CN1292818A - 新型二羰基还原酶及编码其的基因 - Google Patents

Abstract

本发明的新型蛋白质为具有二羰基还原酶活性,具有和已知的小鼠肺特异性羰基还原酶(CR)约70%同源性的氨基酸序列,以二乙酰为底物时显示出很高还原活性的,首次在哺乳动物中克隆化的蛋白质。此外,该蛋白质局部存在于肾髓质乳头部周围,其表达为肾脏特异性,在糖尿病模型小鼠的肾脏内其表达显著降低。

Description

新型二羰基还原酶及编码其的基因

技术领域

本发明涉及具有二羰基还原酶活性的新颖蛋白质及编码其的基因。更进一步，本发明涉及对该蛋白质的抗体、该基因的反义寡核苷酸。此外，本发明还涉及使用该基因的AGE生成检测方法、以含有该蛋白质为特征的二羰基化合物生成抑制剂、AGE生成抑制剂、含有该反义寡核苷酸的AGE生成调节剂、AGE生成调节剂的筛选方法。再进一步，本发明涉及以使用该基因、该蛋白质、该抗体为特征的糖尿病并发症的诊断方法。

背景技术

氨基酸和还原糖非酶反应发生的颜色反应一般称之为美拉德反应。有报道表明，在机体内此反应也是普遍发生的，特别是蛋白质上的氨基起美拉德反应，有报道说自此反应起始，经过脱水、聚合等复杂的过程，形成特有的黄褐色物质。此物质被称为最终糖化物质(Advanced Glycation Endproduct，在以下的本说明书中称为AGE)。

已知AGE在糖尿病患者体内高浓度蓄积，此外它还具有和血红蛋白和胶原结合的性质，因此认为是作为糖尿病并发症的动脉硬化、肾衰竭中纤维化、硬化的原因。

此外，有报道显示二羰基化合物在AGE生成(糖化)过程中是重要的中间体(Kato，H．，Hayase，F．，等：3-脱氧葡糖醛酮，以及美拉德反应的中间产物。3-Deoxyglucosone，and Intermediate Product ofthe Maillard Reaction．《老年化、糖尿病与营养学中的美拉德反应》The Maillard Reaction in Aging，Diabetes and Nutrition．(BaynesJ．W．，等编)p58-83，Alan R．Liss，纽约，1989)。

发明的公开

本发明的目的为(1)开发有效抑制、治疗肾衰竭、动脉硬化等上述糖尿病并发症，调节抑制上述AGE生成的有效手段；(2)发现调节控制AGE生成的物质，开发出检测AGE生成所致糖尿病并发症的方法，开发出该症状的诊断方法和诊断试剂，此外为使开发该症状的治疗方法和治疗药物成为可能，提供具有上述调节抑制AGE生成的酶活性的新颖蛋白质、及编码其的基因。

即，本发明者们基于上述思想进行了深入研究，结果在小鼠肾脏内发现了特异的基因，分离出编码本发明的新颖蛋白质(下面称为蛋白质DCR1)的基因(下面称为基因dcr1)，成功地确定其碱基序列及其编码的蛋白质DCR1的预测氨基酸序列。更进一步，此新颖蛋白质DCR1显示出二羰基还原酶活性，由此完成了本发明。

更进一步，基于上述基因dcr1的碱基序列信息，检索编码人肾脏中存在的具有相同功能蛋白质的新基因，结果分离出编码显示与上述蛋白质DCR1相同活性的新颖蛋白质(下面称为hDCR1)的新基因(下面称为基因hdcr1)，成功确定了其编码蛋白质hDCR1的预测氨基酸序列。

本发明中最初所得的小鼠来源的蛋白质DCR1和人来源的hDCR1的氨基酸序列显示出很高的同源性(约85％)，此外，它和已知的小鼠肺特异性羰基还原酶(CR)约有70％的同源性。

此外，此蛋白质DCR1、hDCR1在二乙酰基为底物时显示出很高的还原性，这是哺乳动物首先克隆的具有二乙酰基还原酶活性的蛋白质。

此外，蛋白质DCR1局部存在于肾脏髓质乳头部周围(小鼠组织抗体染色法)。此外，它的生成是肾特异性的(对于肾以外的器官用各种器官提取液进行Western印迹)，而且它在糖尿病模型小鼠肾中的生成显著降低。

即，本发明提供了含小鼠、人在内的哺乳动物来源的新型二羰基还原酶(特别是提供对具有碳数4～10的直链烷基的α-二酮有高还原活性的二乙酰基还原酶，此外，特别是对芳香族邻醌具有高还原性。作为这里的α-二酮，例如有二乙酰、2，3-戊二酮、2，3-己二酮、3，4-己二酮和2，3-庚二酮等；此外作为上述芳香族邻醌，例如有靛红、菲醌和二氢苊醌等)，编码其的基因，其抗体、反义寡核苷酸，此外还提供含有此二羰基还原酶为成分的二羰基化合物生成抑制剂、AGE生成抑制剂、AGE生成调节剂，还有基因表达调节因子的筛选方法、基因表达调节因子、蛋白质活性调节剂的筛选方法、蛋白质活性调节剂等。

此外，本发明提供编码以下(a)或(b)蛋白质的基因。

(a)由序列表的序列2记载的氨基酸序列形成的蛋白质

(b)由序列表的序列2记载的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列形成的、且具有二羰基还原酶活性的蛋白质。

更进一步，本发明提供上述记载的基因和在严格条件下杂交、且编码具有二羰基还原酶活性蛋白质的基因。

此外，本发明提供以下(a)或(b)的蛋白质。

(a)由序列表的序列2记载的氨基酸序列形成的蛋白质

(b)由序列表的序列2记载的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列形成的、且具有二羰基还原酶活性的蛋白质。

此外，本发明还提供上述记载的蛋白质的抗体。

更进一步，本发明提供具有上述任一项记载的基因的反义链的全部或一部分序列的、且抑制3中记载的蛋白质生物合成的反义寡核苷酸。

还有，本发明提供了二羰基化合物生成抑制剂，其特征在于含有上述记载的蛋白质。

此外，本发明提供AGE生成抑制剂，其特征在于含有上述记载的蛋白质。

还有，本发明提供AGE生成调节剂，其特征在于含有上述记载的反义寡核苷酸。

更进一步，本发明还提供至少利用上述记载基因的一部分筛选上述基因表达调节因子的方法以及由此方法所得的上述基因表达调节因子。

更进一步，本发明还提供至少利用上述记载蛋白质的一部分筛选上述蛋白质活性调节剂的方法以及由此方法所得的上述蛋白质活性调节剂。

下面就发明实施的方案进行详细的说明。对于这里的基因，当表示由天然存在的mRNA逆转录所得的DNA(包括扩增此DNA所得的DNA)时，其意义明确时称为cDNA。

还有，本说明书中需要使用以下简称。简称

DNA       脱氧核糖核酸

A         腺嘌呤

C         胞嘧啶

G         鸟嘌呤

T         胸腺嘧啶

Ala(A)    丙氨酸

Arg(R)    精氨酸

Asn(N)    天冬酰胺

Asp(D)    天冬氨酸

Cys(C)    半胱氨酸

Gln(Q)    谷氨酰胺

Glu(E)    谷氨酸

Gly(G)    甘氨酸

His(H)    组氨酸

Ile(I)    异亮氨酸

Leu(L)    亮氨酸

Lys(K)    赖氨酸

Met(M)    甲硫氨酸

Phe(F)    苯丙氨酸

Pro(P)    脯氨酸

Ser(S)    丝氨酸

Thr(T)    苏氨酸

Trp(W)    色氨酸

Tyr(Y)    酪氨酸

Val(V)    缬氨酸

图的简单说明

图1表示蛋白质hDCR1(人来源，上)的氨基酸序列和蛋白质DCR1(小鼠来源，下)的氨基酸序列的比较。

图2表示蛋白质DCR1的氨基酸序列和肺特异性羰基还原酶(CR)的氨基酸序列的相似性(小鼠)。这里上段表示蛋白质DCR1，下段表示羰基还原酶。下线部表示制备抗体所使用的多肽序列。

图3表示蛋白质hDCR1(人来源，上)、蛋白质DCR1(小鼠来源，中)和小鼠羰基还原酶(CR、下)的底物识别部位氨基酸序列的类似性。图中箭头表示和底物产生疏水相互作用的氨基酸残基。

图4为重组蛋白质DCR1的亲和精制结果的电泳照片。

图5为正常小鼠主要器官中蛋白质DCR1表达量用Western印迹方法测定结果的电泳照片。

图6为用Western印迹方法将病理模型小鼠肾脏提取液和正常小鼠的蛋白质DCR1表达量进行比较的结果的电泳照片。

图7表示以二乙酰为底物的蛋白质DCR1的二羰基还原酶活性的pH依赖性。

发明实施的最佳形式(基因dcr1的克隆)

本发明中的基因dcr1可按以下操作得到。

即，基因(dcr1)可以从肾来源的cDNA文库以含有该基因的cDNA片段分离出来。在这里，本发明者们所用的cDNA文库是用肾脏的肾小球为中心的肾组织调制而成的。

对于上述cDNA文库，作为辨识具有肾组织特异性表达基因的cDNA的方法，可以按照大久保等的方法(Okubo等，自然遗传学NatureGenet．，2，173(1992))，使用解析基因表达发生频率的方法。具体地说，(1)以肾来源的mRNA为模板，用适当限制性内切酶开环的、一端结合有寡聚dT的载体质粒为引物进行cDNA的合成，然后用限制性内切酶MboⅠ和BamHⅠ切断。

因为以dam甲基化酶阳性的大肠杆菌为宿主调制此载体，作为MboⅠ识别序列的“GATC”的A残基被甲基化。所以，MboⅠ只切断新合成的cDNA部分。因为此载体结合寡聚dT的末端在其互补链的末端附近只有一个BamHⅠ切断部位，此酶将载体切开一个切口，如果新合成的cDNA部分也存在BamHⅠ识别序列，也会切开这个部位。BamHⅠ和MboⅠ识别“GATC”序列，生成相同的粘性末端，所以用两酶切断后，用DNA连接酶作为，可以将质粒闭环。

(2)使用这样调制的质粒对大肠杆菌进行转化，构建cDNA文库

所以，此文库含有各mRNA 3’端PolyA部位开始至其5’端部分中最开始出现GATC序列的部位为止的区域。

(3)从所得cNDA文库中随机选择适当个数的重组体，提取各重组体的cDNA，确定其全碱基序列。

对于这样确定的具有特定序列的cDNA片段，根据从随机选择的重组体中可确定几个，从而识别器官特异性的基因和高表达基因。

在本方法中，重组体cDNA的提取及cDNA碱基序列的确定，可以按照任一种本领域技术人员自己已知的操作方法(分子克隆Molecular Cloning，第2版，2nd．ed．，冷泉港实验室出版社，ColdSpring Harbor Lab．Press，1989中记载的方法，或其它本领域技术人员认为是标准方法的技术书籍中介绍的方法，以下称为常规方法)进行。

还有，在识别高表达基因的方法中，随机选择的重组体的总数从数百至数千，可根据需要处理更多个数的重组体。

具体地说，如以下的实施例所示，全部确定适当数目重组体中cDNA片段的碱基序列，选择其中具有相同序列cDNA的出现频率在某定值以上的cDNA片段作为具有肾特异性表达基因DNA片段的候补。

(4)上述cDNA片段如上所述，含有mRNA3’端一部分的区域，基于该区域(以下称为3’片段)的碱基序列信息，按下述方法得到全长链的cDNA。即，以肾cDNA文库为模板，分别合成适当长度具有上述3’片段内序列的寡核苷酸，将其作为引物以PCR方法进行扩增。

此外可以以上述3’片段为探针，将上述cDNA文库进行集落杂交或プラ-ク(嵌段)杂交，按常规方法进行筛选。

此外，可以把上述3’片段作为探针，将上述肾cDNA文库进行集落杂交或噬斑杂交，按常规方法进行筛选。

按上述方法扩增的cDNA片段可以以常规方法和适当的载体〔例如Novagene公司市售的pT7BlueT-载体〕重组，确定全碱基序列。

此时分别得到2个克隆的重组DNA，分别确定其cDNA片段的碱基序列，从而确认序列。所得基因dcr1的碱基序列如序列表中序列1所记载。(基因hdcr1的克隆)

利用上述用小鼠确定的碱基序列信息(考虑到使用的密码子)，对于异种生物，也使用根据从该碱基序列推测的氨基酸序列合成的探针进行集落杂交或Southern印迹杂交，或者使用根据该信息合成的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，可以分离得到编码具有相同作用二羰基还原酶的基因。

即，使用人肾脏mRNA，按通常的方法调制cDNA文库，以适当的质粒亚克隆，可以确定碱基序列。

所得基因hdcr1的碱基序列如序列表的序列3所记载。

更进一步，本发明包括含有上述所得的碱基序列dcr1、hdcr1的DNA序列、与该序列或其衍生的片段和标准条件下杂交的DNA序列、以及基因密码简并所得的和上述DNA序列在标准条件下不杂交但编码具有完全相同氨基酸序列多肽的DNA序列。这里杂交的“标准条件”是指本领域技术人员一般使用的检出特异性杂交信号的、且如Sambrook等(分子克隆，冷泉港实验室出版社，美国纽约，第2版、1989)所述的条件。优选本领域技术人员公知的Sambrook等所述的所谓严格杂交-非严格漂洗条件，更优选所谓的严格杂交-严格漂洗条件。(组织分布的检测)

调制使用上述所得基因的全部或其一部分碱基序列的探针，可以检测表达该基因的组织分布。例如可以将上述探针用通常公知的标记方法标记，以公知的Northern印迹法进行实施。此外，使用特定的标准物，可以定量特定组织中表达的基因。

所以检测该基因的表达可以确认二羰基还原酶活性。此外，该活性和AGE生成调节、抑制相关时，定量检测此基因能够提供AGE生成调节、抑制的检测方法。

同样地，上述基因表达的定量化也可以提供确认AGE生成调节或抑制剂效果的方法。此时，可以确认AGE生成调节、或抑制剂给药的有无、或给药后特定时间内基因表达量的变化。

具体地说，对于根据上述方法选择的cDNA片段中存在的基因，其肾组织特异性表达的确认可以通过Western印迹确认该cDNA序列器官特异性的表达频率来进行。即，调制各器官的粗提取液，进行SDS-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)，将凝胶上的蛋白质转印于薄膜滤器上后，以抗多肽抗体为探针，按常规方法进行杂交。如以下的实施例所示，使用这里说明的方法，研究此cDNA序列表达的器官特异性，可以确认肾组织特异性的表达。(蛋白质DCR1和hDCR1)

按上述方法，可以得到基因dcr1和hdcr1，从这些基因的碱基序列信息可以推导出其编码蛋白质的氨基酸序列。即，本发明的新基因编码的蛋白质为分别含有序列表中序列2和4记载氨基酸序列的蛋白质。蛋白质DCR1和hDCR1的氨基酸序列显示出很高的同源性(图1)。

图2显示所得蛋白质DCR1的氨基酸序列和小鼠肺羰基还原酶(CR)的氨基酸序列的相似性。确认约70％的高相似性。此外，下线表示制造以下说明的抗多肽抗体所使用的序列(上为＃731，下为＃733)。

更进一步，图3比较小鼠来源DCR1、人来源hDCR1和小鼠来源羰基还原酶的底物识别部位的氨基酸序列。

此外，本发明的蛋白质并不仅限于序列表的序列2或4记载的氨基酸序列，还包括其中1或2个以上氨基酸取代、缺失或添加、且具有二羰基还原酶活性的序列(变异蛋白质)。

所以，作为本发明的编码具有二羰基还原酶活性蛋白质的基因(多核苷酸)的具体例子，并不仅限于序列表的序列1所记载的碱基序列所形成的多核苷酸，还包括多核苷酸一部分自然或人工变异而作为此多核苷酸编码多肽主要功能的二羰基还原酶活性没有变化的序列(变异基因)。

人工变异的引入可按照常规方法进行。

此外，根据遗传密码的简并，该基因碱基序列至少一部分碱基被其它碱基取代所得的基因仍可得到具有相同氨基酸序列的蛋白质。所以，本发明中编码蛋白质的基因包括编码本发明的蛋白质及其变异蛋白质的全部简并型。

得到本发明的蛋白质(包括变异蛋白质)的方法没有特殊的限定。具体地说，例如使用蛋白质合成装置等的人工多肽合成方法、或基于本发明所得编码该蛋白质的基因碱基序列信息的遗传工程方法表达蛋白质等各种方法。此时可以单独或以MBP(麦芽糖结合蛋白MaltoseBinding Protein)等的融合蛋白质的形式表达，也可以添加如FLAG多肽的Tag进行表达。此外，遗传工程方法可以用大肠杆菌等的细菌、酵母或动物细胞与昆虫细胞等进行调制。

作为具体例子，有选择适当的载体和宿主、引入基因得到转化体的方法(例如分子克隆(Sambrook，等，编．1989，冷泉港实验室出版社，纽约)中记载的方法)。进一步培养所得的转化体，扩增基因，进行表达，得到目的蛋白质。

接着回收培养物，根据需要进行浓缩、可溶化、透析、各种层析等操作，得到本发明的蛋白质及其变异蛋白质。

关于转化体的培养，可以按照各种教科书，例如分子克隆(Sambrook等编，1989，冷泉港实验室出版社，纽约)中记载的方法进行。基于本发明记载的碱基序列的目的蛋白质(包括变异蛋白质)的表达可按照公知的方法进行。

此时，作为宿主，可以使用大肠杆菌等细菌、酵母、动物细胞等的任一种，特别优选动物细胞。往细胞中引入基因的方法可以使用脂质体法、电穿孔法等。特别优选使用DEAE-葡聚糖法(Pharmacia公司)。

从所得培养物精制蛋白质的方法例如有免疫沉降法、盐析法、超滤法、等电点沉淀法、凝胶过滤法、电泳法、离子交换层析、疏水性层析和抗体层析等各种亲和层析、层析聚焦法、吸附层析法及反相层析等，适当选择对本领域技术人员来说是方便的。

此外，在制造过程中，所制造的目的蛋白质可以以和其它多肽融合的形式从转化体中生产。可根据需要，在精制步骤中用溴化氰等化学物质或蛋白酶等酶进行处理，切除出该目的蛋白质。(抗体)

获得本发明蛋白质(包括以上说明的变异蛋白质)的全部或一部分蛋白质的抗体的方法可以是通常公知的方法。此外，本发明中的抗体限于和本发明的蛋白质(其变异体)反应，包括多克隆多肽、单克隆抗体的任一个。此外，也包括其活性片段及含有其活性片段的嵌合抗体。

抗体，即免疫球蛋白，具有H链和L链，根据物理化学性质和免疫学性质分为5类(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)。在这其中，IgA、IgG因H链的类型还可以进一步分为各种亚型。本发明的新型抗体包括上述所有的类型和亚型。

更进一步，发明的抗体没有必要使用抗体分子的全部，可以只使用具有活性的分子的一部分(活性片段)。作为活性片段，具体地说有F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、重组Fv体和单链Fv等。例如用胃蛋白酶分解得到F(ab’)2、Fc’，木瓜蛋白酶分解得到Fab、Fc。

这些活性片段可以单独使用，也可根据需要和白蛋白、聚乙二醇等物质结合，作为新复合物使用。此复合物一般在机体内长时间不分解，能发挥其最大效果。往活性片段上加成白蛋白、聚乙二醇等物质的方法例如如《抗体，实验手册》Antibodies，A Laboratory Manual(冷泉港实验室，1988)p．77-81、p129-137中记载的。一般来说，使用SPDP(Pharmacia公司制造)、SMPB(PIAS公司制造)、EMCS(ド-タィト公司制造)等2价反应性试剂，能很容易使活性片段和白蛋白等结合。

作为制造本发明抗体的方法，例如可参考《免疫实验操作法》(日本免疫学会编，日本免疫学会发行)。作为免疫抗原，可以是本发明的蛋白质的一部分，即序列表的序列2记载的氨基酸序列、或变异蛋白质的氨基酸序列中连续8个以上氨基酸形成的多肽。此外，此蛋白质只要到达制造抗体所需的精制度即可，得到它的方法不限。

此外，免疫抗原为8～约20个氨基酸构成的多肽时，可以将其和匙孔_血蓝蛋白(KLH)等载体结合作为抗原使用。

该免疫抗原免疫的动物可以是人以外的任何动物，通常优选从本领域技术人员使用的动物中选择能够得到目的抗体的动物。

多克隆抗体由所得抗血清精制得到。精制可以用盐析、离子交换层析、亲和层析等方法组合进行。

单克隆抗体，可按通常制作杂交瘤的方法得到融合细胞后，由此细胞产生得到。细胞融合可以使用聚乙二醇、仙台病毒、电脉冲等方法。

此外，除上述方法外，还可以用遗传工程的方法得到此单克隆抗体。例如，从本发明蛋白质或其一部分免疫的动物的脾脏细胞、淋巴细胞或产生该单克隆抗体的杂交瘤中提取mRNA，以其为模板构建cDNA文库。接着，用该cDNA文库表达抗体。筛选产生和抗原反应的抗体的克隆，得到cDNA文库，培养所得的克隆，从培养混合物中用盐析、离子交换层析、亲和层析等组合方法精制目的抗体。

特别是所用的材料为病理组织时，例如可应用使用上述探针的原位杂交法。此外，可以应用使用本发明抗体的ABC组织染色法。(反义寡核苷酸)

本发明所得的基于上述基因的反义多聚〔或寡聚〕核苷酸中，由碱基、磷酸、糖构成的核苷酸多个结合而成，包括完全天然不存在的。其代表物为DNA和mRNA。

此外，在本发明的反义多核苷酸中，包括所有其立体结构和功能和多核苷酸类似的物质。例如，多核苷酸3’端或5’端结合其它物质的，或多核苷酸的碱基、糖、磷酸至少一部分被取代、缺失或添加修饰而生成的物质，具有天然不存在碱基、糖、磷酸的物质和具有糖-磷酸骨架以外骨架的物质。

此反义多核苷酸及其衍生物可以是本发明基因及其变异基因任一部分杂交而成的。

此外，此反义多核苷酸及其衍生物，可以作为用于研究组织和细胞中编码本发明蛋白质或其变异体的基因存在及表达情况的多核苷酸探针。此外，也可以作为诊断用多核苷酸探针。还有，作为探针，优选12个碱基以上、且GC含量30～70％，特别优选16个碱基以上、且GC含量30～70％者。

此外，使用该反义多核苷酸及其衍生物，可以调节本发明蛋白质(包括其变异体)的表达。它们和编码上述蛋白质的基因或mRNA杂交，能够抑制其蛋白质的表达，所以可用于和这些蛋白质有关疾病的治疗药物。即，该反义多核苷酸及其衍生物可以开发为反义药物。一般来说，使用含有和编码多肽DNA和mRNA互补碱基序列的多核苷酸，调节该多肽表达的方法称为反义法。具有互补序列的多核苷酸在①从基因到mRNA前体的转录阶段、②从mRNA前体到成熟mRNA的加工阶段、③核膜通过阶段、④蛋白质的翻译阶段中的任一阶段，和承载遗传信息的DNA或mRNA结合，通过影响遗传信息的正常传递而调节多肽的表达。

一般来说，含有15个碱基以上的碱基序列认为是具有特异性的序列。所以，本发明的反义多核苷酸和反义多核苷酸衍生物也是15个碱基以上形成的、与本发明蛋白质及其变异体对应的mRNA互补的碱基序列，可推测它对本发明的基因或本发明基因所对应的mRNA能够特异结合。

另一方面，将多核苷酸引入细胞内，其长度不能太长。本发明的反义多核苷酸及其衍生物任意长度均可，考虑到要将本发明的反义多核苷酸和反义多核苷酸衍生物引入细胞、调节蛋白质的表达，上述反义多核苷酸及其衍生物应该是对dcr1对应的mRNA互补的15个碱基以上30个碱基以下的序列，优选15个碱基以上25个碱基以下的序列，更优选18个碱基以上22个碱基以下的序列。

在本发明的反义多核苷酸及其衍生物中，可应用公知的反义技术，以提高作为多核苷酸药物的药效为目的，得到各种衍生物，即，得到与目的DNA及mRNA结合力、组织选择性、细胞通透性、核酸酶耐性、细胞内稳定性高的各种多核苷酸衍生物。

从杂交容易程度方面考虑，一般来说，可设计具有与形成茎环结构区域的碱基序列互补的碱基序列的多核苷酸及其衍生物。本发明的多核苷酸及其衍生物可根据需要形成茎环结构。

此外，具有和翻译起始区密码子附近、核糖体结合部位、加帽部位、剪接部位互补序列的多核苷酸一般可有较高表达抑制效果。所以，因本发明的多核苷酸及其衍生物含有和编码本发明蛋白质或其变异体的基因或该基因对应的mRNA的翻译起始区密码子附近、核糖体结合部位、加帽部位、剪接部位互补的序列，可望具有较高的表达抑制效果。

就目前一般所知的衍生物，报道表明优选核酸酶耐性、组织选择性、细胞通透性、结合能力至少一方面高的衍生物，特别优选该多核苷酸衍生物中具有硫代磷酸酯骨架结构的衍生物(参考)《反义，从技术到治疗》Antisense-From Technology to Therapy(Schlingensiepen等编)1997 Blackwell Science，Berlin-Vienna)。本发明的多核苷酸及其衍生物中包括具有这些功能或结构的衍生物。

关于本发明的反义多核苷酸衍生物的制造方法，例如可应用《反义研究与应用》in Antisense Research and Applications(MichaelJ．GAIT，p290-299，CRC出版，佛罗里达，1993年)中记载的方法。

例如，如果是天然型的DNA和RNA，可以使用化学合成仪进行合成、以编码本发明蛋白质的基因为模板以PCR法得到本发明的反义多核苷酸。此外，在甲基磷酸化型和硫代磷酸酯型等衍生物中，也有可以用化学合成仪合成的(例如，Perkin Elmer Japan公司制造394型)。这种情况下根据附带的说明书操作化学合成仪，所得合成产物以使用反相层析等的HPLC法进行精制，可以得到目的多核苷酸或其衍生物。(二羰基还原酶活性)

酶活性测定方法没有特殊的限定，可按照小鼠羰基还原酶(CR)活性的测定方法进行(欧洲生物化学杂志Eur．J．Biochem．228，381-387(1995))。酶使用表达的重组酶。

(a)底物特异性：为了研究底物特异性，可以使用各种具有酮基、醛基、酯基的烃类或芳香族化合物。特别在本发明中，为了研究底物特异性，作为其优选使用的化合物如下表1所示。在表中，显示就大鼠和人来源的酶的底物特异性所得的结果。这里C表示底物浓度(μM)，RA为以二乙酰为标准100时的相对活性(％)，Km为pH7．0时mM表示的测定结果。

(表1)(底物筛选的结果)小鼠              人C     RA   (Km)  C     RA       (Km)底物                 (μM)  (％)  (％) (μM) (％)      (mM)直链二羰基化合物C2-化合物乙醛                 5，000 1．8羟乙醛               5，000 0．9             未测定乙二醛               5，000 0                未测定C3-化合物甲基乙二醛           5，000 7．9      5，000 20甲基乙二醛           1，000 2．3             未测定苯基乙二醛           1，000 3．9      1，000 35丙酮醇               1，000 0．8             未测定二羟基丙酮           5，000 1                未测定丙酮酸               5，000 0                未测定丙酮酸甲酯           1，000 23．3     1，000 46丙酮酸乙酯           1，000 35．2     1，000 33苯丙酮酸             1，000 0．5             未测定1-丙醛               5，000 0．5             未测定DL-甘油醛            5，000 40        5，000 25DL-甘油醛            1，000 10．4            未测定D-乳醛               1，000 0．6             未测定C4-化合物二乙酰基(2，3-丁二酮)1，000 100       1，000 100        (0．25)1，4-二溴-2，3-丁二酮       未测定    1，000 133        (0．016)1-苯基-1，2-丙二酮   1，000 148       1，000  653-羟基丁酮           5，000 7．4      5，000 132-丁酮               5，000 0                未测定苯基·乙基(甲基)酮   1，000 0                未测定乙酰乙酸甲酯         1，000 0．2             未测定乙酰乙酸乙酯         1，000 0                未测定苯甲酰乙酰乙酸乙酯   1，000 0                未测定C5-化合物2，3-戊二酮          1，000 163       1，000 167        (0．26)2，4-戊二酮          1，000 0         1，000 02-氧代戊二酸二甲酯          未测定    2，000 63苯基-2-丁酮          1，000 0．2             未测定苯基-1，3-丁二酮     1，000 0                未测定C6-化合物2，3-己二酮          1，000 108       1，000 168         (0．24)3，4-己二酮          1，000 232       1，000 170         (0．12)2，5-己二酮          1，000 0                未测定C7以上2，3-庚二酮          1，000 134       1，000 174联苯酰               100    0                未测定其它二羰基化合物及羰基化合物醌类1，2-萘醌*           20     47               未测定靛红                 400    106．7     500   252樟脑醌               500    6          500   23菲醌                 12．5  20．1      12．5 181二氢苊醌             25     14．1      25    181甲萘醌(维生素K3)     100    0．1       100   0酮类1，2-环己二酮         1，000 10．9    1，000 271，4-环己二酮         1，000 0               未测定2-环己烷-1-酮         1，000 1．3            未测定柔红霉素              500 1．1        500    01-苯基-1，3-茚满二酮  400 0．6               未测定苯亚甲基丙酮          500 0                  未测定纳络酮                1，000 0               未测定醋磺己脲              1，000 0               未测定1-茚满酮1，000 0未测定1，000 0               未测定4-苯甲酰基吡啶        1，000 7        1，000 394-硝基苯乙酮          1，000 0        1，000 0醛类4-硝基苯甲醛          1，000 3．3     1，000 693-硝基苯甲醛          3，000 3．3            未测定2-硝基苯甲醛          1，500 3．9     1，000 99吡啶-3-醛             1，000 4        1，000 27吡啶-4-醛             5，000 13．7    1，000 27吲哚烷基醛            1，000 0               未测定1-壬醛                50     0．005          未测定1-壬烯醛              50     0．01           未测定4-羟基壬烯醛          50     0．01           未测定糖衍生物2-酮古洛糖            1，000 0               未测定去氢抗坏血            500    0               未测定a-酮戊二酸            1，000 0               未测定3-脱氧葡糖酮醛**      2，000 0．4     2，000 5D-葡萄糖醛酸盐        1，000 0               未测定D-葡萄糖              200，000 0             未测定甾体，前列腺素17α-羟基黄体酮        20     0．0     50    05β-雄甾烷-3，17-二酮  20     0．05β-孕烷-3，20-二酮    20     0．05α-雄甾烷-3，17-二酮  20     0．0     50    0四氢皮质酮             20     0．05α-DHT                       未测定     50    05β-二氢可的松                未测定     20    0皮质醇-21-醛           20     0．0皮质酮-21-醛           20     0．0皮质酮                        未测定     50    0PGE2                   1，000 0．0

更进一步，对于小鼠酶的主要底物的速率常数如以下表2所示。3，4-己二酮、1-苯基-1，2-戊二酮是即使为最小的Km值也给出很高催化效率(Vmax／Km)的良好底物。(表2)

底物	Km(μM)	Vmax(unit／mg)	Vmax／Km(unit／mg／mM)
				丙酮酸甲酯	1，700	2．7	1．6
苯甲酰基甲酸甲酯	690	8．7	13
				二乙酰基(2，3-丁二酮)	900	6．1	6．7
1-苯基-1，2-丙二酮	140	6．7	48
				3-羟基丁酮	6．500	0．51	0．08
2，3-戊二酮	280	5．7	20
				2，3-己二酮	230	4．1	18
3，4-己二酮	130	6．6	51
				2，3-庚二酮	200	4．4	22
吡啶-3-醛	7，900	0．62	0．08
				吡啶-4-醛	4，400	0．78	0．18

更进一步，对小鼠CDR1时酶反应的抑制物进行评价，其结果如表3所示。这里所用的酶为小鼠CDR1和仓鼠肝脏二乙酰基还原酶(HamsterDR)。

(表3)

化合物	浓度(mM)	抑制率(％)
				CDR1	Hamster DR
		汽巴蓝	0．001			21	18
橡素	0．1			50	33
		四甲撑戊二酸	0．1			0	63
利尿酸	0．1			0	3
		苯甲酸	0．1			32	59
邻氨基苯甲酸	0．1			0	42
		异烟酸	0．1			0	4
二苯乙内酰脲	0．1			17	2
		巴比妥	1			0	5
异丁胺	1			16	50
		苯甲酰胺	1			18	43
4-羟基苯甲酰胺	1			44	19
		邻菲咯啉	1			8	0
吡唑	10			29	5

从所得的底物反应性(表1、表2和表3)中可确认本发明的二羰基还原酶具有以下特征。

(1)本发明中的酶，其辅酶特异性、pH依赖性和底物特异性和哺乳动物(仓鼠)组织的二乙酰基还原酶类似。与微生物的二乙酰基还原酶的底物特异性也相似，但微生物酶依赖于NADH。

(2)对于具有碳数4～10直链烷基的α-二酮，特别是二乙酰、1，4-二溴-2，3-丁二酮、1-苯基-1，2-丙二酮、2，3-戊二酮2，3-己二酮、3，4-己二酮和2，3-庚二酮等有很强的反应性。

(3)对于芳香族邻醌，特别是靛红、菲醌和二氢苊醌具有很强的反应性。

(4)对于丙酮酸酯(甲酯、乙酯)、DL-甘油醛、2-氧戊二酸二甲酯也具有很高的反应性。

(5)其它大多底物显示出较弱反应性。

(6)最适pH：从DCR1、hDCR1的pH特征曲线(profile)可见，pH6(进一步为5)以下具有峰。但是，底物之一的NADPH在pH5以下分解，使用NADPH时此范围不能进行活性测定，不能确认峰。所以，实施例中虽在pH7附近进行，最适pH并不仅限于7附近。

(7)pH稳定性：例如将DCR1、hDCR1在各种pH值的缓冲液中、25℃下孵育3小时后，测定其残留活性，和未在pH8．0下孵育所得的值比较作为相对活性。

(8)金属离子和抑制剂的影响：用各种金属和抑制剂处理酶后，评价残留活性。MgCl₂和CaCl₂对酶基本没有影响。此外，对小鼠给予汞和顺铂时，DCR1的表达量增加。

(9)分子量和亚基：将精制的DCR1和hDCR1(接有(His)-tag)用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳(SDS-PAGE)进行测定，其分子量约为33kDa。(应用例)

如以上一般的说明，利用本发明的基因及其编码的蛋白质、它们的变异体的全部或一部分，可应用于糖尿病并发症的诊断、治疗、或其它各种应用，下面就具体的应用例进行详细的说明。

(1)检测本发明的基因，定量其含量，从糖化可推测出二羰基化合物的分解活性。

(2)本发明的蛋白质，在糖化中可直接分解二羰基化合物，作为含有酶的药物，可抑制二羰基化合物的生成，所以能够阻断或抑制AGE的生成，提供治疗AGE所致糖尿病并发症的治疗药物。

(3)本发明的反义寡核苷酸可以控制二羰基还原酶的活性，所以，在糖化中可以控制二羰基化合物的分解活性，可以提供AGE生成的调节剂。同样地，也提供了AGE生成调节剂的筛选方法。

(4)此外，检测本发明所需的基因、与正常表达量作比较，测定二羰基还原酶活性，根据其值，可以提供AGE所致糖尿病并发症的诊断方法或其诊断药物。同样地，也可提供以检测蛋白质DCR1为特征的、诊断AGE所致糖尿病并发症的方法或诊断药物。

(5)更进一步，也可提供以使用本发明抗体为特征的诊断AGE所致糖尿病并发症的方法或诊断药物。

下面就实施例对本发明进行说明，但本发明并不仅限于此。【实施例】(实施例1)基因dcr1的克隆(1)小鼠肾小球特异性基因部分序列的确定

将小鼠(C57BL／6)按Grant等的方法(Grant等、Eur．J．Biochem．，54、531-540(1975))，精制肾小球部分，用TRIzol(Gibco BRL公司)提取全RNA。以此RNA为模板，按大久保等的方法(Okubo等，NatureGenet．，2，173(1992))，创建肾小球的cDNA文库。

接着，从该文库中随机选择985个重组体，按常规方法提取重组DNA，确定cDNA部分3’端的碱基序列。序列确定使用PE应用生物系统司制造的DNA序列分析仪(ABI PRISM 377)和该公司制造的反应试剂盒。

解析985个重组体中各DNA片段的表达频率，结果发现，具有序列-1(238残基)的基因的表达频率为3／958。

序列-1GATCGTATCC CACTGGGCAA GTTCGNTGAG GTGGAGAACG TCGTGGACAC CATTCTCTTC 60CTGCTGAGCA ACCGGAGTGG CATGACCACT GGCTCCACTT TGCCAGTGGA TGGGGGCTTC 120CTGGCTACCT GAGCCCCCTG CCCACCGACA CTCTGCTCAG CTCTCTGCTC AGGACACTGT 180GCCCTCCGCC CCTGCAATAA AGCTCTCTGC TCAGCCTGTG TGCTGATTCT CCAGGAAA   238(2)取得含有序列-1的DNA片段

含有序列-1的DNA片段可按以下方法得到。(2-1)cDNA文库的构建

以实施例1的(1)调制的全RNA为模板，使用CapFinder PCR cDNA文库制作试剂盒(克隆技术实验室(クロンテツクラボラトリ-ズ)公司制造)合成cDNA。(2-2)含有序列-1的DNA片段的扩增

首先，用PE应用生物系统公司制造的DNA合成仪(ABI 380B)合成序列-1的一部分形成的寡核苷酸。序列-2：5’CAGTGTCCTGAGCAGAGAGCTGAG3’

接着，以(2-1)调制的cDNA文库为模板，以序列-2的寡核苷酸和试剂盒中附带的寡核苷酸为引物进行PCR。此反应中使用宝酒造公司制造的试剂盒(タカラLA PCR Kit Ver．2)，并使用宝酒造公司制造的PCR Thermal Cycler Mp。反应液cDNA文库                     5μl10xPCR缓冲液(含25mM Mg2+)    5μl2．5mM dNTP                  1μl10μM寡核苷酸(序列-2)        2μl试剂盒附带的寡核苷酸         2μl水                       34．5μlLA Taq聚合酶              0．5μl总量                         50μl反应条件

在94℃(下反应30秒，以-1℃／2秒的速度冷却至60℃，在60℃下保持30秒，接着加温到72℃，保持4分钟。这样重复操作30次，将目的序列扩增。

按照上述方法，特异性扩增基因序列-1的一部分的DNA片段(约0．8kb)。(3)碱基序列确定用载体的亚克隆

将(2)所扩增的DNA片段按常规方法用琼脂糖凝胶电泳(凝胶浓度1％)进行分离。将凝胶用溴化乙锭染色后，用紫外线照射，切出含有目的区带的凝胶。从琼脂糖凝胶中提取精制DNA片段用GENECLEANⅡ试剂盒进行。

将此精制的DNA片段按以下方法用碱基序列确定用载体、pT7BlueT-载体(Novagene公司制造)进行亚克隆。连接溶液使用宝酒造公司制造的试剂盒(タカラDNA连接试剂盒Ver．2)，在16℃下反应16小时。反应液PCR产物          1μl(50ng)T7 Blue T-Vector 1μl水               3μl连接溶液         5μl总量            10μl

使用上述反应溶液，按常规方法进行大肠杆菌K12株DH5的转化。将转化体接种于含有氨苄青霉素(Amp)50μg／ml、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-d-半乳糖苷(β-gal)40μg／ml、异丙基-β-d-硫代-半乳吡喃糖苷(IPTG)100μM的LB琼脂培养基中，在37℃下培养一夜。将白色集落接种于10毫升含有50μg／ml Amp的LB液体培养基中，在37℃下培养一夜，离心分离收集菌体后，用QIAprep Spin PlasmidMiniprep试剂盒(キアグン公司制造)精制重组DNA。(4)DNA片段碱基序列的确定

碱基序列的确定使用PE应用生物系统公司制造的DNA序列分析仪，应用双终结子(ダィタ-ミネ-タ-)法。以确定的碱基序列为模板合成寡核苷酸，用引物walking法确定全碱基序列(序列表序列1)。确定两链的碱基序列，此外，独立的2个克隆的碱基序列完全相同。因该碱基序列含有序列-2和序列-1中序列-2上游区域，可确认克隆了目的基因(基因dcr1)。以下显示了含有上述基因dcr1的全碱基序列。TTGCTGCGAG  AAGACGACAG  AATGGGAGGA  CCAGGCTCAA  GCACCATGGA  50CCTGGGGCTT  GCAGGTCGGC  GGGCGCTGGT  CACCGGCGCG  GGCAAAGGCA  100TCGGGCGCAG CACTGTGCTG GCGTTGAAGG CGGCTGGTGC ACAGGTTGTG 150GCGGTGAGTC GGACGCGAGA GGACCTGGAC GACCTGGTCC GCGAGTGTCC 200TGGTGTGGAG CCTGTGTGTG TGGACCTGGC CGACTGGGAG GCCACAGAGC 250AGGCCCTAAG CAATGTGGGA CCCGTGGACC TTCTGGTGAA CAATGCTGCT 300GTGGCTCTGT TGCAGCCCTT CCTGGAGGTC ACCAAGGAGG CCTGTGACAC 350ATCCTTCAAT GTGAATCTTC GGGCTGTCAT CCAGGTGTCT CAGATTGTGG 400CCAAGGGCAT GATAGCTCGG GGAGTTCCAG GAGCCATTGT GAATGTCTCC 450AGCCAGGCCT CCCAACGTGC ACTGACCAAC CATACTGTCT ACTGTTCCAC 500CAAGGGTGCT CTGGACATGT TGACCAAGAT GATGGCCCTA GAGCTTGGGC 550CCCACAAGAT CCGTGTGAAT GCAGTAAACC CCACAGTAGT GATGACACCC 600ATGGGCCGGA CCAACTGGAG TGACCCCCAC AAAGCTAAGG CCATGCTGGA 650TCGTATCCCA CTGGGCAAGT TCGCTGAGGT GGAGAACGTC GTGGACACCA 700TTCTCTTCCT GCTGAGCAAC CGGAGTGGCA TGACCACTGG CTCCACTTTG 750CCAGTGGATG GGGGCTTCCT GGCTACCTGA GCCCCCTGCC CACCGACACT 800CTGCTCAGCT CTCTGCTCAG GACACTGTGC CCTCCGCCCC TGCAATAAAG 850CTCTCTGCTC AGCCTGTGTG CTGATTCTCC AGGAAA  886(实施例2)蛋白质DCR1的生物合成(1)表达载体pHis-glB的构建

用以下所示的引物，将实施例所得的含有基因dcr1的cDNA片段以PCR法进行扩增。PCR按实施例1记载的条件进行。序列-35’TAATGGATCCATGGACCTGGGGCTTGCAGGTCGG 3’序列-45’ATTAGAATTCAGGTAGCCAGGAAGCCCCCATCC 3’

将此扩增、精制的cDNA片段用限制性内切酶EcoRI和BamHI(皆为宝酒造公司制造)切断。切断处理后，再用琼脂糖电泳分离，精制得到约0．7kb的DNA片段。(片段-1)。

将蛋白质生产用载体、pTrcHisA(Invitrogene公司制造)用上述相同的限制性内切酶EcoRI和BamHI切断，精制开环载体。

将片段-1和上述开环载体混合，在实施例1记载的条件下，进行连接及大肠杆菌K12株的转化，进一步培养该转化体，离心收集菌体，精制重组DNA。这样构建的重组DNA命名为pHis-glB。

下面对表达条件和精制操作进行说明。培养基(L+glucose)由以下成分构成(11中)。胰胨蛋白胨    10gNaCl          5gr酵母提取物    5grD-葡萄糖      2gr

此外，预培养使用上述培养基(8ml)中加入200μg／ml氨苄青霉素的培养基，在37℃下振荡培养一夜。

此培养使用上述培养基(150毫升)中加入200μg／ml氨苄青霉素的培养基在37℃下进行，加入100毫克IPTG(约3mM)使OD=0．6，再培养3小时。

冰冷却后，收集细菌，悬浊于10毫升以下的柱缓冲液，在-20℃下冷冻。

柱缓冲液： 10mM Tris-Cl pH8．0200mM NaCl0．1mM PMSF

将其融化后，加入20mg溶菌酶、5μl DNA酶I(5mg／ml)、RNA酶A(5mg／ml)、100μl 10％TritonX-100，在37℃下溶菌15分钟。

在4℃下、9000rpm、离心分离10分钟，取得上清，往此上清中加入10ml新鲜柱缓冲液，再加入1ml bed volume的Nickel-NTA-琼脂糖凝胶(Qiagen公司)，在室温下缓慢振荡15分钟。

将其充填于玻璃柱，按以下条件进行精制。清洗：カラム缓冲液(50ml)：

柱缓冲液+10mM咪唑50ml

柱缓冲液+30mM咪唑10ml洗脱：柱缓冲液+500mM咪唑透析：柱缓冲液(4℃)

往其中加入15％(v／v)甘油，保存于-20℃。

纯度检查在SDS PAGE后用考马斯蓝染色法进行。

此外，蛋白质含量用HSゲラツドフォ-ド法测定(Biorad公司)。

图4显示重组蛋白质DAR1的亲和精制结果。

分子量约为33kDa，推测为95％以上的纯度(收量约3mg(E．coli150mL培养基))。(实施例3)抗体制造

抗DAR1蛋白质抗体的制造使用以下的抗原，按サワデ-バィォテクノロジ-公司的方法进行。

抗体731以Ac-NH-SRTREDLDDLVREC-COOH为抗原，此外抗体733以Ac-NH-QASQRALTNHTVYC-COOH为抗原，以结合的形式免疫家兔。

即，以上述抗原为载体蛋白，结合血蓝蛋白(KLH)，对家兔每次150毫克、两个月时间免疫6次，得到抗多肽抗体。

将0．1μg实施例2所得的重组体进行SDS PAGE后的凝胶用Miniprotein Ⅱ的印迹转移装置(Biorad公司)转移到Hybond-ECL硝基纤维素膜(Amersham公司)上。

印有蛋白质的膜滤器用蒸馏水洗净后，用制作的各种抗体，以Amersham公司制造的ECL Western印迹检测系统进行检测。结果发现，可作为分子量约33kDa的区带被检测出来。所以，使用本抗体使应用各种细胞的免疫测定法成为可能。(实施例4)蛋白质DCR1的表达

(1)图3中以Western印迹法显示了正常小鼠主要器官中蛋白质DCR1的表达量。所用的抗体为实施例3制作的抗体#731和#733。各器官提取液含有100μg的蛋白质。此外，使用0．1μg的重组蛋白质。

器官提取液的制作是往5只小鼠的肾脏加入4毫升缓冲液(含有0．2％ TritonX-100、0．1mM PMSF、0．15M NaCl、1mM MgCl₂、0．5mMEDTA／EGTA的Tris-盐酸缓冲液，pH8．0)，用声波混合器SONICBLENDER(HITACHI HG30)作30秒的超声波处理，重复4、5次。

然后100，000xg、1．5小时离心分离得到上清，将其再离心30分钟时所得的沉淀冻存于-80℃，以备各种实验。

两种抗体都显示该蛋白质为肾脏特异性表达的。此外，抗体#733更特异地和蛋白质DCR1反应，显示出和同工酶的交叉反应(クロスリアクト)少。图5和图6显示的结果为使用抗体#733的结果。

(2)图6表示以Western印迹法对病理模型小鼠肾脏提取液和正常小鼠的蛋白质DCR1表达量进行比较的结果。

所用抗体为抗体#731和特异抗体#733。各器官提取液的蛋白质为150μg，重组蛋白质DCR1为0．1μg。

更进一步，表中显示，病态的严重程度表现在血糖值的高低，它和蛋白质DCR1的减少倾向相关。5只平均        ob／ob    对照    db／db    对照体重(g)        45．6    20．3    42．5    20．6血糖值(mg／dl) 335      195      512      168

此结果显示，蛋白质DCR1的减少倾向和病态的严重程度(血糖值)逆相关。(实施例5)酶活性

(1)按以下条件进行。

反应混合液(共2．0ml)由80mM磷酸钾溶液(pH7．0或6．0)、0．1mMNADPH或NADH、羰基底物和酶(50μl)(10．1μg或3．7μg Glomerin(グロメリン)B)构成。

NAD(P)H氧化速度在340nm下测定。

酶活性的1个单位定义为25℃下1分钟内催化氧化1μmol的NAD(P)H。

(2)羰基化合物对于蛋白质DCR1的底物特异性归纳于表1。

(3)蛋白质DCR1的二乙酰基还原酶活性的pH依赖性

此活性，由使用10mM二乙酰测定的比活性根据蛋白质DCR1试样的蛋白质浓度计算得出(图7)。

还有，确认无活性的化合物为2-环己烯-1-醇、S-茚满-1-醇、4-硝基苯乙酮、甲萘醌(维生素K3)。(实施例6)人型同系物的克隆(1)cDNA的调制

从人肾脏mRNA调制cDNA文库。

人肾脏mRNA使用Clontech公司制造的CATALOG#6538-人肾脏Poly A⁺RNA(Chomczynski，等，分析生物化学Anal．Biochem．162：156-159(1987)、Sambrook，J．，等、(1989)分子克隆，第2版(冷泉港实验室，冷泉港，NY)，pp．6．22-6．34))。

调制时使用Clontech公司制造的SMART^TMPCR文库构建试剂盒，依照该试剂盒的说明书进行。可根据需要使用该试剂盒附带的引物、试剂等。

单链DNA的调制按上述试剂盒方法进行。反应后，将作为模板的mRNA用RNA酶H(Gibco公司制造)消化除去。进一步用琼脂糖凝胶电泳，使用Pharmacia公司制造的Sepaglass band prep试剂盒除去低分子量的不纯物进行精制。

使含有所得单链DNA的溶液最终成25μl。(2)双链cDNA片段的调制

调制时使用上述Clontech公司制造的SMART^TMPCR文库构建试剂盒，根据该试剂盒的说明书，对含加帽位点的双链cDNA片段进行LD-PCR。作为此时的3’端引物，利用上述从小鼠中得到的EST信息，如下所示，设计具有终止密码子下游序列的片段。

引物#1162：5’-ccaagcttgtaggatgagcacggcatgg-3’(28mer)

上述LD-PCR使用宝酒造公司制造的Takara Thermal Cycler MP，按以下条件进行。1 cycle   95          1 min20 cycles 95    30 sec55     2 min72     3 min1  cycle  95     1 min55     3 min72    10 min

反应结束后，用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)除蛋白质，进一步用乙醇沉淀，回收生成的DNA。再进行琼脂糖凝胶电泳(凝胶浓度1．0％)，将凝胶用溴化乙锭染色后，用紫外线照射，切出含有目的区带的凝胶。琼脂糖凝胶中DNA片段的提取和精制使用Pharmacia公司制造的Sepaglas^TM Band Prep试剂盒。

(3)上述(2)所得的cDNA片段只在3’端使用嵌套PCR用的引物再进行PCR扩增。所用的3’端引物具有以下的序列。

引物#1163：5’-ccaagcttgaggtgtgtggagggagc-3’

上述PCR使用宝酒造公司制造的Takara Thermal Cycler MP，按以下条件进行。

1 cycle    95	1 min
		20 cycles  955572	30 sec2 min3 min
1 cycle    955572	1 min3 min10 min

反应结束后，用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)除蛋白质，进一步用乙醇沉淀，回收生成的DNA。再进行琼脂糖凝胶电泳(凝胶浓度1．0％)，凝胶用溴化乙锭染色后，用紫外线照射，切出含有目的区带的凝胶。琼脂糖凝胶中DNA片段的提取和精制使用Pharmacia公司制造的Sepaglas^TM Band Prep试剂盒。

(4)将上述(3)所得的cDNA片段亚克隆于如下的质粒DNA中。所用方法依照Promega公司制造的pGEm^R-T简易载体系统(Easy VectorSystems)的说明书(Promega，美国印刷Printed in USA．修改于Revised 7／79 Part#TM042，技术说明书TECHNICAL MANUAL pGEM-T和pGEM-T简易载体系统，产品使用指导INSTRCTIONS FOR USE OFPRODUCTS A160，A1380，A3600，和A3610)，使用其附带的材料。

连接溶液和条件如下，在40℃下反应3天(60小时)。

反应液

PCR产物                2μl(140ng)

T4 DNA连接酶10x Buffer 1μl

pGEMR-T简易载体        1μl(50ng)

T4 DNA连接酶           1μl

水                     5μl

总量                  10μl

使用上述反应溶液，按常规方法进行JM109株的转化。将转化体在氨苄青霉素(Amp)50μg／ml、37℃下培养一夜。在别的主平板上培养50个菌落，转印于薄膜(Amersham公司制造Hybond+)，和DIG标记的3’端寡核苷酸杂交，选出阳性克隆，将其培养成单个菌落进行精制。然后，接种于10毫升含有50μg／ml Amp的LB液体培养基上，在37℃下培养一夜，离心分离收集菌体后，精制重组DNA。

(5)DNA片段碱基序列的确定

碱基序列的确定使用PE应用生物系统公司制造的DNA序列分析仪，应用双终结子(ダィタ-ミネ-タ-)法。因片段长度约为750bp，较短，引物可用通用的的引物SP6和T7，所以可不用引物walking法而确定碱基序列。

(6)上述(5)所得的序列信息中，根据可读框(ORF)的5’末端Met1相当的部位更上游区域设计新的5’引物。

引物#1446：5’-ggaattcgattccaagcttgt-3’(21mer)

此引物和已经根据EST信息设计的ORF3’端终止密码子下游部分序列构成的3’引物组合成#1162，以上述(1)所得的原单链cDNA为模板，进行低循环数的PCR，取得标准克隆。此时，因5’、3’两端都具有独特引物，20个循环1次的PCR可得到没有错误反应的克隆。

反应条件cDNA             2．5μl水               36．5μl10xPCR缓冲液     5μl(Perkin Elmer)2mM dNTP mix     5μl(Perkin Elmer)5’引物：#1446   1μl3’引物：#1162   1μlAmpli Taq聚合酶  0．5μl(Perkin Elmer)

上述PCR使用宝酒造公司制造的Takara Thermal Cycler MP，按以下条件进行。1个循环     95    1 min20个循环    95   30 sec55    2 min72    3 min1个循环     95    1 min55    3 min72    10 min

反应结束后，用苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)除蛋白质，进一步用乙醇沉淀，回收生成的DNA。再进行琼脂糖凝胶电泳(凝胶浓度1％)，凝胶用溴化乙锭染色后，用紫外线照射，切出含目的区带的凝胶。琼脂糖凝胶中DNA的提取和精制使用Pharmacia公司制造的Sepaglas^TM Band Prep试剂盒。

应用上述(4)和(3)所用的相同方法，将上述精制的cDNA亚克隆于质粒DNA(Promega公司制造pGEMR-T简易载体系统Easy VectorSystems的操作手册(Promega，Printed in USA．Revised 7／79 Part#TM042，技术手册TECHNICAL MANUAL pGEM-T and pGEM-T简易载体系统Easy Vecotr Systems，产品使用指导INSTRCTIONS FOR USE OFPRODUCTS A160，A1380，A3600，AND A3610))。

连接溶液和条件如下，在4℃下反应60小时。反应液PCR产物               3μl(150ng)T4 DNA连接酶10x缓冲液 1μlpGEM^R-T简易载体     1μl(50ng)T4 DNA连接酶          1μl水                    4μl总量                 10μl

使用上述反应溶液按常规方法进行JM109株的转化。将转化体接种于含有氨苄青霉素(Amp)50μg／ml的LB琼脂培养基上，在37℃下培养一夜。将20株白色集落接种于其它主平板，转印于薄膜，和DIG标记的3’寡核苷酸杂交，选出阳性克隆，将其以单个集落分离出来。然后，接种于10毫升含有50μg／ml Amp的LB液体培养基，在37℃下培养一夜，离心分离收集菌体后，精制重组DNA。

碱基序列的确定就多数的克隆进行。序列引物使用上述#1446和#1162。装置使用PE应用生物系统公司制造的DNA序列分析仪，以双终结子(ダィタ-ミネ-タ-)法进行。ORF的部分全部位于引物的内侧。确定的碱基序列如序列表中序列3所示。(实施例7)蛋白质hDCR1的生产

(1)表达载体pHis-glB的构建

使用以下所示的引物，PCR法扩增含有实施例6所得基因hdcr1的cDNA片段。PCR按实施例6记载的条件进行。

序列#1448：caggatccatggsgctgttcctcgcgggc

序列#1449：cagaattctcagcaggcccagaagcccccttc

将此扩增、精制的cDNA片段用限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ(皆为宝酒造公司制造)切断。切断处理后，再用琼脂糖凝胶电泳进行分离，精制得到约0．75kb的DNA片段(片段-1)。

将蛋白质生产用载体pTrcHisA(Invitrogene公司制造)用上述相同限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ切断，精制开环载体。

将片段-1和上述开环载体混合，在实施例6记载的条件下，进行连接和大肠杆菌K12株的转化，进一步培养该转化体，离心收集菌体，精制重组DNA。如此构建的重组DNA命名为pTrcHisAhuglB。

下面说明表达条件和精制操作。

培养基(L+glucose)由以下成分构成。(1l中的量)。

Tripticase peptone    10 g

NaCl                 5 gr

酵母提取物            5 gr

D-葡萄糖              2 gr

此外，预培养是使用上述培养基(8ml)中加入200μg／ml氨苄青霉素的培养基、在37℃下振荡培养一夜。

此培养使用上述培养基(150ml)中加入200μg／ml氨苄青霉素的培养基，在37℃下进行，OD=0．6时加入100毫克IPTG(约3mM)再培养3小时。

冰冷却后，收集细菌，悬浊于10ml以下的柱缓冲液，冻存于-20℃。

柱缓冲液：10mMTris-Cl pH8．0

          200mM NaCl

          0．1mM PMSF

将其溶化后，加入20mg溶菌酶、5μl的DNA酶I(5mg／ml)、RNA酶A(5mg／ml)、100μl 10％ TritonX-100，在37℃下溶菌15分钟。

9000rpm、4℃下离心分离10分钟，得到上清，往此上清中加入10ml新鲜柱缓冲液，再加入1ml的bed volume Nickel-NTA-琼脂糖凝胶(Qiagen公司)，在室温下缓慢振荡15分钟。

将其充填于玻璃柱，按以下条件进行精制。清洗：柱缓冲液(50ml)：

柱缓冲液+10mM咪唑50ml

柱缓冲液+30mM咪唑10ml洗脱：柱缓冲液+500mM咪唑透析：柱缓冲液(4℃)

往其中加入15％(v／v)甘油，保存于-20℃。

纯度检查是在SDS PAGE后，用考马斯蓝染色法进行。此外，蛋白质含量用ゲラツドフォ-ド法(Biorad公司)进行测定。分子量约33kDa，推测为95％以上的纯度。(收量约3mg(E．coli 150mL培养基))。(实施例8)酶活性

(1)按以下条件进行。

反应混合液(全部2．0ml)由80mM磷酸钾溶液(pH7．0或6．0)、0．1mM NADPH或NADH、羰基底物和酶(50μl)(10．1μg或3．7μg hDCR1)构成。

NAD(P)H的氧化速度在340nm下测定。

酶活性的1个单位定义为25℃下1分钟催化氧化1μmol的NAD(P)H。

测定值减去各底物不加酶的反应系统所得的值，表示为对二乙酰还原活性的相对活性。

(2)蛋白质hDCR1对各种羰基化合物底物特异性的研究结果如表1所示。产业上的利用可能性

以二乙酰为代表的二羰基化合物是作为糖尿病并发症起因物质AGE在体内由还原糖和蛋白质生成过程中的中间代谢产物，是有极高反应性的化合物。本发明的二羰基还原酶分解中间代谢产物二羰基化合物，控制AGE的生成，可认为是对糖尿病并发症的发病、发展具有重要作用的酶。所以，本发明对开发以抑制糖尿病并发症、肾衰竭所致的糖代谢紊乱、AGE生成及其伴随的动脉硬化的发病为目的的治疗药物很有用；此外，重组蛋白质本身可用于血中AGE前体二羰基化合物的解毒。

此外，使用本发明的基因，可以得到筛选该基因表达调节因子的方法并由此得到该基因的表达调节因子。

还有，使用本发明的蛋白质，可以得到筛选该蛋白质活性调节剂的方法并由此得到该蛋白质活性调节剂。

此外，可作为已知的糖尿病并发症肾衰竭等的预防或治疗药物，用于这些药物开发创制。

序列表<110> 大正制药株式会社<120> 新型羰基还原酶和编码其的基因<160> 12<170> PatentIn Ver．2．0<210> 1<211> 735<212> DNA<213> Mus musculus<400> 1atggacctgg ggcttgcagg tcggcgggcg ctggtcaccg gcgcgggcaa aggcatcggg 60cgcagcactg tgctggcgtt gaaggcggct ggtgcacagg ttgtggcggt gagtcggacg 120cgagaggacc tggacgacct ggtccgcgag tgtcctggtg tggagcctgt gtgtgtggac 180ctggccgact gggaggccac agagcaggcc ctaagcaatg tgggacccgt ggaccttctg 240gtgaacaatg ctgctgtggc tctgttgcag cccttcctgg aggtcaccaa ggaggcctgt 300gacacatcct tcaatgtgaa tcttcgggct gtcatccagg tgtctcagat tgtggccaag 360ggcatgatag ctcggggagt tccaggagcc attgtgaatg tctccagcca ggcctcccaa 420cgtgcactga ccaaccatac tgtctactgt tccaccaagg gtgctctgga catgttgacc 480aagatgatgg ccctagagct tgggccccac aagatccgtg tgaatgcagt aaaccccaca 540gtagtgatga cacccatggg ccggaccaac tggagtgacc cccacaaagc taaggccatg 600ctggatcgta tcccactggg caagttcgct gaggtggaga acgtcgtgga caccattctc 660ttcctgctga gcaaccggag tggcatgacc actggctcca ctttgccagt ggatgggggc 720ttcctggcta cctga                                                  735<210> 2<211> 244<212> PRT<213> Mus musculus<400> 2Met Asp Leu Gly Leu Ala Gly Arg Arg Ala Leu Val Thr Gly Ala Gly1               5                  10                   15Lys Gly Ile Gly Arg Ser Thr Val Leu Ala Leu Lys Ala Ala Gly Ala20                  25                  30Gln Val Val Ala Val Ser Arg Thr Arg Glu Asp Leu Asp Asp Leu Val35                  40                  45Arg Glu Cys Pro Gly Val Glu Pro Val Cys Val Asp Leu Ala Asp Trp50                  55                  60Glu Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ser Asn Val Gly Pro Val Asp Leu Leu65                  70                  75                  80Val Asn Asn Ala Ala Val Ala Leu Leu Gln Pro Phe Leu Glu Val Thr85                  90                  95Lys Glu Ala Cys Asp Thr Ser Phe Asn Val Asn Leu Arg Ala Val Ile100                 105                 110Gln Val Ser Gln Ile Val Ala Lys Gly Met Ile Ala Arg Gly Val Pro115                 120                 125Gly Ala Ile Val Asn Val Ser Ser GLn Ala Ser Gln Arg Ala Leu Thr130                 135                 140Asn His Thr Val Tyr Cys Ser Thr Lys Gly Ala Leu Asp Met Leu Thr145                 150                 155                 160Lys Met Met Ala Leu Glu Leu Gly Pro His Lys Ile Arg Val Asn Ala165                 170                 175Val Asn Pro Thr Val Val Met Thr Pro Met Gly Arg Thr Asn Trp Ser180                 185                 190Asp Pro His Lys Ala Lys Ala Met Leu Asp Arg Ile Pro Leu Gly Lys195                 200                 205Phe Ala Glu Val Glu Asn Val Val Asp Thr Ile Leu Phe Leu Leu Ser210                 215                 220Asn Arg Ser Gly Met Thr Thr Gly Ser Thr Leu Pro Val Asp Gly Gly225                 230                 235                 240Phe Leu Ala Thr<210> 3<211> 735<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 3atggagctgt tcctcgcggg ccgccgggtg ctggtcaccg gggcaggcaa aggtataggg 60cgcggcacgg tccaggcgct gcacgcgacg ggcgcgcggg tggtggctgt gagccggact 120caggcggatc ttgacagcct tgtccgcgag tgcccgggga tagaacccgt gtgcgtggac 180ctgggtgact gggaggccac cgagcgggcg ctgggcagcg tgggccccgt ggacctgctg 240gtgaacaacg ccgctgtcgc cctgctgcag cccttcctgg aggtcaccaa ggaggccttt 300gacagatcct ttgaggtgaa cctgcgtgcg gtcatccagg tgtcgcagat tgtggccagg 360ggcttaatag cccggggagt cccaggggcc atcgtgaatg tctccagcca gtgctcccag 420cgggcagtaa ctaaccatag cgtctactgc tccaccaagg gtgccctgga catgctgacc 480aaggtgatgg ccctagagct cgggccccac aagatccgag tgaatgcagt aaaccccaca 540gtggtgatga cgtccatggg ccaggccacc tggagtgacc cccacaaggc caagactatg 600ctgaaccgaa tcccacttgg caagtttgct gaggtagagc acgtggtgaa cgccatcctc 660tttctgctga gtgaccgaag tggcatgacc acgggttcca ctttgccggt ggaagggggc 720ttctgggcct gctga                                                  735<210> 4<211> 244<212> PRT<213> Homo sapiens<400> 4Met Glu Leu Phe Leu Ala Gly Arg Arg Val Leu Val Thr Gly Ala Gly1               5                  10                  15Lys Gly Ile Gly Arg Gly Thr Val Gln Ala Leu His Ala Thr Gly Ala20                  25                  30Arg Val Val Ala Val Ser Arg Thr Gln Ala Asp Leu Asp Ser Leu Val35                  40                  45Arg Glu Cys Pro Gly Ile Glu Pro Val Cys Val Asp Leu Gly Asp Trp50                  55                  60Glu Ala Thr Glu Arg Ala Leu Gly Ser Val Gly Pro Val Asp Leu Leu65                  70                  75                  80Val Ash Asn Ala Ala Val Ala Leu Leu Gln Pro Phe Leu Glu Val Thr85                  90                  95Lys Glu Ala Phe Asp Arg Ser Phe Glu Val Asn Leu Arg Ala Val Ile100                 105                 110Gln Val Ser Gln Ile Val Ala Arg Gly Leu Ile Ala Arg Gly Val Pro115                 120                 125Gly Ala Ile Val Asn Val Ser Ser Gln Cys Ser Gln Arg Ala Val Thr130                 135                 140Asn His Ser Val Tyr Cys Ser Thr Lys Gly Ala Leu Asp Met Leu Thr145                 150                 155                 160Lys Val Met Ala Leu Glu Leu Gly Pro His Lys Ile Arg Val Asn Ala165                 170                 175Val Asn Pro Thr Val Val Met Thr Ser Met Gly Gln Ala Thr Trp Ser            180                 185                 190Asp Pro His Lys Ala Lys Thr Met Leu Asn Arg Ile Pro Leu Gly Lys195                 200                 205Phe Ala Glu Val Glu His Val Val Asn Ala Ile Leu Phe Leu Leu Ser210                 215                 220Asp Arg Ser Gly Met Thr Thr Gly Ser Thr Leu Pro Val Glu Gly Gly225                 230                 235                 240Phe Trp Ala Cys<210>5<211> 238<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 探针<400> 5gatcgtatcc cactgggcaa gttcgntgag gtggagaacg tcgtggacac cattctcttc 60ctgctgagca accggagtgg catgaccact ggctccactt tgccagtgga tgggggcttc 120ctggctacct gagccccctg cccaccgaca ctctgctcag ctctctgctc aggacactgt 180gccctccgcc cctgcaataa agctctctgc tcagcctgtg tgctgattct ccaggaaa   238<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 探针<400> 6cagtgtcctg agcagagagc tgag 24&#60210〉 7<211> 34<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 探针<400> 7taatggatcc atggacctgg ggcttgcagg tcgg 34<210> 8<211> 33<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 探针<400> 8attagaattc aggtagccag gaagccccca tcc 33<210> 9<21l> 26<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 探针<400> 9ccaagcttga ggtgtgtgga gggagc 26<210> 10<211> 2l<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 探针<400> 10ggaattcgat tccaagcttg t 21<210> 11<21l> 29<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 探针<400> 11caggatccat ggsgctgttc ctcgcgggc 29<210> 12<211> 32<212> DNA<213> 人工序列<220><223> 探针<400> 12cagaattctc agcaggccca gaagccccct tc 32

Claims (14)

1．对具有碳数4～10直链烷基的α-二酮和芳香族邻醌具有高还原活性的二羰基还原酶。

2．根据权利要求1中记载的二乙酰基还原酶，其特征在于上述α-二酮为二乙酰、2，3-戊二酮、2，3-己二酮、3，4-己二酮和2，3-庚二酮中选出的1个或2个以上的二酮；上述芳香族邻醌为靛红、菲醌和二氢苊醌中选出的1个或2个以上的醌。

3．编码以下(a)或(b)蛋白质的基因：(a)由序列表序列2或4任一个记载的氨基酸序列构成的蛋白质。(b)由在序列表序列2或4任一个记载的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的、且具有二羰基还原酶活性的蛋白质。

4．可与权利要求3记载的基因在严格条件下杂交、且编码具有二羰基还原酶活性蛋白质的基因。

5．以下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表序列2或4任一个记载的氨基酸序列构成的蛋白质；(b)由在序列表序列2或4任一个记载的氨基酸序列中有1个或多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的、且具有二羰基还原酶活性的蛋白质。

6．权利要求5记载的蛋白质的抗体。

7．具有权利要求3或4任一项记载的基因的反义链全部或一部分序列的、且抑制权利要求5记载的蛋白质的生物合成的反义寡核苷酸。

8．一种二羰基化合物生成抑制剂，其特征在于含有权利要求5记载的蛋白质。

9．一种AGE生成抑制剂，其特征在于含有权利要求5记载的蛋白质。

10．一种AGE生成调节剂，其特征在于含有权利要求7记载的反义寡核苷酸。

11．至少利用了权利要求3记载的基因一部分的上述基因表达调节因子的筛选方法。

12．根据权利要求11记载的方法所得的上述基因表达调节因子。

13．至少利用了权利要求5记载的蛋白质一部分的上述蛋白质活性调节剂的筛选方法。

14．根据权利要求13记载的方法所得的上述蛋白质活性调节剂。

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