CN115011537B

CN115011537B - 一株双厌氧启动子诱导产高光学纯l-乳酸的工程菌及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115011537B
Application number: CN202210670431.3A
Authority: CN
Inventors: 王金华; 赵筱; 王永泽; 张正; 黄金成; 许克强; 余杰; 刘宗求
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Jiangsu Cambrian Biological Cell Science Co ltd
Priority date: 2022-06-14
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2042-06-14
Also published as: CN115011537A

Abstract

本发明提供了一株双厌氧启动子诱导产高光学纯L‑乳酸的工程菌及其制备方法与应用，保藏编号为CCTCC NO：M 2022456。本发明还提供了所述产高光学纯L‑乳酸的工程菌在发酵产高光学纯L‑乳酸中的应用；通过分批发酵实验表明，该工程菌在20h内可发酵完成，发酵液中含乳酸量为106g/L，糖酸转化率达≥95％。在培养液中添加3g/L的D‑乳酸进行发酵时，L‑乳酸光学纯度为99.98±0.05％，明显高于出发菌株的97.12±0.09％。本发明通过增强L‑乳酸工程菌在在无氧条件下将D‑乳酸转变为丙酮酸的能力，能在发酵的同时有效消除发酵罐中的D‑乳酸，使目的产物L‑乳酸的光学纯度提高。

Description

一株双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及微生物学、生物化学和发酵工程技术领域，特别涉及一株产高光学纯度L-乳酸的工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

乳酸作为在食品，医药，化工，农药等行业的重要原料，具有巨大的生产经济价值。据报道，2016年全球乳酸总产量达到122万吨，并且每年以16.2％的比例增长。作为以L-乳酸为原料生产的高附加值产品聚L-乳酸(L-PLA)，由于其无毒、无刺激性、生物相容性好、且易降解的特点，在食品，医药以及化妆品行业的应用也越来越广泛。如用于合成植入人体内的固定材料，外科手术缝合线，生物可分解的食品包装容器及器具，化妆品包装材料等。

微生物发酵法由于原料来源广泛、生产成本低、产量高，对环境友好等优点现已成为国内外生产L-乳酸的主要方法。由于人体只能代谢L-乳酸，而无法代谢D-乳酸，因此L-乳酸光学纯度的高低决定了其用于合成L-PLA的附加价值与应用范围，特别是涉及到应用于人体的相关产业和产品。在微生物发酵生产L-乳酸时，一般要求光学纯度不低于99.5％，且越高越好。

因此，为了提高L-乳酸的光学纯度，有必要提供开发一种双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌及发酵生产高光学纯度L-乳酸的方法。

发明内容

本发明目的是提供一株双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌及其制备方法与应用，该菌株应用于L-乳酸发酵生产时，在全程厌氧发酵条件下，能有效消除发酵罐中的D-乳酸，使目的产物L-乳酸的光学纯度和糖酸转化率显著提高。

在本发明的第一方面，提供了一株双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌，所述双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌为Escherichia coli HBUT-L-LND，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022456。

在本发明的第二方面，提供了所述的工程菌在发酵产高光学纯度L-乳酸中的应用。

在本发明的第三方面，提供了一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包括：

将所述的双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌进行发酵获得的发酵液；

或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。

在本发明的第四方面，提供了所述工程菌的制备方法，所述方法包括：

以野生型E.coli W的基因组为模板，以SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.5所示的引物对进行扩增，获得片段1；

以野生型E.coli W的基因组为模板，以SEQ ID NO.6-SEQ ID NO.7所示的引物对进行扩增，获得片段2；

将所述片段1和所述片段2为模板，以SEQ ID NO.8-SEQ ID NO.9所示的引物对进行扩增，获得片段3；将所述片段3进行TA克隆并筛选阳性克隆，获得质粒pJH-ndld；

以所述质粒pJH-ndld为模板，以SEQ ID NO.10-SEQ ID NO.11所示的引物对进行扩增，并通过切胶回收纯化，获得片段4；

使用限制性内切酶Hind III对质粒pAGI02进行酶切，并通过切胶回收纯化，获得带有pflBp6的线性化质粒片段；

将所述片段4与所述带有pflBp6的线性化质粒片段进行无缝克隆，得到双厌氧启动子pflBp6和nirBp调控dld基因的质粒pJH-pndld；

将所述质粒pJH-pndld化转入菌株E.coli HBUT-L16，获得所述工程菌。

在本发明的第五方面，提供了采用所述的工程菌发酵高产光学纯L-乳酸的方法，所述方法包括：

将所述的双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌接种于种子培养基中进行种子培养，获得活化菌液；

将所述活化菌液接种于发酵培养基中进行发酵培养，获得光学纯L-乳酸。

进一步地，所述种子培养基的配方为：添加4wt％葡萄糖的LB培养基；所述种子培养的条件为温度37±0.5℃，转速200±20r/min。

进一步地，所述发酵培养基的配方为：1/5LB培养基，12wt％葡萄糖，添加3g/L D-乳酸；所述发酵培养的条件为温度37±0.5℃，200±20r/min，且所述发酵培养采用厌氧发酵：即添加23wt％氢氧化钙。

进一步地，所述活化菌液的OD₆₀₀至3-4时接种于发酵培养基中进行发酵培养。

进一步地，所述发酵培养中采用5-20％的接种量。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1、本发明通过双启动子稳定增强醌依赖性D-乳酸脱氢酶在厌氧条件下的表达，其效果明显优于单厌氧启动子的效果。通过酶活检测发现，单厌氧启动子对醌依赖性D-乳酸脱氢酶的单位酶活提高到3.73倍，而双厌氧启动子提高到5.27倍。

2、本发明采用的双启动子表达系统是自诱导型表达系统，不需要添加任何诱导剂，使发酵产品适宜用于食品医药等行业的应用。

3、本发明应用于L-乳酸发酵生产时，在全程厌氧发酵条件下，能有效消除发酵罐中的D-乳酸，使目的产物L-乳酸的光学纯度和糖酸转化率显著提高。通过分批发酵实验表明，工程菌E.coli HBUT-L-LND在20h内可发酵完成，发酵液中含乳酸量为106g/L，糖酸转化率达≥95％。在培养液中添加3g/L的D-乳酸分批发酵表明，出发菌株HBUT-L16发酵完成后发酵液中L-乳酸光学纯度为97.12±0.09％，而E.coli HBUT-L-LND可达99.98±0.05％。

本发明的双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌的保藏日期为2022年4月22日，保藏编号为CCTCC NO：M 2022456。其分类命名为Escherichia coli HBUT-L-LND，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为质粒pJH-pndld的物理图；

图2为质粒pJH-pndld构建的PCR验证电泳图。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

本发明的技术问题的发现过程如下：

野生型大肠杆菌只有产D-乳酸的能力。因此，一般构建L-乳酸大肠杆菌工程菌，可通过敲除其本身的D-乳酸脱氢酶基因，并插入外源的L-乳酸脱氢酶基因来实现。

本实验室前期，通过对E.coli W进行基因改造，敲除adhE,frdABCD,pta,pflB,aldA和cscR基因，构建得到D-乳酸工程菌HBUT-D。并以乳酸片球菌L-乳酸脱氢酶基因(ldhL)替换HBUT-D的D-乳酸脱氢酶基因(ldhA)，得到菌株HBUT-L，该菌株在以玉米浆培养基发酵时，乳酸产量可达108.3g/L，糖酸转化率在97％以上，L-乳酸光学纯度在99％以上(李坤朋，许雅洁，赵锦芳，王金华，大肠杆菌工程菌利用玉米浆发酵产L-乳酸的研究，中国酿造，2012，13(12)：64-67)。

后期通过28代耐乳酸钠驯化后得到HBUT-L16，以Ca(OH)₂为中和剂进行发酵时，相对于驯化前菌株HBUT-L，乳酸产量提高了4.4％，糖酸转化率提高了2.8％，生产强度增加了26.71％(文瑶，周玮，刘枣，王永泽，王金华，中和剂对大肠杆菌工程菌HBUT-L16发酵产L-乳酸的影响，中国酿造，2016，35(9)：43-46)。

在将菌株HBUT-L16运用于工业级发酵生产L-乳酸的过程中，我们发现不同批次的发酵，由于使用不同批次发酵原料(如玉米浆和工业级葡萄糖水中含有D-乳酸)，或是发酵罐所处环境中存在D-乳酸，会导致产物的光学纯度下降0.1％-0.2％，影响其使用价值。

因此，本发明为解决上述技术问题总体思路如下：

通过连接PCR将大肠杆菌醌依赖性D-乳酸脱氢酶基因(dld)和优化后的硝酸还原酶亚基B基因(nirB)启动子相连，再通过T5核酸外切酶介导的克隆将连接片段插入表达质粒pAGI02上丙酮酸甲酸裂解酶基因的启动子pflBp6的下游。其中，启动子nirBp位于nirB基因5’非编码区。核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

启动子pflBp6位于pflB基因5’非编码区。核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

dld基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：

具体地：

(1)构建带有双厌氧启动子调控的dld基因的质粒pJH-pndld；

PCR扩增大肠杆菌dld基因全长和nirB基因编码区上游(包括其启动子区域)的片段nirBp；

通过连接PCR连接nirBp和dld基因；

对连接片段nirBp+dld进行TA克隆并测序，将该质粒命名为pJH-ndld；

基于T5核酸外切酶进行克隆的方法，将片段nirBp+dld连接到质粒pAGI02的厌氧启动子pflBp6下游，构建双厌氧启动子调控质粒pJH-pndld。

(2)通过化转的方法将质粒pJH-pndld转入到菌株E.coli HBUT-L16，得到菌株E.coli HBUT-L-LND。本发明将上述菌株用于发酵生产高光纯L-乳酸。

本发明选择的nirBp和pflBp6两个启动子对环境中厌氧条件的响应途径不同，通过串联的方式能够多途径且灵敏地来感知厌氧环境，进而增强dld基因在厌氧条件下的稳定表达，旨在大肠杆菌L-乳酸工程菌的发酵过程中，能有效消除D-乳酸，保证目的产物L-乳酸的高光学纯度。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的一株双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌及其制备方法与应用进行详细说明。

实施例1、构建双厌氧启动子调控dld基因的质粒pJH-pndld

构建质粒pJH-pndld的具体操作步骤如下：

(1)以野生型E.coli W的基因组为模板，以dld-P1和dld-P2为引物，扩增dld基因序列，所用PCR酶为primstar酶。所述野生型E.coli W为E.coli W3110野生型，可购买自百欧博伟生物，平台编号：bio-82057。

表1-本发明中的PCR引物序列

(2)以野生型E.coli W的基因组为模板，以nirBp-P1和nirBp-P2为引物，扩增nirB基因上游序列(包括启动子序列)nirBp，所用PCR酶为primstar酶。

(3)用PCR产物纯化试剂盒纯化(1)和(2)的PCR产物，以分子摩尔比为1：1的比例取纯化后的DNA片段作为模板(模板总量不超过100ng)，以ndld-P1和ndld-P2为引物，通过PCR反应将nirBp与dld片段连接起来，所用PCR酶为Taq酶。

(4)将(3)的连接片段nirBp+dld进行TA克隆。并对抗性平板筛选得到的阳性克隆进行测序验证，将验证正确的质粒命名为pJH-ndld。

(5)使用限制性内切酶Hind III对质粒pAGI02进行酶切，并通过切胶回收纯化，获得带有pflBp6的线性化质粒片段；其中，实施例中的质粒pAGI02是以PUC19质粒作为基本骨架构建而成，其上带有优化后的丙酮酸甲酸裂解酶基因的启动子区域(pflBp6)。质粒pAGI02记载于：Iverson A,Garza E,Zhao J,Wang Y,Zhao X，Wang J，Manow R，ZhouS.Increasing reducing power output(NADH)of glucose catabolism for reductionof xylose to xylitol by genetically engineered Escherichia coli AI05.World JMicrobiol Biotechnol.2013,29(7):1225-1232.

(6)以质粒pJH-ndld为模板，以ndld-P3和ndld-P4为引物进行PCR扩增，所用PCR酶为Taq酶。通过切胶回收纯化扩增的片段。本发明实施例1和实施例2所用的质粒和菌株见表2。

表2-本发明中所用的菌株和质粒

(7)将(6)步纯化的片段和(5)步纯化的线性化质粒按照分子摩尔比3:1加入适量体积(DNA总量不超过2ug)，T5 Exonuclease 1μL(10U/μL),10X Reaction Buffer 5μL,补水至总体积为50μL，在4℃反应5min后，立即用热击法化转入DH5α感受态细胞，并通过抗性平板筛选阳性克隆。

(8)以pndld-P1和pndld-P2为引物，通过PCR对阳性克隆进行验证(如图2)，得到双厌氧启动子pflBp6和nirBp调控dld基因的质粒pJH-pndld(如图1)。

实施例2、获得菌株E.coli HBUT-L-LND

1、菌株HBUT-L16

详见文献：文瑶，周玮，刘枣，王永泽，王金华，中和剂对大肠杆菌工程菌HBUT-L16发酵产L-乳酸的影响，中国酿造，2016，35(9)：43-46.

2、取200μL以CaCl₂法制备的E.coli HBUT-L16感受态细胞于预冷的、无菌的1.5mLEP管中，加入1μL质粒，用移液枪轻柔的吹打混匀，置于冰上30min；42℃水浴锅中热冲击2min，快速放到冰上5min；向EP管中加入1mL LB(2％葡萄糖)液体培养基，摇床中30℃，150r/min，复苏培养2h；取200μL复苏后菌液均匀的涂布于含有氨苄霉素的LB固体平板上，将平板倒置放于37℃恒温培养箱中培养过认；从平板上筛选出的单克隆，于氨苄固体平板上转接1～2代。通过这种化转的方法将质粒pJH-pndld转化入HBUT-L16，得到重组菌株HBUT-L-LND。其中，菌株HBUT-L-LND的保藏日期为2022年4月22日，保藏编号为CCTCC NO：M2022456。其分类命名为Escherichia coli HBUT-L-LND，保藏单位名称为中国典型培养物保藏中心，地址为中国湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072。

对比例1

通过化转的方法将实施例1中的质粒pJH-ndld转化入菌株HBUT-L16，得到菌株HBUT-L-LD。

实验例1、D-乳酸脱氢酶(Dld)的酶活检测

1、提取粗酶液：从平板上挑取2-3个单菌落接种于50mL液体LB培养基中，在37℃、200r/min的条件下培养过夜，按1％的接种量转接到装液量为150mL液体LB培养基的250mL摇瓶中，在37℃、200r/min的条件下12h，离心收集菌体。加入15mL缓冲液(含0.5％TritonX-100)重悬，超声波破碎(超声功率为300W，工作15s,间隔15s，时间为10min)得到细胞裂解液，12000r/min,离心5min，收集上清液即为粗酶液。粗酶液的总蛋白含量用以BSA为标准蛋白的Lowry法进行检测。

2、酶活检测：每毫升反应体系：10uL、10mg/L的PMS，1uL、10umol/mL的FAD-Na₂，50uL 5mg/mL的MTT，500uL 1mg/mL的D-乳酸，50uL适量稀释的酶液，并用0.067mol/L，pH7.0磷酸钾缓冲液将总体积补至1mL。在37℃，pH 7.0的条件下反应20min，冰浴5min终止反应，测定570nm下的吸光度。以灭活酶液作为对照。酶活单位(u)定义为：在37℃，pH 7.0的条件下，每分钟还原1umol MTT所需酶量定义为1个单位。

D-乳酸脱氢酶(Dld)酶活结果如表3所示。

表3 D-乳酸脱氢酶(Dld)的酶活

上述表3的酶活结果表明，相对于出发菌株HBUT-L16，HBUT-L-LD的单位酶活提高至3.73倍，而HBUT-L-LND的单位酶活提高到5.27倍。厌氧启动子调控对dld基因的表达有明显上调作用，且双启动子串联的调控效果要更优于单启动子调控效果。

实验例2、发酵产L-乳酸

通过发酵实验对比三株菌(出发菌株HBUT-L16、实施例2的菌株E.coli HBUT-L-LND、对比例1的菌株E.coli HBUT-L-LD)发酵产L-乳酸的能力；具体操作步骤如下：

从平板上挑一个单菌落，接种于含有10mL种子培养液的无氧管中，37℃过夜培养。取2mL菌液接种于300mL种子液中，37℃下200r/min培养OD600至3.5左右。以10％(v/v)的接种量将菌液接种至5L发酵培养基中，置于带自动调节系统的7L发酵罐Sartorius BB-8846880(德国Sartorius Stedim Biotech公司)中，37℃下200r/min培养发酵，以23％氢氧化钙为中和剂控制pH为7.0。以12％葡萄糖为底物培养至发酵结束。定时取样，测定菌体浓度、葡萄糖、乳酸及其它代谢产物的浓度和乳酸的光学纯度。种子培养基：LB培养基，4％葡萄糖。发酵培养基：1/5LB培养基(即组分浓度为标准LB培养基成分的1/5)，12％葡萄糖，3g/L的D-乳酸。

菌体浓度测定时先用3mol/L HCl溶液酸解，再在可见光分光光度计测定波长600nm下OD值。葡萄糖和有机酸采用高效液相色谱仪Waters e2695(美国Waters公司)分析，色谱柱为Bio-Rad HPX 87H，流动相为4mmol/L H₂SO₄，流速0.5mL/min，柱温40℃，检测器为PDA、ELS检测器。乳酸光学纯度采用高效液相色谱仪Waters e2695(美国Waters公司)分析，色谱柱为手性柱EC 250/4NUCLEOSIL CHIRAL-1，流动相为2mmol/L CuSO₄，流速0.5mL/min，柱温40℃，检测器为PDA检测器。发酵结果如表4所示。

表4发酵结果

由表4可知，工程菌HBUT-L-LND在20h内发酵液含乳酸106g/L，糖酸转化率达96％以上。在添加3g/L D-乳酸时，出发菌株HBUT-L16，带单厌氧启动子调控质粒的菌株HBUT-L-LD，带有双厌氧启动子调控质粒的菌株HBUT-L-LND发酵产L-乳酸的最终光学纯度分别为97.12±0.09％,99.80±0.02％和99.98±0.05％。这也说明菌株HBUT-L-LND在厌氧发酵过程中，能有效的消除D-乳酸，提高目的产物L-乳酸的光学纯度，从而提高产品的使用价值。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 湖北工业大学

<120> 一株双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌及其制备方法与应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 109

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagcaatata cccattaagg agtatataaa ggtgaatttg atttacatca ataagcgggg 60

ttgctgaatc gttaaggtag gcggtaatag aaaagaaatc gaggcaaaa 109

<210> 2

<211> 293

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaccatgcga gttacgggcc tataagccag gcgagatatg atctatatca atttctcatc 60

tataatgctt tgttagtatc tcgtcgccga cttaataaag agagagttag tgtgaaagct 120

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gtctataaag caacgaaaca tccgcttaag actttctatc tggcgattac cgccggtgtt 240

ttcatctcaa tcgcattcgt cttctatatc acagcaacca ctggcacagg cac 293

<210> 3

<211> 1715

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcttcca tgacaacaac tgataataaa gcctttttga atgaacttgc tcgtctggtg 60

ggttcttcac acctgctcac cgatcccgca aaaacggccc gctatcgcaa gggcttccgt 120

tctggtcagg gcgacgcgct ggctgtcgtt ttccctggct cactactaga attgtggcgg 180

gtgctgaaag cctgcgtcac cgccgacaaa attattctga tgcaggccgc caatacaggc 240

ctgaccgaag gatcgacgcc aaacggtaac gattatgatc gcgatgtcgt tatcatcagc 300

accctgcgtc tcgacaagct gcacgttctt ggcaagggcg aacaggtgct ggcctatccg 360

ggcaccacgc tctattcgct ggaaaaagcc ctcaaaccgc tgggacgcga accgcactca 420

gtgattggat catcgtgtat aggcgcatcg gtcatcggcg gtatttgtaa caactccggc 480

ggctcgctgg tgcaacgtgg cccggcgtat accgaaatgt cgttattcgc gcgtataaat 540

gaagacggca aactgacgct ggtgaaccat ctggggattg atctgggcga aacgccggag 600

cagatcctta gcaagctgga tgatgatcgc atcaaagatg acgatgtgcg tcacgatggt 660

cgtcacgccc acgattatga ctatgtccac cgcgttcgtg atattgaagc cgacacgccc 720

gcacgttata acgccgatcc tgatcggtta tttgaatctt ctggttgcgc cgggaagctg 780

gcggtctttg cagtacgtct tgataccttc gaagcggaaa aaaatcagca ggtgttttat 840

atcggcacca accagccgga agtgctgacc gaaatccgcc gtcatattct ggctaacttc 900

gaaaatctgc cggttgccgg ggaatatatg caccgggata tctacgatat tgcggaaaaa 960

tacggcaaag acaccttcct gatgattgat aagttaggca ccgacaagat gccgttcttc 1020

tttaatctca agggacgcac cgatgcgatg ctggagaaag tgaaattctt ccgtccgcat 1080

tttactgacc gtgcgatgca aaaattcggt cacctgttcc ccagccattt accgccgcgc 1140

atgaaaaact ggcgcgataa atacgagcat catctgctgt taaaaatggc gggcgatggc 1200

gtgggcgaag ccaaatcgtg gctggtggat tatttcaaac aggccgaagg cgatttcttt 1260

gtctgtacgc cggaggaagg cagcaaagcg tttttacacc gtttcgccgc tgcgggcgca 1320

gcaattcgtt atcaggcggt gcattccgat gaagtcgaag acattctggc gttggatatc 1380

gctctgcggc gtaacgacac cgagtggtat gagcatttac cgccggagat cgacagccag 1440

ctggtgcaca agctctatta cggccatttt atgtgctatg tcttccatca ggattacata 1500

gtgaaaaaag gcgtggatgt gcatgcgtta aaagaacaga tgctggaact gctacagcag 1560

cgcggcgcgc agtaccctgc cgagcataac gtcggtcatt tgtataaagc accggagacg 1620

ttgcagaagt tctatcgcga gaacgatccg accaacagca tgaatccggg gatcggtaaa 1680

accagtaaac ggaaaaactg gcaggaagtg gagta 1715

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gaaaagaaat cgaggcaaaa atgattattt ccgcagccag cg 42

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acatacagcg ccgaacggtc 20

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ccgtgactta agaaaattta tac 23

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctggctgcgg aaataatcat ttttgcctcg atttcttttc 40

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cagcaatata cccattaagg agtat 25

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aacgactatg ccgcattc 18

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcaaccactg gcacaggcac cagcaatata cccattaagg agtat 45

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

accatgatta cgccaagctt tactccactt cctgccag 38

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

attatgacta tgtccaccgc 20

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

caatttcaca caggaaacag c 21

Claims

1.一株双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌，其特征在于，所述双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌为Escherichia coli HBUT-L-LND，保藏编号为：CCTCCNO：M 2022456。

2.一种权利要求1所述的工程菌在发酵高产光学纯L-乳酸中的应用。

3.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包括：

将如权利要求1所述的双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌进行发酵获得的发酵液；

或将所述发酵液经喷雾干燥获得干粉菌剂。

4.一种双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

5.一种利用权利要求1所述的工程菌发酵高产光学纯L-乳酸的方法，其特征在于，所述方法包括：

将权利要求1所述的双厌氧启动子诱导产高光学纯L-乳酸的工程菌接种于种子培养基中进行种子培养，获得活化菌液；

将所述活化菌液接种于发酵培养基中进行发酵培养，获得高光学纯度的L-乳酸。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子培养基的配方为：添加4 wt%葡萄糖的LB培养基；所述种子培养的条件为温度37±0.5℃，转速200±20 r/min。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：1/5 LB培养基，12 wt%葡萄糖，添加3 g/L D-乳酸；所述发酵培养的条件为温度37±0.5℃，200±20 r/min，且所述发酵培养采用全程厌氧发酵并添加中和剂，所述中和剂为23 wt%氢氧化钙。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述活化菌液的OD600 至3-4时接入发酵培养基中进行发酵培养。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养中采用5-20%的接种量。