CN103695443A

CN103695443A - 一种新型羰基还原酶、其基因及应用

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Publication number: CN103695443A
Application number: CN201410012867.9A
Authority: CN
Inventors: 吴中柳; 刘艳; 裴小琼
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2014-01-12
Filing date: 2014-01-12
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2034-01-12
Also published as: CN103695443B

Abstract

本发明公开了一种来源于金黄杆菌（Chryseobacteriumsp.CA49）的新型羰基还原酶ChKRED03及其编码基因，并利用该羰基还原酶作为生物催化剂催化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮制备光学纯(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，产物的对映体过量值大于99%。除了羰基还原酶ChKRED03纯酶以外，还可以利用相应的重组菌休止细胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形态作为生物催化剂，同样能达到本发明的效果。该酶是一种具有潜力的新型生物催化剂，具有较大的工业应用前景。

Description

一种新型羰基还原酶、其基因及应用

技术领域

本发明涉及一种新的基因及其蛋白质产物，具体涉及一种来源于金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）的新型羰基还原酶ChKRED03及其基因，并利用其生物催化生产(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇，属于应用微生物与酶工程领域。

背景技术

两种光学纯的[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇都是合成NK-1受体拮抗剂的中间体，其中R构型是Merk公司研发的药物阿瑞匹坦（Aprepitant，商品名“Emend”）的关键手性中间体，而S构型常用于整合到拮抗剂中用于临床评价（Pollard D，et al.Effective synthesis of(S)-3,5-bistrifluoromethylphenyl ethanol byasymmetric enzymatic reduction.Tetrahedron：Asymmetry，2006,17,554-559）。近年来，以潜手性酮3,5-双三氟甲基苯乙酮为底物经生物催化过程获得S构型醇迅速发展。目前报道的可以实现该催化过程的的微生物菌株有SaccharomycesRhodotorula（张芳等，红酵母静息细胞催化(S)-3,5-双三氟甲基苯乙醇的不对称还原反应.药物生物技术，2007,14（6）:411-414）、Candida tropicalis104（王普等，一种微生物转化制备(S)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇的方法.中国专利，CN101519674）等，这些全细胞的生物催化过程往往ee值不高或者底物转化浓度较低；商业酶则有来自Rhodococcus erythropolis、Candida parapsilosis、Candidaboidinii等菌株的乙醇脱氢酶ADH，其中由Merk公司开发的ADH RE（来源于Rhodococcus erythropolis）催化工艺（Pollard D，et al.Effective synthesisof(S)-3,5-bistrifluoromethylphenyl ethanol by asymmetric enzymaticreduction.Tetrahedron：Asymmetry，2006,17,554-559），已达到100g/l的工业化水平，该过程需要添加甲酸脱氢酶FDH用于辅酶循环。开发更多有潜力的催化剂，既可获得具有自主知识产权的生物催化工艺，又能丰富生物催化工具箱。

发明内容

本发明的目的是公开一种羰基还原酶ChKRED03及其基因，以及利用该酶还原底物3,5-双三氟甲基苯乙酮制备光学纯(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇的方法。

本发明所述的羰基还原酶ChKRED03的基因碱基数为735bp，其序列为SEQ IDNo.1，编码244个氨基酸残基，其序列为SEQ ID No.2。

羰基还原酶ChKRED03从金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）基因组中克隆获得，该菌的保藏编号为CCTCC M2012484（中国武汉，中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2012年11月27日）。

羰基还原酶ChKRED03的基因PCR扩增时设计的引物如下：正向5′-gaattcATGAATTTCACAGATAAAAATGTAATCATTAC-3′（酶切位点EcoR I），反向5′-aagcttTATCTGCGGATCGTTACTCC-3′（酶切位点HindⅢ）。模板为金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）基因组DNA。获得的目标基因所编码的蛋白质命名为羰基还原酶ChKRED03。将目标基因连入pET28a（+）空载体中，构建重组质粒pET28a-ChKRED03，并转入大肠杆菌BL21（DE3）中构建重组菌。将上述构建的重组菌以常规方法诱导表达后，经纯化获得纯酶。

根据本领域技术人员所熟知的知识，任何基因经操作或者改造后连入各类表达载体，转化至合适宿主细胞，经适当条件诱导均能过量表达目的蛋白。因此，羰基还原酶ChKRED03表达的载体可以为pET或者pCW或者pUC或者pPIC9k等，表达宿主可以为大肠杆菌，毕赤酵母，链霉菌等。

本发明还提供了羰基还原酶ChKRED03作为生物催化剂在转化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。其反应式如下：

具体地，上述应用的操作方法为：生物催化条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择。羰基还原酶ChKRED03作催化剂时，反应体系为：羰基还原酶ChKRED03，磷酸钾缓冲液，NADH或NADPH，底物3,5-双三氟甲基苯乙酮。反应体系的酶浓度、NADH或NADPH量、底物浓度等可以调整。较佳地，磷酸钾缓冲液为pH6.0-8.0，0.1M；底物浓度为1～20g/l；优选的辅酶NADH或NADPH的摩尔浓度等于或高于底物摩尔浓度；反应温度为20～35℃，转速为50～220rpm。反应结束后，等体积乙酸乙酯萃取终止反应，产物存在于乙酸乙酯有机相中。将产物以气相色谱测定其转化率和ee值（对映体过量值）。经验证该酶能够高选择性（ee>99%）地催化3,5-双三氟甲基苯乙酮的羰基不对称还原，获得手性产物(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇。

可进行上述生物催化反应的包括羰基还原酶ChKRED03纯酶、相应的重组菌休止细胞、粗酶液或者粗酶粉等其他存在形态。采用羰基还原酶ChKRED03重组菌休止细胞作催化剂时，通常用辅酶循环底物代替辅酶进行反应，常用的辅酶循环底物为：葡萄糖1%～5%（w/v，占总转化体系的质量体积百分数）和/或异丙醇2%～10%（v/v，占总转化体系的体积百分数）；较佳的菌体浓度为50～200g/L。

根据本领域公共知识，任何基因通过DNA突变技术可以改变其序列，产生各种不同的突变体，这些突变体所表达的蛋白质往往具有相同的功能。本发明涉及的基因及其产物也具有相同的特点。因此，凡是经等位基因突变或者具有一个或多个氨基酸添加、插入、缺失或/和取代且具有催化3,5-双三氟甲基苯乙酮生成(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇功能的酶均属于本发明的保护范围。

羰基还原酶ChKRED03为(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇生物催化合成提供了可供选择的新型酶源，该酶生物催化具有很高的立体选择性（ee>99%）和良好的催化活力，具有进一步应用蛋白工程改造以用于工业生产的潜力。

附图说明

图1羰基还原酶ChKRED03蛋白纯化后SDS-PAGE图

具体实施方式

以下结合实施例详细地说明本发明。实施方案为便于更好的理解本发明，但并非对本发明的限制。

实施例1羰基还原酶ChKRED03基因的克隆

根据金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）全基因组测序信息，得到大量羰基还原酶序列，其中一个具有还原3,5-双三氟甲基苯乙酮生成(S)-1-(3,5-二三氟甲基)苯基乙醇功能的酶为本发明涉及的羰基还原酶ChKRED03。

羰基还原酶ChKRED03的基因是以金黄杆菌（Chryseobacterium sp.CA49）基因组DNA为模板，PCR扩增获得。其操作为常规的基因操作方法。所用引物为：正向5′-gaattcATGAATTTCACAGATAAAAATGTAATCATTAC-3′（酶切位点EcoR I），反向5′-aagcttTATCTGCGGATCGTTACTCC-3′（酶切位点HindⅢ）；PCR条件为：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min；PCR产物以0.8%琼脂糖电泳分离，琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段（天根生化科技北京有限公司），而后连入pMD19T载体（方法参考Takara公司TA克隆说明书）构建TA克隆，送至上海生工生物工程有限公司测序，得到目标基因全长735bp，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示；编码244个氨基酸，其序列如序列表SEQ ID No.2。将测序正确的质粒以EcoR I和Hind Ⅲ酶切，连入以同样酶消化的pET28a（+）空载体中，构建重组质粒pET28a-ChKRED03，并转入大肠杆菌BL21（DE3）中构建重组菌。

实施例2羰基还原酶ChKRED03的诱导表达

挑取实施例1中重组菌单克隆至含卡那霉素50μg/ml的LB培养基中，37℃，230rpm，过夜培养16h，以1%的接种量转接至含卡那霉素50μg/ml的TB培养基中（500ml容量的摇瓶装液200ml培养基），37℃，230rpm，培养3h后，加入终浓度为0.5mMIPTG诱导目的蛋白表达，继续于30℃培养24h。将诱导培养后的菌液离心（8000rpm，4℃），弃上清，并用磷酸钾缓冲液（pH7.0，0.1M）洗涤2次，获得湿菌体。

实施例3羰基还原酶ChKRED03的纯化和生物转化活性

羰基还原酶ChKRED03的纯化采用镍柱亲和层析（美国Bio-Rad公司产品）。将诱导培养24h后的菌液（具体方法见实施例2）离心收集菌体（4℃，13000rpm），重悬于Buffer A（50mM磷酸钠缓冲液，pH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑），ATS高压均质机破碎细胞，离心20min（4℃，13000rpm），将获得的上清液加入已用BufferA平衡的镍柱料中，轻微混匀30min，用含有20mM咪唑的Buffer A漂洗杂蛋白，再用含250mM咪唑的Buffer A的缓冲液洗脱目的蛋白，最后电泳鉴定纯度，并用超微量核酸蛋白仪测定蛋白浓度为5mg/ml，生物催化时根据需要调整成合适浓度。羰基还原酶ChKRED03纯化后的SDS-PAGE图见图1。

纯酶生物催化：10ml反应体系中含有磷酸钾缓冲液（0.1M，pH7.0），0.2mg/ml纯酶，10mM底物3,5-双三氟甲基苯乙酮，20mM NADH或者NADPH。30℃，转速50rpm，反应2h。反应结束后，等体积乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯有机相以气相色谱测定产物的转化率和ee值。

产物测定方法：福立Fuli GC9790气相色谱仪，分离柱为手性柱CHIRASIL-DEX CB（瓦里安，25m×0.25），氢离子火焰检测器，柱温:115℃，进样器：260℃，检测器：280℃。t_R(S)=7.3min,t_R(R)=8.4min。

经测定，以NADH为辅酶时，转化率为56%；以NADPH为辅酶时，转化率为79%；产物为(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇（以下实施例的产物与本例相同，不再赘述），两者的ee值均大于99%。该酶以NADPH为辅酶时转化率更高。

羰基还原酶ChKRED03是一种具有高选择性还原羰基功能的酶，是一种典型的羰基还原酶。

实施例4羰基还原酶ChKRED03纯酶生物催化

反应体系为10ml，磷酸钾缓冲液的浓度均为0.1M。转化体系样品处理方法和产物检测方法同实施例3，表1为羰基还原酶ChKRED03纯酶生物催化的反应条件及结果。

表1羰基还原酶ChKRED03纯酶生物催化的反应条件及结果

*底物摩尔浓度和质量体积浓度的对应关系为：10mM（2.6g/l），20mM（5.1g/l），50mM（12.8g/l）。

实施例5羰基还原酶ChKRED03重组菌休止细胞生物催化

按照实施例2的方法诱导表达羰基还原酶ChKRED03。冷冻离心收集菌体（8000rpm），并以磷酸钾缓冲液（pH7.0，0.1M）洗涤菌体2次，以菌体（休止细胞）作为生物催化剂。生物催化条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择。

羰基还原酶ChKRED03重组菌的培养方法和菌体收集方法见实施例2。转化体系样品的处理方法和产物的测定方法同实施例3。

（1）取菌体0.5g，重悬于10ml磷酸钾缓冲液（pH8.0，0.1M），加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮10mg和0.5ml异丙醇，20℃，50rpm转化3h。反应结束后，以10ml乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为59%，产物对映体过量值大于99%。

（2）取菌体1.0g，重悬于10ml磷酸钾缓冲液（pH7.0，0.1M），加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮20mg和0.5ml异丙醇，28℃，220rpm转化3h。以10ml乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为44%，产物对映体过量值大于99%。

（3）取菌体0.7g，重悬于10ml磷酸钾缓冲液（pH6.0，0.1M），加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮20mg和0.8ml异丙醇，35℃，220rpm转化24h。以10ml乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为36%，产物对映体过量值大于99%。

（4）取菌体2.0g，重悬于10ml磷酸钾缓冲液（pH8.0，0.1M），加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮100mg和0.5ml异丙醇，30℃，220rpm转化24h。以10ml乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为49%，产物对映体过量值大于99%。

（5）取菌体0.5g，重悬于10ml磷酸钾缓冲液（pH7.0，0.1M），加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮10mg和0.2g葡萄糖，30℃，220rpm转化3h。以10ml乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为19%，产物对映体过量值大于99%。

（6）取菌体1.0g，重悬于10ml磷酸钾缓冲液（pH7.0，0.1M），加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮20mg和0.5g葡萄糖，32℃，100rpm转化3h。以10ml乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为24%，产物对映体过量值大于99%。

（7）取菌体2.0g，重悬于10ml磷酸钾缓冲液（pH7.0，0.1M），加入底物3,5-双三氟甲基苯乙酮200mg、0.2g葡萄糖和0.5ml异丙醇，30℃，200rpm转化24h。以10ml乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为39%，产物对映体过量值大于99%。

实施例6羰基还原酶ChKRED03粗酶液生物催化

将诱导培养20h后的菌体（具体方法见实施例2）离心收集（4℃，13000rpm），ATS高压均质机破碎细胞，离心20min（4℃，13000rpm），将上清液用于生物催化反应。转化体系样品的处理方法和产物的测定方法同实施例3。

（1）磷酸钾缓冲液（0.1M，pH6.5），粗酶液以总蛋白计10g/l,底物3,5-双三氟甲基苯乙酮10mM，NADH20mM，25℃，200rpm反应1h，等体积乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为80%，产物对映体过量值大于99%。

（2）磷酸钾缓冲液（0.1M，pH7.0），粗酶液以总蛋白计5g/l,底物3,5-双三氟甲基苯乙酮10mM，NADPH20mM，30℃，50rpm反应1h，等体积乙酸乙酯萃取，经气相色谱分析，底物的转化率为90%，产物对映体过量值大于99%。

实施例7羰基还原酶ChKRED03粗酶粉生物催化

粗酶液的获得方法同实施例5，将粗酶液先冷冻于-80℃过夜，再以冷冻干燥机冻干后获得粗酶粉。催化体系5ml，包括磷酸钾缓冲液（pH7.0,0.1M），粗酶粉量5g/l，底物3,5-双三氟甲基苯乙酮30mM，NADPH50mM。温度30℃，200rpm，反应2h。转化体系样品的处理方法和产物的测定方法同实施例3。测定的转化率为85%，产物对映体过量值大于99%。

Claims

1.一种羰基还原酶ChKRED03的基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2. 一种羰基还原酶ChKRED03，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

3. 如权利要求2所述的羰基还原酶ChKRED03作为生物催化剂在转化底物3,5-双三氟甲基苯乙酮生成(S)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙醇中的应用。