CN109897870B - 一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用大肠杆菌工程菌制备10‑羟基‑2‑癸烯酸的方法，步骤如下：(1)构建重组质粒pBbB5K‑P450融合酶、重组质粒pBbB5K‑FadK、重组质粒pBbB5K–MCAD、重组质粒pBbB5K‑YdiI；(2)构建pBbB5K‑ydiI‑MCAD‑FadK‑P450融合酶组合质粒；(3)融合酶组合质粒转化大肠杆菌，经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；(4)将诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入癸酸，培养，制得10‑羟基‑2‑癸烯酸。本发明以癸酸为原料发酵生产10‑羟基‑2‑癸烯酸，实现以低值癸酸生产高附加值10‑羟基‑2‑癸烯酸的过程。

Description

一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备10-羟基-2-癸烯 酸的方法

技术领域

本发明涉及一种利用大肠杆菌工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法，属于生物发酵技术领域。

背景技术

10-羟基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decenoic acid，10-HDA)是一种含有羟基的单不饱和脂肪酸，分子式为C₁₀H₁₈O₃。迄今为止，自然界中仅从蜂王浆及蜂胶中发现，因此又称王浆酸。研究表明10-HDA具有抗菌、免疫调节及抗氧化，抗肿瘤，降低血糖等多种重要的生理功能，具有极高的医药和保健价值，应用前景十分广泛。该化合物结构如下：

鉴于10-HDA广泛而重要的应用价值，寻找10-HDA高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。10-HDA的结构式如下：

目前10-HDA的获得方法主要有物理提取法、化学合成法。其中物理提取法来源单一，蜂王浆中10-HDA含量仅为1.4％-2.4％，因此产量小，无法满足市场需求。而化学合成法虽然可以满足产业需求，但其操作步骤较冗繁，且化学试剂具有一定的毒性。因而探索10-HDA高效方便、低成本的合成方法，对其大规模开发和利用具有重要的理论和应用价值。近年来微生物发酵合成法生产10-HDA已经成为研究者及该行业的新目标。

但利用廉价的原料如癸酸发酵生产10-羟基-2-癸烯酸的相关技术未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌生产制备10-羟基-2-癸烯酸的方法。

本发明的技术方案如下：

一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌静息细胞制10-羟基-2-癸烯酸的方法，步骤如下：

(1)构建重组质粒pBbB5K-P450融合酶、重组质粒pBbB5K-FadK、重组质粒pBbB5K–MCAD、重组质粒pBbB5K-YdiI；

所述P450融合酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；脂酰CoA合成酶基因FadK的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；脂酰CoA脱氢酶基因MCAD的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

(2)利用步骤(1)制得的重组质粒pBbB5K-P450融合酶、重组质粒pBbB5K-FadK、重组质粒pBbB5K–MCAD、重组质粒pBbB5K-YdiI，构建pBbB5K-ydiI-MCAD-FadK-P450融合酶组合质粒；

(3)取步骤(2)制得的pBbB5K-ydiI-MCAD-FadK-P450融合酶组合质粒转化到的大肠杆菌，经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；

(4)将步骤(3)制得的诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入癸酸至浓度为4～10g/L，在25～35℃条件下培养，制得10-羟基-2-癸烯酸；

所述转化培养基组份如下，均为质量百分比：

甘油0.8～1.2％，葡萄糖0.3～0.5％,抗生素40～60μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，构建含有重组质粒pBbB5K-P450融合酶，包括如下步骤：

以经过密码子优化的水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)的烷烃羟化酶CYP153A与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P450NADH还原酶的融合酶基因(根据《Synthesis ofω-hydroxy dodecanoic acid based on an engineered CYP153A fusionconstruct》,Microbial Biotechnology，Daniel Scheps；2013-11-15；中记载的操作)为模板进行PCR扩增，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和P450NADH还原酶的融合酶基因分别用EcoRI和XhoI分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K-P450融合酶；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH₂O 9.5μL。

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1.45min，循环30次；72℃延伸5min。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，构建含有重组质粒pBbB5K-FadK，包括如下步骤：

以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增脂酰CoA合成酶基因FadK，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和脂酰CoA合成酶基因FadK分别用EcoRI和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K-FadK；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH₂O 9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸5min。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，构建含有重组质粒重组质粒pBbB5K–MCAD，包括如下步骤：

以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增脂酰CoA脱氢酶基因MCAD，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和脂酰CoA脱氢酶基因MCAD分别用EcoRI和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K–MCAD；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH₂O 9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸5min。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，构建含有重组质粒pBbB5K-YdiI，包括如下步骤：

以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI分别用EcoRI和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K-YdiI；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH₂O 9.5μL。

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s,循环30次；72℃延伸5min。

根据本发明进一步优选的，上述连接酶连接条件为22℃连接10min。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中，构建方法采用BglBrick法，构建pBbB5K-ydiI-MCAD-FadK-P450融合酶组合质粒的具体步骤如下：

将重组质粒pBbB5K-ydiI、pBbB5K-MCAD，pBbB5K-FadK分别利用EcoRI和BamHI进行酶切，然后依次连接到经EcoRI和BglII酶切的重组质粒pBbB5K-P450融合酶上，获得pBbB5K-ydiI-MCAD-FadK-P450融合酶组合质粒；

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，筛选为将转化后的大肠杆菌工程菌接入含有浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在35～40℃振荡筛选培养至菌液OD₆₀₀为0.8～1.2。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中，诱导培养为将筛选培养的菌液降温至14～20℃适应0.5～2小时后，然后分别加入IPTG至浓度为0.5～0.8mM、加入癸烷至质量百分比浓度为2～5％、加入吐温80至质量百分比浓度为0.2～0.5％，继续诱导培养4～12小时，分离细胞，制得诱导细胞。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(3)中，诱导培养条件为将筛选培养的菌液降温至16℃适应1小时后，分别加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.32mM、加入癸烷使培养基中癸烷质量百分比浓度为3％、加入吐温80使培养基中吐温80的质量百分比浓度为0.3％，继续诱导培养12小时，分离细胞，制得诱导细胞。

根据本发明进一步优选的，所述步骤(3)中，分离细胞为在5000rpm条件下离心15min，收集沉淀，然后用质量百分比浓度为0.85％的盐水洗涤。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，转化培养条件为在25～35℃条件下培养20小时。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，转化培养基组份如下，均为质量百分比：

甘油1％，葡萄糖0.4％，抗生素50μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，癸酸转化浓度为8g/L。

根据本发明优选的，所述步骤(4)中，癸酸溶解于二甲基亚砜。

有益效果

1、本发明首次采用BglBrick法构建pBbB5K-ydiI-MCAD-FadK-P450融合酶组合质粒，实现10-羟基-2-癸烯酸表达元件的高效组装，并经过特殊诱导处理后，可以通过静息细胞以癸酸为原料发酵生产10-羟基-2-癸烯酸，实现以低值癸酸生产高附加值10-羟基-2-癸烯酸的过程；

2、本发明通过优化10-羟基-2-癸烯酸表达途径，并通过优化转化过程中的相关条件，显著提高10-羟基-2-癸烯酸的转化率，从而使10-羟基-2-癸烯酸的工业化生产成为可能。

附图说明

图1为pBbB5K-MCAD-FadK-P450融合酶组合表达质粒构建图；

图2为PCR扩增FadK、P450融合酶产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为marker，2-4为FadK，5-8为P450融合酶；

图3为PCR扩增MCAD、ydiI产物琼脂糖凝胶电泳图，其中M为marker，1-4为ydiI，5-7为MCAD；

图4为EcoRI,BgLII双酶切质粒pBbB5K-GFP质粒图，其中，泳道M为Marker；泳道1-6为酶切结果；

图5为菌落PCR验证结果图；

其中：M为marker，1-6为MCAD，8-13为P450融合酶,14-19为ydiI，7、20、21为FadK。

图6为实施例5发酵产物的气相色谱检测图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的内容作进一步阐述，但本发明保护内容并不仅局限于此。实施例中未作详细说明的操作方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。

生物材料来源

CYP153A：海杆菌(Marinobacter aquaeolei)Genbank accessionNo.CP000514.1；

P450NADH还原酶：巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)Genbank No.J04832.1；

脂酰辅酶A硫酯酶ydiI：大肠杆菌Genbank accession No.CP033092.1；

MCAD脂酰辅酶A脱氢酶：大肠杆菌Genbank accession No.CP032667.1；

FadK烯酰辅酶A水合酶：大肠杆菌Genbank accession No.CP030240.1；

本发明中所用的试剂及药品均为普通市售产品。

实施例1：大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI、MCAD、FadK、P450融合酶的PCR扩增。

根据大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶基因P450融合酶、FadK、MCAD、ydiI设计PCR扩增引物，上游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、3、5、7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.2、4、6、8所示；

其中，大肠杆菌酯酰辅酶A硫酯酶基因P450融合酶、FadK、MCAD、ydiI的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9、10、11、12所示，表达的小分子硫酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.13、14、15、16所示。

所述构建含有重组质粒pBbB5K-P450融合酶，包括如下步骤：

以经过密码子优化的水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)的烷烃羟化酶CYP153A与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)P450NADH还原酶的融合酶基因(根据《Synthesis ofω-hydroxy dodecanoic acid based on an engineered CYP153A fusionconstruct》,Microbial Biotechnology,Daniel Scheps；2013-11-15；中记载的操作)为模板进行PCR扩增，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，制得酯酰辅酶A硫酯酶基因P450融合酶；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶(一种高保真酶)12.5μL，ddH₂O 9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1.45min，循环30次；72℃延伸5min。

所述构建含有重组质粒pBbB5K-FadK，包括如下步骤：

以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增脂酰CoA合成酶基因FadK,上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和脂酰CoA合成酶基因FadK分别用EcoRI和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K-FadK；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶(一种高保真酶)12.5μL，ddH₂O 9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸5min。

所述构建含有重组质粒重组质粒pBbB5K–MCAD，包括如下步骤：

以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增脂酰CoA脱氢酶基因MCAD,上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和脂酰CoA脱氢酶基因MCAD分别用EcoRI和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K–MCAD；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH₂O 9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸5min。

所述构建含有重组质粒pBbB5K-YdiI，包括如下步骤：

以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI,上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI分别用EcoRI和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K-YdiI；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶()12.5μL，ddH₂O 9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸5min。

PCR产物回收：

PCR扩增结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，结果如图2所示，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工生物工程股份有限公司的DNA胶回收试剂盒回收PCR产物。

实施例2：重组质粒pBbB5K-ydiI、pBbB5K-MCAD，pBbB5K-FadK，pBbB5K-P450融合酶的构建

实施例1中回收的PCR产物及pBbB5K-GFP质粒载体的双酶切反应，反应体系如下：

反应条件：37℃反应1.5h。

PCR产物和质粒载体双酶切后经1％琼脂糖凝胶电泳纯化，并使用DNA胶回收试剂盒进行目的片段回收。

将经过酶切的PCR产物与同样经过酶切的质粒载体连接，连接反应体系如下：

将上述连接反应体系充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，22℃连接10min，得重组质粒pBbB5K-ydiI、pBbB5K-MCAD，pBbB5K-FadK，pBbB5K-P450融合酶。

实施例3：重组质粒pBbB5K-ydiI、重组质粒pBbB5K-MCAD，重组质粒pBbB5K-FadK，重组质粒pBbB5K-P450融合酶的转化：

(1)感受态细胞的制备

①挑取大肠杆菌BL21(DE3)单菌落(或挑取保存菌种)接种至10ml液体LB培养基，37℃、210rpm过夜培养；

②取5ml菌液接种于500ml LB培养基中，37℃、210rpm培养至菌液OD600为0.375左右；

③将菌液放置于冰水混合物上10min，同时预冷50ml离心管；

④将菌液转移到离心管中，4℃，3700rpm离心10min收集菌体；

⑤每个离心管中加入10mL预冷的0.1M CaCl2溶液，重悬菌体，再加入30mL预冷的0.1M CaCl2溶液，颠倒混匀，冰上静置20min；

⑥4℃，3700rpm离心10min收集菌体，按照与步骤④中菌液的体积比为3：125的比例加入预冷的含有15％甘油的0.1M的CaCl2溶液，重悬菌体，得感受态细胞；

⑦将感受态细胞分装，并于-80℃冻存。

(2)重组质粒的转化

①将10μL重组质粒pBbB5K-ydiI、重组质粒pBbB5K–MCAD、重组质粒pBbB5K-FadK、重组质粒pBbB5K-P450融合酶加入到100μL新鲜制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；

②42℃热激90s，然后迅速置于冰浴中冷却3min；

③将上述感受态细胞接入到500μL LB培养基，37℃，200rpm振荡培养60min；

④取上述菌液200μL，涂布于带有50mg/mL卡那霉素的LB固体培养基；

⑤37℃培养箱中正置30min，待菌液被吸干后，倒置平板于37℃培养12-16h。

(3)阳性克隆的鉴定：

①菌落PCR鉴定

挑取上述培养出的单菌落至1mL含有卡那霉素的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养6-8h，吸取1μL菌液，按照20μL PCR反应体系，进行菌落PCR鉴定，鉴定结果如图3所示，出现目的条带且条带单一的，显示菌落为阳性克隆。

②蛋白表达及可溶性鉴定

取上述菌液900μL，并加入终浓度为0.32mM的IPTG，诱导表达4h，12000rpm离心1min，收集菌体，加入2倍上样缓冲液，重悬菌体，100℃水浴变性10min，用SDS-PAGE检测蛋白表达，结果如图4所示，显示为阳性克隆。

③菌样测序

将用以上两种方法鉴定后的阳性克隆，送至测序公司进行测序，进一步证明构建的阳性克隆的正确性。

实施例4：BglBrick组装

将上述克隆成功的重组质粒pBbB5K-FadK利用EcoRI和BamHI进行双酶切，回收片段并连接到经EcoRI和BglII双酶切的重组质粒pBbB5K-P450融合酶上，得重组质粒pBbB5K-FadK-P450融合酶，转化到DH5a中，验证成功后将重组质粒pBbB5K-FadK-P450融合酶用EcoRI和BglII双酶切，同时用EcoRI和BamHI双酶切pBbB5K-MCAD，回收片段并连接，制得重组质粒pBbB5K-MCAD-FadK-P450融合酶，转化到DH5a中，验证成功后将重组质粒pBbB5K-MCAD-FadK-P450融合酶用EcoRI和BglII双酶切，同时用EcoRI和BamHI双酶切pBbB5K-ydiI，回收片段并连接，制得重组质粒pBbB5K-ydiI-MCAD-FadK-P450融合酶，转化到DH5a中，验证成功，实现10-羟基-2癸烯酸表达元件的组装。

实施例5：pBbB5K-ydiI-MCAD-FadK-P450融合酶工程菌发酵

(1)菌种活化：将实施例4中的阳性重组大肠杆菌以1％的接种量接种至50mL的含有卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃、200rpm振荡培养12h；

(2)菌体转接：取上述活化菌株1mL接入100mL含有卡那霉素的液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液OD600为1.0时，降温至16℃适应1小时后，加入0.5mM的5-ALA，0.5mM的Fecl3，20℃，200rpm培养20min，之后加入IPTG使培养基中IPTG浓度为0.32mM、加入癸烷使培养基中癸烷质量百分比浓度为3％、加入吐温80使培养基中吐温80的质量百分比浓度为0.3％，过夜诱导培养；

(3)收集菌体：取上述菌液500mL，5000rpm，4℃离心15min，收集菌体；

(4)用0.85％生理盐水洗涤沉淀三次，并用转化培养基重悬菌体制备菌悬液(50gcwwl-¹)。转化培养基包含100mM磷酸钾缓冲液(pH7.4)，1％的甘油，0.4％的葡萄糖，50μg/mL的卡那抗生素，分别加入1g/L，2g/L，4g/L，8g/L的癸酸进行反应。30℃反应20h并在0，4，8，12h补加0.4％葡萄糖，1％的甘油。

发酵液硅烷化处理：取2mL发酵液于具塞试管中，加入1mL乙酸乙酯，涡旋离心，有机相收集到新管中，加入150uL N,O-双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺振荡混匀，70℃水浴15min后备用。

气相色谱检测生成产物：气相色谱以氮气为载气，恒流模式，进样体积1μl，分流进样，分流比为1：50，进样温度250℃，50℃保持1min，以15℃/min升至250℃，保持10min。产物色谱图如图6所示。

对比例

如实施例5所述，不同之处在于，底物替换为等浓度的10-羟基癸酸，经检测，10-HDA产率与实施例5相同。本对比例虽然生成了10-HDA，但是10-羟基癸酸价格比较昂贵，实验成本较高，而癸酸比较廉价易得，以癸酸为底物实验成本得以降低。

序列表

<110> 齐鲁工业大学

<120> 一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌制备10-羟基-2-癸烯酸的方法

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

gaattcaaaa gatctaaagg aggccatcca tgccgacgtt accacgtac 49

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

ctcgagaaag gatccttacc cagcccacac gtcttt 36

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

gaattcaaaa gatctaaagg aggccatcca tgcatcccac aggcccg 47

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

ctcgagaaag gatccttatt caatctcttc acagacatcc 40

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

gaattcaaaa gatctaaagg aggccatcca tgtttaacca tgacgtggc 49

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

ctcgagaaag gatccttaat gcaacataag ttactgatta 40

<210> 7

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

gaattcaaaa gatctaaagg aggccatcca tgtcggactc agaagtcaat caa 53

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 8

ctcgagaaag gatccttatc acaaaatagc ggtcgtcaat cg 42

<210> 9

<211> 3195

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 9

atgccgacgt taccacgtac ctttgatgac attcagtctc gcttaatcaa tgctacaagt 60

cgtgtggttc caatgcagcg tcagattcag ggtctgaaat ttctgatgag tgccaaacgc 120

aaaacctttg gtccacgtcg cccaatgccg gaatttgtgg aaacacctat cccggatgtt 180

aatacattag ccttagagga cattgatgtg agtaatccgt ttctgtatcg ccagggccag 240

tggcgcgcat attttaaacg cttacgcgat gaagctccag ttcattatca gaaaaatagc 300

ccatttggtc cgttttggag cgtgacccgc tttgaggaca ttctgtttgt ggataaatca 360

catgatctgt ttagcgccga accacagatc atcttaggtg atcctccgga aggcctgtca 420

gtggaaatgt ttattgcgat ggaccctcct aaacatgatg tgcagcgctc tagtgttcag 480

ggtgtggttg cccctaaaaa tctgaaagaa atggaaggcc tgattcgtag tcgtacgggc 540

gatgtgttag attcattacc gacggataaa ccgtttaatt gggttcctgc ggtgagcaaa 600

gaactgacgg gtagaatgct ggctacctta ctggattttc cgtatgaaga acgtcataaa 660

ctggttgaat ggagcgatcg catggccggt gcggcaagtg ctacgggcgg cgaatttgcg 720

gatgaaaatg ctatgtttga tgatgcggca gatatggcac gctctttttc tcgcctgtgg 780

cgcgataaag aagcccgccg tgcagcaggc gaagaaccgg gctttgattt aatctcactg 840

ctacagtcta ataaagaaac caaggatctg atcaatcgtc ctatggaatt tattggcaat 900

ctgaccctgc tgattgtggg cggtaatgat acgacccgca atagcatgtc aggcggctta 960

gttgccatga atgaatttcc tcgtgaattt gaaaaactga aagccaaacc ggaactgatt 1020

ccgaatatgg tgagcgaaat tattcgttgg cagacaccac tggcctatat gcgccgcatt 1080

gccaaacagg atgttgaact gggcggtcag accatcaaaa aaggtgatcg cgttgttatg 1140

tggtatgcct caggtaatcg cgatgaacgt aaatttgata atccggatca gtttattatc 1200

gatcgtaaag atgcacgcaa tcacatgtct tttggctatg gtgttcatcg ctgtatgggt 1260

aatcgtctgg ccgaattaca gctgcgtatt ctgtgggaag aaatcttaaa acgctttgat 1320

aatatcgaag ttgtggaaga accagaacgt gtgcagagca attttgttcg cggctatagc 1380

cgcttaatgg ttaaactgac acctaatagt atgggcggca ttccttcacc aagccgagag 1440

cagtcagcta aaaaagagcg caaaaccgta gaaaacgctc ataatacgcc gcttcttgtg 1500

ctatacggtt caaatatggg aacagccgaa ggaacggcgc gtgatttagc ggatattgcg 1560

atgagcaaag gattcgcacc gcaagtcgca acgcttgatt cccacgcagg aaaccttccg 1620

cgtgaaggag ctgttttaat tgtaacggct tcttataacg gtcatcctcc tgataacgca 1680

aaggaatttg ttgactggtt agaccaagcg tctgctgatg aagtaaaagg cgtgcgctac 1740

tccgtatttg gatgcggtga taaaaactgg gcgacaacgt atcaaaaagt gcctgctttt 1800

attgatgaaa ctcttgccgc taaaggggca gaaaacatag ctgaacgcgg tgaagcagat 1860

gcaagcgacg actttgaagg cacatacgaa gaatggcgtg aacacatgtg gagtgactta 1920

gcagcctact ttaacttaga cattgaaaac agcgaagaaa atgcgtctac gctttcactt 1980

caatttgtcg acagcgctgc ggacatgccg cttgcgaaaa tgcaccgtgc gttttcagca 2040

aacgtcgtag caagcaaaga gcttcaaaag ccaggcagtg cacgaagcac gcgtcatctt 2100

gaaattgaac ttccaaaaga agcttcttat caagaaggag atcatttagg tgttattcct 2160

cgcaactatg aaggaatagt aaatcgtgta gcaacaagat ttggtctaga tgcatcacag 2220

caaatccgtt tggaagctga agaagaaaaa ttagctcatt tgccactcgg taaaacagta 2280

tcagtagaag agcttctgca atacgtggag cttcaagatc ctgttacgcg cacgcagctt 2340

cgcgcaatgg ctgctaaaac agtctgcccg ccgcataaag tagagcttga agtcttgctt 2400

gaaaagcagg cgtacaaaga acaagtgctg gcaaaacgtt taacaatgct tgaactgctt 2460

gaaaaatatc cggcgtgtga aatggaattc agcgaattta tcgcacttct tccaagcatg 2520

cgtccgcgct attactcaat ttcttcatca cctcgtgtcg atgaaaaaca agcaagcatc 2580

acggtcagcg ttgtttcagg agaagcgtgg agcggatacg gagaatacaa aggaattgca 2640

tcgaactatc ttgccaatct gcaagaagga gatacgatta cgtgctttgt ttccacaccg 2700

cagtcaggat ttacgctgcc aaaaggccct gaaacaccac ttatcatggt aggaccggga 2760

acaggcgtcg cgccgtttag aggctttgtg caggctcgca agcagttaaa agaacaagga 2820

cagtcgcttg gagaagcgca tttatacttt ggctgccgtt cacctcatga agattatctg 2880

tatcaaaaag agcttgaaaa cgcccaaaat gaaggcatca ttacgcttca taccgctttt 2940

tctcgcgtac caaatcagcc gaaaacatac gttcaacacg tgatggaaca agacggcaag 3000

aaattgattg aacttcttga ccaaggagcg cacttctata tttgcggaga cggaagccaa 3060

atggcacctg acgttgaagc aacgcttatg aaaagctatg ctgaagttca ccaagtgagt 3120

gaagcagacg ctcgcttatg gctgcagcag ctagaagaaa agggccgata cgcaaaagac 3180

gtgtgggctg ggtaa 3195

<210> 10

<211> 1698

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 10

atgcatccca caggcccgca tctcgggcct gatgttctgt ttcgagagtc caacatgaaa 60

gtgacattaa cgtttaacga acaacgtcgt gcggcgtatc gtcagcaagg gttatggggc 120

gatgcttcgc tggccgatta ctggcagcag accgctcgtg cgatgccaga caaaattgcc 180

gtggtcgata atcatggtgc atcgtacacc tatagcgcgc tcgatcacgc cgcgagctgt 240

ctggcaaact ggatgttagc gaagggtatt gaatcaggcg atcgcatcgc atttcaactg 300

cctggctggt gtgaatttac cgttatctat cttgcctgcc tgaaaatcgg tgcagtttcc 360

gtgccgctgt tgccttcctg gcgggaagca gaactggtgt gggtgctcaa taagtgtcag 420

gcaaaaatgt tctttgcacc gacgttgttt aaacaaacgc gtccggtaga tttaatcctg 480

ccgctgcaaa atcagcttcc acaactacaa caaattgtcg gcgtggacaa actggctccc 540

gccacctctt ccctctcatt aagtcagatt atcgccgaca atacctcact gaccacggcg 600

ataacgaccc acggcgatga attagctgcg gtgctgttta cctccggaac cgagggtctg 660

ccaaagggcg tgatgctaac gcataacaat attctcgcca gtgagcgggc ttattgcgcg 720

cgactgaatc tgacctggca ggatgtcttt atgatgcctg cgccacttgg tcacgcaacg 780

ggctttctgc atggcgtaac ggcaccattc ttaattggcg ctcgcagcgt gttgttagat 840

attttcactc ctgatgcgtg tctcgcgctg cttgagcagc agcgttgcac ctgtatgctc 900

ggcgcaacgc cgtttgtcta tgatcttttg aatgtactag agaaacaacc cgcggacctt 960

tcagcgctgc gtttctttct ttgcggcgga accacaatcc ccaaaaaagt ggcgcgtgaa 1020

tgccagcagc gcggcattaa attattaagt gtttatggtt ccacagaaag ttcgccgcat 1080

gcggtggtga atctcgatga tcctttgtcg cgctttatgc acaccgatgg ttacgctgcc 1140

gcaggtgtag agattaaagt ggtcgatgac gcacgcaaga ccttaccgcc aggttgcgaa 1200

ggtgaagaag cctcgcgtgg ccccaatgtg tttatggggt attttgatga acctgaatta 1260

accgcccgtg ccctggatga agaaggctgg tattacagcg gcgatctctg ccgtatggat 1320

gaggctggct atataaaaat taccggacgc aaaaaagata ttattgtccg cggcggcgaa 1380

aatattagca gccgtgaagt ggaagatatt ttattgcagc atcctaaaat tcacgatgcc 1440

tgtgtggttg caatgtccga tgaacgttta ggtgaacgat catgcgctta tgtcgtgctg 1500

aaagcgccgc atcattcatt atcgctggaa gaggtagtgg ctttttttag ccgtaaacgg 1560

gtcgcaaaat ataaatatcc tgaacatatc gtggtaatcg aaaaactacc gcgaactacc 1620

tcaggtaaaa tacaaaagtt tttgttaaga aaagatatta tgcggcgttt aacgcaggat 1680

gtctgtgaag agattgaa 1698

<210> 11

<211> 1422

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 11

atgcaacata agttactgat taacggagaa ctggttagcg gcgaagggga aaaacagcct 60

gtctataatc cggcaacggg ggacgtttta ctggaaattg ccgaggcatc cgcagagcag 120

gtcgatgctg ctgtgcgcgc ggcagatgca gcatttgccg aatgggggca aaccacgccg 180

aaagtgcgtg cggaatgtct gctgaaactg gctgatgtta tcgaagaaaa tggtcaggtt 240

tttgccgaac tggagtcccg taattgtggc aaaccgctgc atagtgcgtt caatgatgaa 300

atcccggcga ttgtcgatgt ttttcgcttt ttcgcgggtg cggcgcgctg tctgaatggt 360

ctggcggcag gtgaatatct tgaaggtcat acttcgatga tccgtcgcga tccgttgggg 420

gtcgtggctt ctatcgcacc gtggaattat ccgctgatga tggccgcgtg gaaacttgct 480

ccggcgctgg cggcagggaa ctgcgtagtg cttaaaccat cagaaattac cccgctgacc 540

gcgttgaagt tggcagagct ggcgaaagat atcttcccgg caggcgtgat taacatactg 600

tttggcagag gcaaaacggt gggtgatccg ctgaccggtc atcccaaagt gcggatggtg 660

tcgctgacgg gctctatcgc caccggcgag cacatcatca gccataccgc gtcgtccatt 720

aagcgtactc atatggaact tggtggcaaa gcgccagtga ttgtttttga tgatgcggat 780

attgaagcag tggtcgaagg tgtacgtaca tttggctatt acaatgctgg acaggattgt 840

actgcggctt gtcggatcta cgcgcaaaaa ggcatttacg atacgctggt ggaaaaactg 900

ggtgctgcgg tggcaacgtt aaaatctggt gcgccagatg acgagtctac ggagcttgga 960

cctttaagct cgctggcgca tctcgaacgc gtcggcaagg cagtagaaga ggcgaaagcg 1020

acagggcaca tcaaagtgat cactggcggt gaaaagcgca agggtaatgg ctattactat 1080

gcgccgacgc tgctggctgg cgcattacag gacgatgcca tcgtgcaaaa agaggtattt 1140

ggtccagtag tgagtgttac gcccttcgac aacgaagaac aggtggtgaa ctgggcgaat 1200

gacagccagt acggacttgc atcttcggta tggacgaaag atgtgggcag ggcgcatcgc 1260

gtcagcgcac ggctgcaata tggttgtacc tgggtcaata cccatttcat gctggtaagt 1320

gaaatgccgc acggtgggca gaaactttct ggttacggca aggatatgtc actttatggg 1380

ctggaggatt acaccgtcgt ccgccacgtc atggttaaac at 1422

<210> 12

<211> 411

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 12

atgatatgga aacgaaaaat caccctggaa gcactgaatg ctatggggga aggaaacatg 60

gtgggattgc tggatattcg ctttgaacat attggtgatg acacccttga agcgacaatg 120

ccagtagact cacggacaaa gcagcctttc gggttgctgc atggaggtgc atctgtggta 180

ctggccgaaa gtatcggttc cgttgccggt tatttatgta ccgaaggtga gcaaaaagtg 240

gttggtctgg aaatcaatgc taaccacgtc cgctcggcac gagaagggcg ggtgcgcggc 300

gtatgcaaac cgttgcatct cggttcgcgt caccaggtct ggcagattga aatcttcgat 360

gagaaagggc gtttgtgctg ttcgtcacga ttgacgaccg ctattttgtg a 411

<210> 13

<211> 1064

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 13

Met Pro Thr Leu Pro Arg Thr Phe Asp Asp Ile Gln Ser Arg Leu Ile

1 5 10 15

Asn Ala Thr Ser Arg Val Val Pro Met Gln Arg Gln Ile Gln Gly Leu

20 25 30

Lys Phe Leu Met Ser Ala Lys Arg Lys Thr Phe Gly Pro Arg Arg Pro

35 40 45

Met Pro Glu Phe Val Glu Thr Pro Ile Pro Asp Val Asn Thr Leu Ala

50 55 60

Leu Glu Asp Ile Asp Val Ser Asn Pro Phe Leu Tyr Arg Gln Gly Gln

65 70 75 80

Trp Arg Ala Tyr Phe Lys Arg Leu Arg Asp Glu Ala Pro Val His Tyr

85 90 95

Gln Lys Asn Ser Pro Phe Gly Pro Phe Trp Ser Val Thr Arg Phe Glu

100 105 110

Asp Ile Leu Phe Val Asp Lys Ser His Asp Leu Phe Ser Ala Glu Pro

115 120 125

Gln Ile Ile Leu Gly Asp Pro Pro Glu Gly Leu Ser Val Glu Met Phe

130 135 140

Ile Ala Met Asp Pro Pro Lys His Asp Val Gln Arg Ser Ser Val Gln

145 150 155 160

Gly Val Val Ala Pro Lys Asn Leu Lys Glu Met Glu Gly Leu Ile Arg

165 170 175

Ser Arg Thr Gly Asp Val Leu Asp Ser Leu Pro Thr Asp Lys Pro Phe

180 185 190

Asn Trp Val Pro Ala Val Ser Lys Glu Leu Thr Gly Arg Met Leu Ala

195 200 205

Thr Leu Leu Asp Phe Pro Tyr Glu Glu Arg His Lys Leu Val Glu Trp

210 215 220

Ser Asp Arg Met Ala Gly Ala Ala Ser Ala Thr Gly Gly Glu Phe Ala

225 230 235 240

Asp Glu Asn Ala Met Phe Asp Asp Ala Ala Asp Met Ala Arg Ser Phe

245 250 255

Ser Arg Leu Trp Arg Asp Lys Glu Ala Arg Arg Ala Ala Gly Glu Glu

260 265 270

Pro Gly Phe Asp Leu Ile Ser Leu Leu Gln Ser Asn Lys Glu Thr Lys

275 280 285

Asp Leu Ile Asn Arg Pro Met Glu Phe Ile Gly Asn Leu Thr Leu Leu

290 295 300

Ile Val Gly Gly Asn Asp Thr Thr Arg Asn Ser Met Ser Gly Gly Leu

305 310 315 320

Val Ala Met Asn Glu Phe Pro Arg Glu Phe Glu Lys Leu Lys Ala Lys

325 330 335

Pro Glu Leu Ile Pro Asn Met Val Ser Glu Ile Ile Arg Trp Gln Thr

340 345 350

Pro Leu Ala Tyr Met Arg Arg Ile Ala Lys Gln Asp Val Glu Leu Gly

355 360 365

Gly Gln Thr Ile Lys Lys Gly Asp Arg Val Val Met Trp Tyr Ala Ser

370 375 380

Gly Asn Arg Asp Glu Arg Lys Phe Asp Asn Pro Asp Gln Phe Ile Ile

385 390 395 400

Asp Arg Lys Asp Ala Arg Asn His Met Ser Phe Gly Tyr Gly Val His

405 410 415

Arg Cys Met Gly Asn Arg Leu Ala Glu Leu Gln Leu Arg Ile Leu Trp

420 425 430

Glu Glu Ile Leu Lys Arg Phe Asp Asn Ile Glu Val Val Glu Glu Pro

435 440 445

Glu Arg Val Gln Ser Asn Phe Val Arg Gly Tyr Ser Arg Leu Met Val

450 455 460

Lys Leu Thr Pro Asn Ser Met Gly Gly Ile Pro Ser Pro Ser Arg Glu

465 470 475 480

Gln Ser Ala Lys Lys Glu Arg Lys Thr Val Glu Asn Ala His Asn Thr

485 490 495

Pro Leu Leu Val Leu Tyr Gly Ser Asn Met Gly Thr Ala Glu Gly Thr

500 505 510

Ala Arg Asp Leu Ala Asp Ile Ala Met Ser Lys Gly Phe Ala Pro Gln

515 520 525

Val Ala Thr Leu Asp Ser His Ala Gly Asn Leu Pro Arg Glu Gly Ala

530 535 540

Val Leu Ile Val Thr Ala Ser Tyr Asn Gly His Pro Pro Asp Asn Ala

545 550 555 560

Lys Glu Phe Val Asp Trp Leu Asp Gln Ala Ser Ala Asp Glu Val Lys

565 570 575

Gly Val Arg Tyr Ser Val Phe Gly Cys Gly Asp Lys Asn Trp Ala Thr

580 585 590

Thr Tyr Gln Lys Val Pro Ala Phe Ile Asp Glu Thr Leu Ala Ala Lys

595 600 605

Gly Ala Glu Asn Ile Ala Glu Arg Gly Glu Ala Asp Ala Ser Asp Asp

610 615 620

Phe Glu Gly Thr Tyr Glu Glu Trp Arg Glu His Met Trp Ser Asp Leu

625 630 635 640

Ala Ala Tyr Phe Asn Leu Asp Ile Glu Asn Ser Glu Glu Asn Ala Ser

645 650 655

Thr Leu Ser Leu Gln Phe Val Asp Ser Ala Ala Asp Met Pro Leu Ala

660 665 670

Lys Met His Arg Ala Phe Ser Ala Asn Val Val Ala Ser Lys Glu Leu

675 680 685

Gln Lys Pro Gly Ser Ala Arg Ser Thr Arg His Leu Glu Ile Glu Leu

690 695 700

Pro Lys Glu Ala Ser Tyr Gln Glu Gly Asp His Leu Gly Val Ile Pro

705 710 715 720

Arg Asn Tyr Glu Gly Ile Val Asn Arg Val Ala Thr Arg Phe Gly Leu

725 730 735

Asp Ala Ser Gln Gln Ile Arg Leu Glu Ala Glu Glu Glu Lys Leu Ala

740 745 750

His Leu Pro Leu Gly Lys Thr Val Ser Val Glu Glu Leu Leu Gln Tyr

755 760 765

Val Glu Leu Gln Asp Pro Val Thr Arg Thr Gln Leu Arg Ala Met Ala

770 775 780

Ala Lys Thr Val Cys Pro Pro His Lys Val Glu Leu Glu Val Leu Leu

785 790 795 800

Glu Lys Gln Ala Tyr Lys Glu Gln Val Leu Ala Lys Arg Leu Thr Met

805 810 815

Leu Glu Leu Leu Glu Lys Tyr Pro Ala Cys Glu Met Glu Phe Ser Glu

820 825 830

Phe Ile Ala Leu Leu Pro Ser Met Arg Pro Arg Tyr Tyr Ser Ile Ser

835 840 845

Ser Ser Pro Arg Val Asp Glu Lys Gln Ala Ser Ile Thr Val Ser Val

850 855 860

Val Ser Gly Glu Ala Trp Ser Gly Tyr Gly Glu Tyr Lys Gly Ile Ala

865 870 875 880

Ser Asn Tyr Leu Ala Asn Leu Gln Glu Gly Asp Thr Ile Thr Cys Phe

885 890 895

Val Ser Thr Pro Gln Ser Gly Phe Thr Leu Pro Lys Gly Pro Glu Thr

900 905 910

Pro Leu Ile Met Val Gly Pro Gly Thr Gly Val Ala Pro Phe Arg Gly

915 920 925

Phe Val Gln Ala Arg Lys Gln Leu Lys Glu Gln Gly Gln Ser Leu Gly

930 935 940

Glu Ala His Leu Tyr Phe Gly Cys Arg Ser Pro His Glu Asp Tyr Leu

945 950 955 960

Tyr Gln Lys Glu Leu Glu Asn Ala Gln Asn Glu Gly Ile Ile Thr Leu

965 970 975

His Thr Ala Phe Ser Arg Val Pro Asn Gln Pro Lys Thr Tyr Val Gln

980 985 990

His Val Met Glu Gln Asp Gly Lys Lys Leu Ile Glu Leu Leu Asp Gln

995 1000 1005

Gly Ala His Phe Tyr Ile Cys Gly Asp Gly Ser Gln Met Ala Pro Asp

1010 1015 1020

Val Glu Ala Thr Leu Met Lys Ser Tyr Ala Glu Val His Gln Val Ser

1025 1030 1035 1040

Glu Ala Asp Ala Arg Leu Trp Leu Gln Gln Leu Glu Glu Lys Gly Arg

1045 1050 1055

Tyr Ala Lys Asp Val Trp Ala Gly

1060

<210> 14

<211> 566

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 14

Met His Pro Thr Gly Pro His Leu Gly Pro Asp Val Leu Phe Arg Glu

1 5 10 15

Ser Asn Met Lys Val Thr Leu Thr Phe Asn Glu Gln Arg Arg Ala Ala

20 25 30

Tyr Arg Gln Gln Gly Leu Trp Gly Asp Ala Ser Leu Ala Asp Tyr Trp

35 40 45

Gln Gln Thr Ala Arg Ala Met Pro Asp Lys Ile Ala Val Val Asp Asn

50 55 60

His Gly Ala Ser Tyr Thr Tyr Ser Ala Leu Asp His Ala Ala Ser Cys

65 70 75 80

Leu Ala Asn Trp Met Leu Ala Lys Gly Ile Glu Ser Gly Asp Arg Ile

85 90 95

Ala Phe Gln Leu Pro Gly Trp Cys Glu Phe Thr Val Ile Tyr Leu Ala

100 105 110

Cys Leu Lys Ile Gly Ala Val Ser Val Pro Leu Leu Pro Ser Trp Arg

115 120 125

Glu Ala Glu Leu Val Trp Val Leu Asn Lys Cys Gln Ala Lys Met Phe

130 135 140

Phe Ala Pro Thr Leu Phe Lys Gln Thr Arg Pro Val Asp Leu Ile Leu

145 150 155 160

Pro Leu Gln Asn Gln Leu Pro Gln Leu Gln Gln Ile Val Gly Val Asp

165 170 175

Lys Leu Ala Pro Ala Thr Ser Ser Leu Ser Leu Ser Gln Ile Ile Ala

180 185 190

Asp Asn Thr Ser Leu Thr Thr Ala Ile Thr Thr His Gly Asp Glu Leu

195 200 205

Ala Ala Val Leu Phe Thr Ser Gly Thr Glu Gly Leu Pro Lys Gly Val

210 215 220

Met Leu Thr His Asn Asn Ile Leu Ala Ser Glu Arg Ala Tyr Cys Ala

225 230 235 240

Arg Leu Asn Leu Thr Trp Gln Asp Val Phe Met Met Pro Ala Pro Leu

245 250 255

Gly His Ala Thr Gly Phe Leu His Gly Val Thr Ala Pro Phe Leu Ile

260 265 270

Gly Ala Arg Ser Val Leu Leu Asp Ile Phe Thr Pro Asp Ala Cys Leu

275 280 285

Ala Leu Leu Glu Gln Gln Arg Cys Thr Cys Met Leu Gly Ala Thr Pro

290 295 300

Phe Val Tyr Asp Leu Leu Asn Val Leu Glu Lys Gln Pro Ala Asp Leu

305 310 315 320

Ser Ala Leu Arg Phe Phe Leu Cys Gly Gly Thr Thr Ile Pro Lys Lys

325 330 335

Val Ala Arg Glu Cys Gln Gln Arg Gly Ile Lys Leu Leu Ser Val Tyr

340 345 350

Gly Ser Thr Glu Ser Ser Pro His Ala Val Val Asn Leu Asp Asp Pro

355 360 365

Leu Ser Arg Phe Met His Thr Asp Gly Tyr Ala Ala Ala Gly Val Glu

370 375 380

Ile Lys Val Val Asp Asp Ala Arg Lys Thr Leu Pro Pro Gly Cys Glu

385 390 395 400

Gly Glu Glu Ala Ser Arg Gly Pro Asn Val Phe Met Gly Tyr Phe Asp

405 410 415

Glu Pro Glu Leu Thr Ala Arg Ala Leu Asp Glu Glu Gly Trp Tyr Tyr

420 425 430

Ser Gly Asp Leu Cys Arg Met Asp Glu Ala Gly Tyr Ile Lys Ile Thr

435 440 445

Gly Arg Lys Lys Asp Ile Ile Val Arg Gly Gly Glu Asn Ile Ser Ser

450 455 460

Arg Glu Val Glu Asp Ile Leu Leu Gln His Pro Lys Ile His Asp Ala

465 470 475 480

Cys Val Val Ala Met Ser Asp Glu Arg Leu Gly Glu Arg Ser Cys Ala

485 490 495

Tyr Val Val Leu Lys Ala Pro His His Ser Leu Ser Leu Glu Glu Val

500 505 510

Val Ala Phe Phe Ser Arg Lys Arg Val Ala Lys Tyr Lys Tyr Pro Glu

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His Ile Val Val Ile Glu Lys Leu Pro Arg Thr Thr Ser Gly Lys Ile

530 535 540

Gln Lys Phe Leu Leu Arg Lys Asp Ile Met Arg Arg Leu Thr Gln Asp

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Val Cys Glu Glu Ile Glu

565

<210> 15

<211> 474

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 15

Met Gln His Lys Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Val Ser Gly Glu Gly

1 5 10 15

Glu Lys Gln Pro Val Tyr Asn Pro Ala Thr Gly Asp Val Leu Leu Glu

20 25 30

Ile Ala Glu Ala Ser Ala Glu Gln Val Asp Ala Ala Val Arg Ala Ala

35 40 45

Asp Ala Ala Phe Ala Glu Trp Gly Gln Thr Thr Pro Lys Val Arg Ala

50 55 60

Glu Cys Leu Leu Lys Leu Ala Asp Val Ile Glu Glu Asn Gly Gln Val

65 70 75 80

Phe Ala Glu Leu Glu Ser Arg Asn Cys Gly Lys Pro Leu His Ser Ala

85 90 95

Phe Asn Asp Glu Ile Pro Ala Ile Val Asp Val Phe Arg Phe Phe Ala

100 105 110

Gly Ala Ala Arg Cys Leu Asn Gly Leu Ala Ala Gly Glu Tyr Leu Glu

115 120 125

Gly His Thr Ser Met Ile Arg Arg Asp Pro Leu Gly Val Val Ala Ser

130 135 140

Ile Ala Pro Trp Asn Tyr Pro Leu Met Met Ala Ala Trp Lys Leu Ala

145 150 155 160

Pro Ala Leu Ala Ala Gly Asn Cys Val Val Leu Lys Pro Ser Glu Ile

165 170 175

Thr Pro Leu Thr Ala Leu Lys Leu Ala Glu Leu Ala Lys Asp Ile Phe

180 185 190

Pro Ala Gly Val Ile Asn Ile Leu Phe Gly Arg Gly Lys Thr Val Gly

195 200 205

Asp Pro Leu Thr Gly His Pro Lys Val Arg Met Val Ser Leu Thr Gly

210 215 220

Ser Ile Ala Thr Gly Glu His Ile Ile Ser His Thr Ala Ser Ser Ile

225 230 235 240

Lys Arg Thr His Met Glu Leu Gly Gly Lys Ala Pro Val Ile Val Phe

245 250 255

Asp Asp Ala Asp Ile Glu Ala Val Val Glu Gly Val Arg Thr Phe Gly

260 265 270

Tyr Tyr Asn Ala Gly Gln Asp Cys Thr Ala Ala Cys Arg Ile Tyr Ala

275 280 285

Gln Lys Gly Ile Tyr Asp Thr Leu Val Glu Lys Leu Gly Ala Ala Val

290 295 300

Ala Thr Leu Lys Ser Gly Ala Pro Asp Asp Glu Ser Thr Glu Leu Gly

305 310 315 320

Pro Leu Ser Ser Leu Ala His Leu Glu Arg Val Gly Lys Ala Val Glu

325 330 335

Glu Ala Lys Ala Thr Gly His Ile Lys Val Ile Thr Gly Gly Glu Lys

340 345 350

Arg Lys Gly Asn Gly Tyr Tyr Tyr Ala Pro Thr Leu Leu Ala Gly Ala

355 360 365

Leu Gln Asp Asp Ala Ile Val Gln Lys Glu Val Phe Gly Pro Val Val

370 375 380

Ser Val Thr Pro Phe Asp Asn Glu Glu Gln Val Val Asn Trp Ala Asn

385 390 395 400

Asp Ser Gln Tyr Gly Leu Ala Ser Ser Val Trp Thr Lys Asp Val Gly

405 410 415

Arg Ala His Arg Val Ser Ala Arg Leu Gln Tyr Gly Cys Thr Trp Val

420 425 430

Asn Thr His Phe Met Leu Val Ser Glu Met Pro His Gly Gly Gln Lys

435 440 445

Leu Ser Gly Tyr Gly Lys Asp Met Ser Leu Tyr Gly Leu Glu Asp Tyr

450 455 460

Thr Val Val Arg His Val Met Val Lys His

465 470

<210> 16

<211> 235

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 16

Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro

1 5 10 15

Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser

20 25 30

Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu

35 40 45

Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg

50 55 60

Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp

65 70 75 80

Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile

85 90 95

Gly Gly Ala Met Ile Trp Lys Arg Lys Ile Thr Leu Glu Ala Leu Asn

100 105 110

Ala Met Gly Glu Gly Asn Met Val Gly Leu Leu Asp Ile Arg Phe Glu

115 120 125

His Ile Gly Asp Asp Thr Leu Glu Ala Thr Met Pro Val Asp Ser Arg

130 135 140

Thr Lys Gln Pro Phe Gly Leu Leu His Gly Gly Ala Ser Val Val Leu

145 150 155 160

Ala Glu Ser Ile Gly Ser Val Ala Gly Tyr Leu Cys Thr Glu Gly Glu

165 170 175

Gln Lys Val Val Gly Leu Glu Ile Asn Ala Asn His Val Arg Ser Ala

180 185 190

Arg Glu Gly Arg Val Arg Gly Val Cys Lys Pro Leu His Leu Gly Ser

195 200 205

Arg His Gln Val Trp Gln Ile Glu Ile Phe Asp Glu Lys Gly Arg Leu

210 215 220

Cys Cys Ser Ser Arg Leu Thr Thr Ala Ile Leu

225 230 235

Claims (14)

1.一种以癸酸为原料利用大肠杆菌工程菌静息细胞制10-羟基-2-癸烯酸的方法，其特征在于，步骤如下：

（1）构建重组质粒pBbB5K-P450融合酶、重组质粒pBbB5K-FadK、重组质粒pBbB5K –MCAD、重组质粒pBbB5K-YdiI；

所述P450融合酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；脂酰CoA合成酶基因FadK的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；脂酰CoA脱氢酶基因MCAD的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示；酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

（2）利用步骤（1）制得的重组质粒pBbB5K-P450融合酶、重组质粒pBbB5K-FadK、重组质粒pBbB5K –MCAD、重组质粒pBbB5K-YdiI，构建pBbB5K-ydiI-MCAD- FadK- P450融合酶组合质粒；

（3）取步骤（2）制得的pBbB5K-ydiI-MCAD- FadK- P450融合酶组合质粒转化到的大肠杆菌，经筛选，诱导培养，制得诱导细胞；

所述诱导培养为将筛选培养的菌液降温至14～20℃适应0.5～2小时后，然后分别加入IPTG至浓度为0.32mM、加入癸烷至质量百分比浓度为2～5％、加入吐温80至质量百分比浓度为0.2～0.5％，继续诱导培养4～12小时，分离细胞，制得诱导细胞；

（4）将步骤（3）制得的诱导细胞经转化培养基培养，制得静息细胞，然后向培养基中加入癸酸至浓度为4～10g/L，在25～35℃条件下培养，制得10-羟基-2-癸烯酸；

所述转化培养基组份如下，均为质量百分比：

甘油0.8～1.2％, 葡萄糖0.3～0.5％,抗生素40～60μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，构建含有重组质粒pBbB5K -P450融合酶，包括如下步骤：

以经过密码子优化的水油海杆菌(Marinobacter aquaeolei)的烷烃羟化酶CYP153A与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium) P450NADH还原酶的融合酶基因为模板进行PCR扩增，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和P450NADH还原酶的融合酶基因分别用EcoRI和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K -P450融合酶；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH₂O9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1.45min，循环30次；72℃延伸5min。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，构建含有重组质粒pBbB5K-FadK，包括如下步骤：

以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增脂酰CoA合成酶基因FadK, 上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和脂酰CoA合成酶基因FadK分别用EcoRI和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K-FadK；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH₂O9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸5min。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，构建含有重组质粒重组质粒pBbB5K–MCAD，包括如下步骤：

以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增脂酰CoA脱氢酶基因MCAD, 上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和脂酰CoA脱氢酶基因MCAD分别用EcoRI和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K–MCAD；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH₂O9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸5min。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中，构建含有重组质粒pBbB5K-YdiI，包括如下步骤：

以大肠杆菌DH5a基因组为模板，扩增酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI, 上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，然后将pBbB5K-GPF质粒和酯酰辅酶A硫酯酶基因ydiI分别用EcoRI和Xho I分别进行双酶切，经连接酶连接，制得重组质粒pBbB5K-YdiI；

PCR扩增体系如下，总体系25μL：

100μM上游引物1.0μL，100μM下游引物1.0μL，模板1.0μL，5U/μL phanta酶12.5μL，ddH₂O9.5μL；

PCR扩增条件如下：

95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸30s,循环30次；72℃延伸5min。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述连接酶连接条件为22℃连接10min。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中，构建方法采用BglBrick法，构建pBbB5K-ydiI-MCAD- FadK- P450融合酶组合质粒的具体步骤如下：

将重组质粒pBbB5K -ydiI、pBbB5K -MCAD，pBbB5K-FadK分别利用EcoRI和BamHI 进行酶切，然后依次连接到经EcoRI和BglII酶切的重组质粒pBbB5K-P450融合酶上，获得pBbB5K-ydiI-MCAD- FadK- P450融合酶组合质粒。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，大肠杆菌为大肠杆菌MG1655。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，筛选为将转化后的大肠杆菌工程菌接入含有浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在35～40℃振荡筛选培养至菌液OD₆₀₀为0.8～1.2。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中，分离细胞为在5000rpm条件下离心15min，收集沉淀，然后用质量百分比浓度为0.85％的盐水洗涤。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，转化培养条件为在25～35℃条件下培养20小时。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，转化培养基组份如下，均为质量百分比：

甘油1％, 葡萄糖0.4％,抗生素50μg/mL，余量为pH7.4的浓度100mM的磷酸钾缓冲液。

13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，癸酸转化浓度为8g/L。

14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，癸酸溶解于二甲基亚砜。

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