CN1172954C - 肝癌高表达基因、其编码的蛋白hcca2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新的人HCCA2蛋白，编码此多肽的多核苷酸和经重组技术产生这种多肽的方法。本发明还公开了此多肽的药物组合物用于治疗肝癌等多种疾病的方法。本发明还公开了HCCA2蛋白特异性抗体的制备方法以及该抗体用于疾病诊断和治疗等多种用途。本发明还公开了编码这种新的人HCCA2蛋白的多核苷酸的用途。

Description

肝癌高表达基因、其编码的蛋白HCCA2及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的编码人HCCA2蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸编码的多肽。本发明还涉及此多核苷酸和多肽及其特异性抗体的用途和制备。具体地说，本发明的HCCA2蛋白是一种新的在肝癌中高表达的蛋白。

背景技术

1986年著名生物学家诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco在Science杂志上率先提出“人类基因组计划”(Human Genomic Project，简称HGP)，该建议的提出引发了科学界长达三年的激烈争论。1990年10月美国政府决定出资30亿美元正式启动“人类基因组计划”，预期到2005年拿到人体的全部基因序列(共约30亿个核苷酸全序列)；随后研究其相互作用和基因功能，从而揭开人类全部遗传信息之谜，使人类对自身的认识达到一个新的高度。

人类基因组计划可以说是人类有史以来最为伟大的认识自身的世纪工程之一。1997年底，有人提出HGP的最终目标应该是提供生物学周期表，这个周期表的“元素”就是决定人类一切性状的10-14万个基因。完成30亿个碱基的测序只不过为这个目标打下了结构上的基础(即结构基因组学)，而比较基因组学(包括其编码的蛋白质)和整个基因组的功能研究(功能基因组学)在基因组的价值发现上才能直接发挥其重要作用。随着基因组学的发展，人们设计和创造了许多重要的生物分子，广泛用于制药、农业、食品、化工、化妆品、环境、能源等各领域，不仅会推动科学的进步，还将产生惊人的经济效益，从而引发产业革命，以基因组学为基础的生命科学工业已经形成。人类有限的基因资源正在做着一次性分配，获取基因效率最高和数量最多的企业，有望利用其基因专利来垄断未来生物和制药工业市场。比尔.盖茨曾说：下一个创造出更大财富的人将出现在基因领域。

随着基因组计划的迅猛发展，攻克包括肝癌在内的恶性肿瘤在不久的将来将成为现实。我国是原发性肝细胞肝癌(primary hepatocellular carcinoma，HCC)的高发地区，其死亡率已占我国部分农村和城市的第一、二位，是严重影响我国人民健康的重大疾病，每年世界上有38.6万人死于肝癌，而其中的45％是在中国。目前认为，肝癌的发生、发展，亦和其它恶性肿瘤一样，是多基因、多因素参与的复杂过程，包括体细胞基因突变、抑癌基因的丢失、癌基因的激活和过表达等等，许多癌基因、抑癌基因，及相关基因的异常激活或失活是肝癌发生的分子基础。从理论上讲，应该有更多的基因参与其中，但目前已发现的许多基因，其详尽功能仍不十分清楚。目前已证明与人类肝癌相关的癌基因或异常表达基因包括：pTEN、p21、p27、p73、p15、p53、RB1、APC、nm23、P16、MXR7、IGF-I、TGFα、HGF-R(c-met)/HGF、c-fms(CSF-IR)、c-erbB-1(EGF-R)/c-erbB-2(neu)、Ras、Raf、c-myc、c-ets-2等等，但没有一个为肝癌特异性表达基因，因此，寻找新的肝癌异常表达或缺失基因，从基因水平认识肝细胞的生长、分化、再生和癌变的分子机理，并阐明其信号传递过程与途径，不仅有重要的生物学意义，而且对于肝癌的早期基因诊断和信息治疗，均具有重大的临床应用意义和经济开发价值，在人类基因组的研究中也能占领新的制高点。

随着分子生物学技术的迅猛发展，寻找、分离基因的新方法不断出现，主要有以下四种：1、从cDNA或mRNA出发的方法：利用细胞基因表达的差异来分离致病基因是一类重要方法，目前进展较快。包括cDNA消减杂交法、mRNA差异显示技术、EST(Expressed sequence tags)差异杂交筛选等；2、从分析蛋白质入手：根据蛋白的位置、结合特点或部分功能出发，先分离所需蛋白，再得到相应的基因。包括免疫沉淀法、双向电泳法、酵母双杂交系统法等；3、从寻找基因组DNA片段出发：寻找到与目标基因座位紧密连锁的遗传标记或部分功能信息，从而确定某性状相关的基因在基因组中某区段的位置，然后再利用不同方法找到该区段染色体内的表达序列，最终克隆到目的基因。包括复杂探针筛库法、Northern杂交法、剪接位点筛选法、CpG岛筛选法、种间同源序列杂交法、PCR直选法、外显子捕获、一致序列克隆法等；4、从全基因组出发：根据有关基因的效应直接分离该基因的克隆，而不必事先探知其生化功能或图谱定位，也不需要假设基因的数目或其相互作用方式，包括基因组错配扫描及代表性差别分析等。上述寻找新基因的方法各有利弊，使用哪一种方法，应根据各自实验室的条件与优势，扬长避短，采取切实可行的方法。

1992年美国学者Liang Peng等(Liang P，Pardee AB.Differential display of eukaryoticmessenger RNA by means of polymerase chain reaction.Science，1992：257(5072)：967-971)首次应用mRNA差别显示技术分离和鉴定不同组织和细胞间的基因表达，使用该方法，人们已经发现了大量的未知基因，如Liang等(Liang P，Averboukh L，Khandan K，et al.Differential display and cloning of messenger RNAs from human breast cancer versusmammany epithelial cell.Cancer Res，1992；52(24)：6966-6968)用该方法比较正常乳腺和乳腺癌的mRNA，发现了全长600bp的S1基因；Chen等(Chen SL，Maroulakou IG，Green JE，et al.Isolation and characterization of novel gene expressed in multiple cancers.Oncogene，1996：12(4)：741-751)用该方法发现了一个新基因N8，全长2.4kb，定位于8q13染色体上，在肺癌组织中过表达；日本学者Shibabara等(Shibahara K；Asano M；Ishida Y；Aoki T；Koike T；Honjo T.Isolation of a novel mouse gene MA-3 that is induced upon programmedcell death.Gene，1995 Dec，166(2)：297-301)用该方法分离到一个引起细胞程序性死亡的新基因MA-3，等等。但是DDPCR技术目前尚存在一些不足，近年来虽然一些学者已在这方面做了许多改进，如引物设计的合理性、如何减少假阳性等，但仍需不断完善，相信DDPCR技术的不断完善，将会在生命科学领域中成为十分有用的工具。

因此，为治疗和诊断目的研究和开发在肝癌中高表达的基因和/或蛋白具有重要意义。本领域迫切需要新的在肝癌中高表达的基因和/或蛋白。目前尚未见有HCCA2基因cDNA序列或氨基酸序列的报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的、在肝癌中高表达的人HCCA2蛋白(protein ofhepatocellular carcinoma susceptible gene 2，简称为“HCCA2蛋白”)多肽以及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途。

本发明人应用DDPCR法(Liang P，et al.Science，1992：257：967)从肝癌组织中获得一基因片段，进而通过基因克隆技术克隆了一个与HCC正相关新基因全长cDNA序列，该基因序列与原发性肝细胞肝癌(HCC)高度相关。令人感兴趣的是该基因在肝癌中的表达高达79.07％，而癌旁肝组织不表达或表达极低。该基因编码一467个氨基酸的蛋白质，定位于细胞浆。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的HCCA2蛋白多肽，该多肽是人源的，它包含：具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少85％相同性：(a)编码上述人HCCA2蛋白多肽的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：(a)具有SEQ ID NO：1中891-2291位的序列；和(b)具有SEQ ID NO：1中1-2520位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备具有人HCCA2蛋白活性的多肽的方法，该方法包含：(a)在适合表达人HCCA2蛋白的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出具有人HCCA2蛋白活性的多肽。

在本发明的第五方面，提供了与上述的人HCCA2多肽特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-2520个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了模拟、促进、拮抗人HCCA2多肽活性的化合物，以及抑制人HCCA2多肽的表达的化合物。还提供了筛选和/或制备这些化合物的方法。较佳地，该化合物是人HCCA2多肽的编码序列或其片段的反义序列。

在本发明的第七方面，提供了检测样品中是否存在HCCA2蛋白的方法，它包括：将样品与HCCA2蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在HCCA2蛋白。

在本发明的第八方面，提供了一种检测与人HCCA2多肽异常表达相关的疾病或疾病易感性的方法，该方法包括：检测编码所述多肽的核酸序列中是否存在突变。

在本发明的第九方面，提供了本发明多肽和编码序列的用途。例如本发明多肽可被用于筛选促进人HCCA2多肽活性的激动剂，或者筛选抑制人HCCA2多肽活性的拮抗剂、或者被用于肽指纹图谱鉴定。本发明的人HCCA2蛋白的编码序列或其片段，可被作为引物用于PCR扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列。

在本发明的第十方面，提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明的人HCCA2多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体。这些药物组合物可治疗肿瘤等病症。

本发明其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下列附图用于说明本发明具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了本发明人HCCA2蛋白的氨基酸序列及其编码序列，其中氨基酸序列采用标准的氨基酸单字母缩写。全长HCCA2蛋白是467个氨基酸(不包括终止密码子)。

图2显示了HCCA2基因在肝癌(K)、癌旁组织(L)内的Northern印迹杂交和相应RNA甲醛变性电泳结果。

图3显示了HCCA2在正常组织中Northern印迹杂交和相应RNA甲醛变性电泳结果。其中各泳道为1：小肠；2：肌肉；3：肺；4：肝；5：胰腺；6：脑组织；7：胃；8：脾脏；9：大肠；10：心脏组织。

图4显示了HCCA2基因编码区C端GST融合蛋白在XL1-Blue菌中的表达。其中各泳道是：5：蛋白Marker；1-4：导入宿主菌BL-21；5-8：导入宿主菌XL1-Blue；1和9：导入空载体后不加IPTG诱导；2和8：导入空载体后加IPTG诱导；3和6：导入含目的基因的重组载体后不加IPTG诱导；4和7：导入含目的基因的重组载体后加IPTG诱导。

图5显示了Western杂交检测HCCA2基因在293细胞中的过表达。泳道1为导入pcDNA3空载体；泳道2为导入含HCCA2基因的重组载体。

图6显示了HCCA2蛋白的免疫组化染色结果。

具体实施方式

在本发明中，术语“HCCA2蛋白”、“HCCA2多肽”或“肝癌高表达蛋白HCCA2”等可互换使用，都指具有人肝癌高表达蛋白HCCA2氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的蛋白或多肽。该术语包括含有或不含起始甲硫氨酸的肝癌高表达蛋白HCCA2。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的HCCA2蛋白或多肽”是指HCCA2多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化HCCA2蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。HCCA2多肽的纯度能用氨基酸序列分析。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括人HCCA2蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然人HCCA2蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“人HCCA2多肽”指具有人HCCA2蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。该术语还包括具有与人HCCA2蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人HCCA2蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与人HCCA2 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人HCCA2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人HCCA2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了人HCCA2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人HCCA2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供人HCCA2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人HCCA2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“人HCCA2蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：2的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

                   表1

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：2的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：2的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地至少85％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸所编码的多肽与SEQ ID NO：2所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码HCCA2蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的人HCCA2核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；230：1350-1354)被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或HCCA2蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的HCCA2多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人HCCA2多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，人HCCA2多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56：125)；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体(Lee and Nathans，J Bio Chem.263：3521，1988)和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人HCCA2编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的人HCCA2蛋白或多肽有多方面的用途。这些用途包括(但不限于)：直接做为药物治疗HCCA2蛋白功能低下或丧失所致的疾病，和用于筛选促进或对抗HCCA2蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组人HCCA2蛋白筛选多肽库可用于寻找有治疗价值的能抑制或刺激人HCCA2蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对人HCCA2 DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人HCCA2基因产物或片段。较佳地，指那些能与人HCCA2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人HCCA2蛋白的分子，也包括那些并不影响人HCCA2蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人HCCA2基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人HCCA2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人HCCA2蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人HCCA2蛋白功能的抗体以及不影响人HCCA2蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人HCCA2基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人HCCA2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人HCCA2蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测活检标本中的人HCCA2蛋白。此外，与人HCCA2蛋白结合的单克隆抗体也可用放射性同位素标记，注入体内可跟踪其位置和分布。这种放射性标记的抗体可作为一种非创伤性诊断方法用于肿瘤细胞的定位和判断是否有转移。

本发明中的抗体可用于治疗或预防与人HCCA2蛋白相关的疾病。由于HCCA2为胞内蛋白，富含脯氨酸，含有蛋白质-蛋白质相互作用结构域和磷酸化修饰位点，HCCA2很可能是细胞信号传导链中的重要一环，给予适当剂量的抗体可以阻断人HCCA2蛋白的活性及其信号传导而达到治疗目的，这就是新型的癌症治疗方法——“信息治疗”。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如人HCCA2蛋白高亲和性的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭人HCCA2蛋白阳性的细胞(例如肝癌细胞等)。由于本发明的HCCA2蛋白在肝癌细胞中是特异性高表达的，这种杂交抗体可用于定向地杀灭肝癌细胞。

多克隆抗体的生产可用人HCCA2蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

利用本发明蛋白及其抗体，通过各种常规筛选方法，可筛选出与HCCA2蛋白发生相互作用的物质，如与其功能密切相关的相互作用蛋白、抑制剂、激动剂或拮抗剂等。

本发明蛋白及其抗体、抑制剂、激动剂、拮抗剂或其作用蛋白等，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明的多肽可直接用于疾病治疗，如那些在脑和肺等组织中表达低下而导致某些疾病状态的治疗，而该多肽的拮抗剂可用于肿瘤尤其是肝癌方面的治疗。在使用本发明HCCA2蛋白时，还可同时使用其他治疗剂，如IFN-α、IFN-β、TNF-α、TNF-β等。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明HCCA2多肽或其激动剂、拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的HCCA2蛋白或其拮抗剂、激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

人HCCA2蛋白的多聚核苷酸也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于HCCA2蛋白的无表达或异常/无活性的HCCA2蛋白的表达所致的细胞增殖、发育或代谢异常。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成表达变异的HCCA2蛋白(尤其是改变其蛋白质-蛋白质相互作用结构域和磷酸化修饰位点)，以抑制(或竞争性抑制)内源性的HCCA2蛋白活性而阻止HCCA2的细胞内信号传导。来源于病毒的表达载体如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、单纯疱疹病毒、细小病毒等可用于将HCCA2基因转移至细胞内。构建携带HCCA2基因的重组病毒载体的方法可见于已有文献(Sambrook，et al.“分子克隆”)。另外重组人HCCA2基因可包装到脂质体中，然后再转移至细胞内。

抑制人HCCA2 mRNA的寡聚核苷酸(包括反义RNA和DNA)以及核酶也在本发明的范围之内。核酶是一种能特异性分解特定RNA的酶样RNA分子，其作用机制是核酶分子与互补的靶RNA特异性杂交后进行核酸内切作用。反义的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技术获得，如固相磷酸酰胺化学合成法合成寡核苷酸的技术已广泛应用。反义RNA分子可通过编码该RNA的DNA序列在体外或体内转录获得。这种DNA序列已整合到载体的RNA聚合酶启动子的下游。为了增加核酸分子的稳定性，可用多种方法对其进行修饰，如增加两侧的序列长度，核糖核苷之间的连接应用磷酸硫酯键或肽键而非磷酸二酯键。

多聚核苷酸导入组织或细胞内的方法包括：将多聚核苷酸直接注入到体内组织中；或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将多聚核苷酸导入细胞中，再将细胞移植到体内等。

能与人HCCA2蛋白结合的多肽分子可通过筛选由各种可能组合的氨基酸结合于固相物组成的随机多肽库而获得。筛选时，必须对人HCCA2蛋白分子进行标记。

本发明还涉及定量和定位检测人HCCA2蛋白水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的人HCCA2蛋白水平，可以用作解释人HCCA2蛋白在各种疾病中的重要性和用于诊断HCCA2蛋白起作用的疾病。

一种检测检测样品中是否存在HCCA2蛋白的方法是利用HCCA2蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与HCCA2蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在HCCA2蛋白。

HCCA2蛋白的多聚核苷酸可用于HCCA2基因相关疾病的诊断和治疗。在诊断方面，HCCA2蛋白的多聚核苷酸可用于检测HCCA2基因的表达与否或在疾病状态下HCCA2基因的异常表达。如HCCA2 DNA序列可制备成特异性探针用于对活检标本的杂交以判断HCCA2基因的表达异常。杂交技术包括Southern印迹法，Northern印迹法、原位杂交等。这些技术方法都是公开的成熟技术，相关的试剂盒都可从商业途径得到。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。用HCCA2蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测HCCA2蛋白的转录产物。

检测HCCA2基因的突变也可用于诊断HCCA2蛋白相关的疾病。HCCA2蛋白突变的形式包括与正常野生型HCCA2 DNA序列相比的点突变、易位、缺失、重组和其它任何异常等。可用已有的技术如Southern印迹法、DNA序列分析、PCR(SSCP)和原位杂交检测突变。另外，突变有可能影响蛋白的表达，因此用Northern印迹法、Western印迹法可间接判断基因有无突变。

本发明的序列对染色体鉴定也是有价值的。简而言之，根据本发明HCCA2蛋白的cDNA(位于3′-UTR序列)设计并合成PCR引物(优选15-35bp)，可以将序列定位于染色体上。然后，将这些引物用于PCR筛选含各条人染色体的体细胞杂合细胞。只有那些含有相应于引物的人基因的杂合细胞会产生扩增的片段。

一旦序列被定位到准确的染色体位置，此序列在染色体上的物理位置就可以与基因图数据相关联。这些数据可见于例如，V.Mckusick，Mendelian Inheritance in Man(可通过与Johns Hopkins University Welch Medical Library联机获得)。然后可通过连锁分析，确定基因与业已定位到染色体区域上的疾病之间的关系。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从胎盘cDNA文库(该文库可从美国Clontech公司购得)中分离出的。其序列如SEQ ID NO：1所示，它包含的多核苷酸序列全长为2520个碱基，其开放读框位于891-2291位，编码全长为467个氨基酸的人HCCA2蛋白(SEQ ID NO：2)。该HCCA2蛋白是一种肝癌高表达蛋白，HCCA2在肝癌中的表达率高达79.01％，而在癌旁肝组织的表达率和表达水平极低。因此HCCA2多核苷酸、HCCA2蛋白及其抗体，以及HCCA2蛋白相关的拮抗剂、激动剂等可为治疗包括肝癌等多种疾病提供新的治疗途径，因而具有巨大的应用前景。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：组织总RNA的提取

共采用43对HCC及相应癌旁肝组织，1例正常肝组织，1例健康人的肝、小肠、大肠、脾、胰腺、肌肉、肺、脑、胃、心脏组织。

采用一步法提取组织总RNA，基本步骤如下：0.5g组织加入5ml变性液(含4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠，0.5％十二烷基肌酸钠，0.1M β-巯基乙醇)，于绞切式匀浆器(Polytron)匀浆5分钟，混匀后加水饱合酸性苯酚3ml，0.6ml氯仿/异戊醇(24∶1)，振摇10秒钟静置冰浴15分钟。于4℃10000g离心20分钟，水相移至新管，加等体积异丙醇，置-20℃ 30分钟后10000g离心15分钟，沉淀用75％乙醇洗两次，干燥后溶于200μl用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子水中，取2μl紫外分光光度计定量，其余-80℃保存。用OD260/OD280计算RNA纯度，所有RNA样品纯度均在1.70以上。计算RNA浓度：RNA浓度(mg/ml)＝OD260×0.04μg/ml×稀释倍数，并计算40μg RNA所需体积。

实施例2：逆转录PCR和DDPCR

(1)cDNA第一链的合成：

取一例上述制备的总RNA 3μl(约3μg，标本号23)，分别加入DDPCR下游引物各5μl(共四种，浓度为10μM)，加入DEPC处理水2μl，总体积10μl→70℃变性10分钟→冰浴2分钟→加入0.1M DTT 2μl，5×逆转录缓冲液4μl，RNA酶抑制剂(Rnasin)1μl，2.5mM dNTPs 2μl→42℃反应2分钟→加1μl MMLV逆转录酶(20U/μl)→42℃反应50分钟→70℃ 15分钟灭活逆转录酶，产物存于-80℃。

(2)PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳：

a.PCR反应：总体积20μl

上述合成的cDNA第一链(癌、癌旁、正常肝)	4μl
		无核酶H2O	8μl
10×PCR缓冲液	2μl
		dNTPs混合物(2.5mM)	1.6μl
Mg离子(25mM)	1.5μl
		与cDNA第一链对应的3′端引物(10μM)	1μl
各种5′端引物(10μM)	1μl
		TaqDNA聚合酶(5U/μl)	0.5μl
同位素α-32P-dATP(3000Ci/mmol)	0.5μl

混合后进行PCR扩增，反应条件：94℃ 4分钟→93℃ 1分钟→40℃ 2分钟→70℃ 1分钟20秒→共40个循环→72℃延伸10分钟，热启动。

b.聚丙烯酰胺凝胶电泳：

灌制6％(v/v)变性聚丙烯酰胺凝胶，使用1×TBE缓冲液，55W，1900V预电泳40分钟。取上述PCR产物3μl，加入6μl DNA上样缓冲液，100℃变性5分钟，冰浴5分钟，每泳道加入3μl进行电泳：55W、1900V、60mA电泳4.5小时，取下电泳胶，用保鲜膜包裹，于暗室压入X光片，-80℃自显影过夜，第二天冲洗自显影片。

实施例3差异片断的回收纯化和二次PCR扩增

将X光片仍于显影时原样与电泳胶紧密相贴，对照X光片显示的差异条带(癌与癌旁或正常肝组织比较)，用刀片切除(反复烧烤刀片，防止污染)对应位置的电泳胶，放入1.5ml离心管，加入100μl TE(pH8.0)，存-20℃。

回收的聚丙烯酰胺凝胶条带，100℃煮15分钟，冷却后取10μl为PCR反应模板，补加ddH₂O 23μl，10×PCR缓冲液5μl，dNTPs混合物(2.5mM)4μl，Mg离子(25mM)2.5μl，对应的(与得到该片段一致的引物)3′端引物(10μM)2.5μl，5′端引物(10μM)2.5μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.5μl，总体积50μl，反应条件：94℃ 4分钟→93℃ 1分钟→40℃ 2分钟→70℃ 1分钟 20秒→共40个循环→72℃延伸10分钟，热启动。反应结束后取5μl PCR产物，用2％琼脂糖凝胶电泳检测。条带明显者，将剩余45μl PCR产物继续电泳，回收扩增出的DNA片段，条带不明显者，取2μl PCR产物为模板，进行第三次PCR扩增，反应总体积100μl，反应条件同上。使用QIAEXII凝胶回收试剂盒(glassmilk)(Qiagen)回收纯化琼脂糖凝胶条带：用手术刀片将含目的片段凝胶切下，加入5倍体积的凝胶溶解液55℃加热10分钟，使其充分溶解，再加入20μl玻璃奶(glassmilk)室温混匀15分钟，10000g离心30秒，弃上清，沉淀用含80％乙醇的PE缓冲液洗2次，55℃干燥后，加入20μl TE震荡混匀，55℃加热5分钟，10000g离心30秒，取上清，再重复2次加入20μl TE洗脱，共得到约50μl洗脱液，分光光度计或电泳定量。

实施例4差异片断与源标本的Northern印迹杂交

(1)探针的标记：采用随机引物标记法，按Prime-a-Gene^Labeling System试剂盒(promega)的Protocol进行：将25ng DNA溶于30μl水中，100℃水浴加热变性5分钟，冰浴5分钟，加入5×标记缓冲液(含随机寡核苷酸引物)10μl，α-³²P-dATP(3000Ci/mmol)5μl，Exo(-)Klenow酶1μl，BSA(10mg/ml)2μl，dNTPs(15mM的dTTP、dGTP、dCTP等体积混合)2μl，总体积50μl，充分混匀后24℃温育1-5小时，加入终止液2μl。标记后的探针用QIAquick标记核酸纯化试剂盒进行纯化：用5倍标记物体积(250μl)的盐溶液PN缓冲液将标记物混匀，加入吸附柱，6500g离心1分钟，再用500μl含80％乙醇的PE缓冲液洗2次，以去除游离同位素α-³²P-dATP，然后用250μl TE洗脱2次，收集洗脱液，取1μl测比活性5.0×10⁸cpm/μg DNA，余置-20℃备用。

(2)RNA甲醛凝胶电泳和Northern吸印转膜：按分子克隆介绍的方法加以改进：1.5g琼脂糖加水130.5ml，加热融化后冷却至70℃左右，加10×MOPS缓冲液(0.2mol/LMOPS，80mmol/L乙酸钠，10mmol/L EDTA pH80)15ml，甲醛4.5ml，灌胶凝固备用。各种RNA样品40μg加水至11.25μl，加10×MOPS缓冲液5μl 37％甲醛8.75μl，甲酰胺25μl，55℃变性15分钟转至冰浴，加5μl加样缓冲液(50％甘油，1mmol/L EDTA，0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF)混匀后总体积50μl，加样至甲醛凝胶，在装有1×MOPS缓冲液的电泳槽内，电压120V电泳。待溴酚蓝泳动至凝胶2/3位置时停止电泳。在高于装有20×SSC(3M氯化钠，0.3M柠檬酸三钠，调pH至7.0，加水至1L)浅盘液面的平台上，放置一张全部浸透且两端浸入20×SSC的滤纸，将电泳后的凝胶在水中稍事漂洗，翻转置于该滤纸上，凝胶四周围以胶片屏障，凝胶上依次放置湿润的相应大小的硝酸纤维素滤膜、2层2×SSC温润的滤纸、5cm厚的干纸巾、玻璃板及500g重物。吸印18小时，及时更换纸巾。转移结束后用6×SSC漂洗硝酸纤维素滤膜，室温干燥30分钟，80℃烘干固定2小时以备杂交。

(3)预杂交、杂交、洗膜及放射自显影：滤膜经2×SSPE浸漂5分钟，再以20ml预杂交浸润，放入相应大小的塑料盒中，置42℃恒温振荡水浴中6小时。换20ml的新的预杂交液，将放射性标记探针置100℃水浴变性10分钟，转冰浴骤冷至0℃，加入杂交盒中，继续于42℃振荡温育24小时，小心倒出杂交液，滤膜用500ml 2×SSC，0.1％SDS室温洗涤半小时再分别用1×SSC，0.1％SDS、0.2×SSC，0.1％SDS、0.1×SSC，0.1％SDS 56℃洗涤30分钟。将滤膜置于滤纸上室温晾干，包塑料膜平置片盒内，暗室中将医用X光片及增感屏置于膜上，置-70℃放射自显影2小时，用FLA-2000富士荧光及射线影像分析仪观测杂交结果，观测后杂交膜继续-70℃放射自显影7-10天。

实施例5将差异片断克隆到T载体和PCR鉴定

(1)感受态细胞的制备：挑宿主菌DH5α、JM109单菌落于无抗生素(XL1-Blue加四环素至20μg/ml)的3ml LB中，37℃振摇培养过夜，次日取菌液1ml接种至100ml LB中，37℃振摇培养2-3小时(OD600约0.3-0.4)，冰浴10分钟，4℃4000g离心10分钟，弃培养液，加入冰预冷的0.1M CaCl₂ 10ml重悬菌体，冰浴30分钟，4℃4000g离心10分钟，弃上清，再加入冰预冷的0.1M CaCl₂ 4ml重悬菌体，置4℃冰箱12-24小时后使用。

(2)差异片断与T载体的连接和连接产物的PCR鉴定：取差异表达的PCR纯化片段2μl，加入T4 DNA连接酶缓冲液1μl， T载体1μl，T4 DNA连接酶1μl，去离子水5μl，使总体积为101μl，置4℃冰箱连接过夜。第二天连接产物65℃10分钟，以灭活T4连接酶。取连接产物5μl，加入200μl感受态细菌中，冰浴30分钟，加入800μl无抗生素LB，10μl 20％葡萄糖，37℃摇荡培养1小时(转速低于100rpm/分钟)，以使细菌复苏，并表达质粒编码的抗性基因，低速离心菌液后取200μl已转化的感受态细胞沉淀，涂于含50μg/ml氨苄青霉素，和表面涂布X-gal(20mg/ml)、IPTG(200mg/ml)的LB琼脂平板培养基表面，待液体吸收后倒置平皿，37℃培育16小时。第二天，将琼脂板放4℃4小时，挑取白色单菌落于40μl LB中，用PCR法鉴定该菌落是否含重组体：T载体两端含噬菌体T7、SP6启动子序列，针对该序列设计引物：T7引物序列5′TAA TAC GAC TCA CTA TAGGG 3′，SP6引物序列5′CTA TTT AGG TGA CAC TATAG 3′。PCR反应体系如下：总体积20μl，ddH₂O 12μl，10×PCR缓冲液2μl，dNTPs混合物(2.5mM)1.6μl，Mg离子(25mM)1μl，T7、SP6端引物(10μM)各1μl，含单菌落的LB培养液1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.3μl，反应条件：94℃ 4分钟→94℃ 30秒→56℃ 45秒→72℃ 1分钟→共35个循环→72℃延伸10分钟，热启动。反应结束后用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，含目的片断的剩余菌液，接种至含氨苄青霉素(50μg/ml)的5ml LB培养液(蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L加5N NaOH 200μl调pH至7.0)中，37℃振摇培养过夜。

(3)质粒的小量提取：过夜培养菌液12000g离心30秒，弃上清培养液，沉淀菌重悬于冰预冷的溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris/HCl pH8.0，10mmol/L EDTApH8.0)200μl，置冰浴5分钟，加溶液II(0.2M氢氧化钠，1％十二烷基磺酸钠)400μl，颠倒混匀置冰上5分钟，加溶液III(3M乙酸钾pH4.8)300μl，冰浴放置10分钟后12000g离心10分钟，移上清至新管，加等体积异丙醇，室温放置5分钟，12000g离心10分钟，弃上清，沉淀重溶于含RNA酶(1μg/ml)的100μl TE溶液中，37℃温育1小时，酚/氯仿抽提，离心后取水相加0.1体积3M乙酸钠(pH5.2)，2倍体积乙醇，室温放置5分钟后12000g离心10分钟，沉淀用70％乙醇洗涤，室温干燥后重溶于TE溶液。所提质粒DNA经1％琼脂糖凝胶电泳定量。

实施例6差异片断测序和GeneBank查询

按T7测序试剂盒说明书操作，并略有改动：质粒6μl(约6μg)加入T7或SP6测序引物(2pM)3μl，1N NaOH 1μl→65℃变性8分钟→加入1N HCL 1μl，5×退火缓冲液3μl→从65℃逐渐冷却至37℃→在冰浴下加入0.1M DTT 1μl，dNTPs混合物2μl，ddH₂O 1.5μl，T7噬菌体测序酶(3U/μl)0.5μl，同位素α-³⁵S-dATP 1μl→分装4管，每管4.5μl，并分别加入四种双脱氧核糖核酸3μl→55℃延伸8分钟→加入5μl终止液→100℃变性5分钟，冰浴2分钟→取3μl用6％(v/v)变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，2000V，100mA，55W电泳5小时→80℃烤干凝胶2小时，压医用X胶片室温放射自显影3-5天。测序结果输入国际NCBI非重复数据库( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn/nr/)进行同源性比较，证实是否为新基因。

结果获得了582bp的新基因片段，其序列如下：

AGTCAGCCACAGCACAAGCAATGTCCACATTCATGTGGGCCTTATCTTCAGGGGTGGATGGTATAGGAAGATTCAC

AGAATTGCCAGAAACAATTAAGGGTGAGACAGAGGAGGCCACAAGGGGCTGGTTCAATGGACAGGGGAAGGAAGTA

GGGTTAACCAAGAGGGTGGCGATGGGAATAGTCTGGGGACTCTGGGCCACAGCCGCATTGACAGGCTGGATCATGT

TACAGCCACCGCCAAGGCTCACAATCTTCACAGTGGTAGCAGGAACAGTGAAGATAACAGATGCAGGGTGGATAAC

AGGGGCAGGTTTGATACAGCGAAAGGCCCTGGCTCCCCTTCTTTTTGAGGGTCTCCGTCTCACATATGGCTTTCGA

AACATGGAAGAGGCAGGGGAGGGCATCATTACCTTGGGCACAGGGGCAGAAGAGAGCAAAGTCTGGGACTCAGACA

GAGGGAAGCTTGTCCTGGCCTCAGGGGGCATAGCAGGCAGTGCTGCAGGAGACTCAAAACTCTCACCTCCACTGAC

CCCCAGTGGAGGGACACCTGGAACTGTCTGTAAAACAGTGGCTGACTAAT

实施例7筛选胎盘cDNA文库和Southern印迹杂交分析

(1)人胎盘cDNA文库和M13K07辅助噬菌体的滴度测定：将受体菌XL1-Blue单菌落接种于50ml 2×YT培养基(含20μg/ml四环素，0.2％麦芽糖)，37℃摇振培养过夜。第二天菌液37℃轻微摇荡培养(摇速＜50rpm/分)，以利于受体君鞭毛的长出。室温4000g离心10分钟，去上清，沉淀加入25ml 10mM MgSO₄，37℃摇荡培养1小时，菌液立即使用或存4℃保存。取100ml经PSB溶液稀释的，不同滴度的人胎盘cDNA文库或M13K07辅助噬菌体(含卡那霉素抗性，终浓度50μg/ml)，加入100μl XL1-Blue受体菌，37℃静置培养20分钟(利于噬菌体贴附于受体菌)，加入保存在47℃的3ml顶层琼脂(浓度0.7％)，混均后立即倒入含1.5％底层琼脂(在37℃预热)的90mm平皿，室温放置5分钟后，37℃倒置培养6-8小时，计数噬斑数，并计算出噬菌体的滴度：滴度/ml＝噬斑数x稀释度/0.1ml。

(2)转膜和初筛：根据测得的文库滴度计算噬菌体的用量，要求每150mm平皿噬斑数在4-5万左右。顶层琼脂用0.7％琼脂糖替代，用量8ml，加入XL1-Blue受体菌800μl，其余同滴度测定。将噬菌体转印至孔径0.45μm过滤膜上(经100℃高压处理15分钟，防止滤膜缩水)，用变性液(1.5M NaCl，0.5MNaOH)、中和液(1.5M NaCl 0.5MTris-Cl pH8.0)分别处理10分钟，6×SSC漂洗，室温晾干，80℃烤箱烘烤2小时，存室温。已印有cDNA文库的滤膜放入预杂交液中，42℃预杂交5小时，加入已标记变性的探针(不需换杂交液)，42℃杂交40小时，分别用2×SSC、0.1％SDS，1×SSC、0.1％SDS，0.1×SSC、0.1％SDS在室温(5分钟)、42℃(1小时)、56℃(1小时)洗膜，用微型同位素检测仪测CPM值(＜10)，滤膜晾干，包保鲜膜后-80℃自显影3天。

(3)复筛：冲洗自显影片，根据X光片杂交信号的位置，相对应挑取琼脂快，置于1ml PSB中(含50μl氯仿)，37℃摇荡1小时，存4℃冰箱。测初筛阳性克隆噬菌体释放液的滴度，按每150mm平皿约1000个噬斑铺板，进行第二轮筛选(保留第一轮的杂交液，第二、三轮继续使用)，同法进行第三、四轮筛选，铺噬斑密度为100个/150mm平皿，直到可靠挑取单个噬斑为止。

(4)制备Bluescript质粒：本实验用于构建胎盘cDNA文库的噬菌体载体是λZAPII载体，该载体是一插入型载体，进入宿主菌后，在M13辅助噬菌体的存在下，携带克隆化DNA的质粒部分可从载体上切下，形成质粒Bluescript SK(M13)(简称PBS)，利于这一特性，可从噬菌体直接转化为质粒，而不需PCR扩增插入片段，再连入T载体等。100μl噬菌体释放液+200μl新鲜制备的XL1-Blue菌→37℃静置孵育15分钟→加入10μl M13K07辅助噬菌体→37℃静置孵育15分钟→加入10mg/ml卡那霉素15μl，3ml 2×YT培养基→37℃摇荡培养5小时→70℃热灭活20分钟，使噬菌粒释放出→离心4000g，15分钟，保留上清(含PBS质粒)→取上清10μl，加入200μl过夜培养的SOLR细胞(或用其它宿主菌制备的感受态细菌)→37℃静置孵育15分钟→取50μl用于铺含氨苄青霉素的琼脂板，37℃培养过夜。

(5)含目的基因PBS质粒的鉴定和Southern印迹杂交：PBS质粒载体多克隆位点两端含T7、T3噬菌体启动子序列，根据该序列设计引物：T7引物序列同上述鉴定T载体时的引物序列，T3引物序列：5′ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA 3′。将上述过夜培养琼脂板单菌落挑人40μl LB培养液，用PCR方法鉴定菌落是否含目的基因，含目的片断的质粒再小量摇菌，提取质粒。根据PBS质粒多克隆位点两端含限制性内切酶EcoR I、Xho I的酶切位点，用这两种内切酶双酶切PBS质粒，1％琼脂糖电泳分离目的片断→电电泳结束后凝胶在变性液(1.5M NaCl，0.5M NaOH)、中和液(1.5M NaCl 0.5MTris-Cl pH7.0)分别处理45分钟，蒸馏水冲洗→搭桥在20×SSC中转膜20小时(同Northern杂交)→转膜结束后，印有核酸的硝酸纤维素滤膜在6×SSC中泡5分钟，晾干，80℃烘烤2小时→按上述Northern杂交方法，进行预杂交、杂交、洗膜→-80℃自显影4-6小时，观测结果。

结果发现了数个大小不等，含目的基因片段的PBS质粒。

实施例8目的基因测序和GeneBank检索

将上述Southern印迹杂交阳性的PBS质粒(同时用PCR扩出最长片段)，小量提取质粒，用ABI377全自动测序仪进行测序，计算机自动分析测序结果。根据T7、T3引物PCR扩增结果，最长基因片断约2500bp左右，针对该序列设计用于测序的引物，经正反不同方向反复测序，得到该基因的可靠序列。用于该质粒测序的引物是：

   T3：     5′-ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA-3′

   T7：     5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAGGG-3′

   引物1：  5′-GCA ATG TCC ACA TTC ATG-3′

   引物2：  5′-AGT GGC TGG CTG TAT TGG-3′

   引物3：  5′-ACC CAG CAC AAA GGA AGA GA-3′

   引物4：  5′-GTA CTT GCT GAT TAG AGG-3′

   引物5：  5′-CCA GTT GCC GAC CGT TTC-3′

   引物6：  5′-CTT GTG GCC TCC TCT GTC-3′

测序结果输入国际NCBI非重复数据库( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blastn/nr/)进行同源性比较，证实是否为新基因。

结果表明，一种分离的DNA是一新基因，其序列如SEQ ID NO：1所示，序列全长为2520个碱基，其开放读框位于891-2291位，编码全长为467个氨基酸的人HCCA2蛋白(SEQ ID NO：2和图1)。

实施例9大量样品的Northern印迹杂交分析

利用HCCA2基因全长序列作为探针，对43对肝癌和对应癌旁组织，以及10种正常人体组织，进行Northern Blot分析，发现HCCA2基因仅在肝癌组织中表达，癌旁肝组织不表达(个别病例极弱表达)，结果如图2所示，杂交阳性率是79.07％(34/43)。HCCA2基因在人体肌肉、肺、脑组织中高表达，在小肠、脾、直肠、心脏组织中中度表达，在胰腺、胃组织中弱表达，在肝组织中不表达(图3)。

HCCA2基因在43对肝癌和癌旁组织中的表达，与肿瘤的大小和分化程度、甲胎蛋白(AFP)的分泌水平、HBsAg阳性、有无癌栓和卫星灶等指标无关(x²检验，P＞0.05)，但与肝癌包膜的完整性和增殖细胞核抗原Ki-67蛋白的表达有关(x²检验，P＜0.01)，结果如表A所示。

                       表A  HCCA2在肝癌内的表达与肝癌病理特征的关系

病理特征      总例数        癌组织中高表达例数      癌组织中高表达百分数             P值

肿瘤大小

＜5cm         10            6                       60.00

＞5cm         33            28                      84.85                          ＞0.05

分化程度

I-II          5             2                       40.00

III-IV        38            32                      84.21                          ＞0.05

AFP

≤25          19            15                      78.95

＞25          24            19                      79.17                         ＞0.05

血清HBsAg

+             36            29                      80.56

-             7             5                       71.43                          ＞0.05

包膜侵犯

+             31            29                      93.55

-             12            5                       41.67                          ＜0.01

镜下癌栓

+             26            20                      76.92

-             17            14                      82.35                          ＞0.05

癌旁卫星灶

+             30            24                      80.00

-             13            10                      76.92                          ＞0.05

Ki-67蛋白表达

+             33            30                      90.91

-             10            4                       40.00                          ＜0.01

实施例11RT-PCR从肝癌组织中获得HCCA2编码序列

引物合成：合成如下引物，其中在引物中分别加入EcoR I和Xho I接头：

RT引物1：5′-GCGAATTCATGAACAGAGCTCCTGACAAC-3′

RT引物2：5′-CGCTCGAGGCAGGCTAAAGCAAGCTGCTC-3′

逆转录(RT)：反应管(总20μl)中含1μg总RNA和2.5μM引物2。70℃反应10min；冰浴2min后，加入1μM DTT，0.2mM dNTP混合物，1×逆转录反应缓冲液，5U逆转录酶，20U RNA酶抑制剂，在37℃反应1h，最后在70℃加热15min终止反应分装后保存于-80℃。

PCR扩增、克隆及测序：反应管(总100μl)中含5μl逆转录反应产物，2.5μM引物1和引物2，0.2mM dNTP混合物，1.25mM MgCl2和2.5U Taq酶。PCR扩增的循环参数和程序为：94℃，5min→94℃，1min，56℃，1min，72℃，1min 20s，35循环→72℃，8min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，用QIAEX II kit(GIAGEN公司)进行纯化，然后克隆入克隆载体pBluescript SK(或表达载体pGEX-5X-1或pcDNA3)，再进行测序。结果表明扩增产物与SEQ ID NO：1所示的HCCA2编码序列相符。

实施例11制备GST融合蛋白、免疫动物产生抗体和抗体的纯化

(1)GST融合蛋白表达载体的构建：在该基因编码区，针对该基因C端设计PCR引物：5′端引物(1HF)：5′ CGCGAATTCGCCACCCTCTTGGTTAA CC 3′，其中前9个碱基不是该基因的序列，目的是引入EcoR I内切酶位点，并不影响PCR扩增。3′端引物使用含该基因PBS质粒载体上的T7序列引物，使用高保真Taq DNA聚合酶(Clontcch公司)，反应总体积100μl，反应参数：94℃ 4分钟→94℃ 40秒→56℃ 50秒→72℃ 1分钟→共35个循环→72℃延伸10分钟，热启动。扩增出的PCR片段含EcoR I和XholI双酶切位点，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收、纯化后，用EcoR I和Xhol I双酶切，随产生EcoR I和Xhol I粘性末端。GST融合蛋白表达载体PGEX-5X-1的多克隆位点亦含这两种内切酶位点，该质粒载体经EcoR I和Xhol I双酶切后，也产生EcoRI和Xhol I的粘性末端，将经这两种内切酶处理的载体和PCR片段用T4酶连接，则PCR片段定向克隆至PGEX-5X-1上。连接产物转化宿主菌XL1-Blue(含四环素抗性)和BL21，菌落用PCR的方法鉴定是否含目的基因，所用引物是：PGEX 5′端引物：5′-GGG CTG GCA AGC CAC GTT TGG TG-3′，PGEX 3′端引物：5′-CCG GGA GCTGCA TGT GTC AGA GG-3′，PCR鉴定大小正确的菌落，摇菌抽提质粒，再用PCR的方法鉴定，所用引物：引物6(在该PCR片段上)和PGEX 3′端引物，并测序验证，证实所克隆的PCR片段序列的正确性(与含该基因的PBS质粒比较，以防碱基突变)。

(2)GST融合蛋白的鉴定和大量制备：100μl过夜培养、含重组子的宿主菌，接种到2ml LB培养基(含50μg/ml氨苄青霉素)，37℃摇振培养1小时，部分培养管加入2μl 1M IPTG(1/1000体积)，30℃摇振培养3小时，取1ml菌液，10000g离心2分钟，去上清，沉淀加入50μl蛋白上样缓冲液，100℃变性10分钟，12000g离心10分钟后，取20μl进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，120V电泳3小时后，凝胶用考马斯亮蓝R250染色1小时，脱色观测结果。

如图4所示，构建成功的含HCCA2基因编码区C端的GST融合蛋白表达载体，转染宿主菌XL1-Blue或BL-21，经IPTG诱导3小时，蛋白电泳均可见约47KD GST融合蛋白的表达，经IPTG诱导的空载体对照表达26KD的GST蛋白。GST融合蛋白的分子量约为47kDa，与预计的相符。

大量制备GST融合蛋白：100ml过夜培养的宿主菌，接种到900ml LB中，37℃摇振培养1小时，加入1ml 1M IPTG(1/1000体积，终浓度是1mM)，30℃诱导培养3小时，6000rpm离心15分钟，菌体重悬于50ml冰预冷的PBS中，4000rpm离心10分钟。菌体加入20ml冰预冷的TS缓冲液(含50mM Tris-HCl pH8.0，25％蔗糖)，加入2ml溶菌酶(50mg/ml)，冰浴20分钟，加入2ml蛋白酶抑制剂的混合液(含0.5M EDTA 1.68ml，1.6mg/ml aprotinin 0.2ml，17.4mg/ml PMSF 120μl)，冰浴10分钟，加入4ml 10％Triton X-100，混均，冰浴30分钟。超声波处理菌液10分钟，冰浴10分钟，离心20000rpm，45分钟，将上清转移至50ml离心管，加入1.5ml GST-bead，4℃孵育3小时(期间经常摇动离心管)，离心12000rpm 3分钟，沉淀用冰预冷的PBS洗3次，将GST-bead转移到吸附柱中，并用还原型谷光苷肽洗脱，收集洗脱液，每管取10μl电泳鉴定，其余存-20℃。

实施例12抗体制备

免疫家兔产生抗体和抗体的纯化：首次免疫：2mg GST融合蛋白，逐滴加入等体积Freun′s Adjuvant Complete，反复抽吸，使之成油包水型，多点注射到2.5kg健康雄性家兔背部皮下，两周后第二次免疫：1mg GST融合蛋白逐滴加入等体积Freun′sAdjuvant Incomplete中，反复抽吸，使之成油包水型，免疫途径同第一次；间隔两周第三次免疫注射0.5mg融合蛋白，再两周后第四次接种0.5mg融合蛋白，8周时从家兔颈动脉取血，血液37℃放1小时，4℃过夜。离心血液4000rpm 10分钟，吸出血清，部分冻存于-20℃，部分进行纯化。20ml血清加20ml生理盐水，逐滴加入40ml饱和过硫酸氨中，并不断搅拌，4℃静置3小时以上，4000rpm离心30分钟，沉淀溶于20ml生理盐水中，逐滴加入10ml饱和过硫酸氨，4℃静置3小时以上，4000rpm离心30分钟，沉淀溶于10ml生理盐水中，并重复2次，最后将沉淀溶于10ml PBS中，于4℃透析24小时(期间换液3次)。透析结束后，将抗体分装，存-20℃。

实施例13目的基因在真核细胞中的表达和Western杂交检测

(1)含目的基因全长的真核表达载体的构建：将含目的基因HCCA2全长的PBS质粒，用EcoR I和Xhol I双酶切后，产生含EcoR I和Xhol I的粘性末端的基因片段，真核表达载体pcDNA3多克隆位点两端也含这两种内切酶位点，将经这两种内切酶处理的载体和HCCA2基因片段用T4酶连接，则HCCA2基因片段定向克隆至pcDNA3上。连接产物转化宿主菌XL1-Blue，产生重组子，挑菌落用PCR法鉴定(因pcDNA3多克隆位点两端含T7、SP6序列)，鉴定正确的菌落，摇菌提质粒，并测序验证。

(2)将重组载体导入293细胞：两种方法：

(a).葡聚糖介导的方法：按Promega公司的Profection^Mammalian TransfectionSystems说明书操作，并略有改动：293细胞传代培养于60mm平皿→第二天，到培养液，加入5ml 1×PBS溶液，室温放15分钟→移除PBS溶液，加入2ml DEAE-Dextran溶液(用1×PBS稀释，终浓度是1mg/ml)→室温放9分钟→移除DEAE-Dextran溶液，用5ml 1×PBS洗细胞两次→移除PBS洗液，加入325μl含10μg重组质粒的PBS溶液→37℃培养30分钟，并不断摇动平皿→补加3.5ml含15％胎牛血清的DMEM培养液，35μl 8mM氯喹，继续培养2.5小时→换完全培养基，继续37℃培养48-72小时。

(b).电穿孔法：收获对数生长期293细胞，F12培养基洗两次，用F12调细胞浓度为1×10⁷/ml，将制备好的上述pcDNA3-HCCA2重组质粒10μg加入1ml细胞悬液中，冰浴10分钟，将DNA-细胞悬液加入灭菌的电击池中，调电容960μFD，电压360V，电击32ms，然后将细胞悬液移入培养瓶，加入完全培养基，37℃培养72小时。

(3)293细胞总蛋白的提取及SDS-PAGE凝胶电泳：各组细胞培养至约10⁷，倾去培养液，加入细胞裂解液(50mM HEPES，150mM NaCl，1％Triton  X-100，10％甘油，1mMEDTA，100mM NaF，10mM Na₄P₂O₇，40μM Na-orthovanadate，1μg/ml Aprotinin，0.5mMPMSF)0.5ml，刮取细胞裂解物，4℃，12000g离心5分钟，取上清，-20℃冻存。蛋白电泳时每泳道加样量保持一致，在10％聚丙烯凝胶上进行电泳，直到染料到凝胶的底部。

(4)Western杂交：剪6张与凝胶大小一致的Whatman 3MM滤纸和1张硝酸纤维素膜，在转移缓冲液(39mM甘氨酸，48mM Tris，0.037％SDS，20％甲醇)中浸泡5分钟。用Bio-Rad半干式电转移装置，硝酸纤维素膜贴紧凝胶，两侧各加3层滤纸，保持各层之间无气泡，硝酸纤维素膜朝向正极，进行电转移，按0.65mA/cm²接通电流，转移2小时。转移结束后，取出NC膜，用丽春红S染色1分钟，稍事漂洗后，标出Marker所在的位置。将NC膜放入1×NET-Gelatine缓冲液(150mM NaCl，5mM EDTA，50mMTris PH 7.5，0.05％Triton X-100，0.25％gelatine)封闭2×15分钟。加入兔抗人HCCA2C端多抗(1∶2000稀释)，室温作用1小时。1×NET-Gelatine洗膜2×15分钟，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1∶10000稀释)，室温作用1小时。1×NET-Gelatine洗膜2×15分钟，加入新鲜配制的荧光显色液6ml(ECL显色液1、2等体积混匀)，室温作用1分钟，水冲洗中止反应，封入保鲜膜中，压片，放射自显影1-5分钟。

结果如图5所示，将重组质粒转染至293细胞中，培养48小时后，裂解细胞收集蛋白，用上述制备的多克隆抗体进行Western杂交，可见转染目的基因的293细胞表达目的蛋白，HCCA2蛋白的分子量约为50.65kDa，与预计的相符，而转染空载体pcDNA3的293细胞未检测到目的蛋白的表达，提示STW-1基因能在真核细胞293中表达，并证明其核苷酸序列的正确性。

实施例14HCCA2和Ki-67蛋白的免疫组化染色

利用实施例12中制备的HCCA2多克隆抗体(已纯化)，进行石蜡切片的免疫组化染色，方法为：石蜡切片常规脱蜡、水化→1％H₂O₂甲醇室温封闭20分钟→正常羊血清37℃封闭20分钟→加入兔抗人HCCA2多抗(1∶100稀释)37℃作用1小时→加入生物素标记羊抗兔IgG 37℃反应30分钟→加入亲和素-链酶卵白素复合物37℃作用1小时→DAB显色10分钟。上述每步骤间用PBS洗切片3次，阴性对照为PBS代替一抗。Ki-67蛋白的免疫组化染色方法同HCCA2蛋白，Ki-67蛋白单克隆抗体购自Zymed公司，1∶200稀释。

结果如图6所示，HCCA2基因表达产物主要定位于细胞浆，综色细颗粒均匀分布于部分肝癌细胞胞浆内，癌旁肝组织中未见染色。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                                序列表

(1)一般信息：

  (ii)发明名称：新的肝癌高表达基因、其编码的蛋白及其应用

  (iii)序列数目：2

(2)SEQ ID NO：1的信息：

  (i)序列特征：

      (A)长度：2520bp

      (B)类型：核酸

      (C)链性：双链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

GGCACGAGAG AAGGCTTGGG CTCGCGCCGC TGAAGTCGGC TTACCCGCTG GCCGCCTCCT  60

GACAAGCGGG AGGGATCCGC GGTGGACCCA GGGAAGCGGA GGAGCCTGGC GGCCACCCCC  120

TCTTCCTCAC TTCCCTGTAC TCTCATCGCT CTCGGCCTCC GACACGAAAA GGAAGCAAAT  180

GAGCTGATGG AAGATCTGTT TGAAACTTTC CAAGATGAGA TGGGATTCTC CAACATGGAA  240

GATGATGGCC CAGAAGAGGA GGAGCGTGTG GCTGAGCCTC AAGCTAACTT TAACACCCCT  300

CAAGCTCTAC GGTTTGAGGA ACTACTGGCC AACCTACTAA ATGAACAACA TCAGATAGCG  360

AAGGAACTAT TTGAACAGCT GAAGATGAAG AAACCTTCAG CCAAACAGCA GAAGGAGGTA  420

GAGAAGGTTA AACCCCAGTGTAAGGAAGTT  CATCAGACCC TGATTCTGGA CCCAGCACAA  480

AGCTGAAGAG ACTCCAGCAG CAGATGCAGC AGCATGTTCA GCTCTTGACA CAAATCCACC  540

TTTGCCACCT GCAACCCCAA TCTCAATCCG GAGGCCAGTA GCACCAGGAT ATGTCTTAAA  600

GAGCTGGGAA CCTTTGCTCA AAGCTCCATC GCCCTTCACC ATCAGTACAA CCCCAAGTTT  660

CAGACCCTGT TCCAACCCTG TAACTTGATG GGAGCTATGC AGCTGATTGA AGACTTCAGC  720

ACACATGTCA GCATTGACTG CAGCCCTCAT AAAACTGTCA AGAAGACTGT TTGTTAGCTT  780

TAGGACTGAA GCATTTTGAA GGGACTGAGT TTCTTAACCC TCTAATCAGC AAGTACCTTC  840

TAACCTGCAA GACTGCCCGC CAACTGACAG TGAGAATCAA GAACCTCAAC ATGAACAGAG  900

CTCCTGACAA CATCATTAAA TTTTATAAGA AGACCAAACA GCTGCCAGTC CTAGGAAAAT  960

GCTGTGAAGA GATCCAGCCA CATCAGTGGA AGCCACCTAT AGAGAGAGAA GAACACCGGC  1020

TCCCATTCTG GTTAAAGGCC AGTCTGCCAT CCATCCAGGA AGAACTGCGG CACATGGCTG  1080

ATGGTGCTAG AGAGGTAGGA AATATGACTG GAACCACTGA GATCAACTCA GATCAAGGCC  1140

TAGAAAAAGA CAACTCAGAG TTGGGGAGTG AAACTCGGTA CCCACTGCTA TTGCCTAAGG  1200

GTGTAGTCCT GAAACTGAAG CCAGTTGCCG ACCGTTTCCC CAAGAAGGCT TGGAGACAGA  1260

AGCGTTCATC AGTCCTGAAA CCCCTCCTTA TCCAACCCAG CCCCTCTCTC CAGCCCAGCT  1320

TCAACCCTGG GAAAACACCA GCCCAATCAA CTCATTCAGA AGCCCCTCCG AGCAAAATGG  1380

TGCTCCGGAT TCCTCACCCA ATACAGCCAG CCACTGTTTT ACAGACAGTT CCAGGTGTCC  1440

CTCCACTGGG GGTCAGTGGA GGTGAGAGTT TTGAGTCTCC TGCAGCACTG CCTGCTATGC  1500

CCCCTGAGGC CAGGACAAGC TTCCCTCTGT CTGAGTCCCA GACTTTGCTC TCTTCTGCCC  1560

CTGTGCCCAA GGTAATGATG CCCTCCCCTG CCTCTTCCAT GTTTCGAAAG CCATATGTGA  1620

GACGGAGACC CTCAAAAAGA AGGGGAGCCA GGGCCTTTCG CTGTATCAAA CCTGCCCCTG  1680

TTATCCACCC TGCATCTGTT ATCTTCACTG TTCCTGCTAC CACTGTGAAG ATTGTGAGCC  1740

TTGGCGGTGG CTGTAACATG ATCCAGCCTG TCAATGCGGC TGTGGCCCAG AGTCCCCAGA  1800

CTATTCCCAT CGCCACCCTC TTGGTTAACC CTACTTCCTT CCCCTGTCCA TTGAACCAGC  1860

CCCTTGTGGC CTCCTCTGTC TCACCCTTAA TTGTTTCTGG CAATTCTGTG AATCTTCCTA  1920

TACCATCCAC CCCTGAAGAT AAGGCCCACA TGAATGTGGA CATTGCTTGT GCTGTGGCTG  1980

ATGGGGAAAA TGCCTTTCAG GGCCTAGAAC CCAAATTAGA GCCCCAGGAA CTATCTCCTC  2040

TCTCTGCTAC TGTTTTCCCC AAAGTGGAAC ATAGCCCAGG GCCTCCACCA GTCGATAAAC  2100

AGTGCCAAGA AGGATTGTCA GAGAACAGTG CCTATCGCTG GACCGTTGTG AAAACAGAGG  2160

AGGGAAGGCA AGCTCTGGAG CCGCTCCCTC AGGGCATCCA GGAGTCTCTA AACAACTCTT  2220

CCCCTGGGGA TTTAGAGGAA GTTGTCAAGA TGGAACCTGA AGATGCTACA GAGGAAATCA  2280

GTGGATTTCT TTGAGCTAGG AGAATAAGAG TCTGGAGACT GGGAGCCTTC ACTTCGGCCT  2340

CCGATTGGTG GCGCATAGGG TGTAACCAAT AGGAAACCCC TAAAGGGTAC TTAAACCCCA  2400

GATTTTGCAA CTGGGGCTCT TGAGCAGCTT GCTTTAGCCT GCTCCCACTC TGTGGAATAT  2460

ACTTTTGCTT CAATAAATCT GTGCTTTTAT TGCTTCAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA  2520

(2)SEQ ID NO：2的信息：

  (i)序列特征：

    (A)长度：467个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：多肽

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

MNRAPDNIIK FYKKTKQLPV LGKCCEEIQP HQWKPPIERE EHRLPFWLKA  50

SLPSIQEELR HMADGAREVG NMTGTTEINS DQGLEKDNSE LGSETRYPLL  100

LPKGVVLKLK PVADRFPKKA WRQKRSSVLK PLLIQPSPSL QPSFNPGKTP  150

AQSTHSEAPP SKMVLRIPHP IQPATVLQTV PGVPPLGVSG GESFESPAAL  200

PAMPPEARTS FPLSESQTLL SSAPVPKVMM PSPASSMFRK PYVRRRPSKR  250

RGARAFRCIK PAPVIHPASV IFTVPATTVK IVSLGGGCNM IQPVNAAVAQ  300

SPQTIPIATL LVNPTSFPCP LNQPLVASSV SPLIVSGNSV NLPIPSTPED  350

KAHMNVDIAC AVADGENAFQ GLEPKLEPQE LSPLSATVFP KVEHSPGPPP  400

VDKQCQEGLS ENSAYRWTVV KTEEGRQALE PLPQGIQESL NNSSPGDLEE  450

VVKMEPEDAT EEISGFL*                                     467

Claims (9)

1.一种分离的人HCCA2蛋白，其特征在于，它是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽，并且不是HCCA1蛋白。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组：

(a)编码如权利要求1所述多肽的多核苷酸；

(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中891-2291位的序列；

(b)具有SEQ ID NO：1中1-2520位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它是选自下组的一种宿主细胞：

(a)用权利要求6所述的载体转化或转导的宿主细胞；

(b)用权利要求3所述的多核苷酸转化或转导的宿主细胞。

8.一种具有人HCCA2蛋白活性的多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达人HCCA2蛋白的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出具有人HCCA2蛋白活性的多肽。

9.一种能与权利要求1所述的人HCCA2蛋白特异性结合，且不结合于HCCA1的抗体。

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