CN114107150B - 一种α-氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌与应用 - Google Patents

一种α-氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种α‑氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌与应用。所述重组大肠杆菌是通过将SAET蛋白与外膜蛋白OmpA融合表达得到。所述重组大肠杆菌的构建方法为：(1)以pET30a质粒、pACYCDuet‑1质粒或pET21a质粒为载体，将SAET蛋白基因构建至载体上，得到表达载体1；(2)将外膜蛋白OmpA的基因构建至表达载体1上SAET蛋白基因的上游，得到表达载体2；(3)将步骤(2)中所得表达载体2转化到宿主菌中，筛选SAET蛋白与外膜蛋白OmpA融合表达的重组菌，即为所述重组大肠杆菌。所述大肠杆菌在催化合成丙谷二肽中的应用。本发明生产成本低、操作步骤简单，利于其产业化应用。

Description

一种α-氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌 与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是指一种α-氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌与应用。
背景技术
丙谷二肽(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，Ala-Gln)因其热稳定性和高溶解度，在人体内能够水解产生L-Gln，发挥药理作用，在临床上被广泛用作L-Gln 的替代品。目前，合成丙谷二肽主要采用化学合成法、化学酶合成法和生物酶合成法。其中化学法合成丙谷二肽涉及有毒试剂、反应步骤复杂、伴随多种副产物等问题，化学酶法存在生产效率低等问题，不利于工业化生产应用。而生物酶法合成丙谷二肽因其绿色、高效、安全等特点具有良好的应用前景。
生物酶法中合成丙谷二肽活性最高的酶是Hirao等发现来源于Sphingobacterium siyangensis的α-氨基酸酯酰基转移酶(α-amino acid esteracyltransferase，SAET)，该酶催化L-Gln和L-丙氨酸甲酯为底物，直接合成丙谷二肽。SAET具有保守基序(GxSYxG，其中x为非保守氨基酸)，属于一种丝氨酸酶，其信号肽为前20个氨基酸，利于SAET的正确折叠并转运至周质空间发挥催化功能。而大肠杆菌胞内含有二肽降解相关酶包括氨基肽酶A、B、D、N等，同时周质空间内含有周质二肽转运蛋白体DppABCDEF，从而摄取并降解二肽底物。因此利用全细胞合成丙谷二肽时，易造成产物降解。
目前丙谷二肽转化率和生产效率有待进一步提高，这对于生物酶法合成丙谷二肽的产业化具有现实意义。传统的固定化酶技术便于反应后分离底物和产物，易于回收酶和重复利用，可批量连续操作。但对于胞内酶的固定化，首先需要进行酶的分离纯化操作，但该过程大大损伤酶的生物活性，也增加了工业化生产的步骤和成本。
发明内容
为了解决使用全细胞进行生物酶法催化合成丙谷二肽时，底物L-Gln和 L-丙氨酸甲酯盐酸盐需要进入细胞周质空间，在酶的催化作用下，生成丙谷二肽，转化率仍较低，有待进一步提高；另外使用经分离纯化处理过的酶液生产成本高、操作步骤复杂，不利于其产业化应用。
为了解决胞内酶能够回收重复利用，同时避免胞内酶的分离纯化操作，并且减少大肠杆菌肽酶等对二肽等产物的降解问题，因此采用细胞表面展示技术，将目标酶定位在细胞表面，在胞外即可催化L-Gln和L-丙氨酸甲酯一步合成丙谷二肽，从而提高底物转化率，并且仅需收集菌体即可重复使用、操作简单、生产成本低，本发明提供了一种α-氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌与应用。
一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是通过将SAET蛋白与外膜蛋白 OmpA融合表达得到。
在本发明的一个实施例中，所述SAET蛋白的编码基因的核苷酸序列如 SEQ IDNO.1所示。
在本发明的一个实施例中，所述外膜蛋白OmpA为外膜蛋白OmpA的第1-159个氨基酸片段。
在本发明的一个实施例中，所述外膜蛋白OmpA的第1-159个氨基酸片段的序列如SEQ ID NO.2所示。
一种所述重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)以pET30a质粒、pACYCDuet-1质粒或pET21a质粒为载体，将 SAET蛋白基因构建至载体上，得到表达载体1；
(2)将外膜蛋白OmpA的基因构建至表达载体1上SAET蛋白基因的上游，得到表达载体2；
(3)将步骤(2)中所得表达载体2转化到宿主菌中，筛选SAET蛋白与外膜蛋白OmpA融合表达的重组菌，即为所述重组大肠杆菌。
在本发明的一个实施例中，所述SAET蛋白和外膜蛋白OmpA以T7启动子、BAD启动子或rhaPBAD启动子进行启动表达。
在本发明的一个实施例中，所述大肠杆菌选自DH5α、JM109或BL21 菌株。
本发明还提供了所述的重组大肠杆菌在催化合成丙谷二肽中的应用。
在本发明的一个实施例中，所述催化合成丙谷二肽包括以下步骤：将所述重组大肠杆菌的重悬液与含谷氨酰胺底物溶液混合，在20-35℃中反应 20-50min。
在本发明的一个实施例中，所述催化合成丙谷二肽包括以下步骤：将所述重组大肠杆菌的重悬液与含谷氨酰胺底物溶液混合在27℃反应40min。
在本发明的一个实施例中，所述含谷氨酰胺底物溶液为谷氨酰胺与丙氨酸甲酯盐酸盐混合得到的混合溶液，pH值为7.0-9.5。
在本发明的一个实施例中，所述含谷氨酰胺底物溶液为谷氨酰胺与丙氨酸甲酯盐酸盐混合得到的混合溶液的pH值为8.5。
本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
为了解决胞内酶能够回收重复利用，同时避免胞内酶的分离纯化操作，并且减少大肠杆菌肽酶等对二肽等产物的降解问题，因此采用细胞表面展示技术，将目标酶定位在细胞表面，在胞外即可催化L-Gln和L-丙氨酸甲酯一步合成丙谷二肽，从而提高底物转化率，并且仅需收集菌体即可重复使用、操作简单、生产成本低。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
图1是本发明pACYCDuet-PBAD-saet表达质粒图谱；
图2是本发明pACYCDuet-PBAD-ompA-saet表达质粒图谱；
图3是本发明大肠杆菌SAET表面展示系统的示意图；
图4是本发明使用HPLC在波长为338nm处检测丙谷二肽标准品的出峰图谱；
图5是本发明使用HPLC测定绘制丙谷二肽浓度的标准曲线；
图6是本发明pACYCDuet-PBAD-ompA-saet菌株在不同诱导条件下表达的SAET催化合成丙谷二肽的浓度；
图7是本发明在相同条件下，pACYCDuet-PBAD-saet菌株与 pACYCDuet-PBAD-ompA-saet菌株转化率和合成丙谷二肽产量的比较。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明构建的重组大肠杆菌，是通过将SAET蛋白与外膜蛋白OmpA 融合表达得到；所述SAET蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示。所述外膜蛋白OmpA为外膜蛋白OmpA的第1-159个氨基酸片段。所述外膜蛋白OmpA的第1-159个氨基酸片段的序列如SEQID NO.2所示。
重组大肠杆菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)以pET30a质粒、pACYCDuet-1质粒或pET21a质粒为载体，将 SAET蛋白基因构建至载体上，得到表达载体1；所述SAET蛋白和外膜蛋白OmpA以T7启动子、BAD启动子或rhaPBAD启动子进行启动表达。
(2)将外膜蛋白OmpA的基因构建至表达载体1上SAET蛋白基因的上游，得到表达载体2；
(3)将步骤(2)中所得表达载体2转化到宿主菌中，筛选SAET蛋白与外膜蛋白OmpA融合表达的重组菌，即为所述重组大肠杆菌。
所述大肠杆菌选自DH5α、JM109或BL21菌株。
本发明还提供了所述的重组大肠杆菌在催化合成丙谷二肽中的应用。
具体催化合成丙谷二肽的步骤为：将所述重组大肠杆菌的重悬液与含谷氨酰胺底物溶液混合，在20-35℃中反应20-50min。优选的，在27℃反应 40min。
所述含谷氨酰胺底物溶液为谷氨酰胺与丙氨酸甲酯盐酸盐混合得到的混合溶液，pH值为7.0-9.5；优选的，pH值为8.5。
本发明通过构建SAET表面展示系统，使SAET表达在大肠杆菌细胞外膜表面，减少大肠杆菌胞内二肽酶对产物丙谷二肽的降解。
实施例1：SAET表面展示系统的构建
pACYCDuet-PBAD-saet质粒的构建：
1.引物设计：
1-F：
TTACATTAATTGCGTTGCGCTTATGACAACTTGACGGCTACATCATTC AC
1-R：
GTTAAACAAAATTATTTCTACAGGATGGAGAAACAGTAGAGAGTTG CG
2-F：
CCTGTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAATAAGGAGATATACC
2-R：
GCGCAACGCAATTAATGTAAGTTAGC
3-F：
GTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGAAAAACACCATCAGCTGC C
3-R：
TTAATCTTTCAGCACGCTGAATTCAATG
4-F：
TCAGCGTGCTGAAAGATTAATGCTTAAGTCGAACAGAAAGTAATCG TATTG
4-R：
CATGGTATATCTCCTTATTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTACAG
2、常规PCR扩增pACYCDuet-1载体、阿拉伯糖调节蛋白及BAD启动子片段以及SAET基因片段：用1-F/1-R扩增阿拉伯糖调节蛋白及BAD启动子片段，用引物2-F/2-R扩增pACYCDuet-1载体片段。
3、用Gibson组装将2中扩增获得的pACYCDuet-1载体与阿拉伯糖调节蛋白及BAD启动子片段进行同源重组，获得pACYCDuet-PBAD质粒。
4、使用引物3-F/3-R对SAET基因进行扩增，使用引物4-F/4-R扩增 pACYCDuet-PBAD载体片段。
5、用Gibson组装将4中扩增获得的pACYCDuet-PBAD载体片段与SAET 基因片段进行同源重组，获得pACYCDuet-PBAD-saet质粒(图1)。
pACYC-PBAD-ompA-saet质粒的构建：
1.引物设计：
5-F：
TGTTTAACTTTAATAAGGAGATATACCATGAAAAAGACAGCTATCGCGAT TG
5-R：
ACCCGATCCACCTGAGCC
6-F：
GCTCAGGTGGATCGGGTGATGAAAAACACCATCAGCTGCC
6-R：
CATGGTATATCTCCTTATTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTACAG
1、常规PCR分别扩增pACYCDuet-PBAD-saet载体、OmpA外膜蛋白(1-159 个氨基酸)基因片段(C末端带有GSG linker)：用引物6-F/6-R对质粒 pACYCDuet-PBAD-saet进行PCR，用引物5-F/5-R扩增OmpA外膜蛋白(1-159 个氨基酸)基因片段。
2、通过将1中扩增获得的pACYCDuet-PBAD-saet载体片段与OmpA外膜蛋白(1-159个氨基酸)基因片段进行Gibson组装，获得 pACYCDuet-PBAD-ompA-saet质粒(图2)。
实施例2：SAET表面展示系统诱导条件的优化
1、SAET表面展示系统的诱导表达：将测序验证正确的 pACYCDuet-PBAD-ompA-saet质粒转化E.coli BL21(DE3)，挑取单菌落至含有 20mL液体LB的三角瓶(规格250mL)中，37℃、220r/min过夜培养。次日转接1％的重组菌种子液至含50μg/mL氯霉素的50mL液体S发酵培养基，于37℃、220rpm条件下培养OD600达到2.0～2.5时，向培养物中加入阿拉伯糖(1g/L)以诱导蛋白质表达，并将温度调节至16℃以避免包涵体的形成，于振荡培养箱培养12h。通过融合外膜蛋白OMPA，SAET蛋白成功在大肠杆菌细胞表面上表达(图3)。
2、诱导条件的优化：37℃、220rpm条件下培养OD600达到2.0～2.5后于不同温度(20℃、25℃、30℃)诱导，分别加入不同终浓度的诱导剂-阿拉伯糖(1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L)，进行12h的诱导，探究诱导剂浓度及温度对重组酶表达量的影响。
3、催化合成丙谷二肽的反应：取2所得1mL发酵液12000r/min离心2 min，弃去上清，使用pH为7.0的磷酸盐缓冲液洗涤细胞后，使细胞重悬。向1mL的底物溶液(含480mM谷氨酰胺、600mM丙氨酸甲酯盐酸盐，pH 8.5)，添加0.1mL的细胞重悬液，在27℃条件下反应40min，反应结束后立即添加等体积的磷酸溶液(1.7％，V/V)终止反应。
4、使用HPLC测定丙谷二肽浓度：取3中得到的反应液进行HPLC检测。丙谷二肽浓度使用高效液相色谱系统(Waters Corporation,USA)和紫外检测器(Waters 2487)338nm处测定(图4)。检测时的色谱条件：C18柱(Hypersil ODS 4.6mm×250mm，5μm)，柱温50℃，进样体积2μL，流速1.6mL/min。流动相A为：12.5mmol/L Na2HPO4·12H2O，12.5mM Na2B4O7·10H2O(pH 8.2)，流动相B为：甲醇：乙腈：水＝45：45：10。配置不同浓度的丙谷二肽溶液，在试管中配置10g/L的丙谷二肽溶液，加入蒸馏水将其稀释为2.0、1.5、 1.0、0.5g/L。以丙谷二肽含量(g/L)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制丙谷二肽浓度标准曲线(图5)。
5、如图6所示，在诱导条件为20℃、1.5g/L的阿拉伯糖时， pACYCDuet-PBAD-ompA-saet菌株的SAET表达量可达到最高，此时可催化得到丙谷二肽产物的浓度最高。
实施例3：丙谷二肽的合成应用
以含有pACYCDuet-PBAD-saet质粒的E.coliBL21(DE3)菌株作为对照，以含有pACYCDuet-PBAD-ompA-saet质粒的E.coli BL21(DE3)菌株为实验组，进行摇瓶发酵，诱导剂浓度为1.5g/L，诱导剂温度为20℃，其它摇瓶发酵条件保持不变。发酵结束后，各取0.1mL的细胞重悬液进行丙谷二肽的催化合成反应，并对反应液利用HPLC检测反应体系中丙谷二肽的含量。
如图7所示，相同条件下SAET表面展示系统表达菌株催化合成丙谷二肽的产量与对照组相比提高了173.8％，达到82.7g/L，相对于谷氨酰胺的转化率达到79.3％，生产效率为2.068g/(L·min)。表明通过表面展示系统能够将SAET表达在细胞外膜表面，有利于SAET直接在胞外发挥催化作用，减少胞内降解，同时不需要分离纯化，直接离心收集即可实现重复利用，可实现转化效率和生产率的提高。因此可作为一种用于高效生产丙谷二肽的方法。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQ ID NO.1
ATGAAAAACACCATCAGCTGCCTGACCCTGGCGCTGCTGAGCGCGA GCCAGCTGCACGCCCAGACCGCGGCGGACAGCGCGTACGTTCGTGATC ACTACGAAAAAACTGAAGTTGCAATCCCGATGCGTGATGGTAAAAAACTGTTCACCGCGATCTATAGCCCGAAAGATAAATCTAAAAAATACCCGGTGC TGCTGAACCGTACCCCGTACACCGTTTCTCCGTACGGTCAGAACGAATAT AAAAAATCCCTGGGTAACTTCCCGCAGATGATGCGTGAAGGCTACATCTTCGTTTACCAGGATGTTCGCGGCAAATGGATGTCTGAAGGCGACTTTGA GGACATCCGTCCGACCACCTATTCTAAAGATAAAAAAGCGATCGACGAA TCCACCGATACCTACGATGCACTGGAATGGCTGCAGAAAAACCTGAAAA ACTACAACGGCAAAGCGGGTCTGTATGGTATTTCGTATCCGGGTTTCTAT AGCACCGTGGGTCTGGTTAAAACCCACCCGAGCCTGAAAGCTGTGAGC CCGCAGGCGCCGGTAACCGATTGGTACATTGGTGATGATTTCCACCACA ACGGCGTGCTGTTCCTGCAGGATGCATTCACCTTCATGAGCACCTTCGG CGTGCCGCGTCCGAAACCGATCACCCCGGATCAGTTCAAAGGTAAAATC CAGATTAAAGAAGCAGACAAATACAACTTCTTCGCAGAAGCGGGCACC GCGCGCGAACTGAAAGAAAAATACTTCGGTGACTCTGTGCAGTTCTGG AACGACCTGTTTAAACACCCGGACTATGATGACTTCTGGAAAAGCCGCG TTATCACCAACTCTCTGCAGGAAGTGAAACCGGCGGTTATGGTTGTAGG CGGCTTTTTCGATGCAGAAGATGCTTACGGCACCTTTAAAACTTACCAGT CTATTGAAGATAAATCCAAAAAGAACAACTCCATCCTGGTTGCGGGTCC GTGGTACCACGGCGGTTGGGTTCGTGCTGAAGGTAACTATCTGGGCGAT ATCCAGTTCGAAAAGAAAACCTCCATTACCTACCAGGAACAGTTCGAGC AGCCGTTCTTCAAATACTACCTGAAAGACGAAGGTAACTTCGCGCCGTC CGAAGCGAACATTTTCGTTAGCGGTAGCAACGAATGGAAACACTTCGAA CAGTGGCCGCCGAAAAACGTTGAAACCAAAAAACTGTACTTCCAGCCG CAGGGCAAACTGGGTTTCGATAAGGTGCAGCGTACCGATAGCTGGGATG AATATGTTACTGACCCGAACAAACCGGTTCCGCATCAGGGTGGTCTGAT CCAGAACCGCACCCGTGAATACATGGTTGATGACCAGCGTTTCGCTGCG AGCCGCCCGGACGTGATGGTTTACCAGACCGAACCGCTGACCGAAGAT CTGACCATCGTTGGTCCGATTAAAAACTTCCTGAAAGTTTCCAGCACCG GCACTGACGCGGATTATGTTGTGAAACTGATCGATGTTTACCCGAACGAT GCGGCAAGCTACCAGGGTAAAACCATGGCGGGCTACCAGATGATGGTGC GCGGTGAAATCATGGCGGGTAAATATCGTAACGGCTTCGATAAAGCACA GGCGCTGACTCCGGGCATGGTTGAAAAAGTTAACTTCGAAATGCCGGAT GTTGCGCACACCTTCAAAAAAGGCCACCGCATTATGGTTCAGGTGCAGA ACTCCTGGTTCCCGCTGGCAGAACGCAACCCGCAGGTCTTTCTGGCTCC GTACACCGCAACCAAAGCAGATTTCCGTAAAGCTACCCAGCGTATCTTC CACGATGTGAACAACGCGACCTACATTGAATTCAGCGTGCTGAAAGATTAA
SEQ ID NO.2
MKKTAIAIAVALAGFATVAQAAPKDNTWYTGAKLGWSQYHDTGFINN NGPTHENQLGAGAFGGYQVNPYVGFEMGYDWLGRMPYKGSVENGAYKA QGVQLTAKLGYPITDDLDIYTRLGGMVWRADTKSNVYGKNHDTGVSPVF AGGVEYAITPEIATR
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种α-氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌与应用
<130> 2
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1860
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
atgaaaaaca ccatcagctg cctgaccctg gcgctgctga gcgcgagcca gctgcacgcc 60
cagaccgcgg cggacagcgc gtacgttcgt gatcactacg aaaaaactga agttgcaatc 120
ccgatgcgtg atggtaaaaa actgttcacc gcgatctata gcccgaaaga taaatctaaa 180
aaatacccgg tgctgctgaa ccgtaccccg tacaccgttt ctccgtacgg tcagaacgaa 240
tataaaaaat ccctgggtaa cttcccgcag atgatgcgtg aaggctacat cttcgtttac 300
caggatgttc gcggcaaatg gatgtctgaa ggcgactttg aggacatccg tccgaccacc 360
tattctaaag ataaaaaagc gatcgacgaa tccaccgata cctacgatgc actggaatgg 420
ctgcagaaaa acctgaaaaa ctacaacggc aaagcgggtc tgtatggtat ttcgtatccg 480
ggtttctata gcaccgtggg tctggttaaa acccacccga gcctgaaagc tgtgagcccg 540
caggcgccgg taaccgattg gtacattggt gatgatttcc accacaacgg cgtgctgttc 600
ctgcaggatg cattcacctt catgagcacc ttcggcgtgc cgcgtccgaa accgatcacc 660
ccggatcagt tcaaaggtaa aatccagatt aaagaagcag acaaatacaa cttcttcgca 720
gaagcgggca ccgcgcgcga actgaaagaa aaatacttcg gtgactctgt gcagttctgg 780
aacgacctgt ttaaacaccc ggactatgat gacttctgga aaagccgcgt tatcaccaac 840
tctctgcagg aagtgaaacc ggcggttatg gttgtaggcg gctttttcga tgcagaagat 900
gcttacggca cctttaaaac ttaccagtct attgaagata aatccaaaaa gaacaactcc 960
atcctggttg cgggtccgtg gtaccacggc ggttgggttc gtgctgaagg taactatctg 1020
ggcgatatcc agttcgaaaa gaaaacctcc attacctacc aggaacagtt cgagcagccg 1080
ttcttcaaat actacctgaa agacgaaggt aacttcgcgc cgtccgaagc gaacattttc 1140
gttagcggta gcaacgaatg gaaacacttc gaacagtggc cgccgaaaaa cgttgaaacc 1200
aaaaaactgt acttccagcc gcagggcaaa ctgggtttcg ataaggtgca gcgtaccgat 1260
agctgggatg aatatgttac tgacccgaac aaaccggttc cgcatcaggg tggtctgatc 1320
cagaaccgca cccgtgaata catggttgat gaccagcgtt tcgctgcgag ccgcccggac 1380
gtgatggttt accagaccga accgctgacc gaagatctga ccatcgttgg tccgattaaa 1440
aacttcctga aagtttccag caccggcact gacgcggatt atgttgtgaa actgatcgat 1500
gtttacccga acgatgcggc aagctaccag ggtaaaacca tggcgggcta ccagatgatg 1560
gtgcgcggtg aaatcatggc gggtaaatat cgtaacggct tcgataaagc acaggcgctg 1620
actccgggca tggttgaaaa agttaacttc gaaatgccgg atgttgcgca caccttcaaa 1680
aaaggccacc gcattatggt tcaggtgcag aactcctggt tcccgctggc agaacgcaac 1740
ccgcaggtct ttctggctcc gtacaccgca accaaagcag atttccgtaa agctacccag 1800
cgtatcttcc acgatgtgaa caacgcgacc tacattgaat tcagcgtgct gaaagattaa 1860
<210> 2
<211> 159
<212> PRT
<213> （人工合成）
<400> 2
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp Tyr Thr Gly Ala
20 25 30
Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe Ile Asn Asn Asn
35 40 45
Gly Pro Thr His Glu Asn Gln Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr
50 55 60
Gln Val Asn Pro Tyr Val Gly Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly
65 70 75 80
Arg Met Pro Tyr Lys Gly Ser Val Glu Asn Gly Ala Tyr Lys Ala Gln
85 90 95
Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys Leu Gly Tyr Pro Ile Thr Asp Asp Leu
100 105 110
Asp Ile Tyr Thr Arg Leu Gly Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Thr Lys
115 120 125
Ser Asn Val Tyr Gly Lys Asn His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe
130 135 140
Ala Gly Gly Val Glu Tyr Ala Ile Thr Pro Glu Ile Ala Thr Arg
145 150 155

Claims (7)

1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌是通过将SAET蛋白与外膜蛋白OmpA融合表达得到，将OmpA基因构建在SAET蛋白基因上游；所述SAET蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述外膜蛋白OmpA为外膜蛋白OmpA的第1-159个氨基酸片段；所述外膜蛋白OmpA的第1-159个氨基酸片段的序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种权利要求1中所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)以pET30a质粒、pACYCDuet-1质粒或pET21a质粒为载体，将SAET蛋白基因构建至载体上，得到表达载体1；
(2)将外膜蛋白OmpA的基因构建至表达载体1上SAET蛋白基因的上游，得到表达载体2；
(3)将步骤(2)中所得表达载体2转化到宿主菌中，筛选SAET蛋白与外膜蛋白OmpA融合表达的重组菌，即为所述重组大肠杆菌；
所述SAET蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述外膜蛋白OmpA为外膜蛋白OmpA的第1-159个氨基酸片段；所述外膜蛋白OmpA的第1-159个氨基酸片段的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述SAET蛋白和外膜蛋白OmpA融合表达，并以T7启动子、BAD启动子或rhaPBAD启动子进行启动。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述大肠杆菌选自DH5α、JM109或BL21菌株。
5.如权利要求1所述的重组大肠杆菌在催化合成丙谷二肽中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述催化合成丙谷二肽包括以下步骤：将所述重组大肠杆菌的重悬液与含谷氨酰胺底物溶液混合，在20-35℃中反应20-50min。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述含谷氨酰胺底物溶液为谷氨酰胺与丙氨酸甲酯盐酸盐混合得到的混合溶液，pH值为7.0-9.5。
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