CN108118042B

CN108118042B - 2-甲基丁酸侧链水解酶和产莫纳可林j的曲霉菌株及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN108118042B
Application number: CN201611079430.2A
Authority: CN
Inventors: 吕雪峰; 黄雪年; 杨勇; 郑玲辉; 黄隽; 滕云; 应玲萍
Original assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd; Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co Ltd; Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2016-11-30
Filing date: 2016-11-30
Publication date: 2021-01-15
Anticipated expiration: 2036-11-30
Also published as: CN108118042A

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种2‑甲基丁酸侧链水解酶和能够合成该水解酶从而生产莫纳可林J的菌株。本发明提供的2‑甲基丁酸侧链水解酶能够有效水解洛伐他汀为莫纳可林J，酶活性高，从而简化了辛伐他汀的生产工艺，降低成本，提高生产效率，减少环境污染。

Description

2-甲基丁酸侧链水解酶和产莫纳可林J的曲霉菌株及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种2-甲基丁酸侧链水解酶及其应用；更进一步地，涉及莫纳可林J的生产。

背景技术

心脑血管疾病严重威胁人类健康，其发病率和死亡率在许多国家和地区排名第一。高脂血症(高胆固醇血症)是心脑血管疾病的一个重要诱因，因此预防高脂血症、调节血脂和降低血脂成为防治心脑血管疾病的关键。基于上述原因，降胆固醇药物具有很大的市场前景，多年来一直位于全球畅销药物的前列。

辛伐他汀(Simvastatin)即舒降之(Zocor)，是Merck公司研发的一种重要的降血脂药物，能有效地抑制胆固醇的体内合成，是治疗高脂血症的首选药物之一。随着2006年专利到期，辛伐他汀的市场竞争日益激烈，其工艺技术研究和生产成本成为产品竞争的重要因素。辛伐他汀并非天然化合物，而是以土曲霉的发酵产物洛伐他汀(lovastatin)为原料通过化学合成的。辛伐他汀和洛伐他汀的区别仅在于侧链多一个甲基，辛伐他汀为2,2-二甲基丁酸侧链，洛伐他汀为2-甲基丁酸侧链。在辛伐他汀的合成过程中，需要先去除洛伐他汀C8位的2-甲基丁酸侧链，获得莫纳可林J(Monacolin J)，然后再通过后续工艺将2,2-二甲基丁酸侧链添加到莫纳可林J的C8位上，从而获得辛伐他汀。由此可见，莫纳可林J是辛伐他汀合成的重要前体物。目前，辛伐他汀的合成路线中，采用化学方法水解洛伐他汀制备莫纳可林J，整个制备过程中会使用到大量的酸、碱，以及二氯甲烷、甲苯和乙醚等有机试剂，工艺复杂、耗时长、收率低、污染压力大。基因工程改造是一种有效的遗传育种技术。如果能够通过基因工程改造方法对产洛伐他汀土曲霉进行遗传改造，使之能够直接发酵生产莫纳可林J，那么就可以简化辛伐他汀的合成工艺，降低生产成本，同时还可以减少环境污染，从而提高产品的市场竞争力。

因此，如果能找到一种简单高效、环境友好的莫纳可林J生产方法，不仅会简化辛伐他汀的合成工艺，降低生产成本，还可以减少环境污染，从而提高产品的市场竞争力。同时，酶法是一种绿色高效的生物催化方法，自然界中也存在一些微生物能水解掉洛伐他汀的侧链，因此也可以基于这类酶开发出莫纳可林J的酶法生产工艺。在制备辛伐他汀的专利申请(WO2005040107A2)中公布了一种能水解洛伐他汀侧链的β-内酯酶及用其制备莫纳可林J的方法。但是，这种水解酶的活性偏低。此外，由于洛伐他汀和辛伐他汀的结构相似，在工艺上很难分离，使得洛伐他汀残留成为辛伐他汀生产的一个棘手问题。

发明内容

本发明通过提供一种能够产莫纳可林J的曲霉菌株而解决现有技术中存在的技术问题。

在一个方面，本发明提供一种生物材料，为

(1)一种蛋白质，为2-甲基丁酸侧链水解酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

(2)一种核酸分子，其编码氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质；优选地，所述核酸分子的序列如SEQ ID NO:2所示；或

(3)包含(2)所述的核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组微生物。

在第二个方面，本发明提供氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质在水解含有2-甲基丁酸侧链的他汀类物质中的应用；优选地，所述含有2-甲基丁酸侧链的他汀类物质为洛伐他汀、美伐他汀或普伐他汀；进一步优选地，所述洛伐他汀、美伐他汀或普伐他汀为酸式、内酯式或盐式。

在第三个方面，本发明提供一株产莫纳可林J的曲霉菌株，其能够生产氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质。

优选地，所述曲霉菌株包含能表达氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质的表达盒；进一步优选地，所述曲霉菌株包含核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的核酸分子。

在第四个方面，本发明提供一种构建所述产莫纳可林J的曲霉菌株的方法，包括将出发曲霉菌株原生质体与包含核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的核酸分子的DNA片段共培养，经筛选后得到。优选地，所述出发曲霉菌株为曲霉菌(Aspergillus sp.)HZ01，其保藏编号为CGMCC NO.12970。

本发明中使用的出发曲霉菌(Aspergillus sp.)HZ01于2016年10月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC NO.12970，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

曲霉菌株原生质体的制备、原生质体与DNA片段的共培养、阳性曲霉菌的筛选等都是本领域的常规技术。

在第五个方面，本发明提供上述的核酸分子或包含所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组微生物在制备产莫纳可林J的曲霉菌株中的应用。

在第六个方面，本发明提供一种制备莫纳可林J的方法，包括发酵培养本发明提供的曲霉菌株，或者用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的本发明的蛋白质水解洛伐他汀。

在第七个方面，本发明提供上述的生物材料或曲霉菌株或其菌悬液或其发酵液或其代谢产物在制备莫纳可林J中的应用。

在第八个方面，本发明提供上述的生物材料或曲霉菌株或其菌悬液或其发酵液或其代谢产物在生产降血脂药物中的应用，其中所述降血脂药物是辛伐他汀。

本发明提供的产莫纳可林J的曲霉菌株能够产生2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST，在菌体内有效水解洛伐他汀为莫纳可林J，酶活性高，水解效率高，从而简化了辛伐他汀的生产工艺，降低成本，提高生产效率，减少环境污染。

附图说明

图1为SDS-PAGE分析纯化后的2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST和EcBla4蛋白；其中，M：蛋白质标记；1：纯化后的PcEST蛋白；2：纯化后的EcBla4蛋白。

图2为各种他汀类物质及不同存在形式；其中，A：洛伐他汀、莫纳可林J及辛伐他汀的结构及转化关系；B：美伐他汀及其衍生物普伐他汀的结构及转化关系；C：洛伐他汀的三种不同存在形式。

图3为2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST水解三种形式洛伐他汀的HPLC分析结果；其中，A：酸式洛伐他汀；B：内酯式洛伐他汀；C：洛伐他汀钠盐。

图4为2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST水解两种形式美伐他汀的HPLC分析结果；其中，A：酸式美伐他汀；B：内酯式美伐他汀。

图5为2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST水解两种形式普伐他汀的HPLC分析结果；其中，A：酸式普伐他汀；B：普伐他汀钠盐。

图6为2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST水解两种形式辛伐他汀的HPLC分析结果；A：酸式辛伐他汀；B：内酯式辛伐他汀。

图7为2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST水解莫纳可林J的HPLC分析结果。

图8为两种2-甲基丁酸侧链水解酶水解酸式洛伐他汀的HPLC分析结果。

图9为2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST水解辛伐他汀样品中的洛伐他汀的HPLC分析结果。

图10为pG3H的质粒图谱示意图。

图11为过表达PcEST的曲霉转化子的基因组PCR验证结果；其中，2#、3#、4#、5#为共转化方法构建的转化子，52#、54#、58#、60#、b1#为筛选标记串联方法构建的转化子，wt为对照菌株HZ01菌株。

图12为工程菌株细胞提取液中的PcEST活性分析结果；其中，A：对照菌株HZ01菌株；B：4#工程菌株；C：5#工程菌株；D：52#工程菌株；E：58#工程菌株。

图13为工程菌株发酵第四天样品中洛伐他汀和莫纳可林J含量的HPLC分析结果；其中A：4株对照菌株HZ01菌株的分析结果；B：5株基因工程菌株的分析结果。

图14为58#工程菌株和出发菌株HZ01菌株的发酵分析结果；其中，A：两株菌株的洛伐他汀和莫纳可林J产量比较；B：58#工程菌株中莫纳可林J及洛伐他汀残留量的分析；58-MJ：58#工程菌株的莫纳可林J含量；58-LA：58#工程菌株的洛伐他汀含量；HZ-MJ：HZ01菌株的莫纳可林J含量；HZ-LA：HZ01菌株的洛伐他汀含量。

图15为HZ01菌株和58#菌株第8天样品的HPLC分析；其中，A：58#工程菌株；B：出发菌株HZ01菌株。

图16洛伐他汀或莫纳可林J在各时间点的胞内所占比值；其中，58-MJ：58#工程菌株的莫纳可林J胞内含量；58-LA：58#工程菌株的洛伐他汀胞内含量；HZ-MJ：HZ01菌株的莫纳可林J胞内含量；HZ-LA：HZ01菌株的洛伐他汀胞内含量。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒(D6942-01)，DNA片段回收是采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒(D6492-01)，凝胶回收是采用OMEGA公司Gel Extraction Kit试剂盒(D2500-01)。

CD培养基组成为：3g/L NaNO₃，2g/L KCl，1g/L KH₂PO₄，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.02g/L FeSO₄·7H₂O，10g/L葡萄糖。

CD平板培养基组成为：3g/L NaNO₃，2g/L KCl，1g/L KH₂PO₄，0.5g/L MgSO₄·7H₂O，0.02g/L FeSO₄·7H₂O，10g/L葡萄糖，1.5g/L琼脂。

IPM液体培养基：60g L^-1葡萄糖，2g L^-1NH₄NO₃，20mg L^-1(NH₄)₂HPO₄，20mg L^-1FeSO₄，0.4g L^-1MgSO₄，4.4mg L^-1ZnSO₄，0.5g/L玉米浆，pH 3.5。

洛伐他汀发酵种子培养基：9g L^-1葡萄糖，10g L^-1蔗糖，1g L^-1酵母抽提物，1g L^-1蛋白胨，1g L^-1乙酸钠，0.04g L^-1KH₂PO₄，0.1g L^-1MgSO₄，5g L^-1豆粕，1.5g L^-1碳酸钙，pH6.8。

洛伐他汀发酵培养基：70g L^-1葡萄糖，20g L^-1蔗糖，1.5g L^-1酵母抽提物，20g L^-1蛋白胨，7g L^-1乙酸钠，0.5g L^-1KH₂PO₄，0.5g L^-1MgSO₄，5g L^-1豆粕，5g L^-1碳酸钙，泡敌(烟台恒鑫化工科技有限公司，型号THIX-298)0.1mL L^-1，pH6.5。

实施例1：2-甲基丁酸侧链水解酶的制备

(1)2-甲基丁酸侧链水解酶表达菌株的构建

本发明中使用的2-甲基丁酸侧链水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，扩增自产黄青霉(Penicillium chrysogenum)。参照大肠杆菌BL21的密码子偏好性设计了编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列SEQ ID NO.2，由华大基因公司合成了核苷酸序列为SEQ IDNO.2的核酸片段并将其克隆至载体pUC57上，核苷酸序列SEQ ID NO.2的核酸片段记为pcest，其编码的蛋白记为PcEST(即，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，获得质粒pUC57-pcest。以pUC57-pcest质粒为模板，用引物pcest-F(5’-gctcatatggataccacctttcaggc-3’，SEQ ID NO:3)和pcest-R(5’-gatctcgagctgctgacctttccaggcgct-3’，SEQ ID NO:4)进行PCR扩增，PCR扩增程序设定为：首先，94℃预变性5min；然后进入30个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，4℃保温。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳(1％)检测获得大小约为1.2kb的pcest片段，并进行回收纯化。用限制性内切酶Nde I(Thermo，FD0583)和Xho I(Thermo，FD0694)对pcest片段和pEASY-E2载体(即闭合的全式金公司pEASY-E2表达载体(产品编号：CE201-01))进行双酶切，酶切产物经回收纯化后用T4连接酶进行连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，阳性克隆经PCR验证和DNA测序验证正确后，用含有氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养并提取质粒，获得构建正确的PcEST表达质粒pEASY-E2-pcest。将质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到能够表达PcEST的重组菌株BL21(DE3)(pcest)。

参照专利申请WO2005040107A2中所公布的2-甲基丁酸侧链水解酶的核苷酸序列(该专利申请的SEQ ID NO.3)，合成了序列完全一致的DNA片段，将该基因记为ecbla4，其编码的蛋白记为EcBla4，并克隆至载体pUC57上，获得含有该片段的质粒pUC57-ecbla4。以pUC57-ecbla4质粒为模板，用引物ecbla4-F(5’-gctcatatggaaattcatggcacctgc-3’，SEQID NO:5)和ecbla4-R(5’-gatctcgagggtccacgcgccgctcgcatc-3’，SEQ ID NO:6)进行PCR扩增，PCR扩增程序设定为：首先，94℃预变性5min；然后进入30个循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min；最后72℃延伸10min，4℃保温。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳(1％)检测获得大小约为1.2kb的ecbla4片段，并进行回收纯化。用限制性内切酶Nde I(Thermo，FD0583)和Xho I(Thermo，FD0694)对ecbla4片段和pEASY-E2载体进行双酶切，酶切产物经回收纯化后用T4连接酶连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，阳性克隆经PCR验证和DNA测序验证正确后，用含有氨苄青霉素的LB液体培养基进行培养并提取质粒，获得构建正确的EcBla4表达质粒pEASY-E2-ecbla4。将质粒转化至表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，得到能够表达EcBla4的重组菌株BL21(DE3)(ecbla4)。

经氨基酸序列比对发现，PcEST和EcBla4的氨基酸序列的一致性为19.6％，不足20％。

(2)2-甲基丁酸侧链水解酶的表达与纯化

挑取重组菌株BL21(DE3)(pcest)和BL21(DE3)(ecbla4)的阳性单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，生长16h获得种子发酵液；按1％接种量将种子发酵液接到LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)，在37℃摇床培养至OD₆₀₀＝0.6左右，加入终浓度为0.1mM的IPTG进行诱导表达，并在20℃摇床继续培养发酵24h后，将发酵液于4℃、8000g离心15min收集菌体。菌体用结合缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，0.5M NaCl)洗涤一次后，重悬于30mL结合缓冲液中，并加入蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为1mM。将菌悬液进行超声破碎，超声期间菌液孵育于冰水混合物中。将破碎后菌液于4℃、13000g离心30min，收集上清液用于后续的蛋白纯化。

采用Ni-NTA琼脂糖(QIAGEN，Cat No.30230)对目的蛋白进行纯化，纯化过程中温度控制在4℃，步骤如下：(1)用蒸馏水洗净玻璃层析柱，将Ni-NTA琼脂糖摇匀后取5mL装柱，使溶液流出；(2)平衡：用5倍体积的结合缓冲液洗柱，对树脂进行平衡；(3)上样：将上清液用0.45μm滤器过滤后，以1mL/min的流速将样品流加至层析柱中；(4)洗涤：先流加10倍体积的结合缓冲液对层析柱进行洗涤，然后用20倍体积的20mM咪唑溶液(结合缓冲液中溶解有10mM咪唑)进行洗涤，将吸附物质、杂蛋白以及结合力较弱蛋白清洗除去，洗涤过程中溶液流速为1.0mL/min；(5)洗脱：用20mL的100mM咪唑溶液(结合缓冲液中溶解有10mM咪唑)将结合在树脂上的蛋白进行洗脱，洗脱过程中流速为1.0mL/min，收集洗脱的蛋白液；(6)透析：将洗脱的蛋白液装于已预处理的透析袋中，置于2L透析液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，0.1MNaCl)中并用磁力搅拌器缓慢搅动，8小时后更换新的透析液，透析全过程都于4℃进行；(7)浓度测定：将透析后的蛋白液进行收集，用Bradford方法测定蛋白质浓度，用SDS-PAGE分析蛋白质纯化结果(图1)。

参照上述方法分别获得纯化后的PcEST和EcBla4酶，用于后续的酶活性分析。

实施例2：PcEST的酶活分析

分析了PcEST对洛伐他汀(酸式、内酯式、钠盐式)、辛伐他汀(酸式、内酯式)、美伐他汀(酸式、内酯式)、普伐他汀(酸式、钠盐式)、莫纳可林J的水解活性。各物质的结构图及转化关系见图2。反应条件：底物浓度0.1g/L，酶浓度0.1mg/mL，缓冲体系50mM Tris-HCl(pH8.0)，对照组(Control)用50mM Tris-HCl(pH8.0)代替酶液，总体积为300μL，37℃反应1小时，加入300μL无水甲醇终止反应，用0.22μm的有机相滤器过滤后用高效液相色谱(HPLC)对样品进行分析，分析方法为：液相色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18液相色谱柱883975-902(4.6×150mm,5μm)，流动相为甲醇/0.1％H₃PO₄＝0.78/0.22，流速为0.5ml/min，紫外检测器(237nm)，25℃。内酯式和钠盐形式的底物都溶解于无水乙醇中至终浓度为2g/L，酸式的他汀类底物制备方法为：称量0.01g内酯式的他汀药品，溶解于10mL的0.2M NaOH溶液中，置于超声震荡清洗仪中37℃超声震荡3小时。

HPLC分析结果显示PcEST对酸式、内酯式、钠盐形式的洛伐他汀均有水解能力(图3)，对酸式、内酯式美伐他汀也有水解能力(图4)，对酸式、钠盐形式的普伐他汀也有水解能力(图5)。HPLC结果也可以发现辛伐他汀的溶解度较差，但是可以确定酸式和内酯式辛伐他汀均无水解，没有水解后的产物莫纳可林J的生成，由此可见该酶对酸式和内酯式辛伐他汀均完全无水解能力(图6)。另外，分析结果显示该酶不会水解莫纳可林J(图7)。洛伐他汀、美伐他汀和普伐他汀的共性在于其侧链都是2-甲基丁酸侧链，而洛伐他汀与美伐他汀的区别在于侧链不同，PcEST能水解洛伐他汀、美伐他汀和普伐他汀，而不能水解辛伐他汀，据此可以推测PcEST特异性识别底物的2-甲基丁酸侧链。

PcEST酶可以水解洛伐他汀、普伐他汀、美伐他汀的2-甲基丁酸侧链，因此可以用其作为催化剂水解这些他汀类物质，从而获得相应的无2-甲基丁酸侧链的母核。例如，可以用其水解洛伐他汀制备莫纳可林J，而莫纳可林J可以作为合成辛伐他汀的原料。

实施例3：2-甲基丁酸侧链水解酶活性的比较分析

洛伐他汀侧链水解酶PcEST是一种酯酶，属于β-内酰胺酶家族，具有SXXK模体。专利申请WO2005040107A2中的SEQ ID NO.4是一种同样具有SXXK模体的酯酶，也具有水解洛伐他汀侧链的活性，但是与本发明SEQ ID NO.1的序列一致性低于20％。以酸式洛伐他汀为底物，比较分析了两种水解酶PcEST和EcBla4的活性。反应条件：缓冲体系50mM Tris-HCl(pH8.0)，底物为0.2mM的酸式洛伐他汀，按如表1中的梯度加入酶量，对照组(Control)用50mM Tris-HCl(pH8.0)代替酶液，总体积为300μL。37℃反应1小时后加入300μL无水甲醇终止反应，样品经0.22μm有机相滤器过滤后用高效液相色谱(HPLC)进行分析。结果如表1所示，从中可以看出本发明提供的2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST比专利申请WO2005040107A2公布的酶EcBla4的洛伐他汀水解活性高约15倍(表1，图8)。

表1两种酶水解洛伐他汀能力的比较分析

*反应量太小，HPLC定量不够准确，测定值不可信

**底物消耗比例过大，酶活测定值会偏小

从图8中可以看出，酶使用量相近的情况下，PcEST水解的洛伐他汀的量明显多于EcBla4，同理，生成的莫纳可林J的量也明显多于EcBla4。

实施例4：2-甲基丁酸侧链水解酶PcEST清除辛伐他汀样品中残留的洛伐他汀

取混有少量洛伐他汀的辛伐他汀样品，溶解于0.2M NaOH溶液中，至终浓度为5g/L，由于辛伐他汀溶解度低，因此溶液中有未完全溶解的沉淀。反应体系总体积为1mL，含有200μL辛伐他汀悬液，100μL PcEST酶溶液(1mg/mL)，700μL的50mM Tris-HCl(pH8.0)；对照组(Control)用50mM Tris-HCl(pH8.0)代替酶溶液，37℃反应4小时后加入等体积的无水甲醇，用0.22μm的有机相滤器过滤后进行HPLC分析。结果如图9所示，反应体系中洛伐他汀的浓度为0.16g/L，辛伐他汀的峰面积较小是因为其溶解度低，已达到饱和，由此可以计算出该样品中洛伐他汀含量为16％。加入PcEST酶处理4小时后，洛伐他汀全部被水解成等物质的量的莫纳可林J，而辛伐他汀未被水解。由此可见用PcEST水解辛伐他汀中残留的洛伐他汀是可行的。

实施例5：产莫纳可林J的曲霉工程菌株的构建

(1)共转化构建产莫纳可林J曲霉工程菌株

以质粒pEASY-E2-pcest为模板，用引物pcest-F1(5’-gatccatggataccacctttcaggc-3’，SEQ ID NO:7)和pcest-R1(5’-gatgcggccgcgttagcagccggatctcagtg-3’，SEQ ID NO:8)扩增pcest基因片段，用限制性内切酶Nco I(Thermo，FD0573)和Not I(Thermo，FD0593)进行酶切并回收目的片段(1.2kb)。用限制性内切酶PciI(Thermo，ER1871)和Not I对载体pG3H(图10，Xuenian Huang,Xuefeng Lv,Jianjun Li*,Cloning and functional characterization of a native glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase promoter for Aspergillus terreus,Journal ofIndustrial Microbiology and Biotechnology,2014,41(3):585-592)进行酶切，回收大小约为7.3kb的片段。将酶切回收后的pcest片段和pG3H载体用T4连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5a，PCR及测序验证正确的质粒记为pG3H-pcest。以pG3H-pcest为模板，用引物PgpdAt-F630(5’-catcatcgcattctccctctcg-3’，SEQ ID NO:9)和TtrpC-R2(5’-ttactattgtatacccatcttag-3’，SEQ ID NO:10)进行PCR扩增，获得PcEST的表达元件PgpdAt-pcest-TtrpC，该表达元件包括启动子PgpdAt、PcEST编码序列pcest、终止子TtrpC，大小为2490bp，通过PCR产物回收试剂盒进行回收纯化。以质粒pPTR II(TAKARA,CatalogNo.:3621)为模板，以ptrA-F(5’-gggcaattgattacgggatc-3’，SEQ ID NO:11)和ptrA-R(5’-atggggtgacgatgagccgc-3’，SEQ ID NO:12)作为引物扩增获得大小约为2.0kb的筛选标记吡啶硫胺抗性基因ptrA片段，经PCR产物回收试剂盒回收纯化。

将曲霉菌株HZ01接种于PDA固体平板(BD，Difco^TM Potato Dextrose Agar,213400)上，30℃培养7天，获得孢子。将HZ01菌株的孢子接种至50mL液体培养基IPM(60g L^-1葡萄糖，2g L^-1NH₄NO₃，20mg L^-1(NH₄)₂HPO₄，20mg L^-1FeSO₄，0.4g L^-1MgSO₄，4.4mg L^-1ZnSO₄，0.5g/L玉米浆粉(Sigma，C8160-500G)，pH 3.5)中，使孢子浓度约为10⁷个/mL，在200rmp、32℃培养12-18h。用无菌单层500目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用灭菌的0.6M MgSO₄溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50ml三角瓶中；称取1g菌丝，加入10ml酶解液，在30℃、60rpm处理1-3h。酶解液成分为：0.8％(质量体积比)纤维素酶(Sigma，Catalog No.：C1184)、0.8％(质量体积比)裂解酶(Sigma，Catalog NO.：L1412)、0.4％(质量体积比)蜗牛酶(上海生工，Catalog No.：SB0870)、0.6M MgSO₄，经由0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。将上述酶解后的混合液先用8层擦镜纸过滤，收集滤液。4℃离心收集原生质体，用预冷1.0M山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC(STC为1.0M山梨醇，50mM Tris·HCl-pH 8.0，50mM CaCl₂)洗涤一次，最后把原生质体重悬于预冷的STC中，并用STC将原生质体浓度调整为2×10⁸个/mL，得到原生质体悬液。

向150μl上述原生质体悬液中同时加入DNA片段PgpdAt-pcest-TtrpC(约3μg)和ptrA(约0.5μg)，PgpdAt-pcest-TtrpC和ptrA总体积为15μl，PgpdAt-pcest-TtrpC和ptrA的摩尔比为1:5。再加入50μl冰浴的PSTC(PSTC为40％PEG4000，1.2M山梨醇，50mM Tris-HCl-pH8.0，50mM CaCl₂)，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL常温的PSTC，混匀后室温放置20min；然后与30mL上层琼脂(CD+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48℃保温)混合后倾注于10块CD-SP再生筛选培养基平板(CD平板+1.2M山梨醇+0.1mg/L吡啶硫胺(Sigma，P0256))上，在30℃、黑暗条件下培养5-7天。

从转化筛选平板上挑取具有吡啶硫胺抗性转化子转接至筛选平板CD-P上(CD平板+0.1mg/L吡啶硫胺)，在32℃培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取稳定传代的4个转化子(2#、3#、4#、5#)进行单孢分离纯化，选择得到的单菌落孢子接种于IPM液体培养基中，30℃，200rpm，培养48小时，收集菌丝提取基因组。用引物PgpdAt-F630/TtrpC-R2进行PCR验证，能扩增出大小约为2.6kb的条带(PcEST表达元件PgpdAt-pcest-TtrpC)者为阳性。由图11可知该方法获得的4#、5#转化为为阳性，基因组上整合有PcEST表达元件PgpdAt-pcest-TtrpC。

(2)筛选标记串联法构建产莫纳可林J的曲霉工程菌株

以质粒pPTR II(TAKARA,Catalog No.:3621)为模板，以ptrA-F1(5’-gatactagtgggcaattgattacgggatc-3’，SEQ ID NO:13)和ptrA-R1(5’-gatactagtatggggtgacgatgagccGC-3’，SEQ ID NO:14)作为引物扩增获得大小约为2.0kb的ptrA-BcuI片段，经PCR产物回收试剂盒回收纯化，用限制性内切酶Bcu I(Thermo，FD1253)进行酶切并回收目的片段(2.0kb)。用限制性内切酶Xba I(Thermo，FD0684)对载体pG3H-pcest进行酶切并用FastAP(Thermo，EF0651)进行去磷酸化处理，回收大小约为5.6kb的片段。将酶切回收后的ptrA-BcuI片段和pG3H-pcest载体用T4连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5a，PCR及测序验证正确的质粒记为pG3H-pcest-ptrA。以pG3H-pcest-ptrA为模板，用引物PgpdAt-F630(5’-catcatcgcattctccctctcg-3’，SEQ ID NO:9)和pMD-R1(5’-catgattacgaactcgtcctcgg-3’，SEQ ID NO:15)进行PCR扩增，获得串联有筛选标记ptrA的PcEST表达元件PgpdAt-PcEST-TtrpC-ptrA片段，经PCR产物回收试剂盒回收纯化。

将曲霉HZ01菌株接种于PDA固体平板中，30℃培养7天，获得孢子。将HZ01菌株的孢子接种至50mL液体培养基IPM(60g L^-1葡萄糖，2g L^-1NH₄NO₃，20mg L^-1(NH₄)₂HPO₄，20mg L^- ¹FeSO₄，0.4g L^-1MgSO₄，4.4mg L^-1ZnSO₄，0.5g/L玉米浆，pH 3.5)中，使孢子浓度约为10⁷个/mL，在200rmp、32℃培养12-18h。用无菌单层500目尼龙布过滤收集长出的菌丝，并用灭菌的0.6M MgSO₄溶液冲洗三次，压干后置于无菌的50ml三角瓶中；称取1g菌丝，加入10ml酶解液，在30℃、60rpm处理1-3h。酶解液成分为：0.8％纤维素酶(Sigma，Catalog No.：C1184)、0.8％裂解酶(Sigma，Catalog NO.：L1412)、0.4％蜗牛酶(上海生工，Catalog No.：SB0870)、0.6M MgSO₄，经由0.22μm的无菌过滤器过滤除菌。将上述酶解后的混合液先用8层擦镜纸过滤，收集滤液。4℃离心收集原生质体，用预冷1.0M山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC(STC为1.0M山梨醇，50mM Tris·HCl-pH 8.0，50mM CaCl₂)洗涤一次，最后把原生质体重悬于预冷的STC中，并用STC将原生质体浓度调整为2×10⁸个/mL，得到原生质体悬液。

向150μl上述原生质体悬液中加入10μl DNA片段PgpdAt-PcEST-TtrpC-ptrA片段(约3μg)，再加入50μl冰浴的PSTC(PSTC为40％PEG4000，1.2M山梨醇，50mM Tris-HCl-pH8.0，50mM CaCl₂)，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL常温的PSTC，混匀后室温放置20min；然后与30mL上层琼脂(CD+1.2M山梨醇+4g/L琼脂糖，灭菌后48℃保温)混合后倾注于10块再生筛选培养基平板CD-SP(CD平板+1.2M山梨醇+0.1mg/L吡啶硫胺)上，在30℃、黑暗条件下培养5-7天。

从转化筛选平板上挑取具有吡啶硫胺抗性转化子转接至筛选平板CD-P上(CD平板+0.1mg/L吡啶硫胺)，在32℃培养5天进行传代纯化，连续传代4次。选取稳定传代的5个转化子(52#、54#、58#、60#、b1#)进行单孢分离纯化，选择得到的单菌落孢子接种于IPM液体培养基中，30℃，200rpm，培养48小时，收集菌丝提取基因组。用引物PgpdAt-F743/TtrpC-R2进行PCR验证，能扩增出大小约为2.6kb的条带(PcEST表达元件PgpdAt-pcest-TtrpC)者为阳性。由图11可知该方法获得的52#、58#、b1#转化为阳性，基因组上整合有PcEST表达元件PgpdAt-PcEST-TtrpC。

实施例6：产莫纳可林J的曲霉工程菌株的发酵验证

将5株工程菌株4#、5#、52#、58#、b1#和对照菌株HZ01接种于PDA固体平板，30℃培养7天获得孢子。将孢子接种于35ml洛伐他汀发酵种子培养基(250mL三角瓶)，28℃、22rpm震荡培养48小时，对照菌株HZ01菌株接种4瓶。将3.5mL种子液接种于30mL洛伐他汀发酵培养基(250mL三角瓶)，28℃，220rpm震荡培养4天。取2mL发酵液离心收集菌丝，用无菌水洗涤两次后加入0.5mL 50mM Tris-HCl(pH8.0)、0.2mM PMSF和少许石英砂，冰浴后置于快速核酸提取仪(

-24)上震荡2分钟，于4℃、13000g离心20分钟，收集上清为菌体破碎液，参照实施例3中方法测定破碎液的PcEST活性，结果如图12，所有转化子的菌体破碎液都能够水解洛伐他汀生产莫纳可林J，而对照菌株HZ01菌株则无此活性，这说明PcEST在工程菌株中成功表达且有活性。取1mL发酵液(用剪头的枪头)加入至1mL无水甲醇，置于混匀仪上翻转震荡4小时，用有机相滤器过滤后送HPLC分析，结果如图13所示，对照菌株发酵液中的产物主要为洛伐他汀，莫纳可林J很少，而5株工程菌株中洛伐他汀含量极少，莫纳可林J产量反而明显增高，这说明工程菌株合成的洛伐他汀都被水解成了莫纳可林J。

将58#工程菌株和对照菌株HZ01菌株的孢子接种于35ml洛伐他汀发酵种子培养基(250mL三角瓶)，28℃、22rpm震荡培养48小时，双平行。将3.5mL种子液接种于30mL洛伐他汀发酵培养基(250mL三角瓶)，28℃，220rpm震荡培养8天，每2天取样一瓶进行样品处理。总产量样品处理方式为：取0.8mL发酵液(用剪头的枪头)加入至15mL离心管中，加入0.8mL的0.2M NaOH溶液，再加入8mL无水甲醇，置于混匀仪上翻转震荡4小时。胞内与胞外样品：取0.8mL发酵液(用剪头的枪头)加入至1.5mL离心管中，离心，取上清，用无菌水将菌丝体洗涤一次，回收洗涤液并与之前的上清液合并作为胞外样品，菌丝体则作为胞内样品。分别向两样品中加入0.8mL的0.2M NaOH溶液，用无水甲醇定容至9.6mL，置于混匀仪上翻转震荡4小时。用0.22μm有机相滤器过滤处理样品，送HPLC分析。HPLC分析方法为：液相色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18液相色谱柱883975-902(4.6×150mm,5μm)，流动相为乙腈/0.1％H₃PO₄＝0.7/0.3，流速为0.5ml/min，紫外检测器(237nm)，25℃。结果如图14所示，在出发菌株HZ01菌株中产物主要是洛伐他汀，莫纳可林J含量很少。而改造后的工程菌株58#中则完全相反，洛伐他汀基本被水解成了莫纳可林J，仅6％的残留。另外，按照物质的量计算，改造后的工程菌株合成的莫纳可林J的量略低于出发菌株中的洛伐他汀的量，约为80.2％。

此外，对洛伐他汀和莫纳可林J的胞内外分布也进行了分析。图15为58#工程菌株和HZ01菌株的第8天样品的HPLC分析结果，结果表明洛伐他汀主要存在于胞内，莫纳可林J主要存在于胞外。图16为洛伐他汀或莫纳可林J在胞内所占比例的时间变化图，从中可以看出洛伐他汀和莫纳可林J的胞内外分布比例并未随发酵时间而发生大的改变。两种物质的分布不受总产量高低的影响，在洛伐他汀和莫纳可林J产量迥异的两株菌株中，洛伐他汀都主要存在于胞内，莫纳可林J都主要存在于胞外。对照菌株HZ01的洛伐他汀产量很高，且有80％位于胞内。改造后的58#工程菌株的洛伐他汀残留量很低，残留量中近70％位于胞内，而约80％的莫纳可林J位于胞外。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

PgpdAt序列(SEQ ID NO:16)：

CatcatcgcattctccctctcgtaaggtacctaccacaaacccccactatcgttcatccgtccccggttacaacgggaagaaaaagcccggggagagggggaagaagaaaatcccaagggacgggaatagccgtgcggaagagaagacgattagcctaggtagaagcctcatggccgaccatttgattccgaaaagctggcaaaacattcacgagatagacacagtgaggacccggacgatgccctatgcggcgcgctgattggccaggccgggcagtgccgaagcagcaaatatcgtgagtctcctgctttgcccggtgtatgaaaccggaaagggttgctggggagctggtcagcggcgcaagccgggagggcgactgagctctgtagcttttgccccgtctgtccgtccggtgtagagtggcagaccaccgcctgctgcgcctcccattgggtcttccccaacgtgactgggtcgttgcgtcagtccatgtcgctgcctttttcttcctccccctcccccgctgtccttcttcttcttcttcttctctctttctcccatcatcctctcatcctctgcctttcccatcgaactcacttcttctaccaacaactcatcaatcatcacaacTtrpC序列(SEQ ID NO:17)：

ggatccacttaacgttactgaaatcatcaaacagcttgacgaatctggatataagatcgttggtgtcgatgtcagctccggagttgagacaaatggtgttcaggatctcgataagatacgttcatttgtccaagcagcaaagagtgccttctagtgatttaatagctccatgtcaacaagaataaaacgcgtttcgggtttacctcttccagatacagctcatctgcaatgcattaatgcattggacctcgcaaccctagtacgcccttcaggctccggcgaagcagaagaatagcttagcagagtctattttcattttcgggagacgagatcaagcagatcaacggtcgtcaagagacctacgagactgaggaatccgctcttggctccacgcgacta tatatttgtctctaattgtactttgacatgctcctcttctttactctgatagcttgactatgaaaattccgtcaccagcccctgggttcgcaaagataattgcactgtttcttccttgaactctcaagcctacaggacacacattcatcgtaggtataaacctcgaaaatcattcctactaagatgggtatacaatagtaa

ptrA序列(SEQ ID NO:18)：

gggcaattgattacgggatcccattggtaacgaaatgtaaaagctaggagatcgtccgccgatgtcaggatgatttcacttgtttcttgtccggctcaccggtcaaagctaaagaggagcaaaaggaacggatagaatcgggtgccgctgatctatacggtatagtgcccttatcacgttgactcaacccatgctatttaactcaacccctccttctgaaccccaccatcttcttccttttcctctcatcccacacaattctctatctcagatttgaattccaaaagtcctcggacgaaactgaacaagtcttcctcccttcgataaacctttggtgattggaataactgaccatcttctatagttcccaaaccaaccgacaatgtaaatacactcctcgattagccctctagagggcatacgatggaagtcatggaatacttttggctggactctcacaatgatcaaggtatcttaggtaacgtctttggcgtgggccggtgttcgttcccagtcatcgatgcattcacatgccctccctaagctgggccctagactctaggatcctagtctagaaggacatggcatcgatggactgggttcgttctgagattatacggctaaaacttgatctggataataccagcgaaaagggtcatgccttctctcgttcttcctgttgatggaatggctaacagatgatagtcattgcaacttgaaacatgtctcctccagctgccatctacgaacccactgtggccgctaccggcctcaagggtaaggtcgtggtttctgagaccgtccccgttgagggagcttctcagaccaagctgttggaccatttcggtggcaagtgggacgagttcaagttcgcccctatccgcgaaagccaggtctctcgtgccatgaccagacgttactttgaggacctggacaagtacgctgaaagtgacgttgtcattgttggtgctggttcctgcggtctgagcactgcgtacgtcttggccaaggctcgtccggacctgaagattgctatcgtcgaggccagcgtctctcctggtcagtagtccatgatggattgccttgcactcagctttccggaactaacgtgcaataggtggcggtgcctggttgggtggccaactcttttctgctatggtcatgcgccgtcccgcggaagtcttcctgaacgagctgggtgttccttacgaagaggacgcaaaccccaactacgttgtcgtcaagcacgcctccctgtttacctcgacactcatgtcgaaggttctctccttccccaatgtcaagctcttcaatgctaccgctgttgaggacttgatcacccgtccgaccgagaacggcaacccccagattgctggtgttgtcgtcaactggacgctggtcacccttcaccacgatgatcactcctgcatggaccccaacactatcaacgctcctgtcatcatcagtaccactggtcacgatgggccattcggcgccttctgtgcgaagcgcttggtgtccatgggcagcgtcgacaagctaggtggcatgcgtggtctcgacatgaactcggccgaggatgccatcgtcaagaacacccgcgaggttactaagggcttgataatcggcggtatggagctgtctgaaattgatggctttaaccgcatgggccctaccttcggtgccatggttctcagtggtgtcaaggctgccgaggaggcattgaaggtgttcgacgagcgtcagcgcgagtgtgctgagtaaatgactcactacccgaatgggttcagtgcatgaaccggatttgtcttacggtctttgacgataggggaatgatgattatgtgatagttctgagatttgaatgaactcgttagctcgtaatccacatgcatatgtaaatggctgtgtcccgtatgtaacggtggggcattctagaataattatgtgtaacaagaaagacagtataatacaaacaaagatgcaagagcggctcatcgtcaccccat

序列表

<110> 中国科学院青岛生物能源与过程研究所

浙江海正药业股份有限公司

<120> 2-甲基丁酸侧链水解酶和产莫纳可林J的曲霉菌株及其构建方法与应用

<130> DP1F160522ZX/CNZJHZ/XWY

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 399

<212> PRT

<213> 产黄青霉

<400> 1

Met Asp Thr Thr Phe Gln Ala Ala Ile Asp Thr Gly Lys Ile Asn Gly

1 5 10 15

Ala Val Val Cys Ala Thr Asp Ala Gln Gly His Phe Val Tyr Asn Lys

20 25 30

Ala Thr Gly Glu Arg Thr Leu Leu Ser Gly Glu Lys Gln Pro Gln Gln

35 40 45

Leu Asp Asp Val Leu Tyr Leu Ala Ser Ala Thr Lys Leu Ile Thr Thr

50 55 60

Ile Ala Ala Leu Gln Cys Val Glu Asp Gly Leu Leu Ser Leu Asp Gly

65 70 75 80

Asp Leu Ser Ser Ile Ala Pro Glu Leu Ala Ala Lys Tyr Val Leu Thr

85 90 95

Gly Phe Thr Asp Asp Glu Ser Pro Leu Asp Asp Pro Pro Ala Arg Pro

100 105 110

Ile Thr Leu Lys Met Leu Leu Thr His Ser Ser Gly Thr Ser Tyr His

115 120 125

Phe Leu Asp Pro Ser Ile Ala Lys Trp Arg Ala Gln Tyr Ala Asn Pro

130 135 140

Glu Asn Glu Lys Pro Arg Leu Val Glu Glu Met Phe Thr Tyr Pro Leu

145 150 155 160

Ser Phe Gln Pro Gly Thr Gly Trp Met Tyr Gly Pro Gly Leu Asp Trp

165 170 175

Ala Gly Arg Val Val Glu Arg Val Thr Gly Gly Thr Leu Met Glu Phe

180 185 190

Met Gln Lys Arg Ile Phe Asp Pro Leu Gly Ile Thr Asp Ser Gln Phe

195 200 205

Tyr Pro Val Thr Arg Glu Asp Leu Arg Ala Arg Leu Val Asp Leu Asn

210 215 220

Pro Ser Asp Pro Gly Ala Leu Gly Ser Ala Val Ile Gly Gly Gly Gly

225 230 235 240

Glu Met Asn Leu Arg Gly Arg Gly Ala Phe Gly Gly His Gly Leu Phe

245 250 255

Leu Thr Gly Leu Asp Phe Val Lys Ile Leu Arg Ser Leu Leu Ala Asn

260 265 270

Asp Gly Met Leu Leu Lys Pro Ala Ala Val Asp Asn Met Phe Gln Gln

275 280 285

His Leu Gly Pro Glu Ala Ala Ala Ser His Arg Ala Ala Leu Ala Ser

290 295 300

Pro Leu Gly Pro Phe Phe Arg Val Gly Thr Asp Pro Glu Thr Lys Val

305 310 315 320

Gly Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Leu Thr Leu Glu Asp Val Asp Gly Trp

325 330 335

Tyr Gly Glu Arg Thr Leu Thr Trp Gly Gly Gly Leu Thr Leu Thr Trp

340 345 350

Phe Ile Asp Arg Lys Asn Asn Leu Cys Gly Val Gly Ala Ile Gln Ala

355 360 365

Val Leu Pro Val Asp Gly Asp Leu Met Ala Asp Leu Lys Gln Thr Phe

370 375 380

Arg His Asp Ile Tyr Arg Lys Tyr Ser Ala Trp Lys Gly Gln Gln

385 390 395

<210> 2

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 2-甲基丁酸侧链水解酶编码序列

<400> 2

atggatacca cctttcaggc ggcgattgat accggcaaaa ttaacggcgc agttgtttgc 60

gcaaccgacg cacagggcca ttttgtttat aacaaagcaa ccggcgaacg taccctgctg 120

tctggcgaaa aacaaccgca acagctggat gatgttctgt atctggcaag cgcgaccaaa 180

ctgattacca ccattgctgc tctgcaatgc gttgaagacg gtctgctgag tctggacggc 240

gatctgagta gtattgcacc ggaactggca gcgaaatacg ttctgaccgg ttttaccgac 300

gacgaaagtc cgctggacga tccgccggca cgtccgatta ccctgaaaat gctgctgacc 360

catagcagcg gtaccagcta tcatttcctg gatccgtcta tcgcaaaatg gcgcgcacaa 420

tacgcgaatc cggaaaacga aaaaccgcgt ctggtcgaag agatgttcac ctatccgctg 480

agttttcaac cgggtaccgg ctggatgtac ggtccgggtc tggattgggc aggtcgcgtt 540

gttgaacgtg ttacgggcgg taccctgatg gaattcatgc agaaacgcat cttcgatccg 600

ctgggtatca ccgatagcca gttttatccg gttacccgcg aagatctgcg cgcacgtctg 660

gttgatctga atccgtctga tccgggcgca ctgggttctg cagttattgg cggcggcggt 720

gaaatgaatc tgcgcggtcg cggcgcattt ggcggtcacg gtctgtttct gaccggtctg 780

gatttcgtca aaatcctgcg tagcctgctg gctaacgacg gtatgctgct gaaaccggct 840

gctgtcgata acatgttcca gcagcatctg ggtccggaag cagcagcaag tcatcgcgca 900

gcactggcaa gtccgctggg tccgtttttc cgcgttggta ccgatccgga aaccaaagtt 960

ggttacggtc tgggcggtct gctgaccctg gaagacgttg acggttggta cggcgaacgt 1020

accctgacct ggggcggtgg tctgaccctg acctggttta tcgaccgcaa aaacaacctg 1080

tgtggtgttg gcgcaattca agcagttctg ccggttgacg gcgatctgat ggcagatctg 1140

aaacagacct tccgccacga tatctaccgc aaatacagcg cctggaaagg tcagcagtga 1200

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物pcest-F

<400> 3

gctcatatgg ataccacctt tcaggc 26

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物pcest-R

<400> 4

gatctcgagc tgctgacctt tccaggcgct 30

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ecbla4-F

<400> 5

gctcatatgg aaattcatgg cacctgc 27

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ecbla4-R

<400> 6

gatctcgagg gtccacgcgc cgctcgcatc 30

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物pcest-F1

<400> 7

gatccatgga taccaccttt caggc 25

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物pcest-R1

<400> 8

gatgcggccg cgttagcagc cggatctcag tg 32

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物PgpdAt-F630

<400> 9

catcatcgca ttctccctct cg 22

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TtrpC-R2

<400> 10

ttactattgt atacccatct tag 23

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ptrA-F

<400> 11

gggcaattga ttacgggatc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ptrA-R

<400> 12

atggggtgac gatgagccgc 20

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ptrA-F1

<400> 13

gatactagtg ggcaattgat tacgggatc 29

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物ptrA-R1

<400> 14

gatactagta tggggtgacg atgagccgc 29

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物pMD-R1

<400> 15

catgattacg aactcgtcct cgg 23

<210> 16

<211> 631

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PgpdAt序列

<400> 16

catcatcgca ttctccctct cgtaaggtac ctaccacaaa cccccactat cgttcatccg 60

tccccggtta caacgggaag aaaaagcccg gggagagggg gaagaagaaa atcccaaggg 120

acgggaatag ccgtgcggaa gagaagacga ttagcctagg tagaagcctc atggccgacc 180

atttgattcc gaaaagctgg caaaacattc acgagataga cacagtgagg acccggacga 240

tgccctatgc ggcgcgctga ttggccaggc cgggcagtgc cgaagcagca aatatcgtga 300

gtctcctgct ttgcccggtg tatgaaaccg gaaagggttg ctggggagct ggtcagcggc 360

gcaagccggg agggcgactg agctctgtag cttttgcccc gtctgtccgt ccggtgtaga 420

gtggcagacc accgcctgct gcgcctccca ttgggtcttc cccaacgtga ctgggtcgtt 480

gcgtcagtcc atgtcgctgc ctttttcttc ctccccctcc cccgctgtcc ttcttcttct 540

tcttcttctc tctttctccc atcatcctct catcctctgc ctttcccatc gaactcactt 600

cttctaccaa caactcatca atcatcacaa c 631

<210> 17

<211> 600

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> TtrpC序列

<400> 17

ggatccactt aacgttactg aaatcatcaa acagcttgac gaatctggat ataagatcgt 60

tggtgtcgat gtcagctccg gagttgagac aaatggtgtt caggatctcg ataagatacg 120

ttcatttgtc caagcagcaa agagtgcctt ctagtgattt aatagctcca tgtcaacaag 180

aataaaacgc gtttcgggtt tacctcttcc agatacagct catctgcaat gcattaatgc 240

attggacctc gcaaccctag tacgcccttc aggctccggc gaagcagaag aatagcttag 300

cagagtctat tttcattttc gggagacgag atcaagcaga tcaacggtcg tcaagagacc 360

tacgagactg aggaatccgc tcttggctcc acgcgactat atatttgtct ctaattgtac 420

tttgacatgc tcctcttctt tactctgata gcttgactat gaaaattccg tcaccagccc 480

ctgggttcgc aaagataatt gcactgtttc ttccttgaac tctcaagcct acaggacaca 540

cattcatcgt aggtataaac ctcgaaaatc attcctacta agatgggtat acaatagtaa 600

<210> 18

<211> 2008

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> ptrA序列

<400> 18

gggcaattga ttacgggatc ccattggtaa cgaaatgtaa aagctaggag atcgtccgcc 60

gatgtcagga tgatttcact tgtttcttgt ccggctcacc ggtcaaagct aaagaggagc 120

aaaaggaacg gatagaatcg ggtgccgctg atctatacgg tatagtgccc ttatcacgtt 180

gactcaaccc atgctattta actcaacccc tccttctgaa ccccaccatc ttcttccttt 240

tcctctcatc ccacacaatt ctctatctca gatttgaatt ccaaaagtcc tcggacgaaa 300

ctgaacaagt cttcctccct tcgataaacc tttggtgatt ggaataactg accatcttct 360

atagttccca aaccaaccga caatgtaaat acactcctcg attagccctc tagagggcat 420

acgatggaag tcatggaata cttttggctg gactctcaca atgatcaagg tatcttaggt 480

aacgtctttg gcgtgggccg gtgttcgttc ccagtcatcg atgcattcac atgccctccc 540

taagctgggc cctagactct aggatcctag tctagaagga catggcatcg atggactggg 600

ttcgttctga gattatacgg ctaaaacttg atctggataa taccagcgaa aagggtcatg 660

ccttctctcg ttcttcctgt tgatggaatg gctaacagat gatagtcatt gcaacttgaa 720

acatgtctcc tccagctgcc atctacgaac ccactgtggc cgctaccggc ctcaagggta 780

aggtcgtggt ttctgagacc gtccccgttg agggagcttc tcagaccaag ctgttggacc 840

atttcggtgg caagtgggac gagttcaagt tcgcccctat ccgcgaaagc caggtctctc 900

gtgccatgac cagacgttac tttgaggacc tggacaagta cgctgaaagt gacgttgtca 960

ttgttggtgc tggttcctgc ggtctgagca ctgcgtacgt cttggccaag gctcgtccgg 1020

acctgaagat tgctatcgtc gaggccagcg tctctcctgg tcagtagtcc atgatggatt 1080

gccttgcact cagctttccg gaactaacgt gcaataggtg gcggtgcctg gttgggtggc 1140

caactctttt ctgctatggt catgcgccgt cccgcggaag tcttcctgaa cgagctgggt 1200

gttccttacg aagaggacgc aaaccccaac tacgttgtcg tcaagcacgc ctccctgttt 1260

acctcgacac tcatgtcgaa ggttctctcc ttccccaatg tcaagctctt caatgctacc 1320

gctgttgagg acttgatcac ccgtccgacc gagaacggca acccccagat tgctggtgtt 1380

gtcgtcaact ggacgctggt cacccttcac cacgatgatc actcctgcat ggaccccaac 1440

actatcaacg ctcctgtcat catcagtacc actggtcacg atgggccatt cggcgccttc 1500

tgtgcgaagc gcttggtgtc catgggcagc gtcgacaagc taggtggcat gcgtggtctc 1560

gacatgaact cggccgagga tgccatcgtc aagaacaccc gcgaggttac taagggcttg 1620

ataatcggcg gtatggagct gtctgaaatt gatggcttta accgcatggg ccctaccttc 1680

ggtgccatgg ttctcagtgg tgtcaaggct gccgaggagg cattgaaggt gttcgacgag 1740

cgtcagcgcg agtgtgctga gtaaatgact cactacccga atgggttcag tgcatgaacc 1800

ggatttgtct tacggtcttt gacgataggg gaatgatgat tatgtgatag ttctgagatt 1860

tgaatgaact cgttagctcg taatccacat gcatatgtaa atggctgtgt cccgtatgta 1920

acggtggggc attctagaat aattatgtgt aacaagaaag acagtataat acaaacaaag 1980

atgcaagagc ggctcatcgt caccccat 2008

Claims

1.氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质在水解含有2-甲基丁酸侧链的他汀类物质中的应用，其中，所述含有2-甲基丁酸侧链的他汀类物质为洛伐他汀。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述洛伐他汀为酸式、内酯式或盐式。

3.一株产莫纳可林J的曲霉菌株，其能够生产氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质，其构建方法包括：将出发曲霉菌株原生质体与包含核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的核酸分子的DNA片段共培养，经筛选后得到；所述出发曲霉菌株为曲霉菌HZ01，其保藏编号为CGMCC NO.12970。

4.根据权利要求3所述的产莫纳可林J的曲霉菌株，其中，所述曲霉菌株包含能表达氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质的表达盒。

5.根据权利要求4所述的产莫纳可林J的曲霉菌株，其中，所述曲霉菌株包含核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的核酸分子。

6.一种构建如权利要求3～5任一项所述的产莫纳可林J的曲霉菌株的方法，包括将出发曲霉菌株原生质体与包含核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的核酸分子的DNA片段共培养，经筛选后得到，所述出发曲霉菌株为曲霉菌HZ01，其保藏编号为CGMCC NO.12970。

7.核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的核酸分子或包含所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组微生物在制备产莫纳可林J的曲霉菌株中的应用。

8.一种制备莫纳可林J的方法，包括发酵培养如权利要求3～5任一项所述的曲霉菌株，或者用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质水解洛伐他汀。

9.如权利要求3～5任一项所述的曲霉菌株或其菌悬液或其发酵液或其代谢产物在制备莫纳可林J中的应用。

10.如权利要求3～5任一项所述的曲霉菌株或其菌悬液或其发酵液或其代谢产物在生产降血脂药物中的应用，所述降血脂药物是辛伐他汀。