CN1281622C - 作为肿瘤标志物的肿瘤相关分泌蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的肿瘤标志物-TSP1蛋白，编码TSP1蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种TSP1蛋白的方法。本发明还公开了TSP1蛋白及其编码序列的用途，如用于诊断肝癌。本发明还提供了检测TSP1蛋白的试剂盒。

Description

作为肿瘤标志物的肿瘤相关分泌蛋白及其用途

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地说，本发明涉及一种新的肿瘤标志物-肿瘤相关分泌蛋白1(Tumor Associated Secretory Proteinl，简称为TSP1蛋白)，编码TSP1蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种TSP1蛋白的方法。本发明还公开了TSP1蛋白及其编码序列的用途，如用于诊断肿瘤，以及含TSP1蛋白拮抗剂(如抗体和反义核酸)的药物组合物。

背景技术

二十世纪50年代以来医学科学有了飞跃的发展，癌症治疗的进展也是卓有成效的，并发现了不少直接与癌症发生相关的癌基因与抑癌基因。

迄今为止，已在黑色素瘤及包括前列腺癌、胸腺癌、卵巢癌、肠胃癌在内的各种肿瘤组织中发现了不少肿瘤抗原。目前已发现的人类肿瘤免疫排斥抗原可分为四种类型。第一类抗原来自于正常基因产物的体细胞突变，第二类抗原来自于和致癌过程相关的基因突变。这两类抗原均为患者特异性抗原，不适合普遍性治疗。第三类抗原为那种在正常组织中也有表达，但在肿瘤中表达量升高的基因的产物。如果不涉及突变，这类抗原在各种癌症病人中是具有普遍性的，但它们通常是组织特异的，且并非为肿瘤所特有，在临床应用上意义不大。第四类抗原具有严格的肿瘤特异性，和一般的致癌过程相关。因此，这类抗原在人类肿瘤中广泛的表达，最适合于作为肿瘤标志物以及抗肿瘤免疫攻击的靶点。此外，特别适合用于诊断的肿瘤标志物是那些分泌性的蛋白。然而，目前已发现的抗原中很少是属于这一类的。

为了治疗和诊断目的开发肿瘤相关的分泌蛋白具有十分重要意义。因此，本领域迫切需要开发新的分泌性的肿瘤标志物，用于肿瘤的诊断和治疗。

发明概述

本发明的目的是提供一种新的人肿瘤标志物TSP1蛋白以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

本发明经过广泛而深入的研究，发现并分离出了新的可作为肿瘤标志物的抗原基因：TSP1。该基因的表达产物在肝癌病人的血清中可以检测到，但是在正常人和其他非肝癌患者中的血清缺检测不到。这表明TSP1是一特异的分泌性的肝癌标志物。在此基础上完成了本发明。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的TSP1多肽，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。

较佳地，该TSP1多肽选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进肝癌细胞生长的功能的由(a)衍生的多肽。

更佳地，该多肽具有SEQ ID NO：2中1-208位或26-208位的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述人TSP1多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2中1-208位或26-208位氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中779-1402位的序列；(b)具有SEQ ID NO：1中1-2978位的序列；(c)具有SEQ ID NO：1中854-1402位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备TSP1蛋白的方法，该方法包含：(a)在适合表达蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出TSP1蛋白。

在本发明的第五方面，提供了与上述的人TSP1多肽特异性结合的抗体。还提供了可用作引物或探针的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的15-2978个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人TSP1多肽活性的化合物，以及抑制人TSP1多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人TSP1多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在TSP1蛋白的方法，它包括：将样品与TSP1蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在TSP1蛋白。还提供了一种检测肿瘤的方法，包括步骤：将待检测个体的样品(如血液、尿液、体液、唾液等)与特异性抗TSP1蛋白的抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示该个体患有肝癌或肝癌易感性高于正常人群。

在本发明的第八方面，本发明还提供了一种检测肿瘤(尤其是肝癌)的试剂盒，它含有TSP1蛋白的特异性抗体和说明书。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人TSP1多肽活性的激动剂，或者抑制人TSP1多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人TSP1蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人TSP1拮抗剂以及药学上可接受的载体。优选的TSP1拮抗剂是抗TSP1的抗体和TSP1反义序列。这些药物组合物可治疗肿瘤。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了TSP1蛋白的表达。其中，图A是诱导前后的表达情况，泳道1.pT7470-TSP1-HMS174(DE3)诱导前；2.pT7470-TSP1-HMS174(DE3)诱导后；3.pT7470-TSP1-HMS174(DE3)包涵体；4.标准蛋白分子量。图B为纯化前后的电泳图，泳道1.标准蛋白分子量；2.pT7470-TSP1-HMS174(DE3)包涵体；3.pT7470-TSP1-HMS174(DE3)第二次超声上清；4.TSP1蛋白割胶后浓缩样。图C为Western印迹检测结果(1∶10000)，泳道1.pT7470-TSP1-HMS174(DE3)诱导前菌体；2.TSP1蛋白样品。

图2显示了在小鼠血清中对TSP1蛋白的检测结果。各泳道如下：A、电转空载体质粒的小鼠血清经免疫共沉淀后B、TSP1蛋白表达的阳性对照C、电转TSP1质粒的小鼠血清经免疫共沉淀后(分别为5ul和10ul样品)D、电转TSP1质粒小鼠血清未经免疫共沉淀。

图3显示了对部分病人血清的Western Blot结果。各泳道如下：A、TSP1蛋白表达的阳性对照；H1-H5、HBV阳性的肝炎患者血清；K1-K5、肝癌患者血；N1-N3、正常人血清。

图4是pT₇470载体的结构图。

发明详述

在本发明中，术语“TSP1蛋白”、“TSP1多肽”或“肿瘤标志物TSP1”可互换使用，都指具有人肿瘤标志物TSP1氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。它们还包括不含有信号肽(1-23位)的成熟TSP1。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的TSP1蛋白或多肽”是指TSP1多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化TSP1蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人TSP1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人TSP1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人TSP1多肽”指具有人TSP1蛋白活性的SEQ ID NO：2序列的全长多肽或成熟多肽。该术语还包括具有与人TSP1蛋白相同功能(如促进肝癌细胞生长的功能)的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人TSP1蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人TSP1 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人TSP1多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人TSP1多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人TSP1多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人TSP1多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人TSP1蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人TSP1多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人TSP1蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                    表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码TSP1的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少90％或95％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码TSP1蛋白的多核苷酸。由于TSP1是一具有促进肝癌细胞生长的蛋白，因此反义的核酸片段可以用于抑制TSP1的表达。

本发明的人TSP1核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或TSP1蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的TSP1多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人TSP1多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人TSP1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人TSP1编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人TSP1蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：用于筛选对抗TSP1蛋白功能的抗体、多肽或其它物质。

另一方面，本发明还包括对人TSP1 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人TSP1基因产物或片段。较佳地，指那些能与人TSP1基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

抗人TSP1蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人TSP1蛋白。

本发明抗体可用于治疗或预防人TSP1蛋白相关疾病如肿瘤。一种方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人TSP1蛋白阳性的细胞，如肿瘤细胞。

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与TSP1蛋白发生相互作用的物质，如受体、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或受体等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

TSP1拮抗剂(如抗体和反义序列)可直接用于疾病治疗，例如，用于肿瘤方面的治疗。此外，还可联用其他治疗剂，如TNF-α、TNF-β等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明TSP1拮抗剂(如抗体和反义序列)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。

本发明还涉及定量和定位检测人TSP1蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人TSP1蛋白水平，可以用于诊断肿瘤。

一种检测样品中是否存在TSP1蛋白的方法是利用TSP1蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与TSP1蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在TSP1蛋白。

TSP1蛋白的多核苷酸可用于TSP1蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗TSP1的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的TSP1蛋白。

本发明还提供了一种检测肿瘤的试剂盒，它含有特异性扩增TSP1的引物对和/或TSP1特异性抗体。此外，还可含有特异性探针和/或PCR缓冲液等。

此外，鉴于TSP1是一个肿瘤细胞特有的免疫性抗原，分泌到体液中。因此，血样或尿液中的TSP1的直接测定除了可以作为肿瘤的辅助诊断和愈后的观察指标之外，也可作为肿瘤早期诊断的依据。

本发明的主要优点在于：

(1)TSP1仅存在于肝癌病人血清中，而在正常人或非肝癌患者的血清中不能检测到。因此，假阳性率低。

(2)TSP1是一分泌性蛋白，便于应用于肝癌的血清学诊断、预后监测，并且可作为基因治疗、研制基因工程药物或作为设计抗癌新药的靶分子。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

TSP1的获得

TSP1是通过用常规方法构建人胎儿cDNA文库获得的。取3、6、9月龄胎儿组织，用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA，用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用pCMV-script TMXR cDNA文库构建试剂盒(Stratagene公司)构建上述mRNA的cDNA文库。其中反转录酶改用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL)，反转录反应在42℃进行。转化XL 10-Gold感受细胞，获得了1×10⁶cfu/μg cDNA滴度的cDNA文库。第一轮随机挑取cDNA克隆，其后以高丰度cDNA克隆和已证明有促癌细胞生长功能的cDNA克隆为探针，杂交筛选cDNA文库，挑取弱阳性及阴性克隆。用Qiagen 96孔板质粒抽提试剂盒，按厂家说明书进行质粒DNA的提取。质粒DNA和空载体同时转染肝癌细胞系7721。100ng DNA酒精沉淀干燥后，加6μl H₂O溶解，待转染。每份DNA样品中加0.74μl脂质体及9.3μl无血清培液，混匀后，室温放置10分钟。每管中加150μl无血清培液，均分加入3孔生长于96孔板的7721细胞中，37℃放置2小时，每孔再加50μl无血清培液，37℃24小时。每孔换100μl全培液，37℃24小时，换含G418的全培液100μl，37℃24-48小时，边观察，边换G418浓度不等的培液。约2-3次后，直到镜检细胞有克隆形成，计数。发现TSP1克隆有促进癌细胞克隆形成作用，结果如下表所示。

               cDNA克隆转染细胞(7721)克隆形成情况

cDNA克隆名称	cDNA克隆数(三个重复)			空载体克隆数(三个重复)
							TSP1	49	53	45	19	22	16

对cDNA克隆采用双脱氧终止法，在ABI377 DNA自动测序仪上测定其核苷酸序列，获得全长序列SEQ ID NO：1，ORF位于779-1402位，编码一个208个氨基酸的TSP1蛋白(分子量约21Kda)，其中信号肽位于1-23位，因此成熟蛋白具有SEQ ID NO：2中第26-208位的氨基酸序列。

  1   MGTGGSLLCG CSLVLSCLCP SASLPDPGNS TWPPGAQAGL PAALALPLPR LPRILFPMAG

 61  RPARPSSDFV GCAQGMCCHG RQGTVHIHTS SVSCWTPCPV TGTGGTAVSR KDRVLPHRRQ

121  VSLACVCAVG ERAGQLWSQK PVQMARPSAR HLLPRGSSPN SQAVLLPSVC PVPWPPVGPS

181  PGQGEGLSPA FPGVGTDRGD SWALVLQV(SEQ ID NO：2)

实施例2：从胎盘或胎儿cDNA中PCR获得全长基因：

取3、6、9月龄的胎儿组织，用Trizol试剂(GIBCO BRL公司)按厂方说明书提取总RNA，用mRNA提纯试剂盒(Pharmacia公司)提取mRNA。用MMLV-RT-Superscript II(GIBCO BRL)，反转录酶在42℃进行反转录反应，获得胎盘或胎儿cDNA。利用特异引物(如下表所示)，按97℃ 3’1个循环。94℃ 30″60℃ 30″72℃ 1’35个循环，72℃ 10’1个循环进行PCR扩增，获得含有完整开放阅读框序列的各蛋白基因的扩增产物。扩增产物经测序验证，与实施例1测得的序列相符。

                                 基因特异引物

克隆名称	特异引物1(5’→3’)	特异引物2(5’→3’)
			TSP1	GGTCTTGATGTGGCAGGAGT(SEQ ID NO：3)	GATTGACCCGAAACAGGTGG(SEQ ID NO：4)

实施例3  TSP1蛋白重组表达和纯化

在该实施例中，以实施例2中的PCR扩增产物为模板，用序列如下的5’和3’端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得人TSP1 DNA作为插入片段。

5’端寡核苷酸引物序列为：5’-GCCCGAATTCGACCCTGGCAACAGCACCTGG-3’(SEQID NO：5)。该引物含有EcoRI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是不含信号肽序列的部分编码序列；

3’端引物序列为：5’-GCCCAAGCTTCTACACCTGAAGGACCAATG-3’(SEQ ID NO：6)。该引物含有HindIII限制性内切酶的酶切位点、翻译终止子和人TSP1的部分编码序列。

在Novagen公司pET21a+载体的N端加入了6XHis tag序列后形成的质粒pT7470(图4)

人TSP1蛋白cDNA PCR产物纯化后经EcoRI，HindIII双酶切，与双酶切的pT₇470载体连接形成载体pT₇470-TSP1并转化至感受态大肠杆菌HMS174(DE3)(Novagen公司)，挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序(ABI公司的377型测序仪，BigDye Terminator试剂盒，PE公司)。测序证实插入完整的TSP1编码序列。

挑表达TSP1的阳性大肠杆菌DE3克隆接种于10ml LB培养基中，37℃300rpm振荡培养过夜，1∶100稀释于接种于LB培养基振荡培养2.5hr，加100mM IPTG至0.1mM后37℃诱导2-3hr，5,000g 4℃离心10min去上清，置冰上用50ml上样缓冲液(0.5M NaCl，20mM咪唑2.7mM KCl，10.1mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH8.0)重悬，超声(B.Braun Labsonic U)破碎，然后12,000g 4℃离心10min，上清用0.8μm滤膜过滤后，过1ml Ni²⁺金属螫合Sepharose 4B层析柱，上样缓冲液充分洗涤后，加入500ul咪唑洗脱缓冲液(0.5M NaCl，500mM咪唑2.7mM KCl，10.1mM Na₂HPO₄，1.8mM KH₂PO₄，pH8.0)室温静置30分钟后收集洗脱液，重复洗脱2-3次，得到人TSP1蛋白。

结果如图1A和1B所示，TSP1蛋白的分子量约为21Kda，与预测值相符。

实施例4  抗TSP1蛋白抗体的产生

将实施例3中获得的重组人TSP1蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体方法如下。重组分子用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用150μg/0.2ml乳化过的蛋白，对兔子(新西兰兔)进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原，对兔子以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人TSP1蛋白基因翻译产物的能力加以评估。

结果发现，抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合(图1C)。

实施例5：TSP1电转小鼠试验

将TSP1编码区序列克隆到市售的pCDNA3.1载体，质粒DNA与空载体分别电转到BALB/e小鼠。具体方法是：取BALB/e小鼠16-18只，在两侧大腿肌肉注射DNA(每只小鼠20ug DNA，溶解于100ul生理盐水中)。立即电击注射的肌肉部位。

三周后小鼠处死，从眼球采血，分离血清。用免疫共沉淀的方法鉴定血清中是否存在TSP1蛋白。取小鼠血清20ul，加入蛋白A/G琼脂糖珠(Invitrogen公司)1ul，混匀后，4℃放置1小时。离心2,000g×2min，取上清。加入蛋白A/G琼脂糖珠10ul，和兔抗TSP1多克隆抗体10ul。混匀后，4℃放置过夜。离心2000g×2min，取沉淀。沉淀用PBS反复洗5次后，加入1×样品缓冲液15ul，混匀后置于100℃5分钟。SDS PAGE电泳15％分离胶，5％浓缩胶。电泳条件：100V×10min，200V×50min。电转移至PVDF膜，转移条件：40V×35min。PVDF膜用PBST漂洗后，在室温下用含有5％脱脂奶粉的PBST封闭4小时。加兔抗TSP1多克隆抗体(1∶2000稀释)，4℃过夜。用PBST洗膜3次。加入带有辣根过氧化物酶的鼠抗兔抗体(Invitrogen，1∶2500稀释)，室温放置1小时。PBST洗膜3次。用Super Signal West Femto MaximumSensitivity Substrate(PIERCE，辣根过氧化物酶底物)处理后，压X光片。

结果如图2所示，在小鼠血清中检测到分泌表达的TSP1蛋白。

实施例6：TSP1在肝炎、肝癌病人血清中的检测

用Wester Blot检测病人血清中TSP1蛋白。

样品处理：血清样品2ul，6×样品处理液1.67ul，H₂O 6.33ul。100℃，3分钟。高速离心(13,000rpm，3min)。取上清上样。

SDS-PAGE电泳分析：12％分离胶，4％浓缩胶。

电转移(湿式)到protran膜(Schleicher & Schuell)：400mA 3小时。

膜用PBST漂洗后，在室温下用含有5％脱脂奶粉的PBST封闭4小时。加兔抗TSP1多克隆抗体(1∶500稀释)，4℃16小时。加入带有辣根过氧化物酶的鼠抗兔抗体(Invitrogen，1∶2000稀释)，室温放置1小时。用Super Signal West Femto MaximumSensitivity Substrate(PIERCE，辣根过氧化物酶底物)处理后，压X光片。

结果如图3所示。共检测了肝癌病人血清21例，其中15例检测到TSP1蛋白(阳性率71.4％)；正常人血清3例、HBV阳性的肝炎病人血清16例、卵巢癌病人血清4例、胰腺癌病人血清3例、结肠癌病人血清4例、胃癌病人血清4例、直肠癌病人血清1例、盆腔癌病人血清1例、脑癌病人血清1例，TSP1蛋白检测均为阴性。这表明TSP1是一种特异的分泌性的肝癌标志物。

实施例7

检测试剂盒

在本实施例中，制备检测TSP1的诊断试剂盒，该试剂盒含有200微升实施例4制备的抗TSP1的特异性抗血清以及描述如何使用试剂盒来检测TSP1的说明材料。试剂盒还可含有下组中的一种或多种：用于协助检测的各种标记物或标记试剂；用于杂交的试剂(包括缓冲液等)；采样装置，包括细针头等；以及阳性和阴性杂交对照等。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                                  序列表

<110>上海新世界基因技术开发有限公司

<120>作为肿瘤标志物的肿瘤相关分泌蛋白及其用途

<130>032890

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2978

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(779)..(1402)

<223>

<400>1

ggcttactgc ggaacagcag gttggtgtcc acagcattca gcatctggaa cacggcctgg     60

gggtggtagc agatggtgtg gcctgtgtaa cagacgggca gctggtggct cagggctccc    120

tgtctcctgg ggggctgtag cccacccctg cccctcttca gccccaagct cctcctcatc    180

cacccccttt cctctcttgt gggtggtgag tcagggaggg tcaagggtgc ttgggtgggg    240

gcaggcctgg gggtctttaa gcccggcctc gccctcccac ctatgaagag tgtcacccag    300

gtcttgatgt ggcaggagtg gctgtgcagg tagctgaggg cctgtgacaa gtggatgctg    360

aattcctcct ggctgcgggt catctggccg gaggagagca cacctggctg ggacgggctg    420

ggggccctgg gcataccagg gtcctccagc cccagtttgc cttgcccagc ccctggagct    480

gctatagcag ctgtgtgtga gacgggagtg aatgggggag ccgcaagcct ggtctccccc    540

actccctggc cctgttcctc cccaccgatc ccaggcctct caccaggcag gtccagagga    600

agtggcgggc gctgaggccc ctctcccagg ccagcgtgca gaagagggtg tgcagtagcc    660

gccagcggag cagcacagca cagcggtaga aggtgaactt ggcctgctgc agggacaggc    720

gtggagggtc acccaccgcc tatgtctgag ccctttcccc tagaggccac aggcctcc      778

atg ggc act gga ggc agc ctg ctg tgc ggg tgt tcc ctg gtt ctg tcc     826

Met Gly Thr Gly Gly Ser Leu Leu Cys Gly Cys Ser Leu Val Leu Ser

1               5                   10                  15

tgc ttg tgc ccc tcg gca agc ctc ccc gac cct ggc aac agc acc tgg     874

Cys Leu Cys Pro Ser Ala Ser Leu Pro Asp Pro Gly Asn Ser Thr Trp

            20                  25                  30

ccc ccc gga gcc cag gct ggt ctg ccc gcg gcc ctg gcc ctg ccc ctt     922

Pro Pro Gly Ala Gln Ala Gly Leu Pro Ala Ala Leu Ala Leu Pro Leu

        35                  40                  45

cca cgg ttg ccc cgt atc ctt ttc ccc atg gca ggg aga ccc gcg agg     970

Pro Arg Leu Pro Arg Ile Leu Phe Pro Met Ala Gly Arg Pro Ala Arg

    50                  55                  60

cca agc tct gac ttc gtg ggc tgt gca cag ggc atg tgc tgc cac ggc    1018

Pro Ser Ser Asp Phe Val Gly Cys Ala Gln Gly Met Cys Cys His Gly

65                  70                  75                  80

agg cag ggc aca gtc cat att cac aca agc tct gtg agc tgc tgg acc    1066

Arg Gln Gly Thr Val His Ile His Thr Ser Ser Val Ser Cys Trp Thr

                85                  90                  95

ccc tgc ccc gtt aca ggg act ggg ggc aca gca gtg agc aga aaa gac    1114

Pro Cys Pro Val Thr Gly Thr Gly Gly Thr Ala Val Ser Arg Lys Asp

            100                 105                 110

cgg gtc ctg ccg cat cga cgg caa gtc tcg ctc gca tgc gtg tgc gca    1162

Arg Val Leu Pro His Arg Arg Gln Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Ala

        115                 120                 125

gtg ggg gag cgg gca ggc caa ctg tgg tca cag aaa cca gtg cag atg    1210

Val Gly Glu Arg Ala Gly Gln Leu Trp Ser Gln Lys Pro Val Gln Met

    130                 135                 140

gcc aga ccc tct gcc cgc cac ttg ctg ccc cgt ggg agc tcc ccc aac    1258

Ala Arg Pro Ser Ala Arg His Leu Leu Pro Arg Gly Ser Ser Pro Asn

145                 150                 155                 160

tct cag gca gtg ctg ctg cca tcc gtc tgc ccc gta ccc tgg cct cct    1306

Ser Gln Ala Val Leu Leu Pro Ser Val Cys Pro Val Pro Trp Pro Pro

                165                 170                 175

gtg ggt ccc agc cct ggc caa ggt gaa ggc cta tca cct gcc ttt cct    1354

Val Gly Pro Ser Pro Gly Gln Gly Glu Gly Leu Ser Pro Ala Phe Pro

            180                 185                 190

ggg gtg ggc act gac cgt ggc gac agc tgg gca ttg gtc ctt cag gtg    1402

Gly Val Gly Thr Asp Arg Gly Asp Ser Trp Ala Leu Val Leu Gln Val

        195                 200                 205

taggagcagg ggcaccatgc tctggtgcac ctgggtccgc agccgctcag ctccctgtct    1462

gccatggccg ccaccaggtc cccgaacagt gccatggctg ccgcccgaat cccgtccgct    1522

cctgcaaggc agaggctcag aggcacggcc agacctgtcc aggggtccca gctttggtcc    1582

aagttgggac cccacacctt gtaggggtac aactcagttc tttctgcagg attccttcac    1642

ccaggctctc ggctcccggg gaagggaagg gctggggctc ccccctcaca cagggctctc    1702

tggtgtccct gaggatgtaa gaatcacatc tcccttctac ccacaactgc atcctggcag    1762

cccaggcctc atgaatgcat ttgaggggcg cctatccccc agattcccca gtgaaggaaa    1822

aacagccacg ctaaccgtgc tgacatgtca gaaagcaaat ctgggtaggc tgtcgtgggg    1882

ccggagacca ctgcacttgg agactgaacg tgagaactag ttcagccctg tggagaaggg    1942

gtgagcgcca ggggcccacc cagcccacct gctcagtgcc cacctcaacc gagggccaca    2002

agcgggcagc tccccagggc ctgggcctcc ctgcttgcag cttggggttc cccctttggc    2062

agaggaaggg agctgggttg ggaggagggt cctggagggc gtgagcagga ggtagccccg    2122

ccctgcccca gtgctcacgt cattaaagaa ggagcgtgtg ctgatggcaa cgccgaggct    2182

ctgactccct gtgccctgcg cgcccaggcg gtgcagcgtg tctgacacgg tgcccatgat    2242

gcacacgatc acctggtcgc tgctctggaa gaagccgtcg agcaagggct gcagctgtcc    2302

ctggagcagg cttccctggg ggtggtggcg gctggtgggc ggagagcact aggacccgct    2362

ggccccatgc ccccgcctcg ttctcccact tgaccccctc accccatctg cactgggtgg    2422

gggggtgggg ggtggtgatt cagagctgtg ggtcccggcc tggcccttcc cgccatgggg    2482

agctgtgggt cccggcctgg ccctgcccac cgtggggagc tgtgccccta actgggcttt    2542

gtccaccagg agctgcgtgg tctggacagg gtggcctctt ttcttttttg agacagggtc    2602

tcacactgtc acccaggctg gagtacagtg gtgtgaccat agcttactgc agccttgacc    2662

tcccaggctc aagcaatcct cccaacataa cctcctgagt agctgggtct acagccagtt    2722

ccgtcttctc cacttgattg cgtgtttgca gtgagttcct gagttatcgg gatgaatggt    2782

cagaaagcag tgtgcccacc aatggatgtt tcctgccatt gggcccctta gcagtgactt    2842

gggtgcaaac cagggtgatt tttacaactt ttaaacaagt ttaaagcaac tttgttggct   2902

ttcttagctg tttgctttga aaatattaaa ttcattttca gcaagtgagt cattcaacaa   2962

aaaaaaaaaa aaaaaa                                                   2978

<210>2

<211>208

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Gly Thr Gly Gly Ser Leu Leu Cys Gly Cys Ser Leu Val Leu Ser

1               5                   10                  15

Cys Leu Cys Pro Ser Ala Ser Leu Pro Asp Pro Gly Asn Ser Thr Trp

            20                  25                  30

Pro Pro Gly Ala Gln Ala Gly Leu Pro Ala Ala Leu Ala Leu Pro Leu

        35                  40                  45

Pro Arg Leu Pro Arg Ile Leu Phe Pro Met Ala Gly Arg Pro Ala Arg

    50                  55                  60

Pro Ser Ser Asp Phe Val Gly Cys Ala Gln Gly Met Cys Cys His Gly

65                  70                  75                  80

Arg Gln Gly Thr Val His Ile His Thr Ser Ser Val Ser Cys Trp Thr

                85                  90                  95

Pro Cys Pro Val Thr Gly Thr Gly Gly Thr Ala Val Ser Arg Lys Asp

            100                 105                 110

Arg Val Leu Pro His Arg Arg Gln Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Ala

        115                 120                 125

Val Gly Glu Arg Ala Gly Gln Leu Trp Ser Gln Lys Pro Val Gln Met

    130                 135                 140

Ala Arg Pro Ser Ala Arg His Leu Leu Pro Arg Gly Ser Ser Pro Asn

145                 150                 155                 160

Ser Gln Ala Val Leu Leu Pro Ser Val Cys Pro Val Pro Trp Pro Pro

                165                 170                 175

Val Gly Pro Ser Pro Gly Gln Gly Glu Gly Leu Ser Pro Ala Phe Pro

            180                 185                 190

Gly Val Gly Thr Asp Arg Gly Asp Ser Trp Ala Leu Val Leu Gln Val

        195                 200                 205

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

ggtcttgatg tggcaggagt                                              20

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

gattgacccg aaacaggtgg                                              20

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

gcccgaattc gaccctggca acagcacctg g                                     31

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

gcccaagctt ctacacctga aggaccaatg                                      30

Claims (10)

1.一种分离的人TSP1多肽，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)氨基酸序列如SEQ ID N0：2所示的多肽；

(b)将SEQ ID N0：2氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进肝癌细胞生长的功能的由(a)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽的氨基酸序列选自下组：SEQ ID NO：2中1-208位或26-208位氨基酸序列。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)SEQ ID NO：1中779-1402位的序列；

(b)SEQ ID NO：1中1-2978位的序列；

(c)SEQ ID NO：1中854-1402位的序列。

5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。

7.一种TSP1蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出TSP1蛋白。

8.一种能与权利要求1所述的TSP1蛋白特异性结合的抗体。

9.一种检测样品中是否存在TSP1蛋白的方法，其特征在于，包括：

将样品与TSP1蛋白特异性结合的抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在TSP1蛋白。

10.一种检测肝癌的试剂盒，其特征在于，它含有权利要求8所述的抗体和说明书。

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