穿梭质粒pHS-cotG的浓度。
在T4 DNA酶作用下把酶切后的nit 和穿梭质粒pHS-cotG连接起来。连接体系为：10×DNA ligase Buffer 2 μL，DNA ligase 1 μL，nit 13 μL，pHS-cotG 4 μL。反应条件为16 ℃过夜。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态。通过含7.5 μg/mL 氯霉素的LB平板筛选转化子。挑取单菌落至含7.5 μg/mL氯霉素LB液体培养基中，过夜培养，用质粒提取试剂盒提取质粒。该质粒命名为pHS-cotG-nit。送该质粒测序。
实施例6：重组枯草芽孢杆菌DB403（pHS-cotG-nit）的构建
以重组质粒pHS-cotG-nit转化枯草芽孢杆菌DB403感受态。转化方法为：从-80℃冰箱取出感受态，45℃水浴锅融化，向500 μL感受态中加入5 μL pHS-cotG-nit，然后把装有感受态的离心管放在恒温摇床里培养1小时，培养条件为120 rpm、37℃。然后把菌体涂在含有7.5 μg/mL 氯霉素的LB平板筛选转化子。以菌落PCR检验转化子的正确性。以上述转化子为模板，以Pnit-up2和Pnit-down2为引物扩增融合基因nit，在770bp左右可以获得一条明亮的条带，证明pHS-cotG-nit 转化到到DB403中，说明重组菌构建成功。
上述枯草芽孢杆菌感受态的制备方法为：接种DB403单菌落在GMI培养基中30 ℃慢摇过夜培养，次日取2 mL在18 mLGMI中快摇培养3.5小时，然后取10 mL到90 mLGM2培养基中37℃慢摇90 min后离心，取10 mL上清悬浮沉淀即为感受态细胞。
上述制作枯草芽孢杆菌感受态所用的试剂配方为。GMI培养基：1×最低盐溶液95 mL，50%葡萄糖1 mL，5%水解酪蛋白0.4 mL，10%酵母汁1 mL，2 mg/mL L-trp 2.5 mL（50 μg/mL）。GMⅡ培养基：1×最低盐溶液97.5 mL，50%葡萄糖1 mL，5%水解酪蛋白0.08 mL，10%酵母汁0.04 mL，0.5 mol/L MgCl2 0.5 mL(2.5 mmol/L)，0.1 mol/L CaCl2 0.5 mL(0.5 mmol/L)，2 mg/mL L-trp 0.5 mL（5 μg/mL）。10×最低盐溶液：K2HPO4 14 g（K2HPO4·3H2O 18.34g），KH2PO4 6 g，(NH4)2SO4 2 g，柠檬酸钠（Na3C6H5O7·2 H2O）1 g，MgSO4· 7 H2O 0.2 g，在蒸馏水中依次溶解，加水定容至100 mL。
实施例7：重组孢子的获得
将DB403（pHS-cotG-nit）接种在含有7.5 μg/mL氯霉素LB平板上，37℃培养12小时。挑取单菌落至含有7.5 μg/mL氯霉素LB液体培养基中，37 ℃、220 rpm培养12小时后取1 mL菌液接种到含有7.5 μg/mL氯霉素的DSM培养基中，37 ℃、220 rpm培养48小时诱导形成芽孢。DSM培养基配方为：0.8% nutrient broth(营养肉汤Difo)，0.1% KCl，0.025% MgS04·7 H20，1.0 mmol/L Ca(N03)2· 4H20，10 μmol/L MnCl2，1.0 μmol/L FeS04 。
上述菌液12000 rpm离心10 min回收菌体，重悬于相同体积的GTE Buffer中，37 ℃水浴处理30 min破坏营养细胞，12000 rpm，10 min沉淀芽孢，用pH 7.4的PBS洗3次，最后把孢子重悬于pH 7.4的PBS中，制成孢子悬液。
取上述孢子悬液离心后后重悬于相同体积的SDS-DTT缓冲液中，65 ℃水浴处理10 min后做SDS-PAGE分析，DB403(pHS-cotG-nit)孢子蛋白电泳条带相对于对照组DB403孢子蛋白电泳条带，在53.2 KDa附近可以看到一条特异性条带，初步认为该特异条带为重组蛋白CotG-NIT，结果如图11所示。
纯化后的腈水解酶溶于生理盐水，与佐剂乳化后免疫新西兰大白兔，使其产生免疫反应，产生抗腈水解酶的抗体，第一次重组蛋白与弗氏完全佐剂乳化，第二次和第三次重组蛋白与弗氏不完全佐剂乳化。六周以后杀兔获得兔血清。将制得的抗血清-80 ℃保存。进一步通过western blotting检验该特异条带是否为重组蛋白CotG-NIT，用之前以原核表达的重组腈水解酶免疫新西兰大白兔制备的抗血清为一抗，以辣根氧化酶标记的羊抗兔lgG为二抗，以天根HRP-DAB底物显色试剂盒检验。在53.2 KDa附近处可以杂交到一条特异性的条带，进一步的说明该条带为重组蛋白为CotG-NIT，结果如图12所示，。
其中上述中的GTE Buffer的配方为：50 mmol/L葡萄糖，20 mmol/L pH 7.5 Tris-HCI，10 mmol/L EDTA，2 mg/mL溶菌酶。
其中上述中的SDS-DTT缓冲液配方为：0.1 mmol/L pH 7.4 PBS，50 mmol/L DTT，1.5％ SDS。
为了比较原核表达的游离腈水解酶和展示在孢子表面的重组腈水解酶的活力大小，需要对重组腈水解酶的质量进行定量，通过Bio-Rad DC Protein Assay kit测定蛋白的总质量，用Alphalmager图像分析软件SPOT DENSE功能分析每个蛋白条带的IDV值（即目的蛋白占全菌总蛋白的百分含量），以定量的BSA条带为对照计算获得目的蛋白的质量。
实验例8：重组孢子酶活
按实施例7中的方法制备孢子悬液，以重组孢子催化3-氰基吡啶，具体的反应体系为：取100 μL溶于pH7.4 PBS浓素为20 mg/mL的3-氰基吡啶，加入900 μL的孢子悬液中，分别放在30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55℃恒温摇床反应1个小时，离心回收芽孢，向上清中加入1mL乙酸乙酯，充分颠倒摇晃，使水相和有机相充分接触，通过离心使水相和有机相充分分开，离心条件为10000 rpm、10 min，使水相和有机相充分分开，小心取200 μL上层乙酸乙酯转移到另一离心管中，在超净工作台使乙酸乙酯挥发完后，再向各个离心管中分别加100 μL水，50 ℃水浴充分溶解后经过0.22 μm滤膜过滤，滤过液进行高效液相色谱（HPLC）分析。在45 ℃时重组孢子的酶活最强，催化3-氰基吡啶的能力达到6.34酶活单位/mg重组蛋白（图13）。
再在45 ℃的条件下设置6个pH梯度，分别为pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9、pH 10，反应体系的配制如前所述，其中在pH 7.0时原核表达的重组腈水解酶催化3-氰基吡啶生成烟酸的能力最强，蓝色点所示为原核表达的腈水解酶的活性，紫色点所示为重组孢子上的腈水解酶的活性。相对于原核表达的重组腈水解酶，展示在孢子表面的腈水解酶表现出更高的pH耐受度（图14）。
将之前所述的芽孢悬液离心后回收芽孢，把芽孢加入浓素为0.1%，溶于pH 8.0的PBS的胰蛋白酶中，37 ℃处理1个小时，然后再测其催化3-氰基吡啶的能力，发现其不再具有活力。取另一批芽孢加入浓素为0.1%，溶于pH 7.5的Tirs-HCl的蛋白酶K中，37 ℃处理1个小时，然后再测其催化3-氰基吡啶的能力，发现其也不再具有活力。说明蛋白酶可以把孢子表面的腈水解酶降解，从而使孢子不再具有腈水解酶活性，从侧面验证了重组孢子的活性（图15）。
将反应后的重组芽孢离心回收再次催化底物，第四次催化时仍然能保持75.3%的活性（图16）。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏大学
<120> 一种腈水解酶基因及其原核表达和固定化技术
<130> 一种腈水解酶基因及其原核表达和固定化技术
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 774
<212> DNA
<213> 热纤梭菌(Clostridium thermoceUum)
<400> 1
atgagagctg cattatacca aatggagata gcatgggaag acaaggagaa aaactataaa 60
aagctggagg gtgtatcaga agaggtaaaa aagcatggcg cggacctgct tttattgccg 120
gaaatgagct ttacgggttt ttcaatgaac acaaagctta ctaaagaata caatgatgaa 180
agcaaagaca gggtaaagat gatttgcaaa agccatcaaa ttagtattgg cttcggctgg 240
gtaaaggctg cgggggaaaa agcggaaaac cattatacaa taattaacga aaaaggtgat 300
gaaatttcag attatgtaaa aattcaccca tttagcatgg caggtgagga aaagtatttt 360
gtgaaaggga acaagttatc gacttgtaag ttgcaaggga gggagattgc tacttttatt 420
tgctatgatt tacgctttcc agctgtcttt caggcccttg gagatgaaac cgaaattgtg 480
gttgttgctg caaactggcc taaaaaacga agagaacatt ggaagtgttt gcttcaggca 540
cgggcaattg aaaaccaggt ttacattttg ggcgtaaatt gtgtgggtaa tatgggcgga 600
cttgagtatt cgggggacag ctgtgtaata aatcccaatg gagaaataat tgaaataatt 660
gaagacaaag aaggagttat atatgcagac attgagcagg atgtaaagaa aattagagac 720
agctttccgc tgcgtttgga cagacgaacg gagctttata aaactttatt ttaa 774
<210> 2
<211> 257
<212> PRT
<213> 热纤梭菌(Clostridium thermoceUum)
<400> 2
Met Arg Ala Ala Leu Tyr Gln Met Glu Ile Ala Trp Glu Asp Lys Glu
1 5 10 15
Lys Asn Tyr Lys Lys Leu Glu Gly Val Ser Glu Glu Val Lys Lys His
20 25 30
Gly Ala Asp Leu Leu Leu Leu Pro Glu Met Ser Phe Thr Gly Phe Ser
35 40 45
Met Asn Thr Lys Leu Thr Lys Glu Tyr Asn Asp Glu Ser Lys Asp Arg
50 55 60
Val Lys Met Ile Cys Lys Ser His Gln Ile Ser Ile Gly Phe Gly Trp
65 70 75 80
Val Lys Ala Ala Gly Glu Lys Ala Glu Asn His Tyr Thr Ile Ile Asn
85 90 95
Glu Lys Gly Asp Glu Ile Ser Asp Tyr Val Lys Ile His Pro Phe Ser
100 105 110
Met Ala Gly Glu Glu Lys Tyr Phe Val Lys Gly Asn Lys Leu Ser Thr
115 120 125
Cys Lys Leu Gln Gly Arg Glu Ile Ala Thr Phe Ile Cys Tyr Asp Leu
130 135 140
Arg Phe Pro Ala Val Phe Gln Ala Leu Gly Asp Glu Thr Glu Ile Val
145 150 155 160
Val Val Ala Ala Asn Trp Pro Lys Lys Arg Arg Glu His Trp Lys Cys
165 170 175
Leu Leu Gln Ala Arg Ala Ile Glu Asn Gln Val Tyr Ile Leu Gly Val
180 185 190
Asn Cys Val Gly Asn Met Gly Gly Leu Glu Tyr Ser Gly Asp Ser Cys
195 200 205
Val Ile Asn Pro Asn Gly Glu Ile Ile Glu Ile Ile Glu Asp Lys Glu
210 215 220
Gly Val Ile Tyr Ala Asp Ile Glu Gln Asp Val Lys Lys Ile Arg Asp
225 230 235 240
Ser Phe Pro Leu Arg Leu Asp Arg Arg Thr Glu Leu Tyr Lys Thr Leu
245 250 255
Phe
Claims (10)
1.一种腈水解酶基因，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的腈水解酶基因，其特征在于，所述腈水解酶基因编码SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的腈水解酶基因，其特征在于，所述腈水解酶基因源自热纤梭菌(Clostridium thermoceUum)。
4.一种含有权利要求1所述腈水解酶基因的重组质粒pET-28a-nit。
5.一种含有权利要求4所述重组质粒pET-28a-nit转化得到的重组菌BL21（pET-28a-nit）。
6.根据权利要求1所述的腈水解酶在制备重组腈水解酶中的应用。
7.根据权利要求6所述的腈水解酶基因在制备重组腈水解酶中的应用，其特征在于，所述的应用为：构建含有所述腈水解酶基因的重组质粒，将所述重组质粒转化至大肠杆菌中，获得重组菌进行诱导培养，超声破碎诱导表达后的重组菌，离心分离沉淀和上清，通过SDS-PAGE检验上清和沉淀，发现过表达的重组腈水解酶全部在上清里，通过Ni-NTA对上清内的腈水解酶进行纯化。
8.根据权利要求7所述的腈水解酶基因在制备重组腈水解酶中的应用，其特征在于，纯化后的腈水解酶用于催化3-氰基吡啶生成烟酸，该腈水解酶在pH 7.4、45 ℃时催化活性最高。
9.一种通过把腈水解酶展示在枯草芽孢杆菌孢子表面从而对其进行固定化的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
A. 用于孢子表面展示的重组质粒pHS-cotG-nit的构建：
以pLJ为模板进行PCR扩增获得一条不含有乳糖诱导调控序列Pglv-inframe的质粒骨架片段，且在扩增时在片段的两端同时引入Eco RI酶切位点，对片段进行酶切后会在两端产生两个相同的粘性末端，在T4 DNA连接酶的作用下进行自环化，该质粒即为pHS；再在pHS的多克隆位点Xma I和Spe I之间插入芽孢外衣壳蛋白cotG基因，在Spe I和Xba I之间插入腈水解酶基因，得到孢子表面展示载体pHS-cotG-nit；
B. 重组质粒转入DB403构建重组菌DB403（pHS-cotG-nit）：
把重组质粒pHS-cotG-nit转化进入菌株DB403，经过筛选获得重组枯草芽孢杆菌DB403（pHS-cotG-nit）；
C. 重组芽孢的形成：把重组菌在DSM培养基里耗竭法培养48小时，诱导芽孢形成。
10.根据权利要求9所述的一种通过把腈水解酶展示在枯草芽孢杆菌孢子表面从而对其进行固定化的方法，其特征在于，所得表面展示有腈水解酶的孢子悬液作为孢子催化剂催化3-氰基吡啶，该重组孢子悬液在pH 7.4、45 ℃时其活性最高。
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