CN1279057C - 重组的抗cd25单克隆抗体、其编码序列及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗CD25的特异性单克隆抗体。该单克隆抗体稳定性好、特异性强，特别适用于预防和治疗移植排斥反应。本发明还提供了所述单克隆抗体的制备方法以及含有所述单克隆抗体的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及医学领域。更具体地，本发明涉及抗CD25的特异性单克隆抗体及其应用。本发明的抗体对于移植排斥反应的预防和治疗非常有用。
背景技术
目前，器官移植技术已成为脏器功能衰竭终末期的有效、常规性治疗手段。特别是发达国家现已成为医学领域的一门新兴学科，取得了丰硕的成果和巨大进展。到1998年止，全世界已施行同种肾移植447182例次；215个肝移植中心开展了62502例肝移植，美国每年实施胰肾联合移植千例以上。随着干细胞的研究的深入，干细胞的移植，以及用干细胞发育成器官的组织工程学的飞速发展，移植手术必将迅猛发展，其市场前景和经济效益无法估量。
但是，器官移植最大的问题是免疫排斥反应。患者术后每年单用于抗排斥反应药物的费用高达1-2万元。因此，在器官移植，特别是肾、肝、心脏、肺和骨髓移植中，减小免疫系统的移植排斥反应是非常必要的。目前已经研制出许多免疫抑制剂，而且在临床上也获得了成功，比如包括类固醇、咪唑硫嘌呤和环孢菌素A。但是它们都必须严格进行控制，以避免产生不必要的副作用。另外还有一个难点，就是免疫抑制作用使移植器官易被细菌或病毒感染，而这类细菌或病毒感染在正常情况下是能够由个体的免疫系统消除的。
除了使用免疫抑制剂，还可以使用一些单克隆抗体(MAbs)来抑制免疫反应，特别是那些可以识别T细胞表面不同抗原的单克隆抗体。这些单克隆抗体通常根据相应的CD数命名，如CD3的抗体描述为“抗CD3”。但在应用于临床时出现一些问题：这些抗体不是作用过强就是不足以产生效果，甚至还可能引发严重的副作用，比如高烧。
T细胞膜上的抗原(如CD3抗原)的单克隆抗体是非常有应用潜力的抗体，它具有全面的免疫系统抑制活性。但是，一旦发生感染，人体将丧失由记忆T细胞介导的瞬时免疫应答，这在治疗移植排斥时是不希望出现的情况。一个可预防上述情况发生的途径是保持记忆T细胞的活性，同时使直接涉及排斥反应的T细胞失活。
另外，也可以使用单抗来活化T细胞，这些T细胞的特性是其膜表面有高亲和力干扰素2受体(IL-2R)的存在。IL-2R高亲和力受体包含至少两条不同的多肽链：α链和β链。IL-2R是异多聚体糖蛋白，分子量约为140KD，其中α链55kD(p55)，β链70-75kD(p75)。
IL-2R的α链即CD25抗原，又称TAC，是活化T淋巴细胞的重要标志，并且它是IL-2特异性的，只与IL-2结合。人IL-2Rα链基因位于染色体10p14-15，长度25kB，有7个外显子，抗CD25单克隆抗体能够特异性结合α链，从而阻断IL-2与α链的相互作用。
休眠状态的T细胞不表达高亲和力受体，但是低表达或间歇表达包含α-β链同源二聚物的亲和受体。CD25抗体能够干扰IL-2结合到其高亲和受体上，从而选择性地抑制了免疫应答，因此，CD25抗体是一种可用于预防器官移植排斥反应的抗体。
虽然在国内外已经建立了许多针对CD25抗原的单克隆抗体，但是这些单克隆抗体的特异性及中和能力均不够理想。因此，本领域迫切需要建立可以用于临床治疗的单克隆抗体以及人源化的高亲和力的单克隆抗体。
发明内容
本发明的目的提供一种特异性抗CD25单克隆抗体。
本发明的另一目的是提供一种所述特异性抗CD25单克隆抗体的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种含所述抗CD25单克隆抗体的药物组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种单克隆抗体VH链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：5所示的CDR1，
SEQ ID NO：6所示的CDR2，
SEQ ID NO：7所示的CDR3。
较佳地，所述的单克隆抗体VH链具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种单克隆抗体VL链，它的互补决定区CDR具有选自下组的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：8所示的CDR1，
SEQ ID NO：9所示的CDR2，
SEQ ID NO：10所示的CDR3。
较佳地，所述的单克隆抗体VL链具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种单克隆抗体，其VH链和VL链分别具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
较佳地，所述的单克隆抗体是单克隆抗体。
在本发明的第四方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：
本发明上述的单克隆抗体VH链、单克隆抗体VL链、或单克隆抗体。
较佳地，所述的DNA分子具有选自下组的DNA序列：SEQ ID NO：1和SEQID NO：3。
在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，它含有单克隆抗体和药学上可接受的载体，所述单克隆抗体的VH链和VL链分别具有SEQ ID NO：5-7和SEQ IDNO：8-10所示的CDR。较佳地，所述单克隆抗体的VH链和VL链分别具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
具体实施方式
本发明人通过筛选人源抗体库，成功获得了对CD25高特异性的单克隆抗体，并且对抗CD25人源化单克隆抗体基因和抗体可变区位点进行了独特的人工设计，即构建全人源的抗体库，筛选表达量高的抗体，并且将之与人源的IgG1-Fc相连，因此该抗体是全人源的，因而更适于在哺乳动物细胞(优选CHO)中进行表达。在此基础上完成了本发明。
本发明提供了一种重组抗CD25人源化单克隆抗体，它包括人源恒区(如人源恒区IgG1-Fc)，经过人工设计后的重链可变区和轻链可变区具有独特的不同于现有技术的结构。
本发明还提供了抗CD25单克隆抗体的氨基酸序列及其其可变区链，以及具有这些链的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为超变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
此外，最近还发现由轻链可变区构成的相关结构，与相应的重链可变区相比，其结合的动力学比较小，分离的重链可变区域自身具有抗原结合活性。
此处鉴定的V链的超变区或互补决定区(complementarity determiningregion，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明还提供了编码上述单克隆抗体或其片段的DNA分子。本发明的单抗的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明还提供了一种治疗移植排斥的药物组合物，它含有上述的单克隆抗体或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于预防和治疗移植排斥。此外，还可同时使用其他治疗剂，如类固醇、咪唑硫嘌呤和环孢菌素A等。
本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的单克隆抗体以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的突出优点在于：本发明的单克隆抗体的生理活性和在宿主细胞(如CHO细胞)中的表达量比现有的单克隆抗体有显著的提高。而且，本发明的单克隆抗体是人源化的，其亲和力已经达到0.1nM的水平。这种高亲和力的单克隆抗体在临床上具有重要的价值。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
从抗体库中筛选抗CD25抗体的可变区基因
1)人源抗体库的构建
按照Marks等人J.Mol.Biol.，222，581-597；Hoogenboom和Winte，J.Mol.Biol.，227，381-388；Haidaris CG等，J Immunol Methods.2001 Nov 1；257(1-2)：185-202；Griffiths，A.D.等EMBO J.，13，3245-3260(1994)；Nissim，A.等EMBO J.，13，692-698(1994)中描述的方法构建人源抗体库。简而言之，从外周血淋巴细胞制备免疫球蛋白重链和轻链的基因，用PCR方法进行体外扩增，并将其克隆到噬菌体载体，利用抗体分子片段在噬菌体表面呈现的特点，以CD25蛋白(美国R&D公司产品，购自深圳晶美公司)为抗原，筛选到相应的特异性抗体。
2)筛选
将复苏的抗体库菌株1毫升加入新鲜LB培养基14毫升，于50毫升三角瓶中37℃培养16小时。
12000rpm高速离心10分钟，转移上清至一个无菌的50毫升离心管中，保存备用。其滴度应在2×1011以上。以纯化的CD25蛋白(购自深圳晶美公司)为抗原，包被25毫升细胞培养瓶。在包被后的细胞瓶中加入不少于3×1010噬菌体颗粒，37℃温育1小时。然后，倒掉瓶中的液体，用10毫升加入了1％Tween-20的PBS洗涤培养瓶10次。在培养瓶中加入1毫升对数期的TG1细胞，37℃温育震荡培养16小时。
重复上段所述步骤共4次。
将上述获得的细胞稀释至100000细胞/毫升，然后在加入0.1％氨苄青霉素的1.5％琼脂平板上进行培养以获得单克隆。取上述平板上的克隆在96孔深孔板上进行培养，每孔一个克隆，共作960个克隆(10块96孔板)。将上述深孔板在96孔板离心机上5000rpm离心20分钟，将上清转移到新的无菌深孔板，封口后保藏于4℃备用。
取96孔板10块，每孔中加入CD25(10微克/毫升)10微升常规包被后，分别加入上述保存的上清10微升，37℃温育1小时后用含有1％Tween-20的PBS洗涤20次。加入1微升HRP标记的羊抗M13单抗，37℃温育30分钟后用1％Tween-20的PBS洗涤10次。
加入含有0.025％DAB显色剂的PBS 200微升和1微升1％的H2O2，37℃温育显色20分钟后在读板机上读取595纳米处的光吸收。根据光吸收读数确定显色反应强的孔，这些孔相对应的克隆即为亲和力较强的抗体可变区克隆。
通过上述过程共筛选出415个阳性克隆，根据读数确定其中5个亲和力最强的克隆。将这5个克隆分别接种在100毫升LB培养基中，在37℃260rpm条件下震荡培养9小时后加入终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导培养10小时。然后用Pharmacia的“重组人scFv纯化系统”，参照厂家说明书分离纯化重组scFv抗体蛋白。抽提纯化的重组scFv蛋白质用于亲和力研究。
亲和力研究证明，在这415个阳性克隆中有3个具有较高的亲和力，它们分别命名为5H4、9D2和3G6。其中，3G6既具有最高的表达量，又具有最高的亲和力，此克隆将用在后续的研究。
实施例2
抗体可变区编码序列的表达载体的克隆
将实施例1得到的3G6克隆的菌株，在100毫升LB培养基中扩增，用Promega公司的质粒DNA抽提纯化试剂盒纯化质粒DNA。
用XbaI和NheI酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取350bp左右的带进行胶回收，所得片段即为重链可变区编码序列。
用HindIII和Bsi WI酶切上述质粒DNA后在1.5％琼脂糖凝胶电泳上分离酶切片段，取320bp左右的带进行胶回收，所得片段即为轻链可变区编码序列。
然后首先将上述重链可变区编码序列插入到表达载体pMG18-3K(参见书籍DEVELOPMENT OF TOOLS FOR ENVIRONMENTAL MONITORING BASEDON INCP-9 PLASMIDS SEQUENCES.A.Greated，R.Krasowiak，M.Titok，C.M.Thomas School of Biological Sciences，University of Birmingham，Edgbaston，Birmingham B15 2TT，UK and Faculty of Biology，Dept of Microbiology，BelarusState University Scorina Av.4，Minsk 220080 Belarus1992年出版。此外该载体是可购自Invitrogen公司)的XbaI/NheI位点中，再用Hind III和Bsi WI将上述抗体轻链可变区编码序列插入到插入有重链可变区编码序列的pMG18-3K的HindIII/BsiWI位点中，构建成人源化抗CD25抗体基因的表达载体。
实施例3
CHO细胞的转染与重组克隆的筛选
上述实施例2中构建的带有抗体基因的表达载体转入在大肠杆菌DH5α菌株，然后接种于100毫升LB培养基中进行扩增，用Qiagen公司的超纯质粒DNA纯化试剂盒(Ultrapure Plasmid DNA Purification Kit)抽提纯化质粒DNA。将上述纯化的质粒DNA采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒转染CHO细胞，操作参照厂家的说明书进行。
转化的CHO细胞在选择培养基上进行连续9周的选择，最后在96孔板上进行极度稀释培养，连续进行3次，进行单克隆化。
挑出的单克隆细胞系在rpmI 1641培养基上进行培养，对上清进行Western印迹实验，根据染色反应判断表达强度，挑选出10个表达较强的克隆作为候选细胞株，即3E9、5D7、4C6、5H8、8A3、3B4、4D8、4F6、5G7、6G2。
实施例4
单克隆抗体的纯化
发酵液10000rpm离心5分钟除去细胞和细胞碎片。100Kd截留分子量的滤膜超滤浓缩至1/10体积。超滤缓冲液是100mM Tris-HCl，pH7.5。过SPA-sepharose亲和层析柱。上样液为100mM Tris-HCl，pH7.5.洗脱液为100mMTris-HCl，pH7.5，100mM NaCl。分子筛(Sephadex G200)层析。洗脱液为100mMTris-HCl，pH7.5。得纯品。SDS-PAGE鉴定纯度。
上述单抗的纯化采用Protein A(Pharmacia公司)亲和层析柱从细胞培养上清中直接分离纯化，并用SDA-PAGE电泳证明，所得产物纯度大于90％。以上亲和层析的产物再次经过分子筛层析，获得了纯度＞98％的样品。
实施例5
抗体基因在CHO细胞中的表达强度
将上述筛选得到的高表达候选克隆培养于10cm的组织培养皿中，采用ELISA法测量抗体的表达量：羊抗人IgG(Fc)包被于ELISA板，4℃过夜，经2％BSA于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(人IgG1)，37℃孵育2小时，加入HRP-羊抗人IgG(κ)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用10分钟，最后用H2SO4终止反应，测A450值。测得上述10个候选克隆的表达量如下：
表1抗体基因在CHO细胞中表达强度
| 细胞株编号 | 3E9 | 5D7 | 4C6 | 5H8 | 8A3 | 3B4 | 4D8 | 4F6 | 5G7 | 6G2 |
| 表达量(mg/毫升) | 116.7 | 128.9 | 366.7 | 343.2 | 408.6 | 372.1 | 332.1 | 176.4 | 231.4 | 146.9 |
从表1可以看出，编号为4C6、5H8、8A3和3B4的细胞株的表达水平具有很高的表达水平(340-410毫克/毫升)，已经远远超出了国内外单抗类的表达水平(50-100mg/毫升)。
实施例6
CD25单克隆抗体基因的序列确定
对上述细胞株8A3的抗CD25单克隆抗体基因进行DNA测序。即用人源抗体可变区通用引物，进行PCR扩增，获得的轻链和重链可变区委托上海基康公司进行PCR测序。
结果显示在序列表中，其中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3分别是本发明获得的高活性高表达CD25单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA编码序列；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4分别是根据上述DNA编码序列推测的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
gag aac atg ctg gtg cag tcc ggc ggc ggc gtg gtg aag ccc ggc atg 48
Glu Asn Met Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Lys Pro Gly Met
1 5 10 15
tcc ctg cgc aac tcc tgc gcc gcc tcc cac ttc acc ttc tac aac tac 96
Ser Leu Arg Asn Ser Cys Ala Ala Ser His Phe Thr Phe Tyr Asn Tyr
20 25 30
ggc atg cac atg gtg ggc atc atc ccc ggc ccc ggc ctg gag tgg gtg 144
Gly Met His Met Val Gly Ile Ile Pro Gly Pro Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc atg atc tcc tac gac ggc aag aac gag tac tgc gcc aac tcc ctg 192
Ala Met Ile Ser Tyr Asp Gly Lys Asn Glu Tyr Cys Ala Asn Ser Leu
50 55 60
aag ggc cgc tac acc atc cac cgc gac acc tcc aag aac acc atc atg 240
Lys Gly Arg Tyr Thr Ile His Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ile Met
65 70 75 80
ctg cag aac atg tcc ctg aag gcc gag tgc aag gcc gtg tac atc tgc 288
Leu Gln Asn Met Ser Leu Lys Ala Glu Cys Lys Ala Val Tyr Ile Cys
85 90 95
gcc aag ggc atg aag tac gac tcc tcc ggc cgc tac tcc tac atg aag 336
Ala Lys Gly Met Lys Tyr Asp Ser Ser Gly Arg Tyr Ser Tyr Met Lys
100 105 110
ctg atg tgc tcc aag aag atg atg acc gtg tcc tcc ctg tcc tac aag 384
Leu Met Cys Ser Lys Lys Met Met Thr Val Ser Ser Leu Ser Tyr Lys
115 120 125
tgc ccc 390
Cys Pro
130
(SEQ ID NO：1和2)
其中重链的CDR区为31-35，50-66，99-106位氨基酸。
atg aac gcc ctg aag acc cgc acc tgc aac tcc aag aag tcc gac ggc 48
Met Asn Ala Leu Lys Thr Arg Thr Cys Asn Ser Lys Lys Ser Asp Gly
1 5 10 15
ggc atc tgc acc tgc tcc tgc aac ggc acc aag tcc gac gtg ctg aac 96
Gly Ile Cys Thr Cys Ser Cys Asn Gly Thr Lys Ser Asp Val Leu Asn
20 25 30
tac aac ctg gtg aag ctg tac cag tgc cac aag tgc aag gtg ctg aag 144
Tyr Asn Leu Val Lys Leu Tyr Gln Cys His Lys Cys Lys Val Leu Lys
35 40 45
ctg atg atc cac gag gac aac aag cgc ctg tcc ggc aag tcc atg cgc 192
Leu Met Ile His Glu Asp Asn Lys Arg Leu Ser Gly Lys Ser Met Arg
50 55 60
aag tcc ggc ctg aag tcc ctg aac acc tgc tcc ctg aag ctg atg ggc 240
Lys Ser Gly Leu Lys Ser Leu Asn Thr Cys Ser Leu Lys Leu Met Gly
65 70 75 80
ctg tgc gcc gag gac cac gcc gac tac atc tgc ggc tcc tac gcc aac 288
Leu Cys Ala Glu Asp His Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Ser Tyr Ala Asn
85 90 95
atg aac gac ggc atc ttc tgc gag ggc acc ctg ctg acc atg ctg ggc 336
Met Asn Asp Gly Ile Phe Cys Glu Gly Thr Leu Leu Thr Met Leu Gly
100 105 110
aag ccc cag gcc gcc aag tcc gtg acc atg ttc ccc ggc ccc ctg 381
Lys Pro Gln Ala Ala Lys Ser Val Thr Met Phe Pro Gly Pro Leu
115 120 125
(SEQ ID NO：3和4)
其中，轻链的CDR区为24-33，49-56，88-95位氨基酸。
实施例7
亲和力测定
采用Scatchard分析法(Munson等人，1980，Anal.BioChem.，107：220)，对本发明的各种单抗进行测试。
结果表明，4C6、5H8、8A3三种单抗的亲和力分别达到3.2×10-9，1.18×10-8和8×10-6，亲和力有很大的改善，尤其是4C6和5H8两株单克隆抗体的亲和力有更大提高。
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>马，菁
<120>重组的抗CD25单克隆抗体、其编码序列及应用
<130>023429
<160>10
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>390
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(390)
<223>抗CD25抗体重链scFv的编码序列
<400>1
gagaacatgc tggtgcagtc cggcggcggc gtggtgaagc ccggcatgtc cctgcgcaac 60
tcctgcgccg cctcccactt caccttctac aactacggca tgcacatggt gggcatcatc 120
cccggccccg gcctggagtg ggtggccatg atctcctacg acggcaagaa cgagtactgc 180
gccaactccc tgaagggccg ctacaccatc caccgcgaca cctccaagaa caccatcatg 240
ctgcagaaca tgtccctgaa ggccgagtgc aaggccgtgt acatctgcgc caagggcatg 300
aagtacgact cctccggccg ctactcctac atgaagctga tgtgctccaa gaagatgatg 360
accgtgtcct ccctgtccta caagtgcccc 390
<210>2
<211>130
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(130)
<223>抗CD25抗体重链scFv
<400>2
Glu Asn Met Leu Val Gln Ser Gly G1y Gly Val Val Lys Pro Gly Met
1 5 10 15
Ser Leu Arg Asn Ser Cys Ala Ala Ser His Phe Thr Phe Tyr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met His Met Val Gly Ile Ile Pro Gly Pro Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Met Ile Ser Tyr Asp Gly Lys Asn Glu Tyr Cys Ala Asn Ser Leu
50 55 60
Lys Gly Arg Tyr Thr Ile His Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ile Met
65 70 75 80
Leu Gln Asn Met Ser Leu Lys Ala Glu Cys Lys Ala Val Tyr Ile Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Met Lys Tyr Asp Ser Ser Gly Arg Tyr Ser Tyr Met Lys
100 105 110
Leu Met Cys Ser Lys Lys Met Met Thr Val Ser Ser Leu Ser Tyr Lys
115 120 125
Cys Pro
130
<210>3
<211>381
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(381)
<223>抗CD25抗体轻链scFv的编码序列
<400>3
atgaacgccc tgaagacccg cacctgcaac tccaagaagt ccgacggcgg catctgcacc 60
tgctcctgca acggcaccaa gtccgacgtg ctgaactaca acctggtgaa gctgtaccag 120
tgccacaagt gcaaggtgct gaagctgatg atccacgagg acaacaagcg cctgtccggc 180
aagtccatgc gcaagtccgg cctgaagtcc ctgaacacct gctccctgaa gctgatgggc 240
ctgtgcgccg aggaccacgc cgactacatc tgcggctcct acgccaacat gaacgacggc 300
atcttctgcg agggcaccct gctgaccatg ctgggcaagc cccaggccgc caagtccgtg 360
accatgttcc ccggccccct g 381
<210>4
<211>127
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(127)
<223>抗CD25抗体轻链scFv
<400>4
Met Asn Ala Leu Lys Thr Arg Thr Cys Asn Ser Lys Lys Ser Asp Gly
1 5 10 15
Gly Ile Cys Thr Cys Ser Cys Asn Gly Thr Lys Ser Asp Val Leu Asn
20 25 30
Tyr Asn Leu Val Lys Leu Tyr Gln Cys His Lys Cys Lys Val Leu Lys
35 40 45
Leu Met Ile His Glu Asp Asn Lys Arg Leu Ser Gly Lys Ser Met Arg
50 55 60
Lys Ser Gly Leu Lys Ser Leu Asn Thr Cys Ser Leu Lys Leu Met Gly
65 70 75 80
Leu Cys Ala Glu Asp His Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Ser Tyr Ala Asn
85 90 95
Met Ash Asp Gly Ile Phe Cys Glu Gly Thr Leu Leu Thr Met Leu Gly
100 105 110
Lys Pro Gln Ala Ala Lys Ser Val Thr Met Phe Pro Gly Pro Leu
115 120 125
<210>5
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>重链CDR1
<400>5
Asn Tyr Gly Met His
1 5
<210>6
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(17)
<223>重链CDR2
<400>6
Met Ile Ser Tyr Asp Gly Lys Asn Glu Tyr Cys Ala Asn Ser Leu Lys
1 5 10 15
Gly
<210>7
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(7)
<223>重链CDR3
<400>7
Ile Cys Ala Lys Gly Met Lys
1 5
<210>8
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(10)
<223>轻链CDR1
<400>8
Asn Gly Thr Lys Ser Asp Val Leu Asn Tyr
1 5 10
<210>9
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(8)
<223>轻链CDR2
<400>9
Leu Met Ile His Glu Asp Asn Lys
1 5
<210>10
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(8)
<223>轻链CDR3
<400>10
Asp Tyr Ile Cys Gly Ser Tyr Ala
1 5
Claims (5)
1.一种单克隆抗体，其特征在于，所述抗体的VH链的互补决定区CDR具有以下的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：5所示的CDR1，
SEQ ID NO：6所示的CDR2，和
SEQ ID NO：7所示的CDR3；
并且，所述抗体的VL链的互补决定区CDR具有以下的CDR的氨基酸序列：
SEQ ID NO：8所示的CDR1，
SEQ ID NO：9所示的CDR2，和
SEQ ID NO：10所示的CDR3；
并且，所述的VH链具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；所述的VL链具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述的单克隆抗体具有人源恒定区IgG-Fc。
3.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的单克隆抗体。
4.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，它具有SEQ ID NO：1所示的编码VH链的核苷酸序列和SEQ ID NO：3所示的编码VL链的核苷酸序列。
5.一种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的单克隆抗体和药学上可接受的载体。
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-
2002
- 2002-07-12 CN CN 02112493 patent/CN1279057C/zh not_active Expired - Lifetime
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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 201203 ROOM 431, BUILDING 1, NO.351, GUOSHOUJING ROAD, PUDONG NEW DISTRICT, SHANGHAI TO: 201203 NO.399, LIBING ROAD, HIGH TECHNOLOGY PARK, ZHANGJIANG, SHANGHAI |
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Free format text: CORRECT: ADDRESS; FROM: 201203 NO. 399, LIBING ROAD, ZHANGJIANG HIGH-TECH. PARK, SHANGHAI TO: 201203 BUILDING 3, NO. 399, LIBING ROAD, ZHANGJIANG HIGH-TECH. PARK, PUDONG NEW DISTRICT, SHANGHAI |
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