CN103898072A - 一种酮还原酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酮还原酶突变体及其应用，所述突变体酮还原酶是将SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的第21位的色氨酸残基突变为谷氨酰胺或丝氨酸，同时将第86位的色氨酸残基突变成谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺或缬氨酸；本发明突变体酮还原酶改变了野生型酮还原酶对酮酯类化合物（如：2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或2,4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯）催化的立体倾向性，生成的主要产物（如：2-羟基-4-苯基丁酸乙酯或2-羟基-4-氧代-4-苯基丁酸乙酯）由（S-）构象变成了（R-）构象，并且对映体过量值（ee值）由76.7%（S-）转变为99.4%（R-）。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种酮还原酶及制备手性羟基酯中的应用，特别涉及突变体酮还原酶、编码基因、载体、重组工程菌及应用。
（二）背景技术
酮还原酶（Ketoreductase）是一种普遍存在于自然界中的氧化还原酶，它能将含羰基物质（如酮酯、酮酸等）不对称还原成相应的手性醇。酮还原酶催化酮类的还原需要辅因子向羰基转移氢，常用的辅因子是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）。
相较于化学合成过程中出现的催化剂价格昂贵、污染环境、产物纯度不高、催化条件苛刻等问题，酮还原酶因其高效、高立体选择性、条件温和及绿色环保等众多优点而广泛用于光学活性物质的合成。比如，还原二氧羧酸类(例如美国专利第6,399,339号)；还原(S)氯-5-羟基-3-氧代己酸叔丁酯(例如美国专利第6,645，746号和WO01/40450)；还原基于吡咯并三嗪的化合物(例如美国申请第2006/0286646号)；还原取代的乙酰苯(例如美国专利第6,800，477号)；以及还原羟基四氢噻吩(hydroxythiolanes)(WO2005/054491)。可见，酮还原酶是一种非常有效的生物催化剂。
虽然野生型酮还原酶对于其天然底物通常具有较好的反应活性和选择性，但是对于非天然底物，它们的反应活性、稳定性和选择性却常不尽人意。然而，酮还原酶在工业生产当中多数情况下是非天然底物，这就要求对野生型酮还原酶进行改造，以提高其对非天然底物的反应活性、稳定性和选择性（包括化学选择性、区域选择性和立体选择性）。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种突变体酮还原酶（即酮还原酶突变体），以及该突变体在高效、高立体选择性催化非天然底物中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种突变体酮还原酶，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示（优选从超嗜热菌（Thermotoga maritima筛选得到），所述突变体酮还原酶是将SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的第21位的色氨酸残基突变为谷氨酰胺或丝氨酸，同时将第86位的色氨酸残基突变成谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺或缬氨酸。
进一步，优选所述突变体酮还原酶的氨基酸序列具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQID NO：6所示氨基酸序列80%以上同源性，更优选所述突变体酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。
本发明还提供一种编码所述突变体酮还原酶的基因。
本发明提供一种含有所述突变体酮还原酶编码基因的重组载体。
本发明提供一种含有所述重组载体的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌的构建方法为：构建含突变体酮还原酶编码基因的重组载体，将所述重组载体转化至所述宿主体内，将获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化得到含突变体酮还原酶的菌体细胞。
此外，本发明提供一种所述突变体酮还原酶在制备光学活性羟基酯中的应用，所述的应用为：将含突变体酮还原酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体用PBS缓冲液重悬后进行超声破碎、离心，取上清液在70℃下水浴1h，再次离心，取再次离心获得的上清液作为酶源，以酮酯类化合物为底物，以葡萄糖为辅助底物，以葡糖糖脱氢酶和还原性辅酶NADP+作为辅助酶源，加入二甲基亚砜，于水中构成pH7.2～7.4的转化体系，在25～37℃、150～250rpm条件下转化反应（优选37℃、200rpm反应12小时），反应完全后，取反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层即获得含有光学活性羟基酯的混合液，将混合液分离纯化，即获得光学活性羟基酯；所述酶源的用量以超声破碎前湿菌体的菌体干重计为10～20g/L转化体系，所述底物的初始浓度为7～10mmol/L，葡萄糖的初始浓度为10～20mmol/L，所述葡糖糖脱氢酶的用量为5～10U/L，所述还原性辅酶NADP+的用量为0.05～0.1mM，所述二甲基亚砜的体积终浓度为1.5%。
进一步，所述酮酯类化合物为2-氧代-4-苯基丁酸乙酯、2,4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯、乙酰乙酸乙酯、4-氯乙酰乙酸乙酯、甲酰乙酸乙酯、丙酰乙酸乙酯或甲酰甲酸乙酯。
更进一步，所述酶源的用量以超声破碎前湿菌体的菌体干重计为10g/L转化体系，所述底物的初始浓度为7mmol/L转化体系，所述葡萄糖的初始浓度为10mmol/L转化体系，所述葡糖糖脱氢酶的用量为5U/L转化体系，所述还原性辅酶NADP+的用量为0.05mM转化体系，所述二甲基亚砜的体积终浓度为1.5%。
本发明所述酶源按如下方法制备：将含有突变体酮还原酶基因的重组工程菌接种至液体LB培养基，37℃培养3～5h，获得种子液；所述液体LB培养基质量终浓度组成为：1%酵母粉，1%蛋白胨，0.5%NaCl，溶剂为水，pH值为7.2～7.4；
将种子液以体积比1：100的接种量接种至自诱导培养基，20～25℃培养48h，将培养液离心，收集湿菌体，将湿菌体用pH7.2～7.4的PBS缓冲液重悬，在200W条件下超声破碎5min，再将破碎液离心，取上清液（即粗酶液）在70℃下水浴1h，再次离心，取再次离心获得的上清液（即纯酶液）作为酶源；所述自诱导培养基的终浓度组成为：阿拉伯糖3g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸盐6.8g/L，硫酸盐1.2g/L，NH4Cl2.65g/L，MgSO40.98g/L，CaCl20.1g/L，溶剂为水，pH值为7.2～7.4。
本发明所述突变体酮还原酶的酶活定义：每分钟消耗1μmol NADPH所需要的酶量为一个酶活单位（U）。
相对酶活：以野生型酮还原酶催化EOPB的酶活力为100%标准，测得的突变体酮还原酶的酶活力即为相对酶活。
由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1～SEQ ID No.6之一所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在80%以上，均属于本发明保护范围之列。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。
在已知该氨基酸序列情况下，该氨基酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明突变体酮还原酶改变了野生型酮还原酶对酮酯类化合物（如：2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或2,4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯）催化的立体倾向性，生成的主要产物（如：2-羟基-4-苯基丁酸乙酯或2-羟基-4-氧代-4-苯基丁酸乙酯）由（S-）构象变成了（R-）构象，并且对映体过量值（ee值）由76.7%（S-）转变为99.4%（R-）。
（四）附图说明
图1为酮还原酶粗酶液和纯酶液电泳对照图，泳道1、2、3、4、5、6、7分别是蛋白Maker、野生型酮还原酶（Tm）粗酶液、Tm纯酶液、W21Q/W86E粗酶液、W21Q/W86E纯酶液、W21S/W21E粗酶液、W21S/W21E纯酶液。
图2为突变体酮还原酶催化EOPB转化为R-EHPB的反应式。
图3为2-氧代-4苯基丁酸乙酯反应后液相色谱图：10.132分钟的峰为S-EHPB，峰面积为14；10.739分钟的峰为R-EHPB，峰面积为4555。
图4为突变体酮还原酶催化2,4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯转化为R-2-羟基-4-氧代-4-苯基丁酸乙酯的反应式。
图5为2,4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯反应后液相色谱图：10.101分钟的峰为S-产物，峰面积为22；10.704分钟的峰为R-产物，峰面积为4416。
图6为野生型酮还原酶与单突变体型酮还原酶基因测序图。
图7为野生型酮还原酶与单突变体型酮还原酶基因测序图。
图8为野生型酮还原酶与双突变体型酮还原酶基因测序图。
图9为野生型酮还原酶与双突变体型酮还原酶基因测序图。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明液体LB培养基质量终浓度组成为：1%酵母粉，1%蛋白胨，0.5%NaCl，溶剂为水，pH值为7.2～7.4。
所用LB固体培养基质量终浓度组成为：1wt%NaCl，1wt%蛋白胨，0.5wt%酵母粉，1.5wt%琼脂，溶剂为水，pH值为7.2～7.4。
所述自诱导培养基的终浓度组成为：阿拉伯糖3g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸盐6.8g/L，硫酸盐1.2g/L，NH4Cl2.65g/L，MgSO40.98g/L，CaCl20.1g/L，溶剂为水，pH值为7.2～7.4。
实施例1突变体酮还原酶
（1）野生型酮还原酶（SEQ ID NO：7）的获得
从超嗜热菌（Thermotoga maritima）中克隆编码酮还原酶的基因tadh（核苷酸序列为SEQ ID NO：8所示），连接到载体pET28a（+）上形成重组子，并将重组子转化到大肠杆菌JM109（DE3）内发酵表达：先将重组菌于液体LB培养基中，37℃培养3～5h，得到种子液；再将种子液按体积比1：100的比例接种到自诱导培养基中，20～25℃培养48h，即可得到含野生型酮还原酶的细胞，野生型酮还原酶的氨基酸序列为SEQ IDNO：7所示，其野生型酮还原酶的核苷酸序列已经通过基因测序得到了验证。
（2）突变和筛选
在同源建模和分子对接的基础上，选择可能的关键性氨基酸残基（W21，W86）进行饱和突变，筛选后获得突变体酮还原酶。
饱和突变过程如下：
首先设计针对W21和W86二个氨基酸残基分别设计饱和突变引物（具体如下所示）；然后以野生型酮还原酶编码基因（SEQ ID NO：8所示）为模板进行基于PCR的定点饱和突变。
简并引物设计：
突变21位氨基酸：
正向引物：5’NNKGGTATCGGCGGTTTTGA3’
反向引物：5’GGTACCCAGACCCAGTGCCGGA3’
突变86位氨基酸：
正向引物：5’NNKCCGACCCATCTGCGTCGCGAT3’
反向引物：5’AACTTTGCTCACAATGAACAGATC3’
50μl反应体系：
PCR循环过程：94℃预热2min，98℃变性10s，68℃延伸3min45s，循环11次。
Dpn1消化分解模板DNA
PCR产物回收，加入DpnⅠ（1μl），保持37℃，1.5h，消化含甲基的模板DNA，完全消化后，以琼脂糖（1%）凝胶电泳检测突变后DNA的含量及成功与否。
PCR产物清洗
PCR cleaning试剂盒清洗，去除反应体系内各种杂质，以保证PNK激酶连接的效率。
PNK连接
连接体系为：
Ligation Buffer 5μl
PNK 1μl
PCR cleaning 10μl
混合均匀后，放置于PCR仪中，16℃，1.5h后，可完成连接并进行转化。
筛选过程如下：
从上面转化获得的平板中挑取单菌落进行基因表达与纯化。首先按常规方法分离质粒，并将其转化到感受态细胞（大肠杆菌JM109（DE3）），然后将获得的含突变重组子的感受态细胞接种至LB固体培养基，37℃培养箱中培养12h。挑取菌落接种到LB液体培养基内活化，接1:100比例的种子液到自诱导培养基中，25℃、200rpm摇床震荡48h。收集菌液，8000rpm离心10min，以pH7.2～7.4的PBS缓冲液（NaCl137mmol/l，KCl2.7mmol/l，Na2HPO410mmol/l，KH2PO41.76mmol/l）重悬菌体，200W超声5min进行超声波细胞破碎。12000rpm离心1min后，获得的上清液即为突变体酮还原酶的粗酶液，在70℃下将粗酶液水浴1h，进行热纯化以除去杂蛋白得到纯酶液，12000rpm离心5min，取上清液即获得纯酶液，用作酶源，以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯为底物，转化反应体系及反应条件同实施例3，通过对模式底物eopb（即2-氧代-4-苯基丁酸乙酯）的催化，筛选出突变体。突变体的筛选目标为：由野生酶的S型产物转化为R型的ee值要发生逆转，而且ee值至少高于95%，相对酶活大于野生型酶活的50%。按照此筛选标准筛选出单突变体10个。经由南京金斯瑞生物科技有限公司对野生型酮还原酶与单突变体型酮还原酶进行基因测序，验证W21，W86所突变成的氨基酸，见图6和图7所示。发现的单突变体有：W21位点3个（W21C、W21Q、W21S），W86位点7个（W86A、W86E、W86H、W86I、W86L、W86N、W86V）。
将筛选出来的单突变体组合，进行迭代突变，构建出一个双突变文库，如表1所示。
表1双突变体文库：
以所述的引物和表1所述的双突变文库进行PCR反应，比如W21C/W86A的获得是以W21C的单突变体为模板，在突变86位氨基酸的正反向引物作用下进行PCR反应制备得到。
同样，将双突变重组子转化到感受态细胞进行表达与纯化之后筛选，筛选方法同单突变体筛选，获得针对模式底物（2-氧代-4-苯基丁酸乙酯）高于95%的ee值与活力。
最终由野生型酮还原酶基因tadh，分别得到了6种突变体酮还原酶W21Q/W86E（氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列为SEQ IDNO：9所示），突变体酮还原酶W21Q/W86V（氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示，核苷酸序列为SEQ ID NO：10所示），突变体酮还原酶W21S/W86E（氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示，核苷酸序列为SEQ ID NO：11所示），突变体酮还原酶W21S/W86H（氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示，核苷酸序列为SEQ ID NO：12所示），突变体酮还原酶W21S/W86I（氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示，核苷酸序列为SEQ ID NO：13所示），突变体酮还原酶W21S/W86N（氨基酸序列为SEQ ID NO：6所示，核苷酸序列为SEQ ID NO：14所示）。
经由南京金斯瑞生物科技有限公司对野生型酮还原酶与双突变体型酮还原酶进行基因测序，验证突变结果为所预期目标，见图8和图9所示。
实施例2酶源
分别将实施例1制备的6种编码突变体酮还原酶W21Q/W86E、W21Q/W86V、W21S/W86E、W21S/W86E、W21S/W86H、W21S/W86I、W21S/W86N的双突变重组子各自转化到感受态细胞（大肠杆菌JM109（DE3），购买于浙江省东洋纺生物有限公司），获得含有突变体酮还原酶编码基因的大肠杆菌，置于LB固体培养基（1wt%NaCl，1wt%蛋白胨，0.5wt%酵母粉，1.5wt%琼脂，溶剂为水，pH值为7.2～7.4）37℃培养箱中培养12h。挑取单个菌落接种到自诱导培养基中，25℃、200rpm摇床震荡48h。收集菌液，8000rpm离心10min，以PBS缓冲液（NaCl137mmol/l，KCl2.7mmol/l，Na2HPO410mmol/l，KH2PO41.76mmol/l，pH7.2～7.4）重悬菌体，200W超声5min进行超声波细胞破碎。12000rpm离心1min后，获得的上清液即为突变体酮还原酶的粗酶液，在70℃下将粗酶液水浴1h，进行纯化以除去杂蛋白得到纯酶液，12000rpm离心5min，取上清液即获得纯酶液，用作酶源。
野生型酮还原酶粗酶液和纯酶液的制备方法同突变体酮还原酶粗酶液和纯酶液。
将野生型酮还原酶与突变体酮还原酶的粗酶液和纯酶液分别进行电泳检测，根据目的蛋白的大小（31.49kDa），分离胶选用10%SDS-PAGE，浓缩胶选用5%SDS-PAGE。电泳参数：样品上样10μL，Maker上样10μL，浓缩胶电压50V，分离胶电压200V。结果如图1所示，泳道1、2、3、4、5、6、7分别是蛋白Maker、野生型酮还原酶（Tm）粗酶液、Tm纯酶液、W21Q/W86E粗酶液、W21Q/W86E纯酶液、W21S/W21E粗酶液、W21S/W21E纯酶液，可以看到：在29.0kDa（泳道1所示）附近的位置上，均有一条明显的蛋白表达条带，与目标蛋白的理论蛋白相对分子质量一致，表明获得了目标突变体。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果表明突变体酮还原酶W21Q/W86V、突变体酮还原酶W21S/W86E、突变体酮还原酶W21S/W86H、突变体酮还原酶W21S/W86I、突变体酮还原酶W21S/W86N在29.0kDa附近的位置上，均有一条明显的蛋白表达条带，与目标蛋白的理论蛋白相对分子质量一致，表明获得了目标突变体。
实施例3突变体酮还原酶催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯（EOPB）的还原
将实施例2方法获得的突变体酮还原酶W21S/W86E纯酶液（200μL，以菌体干重计20g/L反应体系）、葡萄糖（终浓度10mM）、葡糖糖脱氢酶GDH（终浓度200μL，即5U/L）、还原性辅酶NADP+（终浓度0.05mM）与底物EOPB（终浓度7mM）混合，加入15μLDMSO，于水中构成1mL转化体系，转化体系的pH值为7.2～7.4，反应式如图2所示，37℃、200rpm摇床震荡12h。反应结束后，反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层进行高效液相色谱（手性色谱IC柱，流动相：正己烷（A）/异丙醇（B）=95/5，v/v，1mL/min，柱温：35℃，检测波长：ΜV220nm紫外检测器）分析测定还原产物的eeR值。液相色谱图如图3所示，10.132分钟的峰为S-EHPB，峰面积为14；10.739分钟的峰为R-EHPB，峰面积为4555，eeR值99.40%，同野生型的相对酶活达56.06%，其他突变体检测结果见表2所示。
表2突变体酮还原酶对底物eopb的测定
实施例4突变体酮还原酶对其他酮酯类化合物的酶活力测定
酶反应体系包括3ml Tris-HCl缓冲液（50mM，pH8.0），30μlNADPH(10mg/mL)，5μl底物（如：乙酰乙酸乙酯，4-氯乙酰乙酸乙酯，甲酰乙酸乙酯，丙酰乙酸乙酯，甲酰甲酸乙酯，2-氧代-4-苯基丁酸乙酯或2,4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯），15μl DMSO，30μl突变体酮还原酶W21S/W86E纯酶液（实施例2方法制备），340nm处测定吸光值。
酶活力定义为：每分钟消耗1μmol NADPH所需要的酶量为一个酶活单位（U）。酶活力按公式（1）计算，结果见表3所示。
公式（1）中，△OD340：吸光值变化；V：反应体系总体积（3mL）；△t：反应时间（3min）；e：摩尔吸光系数，6.22mL/（mol·cm）；L：石英比色杯光程（1cm）
表3突变体酶对酮酯类化合物的活力测定
突变体酮还原酶对各种测定的酮酯类化合物均有一定的作用，其中EOPB、4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯和2,4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯是比较好的底物。突变体酮还原酶W21S/W86E对EOPB催化酶活为7.19U/mL，以野生型酶催化EOPB的酶活力为标准，对比野生型酶催化其他酮酯类底物的相对酶活及其他突变体酶针对其他酮酯类底物的相对酶活。标注对各底物的相对酶活如表3。由表3中数据可看出，突变体酮还原酶对酮酯类化合物有很高的活性。
实施例5突变体酮还原酶催化2,4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯的还原
将实施例3中底物改为2,4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯，以实施例3制备的突变体酮还原酶W21S/W86E纯酶液催化其不对称还原，其他操作同实施例3，反应式如图4所示。
液相色谱图如图5所示，10.101分钟的峰为S-产物，峰面积为22；10.704分钟的峰为R-产物，峰面积为4416，eeR值99.01%，与野生型的相对酶活力为67.55%，其他突变体酮还原酶的检测结果表4所示。
表4其他突变体催化2,4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯的测定
实施例6野生型酮还原酶和突变体酮还原酶的酶促反应动力学的检测
以野生型酮还原酶为对照，将纯化后的突变体酮还原酶（实施例2制备的纯酶液）利用米氏方程双倒数法（参照
）测定酮还原酶Km值，进而得到Kcat值。具体数据如表5：
表5野生型和突变体酶的反应动力学参数
| Enzyme | Km（mol/L） | Kcat(S-1) | Kcat/Km[(mol/L)-1S-1] |
| Tm（野生型） | 1.015×10-3 | 1.83 | 1.803×103 |
| W21Q/W86E | 1.839×10-3 | 7.225 | 3.929×103 |
| W21Q/W86V | 1.034×10-3 | 20.853 | 2.017×104 |
| W21S/W86E | 1.031×10-3 | 9.818 | 9.523×103 |
| W21S/W86H | 0.414×10-3 | 8.566 | 2.069×104 |
| W21S/W86I | 1.201×10-3 | 19.505 | 1.624×104 |
| W21S/W86N | 1.323×10-3 | 8.92 | 6.742×103 |
通过比较，可以发现相对于野生型Tm来说，除了W21S/W86H之外，其他突变体酶的Km值大小基本不变，也就是说本发明中的点突变并没有改变该酮还原酶与底物的亲和力；并且突变体酶的Kcat/Km值与野生型酶相比都有明显的提高，说明突变体酶对底物EOPB的催化效率比野生型酶更好。
Claims (10)
1.一种突变体酮还原酶，所述酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示，其特征在于：所述突变体酮还原酶是将SEQ ID NO：7所示氨基酸序列的第21位的色氨酸残基突变为谷氨酰胺或丝氨酸，同时将第86位的色氨酸残基突变成谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、天冬酰胺或缬氨酸。
2.如权利要求1所述突变体酮还原酶，其特征在于所述突变体酮还原酶的氨基酸序列具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示氨基酸序列80%以上同源性。
3.如权利要求1所述突变体酮还原酶，其特征在于所述突变体酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示。
4.一种编码权利要求1所述突变体酮还原酶的基因。
5.一种含有权利要求4所述突变体酮还原酶编码基因的重组载体。
6.一种含有权利要求5所述重组载体的重组基因工程菌。
7.一种权利要求1所述突变体酮还原酶在制备光学活性羟基酯中的应用，其特征在于所述的应用为：将含突变体酮还原酶基因的重组工程菌经发酵培养获得的湿菌体用PBS缓冲液重悬后进行超声破碎、离心，取上清液在70℃下水浴1h，再次离心，取再次离心获得的上清液作为酶源，以酮酯类化合物为底物，以葡萄糖为辅助底物，以葡糖糖脱氢酶和还原性辅酶NADP+作为辅助酶源，加入二甲基亚砜，于水中构成pH7.2～7.4的转化体系，在25～37℃、150～250rpm条件下转化反应，反应完全后，取反应液用等体积的乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层即获得含有光学活性羟基酯的混合液，将混合液分离纯化，即获得光学活性羟基酯；所述酶源的用量以超声破碎前湿菌体的菌体干重计为10～20g/L转化体系，所述底物的初始浓度为7～10mmol/L转化体系，所述葡萄糖的初始浓度为10～20mmol/L转化体系，所述葡糖糖脱氢酶的用量为5～10U/L转化体系，所述还原性辅酶NADP+的用量为0.05～0.1mM转化体系，所述二甲基亚砜的体积终浓度为1.5%。
8.如权利要求7所述应用，其特征在于所述酮酯类化合物为2-氧代-4-苯基丁酸乙酯、2,4-二氧代-4-苯基丁酸乙酯、乙酰乙酸乙酯、4-氯乙酰乙酸乙酯、甲酰乙酸乙酯、丙酰乙酸乙酯或甲酰甲酸乙酯。
9.如权利要求7所述应用，其特征在于所述酶源的用量以超声破碎前湿菌体的菌体干重计为10g/L转化体系，所述底物的初始浓度为7mmol/L转化体系，所述葡萄糖的初始浓度为10mmol/L转化体系，所述葡糖糖脱氢酶的用量为5U/L转化体系，所述还原性辅酶NADP+的用量为0.05mM转化体系，所述二甲基亚砜的体积终浓度为1.5%。
10.如权利要求7所述应用，其特征在于所述酶源按如下方法制备：将含有突变体酮还原酶基因的重组工程菌接种至液体LB培养基，37℃培养3～5h，获得种子液；所述液体LB培养基质量终浓度组成为：1%酵母粉，1%蛋白胨，0.5%NaCl，溶剂为水，pH值为7.2～7.4；
将种子液以体积比1：100的接种量接种至自诱导培养基，20～25℃培养48h，将培养液离心，收集湿菌体，将湿菌体用pH7.2～7.4的PBS缓冲液重悬，在200W条件下超声破碎5min，再将破碎液离心，取上清液在70℃下水浴1h，再次离心，取再次离心获得的上清液作为酶源；所述自诱导培养基的终浓度组成为：阿拉伯糖3g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸盐6.8g/L，硫酸盐1.2g/L，NH4Cl2.65g/L，MgSO40.98g/L，CaCl20.1g/L，溶剂为水，pH值为7.2～7.4。
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