CN1632119A - 人lsb基因序列、其编码的多肽、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种在人类肝脏中特异表达并与肝癌密切相关的基因LSB。本发明还提供了该人LSB基因的cDNA编码序列、该序列编码的多肽，以及利用重组技术生产所述的新的人LSB的方法。本发明还提供了这种新的人LSB基因和多肽的应用。

Description

人LSB基因序列、其编码的多肽、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学、分子生物学和基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因和蛋白。更具体地说，本发明涉及一种新的人LSB基因的核酸序列、其编码的多肽以及产生具有LSB蛋白活性的多肽的方法。本发明还提供了这种新的人LSB基因的应用

背景技术

肝脏的恶性肿瘤80％来自于肝细胞，所以肝脏肿瘤多称为肝细胞癌或肝细胞(hepatocellular cancer-HCC or hepatoma)，肝癌是目前世界上比较多见的恶性肿瘤之一。在亚洲它是最常见的肿瘤占所有癌中的20-30％。中国肝癌的发生率又高达45％，而且近年的研究表明，发生率仍有继续上升的趋势。尽管对进展中的肿瘤进行常规手术切除可以延长部分患者的生存期，但是大多数晚期肝癌患者生存机会仍然很小。肝癌已经严重危害了人们的生命健康。

我们知道，肿瘤是多基因突变，多步骤发生的渐进的过程，也就是说肿瘤的发生与肿瘤相关基因(或称致病基因)有很大的关系。比如癌基因(oncogenes)和抑癌基因(tumor suppressor genes)等在肿瘤的发生，发展过程中起到非常重要的作用。目前，世界各国研究人员，在基因表达谱研究的基础上，一方面，详细阐述肝癌发病的分子机制；一方面，投入大量人力继续进行关注单个候选肿瘤相关基因的研究。

本发明中，发明人提供了一种新的人类基因，它在肝脏组织中特异表达，肝癌中高表达，并与伯纳病毒(Borna disease virus)p40蛋白有较高的同源性。该基因被命名为LSB(Liver-Specific and homologous with Borna virus)基因，可以作为肝癌诊断或治疗的靶点。

伯纳病毒是一种嗜神经组织的非片断化、负性、单链病毒，在动物中枢神经系统中以非溶细胞的方式进行复制。伯纳病毒具有比较宽的宿主范围和实验感染动物，而且也可以感染人类，甚至在人的外周血中也可以检测到此类病毒的存在。伯纳病毒有6个开放性阅读框(ORFs)，其中p40蛋白在刺激机体产生免疫反应中起到非常重要的作用(Hausmann J，Schamel K，Staeheli P. J Virol.2001Nov；75(21)：10460-6)；最近有研究表明伯纳病毒的p40蛋白可以直接与HMGB1结合，从而抑制此蛋白的功能(W.Kamitani，Y.Shoya，T.Kobayashi，M.Watanabe，B.J.Lee，G Zhang，K.Tomonaga，and K.Ikuta， J Virol.75：8742-8751，2001)。在此基础之上Tomonaga实验证明伯纳病毒的p40蛋白可以通过干涉HMGB1蛋白的作用来抑制p53介导的转录活性(Zhang G，Kobayashi T，Kamitani W，Komoto S，Yamashita M，Baba S，Yanai H，Ikuta K，Tomonaga K. J Virol.2003Nov；77(22)：12243-51)。

在本发明之前还没有公开或发表过人体中LSB基因的同源基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码一种新的人LSB基因。

本发明的另一目的是提供一种新的蛋白，该蛋白被命名为LSB蛋白。

本发明的再一个目的是提供一种生产所述的新的人LSB蛋白的方法。

本发明还提供了这种新的人LSB基因序列和多肽的应用。

本发明的上述目的是通过如下技术方案来实现的：

在本发明的一个方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包括：编码具有人LSB蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述多核苷酸具有与SEQ ID NO.1中从核苷酸22-840位的核苷酸序列有至少70％同源性的序列；或者所述的多核苷酸具有能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸22-840位的核苷酸序列杂交的序列。较佳地，所述的多核苷酸编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。更佳地，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.1中从核苷酸22-840位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离的LSB蛋白多肽，所述多肽具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。较佳地，所述多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。

在本发明的再一方面，提供了一种载体，所述载体含有上述分离出的多核苷酸。

在本发明的再一方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞是用上述载体转化的宿主细胞。较佳地，所述宿主细胞是大肠杆菌或者所述宿主细胞是真核细胞。

在本发明的再一方面，提供了一种产生具有LSB蛋白活性的多肽的方法，该方法包括如下步骤：

(a)将编码具有LSB蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成LSB蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸22-840位的核苷酸序列有至少70％同源性，较佳地，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸22-840位的核苷酸序列；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成LSB蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达LSB蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有LSB蛋白活性的多肽。

本发明还提供了一种抗体，该抗体能与上述的LSB蛋白多肽特异性结合。

本发明还提供了上述新的人LSB多核苷酸序列的反义序列。这种反义分子可用于抑制细胞内LSB的表达。

本发明还包括一种探针分子，该探针分子通常还有LSB核苷酸序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针分子可用于检测样品中是否存在编码LSB的核酸分子。

本发明还提供了所述的多核苷酸、多肽及抗体在制备治疗肝癌的药物及试剂盒中的应用。

本发明还包括检测LSB核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于LSB多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA，或人工化学合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。单链的DNA可以是编码链或非编码链。

在本发明中，“分离的”多核苷酸是指，该多核苷酸或片断已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该多核苷酸或片断已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。

本发明中，术语“LSB蛋白(或多肽)编码序列”是指编码具有LSB蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1中22-840位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.1序列的编码框22-840位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.1中22-840位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.2所述的序列。该术语还包括在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID NO.1中从核苷酸22-840位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.1中从核苷酸22-840位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。

该术语还包括能编码具有与人LSB相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.1中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常位1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常位60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。

在本发明中，术语“LSB蛋白多肽”是指具有LSB蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人LSB蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括LSB蛋白的活性片断和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与LSB DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗LSB多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含LSB多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了LSB多肽的可溶性片段。通常，该片段具有LSB多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供LSB蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然LSB多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞和哺乳动物细胞。

另一方面，本发明还包括对LSB DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的抗体，尤其是单克隆抗体。这里“特异性”是指抗体能结合于LSB基因产物或片段。较佳地，指那些能与LSB基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制LSB蛋白的分子，也包括那些并不影响LSB蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的LSB基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利NO.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的LSB基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达LSB或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断LSB功能的抗体以及不影响LSB功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用LSB基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得，这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与LSB基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

本发明的LSB核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列，这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当然，也可通过先合成多个小片段，然后再进行连接而获得序列很长的片段。

根据同源比较的结果，本发明的核苷酸序列及其编码的蛋白质序列与伯纳病毒的P40蛋白显示了显著的同源性。而且，本发明中新的人LSB基因是在人类肝脏中特异表达，并在肝癌中高表达，与肝癌的发生密切相关，是一个新的候选病毒癌基因。本发明的人LSB基因可用于制备诊断或治疗肝癌的药物或试剂盒。

附图说明

图1为本发明的人LSB的编码蛋白质与伯纳病毒P40蛋白的同源比较图。

图2为本发明的人LSB基因在人12种组织中的表达谱结果图。其中，以在各组织中均有表达的结构蛋白Beta-actin作为内对照，结果显示1.3Kb的剪切本在人体肝组织中有表达，而其它组织中几乎均没有表达。

图3为利用RNA印渍实验检测人LSB基因在6对肝癌和癌旁组织中的表达差异图。其中，N代表癌旁组织、C则代表肝癌组织，以组织中28s的核糖体RNA作对照。结果显示有4对样本中LSB在肝癌组织中有高表达的趋势。

图4为利用RT-PCR技术检测LSB基因在18对肝癌和癌旁组织中的表达差异结果图。其中，N代表癌旁组织、C则代表肝癌组织。检测样本中结构蛋白Beta-actin基因作为内对照。结果显示有12对样本中LSB在肝癌组织中高表达，其中LSB基因在7对样本中的表达为有和无的形式。

图5为构建LSB与GST融合蛋白原核表达载体在BL21大肠杆菌中的表达后的电泳鉴定图。其中，“对照”是未经IPTG诱导的，LSB为IPTG诱导后的结果，与“标记”比对可以发现在56KD处出现一明显的蛋白表达条带(箭头所指的位置)。

图6为构建LSB与GFP融合蛋白真核表达载体在Hela及293细胞株中的表达状况图。其中，从上至下，第一排是暗视野的结果；第二排是LSB与GFP融合基因在两种细胞中的表达，可以发现LSB基因的表达产物均定位于细胞浆的内膜处；第三排为对照组GFP基因在两种细胞中的表达，GFP表达产物弥散于细胞各处。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

LSB基因的克隆

实验标本来源外科手术切除的肝癌及其癌旁组织。手术标本一经离体立即置于液氮中冷冻保存备用。注意所有癌标本尽可能取癌中心的非坏死区。所有标本同时经病理学证实。取出组织，用研钵研碎，加入盛有裂解液的50ml管，充分振荡后，再移入玻璃匀浆器内。匀浆后移至50ml新管，抽提总RNA(TRIzolReagents，Gibco，NY，USA)，从而得到肝库总RNA。

以寡核苷酸R1：5’-ATGGGTTATTTTCTTAAATTG-3’(SEQ ID NO.3)为正向引物，寡核苷酸R2：5’-TGCCAAGAAAGCACAGATGA-3’(SEQ ID NO.4)为反向引物，以肝库总RNA为模板，进行RT-PCR扩增，R1/R2的PCR条件为94℃5分钟，随之以94℃30秒、57℃30秒和72℃1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，获得扩增片段长度为1276bp，经测序确证无误，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放阅读框位于22-840位核苷酸。

根据得到的全长cDNA序列推导出LSB的氨基酸序列，共272个氨基酸，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.2。

实施例2

人LSB基因的序列信息与同源性分析

本发明新的人LSB全长cDNA的长度为1276bp，详细序列见SEQ ID NO.1，其中开放读框位于22-840位核苷酸。根据全长cDNA推导出人LSB的氨基酸序列，共272个氨基酸残基，氨基酸序列详见SEQ ID NO.2，分子量30564,61，pI为9.2。

将人LSB的全长cDNA序列及其编码蛋白质用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸和蛋白质同源性检索，结果发现它与伯纳病毒(Borna disease virus)的P40蛋白具有较高的同源性。(参见附图1)。

实施例3

人LSB蛋白的结构和功能研究

将人LSB蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)在PROSITE数据中(http：//www.expasy.org/prosite/)检索基序(motif)，发现在氨基酸序列(SEQ ID NO.2)中，存在以下功能基序：

(1)糖基化位点(N-linked glycosylation site)：195-197

(2)蛋白激酶C磷酸化位点(Protein kinase C phosphorylation site)：24-2628-30 80-82 146-148 198-200 244-246

(3)酪蛋白激酶II磷酸化位点(Casein kinase II phosphorylation site)：59-6296-99 109-112 223-226

(4)N-豆蔻酰化位点(N-myristoylation site)：135-140 161-166 176-181192-197

(5)环磷酰胺磷酸化位点(cAMP-and cGMP-dependent protein kinasephosphorylation site)：52-55 269-272

而糖基化位点、N-豆蔻酰化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点以及环磷酰胺磷酸化位点均与翻译后修饰(post-translationalmodifications)有关。

实施例4

人LSB基因的组织表达谱

表达谱：采用northern blot杂交的方法，从clontech生物公司购买商业化的人的12种组织表达谱(脑、心、骨胳肌、结肠、胸腺、脾、肾、肝、小肠、胎盘、外周血)的膜，用LSB基因片断为模板，以随机引物合成同位素32p-dCTP掺入的检测探针，杂交结果显示1.3kb的该基因转录本只在肝脏中特异表达。在其它组织中均不表达(参见附图2)。这一结果进一步证明LSB基因在肝脏中发挥着重要的作用。

LSB基因在肝癌及癌旁组织中的表达差异是：采用northern blot杂交的方法，分别取肝癌及癌旁组织的总RNA20μg进行变性胶电泳分离RNA，随后将胶上的RNA转到杂交专用的尼龙膜上，用LSB基因片断为模板，以随机引物合成同位素32p-dCTP掺入的检测探针，进行杂交。结果显示，LSB在肝癌组织中有上调的趋势(参见附图3)。

为了证实这种差异的普遍性，继续采用RT-PCR的方法来验证。随机选取18对肝癌和癌旁组织的RNA经逆转录酶反转录为cDNA作为扩增模板，以R1：5’-ATGGGTTATTTTCTTAAATTG-3’(SEQ ID NO.3)为正向引物，R2：5’-TGCCAAGAAAGCACAGATGA-3’(SEQ ID NO.4)为反向引物，进行RT-PCR扩增，条件为94℃5分钟，随之以94℃30秒、55℃30秒和72℃1分钟进行30个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物。同时以结构蛋白beta-actin基因作为内参。结果显示，LSB基因在癌组织中上调率为78％，同时在正常组织和胎肝中均有表达(参见附图4)。为了保证肝癌标本的准确性，所有标本均检测目前国际上公认的在肝癌中普遍性升高的甲胎蛋白，可以看到二者有明显的一致性。

实施例5

人LSB多肽的制备和提纯

在该实施例中，将全长的人LSB编码序列或片段构建入商品化的蛋白质融合表达载体之中，以表达和提纯重组蛋白。

(1)原核表达载体的构建，以及转化大肠杆菌

我们所用的表达载体是pGEX-5x载体(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其抗性为氨苄青霉素(Amp)。选用分别带EcoRI和Xhol I酶切位点且能扩增出完整编码阅读框的正反引物：5’-GGA ATT CCA ATG GGT TAT TTT CTT AAA TTGTAT GC-3’(SEQ ID NO.5)和5’-CCG CTC GAG CGG AAC TTG ACT TGC GTAGCT TGT GT-3’(SEQ ID NO.6)，以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将人LSB基因克隆至pGEX-5x载体。

经测序鉴定好的表达载体利用电转化方法转入大肠杆菌DH5α，利用表达载体的抗性筛选鉴定得到含有pGEX-5x-LSB表达载体的工程菌DH5α-pGEX-5x-LSB。

(2)表达GST-LSB重组蛋白的工程菌的分离鉴定

挑取单菌落的DH5α-pGEX-5x-LSB工程菌于3ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中振摇培养过夜，按1∶100的浓度吸取培养液于新的LB培养基(含100μg/ml氨苄青霉素)中培养约3小时，至OD₆₀₀达0.5后，加入IPTG至终浓度1mmol/L继续于37℃分别培养0、1、2、3小时。取培养时间不同的1ml菌液离心，在细菌沉淀物中加入裂解液(2×SDS上样缓冲液50μl，蒸馏水45μl，二巯基乙醇5μl)，混悬细菌沉淀，沸水浴中煮5分钟，10000rpm离心1分钟，上清加入12％SDS-PAGE胶中电泳。染色后观察预期分子量大小的蛋白量随IPTG诱导时间增加而增加的菌株即为表达pGEX-5x-LSB融合蛋白的工程菌。

(3)GST-LSB融合蛋白的提取纯化

按上述方法诱导表达pGEX-5x-LSB融合表达蛋白的工程菌DH5α-pGEX-5x-LSB。诱导后的细菌离心沉淀，按每400ml菌加入20ml PBS重悬细菌，超声破碎细菌。破菌完全的超声液按每毫升加入20微升的量加入PBS饱和的50％谷胱苷肽Sepharose 4B，37℃振摇结合30分钟，10000rpm离心10分钟沉淀结合了GST-LSB的谷胱苷肽Sepharose 4B，弃上清。按每毫升超声液所得沉淀加入100μl PBS的量清洗两次，而后按每毫升超声液所得沉淀加入10μl还原型谷胱苷肽洗脱液，室温置10分钟，10000rpm离心10分钟，上清即为洗脱的融合蛋白。重复洗脱两次。洗脱的上清保存于-80℃，并进行SDS-PAGE电泳，检测纯化效果。在大约56kDa处的蛋白质条带即为人LSB蛋白(参见附图5)。

实施例6

人LSB蛋白或多肽在细胞株中进行真核细胞表达

根据人LSB的全长编码序列，设计扩增出完整编码阅读框的正反引物：

5’-CCGAATTCTGATGGGTTATTTTCTTAAATTG-3’(SEQ ID NO.7)和

5’-CGGGATCCCGTCTGTGCTTTCTTGGCA-3’(SEQ ID NO.8)。并在正反引物上分别引入限制性内切酶位点，在起始密码子ATG前加入了EcoR I位点；去掉目的基因的终止密码子TGA(融合基因共用GFP的终止子)，然后在下游引物5’端加入BamH I位点。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将人LSB cDNA克隆至绿色荧光蛋白载体(green fluorescent protein，GFP)。鉴定好的表达载体3μg，脂质体(Gibco-BRL，NY)15μl，加入1ml无血清DMEM培养基中，振荡15秒混匀，室温孵育30分钟备用。分别取1ml(2×10⁶)人胚肾(293)及宫颈癌细胞株(Hela)的细胞悬液于60mm组织培养板中，贴壁1小时后换转染培养基，室温孵育15分钟后弃培养基，分别加入前面制备好的DNA载体转染混合物，蜡膜密封培养板，于室温27℃振摇培养4小时，而后换完全培养基培养48小时，荧光显微镜观察结果。结果显示，LSB基因弱表达于细胞浆的内膜处(参见附图6)。

实施例7

制备抗体

将实施例5和6中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组蛋白用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀LSB基因翻译产物的能力加以评估。

                             序列表

<110>上海人类基因组研究中心

<120>人LSB基因序列、其编码的多肽、制备方法及应用

<160>8

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1276

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(22)..(840)

<400>1

gtcaagtcat agcgactaat a atg ggt tat ttt ctt aaa ttg tat gct tat     51

                        Met Gly Tyr Phe Leu Lys Leu Tyr Ala Tyr

                        1               5                   10

gtt aat tct cac agt ctt ttt gtt tgg gtc tgt gac aga tct tac aaa     99

Val Asn Ser His Ser Leu Phe Val Trp Val Cys Asp Arg Ser Tyr Lys

                15                  20                  25

aga tct ttt aga cct atg att ctt aac aaa att aaa gaa tta agt cgg    147

Arg Ser Phe Arg Pro Met Ile Leu Asn Lys Ile Lys Glu Leu Ser Arg

            30                  35                  40

aac caa ttt tcc aca atg tct cat cta aga aag gac tca cag ccc agc    195

Asn Gln Phe Ser Thr Met Ser His Leu Arg Lys Asp Ser Gln Pro Ser

        45                  50                  55

agc cca gga gat gac gca atg gac agg agt ggg ctc cct gac ctt caa    243

Ser Pro Gly Asp Asp Ala Met Asp Arg Ser Gly Leu Pro Asp Leu Gln

    60                  65                  70

gga aga ttt gag cta tct ggg aaa aac aga cag tat cca ctg gat gca    291

Gly Arg Phe Glu Leu Ser Gly Lys Asn Arg Gln Tyr Pro Leu Asp Ala

75                  80                  85                  90

ttg gaa ccc caa ccc agc att ggg gat att aag gac att aaa aaa gca    339

Leu Glu Pro Gln Pro Ser Ile Gly Asp Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala

                95                  100                 105

gcc aag tct atg cta gac cca gca cat aaa tct cat ttc cac cct gtg    387

Ala Lys Ser Met Leu Asp Pro Ala His Lys Ser His Phe His Pro Val

            110                 115                 120

acc cca agt tta gta ttc ttg tgt ttc ata ttt gat ggg tta cac cag    435

Thr Pro Ser Leu Val Phe Leu Cys Phe Ile Phe Asp Gly Leu His Gln

        125                 130                 135

gca tta ctg agt gtt ggt gtg agc aag agg tct aat act gtg gtt ggg    483

Ala Leu Leu Ser Val Gly Val Ser Lys Arg Ser Asn Thr Val Val Gly

    140                 145                 150

aat gag aac gag gaa agg ggt act cct tat gct agc aga ttc aaa gat    531

Asn Glu Asn Glu Glu Arg Gly Thr Pro Tyr Ala Ser Arg Phe Lys Asp

155                 160                 165                 170

atg cct aac ttt att gcc ctt gag aag tca tca gtt ctc cgc cac tgc    579

Met Pro Asn Phe Ile Ala Leu Glu Lys Ser Ser Val Leu Arg His Cys

                175                 180                 185

tgt gac ctt ttg ata ggc att gcg gct gga tca agt gat aag att tgc    627

Cys Asp Leu Leu Ile Gly Ile Ala Ala Gly Ser Ser Asp Lys Ile Cys

            190                 195                 200

acc agc agt ctc caa gtt cag aga cga ttc aag gca atg atg gca tct    675

Thr Ser Ser Leu Gln Val Gln Arg Arg Phe Lys Ala Met Met Ala Ser

        205                 210                 215

att gga aga ctt tca cat ggt gag agt gct gat ctg cta atc agc tgc    723

Ile Gly Arg Leu Ser His Gly Glu Ser Ala Asp Leu Leu Ile Ser Cys

    220                 225                 230

aat gca gaa tca gcc ata ggt tgg atc agc tca aga ccg tgg gtt gga    771

Asn Ala Glu Ser Ala Ile Gly Trp Ile Ser Ser Arg Pro Trp Val Gly

235                 240                 245                 250

gaa tta atg ttc aca ctt cta ttt gga gac ttt gaa tcc cct cta cac    819

Glu Leu Met Phe Thr Leu Leu Phe Gly Asp Phe Glu Ser Pro Leu His

                255                 260                 265

aag cta cgc aag tca agt tag ttgccaagaa agcacagatg acaacctatt       870

Lys Leu Arg Lys Ser Ser

            270

aatgctgtga gaatgtttct agatcagtgc atggatggct ccattgctct acgggccatt    930

gtgtctgaga tcccagtctt tgaggagaaa aaaaacaatg gttaaaaagg cattggggaa    990

atattttgag tttgggggtg tactttgcca ccccattatt ggggagctgt caccacgaat   1050

gttcccaaac ttagcaacag cggcaaacta ctgggccaag atgagcaacc ccacattttt   1110

gggatttaaa gctcctgatg ttataccagg atcaaccatc acactccctt tgcttcaaat   1170

ggcatctacc ccgtaagatc ttgagggggg agtgttgggt ggaatcatag atccatgcac   1230

tcctaacatg aactaattct cattatttaa aaaaaaaaaa aaaaaa                  1276

<210>2

<211>272

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Gly Tyr Phe Leu Lys Leu Tyr Ala Tyr Val Asn Ser His Ser Leu

1               5                   10                  15

Phe Val Trp Val Cys Asp Arg Ser Tyr Lys Arg Ser Phe Arg Pro Met

            20                  25                  30

Ile Leu Asn Lys Ile Lys Glu Leu Ser Arg Asn Gln Phe Ser Thr Met

        35                  40                  45

Ser His Leu Arg Lys Asp Ser Gln Pro Ser Ser Pro Gly Asp Asp Ala

    50                  55                  60

Met Asp Arg Ser Gly Leu Pro Asp Leu Gln Gly Arg Phe Glu Leu Ser

65                  70                  75                  80

Gly Lys Asn Arg Gln Tyr Pro Leu Asp Ala Leu Glu Pro Gln Pro Ser

                85                  90                  95

Ile Gly Asp Ile Lys Asp Ile Lys Lys Ala Ala Lys Ser Met Leu Asp

            100                 105                 110

Pro Ala His Lys Ser His Phe His Pro Val Thr Pro Ser Leu Val Phe

        115                 120                 125

Leu Cys Phe Ile Phe Asp Gly Leu His Gln Ala Leu Leu Ser Val Gly

    130                 135                 140

Val Ser Lys Arg Ser Asn Thr Val Val Gly Asn Glu Asn Glu Glu Arg

145                 150                 155                 160

Gly Thr Pro Tyr Ala Ser Arg Phe Lys Asp Met Pro Asn Phe Ile Ala

                165                 170                 175

Leu Glu Lys Ser Ser Val Leu Arg His Cys Cys Asp Leu Leu Ile Gly

            180                 185                 190

Ile Ala Ala Gly Ser Ser Asp Lys Ile Cys Thr Ser Ser Leu Gln Val

        195                 200                 205

Gln Arg Arg Phe Lys Ala Met Met Ala Ser Ile Gly Arg Leu Ser His

    210                 215                 220

Gly Glu Ser Ala Asp Leu Leu Ile Ser Cys Asn Ala Glu Ser Ala Ile

225                 230                 235                 240

Gly Trp Ile Ser Set Arg Pro Trp Val Gly Glu Leu Met Phe Thr Leu

                245                 250                 255

Leu Phe Gly Asp Phe Glu Ser Pro Leu His Lys Leu Arg Lys Ser Ser

            260                 265                 270

<210>3

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

atgggttatt ttcttaaatt g                                               21

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

tgccaagaaa gcacagatga                                                 20

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

ggaattccaa tgggttattt tcttaaattg tatgc                                35

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

ccgctcgagc ggaacttgac ttgcgtagct tgtgt                                35

<210>7

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

ccgaattctg atgggttatt ttcttaaatt g                                    31

<210>8

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>8

cgggatcccg tctgtgcttt cttggca                                         27

Claims (18)

1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包括：编码具有人LSB蛋白活性的多肽的核苷酸序列，

所述多核苷酸具有与SEQ ID NO.1中从核苷酸22-840位的核苷酸序列有至少70％同源性的序列；或者

所述的多核苷酸具有能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸22-840位的核苷酸序列杂交的序列。

2.如权利要求1所述的一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.2所示的序列。

3.如权利要求1所述的一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO.1中从核苷酸22-840位的核苷酸序列。

4.一种分离的LSB蛋白多肽，其特征在于，所述多肽具有与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少70％同源性的序列。

5.如权利要求4所述的一种分离的LSB蛋白多肽，其特征在于，所述多肽是具有SEQ ID NO.2序列的多肽。

6.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的分离的多核苷酸。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。

8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是大肠杆菌。

9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述细胞是真核细胞。

10.一种产生具有LSB蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(a)将编码具有LSB蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成LSB蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸22-840位的核苷酸序列有至少70％同源性；

(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成LSB蛋白的重组细胞；

(c)在适合表达LSB蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；

(d)分离出具有LSB蛋白活性的多肽。

11.如权利要求10所述的一种产生具有LSB蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO.1中从核苷酸22-840位的核苷酸序列。

12.一种抗体，其特征在于，所述抗体是能与权利要求4所述的LSB蛋白多肽特异性结合的抗体。

13.一种核苷酸分子，其特征在于，所述核苷酸分子是权利要求1所述的多核苷酸的反义序列。

14.一种探针分子，其特征在于，所述的探针分子含有权利要求1所述的多核苷酸中约8-100个连续的核苷酸。

15.权利要求4的多肽在制备治疗肝癌的药物中的应用。

16.权利要求1的多核苷酸在制备治疗肝癌的药物中的应用。

17.一种用于诊断和治疗肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2的多核苷酸或其连续片断。

18.一种用于诊断和治疗肝癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求12的抗体。

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