CN116286567B - 一株产α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠埃希氏菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一株产α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠埃希氏菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产α‑氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠埃希氏菌及其构建方法和应用，涉及生物技术领域。该重组大肠埃希氏菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2022年8月19日，保藏编号CGMCCNo.25553。本发明构建得到了一株产α‑氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠埃希氏菌，该菌株生产的α‑氨基酸酯酰基转移酶，可用于合成丙酪二肽，转化率最高可以达到63.8％。

Description

一株产α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠埃希氏菌及其构建 方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一株产α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠埃希氏菌及其构建方法和应用。
背景技术
酪氨酸是维持细胞生长必备的氨基酸之一，特别在皮肤色素合成过程中起至关重要的作用，但其溶解度极差(0.4g/L)。含酪氨酸的二肽溶解度有很大的改善，并增加很多活性功能，尤其是营养作用、抗氧化活性和潜在的治疗白癜风功能备受关注。其中，最受关注的是L-丙氨酰-L-酪氨酸(L-alanyl-L-tyrosine，Ala-Tyr)，简称丙酪二肽，是由L-丙氨酸和L-酪氨酸脱水缩合形成的二肽，其分子式为C12H16N2O4，分子量为252.27，丙酪二肽具有很好的水溶性(14g/L，20℃)，在体内能够迅速地分解为L-酪氨酸和L-丙氨酸，能迅速补充机体需要的酪氨酸，克服了L-酪氨酸溶解度低的缺点。目前丙酪二肽的生产均采用固相化学合成工艺，工序复杂、得率低、高能耗、高污染，且没有产业化，迫切需要进行产业升级，开发出有自主知识产权、绿色高效的生物酶法二肽生产工艺，以满足市场的需要。
相比于化学合成法，利用酶法或全细胞法生产丙酪二肽有如下优势：(1)生产条件为常温常压，不使用有毒有害的有机溶剂，绿色环保；(2)得率高，比化学合成法提高10％以上；(3)副产物降低，为后继产品精制提供了便利；(4)工序简单，由多步变为一步，生产成本降低，产业化优势明显。目前尚未见酶法或全细胞法制备丙酪二肽的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株产α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠埃希氏菌及其构建方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明构建的重组大肠埃希氏菌可以生产α-氨基酸酯酰基转移酶，利用该酶催化合成丙酪二肽，转化率最高可以达到63.8％。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一株产α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠埃希氏菌，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2022年8月19日，保藏编号CGMCC No.25553。
本发明还提供一种上述的重组大肠埃希氏菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)将酯酰基转移酶基因连接到表达载体上构建得到重组质粒；所述酯酰基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)所述重组质粒转化到感受态大肠杆菌中，经过筛选和验证后，得到所述重组大肠埃希氏菌。
进一步地，在步骤(1)中，所述表达载体为pET-28a-(+)。
进一步地，在步骤(2)中，所述感受态大肠杆菌为感受态大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还提供一种α-氨基酸酯酰基转移酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供一种α-氨基酸酯酰基转移酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供上述的重组大肠埃希氏菌或编码基因在制备α-氨基酸酯酰基转移酶中的应用。
本发明还提供上述的重组大肠埃希氏菌、编码基因或α-氨基酸酯酰基转移酶在合成丙酪二肽中的应用。
本发明还提供一种利用酶法生产丙酪二肽的方法，包括：以丙氨酸甲酯盐酸盐和酪氨酸为底物，利用上述的α-氨基酸酯酰基转移酶进行催化反应，制备得到所述丙酪二肽。
本发明还提供一种利用全细胞法生产丙酪二肽的方法，包括：以丙氨酸甲酯盐酸盐和酪氨酸为底物，利用上述的重组大肠埃希氏菌的全细胞进行催化反应，制备得到所述丙酪二肽。
本发明公开了以下技术效果：
本发明构建得到了一株产α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠埃希氏菌SAET-SG01，该菌株生产的α-氨基酸酯酰基转移酶，可用于合成丙酪二肽，转化率最高可以达到63.8％。
本发明开公开了利用酶法或全细胞法生产丙酪二肽的方法，整个催化反应在常温常压下进行，环境友好；不使用有毒有害的有机溶剂，减少了环境污染；整个催化过程为一步反应，转化率高，纯化步骤简洁，工序简单，更好的节约了生产成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pET28a-SAET-SG01重组质粒的构建示意图；
图2为利用基因工程菌SAET-SG01生成的α-氨基酸酯酰基转移酶催化合成丙酪二肽的过程；
图3为实施例6纯化的丙酪二肽的核磁碳谱图；
图4为实施例6纯化的丙酪二肽核磁氢谱图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
以下实施例或对比例中：大肠杆菌DH5α，大肠杆菌BL21(DE3)购自全式金生物公司；载体pET-28a-(+)购自Novagen公司。
S培养基中各组分及浓度为：甘油5g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母浸膏20g/L，Na2HPO4·12H2O 11.819g/L，NaH2PO4·2H2O 18.25g/L，MgSO41g/L。
酶活的具体测定方法为：用硼酸缓冲液配置10mL含100mmol/L的AlaOMe.HCl和50mmol/LTyr，用NaOH将pH调到9.5，加入1mL的酶液，于30℃水浴1h，吸取500μL反应液，加入500μL的1.7％(v/v)H3PO4，通过高效液相检测丙酪二肽的浓度，在30℃下，1mL底物反应液中每小时催化底物产生0.1mg丙酪二肽所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
实施例1
从NCBI中寻找多条α-氨基酸酯酰基转移酶基因，比对后选择鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium.sp)基因(GenBank:AB610978.1)为模板，经密码子优化后合成基因SAET，根据SAET基因序列和载体pET-28a-(+)的序列，借助Primer Primer 5软件设计合成引物1(正向引物SEQ ID NO.2：5'-CGGGGATCCATGAAGAACACCATCTCCTG-3'，反向引物SEQ IDNO.3：5'-CCCAAGCTTATCTTTCAGAACAGAAAATTC-3')；通过PCR扩增技术，得到含BamH I和HindIII酶切位点截短后的基因克隆片段SAET-QC01(SEQ ID NO.11)；将上述的基因克隆片段SAET-QC01用BamH I和Hind III双酶切，酶切产物连接到载体pET-28a-(+)的双酶切位点上构建得到pET-28a-(+)/SAET重组质粒之后导入大肠杆菌DH5α中克隆，提取质粒，以此质粒为模板，利用引物1-1(正向引物SEQ ID NO.4：5'-GCTTTGATAAAGGGCAGGCCCTGACG-3'，反向引物SEQ ID NO.5：5'-CGTCAGGGCCTGCCCTTTATCAAAGC-3')以及Pfu DNA聚合酶进行重叠延伸PCR，得到重组质粒pET-28a-(+)/SAET-1，实现537位点的突变，导入大肠杆菌DH5α中克隆，提取质粒。以此质粒为模板，以引物1-2(正向引物SEQ ID NO.7：5'-TACTTACTCTTACGACAAAAAAGCCATCGACG-3'，反向引物SEQ ID NO.8：5'-CTTTTTTGTCGTAAGAGTAAGTAGTCGGACGG-3')、1-3(正向引物SEQ ID NO.9：5'-AGAAGTGAAAACTGCAGTGATGGTGGTTGG-3'，反向引物SEQID NO.10：5'-CCATCACTGCAGTTTTCACTTCTTGCAGGGAGT-3')为引物，按照同样的步骤，迭加123、287位点的突变，获得三个位点都突变的重组质粒pET-28a-(+)/SAET-SG01(即SAET-QC01突变为SAET-SG01)，导入大肠杆菌DH5α中克隆，提取该质粒，测序验证后，转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，经过卡那霉素抗性筛选，获得α-氨基酸酯酰基转移酶重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28a-(+)-SAET-SG01，菌株编号SAET-SG01，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2022年8月19日，保藏编号CGMCC No.25553。(构建过程如图1所示)。
SAET-SG01(SEQ ID NO.1)的核苷酸序列：
atgaagaacaccatctcctgcctgacgctggctctgctgtctgcatctcaactgcatgcacaaaccgctgcagattctgcttacgttcgtgatcattacgaaaagactgaggtcgcaatccctatgcgtgacggtaaaaagctgttcactgcaatctacagcccaaaggataagtccaagaagtacccagtcctgctgaaccgtaccccttacactgtctctccatacggtcagaacgagtacaagaaatccctgggtaacttccctcaaatgatgcgtgagggctacatcttcgtttaccaggacgtccgtggtaaatggatgagcgagggtgatttcgaggatatccgtccgactacttactcttacgacaaaaaagccatcgacgagagcacggacacctacgacgcactggagtggctgcagaagaatctgaaaaactacaacggcaaagctggtctgtatggcatcgcttacccaggtttctatagcaccgtcggtctggtaaaaacccacccatctctgaaagcagtgtctccacaggctccggtaactgattggtacatcggtgatgattttcaccataatggcgtcctgtttctgcaggacgcattcaccttcatgagcactttcggtgtgccgcgtccgaaaccgattactccggatcaatttaaaggtaaaatccagatcaaagaagccgacaaatacaacttcttcgcggaagcgggcaccgcacgtgaactgaaagaaaaatacttcggcgactccgtgcagttctggaacgacctgttcaaacacccggactacgacgacttctggaaatcccgtgtgatcactaactccctgcaagaagtgaaaactgcagtgatggtggttggtggtttcttcgctgctgaagatgcttacggcactttcaagacttaccagtctatcgaagataaaccgaaaaagaacaactccatcctggtggcgggtccttggtacgctggcggttgggtgggtgcggaaggtaattatctgggtgatatccagttcgaaaagaaaacgagcattacgtaccaggaacagttcgagcagccgttcttcaaatactacctgaaagacgaaggcaacttcgccccgtccgaagctaacattttcgtgagcggcagcaacgaatggaaacacttcgaacagtggccgccgaaaaacgtagaaaccaaaaaactgtatttccagccgcagggtaaactgggctttgacaaagtacagcgcaccgactcctgggacgaatacgtaaccgacccgaacaaaccggttccgcatcaaggtggtctgattcagaaccgcacccgtgaatatatggtagacgatcagcgttttgctgcttctcgtccggatgtaatggtttatcagacggaaccgctgactgaagacctgaccattgttggtccgatcaaaaacttcctgaaagtttccagcccgggtaccgacgcggattatgtggttaaactgatcgacgtttatccgaacgacgctgcgtcttatcagggcaaaaccatggccggctatcagatgatggttcgtggcgaaattatggcgggcaaatatcgcaacggctttgataaagggcaggccctgacgccgggcatggttgaaaaagtaaattttgaaatgccggatgttgcgcacaccttcaaaaaaggccaccgcatcatggttcaggttcagaactcttggttcccgctggcggaacgcaatccgcaggtttttctggcgccgtataccgcgaccaaagcggattttcgcaaagccacccagcgcatttttcacgatgttaacaacgccacctatattgaattttctgttctgaaagataagctt。
实施例2重组大肠杆菌SAET-SG01的表达
将重组大肠杆菌SAET-SG01接种到含40μg/mL卡那霉素的50mL LB培养基中，转速250r/min，40℃培养8h，吸取2mL菌液加入至200mL S培养基中，转速250r/min，37℃培养，当菌浓度OD600达到1.5时，加入浓度为0.6mmol/mL IPTG诱导剂，25℃发酵诱导6h；0℃下，6000r/min离心12min，倒去上清，加入蒸馏水振荡清洗，再次离心，收集菌体，加入生理盐水悬浮制备得菌体浓度为0.1g/mL的活细胞体系，酶活达909U/mL，向上述离心所得菌体中加入pH值为9.0的硼酸缓冲液震荡摇匀，外加冰水浴，超声破碎后15min，离心分离，取其上清液即得粗酶液，酶活达946U/mL。
实施例3
将基因工程菌SAET-SG01接种到含60μg/mL卡那霉素的50mL LB培养基中，转速250r/min，35℃培养15h，吸取2mL菌液加入至200mL S培养基中，转速250r/min，37℃培养，当菌浓度OD600达到2.5时，加入浓度为1mmol/mL IPTG诱导剂，25℃发酵诱导12h；0℃下，6000r/min离心15min，倒去上清，加入蒸馏水振荡清洗，再次离心，收集菌体，加入生理盐水悬浮制备得菌体浓度为0.1g/mL的活细胞体系，酶活达905U/mL。向上述离心所得菌体中加入pH值为9.0的硼酸缓冲液震荡摇匀，外加冰水浴，超声破碎后15min，离心分离，取其上清液即得粗酶液，酶活达940U/mL。
重组大肠杆菌SAET-SG01表达的α-氨基酸酯酰基转移酶的氨基酸序列(SEQ IDNO.6)如下：
MKNTISCLTLALLSASQLHAQTAADSAYVRDHYEKTEVAIPMRDGKKLFTAIYSPKDKSKKYPVLLNRTPYTVSPYGQNEYKKSLGNFPQMMREGYIFVYQDVRGKWMSEGDFEDIRPTTYSYDKKAIDESTDTYDALEWLQKNLKNYNGKAGLYGIAYPGFYSTVGLVKTHPSLKAVSPQAPVTDWYIGDDFHHNGVLFLQDAFTFMSTFGVPRPKPITPDQFKGKIQIKEADKYNFFAEAGTARELKEKYFGDSVQFWNDLFKHPDYDDFWKSRVITNSLQEVKTAVMVVGGFFAAEDAYGTFKTYQSIEDKPKKNNSILVAGPWYAGGWVRAEGNYLGDIQFEKKTSITYQEQFEQPFFKYYLKDEGNFAPSEANIFVSGSNEWKHFEQWPPKNVETKKLYFQPQGKLGFDKVQRTDSWDEYVTDPNKPVPHQGGLIQNRTREYMVDDQRFAASRPDVMVYQTEPLTEDLTIVGPIKNFLKVSSPGTDADYVVKLIDVYPNDAASYQGKTMAGYQMMVRGEIMAGKYRNGFDKGQALTPGMVEKVNFEMPDVAHTFKKGHRIMVQVQNSWFPLAERNPQVFLAPYTATKADFRKATQRIFHDVNNATYIEFSVLKDKL。
实施例4基因工程菌SAET-SG01全细胞制备丙酪二肽的方法
取用低共熔溶剂-硼酸缓冲液(低共融溶剂含水量为15％v/v)配制10mL的100mm/L丙氨酸甲酯盐酸盐溶液，之后在搅拌的状态下加入实施例2制备得到的活细胞体系(使酶在反应体系中的酶活为700U/mL)后，立即加入用低共熔溶剂-硼酸(低共融溶剂含水量为15％v/v)缓冲液配制的10mL的50mm/L酪氨酸溶液，于30℃下搅拌反应10min，催化获得丙酪二肽(催化合成过程见图2)，转化率为60％。
低共熔溶剂-硼酸(低共融溶剂含水量为15％v/v)缓冲液的配制：氯化胆碱和尿素按摩尔比1:2在120℃下混合2h制备低共熔溶剂DESs)，制得的DESs在70℃真空下预干燥48h后使用。
选用摩尔比为氯化胆碱：甘油＝1：2或氯化胆碱：山梨醇＝1：1的低共熔溶剂配制低共熔溶剂-硼酸(低共融溶剂含水量为15％v/v)缓冲液，可达相同效果。
实施例5
取用低共熔溶剂-硼酸(低共融溶剂含水量为15％v/v)缓冲液(配制方法同实施例4)配制10mL的100mm/L丙氨酸甲酯盐酸盐溶液，在搅拌的状态下加入实施例3制备得到的粗酶液(使酶在反应体系中的酶活为700U/mL)后，立即加入用低共熔溶剂-硼酸(低共融溶剂含水量为15％v/v)缓冲液配制的10mL的50mm/L酪氨酸溶液，于30℃(30～35℃可达相同效果)下搅拌反应10min，催化获得丙酪二肽，转化率为63.8％。
实施例6
取实施例3催化获得的反应液将置于65℃下30min终止反应，过滤除去蛋白沉淀；向滤液中投入20g活性炭搅拌10min，过滤；将滤液在旋蒸仪上浓缩至三分之一后加入体积分数为2.5％的盐酸于65℃加热搅拌30min，加入3倍体积的无水乙醇后旋蒸浓缩至三分之一，过滤除去部分酪氨酸，50℃下加入5倍体积的甲醇，逐渐降温至10℃(5-10℃可达相同效果)，结晶4h，离心过滤后烘干得到精制丙酪二肽，纯度96.8％，核磁碳谱图见图3，核磁氢谱图见图4。
对比例1
同实施例5，区别仅在于，将实施例3制备得到的粗酶液替换为以下方法制备得到的粗酶液：
利用SAET-QC基因，构建得到重组大肠杆菌SAET-QC01，之后发酵表达α-氨基酸酯酰基转移酶，得到粗酶液，酶活720U/mL(构建方法和产酶发酵方法参考专利文献CN107603936A)。其中，SAET-QC01基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.11)如下：
atgaagaacaccatctcctgcctgacgctggctctgctgtctgcatctcaactgcatgcacaaaccgctgcagattctgcttacgttcgtgatcattacgaaaagactgaggtcgcaatccctatgcgtgacggtaaaaagctgttcactgcaatctacagcccaaaggataagtccaagaagtacccagtcctgctgaaccgtaccccttacactgtctctccatacggtcagaacgagtacaagaaatccctgggtaacttccctcaaatgatgcgtgagggctacatcttcgtttaccaggacgtccgtggtaaatggatgagcgagggtgatttcgaggatatccgtccgactacttactctaaagacaaaaaagccatcgacgagagcacggacacctacgacgcactggagtggctgcagaagaatctgaaaaactacaacggcaaagctggtctgtatggcatcgcttacccaggtttctatagcaccgtcggtctggtaaaaacccacccatctctgaaagcagtgtctccacaggctccggtaactgattggtacatcggtgatgattttcaccataatggcgtcctgtttctgcaggacgcattcaccttcatgagcactttcggtgtgccgcgtccgaaaccgattactccggatcaatttaaaggtaaaatccagatcaaagaagccgacaaatacaacttcttcgcggaagcgggcaccgcacgtgaactgaaagaaaaatacttcggcgactccgtgcagttctggaacgacctgttcaaacacccggactacgacgacttctggaaatcccgtgtgatcactaactccctgcaagaagtgaaaccggcagtgatggtggttggtggtttcttcgctgctgaagatgcttacggcactttcaagacttaccagtctatcgaagataaaccgaaaaagaacaactccatcctggtggcgggtccttggtacgctggcggttgggtgggtgcggaaggtaattatctgggtgatatccagttcgaaaagaaaacgagcattacgtaccaggaacagttcgagcagccgttcttcaaatactacctgaaagacgaaggcaacttcgccccgtccgaagctaacattttcgtgagcggcagcaacgaatggaaacacttcgaacagtggccgccgaaaaacgtagaaaccaaaaaactgtatttccagccgcagggtaaactgggctttgacaaagtacagcgcaccgactcctgggacgaatacgtaaccgacccgaacaaaccggttccgcatcaaggtggtctgattcagaaccgcacccgtgaatatatggtagacgatcagcgttttgctgcttctcgtccggatgtaatggtttatcagacggaaccgctgactgaagacctgaccattgttggtccgatcaaaaacttcctgaaagtttccagcccgggtaccgacgcggattatgtggttaaactgatcgacgtttatccgaacgacgctgcgtcttatcagggcaaaaccatggccggctatcagatgatggttcgtggcgaaattatggcgggcaaatatcgcaacggctttgataaagcgcaggccctgacgccgggcatggttgaaaaagtaaattttgaaatgccggatgttgcgcacaccttcaaaaaaggccaccgcatcatggttcaggttcagaactcttggttcccgctggcggaacgcaatccgcaggtttttctggcgccgtataccgcgaccaaagcggattttcgcaaagccacccagcgcatttttcacgatgttaacaacgccacctatattgaattttctgttctgaaagataagctt。
本对比例制备丙酪二肽的转化率为8.9％。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一株产α-氨基酸酯酰基转移酶的重组大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，其特征在于，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2022年8月19日，保藏编号CGMCC No.25553。
2.一种如权利要求1所述的重组大肠埃希氏菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将酯酰基转移酶基因连接到表达载体上构建得到重组质粒；所述酯酰基转移酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)所述重组质粒转化到感受态大肠杆菌中，经过筛选和验证后，得到所述重组大肠埃希氏菌。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述表达载体为pET-28a-(+)。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述感受态大肠杆菌为感受态大肠杆菌BL21(DE3)。
5.一种α-氨基酸酯酰基转移酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
6.一种α-氨基酸酯酰基转移酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
7.一种如权利要求1所述的重组大肠埃希氏菌或权利要求5所述的编码基因在制备α-氨基酸酯酰基转移酶中的应用。
8.一种如权利要求1所述的重组大肠埃希氏菌、权利要求5所述的编码基因或权利要求6所述的α-氨基酸酯酰基转移酶在合成丙酪二肽中的应用。
9.一种利用酶法生产丙酪二肽的方法，其特征在于，包括：以丙氨酸甲酯盐酸盐和酪氨酸为底物，利用权利要求6所述的α-氨基酸酯酰基转移酶进行催化反应，制备得到所述丙酪二肽。
10.一种利用全细胞法生产丙酪二肽的方法，其特征在于，包括：以丙氨酸甲酯盐酸盐和酪氨酸为底物，利用权利要求1所述的重组大肠埃希氏菌的全细胞进行催化反应，制备得到所述丙酪二肽。
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480172A (zh) * 2014-11-19 2015-04-01 江南大学 一种利用重组大肠杆菌生产l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的方法
CN105481945A (zh) * 2016-01-04 2016-04-13 湖北泓肽生物科技有限公司 一种l-丙氨酰-l-酪氨酸的制备方法
CN107603936A (zh) * 2017-09-21 2018-01-19 合肥工业大学 一种表达α‑氨基酸酯酰基转移酶的重组工程菌及其构建方法和用途
WO2018121458A1 (zh) * 2016-12-30 2018-07-05 大连医诺生物股份有限公司 编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用
CN110382705A (zh) * 2018-09-26 2019-10-25 邦泰生物工程(深圳)有限公司 丙谷二肽的制备方法、丙谷二肽制备用酶及应用
CN114107150A (zh) * 2021-11-12 2022-03-01 江南大学 一种α-氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌与应用

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104480172A (zh) * 2014-11-19 2015-04-01 江南大学 一种利用重组大肠杆菌生产l-丙氨酰-l-谷氨酰胺的方法
CN105481945A (zh) * 2016-01-04 2016-04-13 湖北泓肽生物科技有限公司 一种l-丙氨酰-l-酪氨酸的制备方法
WO2018121458A1 (zh) * 2016-12-30 2018-07-05 大连医诺生物股份有限公司 编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用
CN107603936A (zh) * 2017-09-21 2018-01-19 合肥工业大学 一种表达α‑氨基酸酯酰基转移酶的重组工程菌及其构建方法和用途
CN110382705A (zh) * 2018-09-26 2019-10-25 邦泰生物工程(深圳)有限公司 丙谷二肽的制备方法、丙谷二肽制备用酶及应用
CN114107150A (zh) * 2021-11-12 2022-03-01 江南大学 一种α-氨基酸酯酰基转移酶在细胞表面表达的重组大肠杆菌与应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Enzymatic production of L-alanyl-L-glutamine by recombinant E. coli expressing α-amino acid ester acyltransferase from Sphingobacterium siyangensis.;Hirao Y等;《Biosci Biotechnol Biochem》;第77卷(第3期);第618-623页 *
L-丙氨酰-L-酪氨酸二肽化学合成研究;霍婷等;《化工技术与开发》;第43卷(第2期);第16-17页 *
α-氨基酸酯酰基转移酶表达纯化、酶学性质及其催化应用;刘鹏飞等;《生物工程学报》;第34卷(第7期);第1169-1177页 *
响应面法优化重组大肠杆菌全细胞催化合成丙谷二肽;上官丁从等;《中国食品添加剂》;第32卷(第9期);第58-65页 *

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