CN1169832C - 基因p28－II的鉴定与功能研究 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的人p28-II蛋白，编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生这种多肽的方法。本发明还公开了此多肽的药物组合物用于治疗肝癌等多种疾病的方法。本发明还公开了p28-II蛋白特异性抗体的制备方法以及该抗体用于疾病诊断和治疗等多种用途。本发明还公开了编码这种新的人p28-II蛋白的多核苷酸的用途。

Description

基因p28-II的鉴定与功能研究

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码人p28-II蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽及其特异性抗体的用途和制备。具体地说，本发明的p28-II蛋白是一种新的在肝癌中高表达的蛋白。

背景技术

随着基因组计划的迅猛发展，攻克包括肝癌在内的恶性肿瘤在不久的将来将成为现实。我国是原发性肝细胞肝癌(primary hepatocellular carcinoma，HCC)的高发地区，其死亡率已占我国部分农村和城市的第一、二位，是严重影响我国人民健康的重大疾病，每年世界上有38.6万人死于肝癌，而其中的45％是在中国。目前认为，肝癌的发生、发展，亦和其它恶性肿瘤一样，是多基因、多因素参与的复杂过程，包括体细胞基因突变、抑癌基因的丢失、癌基因的激活和过表达等等，许多癌基因、抑癌基因，及相关基因的异常激活或失活是肝癌发生的分子基础。从理论上讲，应该有更多的基因参与其中，但目前已发现的许多基因，其详尽功能仍不十分清楚。目前已证明与人类肝癌相关的癌基因或异常表达基因包括：pTEN、p21、p27、p73、p15、p53、RB1、APC、nm23、P16、MXR7、IGF-II、TGFα、HGF-R(c-met)/HGF、c-fms(CSF-IR)、c-erbB-1(EGF-R)/c-erbB-2(neu)、Ras、Raf、c-myc、c-ets-2等等。自然医学(Nature Medicine 2000，6：96-99)发表文章，提示一种蛋白p28(也称为gankyrin)在肝癌中高表达，正常肝不表达，p28蛋白的cDNA全长为1495bp。翻译出的蛋白质长226氨基酸。

然而到目前位置，没有一个令人满意的肝癌特异性表达基因，因此，寻找新的肝癌异常表达或缺失基因，从基因水平认识肝细胞的生长、分化、再生和癌变的分子机理，并阐明其信号传递过程与途径，不仅有重要的生物学意义，而且对于肝癌的早期基因诊断和信息治疗，均具有重大的临床应用意义和经济开发价值，在人类基因组的研究中也能占领新的制高点。

因此，为治疗和诊断目的研究和开发在肝癌中高表达的基因和/或蛋白具有重要意义。本领域迫切需要新的在肝癌中高表达的基因和/或蛋白。目前尚未见有p28-II基因cDNA序列或氨基酸序列的报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的、在肝癌中高表达的人p28-II蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

本发明人应用RT-PCR法从肝癌组织中获得了p288-II基因，该基因序列与肝癌高度相关。该基因在肝癌中的高表达，而癌旁肝组织不表达。该基因编码一个151氨基酸的蛋白质。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的p28-II蛋白多肽，该多肽是人源的，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性：(a)编码上述人p28-II蛋白多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中22-474位的序列；和(b)具有SEQ ID NO：1中1-767位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有人p28-II蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达人p28-II蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人p28-II蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的人p28-II多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-767个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人p28-II多肽活性的化合物，以及抑制人p28-II多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人p28-II多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在p28-II蛋白的方法，它包括：将样品与p28-II蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在p28-II蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与人p28-II多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人p28-II多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人p28-II多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人p28-II蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人p28-II多肽拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗肿瘤等病症。

本发明其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1.5对人肝癌与相应癌旁组织、2个人正常肝组织RNA的RT-PCR结果。M为分子量标准，L为癌旁肝组织，K为肝癌组织，N为正常肝组织，RT(-)示RNA未经RT直接PCR，PCR(-)示不加RT产物的PCR。箭头所指即为p28-II基因扩增条带。

图2.T载体连接产物转化菌行菌落PCR反应进行鉴定，引物为P1，P2。LD为癌旁阳性条带克隆，KD为癌组织阳性条带克隆。箭头所指即为p28-II阳性克隆。

图3.p28-II的部分测序结果，在458位和459位碱基之间缺失了相对于p28/gankyrin基因序列471-549位的79个碱基。

图4.p28-II基因的cDNA和蛋白序列，下划线表示ankyrin重复结构域的保守序列。

图5.Northern印迹结果显示p28/gankyrin基因在人肝癌和癌旁组织中的表达，癌较癌旁组织表达有明显升高。L：癌旁组织 K：癌组织，下方为RNA上样量的内参照，即18S和28S rRNA。箭头所示为p28-II基因的杂交条带。

图6.p28-II mRNA在人肝癌内的表达与临床病理指标的统计学相关性。门静脉癌栓和肝分支静脉侵润两项指标与p28-II基因表达呈正相关。

图7 p28-II基因在人正常组织中的表达。

图8 p28-II基因在人非肝肿瘤中的表达。

图9 p28-II基因在人肝癌细胞系中的表达。

图10 p28-II基因在人非肝肿瘤细胞系中的表达。

图11.原位杂交显示p28基因mRNA在人肝癌组织中的表达(100×)。

图12.亲和层析纯化p28-II蛋白，不同流出和洗脱组分变性后上样10％SDS-PAGE电泳，凝胶经考马斯亮蓝染色。箭头所指即为p28-II蛋白的洗脱产物。

图13.免疫组化显示p28-II蛋白在人肝细胞肝癌组织中的表达(100×)。

具体实施方式

在本发明中，术语“p28-II蛋白”、“p28-II多肽”或“肝癌高表达蛋白p28-II”等可互换使用，都指具有人肝癌高表达蛋白p28-II氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。该术语包括含有或不含起始甲硫氨酸的肝癌高表达蛋白p28-II。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的p28-II蛋白或多肽”是指p28-II多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化p28-II蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人p28-II蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人p28-II蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人p28-II多肽”指具有人p28-II蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人p28-II蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人p28-II蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人p28-II DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人p28-II多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人p28-II多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人p28-II多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人p28-II多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人p28-II蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人p28-II多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人p28-II蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                    表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列+各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)+非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少85％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸所编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码p28-II蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人p28-II核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或p28-II蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的p28-II多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人p28-II多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人p28-II多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人p28-II编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人p28-II蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：用于筛选促进或对抗p28-II蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人p28-II蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人p28-II蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人p28-II DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人p28-II基因产物或片段。较佳地，指那些能与人p28-II基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人p28-II蛋白的分子，也包括那些并不影响人p28-II蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人p28-II基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人p28-II基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人p28-II蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人p28-II蛋白功能的抗体以及不影响人p28-II蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人p28-II基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人p28-II基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人p28-II蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人p28-II蛋白。此外，与人p28-II蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人p28-II蛋白相关的疾病。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人p28-II蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人p28-II蛋白阳性的细胞(例如肝癌细胞等)。由于本发明的p28-II蛋白在肝癌细胞中是特异性高表达的，这种杂交抗体可用于定向地杀灭肝癌细胞。

多克隆抗体的生产可用人p28-II蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白及其抗体，通过各种常规筛选方法，可筛选出与p28-II蛋白发生相互作用的物质，如与其功能密切相关的相互作用蛋白、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或其作用蛋白等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，如那些在脑和肺等组织中表达低下而导致某些疾病状态的治疗，而该多肽的拮抗剂可用于肿瘤尤其是肝癌方面的治疗。在使用本发明p28-II蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明p28-II多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的p28-II蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人p28-II蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于p28-II蛋白的无表达或异常/无活性的p28-II蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的p28-II蛋白(尤其是改变其蛋白质-蛋白质相互作用结构域和磷酸化修饰位点)，以抑制(或竞争性抑制)内源性的p28-II蛋白活性而阻止p28-II的细胞内信号传导。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将p28-II基因转移至细胞内。构建携带p28-II基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献。另外重组人p28-II基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制人p28-II mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与人p28-II蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。

本发明还涉及定量和定位检测人p28-II蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人p28-II蛋白水平，可以用作解释人p28-II蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断p28-II蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在p28-II蛋白的方法是利用p28-II蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与p28-II蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在p28-II蛋白。

p28-II蛋白的多聚核苷酸可用于p28-II基因相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，p28-II蛋白的多聚核苷酸可用于检测p28-II基因的表达与否或在疾病状态下p28-II基因的异常表达。如p28-II DNA序列可制备成特异性探针用于对活检标本的杂交以判断p28-II基因的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用p28-II蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测p28-II蛋白的转录产物。

检测p28-II基因的突变也可用于诊断p28-II蛋白相关的疾病。p28-II蛋白突变的形式包括与正常野生型p28-II DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR(SSCP)和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明p28-II蛋白的cDNA(位于3’-UTR序列)设计并合成PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从肝癌组织中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为767个碱基，其开放读框位于22-474位，编码全长为151个氨基酸的人p28-II蛋白(SEQ ID NO：2)。该p28-II蛋白是一种肝癌高表达蛋白。因此p28-II多核苷酸、p28-II蛋白及其抗体，以及p28-II蛋白相关的拮抗剂、激动剂等可为治疗包括肝癌等多种疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

肝癌高表达基因p28-II的克隆

在本实施例中，应用RT-PCR技术，从人肝细胞肝癌组织中分离得到p28-II新基因。

根据肝癌高表达基因p28/gankyrin(D83197，Nature Medicine 2000，6：96-99)全长可翻译区的两侧序列(5′和3′非翻译区)设计并合成上下游引物：

P1：5′-AGTAGTTGCTGGGACAGCG-3′(SEQ ID NO：3)

P2：5′-GGAACAAGAGTCAACATGT-3′(SEQ ID NO：4)

提取人肝癌组织和相应癌旁组织的总RNA，定量稀释后为反应模板。反转录酶购自大连宝生物工程有限公司(Takara)。反转录条件按产品说明书进行。反转录产物2ul用于PCR反应，程序为：94℃ 5min，1个循环，94℃ 40s，52℃ 30s，72℃ 55s，35个循环，72℃延伸7分钟。PCR产物上2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙淀染色。(见图1)

如图1所示，RT-PCR产物在肝癌和相应癌旁组织中都有两条阳性条带，在正常肝组织和阴性对照组中未见扩增产物。产物中较大的条带为预期p28/gankyrin基因的扩增条带(约862bp)，在它的下方可见另一条产量较少的阳性条带。为排除非特异性产物的可能，升高退火温度至55℃后，仍可见此条带(结果未显示)。

对以上3号标本的癌旁和癌组织分子量较小条带用凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Germany)进行胶回收，回收产物克隆入pMD18-T载体(大连宝生物工程有限公司)中，反应体系为：pMD18-T载体1ul；DNA插入片段(3L，3K)4ul；溶液I 5ul，共10ul。

连接产物转化XL-1感受态菌，挑取阳性克隆LD1-5，KD1-5，PCR鉴定(见图2)，克隆KD1和LD4送上海生物工程公司以M13+/-引物测序。

测序结果递交NCBI的Genbank数据库进行检索，结果显示与p28/gankyrin基因相比，有一段从471bp-549bp共79bp的缺失(见图3)。在测得的序列内有起始密码子ATG，有终止密码子TAG，全长767bp，读码框可翻译出151个氨基酸组成的蛋白质(见图4)。新得到的序列被命名为p28-II。

比较p28-II与p28/gankyrin的基因序列，可见p28-II较p28/gankyrin基因全长缺失了3′端的79bp，从而有终止密码子TAG的移码提前，形成C端截短的p28-II蛋白序列(共151个氨基酸)。

测定的p28-II的DNA序列列于如SEQ ID NO：1，全长为767个碱基，其开放读框位于22-474位，编码全长为151个氨基酸的人p28-II蛋白(SEQ ID NO：2)。p28-II的Genbank登录号为：GenBank AY057056(因申请保密，在本申请提交前未公开)。

实施例2

p28-II在人肝癌组织中的表达

在本实施例中，通过Northern印迹法分析p28-II基因在64对人肝癌组织中的表达结果。

采用横跨缺失区(与ankyrin蛋白相比)的序列为杂交探针(约450bp)。探针标记采用随机引物法，以α-³²P-dATP标记p28-II基因。人肝癌组织及相应癌旁组织标本采用一步法提取总RNA。RNA样品(40μg/泳道)进行甲醛变性胶电泳、转膜。用制备的特异性探针进行杂交，严谨洗膜后进行放射自显影。杂交信号以18s rRNA作为内参照进行标化，用SX-100生物影像分析系统对杂交结果进行分析，以癌旁肝杂交信号相对灰度值为1，肝癌的相对灰度值与之比较得表达上调指数(图5)。

实施例3

p28-II与临床病理指标间的联系

p28-II基因在肝癌内的表达水平与临床病理指标相对照，各组内基因MRNA表达水平以均值±标准差表示，统计方法采用不配对计量资料t检验和方差分析ANOVA(SPSS10.0统计软件)，p＜0.05为具有统计学意义。

p28-II表达上调指数与临床病理指标间的统计学比较结果如下：被检的64例人肝细胞肝癌中，p28-II基因的检出率为98.4％(63/64)，其中癌较癌旁组织表达明显升高的占88.9％(56/63，2.708±1.418，p＜0.01)。余7例中5例(5/63)癌和癌旁都弱表达，但差异不明显；还有2例(2/63)癌旁表达高于癌组织。有门脉癌栓形成的肝癌p28-II的表达显著高于无癌栓的肝癌(p＜0.001)，肿瘤组织内有肝分支静脉侵犯的肝癌p28-II的表达明显高于无静脉侵犯的肝癌(p＝0.067)，表达升高与其它临床病理指标无明显相关性。(见表1；图6)

表1  p28-II基因在肝癌内的表达与肝癌临床病理指标之间的关系

临床指标与病                     mRNA表达水平        自由       P值(F/t检

                 总例数

理特点                           (平均值±标准差)    度(Df)     验)

年龄                                                 62         0.273

    ＜40         18              2.910±0.695

    40-60        35              2.790±0.367

    ＞60         11              1.673±0.546

性别                                                 62         0.401

    男           48              2.734±0.422

    女           16              2.650±0.238

乙肝病毒感染                                         62         0.169

    +            50              2.919±1.426

    -            14              2.317±1.362

血清AFP(μg/l)                                       60         0.236

    ＜25         14              2.439±1.362

    25-1000      21              2.469±1.273

    ＞1000       27              2.821±1.389

肿瘤分级                                             62         0.466

    I-II级       19              2.809±1.538

    III-IV级     45              2.859±1.655

肿瘤大小(直径                                        62         0.124

cm)

    ＜5          22              2.393±1.206

    5-10         25              2.852±1.468

    ＞10         17              3.001±1.652

包膜完整                                             49         0.242

    +            27              2.513±1.226

    -         24             2.833±1.636

卫星灶                                             62       0.243

    +         28             2.467±0.209

    -         36             2.931±0.554

门脉癌栓                                           62       ＜0.001

    +         17             3.971±1.384

    -         47             2.390±1.243

肝分支静脉侵

润                                                 62       0.067

    +         23             3.726±0.306

    -         41             2.442±0.532

肝硬化                                             62       0.180

    +         50             2.636±1.343

    -         14             3.157±1.885

实施例4

p28-II的表达谱

在本实施例中，应用Northern印迹技术，分析p28-II基因在人正常组织、6种人非肝肿瘤组织、5种人肝癌细胞系和6种人非肝肿瘤细胞系中的表达。

所用的细胞包括：5种肝癌细胞系WRL68，Chang liver，Hu-H7，HepG2 andSK-Hep1，6种人非肝肿瘤细胞系Colo 320DM(直肠腺癌)，A172(脑瘤)，TE671(横纹肌肉瘤)，A431(皮肤鳞癌)，J45.01(急淋性白血病T细胞)和HBL-100(乳腺癌)。

结果表明，p28-II基因的1.5kb转录子在人脑组织中高表达，弱表达于肺、脾、骨骼肌和心肌，不表达于肝、胰、胃、小肠和大肠等消化道组织(图7)。在5例非肝肿瘤组织标本中，p28-II的表达较相应癌旁组织无明显差异(图8)。p28-II在5种人肝癌细胞系和6种非肝肿瘤细胞系中均有表达。其中在6种非肝肿瘤细胞系中的表达无明显差异(图10)，而在5种人肝癌细胞系中，SK-Hep1细胞系中的表达最强，HepG2细胞系中的表达最弱(图9)。

实施例5

原位杂交分析

按常规原位杂交技术，研究了p28-II基因转录产物在人肝细胞肝癌中的表达分布。

结果表明，在受检的10例肝癌组织切片中，p28-II基因mRNA的阳性杂交信号主要位于肝癌细胞的胞浆和核膜附近，个别区域有胞核的阳性染色。癌旁和正常肝组织未见阳性信号(图11)。

实施例6

原核表达p28-II蛋白

以p28-II全长可翻译区为目的序列，合成以下引物：

HP1：gc ggatccagtagttgctgggacagcg(BamHI酶切接头)(SEQ ID NO：5)

HP2：gc ctcgagggaacaagagtcaacatgt(XhoI酶切接头)(SEQ ID NO：6)

以人肝癌组织cDNA文库为模板，行RT-PCR后，将预期大小片段胶回收(Qiagen，Germany)，定向克隆入pProEX HTb载体(Gibco，BRL)中，转化DH5α细菌，挑取阳性克隆。用IPTG诱导后，按Histidine-Tagged Protein Purification Kit(Qiagen，Germany)提供的操作说明书纯化p28-II原核表达蛋白。经Ni-Ta亲合层析纯化的蛋白上样聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳后，考马斯亮蓝染色鉴定见图12。

实施例7

兔源性多克隆抗体的制备

按分子克隆指南(Cold spring harbor laboratory edition，1989)，将实施例6中纯化得到的p28蛋白与福氏佐剂混合后免疫家兔，加强三次后取血，制得抗p28的兔源多克隆抗血清。

实施例8

免疫组织化学分析

按常规方法，对p28-II蛋白在人肝癌组织中的表达水平进行免疫组织化学分析。

免疫组化结果提示：p28-II蛋白只在肿瘤组织内的肝细胞中有表达，定位在胞浆，不表达于胆管上皮细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞和间质细胞。正常肝细胞未见阳性表达，癌旁肝细胞有弱表达(图13)。

讨论

p28/gankyrin基因是2000年日本科学家Fujita等人应用消减杂交法从人肝细胞癌组织中筛选出的一条编码重复ankyrin序列的新基因(GenBank：D83197，Nature Medicine 2000，6：96-99)，其开放阅读框编码一个226氨基酸组成的25kDa大小的蛋白质，其中含有6个重复ankyrin序列和1个Rb蛋白结合域。经NCBI的BLAST软件检索，我们发现它与1998年GenBank登录的p28基因(GenBank：AB009619)序列100％同源。p28基因编码的蛋白是人26S蛋白酶体(26S proteasome)调节亚单位19S/PA700复合物的一种非ATP酶亚基，它具有保守的串联ankyrin序列，介导蛋白与蛋白间的相互作用，与降解体内某些错折叠蛋白或细胞周期蛋白有关。

Fujita等人用Northern印迹杂交显示p28/gankyrin基因的mRNA水平在受检的34对肝细胞癌和相应癌旁组织中全部呈肝癌组织高表达，上升幅度为120％至387％之间(平均约360％)。p28/gankyrin的蛋白水平在34例肝癌组织标本中亦呈高表达。p28/gankyrin基因在mRNA和蛋白质水平的肝细胞癌高表达状态与肿瘤的分级和分期无关。

p28-II基因较p28/gankyrin基因缺失79bp，就蛋白序列来看，p28-II蛋白的C端缺失了近2个ankyrin重复结构域，同时也缺失了Rb蛋白结合结构域(LXCXE)。从我们大样本基础上的Northern印迹结果来看，p28-II基因在人肝癌内明显上调，且表达上调指数(癌/癌旁)与两项临床病理指标有统计学相关性，即有门静脉癌栓或有肝分支静脉侵润的肝癌更有高表达p28-II的倾向，提示p28-II可能与肝癌的侵袭性和转移性密切相关，也提示p28-II基因有可能成为临床肝癌基因治疗的潜在靶点。

p28-II的免疫组化结果提示它在人肝癌组织内的表达特异性明显，只在肝癌细胞中表达，不表达于胆管细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞和间质细胞，提示p28-II有望成为临床鉴别肝脏肿瘤组织来源的有效指标。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                         序列表

<110>上海东方肝胆外科医院

<120>基因p28-II的鉴定与功能研究

<130>015534

<160>6

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>767

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(22)..(474)

<400>1

agtagttgct gggacagcga a atg gag ggg tgt gtg tct aac cta atg gtc    51

                        Met Glu Gly Cys Val Ser Asn Leu Met Val

                        1               5                 10

tgc aac ctg gcc tac agc ggg aag ctg gaa gag ttg aag gag agt att    99

Cys Asn Leu Ala Tyr Ser Gly Lys Leu Glu Glu Leu Lys Glu Ser Ile

                15                 20                  25

ctg gcc gat aaa tcc ctg gct act aga act gac cag gac agc aga act    147

Leu Ala Asp Lys Ser Leu Ala Thr Arg Thr Asp Gln Asp Ser Arg Thr

            30                 35                  40

gca ttg cac tgg gca tgc tca gct gga cat aca gaa att gtt gaa ttt    195

Ala Leu His Trp Ala Cys Ser Ala Gly His Thr Glu Ile Val Glu Phe

        45                 50                  55

ttg ttg caa ctt gga gtg cca gtg aat gat aaa gac gat gca ggt tgg    243

Leu Leu Gln Leu Gly Val Pro Val Asn Asp Lys Asp Asp Ala Gly Trp

    60                 65                  70

tct cct ctt cat att gcg gct tct gct ggc cgg gat gag att gta aaa    291

Ser Pro Leu His Ile Ala Ala Ser Ala Gly Arg Asp Glu Ile Val Lys

75                  80                 85                  90

gcc ctt ctg gga aaa ggt gct caa gtg aat gct gtc aat caa aat ggc    339

Ala Leu Leu Gly Lys Gly Ala Gln Val Asn Ala Val Asn Gln Asn Gly

                95                 100                 105

tgt act ccc tta cat tat gca gct tcg aaa aac agg cat gag atc gct    387

Cys Thr Pro Leu His Tyr Ala Ala Ser Lys Asn Arg His Glu Ile Ala

            110                115                 120

gtc atg tta ctg gaa ggc ggg gct aat cca gat gct aag gac cat tat      435

Val Met Leu Leu Glu Gly Gly Ala Asn Pro Asp Ala Lys Asp His Tyr

        125                130                 135

gag gct aca gca atg cac cgg gca gca gcc aag gac act tagcctgtga       484

Glu Ala Thr Ala Met His Arg Ala Ala Ala Lys Asp Thr

    140                145                 150

tgaggagaga gtggaagaag caaaactgct ggtgtcccaa ggagcaagta tttacattga    544

gaataaagaa gaaaagacac ccctgcaagt ggccaaaggt ggcctgggtt taatactcaa    604

gagaatggtg gaaggttaaa cagcttggat ttattcttac tttgtatgtt gtgttgttgt    664

ccccagtgtc ctacaaacta atgtatttgt gcacaagaca tcatctatga atgatgaagt    724

tttctcacct tcaaagtctt ataaacatgt tgactcttgt tcc                      767

<210>2

<211>151

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Glu Gly Cys Val Ser Asn Leu Met Val Cys Asn Leu Ala Tyr Ser

1               5                  10                  15

Gly Lys Leu Glu Glu Leu Lys Glu Ser Ile Leu Ala Asp Lys Ser Leu

            20                 25                  30

Ala Thr Arg Thr Asp Gln Asp Ser Arg Thr Ala Leu His Trp Ala Cys

        35                 40                  45

Ser Ala Gly His Thr Glu Ile Val Glu Phe Leu Leu Gln Leu Gly Val

    50                 55                  60

Pro Val Asn Asp Lys Asp Asp Ala Gly Trp Ser Pro Leu His Ile Ala

65                  70                 75                  80

Ala Ser Ala Gly Arg Asp Glu Ile Val Lys Ala Leu Leu Gly Lys Gly

                85                 90                  95

Ala Gln Val Asn Ala Val Asn Gln Asn Gly Cys Thr Pro Leu His Tyr

            100                105                 110

Ala Ala Ser Lys Asn Arg His Glu Ile Ala Val Met Leu Leu Glu Gly

        115                120                 125

Gly Ala Asn Pro Asp Ala Lys Asp His Tyr Glu Ala Thr Ala Met His

    130                135                 140

Arg Ala Ala Ala Lys Asp Thr

145                 150

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>3

agtagttgct gggacagcg                                                    19

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>4

ggaacaagag tcaacatgt                                                    19

<210>5

<211>27

<212>DNA

<213>引物

<400>5

gcggatccag tagttgctgg gacagcg                                           27

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>引物

<400>6

gcctcgaggg aacaagagtc aacatgt                                           27

Claims (8)

1.一种分离的人p28-II多肽，其特征在于，它具有SEQ ID NO：2氨基酸序列。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中22-474位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-767位的序列。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞：

(a)用权利要求5所述的载体转化或转导的宿主细胞；

(b)用权利要求2所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

7.一种人p28-II多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达人p28-II蛋白的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有人p28-II蛋白活性的多肽。

8.一种能与权利要求1所述的人p28-II蛋白特异性结合的抗体。

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