CN102433313B - 一种l-atc水解酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种L-ATC水解酶和编码基因序列及其重组表达蛋白质的制备及应用。本发明所提供的来源于假单胞菌（保藏号CGMCC No.5315）的L-ATC水解酶是序列表中SEQIDNo.1的氨基酸残基序列或将SEQIDNo.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的替代、缺失或添加具有与SEQIDNo.1相同活性的由SEQIDNo.1衍生的蛋白质。编码基因序列是序列表中SEQIDNo.2的核苷酸序列。本发明将来源于假单胞菌的L-ATC水解酶基因克隆并表达制备重组酶，可用于生物法水解L-ATC生产N-氨甲酰-L-半胱氨酸(L-NCC)，进一步用于酶法生产L-半胱氨酸。

Description

一种L-ATC水解酶和编码基因及其重组表达蛋白质的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及来源于假单胞菌的一种L-ATC水解酶的编码基因，以及重组蛋白质的表达与应用。
背景技术
L-ATC水解酶(L-ATC hydrolyse)是一种催化L-ATC(L-2-氨基Δ2-噻唑啉-4-羧酸，L-2-amino-Δ2-thiazoline-4-carboxylic acid)水解产生N-氨甲酰-L-半胱氨酸(N-carbamyl-L-cysteine，L-NCC)的酶。因为L-NCC可作为中间产物，经N-氨甲酰-L-半胱氨酸酰胺水解酶(L-NCC酰胺水解酶)催化生成终产物L-半胱氨酸，所以L-ATC水解酶是参与酶法转化生产L-半胱氨酸的重要成员之一。具体过程参见附图1。
L-半胱氨酸(L-cysteine)是组成蛋白质的20种氨基酸之一，是一种α氨基酸，它的存在可以保持蛋白质的稳定性，同一条或不同多肽链两个L-半胱氨酸残基间以二硫键(-S-S-)连接，使蛋白质具有稳定的空间立体结构。L-半胱氨酸在医药、食品、饲料、化妆品等行业具有广泛的用途，日益受到重视。目前L-半胱氨酸的生产方法主要有毛发水解后还原法、化学合成法、发酵法和酶法合成法等。近年来，以微生物为酶源，采用酶法制备氨基酸的技术有了快速的发展。微生物酶法具有特异性强、生产工艺简单、副反应和副产物少等优点。特别是近年来，以酶法合成替代难于用发酵法生产的氨基酸，有了显著的进步。目前，有3种微生物酶法转化合成L-半胱氨酸的工艺路线：(1)以3-氯-L-丙氨酸为前体物的L-半胱氨酸酶法合成；(2)以O-乙酰丝氨酸为前体物的酶法合成L-半胱氨酸；(3)以DL-ATC为前体物的酶法生产L-半胱氨酸。
DL-ATC是以丙烯酸甲酯为前体物合成的化工产品。日本学者Sano等于1977年以添加甘油和DL-ATC的极限培养基进行筛选，从388个土样中筛选到一株嗜硫氮杂环戊烯假单胞菌AJ3854，该菌株可以以DL-ATC为底物合成L-半胱氨酸。以培养18h的AJ3854细胞为酶源，添加1％DL-ATC·3H2O、1％KH2PO4和0.14％盐酸羟胺的缓冲液为底物溶液，二者按一定比例混合后在30℃反应24h后，在反应液中可产生6.1g/L的L-半胱氨酸(反应过程中有部分L-半胱氨酸氧化为L-胱氨酸，均以L-半胱氨酸计)。Sano又以其实验室中37个属的463株菌株为实验对象，研究了这些菌株以DL-ATC为底物的L-半胱氨酸合成能力，研究发现，除了假单胞菌之外，其余22株菌(分属13个属)也可以以DL-ATC为底物合成L-半胱氨酸，这些属的代表菌株及其转化能力如表1所列。
表1不同细菌转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的产量
Figure GDA0000131019810000021
对DL-ATC酶法合成L-半胱氨酸转化途径的研究最早开始于1979年，日本学者Sano提出了完成该转化过程的两种假设：一种是以S-氨甲酰-L-半胱氨酸(S-carbamyl-L-cysteine，L-SCC)为中间产物的S-代途径；另一种是以L-NCC为中间产物的N-代途径，反应过程和酶系如附图1所示。其中以N-氨甲酰-L-半胱氨酸为中间产物的转化途径最初于1998年由Tamura报道。该学者对L-半胱氨酸合成菌株假单胞菌ON-4a和AJ3865进行研究，诱导实验发现，如果分别以DL-ATC、L-NCC和L-SCC为诱导物进行细胞培养，诱导后的细胞加入不同的底物进行酶活测定，仅DL-ATC诱导后的细胞具有L-ATC水解酶活性；而且各种细胞均有L-NCC酰胺水解酶活性而无L-SCC酰胺水解酶活性，而且各种细胞均不能够利用N-氨甲酰-D-半胱氨酸、S-氨甲酰-L-半胱氨酸和S-氨甲酰-D-半胱氨酸为底物进行酶促反应生成L-半胱氨酸。Tamura还对中间产物进行了纯化，纯化后的产物经过红外光谱扫描、质谱分析、核磁共振分析和元素分析，结果与标准的N-氨甲酰-L-半胱氨酸完全相同，因此证明了这两株菌进行以L-NCC为中间产物的L-半胱氨酸合成代谢途径。
目前，有关酶法合成L-半胱氨酸相关酶系的报道不多。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的L-ATC水解酶及其编码基因，获得活力较高的重组酶，并且这种L-ATC水解酶可在制备L-NCC及进一步酶法生产L-半胱氨酸中应用。
本发明申请人从污泥中分离得到了一株新的假单胞菌Pseudomonas sp.QR-101，于2011年10月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC No.5315，它进行以L-NCC为中间产物的L-半胱氨酸合成代谢途径，涉及ATC消旋酶、L-ATC水解酶和L-NCC酰胺水解酶等3个酶的协同催化作用。
本发明提供的L-ATC水解酶，来源于假单胞菌Pseudomonas sp.QR-101，是序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列或将SEQ ID No.1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的缺失、替代或添加且具有与SEQ ID No.1相同活性的由SEQ ID No.1衍生的蛋白质。
序列表中SEQ ID No.1的氨基酸残基序列是由173个氨基酸残基组成的蛋白质。
本发明所提供的L-ATC水解酶的编码基因，是下列核苷酸序列之一：
(1)序列表中SEQ ID No.2的DNA序列，由519个碱基组成；
(2)编码序列表中SEQ ID No.1蛋白质序列的多核苷酸序列。
含本发明基因的表达载体及细胞体系均属于本发明的保护范围。所述的细胞体系为原核细胞体系。
本发明重组L-ATC水解酶蛋白可以通过以下方法获得：培养含有L-ATC水解酶表达载体的宿主菌E.coli BL21/pET-21a(+)-atcB，该细胞体系为原核细胞体系，在所规定的蛋白质表达条件下，获得表达产物L-ATC水解酶。
本发明的L-ATC水解酶及其变法基因可在制备L-NCC及进一步微生物酶法生产L-半胱氨酸中应用。
本发明的有益效果：
本发明从一株假单胞菌中成功地克隆到一个新的L-ATC水解酶基因并进行了表达/重组酶的制备和转化等研究，本发明涉及的L-ATC水解酶的氨基酸序列通过GenBank Blast发现，与来自Pseudomonas sp.Strain BS的atcB(GenBank：BAD15359.1)的同源性为90％，它们的核苷酸序列同源性为88％。利用高效表达L-ATC水解酶的大肠杆菌E.coliBL21/pET-21a(+)-atcB，水解L-ATC生产L-NCC，催化效率高，发酵成本低，且反应液中成分单一，后续分离纯化方便，生成的L-NCC可作为L-半胱氨酸的中间体，因此本发明在L-半胱氨酸和L-胱氨酸的工业化生产领域具有良好的产业化价值。
附图说明
图1：是酶法转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的S-代和N-代途径示意图；
图2：是Pseudomonas sp.QR-101的L-ATC水解酶与数据库中已知序列L-ATC水解酶(GenBank：BAD15359.1)的核苷酸序列比对。
图3：是重组质粒pET-21a(+)/atcB的图谱。
图4：是基因工程菌E.coli BL21/pET-21a(+)-atcB的酶切鉴定图。其中：泳道M：DNAMarker 15000；泳道1：Bam HI单酶切质粒；泳道2：Bam HI和HindIII双酶切质粒pET-21a(+)-atcB(+)；泳道3：Bam HI和Hind III双酶切质粒pET-21a(+)；泳道4：以Pseudomonas sp.QR-101的基因组DNA为模板的PCR产物；以质粒pET-21a(+)-atcB为模板的PCR产物。
图5：是基因工程菌E.coli BL21/pET-21a(+)-atcB表达蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中，泳道1：Pseudomonas sp.QR-101；泳道2：基因工程菌E.coliBL21/pET-21a(+)-atcB；泳道3：E.coli BL21/pET-21a(+)。
图6：是酶催化L-ATC生成L-NCC的薄层层析图谱。其中，第1道：L-ATC标准品；第2道：L-NCC标准品；第3道：酶催化反应液。
具体实施方式
实施例1
L-ATC水解酶的克隆及一级结构特征
本发明人从假单胞菌Pseudomonas sp.QR-101中提取基因组DNA，然后用HindIII酶切基因组DNA，用胶回收试剂盒从1.2％的琼脂糖凝胶上分别回收2-9kb的Hind III酶切片段，将回收的酶切片段连接在经相同酶切处理的pUC18载体上，转入E.coli JM109中，在涂有X-gal和IPTG的平板上进行蓝白初筛。
将含有插入片段的重组白色单菌落，分别挑入每孔含50μL LB培养基，37℃过夜培养后，加入100μL 0.6％L-ATC作为底物，同时加入L-NCC酰胺水解酶(其基因序列见序列表SEQ ID No.3)0.5U，于35℃振荡30min，分别加入150μL酸性茚三酮进行显色反应，以不加培养液的空白作为对照。
通过微孔板复筛较高活性的重组子，并抽提质粒，然后进行DNA序列测定，结果显示阳性重组子PU113中含有插入片段为2630bp，在其中位于230-748bp间有一个完整的读码框，为519bp(SEQ ID No.2)，G+C含量为61.46％，编码173aa，其计算分子量为19.25kD。将该DNA序列通过GenBank Blast发现，与来自Pseudomonas sp.Strain BS的atcB(GenBank：BAD15359.1)的同源性为92％，它们的核苷酸序列同源性为88％。因此，本发明的L-ATC水解酶基因序列不同于现有文献报道的类似酶的序列，它是一个新基因。
实施例2
大肠杆菌基因工程菌的构建及重组L-ATC水解酶的表达
根据测序结果，按照该蛋白质编码基因的两末端序列设计引物P1和P2，其中上游P1：5’-CCC GGA TCC ATG AGT GAT AAG CCA GTC CAC AG-3’含有Bam HI酶切位点；下游引物P2：5’-CCC AAG CTT TCA TTT CTG GCC ACC CTG TTG TT-3’含有HindIII酶切位点。
以假单胞菌Pseudomonas sp.QR-101的基因组为模板，按如下PCR程序进行DNA扩增：
94℃变性1min，66℃复性1min，72℃延伸1min，扩增反应进行30个循环。
PCR扩增产物经Bam HI和Hind III双酶切后，连接到经相同酶切后的载体pET-21a(+)，构建重组子pET-21a(+)/atcB。
获得的重组子pET-21a(+)/atcB采用CaCl2法转化宿主菌大肠杆菌BL21(DE3)，经鉴定后获得BL21(pET-21a(+)/atcB)工程菌。
将BL21(pET-21a(+)/atcB)工程菌于37℃活化过夜，按1∶100转接到100mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养至对数生长期；加入终浓度为1mM的IPTG，37℃继续培养3h；4℃，6,000r/min离心10min，收集菌体，加入0.1mol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)悬浮洗涤后，6,000r/min离心10min，收集菌体，重复洗涤一次，加入磷酸钾缓冲液制成酶源细胞悬液。
实施例3
L-ATC水解酶活力的测定方法
(1)原理：采用酸性茚三酮法。L-ATC水解酶水解L-ATC生成L-NCC，L-NCC能被L-NCC酰胺水解酶分解生成L-半胱氨酸，L-半胱氨酸在煮沸的条件下与酸性茚三酮试剂生成红色物质，在560nm下有最大吸收，其颜色深浅与L-半胱氨酸的量成正比。
(2)方法：在1％的L-ATC的溶液中加入6％的K2HPO4至pH值7.5配成底物终浓度为0.75％的溶液，然后取1mL的底物溶液，加入0.5mL实施例2制备的酶源细胞悬液，同时加入50U L-NCC酰胺水解酶，于37℃水浴中反应10min。
反应液中L-半胱氨酸含量测定采用酸性茚三酮法，取反应液0.2mL，加入0.2mL冰醋酸，再加入0.2mL酸性茚三酮试剂(称取250mg茚三酮，溶于6mL乙酸和4mL浓盐酸的混合液中)，于沸水浴中反应10min，然后立即在冷水中冷却，最后加入2.4mL工业酒精，总体积3mL，放置10min后于560nm下比色，以不加酶源细胞悬液的反应液作空白对照。
L-半胱氨酸测定标准曲线的建立：精确配制1mmol/L L-半胱氨酸标准溶液，分别用蒸馏水稀释至以下浓度：0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1mmol/L。分别取0.2mL不同稀释度的溶液加入0.2mL冰醋酸，再加入0.2mL酸性茚三酮试剂，于沸水浴中反应10min，然后立即在冷水中冷却，最后加入2.4mL工业酒精，总体积3mL，放置10min后于560nm下比色，以L-半胱氨酸的浓度为横坐标、以A560nm为纵坐标绘制标准曲线。
酶活力定义：在上述反应条件下，每分钟生成1微摩尔L-半胱氨酸产物所需的酶量定为一个酶活力单位。
测定相应的L-ATC水解酶活力，大肠杆菌基因工程菌酶源细胞的酶活可达1045U/g。
取150g/L的酶源细胞悬液20mL，加入6.25g/L的L-ATC底物溶液80mL混合，在35℃下进行催化反应2h，反应完毕后的反应液经三氯乙酸去除蛋白后进行薄层层析(展层液配比为：异丙醇∶浓氨水＝1∶1)，与标准品进行对照，结果见图6。从图中可以看出，在第3展层道，酶催化L-ATC后的产物为L-NCC(图中所示还有少部分底物L-ATC未转化成产物L-NCC)。
实施例4
以重组大肠杆菌的发酵菌体为酶源细胞，转化L-ATC生产L-半胱氨酸
L-NCC是酶法转化DL-ATC(或L-ATC)合成L-半胱氨酸过程的中间产物。L-ATC水解酶能够催化水解L-ATC生成L-NCC，L-NCC再经L-NCC酰胺水解酶催化生成终产物L-半胱氨酸，L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于医药、食品、化妆品以及饲料工业。
①反应体系组成：
底物：5g/L的L-ATC
反应温度：35℃
PH：8.0
酶源细胞悬液：8g/L
L-NCC酰胺水解酶：500U/L
②转化率：
酶源细胞悬液为8g/L，底物L-ATC的浓度为5g/L，反应体系为3L，35℃反应2h后，在上述条件下，底物转化率约为85％。
Figure IDA0000109353080000021
Figure IDA0000109353080000031

Claims (6)

1.一种L-ATC水解酶，其特征在于，是序列表中SEQ ID No.1氨基酸序列的蛋白质。
2.一种权利要求1所述的L-ATC水解酶的编码基因，其特征在于，是编码序列表中的SEQ ID No.1蛋白质序列的多核苷酸序列。
3.一种含有权利要求2所述基因的表达载体。
4.一种含有权利要求2所述基因的细胞体系。
5.根据权利要求4所述的细胞体系，其特征在于，所述的细胞体系为原核细胞系统。
6.权利要求1所述的L-ATC水解酶在微生物酶法生产L-半胱氨酸中的应用。
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