CN1257271C - 丝氨酸蛋白酶及其编码序列 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新的抗肿瘤蛋白SC(简称：SC蛋白质)，编码SC蛋白质的多核苷酸和经重组技术产生这种SC蛋白质的方法。本发明还公开了此SC蛋白质用于治疗多种疾病的方法，如用于肿瘤等疾病。本发明还提供了含SC蛋白质的药物组合物。

Description

丝氨酸蛋白酶及其编码序列
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及新的具有抗肿瘤功能的丝氨酸蛋白酶(简称为SC蛋白)以及编码SC蛋白质的多核苷酸。本发明还涉及此多核苷酸和蛋白质的制法和用途，以及含该SC蛋白质的药物组合物。
背景技术
丝氨酸蛋白水解酶(也称为丝氨酸蛋白酶)是蛋白水解酶中的一种，它主要功能为针对蛋白质的水解作用。
目前已经发现的丝氨酸蛋白水解酶的种类较多，然而，作为蛋白水解酶的一种，丝氨酸蛋白水解酶具有各种用途，例如水解蛋白酶活性，某些丝氨酸蛋白水解酶还同时具有BAEE活性，NGF活性，以及肿瘤抑制活性。
因此，本领域迫切需要开发新的SC蛋白质。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的SC蛋白质以及其片段、类似物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些蛋白质的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些蛋白质的方法以及该蛋白质和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的SC蛋白质，它包含：具有SEQ IDNO：2氨基酸序列的蛋白质、或其保守性变异蛋白质、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，该蛋白质选自下组：
(a)具有SEQ ID N0：2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID N0：2氨基酸序列经过一个或多个(如1-10，较佳地1-8个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有丝氨酸蛋白水解功能的由(a)衍生的多肽。是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的蛋白质。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它编码上述的SC蛋白。
较佳地，所述的多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。更佳地，该多核苷酸含有SEQ ID NO：1中1-714位的序列。
在本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有上述编码SC蛋白的多核苷酸。以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞
在本发明的第四方面，提供了一种蛋白质的制备方法，该方法包含步骤：
(a)在表达条件下，培养上述的宿主细胞；
(c)从培养物中分离出蛋白质，所述蛋白质含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在本发明的第五方面，提供了一种能与上述的SC蛋白质特异性结合的抗体。
在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的上述的SC蛋白质以及药学上可接受的载体。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了SC蛋白质的PCR扩增条带，泳道1为DNA标准；泳道2为PCR扩增产物。
图2显示了表达SC蛋白质的真核表达载体酵母GS115中的构建过程。
图3和图4显示了SC蛋白质的基因序列及其编码的蛋白质序列。
具体实施方式
本发明人首先从江浙蝮蛇蛇毒(Agkistrondon Halyspallas)中分离了一种分子量为29.375KD的蛇毒蛋白(质谱测定结果)，命名它为SC蛋白质。并且，测定了SC蛋白质的N端一段氨基酸序列，并以此为根据合成了相应的引物，然后从江浙蝮蛇毒腺中分离有关的mRNA为模板，经反转录获得cDNA，用PCR法扩增和克隆了SC蛋白的基因，并测定了基因的全序列。然后将SC蛋白质的编码序列插入合适载体并转入合适的宿主细胞，表达并分离了SC蛋白质。并通过Western印迹分析加以鉴定。
研究结果表明，SC蛋白质是一种丝氨酸蛋白水解酶，同时具有一定的NGF活性；该蛋白质在体外能够抑制肿瘤细胞的生长，并引起肿瘤细胞的凋亡。体内动物荷瘤试验证明，经注射SC蛋白质可以有效地抑制实体瘤在动物体内的生长速度，从而达到抑制肿瘤的效果。基于SC蛋白质这样一种特性，SC蛋白质可被应用于肿瘤治疗领域，
在本发明中，术语“SC蛋白质”或“SC多肽”可互换使用，都指基本上具有SC蛋白质氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的多肽或蛋白质。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的SC蛋白质。这些术语还包括含有或不含有信号肽的SC蛋白质。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白质是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白质如从天然状态中与存在的其他物质中分开，则为分离纯化。
如本文所用，“分离的SC多肽蛋白质基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术(尤其是FPLC)分离纯化出SC蛋白质。
本发明的蛋白质可以是重组蛋白质、天然蛋白质、合成蛋白质，优选重组蛋白质。本发明的蛋白质可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白质可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白质还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括SC蛋白质的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然SC蛋白质相同的生物学功能或活性的蛋白质。本发明的蛋白质片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白质，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白质，或(iii)成熟蛋白质与另一个化合物(比如延长蛋白质半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白质，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白质序列而形成的蛋白质(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白质的序列或酶原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“SC蛋白质”指具有SC蛋白质活性的SEQ ID NO.2序列的蛋白质。该术语还包括具有与SC蛋白质相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸残基如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸残基取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸残基也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括SC蛋白质的活性片段和活性衍生物。
该蛋白质的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与SC DNA杂交的DNA所编码的蛋白质以及利用抗SC蛋白质的抗血清获得的多肽或蛋白质。本发明还提供了其他蛋白质，如包含SC蛋白质或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白质外，本发明还包括了SC蛋白质序列的可溶性片段。通常，该片段具有SC蛋白质序列的至少约10个连续氨基酸残基，通常至少约30个连续氨基酸残基，较佳地至少约50个连续氨基酸残基，更佳地至少约80个连续氨基酸残基，最佳地至少约100个连续氨基酸残基。
发明还提供SC蛋白质的类似物。这些类似物与天然SC蛋白质的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白质包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白质并不限于上述例举的代表性的蛋白质。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的蛋白质的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白质。这种修饰可以通过将蛋白质暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白质。
在本发明中，“SC保守性变异蛋白质”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸残基所替换而形成蛋白质。这些保守性变异蛋白质最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
                  表1
  最初的残基   代表性的取代   优选的取代
  Ala(A)   Val；Leu；Ile   Val
  Arg(R)   Lys；Gln；Asn   Lys
  Asn(N)   Gln；His；Lys；Arg   Gln
  Asp(D)   Glu   Glu
  Cys(C)   Ser   Ser
  Gln(Q)   Asn   Asn
  Glu(E)   Asp   Asp
  Gly(G)   Pro；Ala   Ala
  His(H)   Asn；Gln；Lys；Arg   Arg
  Ile(I)   Leu；Val；Met；Ala；Phe   Leu
  Leu(L)   Ile；Val；Met；Ala；Phe   Ile
  Lys(K)   Arg；Gln；Ash   Arg
  Met(M)   Leu；Phe；Ile   Leu
  Phe(F)   Leu；Val；Ile；Ala；Tyr   Leu
  Pro(P)   Ala   Ala
  Ser(S)   Thr   Thr
  Thr(T)   Ser   Ser
  Trp(W)   Tyr；Phe   Tyr
  Tyr(Y)   Trp；Phe；Thr；Ser   Phe
  Val(V)   Ile；Leu；Met；Phe；Ala   Leu
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟蛋白质的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO：2的成熟蛋白质的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白质的编码序列；成熟蛋白质的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白质的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码蛋白质的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白质的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或蛋白质的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白质的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％同源性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白质与SEQ ID NO：2所示的成熟蛋白质有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码SC蛋白质的多聚核苷酸。
本发明中的蛋白质和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。
本发明的SC核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得到有关序列。也可直接通过RT-PCR的方法扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白质(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白质序列中。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或SC蛋白质编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的SC蛋白质。一般来说有以下步骤：
(1).用本发明的编码SC蛋白质的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，SC蛋白质多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含SC蛋白质编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞的动物细胞等。
本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：原生质体法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白质。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白质沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的SC或蛋白质有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接作为药物治疗肿瘤疾病，和用于筛选促进或对抗SC蛋白功能的抗体、蛋白质或其它配体。用表达的重组SC蛋白质筛选蛋白质库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激SC蛋白质功能的蛋白质分子。
另一方面，本发明还包括对SC蛋白质编码DNA或是其片段编码的蛋白质具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于SC蛋白质或片段。较佳地，指那些能与SC蛋白质或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制SC蛋白质的分子，也包括那些并不影响SC蛋白质功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的SC蛋白质结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的SC蛋白质或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达SC蛋白质或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用SC蛋白质的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用蛋白质合成仪合成。与SC蛋白质的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
利用本发明SC蛋白质，通过各种常规筛选方法，可筛选出与SC蛋白质发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。
本发明SC蛋白质及其抗体、抑制剂、激动剂、或拮抗剂等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明的蛋白质可直接用于疾病治疗，例如，用于肿瘤疾病的治疗。在使用本发明SC蛋白质时，还可同时使用其他治疗剂，如已知的抗肿瘤药物等。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明SC蛋白质以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1纳克/千克体重-约10毫克/千克体重。此外，本发明的蛋白质还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的SC蛋白质施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/天，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/天-约0.5毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
一种检测样品中是否存在SC蛋白质的方法是利用SC蛋白质的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与SC蛋白质特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在SC蛋白质。
本发明的主要优点在于：蛇毒中含有很微量的SC蛋白质。从蛇毒中分离纯化至单一的纯度，在工艺上有一定的难度。本发明克隆到SC蛋白质的基因，分析测定了其基因序列，并成功地进行了表达。这些研究成果，不仅为今后开发研究基因工程产品创造了良好的条件，也为今后开发SC蛋白质针剂提供了必要的化学结构资料。此外，本发明的SC蛋白质为治疗肿瘤疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化天然的SC蛋白质
在本实施例中，采用了江浙蝮蛇蛇毒，在本实施例及以下实施例中，除非特别注明，否则指以上这种蝮蛇。
取少量蛇毒，用蒸馏水溶解，经离子交换柱，亲和层析柱，分子筛柱等多步分离纯化，得到SC蛋白质精制样品。样品经HPLC法，或SDS电泳分析，呈现单一条带。然后，对该SC蛋白质用质谱测定分子量，结果为29,375道尔顿。活力测定结果表明该蛋白质属丝氨酸蛋白酶家族，该酶被命名为SC蛋白质。
实施例2
SC蛋白质的纯化和N端20个氨基酸序列的测定
蛇毒通过Sephadex G-75，DEAE-Sepharose CL-6B及Mono Q柱分离，纯化到SC蛋白质样品。纯化的SC蛋白质样品在PE491蛋白质测序仪上经过20个循环，测得如下N端序列：IIGGDECNINEHRFLVALYT(SEQ ID NO：7)。
实施例3
引物的设计和合成
据实施例2中测定的SC蛋白质的N端的序列，设计上游寡核苷酸引物为：
5′GTAGTACTAT(T/C/A)AT(T/C/A)GGNGGNGA(T/C)GA 3′(SEQ ID NO：3)，并在成熟蛋白的N端加上了起始密码子和BamHI位点，以利于该基因的表达研究和操作。由于迄今为止缺乏SC蛋白质C端及其基因下游的任何信息，本发明人用3′RACE方法克隆该基因。下游引物为：5′TTTCTCCTCTT(G/A)A(G/C)(C/T)(A/T)TTTCAAA 3′(SEQ ID NO：4)。引物的合成委托上海生工生物工程公司完成。
实施例4
总RNA的提取
取江浙蝮蛇一条，取毒腺组织，在液氮中研磨成粉末。取200mg粉末，加入4mL溶液D(含4mol/L异硫氰酸胍，25mmol/L柠檬酸钠，pH7.0；5％十二烷基肌氨酸钠，0.1mol/Lβ-巯基乙醇)，充分匀浆后，将溶液转移至离心管中，4℃，12,000g离心5分钟。上清吸入新的离心管中，加入0.4mL 2mol/L NaAc，pH4.0，4mL水饱和酚和2mL氯仿∶异戊醇(49∶1)混合物，充分振荡后，冰浴15min。4℃，10,000g离心20min。取上层水相与等体积异丙醇混匀，-20℃放置1h。4℃，10,000g离心20min收集沉淀.沉淀重溶于2mL溶液D中，65℃温育2-3min，使其充分溶解，加入0.2mL 2mol/L NaAc，pH4.0和2mL异丙醇，混匀后-20℃放置1h。4℃，10,000g离心20min，沉淀用75％乙醇洗涤后，敞口于空气中放置数分钟，使乙醇充分挥发干净。最后溶于DEPC(焦碳酸二乙酯)处理过的灭菌水30μL中。取1μL测RNA的OD260/OD280，1μL走甲醛变性电泳，以确定RNA的纯度和完整性。
实施例5
RT-PCR扩增SC蛋白质基因
以实施例4中制得的江浙蝮蛇总RNA为模板，用宝林曼公司3′RACE KIT反转录，操作按说明书进行。
使用实施例3中合成的引物，从上述所得的cDNA为模板，进行PCR扩增。总反应体系为50μL，其中MgCl2的终浓度为1.5mmol/L，dNTP的终浓度为200μmol/L。引物浓度为30nmol/L，Tag酶2单位(购自Takara公司)。反应条件为：先94℃变性3min，。然后进入循环，。94℃，变性1min；50℃退火min；72℃延伸1.5min，进行30个循环，最后在72℃保温10min。PCR产物取5μL进行1％的琼脂糖电泳检查，扩增出一条约1000bp的DNA片段(见图1)。产物以氯仿抽提，乙醇沉淀回收，溶于10μL的灭菌水中。
实施例6
SC蛋白质基因的克隆
由于扩增的是一个未知序列的核酸，为避免基因内部出现巧合的酶切位点导致基因被切割而破坏其完整性，用T-载体进行克隆。
1)T-载体的制备：载体pBluescript-SK(购自Stratagene公司)1μg用EcoRI切割，等体积酚：氯仿处理，乙醇沉淀，溶于50μL体系中，内含10×PCR缓冲液5μL，100mmol/L dNTP2μL，Taq酶1单位。在70℃保温2h，等体积的酚∶氯仿处理，乙醇沉淀后，溶于10μL灭菌水。
2)取PCR回收产物2μL与自制T-载体1μL连接，转化，经兰白斑筛选，酶切和PCR鉴定，获得阳性克隆。
实施例7
兔抗SC蛋白质抗体的制备
取体重为2公斤左右的雄性新西兰大耳兔一只。以1mgSC蛋白质样品加弗氏完全佐剂研磨成乳胶状，在兔颈部多点注射。饲养半个月后，以1mgSC蛋白质样品加弗氏不完全佐剂研磨成乳胶状，再在兔颈部多点注射。一个月后，用1.5mgSC蛋白质样品加弗氏不完全佐剂以同样的方法加强免疫。半个月后，再用1mgSC蛋白质样品加弗氏不完全佐剂再次加强免疫。饲养半个月后，颈动脉取血，4℃静置过夜，2,000转离心3分钟。上层血清即为兔抗SC蛋白质抗体。
实施例8
SC蛋白质基因的鉴定
实施例6中获得的阳性克隆委托上海基康生物技术公司测定。基因全序列和编码的蛋白质序列见图3和4。该基因示于SEQ ID NO：1，长714个bp，编码238个氨基酸残基(SEQ ID NO：2)。
SC蛋白质cDNA编码的蛋白质序列与另一个被称为Lumbricus bimastus的cDNA编码的蛋白质序列同源性达54％。因此，这是一个新的未见报道的SC蛋白质基因，质谱测定其分子量为29.375KD。
实施例9
SC蛋白质的表达和鉴定
在该实施例中，为进一步证实该基因的确编码了SC蛋白质，将该基因的翻译区在真核表达载体pPIC9K(Invitrogen公司)中表达，用实施例7中制得的兔抗SC蛋白质抗体与表达产物进行Western杂交鉴定。其中质粒构建图谱见图2。
(1)表达
根据全基因序列另合成两条引物，以便于在pPIC9K中表达：上游引物为5′CTCTCGAGAAAAGAATCATTGGCGGGGATGAATG 3′(引物3)(SEQ ID NO：5)，下游引物为：5′GTGAATTCAGTTTTCACGGGGGGCA 3′(引物4)(SEQ ID NO：6)。以反转录江浙蝮蛇总RNA形成的cDNA为模板，如上所述进行PCR扩增。扩增产物经XhoI位点与pPIC9K质里粒中的MFL前导肽连接，进一步扩增后，EcoRI/BamHI酶切后克隆于pPIC9K的EcoRI/BamHI位点中，酶切的阳性克隆经测序确保无误之后，命名为SC-5质粒，转化于酵母菌株GS115中。待细菌的OD600到0.6后加入甲醇至5％诱导基因的表达。收集表达上清液进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝R-250染色。
(2)Western印迹
SDS-PAGE结束后，取下电泳胶在冰浴的条件下100V电转2h至尼龙膜上。将膜放入杂交袋，加入5mL封闭液(5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液)，在摆动平台上摇动1h.。用封闭液以1∶1000稀释第一抗体(实施例7中制得的兔抗SC蛋白质抗体)。打开杂交袋，倒掉封闭液，加入稀释好的第一抗体，摇动1h。用磷酸盐缓冲液洗涤尼龙膜3次，每次15min。将洗涤好的膜与封闭液稀释好的羊抗兔碱性磷酸酶(1∶3000稀释)杂交1h.。膜用碱性磷酸酶缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，pH9.5，5mmol/L MgCl2，100mmol/L NaCl)洗涤后，用BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3---吲哚磷酸/氮蓝四唑)显色。
杂交结果显示，表达的蛋白质与SC蛋白质抗体专一性地结合。
实施例10
SC蛋白质抑制肿瘤活性试验结果
采用昆明种小白鼠为试验动物，皮下接种S180肿瘤细胞，经腹腔注射给药SC，连续7天，观察动物活动状况和生存情况。在试验期内动物无一死亡，表明对SC药物注射后的耐受性。
给药后，处死动物，并取瘤体，称重，计算SC对肿瘤的抑制率，结果如下表：
  剂量(mg/kg×d)   动物数(Initial/Final)   体重(Initial/Final，g)   瘤重(g)   抑制率(％)   P值(*)
对照CTXSC /60.0×10.1×70.5×72.5×7 10/1010/1010/1010/1010/10   20.0±0.83/31.2±4.6420.0±0.82/23.9±1.4819.8±1.23/29.5±3.3419.8±1.48/31.6±3.3519.9±1.10/23.5±4.75 2.17±0.6530.54±0.1271.65±0.4571.13±0.3840.97±0.244 /75.224.048.255.6 /＜0.001＞0.05＜0.001＜0.001
*与对照组相比
实施例11
含SC蛋白质的药物组合物
按以下配方，用常规方法制备药物组合物：
 SC蛋白  100微克
 右旋糖酐  1毫克
 100毫摩尔磷酸缓冲液  1毫升
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
                       序列表
<110>上海川耕生物技术有限公司
<120>丝氨酸蛋白酶及其编码序列
<130>035271
<160>7
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>714
<212>DNA
<213>江浙蝮蛇蛇毒(Agkistrodon Halyspallas)
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(714)
<223>
<400>1
atc att ggc ggg gat gaa tgt aac ata sat gaa cat cgt ttc ctt gta     48
Ile Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asn Ile Asn Glu His Arg Phe Leu Val
1               5                   10                  15
gcc tta tac acc tct aga tct agg act ttg ttc tgc ggt ggg act ttg     96
Ala Leu Tyr Thr Ser Arg Ser Arg Thr Leu Phe Cys Gly Gly Thr Leu
            20                  25                  30
atc aac cag gaa tgg gtg ctc act gct gca cac tgt gac agg aaa aat    144
Ile Asn Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asp Arg Lys Asn
        35                  40                  45
ttc cgg ata aag ctt ggt atg cat agc aaa aag gta cca aat gag gat    192
Phe Arg Ile Lys Leu Gly Met His Ser Lys Lys Val Pro Asn GluAsp
    50                  55                  60
gag cag aca aga gtc cca aag gag aag ttc ttt tgt ctc agt agc aaa    240
Glu Gln Thr Arg Val Pro Lys Glu Lys Phe Phe Cys Leu Ser Ser Lys
65                  70                  75                  80
aac tat acc ctt tgg gac aag gac atc atg ttg atc agg ctg gac agc    288
Asn Tyr Thr Leu Trp Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asp Ser
                85                  90                  95
cct gtt aag aac agt aaa cac att gcg cct ttc agc ttg ccc tcc agc    336
Pro Val Lys Asn Ser Lys His Ile Ala Pro Phe Ser Leu Pro Ser Ser
            100                 105                 110
cct ccc agt gtg ggc tca gtt tgc cgc att atg gga tgg ggc aga atc    384
Pro Pro Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Arg Ile
        115                 120                 125
tca cct act gaa ggg act tat ccc gat gtc cct cat tgt gtt aac att    432
Ser Pro Thr Glu Gly Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Val Asn Ile
    130                 135                 140
aac cta ctc gaa tat gag atg tgt cga gca cct tac cca gaa ttt gag    480
Asn Leu Leu Glu Tyr Glu Met Cys Arg Ala Pro Tyr Pro Glu Phe Glu
145                 150                 155                 160
ttg cca gcg aca agc aga aca ttg tgt gca ggt atc ctg gaa ggg ggc    528
Leu Pro Ala Thr Ser Arg Thr Leu Cys Ala Gly Ile Leu Glu Gly Gly
                165                 170                 175
aaa gat aca tgt aag ggt gac tct ggg gga ccc ctc atc tgt aat gga    576
Lys Asp Thr Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly
            180                 185                 190
caa ttc cag ggc att gca tct tgg gga gac gat cct tgt gcc caa ccg    624
Gln Phe Gln Gly Ile Ala Ser Trp Gly Asp Asp Pro Cys Ala Gln Pro
        195                 200                 205
cat aag cca gcc gcg tac acc aag gtc ttc gat cat ctt gac tgg atc    672
His Lys Pro Ala Ala Tyr Thr Lys Val Phe Asp His Leu Asp Trp Ile
    210                 215                 220
gag aac att att gca gga aat aca gat gcg tcc tgc ccc ccg            714
Glu Asn Ile Ile Ala Gly Asn Thr Asp Ala Ser Cys Pro Pro
225                 230                 235
<210>2
<211>238
<212>PRT
<213>江浙蝮蛇蛇毒(Agkistrodon Halyspallas)
<400>2
Ile Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asn Ile Asn Glu His Arg Phe Leu Val
1               5                   10                  15
Ala Leu Tyr Thr Ser Arg Ser Arg Thr Leu Phe Cys Gly Gly Thr Leu
            20                  25                  30
Ile Asn Gln Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Asp Arg Lys Asn
        35                  40                  45
Phe Arg Ile Lys Leu Gly Met His Ser Lys Lys Val Pro Asn Glu Asp
    50                  55                  60
Glu Gln Thr Arg Val Pro Lys Glu Lys Phe Phe Cys Leu Ser Ser Lys
65                  70                  75                  80
Asn Tyr Thr Leu Trp Asp Lys Asp Ile Met Leu Ile Arg Leu Asp Ser
                85                  90                  95
Pro Val Lys Asn Ser Lys His Ile Ala Pro Phe Ser Leu Pro Ser Ser
            100                 105                 110
Pro Pro Ser Val Gly Ser Val Cys Arg Ile Met Gly Trp Gly Arg Ile
        115                 120                 125
Ser Pro Thr Glu Gly Thr Tyr Pro Asp Val Pro His Cys Val Asn Ile
    130                 135                 140
Asn Leu Leu Glu Tyr Glu Met Cys Arg Ala Pro Tyr Pro Glu Phe Glu
145                 150                 155                 160
Leu Pro Ala Thr Ser Arg Thr Leu Cys Ala Gly Ile Leu Glu Gly Gly
                165                 170                 175
Lys Asp Thr Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Gly
            180                 185                 190
Gln Phe Gln Gly Ile Ala Ser Trp Gly Asp Asp Pro Cys Ala Gln Pro
        195                 200                 205
His Lys Pro Ala Ala Tyr Thr Lys Val Phe Asp His Leu Asp Trp Ile
    210                 215                 220
Glu Asn Ile Ile Ala Gly Asn Thr Asp Ala Ser Cys Pro Pro
225                 230                 235
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(25)
<223>引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(17)..(17)
<223>n＝a，t，c，g
<220>
<221>misc_feature
<222>(20)..(20)
<223>n＝a，t，c，g
<400>3
gtagtactat hathggnggn gayga                                           25
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(23)
<223>引物
<400>4
tttctcctct trasywtttc aaa                                             23
<210>5
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(34)
<223>引物
<400>5
ctctcgagaa aagaatcatt ggcggggatg aatg                                 34
<210>6
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>1misc_feature
<222>(1)..(25)
<223>引物
<400>6
gtgaattcag ttttcacggg gggca                                           25
<210>7
<211>20
<212>PRT
<213>江浙蝮蛇蛇毒(Agkistrodon Halyspallas)
<400>7
Ile Ile Gly Gly Asp Glu Cys Asn Ile Asn Glu His Arg Phe Leu Val
1               5                   10                  15
Ala Leu Tyr Thr
            20

Claims (9)

1.一种分离的蛋白质，其特征在于，该蛋白质选自下组：
(a)是SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；
(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有丝氨酸蛋白水解功能的由(a)衍生的多肽。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它编码权利要求1所述的蛋白。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸是SEQ ID NO：1中1-714位的序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种蛋白质的制备方法，其特征在于，该方法包含步骤：
(a)在表达条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；
(c)从培养物中分离出蛋白质，所述蛋白质是SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
9.一种药物组合物，其特征在于，它含有安全有效量的权利要求1所述的蛋白质以及药学上可接受的载体。
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