CN103695443A - 一种新型羰基还原酶、其基因及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种来源于金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.CA49)的新型羰基还原酶ChKRED03及其编码基因,并利用该羰基还原酶作为生物催化剂催化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮制备光学纯(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇,产物的对映体过量值大于99%。除了羰基还原酶ChKRED03纯酶以外,还可以利用相应的重组菌休止细胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形态作为生物催化剂,同样能达到本发明的效果。该酶是一种具有潜力的新型生物催化剂,具有较大的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种新的基因及其蛋白质产物,具体涉及一种来源于金黄杆菌(Chryseobacterium sp.CA49)的新型羰基还原酶ChKRED03及其基因,并利用其生物催化生产(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇,属于应用微生物与酶工程领域。
背景技术
两种光学纯的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇都是合成NK-1受体拮抗剂的中间体,其中R构型是Merk公司研发的药物阿瑞匹坦(Aprepitant,商品名“Emend”)的关键手性中间体,而S构型常用于整合到拮抗剂中用于临床评价(Pollard D,et al.Effective synthesis of(S)-3,5-bistrifluoromethylphenyl ethanol byasymmetric enzymatic reduction.Tetrahedron:Asymmetry,2006,17,554-559)。近年来,以潜手性酮3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物经生物催化过程获得S构型醇迅速发展。目前报道的可以实现该催化过程的的微生物菌株有SaccharomycesRhodotorula(张芳等,红酵母静息细胞催化(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的不对称还原反应.药物生物技术,2007,14(6):411-414)、Candida tropicalis104(王普等,一种微生物转化制备(S)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法.中国专利,CN101519674)等,这些全细胞的生物催化过程往往ee值不高或者底物转化浓度较低;商业酶则有来自Rhodococcus erythropolis、Candida parapsilosis、Candidaboidinii等菌株的乙醇脱氢酶ADH,其中由Merk公司开发的ADH RE(来源于Rhodococcus erythropolis)催化工艺(Pollard D,et al.Effective synthesisof(S)-3,5-bistrifluoromethylphenyl ethanol by asymmetric enzymaticreduction.Tetrahedron:Asymmetry,2006,17,554-559),已达到100g/l的工业化水平,该过程需要添加甲酸脱氢酶FDH用于辅酶循环。开发更多有潜力的催化剂,既可获得具有自主知识产权的生物催化工艺,又能丰富生物催化工具箱。
发明内容
本发明的目的是公开一种羰基还原酶ChKRED03及其基因,以及利用该酶还原底物3,5-双三氟甲基苯乙酮制备光学纯(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法。
本发明所述的羰基还原酶ChKRED03的基因碱基数为735bp,其序列为SEQ IDNo.1,编码244个氨基酸残基,其序列为SEQ ID No.2。
羰基还原酶ChKRED03从金黄杆菌(Chryseobacterium sp.CA49)基因组中克隆获得,该菌的保藏编号为CCTCC M2012484(中国武汉,中国典型培养物保藏中心,保藏日期为2012年11月27日)。
羰基还原酶ChKRED03的基因PCR扩增时设计的引物如下:正向5′-gaattcATGAATTTCACAGATAAAAATGTAATCATTAC-3′(酶切位点EcoR I),反向5′-aagcttTATCTGCGGATCGTTACTCC-3′(酶切位点HindⅢ)。模板为金黄杆菌(Chryseobacterium sp.CA49)基因组DNA。获得的目标基因所编码的蛋白质命名为羰基还原酶ChKRED03。将目标基因连入pET28a(+)空载体中,构建重组质粒pET28a-ChKRED03,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌。将上述构建的重组菌以常规方法诱导表达后,经纯化获得纯酶。
根据本领域技术人员所熟知的知识,任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体,转化至合适宿主细胞,经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此,羰基还原酶ChKRED03表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等,表达宿主可以为大肠杆菌,毕赤酵母,链霉菌等。
本发明还提供了羰基还原酶ChKRED03作为生物催化剂在转化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。其反应式如下:
具体地,上述应用的操作方法为:生物催化条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择。羰基还原酶ChKRED03作催化剂时,反应体系为:羰基还原酶ChKRED03,磷酸钾缓冲液,NADH或NADPH,底物3,5-双三氟甲基苯乙酮。反应体系的酶浓度、NADH或NADPH量、底物浓度等可以调整。较佳地,磷酸钾缓冲液为pH6.0-8.0,0.1M;底物浓度为1~20g/l;优选的辅酶NADH或NADPH的摩尔浓度等于或高于底物摩尔浓度;反应温度为20~35℃,转速为50~220rpm。反应结束后,等体积乙酸乙酯萃取终止反应,产物存在于乙酸乙酯有机相中。将产物以气相色谱测定其转化率和ee值(对映体过量值)。经验证该酶能够高选择性(ee>99%)地催化3,5-双三氟甲基苯乙酮的羰基不对称还原,获得手性产物(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。
可进行上述生物催化反应的包括羰基还原酶ChKRED03纯酶、相应的重组菌休止细胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形态。采用羰基还原酶ChKRED03重组菌休止细胞作催化剂时,通常用辅酶循环底物代替辅酶进行反应,常用的辅酶循环底物为:葡萄糖1%~5%(w/v,占总转化体系的质量体积百分数)和/或异丙醇2%~10%(v/v,占总转化体系的体积百分数);较佳的菌体浓度为50~200g/L。
根据本领域公共知识,任何基因通过DNA突变技术可以改变其序列,产生各种不同的突变体,这些突变体所表达的蛋白质往往具有相同的功能。本发明涉及的基因及其产物也具有相同的特点。因此,凡是经等位基因突变或者具有一个或多个氨基酸添加、插入、缺失或/和取代且具有催化3,5-双三氟甲基苯乙酮生成(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇功能的酶均属于本发明的保护范围。
羰基还原酶ChKRED03为(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇生物催化合成提供了可供选择的新型酶源,该酶生物催化具有很高的立体选择性(ee>99%)和良好的催化活力,具有进一步应用蛋白工程改造以用于工业生产的潜力。
附图说明
图1羰基还原酶ChKRED03蛋白纯化后SDS-PAGE图
具体实施方式
以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明,但并非对本发明的限制。
实施例1羰基还原酶ChKRED03基因的克隆
根据金黄杆菌(Chryseobacterium sp.CA49)全基因组测序信息,得到大量羰基还原酶序列,其中一个具有还原3,5-双三氟甲基苯乙酮生成(S)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇功能的酶为本发明涉及的羰基还原酶ChKRED03。
羰基还原酶ChKRED03的基因是以金黄杆菌(Chryseobacterium sp.CA49)基因组DNA为模板,PCR扩增获得。其操作为常规的基因操作方法。所用引物为:正向5′-gaattcATGAATTTCACAGATAAAAATGTAATCATTAC-3′(酶切位点EcoR I),反向5′-aagcttTATCTGCGGATCGTTACTCC-3′(酶切位点HindⅢ);PCR条件为:95℃预变性5min,94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,30个循环,最后72℃延伸10min;PCR产物以0.8%琼脂糖电泳分离,琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段(天根生化科技北京有限公司),而后连入pMD19T载体(方法参考Takara公司TA克隆说明书)构建TA克隆,送至上海生工生物工程有限公司测序,得到目标基因全长735bp,其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示;编码244个氨基酸,其序列如序列表SEQ ID No.2。将测序正确的质粒以EcoR I和Hind Ⅲ酶切,连入以同样酶消化的pET28a(+)空载体中,构建重组质粒pET28a-ChKRED03,并转入大肠杆菌BL21(DE3)中构建重组菌。
实施例2羰基还原酶ChKRED03的诱导表达
挑取实施例1中重组菌单克隆至含卡那霉素50μg/ml的LB培养基中,37℃,230rpm,过夜培养16h,以1%的接种量转接至含卡那霉素50μg/ml的TB培养基中(500ml容量的摇瓶装液200ml培养基),37℃,230rpm,培养3h后,加入终浓度为0.5mMIPTG诱导目的蛋白表达,继续于30℃培养24h。将诱导培养后的菌液离心(8000rpm,4℃),弃上清,并用磷酸钾缓冲液(pH7.0,0.1M)洗涤2次,获得湿菌体。
实施例3羰基还原酶ChKRED03的纯化和生物转化活性
羰基还原酶ChKRED03的纯化采用镍柱亲和层析(美国Bio-Rad公司产品)。将诱导培养24h后的菌液(具体方法见实施例2)离心收集菌体(4℃,13000rpm),重悬于Buffer A(50mM磷酸钠缓冲液,pH8.0,300mM NaCl,10mM咪唑),ATS高压均质机破碎细胞,离心20min(4℃,13000rpm),将获得的上清液加入已用BufferA平衡的镍柱料中,轻微混匀30min,用含有20mM咪唑的Buffer A漂洗杂蛋白,再用含250mM咪唑的Buffer A的缓冲液洗脱目的蛋白,最后电泳鉴定纯度,并用超微量核酸蛋白仪测定蛋白浓度为5mg/ml,生物催化时根据需要调整成合适浓度。羰基还原酶ChKRED03纯化后的SDS-PAGE图见图1。
纯酶生物催化:10ml反应体系中含有磷酸钾缓冲液(0.1M,pH7.0),0.2mg/ml纯酶,10mM底物3,5-双三氟甲基苯乙酮,20mM NADH或者NADPH。30℃,转速50rpm,反应2h。反应结束后,等体积乙酸乙酯萃取,取乙酸乙酯有机相以气相色谱测定产物的转化率和ee值。
产物测定方法:福立Fuli GC9790气相色谱仪,分离柱为手性柱CHIRASIL-DEX CB(瓦里安,25m×0.25),氢离子火焰检测器,柱温:115℃,进样器:260℃,检测器:280℃。tR(S)=7.3min,tR(R)=8.4min。
经测定,以NADH为辅酶时,转化率为56%;以NADPH为辅酶时,转化率为79%;产物为(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇(以下实施例的产物与本例相同,不再赘述),两者的ee值均大于99%。该酶以NADPH为辅酶时转化率更高。
羰基还原酶ChKRED03是一种具有高选择性还原羰基功能的酶,是一种典型的羰基还原酶。
实施例4羰基还原酶ChKRED03纯酶生物催化
反应体系为10ml,磷酸钾缓冲液的浓度均为0.1M。转化体系样品处理方法和产物检测方法同实施例3,表1为羰基还原酶ChKRED03纯酶生物催化的反应条件及结果。
表1羰基还原酶ChKRED03纯酶生物催化的反应条件及结果
*底物摩尔浓度和质量体积浓度的对应关系为:10mM(2.6g/l),20mM(5.1g/l),50mM(12.8g/l)。
实施例5羰基还原酶ChKRED03重组菌休止细胞生物催化
按照实施例2的方法诱导表达羰基还原酶ChKRED03。冷冻离心收集菌体(8000rpm),并以磷酸钾缓冲液(pH7.0,0.1M)洗涤菌体2次,以菌体(休止细胞)作为生物催化剂。生物催化条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择。
羰基还原酶ChKRED03重组菌的培养方法和菌体收集方法见实施例2。转化体系样品的处理方法和产物的测定方法同实施例3。
(1)取菌体0.5g,重悬于10ml磷酸钾缓冲液(pH8.0,0.1M),加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮10mg和0.5ml异丙醇,20℃,50rpm转化3h。反应结束后,以10ml乙酸乙酯萃取,经气相色谱分析,底物的转化率为59%,产物对映体过量值大于99%。
(2)取菌体1.0g,重悬于10ml磷酸钾缓冲液(pH7.0,0.1M),加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮20mg和0.5ml异丙醇,28℃,220rpm转化3h。以10ml乙酸乙酯萃取,经气相色谱分析,底物的转化率为44%,产物对映体过量值大于99%。
(3)取菌体0.7g,重悬于10ml磷酸钾缓冲液(pH6.0,0.1M),加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮20mg和0.8ml异丙醇,35℃,220rpm转化24h。以10ml乙酸乙酯萃取,经气相色谱分析,底物的转化率为36%,产物对映体过量值大于99%。
(4)取菌体2.0g,重悬于10ml磷酸钾缓冲液(pH8.0,0.1M),加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮100mg和0.5ml异丙醇,30℃,220rpm转化24h。以10ml乙酸乙酯萃取,经气相色谱分析,底物的转化率为49%,产物对映体过量值大于99%。
(5)取菌体0.5g,重悬于10ml磷酸钾缓冲液(pH7.0,0.1M),加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮10mg和0.2g葡萄糖,30℃,220rpm转化3h。以10ml乙酸乙酯萃取,经气相色谱分析,底物的转化率为19%,产物对映体过量值大于99%。
(6)取菌体1.0g,重悬于10ml磷酸钾缓冲液(pH7.0,0.1M),加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮20mg和0.5g葡萄糖,32℃,100rpm转化3h。以10ml乙酸乙酯萃取,经气相色谱分析,底物的转化率为24%,产物对映体过量值大于99%。
(7)取菌体2.0g,重悬于10ml磷酸钾缓冲液(pH7.0,0.1M),加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮200mg、0.2g葡萄糖和0.5ml异丙醇,30℃,200rpm转化24h。以10ml乙酸乙酯萃取,经气相色谱分析,底物的转化率为39%,产物对映体过量值大于99%。
实施例6羰基还原酶ChKRED03粗酶液生物催化
将诱导培养20h后的菌体(具体方法见实施例2)离心收集(4℃,13000rpm),ATS高压均质机破碎细胞,离心20min(4℃,13000rpm),将上清液用于生物催化反应。转化体系样品的处理方法和产物的测定方法同实施例3。
(1)磷酸钾缓冲液(0.1M,pH6.5),粗酶液以总蛋白计10g/l,底物3,5-双三氟甲基苯乙酮10mM,NADH20mM,25℃,200rpm反应1h,等体积乙酸乙酯萃取,经气相色谱分析,底物的转化率为80%,产物对映体过量值大于99%。
(2)磷酸钾缓冲液(0.1M,pH7.0),粗酶液以总蛋白计5g/l,底物3,5-双三氟甲基苯乙酮10mM,NADPH20mM,30℃,50rpm反应1h,等体积乙酸乙酯萃取,经气相色谱分析,底物的转化率为90%,产物对映体过量值大于99%。
实施例7羰基还原酶ChKRED03粗酶粉生物催化
粗酶液的获得方法同实施例5,将粗酶液先冷冻于-80℃过夜,再以冷冻干燥机冻干后获得粗酶粉。催化体系5ml,包括磷酸钾缓冲液(pH7.0,0.1M),粗酶粉量5g/l,底物3,5-双三氟甲基苯乙酮30mM,NADPH50mM。温度30℃,200rpm,反应2h。转化体系样品的处理方法和产物的测定方法同实施例3。测定的转化率为85%,产物对映体过量值大于99%。
Claims (3)
1.一种羰基还原酶ChKRED03的基因,其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
2. 一种羰基还原酶ChKRED03,其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
3. 如权利要求2所述的羰基还原酶ChKRED03作为生物催化剂在转化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。
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