CN1142274C - 具有细胞凋亡促进活性的多肽 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人类细胞来源的具有细胞凋亡促进活性的多肽及编码该多肽的核酸序列。还公开了以重组技术生产该多肽的方法，以及抗该多肽的抗体和拮抗剂，含有该多肽或其DNA编码序列及一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物，以及所说的多肽或编码该多肽的核酸在生产用于体外和/或体内诊断或治疗细胞凋亡程序紊乱相关疾病的药物中的应用。还公开了用于鉴定编码所说的多肽之核酸中的突变的，以及检测所说的多肽水平改变的诊断试剂盒。

Description

具有细胞凋亡促进活性的多肽

本发明涉及新的多核苷酸，由所说的多核苷酸编码的多肽，所说的多肽的生产方法及其应用。更具体地说，本发明涉及存在于脊髓动物细胞内的，具有细胞凋亡促进活性的多肽，编码该多肽的多核苷酸序列，以重组DNA技术生产所说多肽的方法以及所说的多肽或多核苷酸在诊断或治疗细胞正常凋亡途径障碍相关性疾病中的应用。

细胞编程性死亡(又称细胞凋亡)是Kerr等人(Br.J.Cancer 26：239-257，1972)首先提出的一种本质上完全不同于细胞坏死的细胞死亡形式，是贯穿于个体生长、发育直至死亡的整个生理过程的基本生物学现象。在生物体的进化、内环境稳定及许多系统的发育中起着重要作用。细胞凋亡的异常往往导致许多疾病，如肿瘤、病毒感染、获得性免疫缺陷综合症、变应性自身免疫病、神经退化性病变等的发生(Thompson CB.，Science 267：1456-1462，1995)。

细胞凋亡是受体内外许多因素影响的多阶段复杂过程。一方面，例如激素、生长因子缺乏、细胞间分子相互作用、某些神经递质、细菌毒素、病毒感染、致癌基因表达，以及其他物理或化学因素均可导致细胞的凋亡。另一方面，生物体内还存在许多相应的抗凋亡因素，两方面因素的相互协调和抑制作用决定了细胞的最终命运(Thompson CB.，Science 267：1456-1462，1995)。

从接受凋亡信号，到凋亡调控分子的相互作用，然后到蛋白水解酶(Caspase)活化，最后导致细胞凋亡的全过程中，往往在同一细胞内同时存在多种相互联系又各自发挥其功能的许多凋亡促进分子和凋亡抑制因子。现已知道，有许多蛋白质或蛋白质家族参予细胞凋亡过程中蛋白质分子间相互作用的调控机制，这些蛋白质包括引发细胞凋亡的Bcl-1蛋白质家族、由凋亡拮抗因子和凋亡促进因子组成的Bcl-2蛋白质家族、通过转录依赖性和非转录依赖性途径诱导或引发细胞特别是造血系统来源的细胞凋亡的p53蛋白、促进细胞增殖和凋亡的C-myc(作为一种转录因子)、通过分子的死亡区与蛋白酶结合以促进细胞凋亡的Fas/TNFR1家族、在凋亡的执行阶段被激活的可识别和切割天冬氨酸残基的半胱氨酸蛋白酶Caspase家族，以及热休克蛋白(Hsp 70)等。

人们在不断深入地阐明细胞凋亡机制和寻找调整细胞凋亡异常的基因药物的努力中，总是希望找到新的凋亡相关基因、其编码的蛋白质及该蛋白质在整个细胞凋亡的复杂过程中的功能活性及其控制机制。本发明人在利用已建立的细胞因子依赖性TF-1细胞系所进行的研究中，成功地分离并克隆了一组凋亡相关基因。经同源性分析显示，其中至少一个克隆的核苷酸序列与已知基因的核苷酸序列最多只有59％同源性。我们基于已在线虫(Caenorhabditis elegans)中鉴定的编程性细胞死亡的遗传学途径，利用已知实验系统深入研究了该多核苷酸的结构特征，其在原核和真核细胞中的表达、所说的多核苷酸和其编码的多肽，即本发明所称的AAP14多肽对去细胞因子所致TF-1细胞凋亡的影响。结果令人惊奇的发现，该多核苷酸及其编码的多肽作为一利细胞核内调控因子在TF-1细胞及其他人肿瘤细胞系的凋亡早期发挥明显的凋亡促进作用。

因此，本发明的一个目的是提供一种新的成熟的多肽，及其有生物学活性的并在诊断或治疗上有用的片段、类似物或衍生物。

本发明的另一个目的是提供编码本发明多肽的分离的核酸分子，其中包括mRNA、DNA、cDNA、基因组DNA及其类似物和其有生物学活性的并在诊断或治疗上有用的片段。

本发明的再一个目的是提供以重组DNA技术生产所说的多肽的方法，该方法包括在适于表达本发明的多肽的条件下培养含有编码所说多肽之核酸序列的重组体原核或真核宿主细胞，然后回收所说的多肽。

本发明的再一个目的是提供含有作为活性成分的上述多肽及一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂的药物组合物。

本发明的再一个目的是提供上述多肽或编码这些多肽的多核苷酸，在生产用于诊断或治疗细胞凋亡程序紊乱相关疾病的药物，如抗病毒剂、抗肿瘤剂，或胚胎发育及组织内环境稳定控制剂中的应用。

本发明的再一个目的是提供长度足以与本发明的核酸序列特异地杂交的核酸探针。

本发明的再一个目的是提供与上述多肽发生特异性免疫反应的抗体。

本发明的再一个目的是提供可用于抑制上述多肽的作用的拮抗剂，以及这些拮抗剂在生产用于治疗早老性痴呆、帕金森氏病、类风湿性关节炎、心肌梗塞、肝坏死、自身免疫病的药物中的应用。

下列附图是图解显示本发明的实施方案，而不意味着限制本发明的待批要求的范围。

图1显示本发明的cDNA序列(上行)(SEQ ID NO：1)及由之推测的蛋白质AAP14的氨基酸序列(下行)(SEQ ID NO：2)。由所示氨基酸序列组成的多肽是已鉴定的成熟形式的多肽(减去起始蛋氨酸残基)，并且其中使用标准的三字母缩写符号表示各氨基酸；

图2是对TF-1细胞进行去细胞因子所致细胞凋亡研究中所使用的cDNA呈现差异分析(cDNA-RDA)的战略示意图；

图3显示用于在原核宿主中表达本发明的细胞凋亡促进蛋白质AAP14的重组表达载体pMTY4AAP14的构建；

图4显示用于在真核宿主中表达本发明的细胞凋亡促进蛋白质AAP14的重组表达载体pcDIAAP14(+)的构建。

图5显示用重组表达载体pcDIAAP14(+)(1)、对照质粒pcDI(2)，和pcDIAAP14(-)(3)转染TF-1靶细胞后，以Annexin V凋亡检测试剂盒检测AAP14的瞬时表达对去细胞因子所致的TF-1细胞凋亡的影响。

图6显示AAP14对去除细胞因子后培养的TF-1细胞凋亡的影响。

图7显示AAP14蛋白质在稳定转化的MGC-803细胞中的表达对宿主细胞体外生长能力的影响。

图8显示重组表达载体pcDIAAP14稳定转染后对人肿瘤细胞去血清所致凋亡的影响。

根据本发明的一个方面，本发明提供编码具有图1(下行)(SEQ ID NO：2)所示推测的氨基酸序列之成熟多肽的分离的核酸(多核苷酸)。其中所说的成熟多肽是由保藏于中国微生物保藏委员会典型菌种保藏中心(CGMCC)，保藏登记号为CGMCC NO.0350(保藏日为1998年5月18日)的重组体大肠杆菌所携带的cDNA编码的。保藏物CGMCC NO.0350含有编码AAP14的cDNA。

可从人的神经组织、上皮组织和胚胎组织中，以及相关组织来源的肿瘤中检测到编码AAP14的多核苷酸。该多核苷酸含有编码125个氨基酸残基的开放读框(从核苷酸25到399)，并且其中ATG起始密码子的周边序列(GCCATGG)完全符合Kozak规律(见参Kozak M.J.Biol.Chem.266(30)：19867-19870，1991)。

本发明的多核苷酸可以是RNA形式的或DNA形式的，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA。该DNA可以是双链或单链的。如果是单链的，其可以是编码链或非编码(反义)链。

编码成熟多肽的编码序列可以完全相同于附图1(上行)(SEQ ID NO：1)中所示的或已保藏的重组体大肠杆菌所携带的编码序列，或者由于遗传密码子的简并性，其可以不同于编码相同成熟多肽及其衍生物的如图1(上行)(SEQ ID NO：1)所示的或已保藏的重组体大肠杆菌中所携带的DNA编码序列。

编码图1(下行)(SEQ ID NO：2)所示成熟多肽的多核苷酸可以只包括成熟多肽的编码序列或包括成熟多肽的编码序列和附加编码序列、成熟多肽的编码序列和非编码序列，例如内含子或成熟多肽之编码序列的5′和/或3′端非编码序列。

本发明进一步涉及编码具有图1(下行)(SEQ ID NO：2)所示推测的氨基酸序列之多肽或由已保藏的重组体大肠杆菌所携带的cDNA编码之多肽的片段、类似物及衍生物的上述多核苷酸的变异体，多核苷酸的变异体可以是该多核苷酸的天然存在的等位基因变异体，或其非天然存在的变异体。这样的变异体也可以是编码与图1(下行)(SEQ ID NO：2)所示推测的氨基酸序列的多肽有相同或相似生物学活性之多肽的缺失变异体、取代变异体及加入或插入变异体，所说的等位变异体是可以带有核苷酸取代、缺失或加入的，但实质上没有改变所编码之多肽的功能的多核甘酸序列的可替代形式。

本发明的多核苷酸也可具有在码内融合到为纯化本发明的多肽所需之序列上的编码序列。例如，在细菌宿主中表达时，可使用编码噬菌体MS2的序列作为标志并与之融合，以利于纯化所需的成熟肽。

可以使用本发明全长基因的片段作为cDNA文库的杂交探针，以分离全长度基因及其他与本发明的基因有高度序列相似性或相似生物学活性的基因。这些探针一般至少有30个碱基，并且也可含有多达50个以上的碱基。可使用这些探针鉴定相当于全长度转录物和含有完整基因之基因组克隆的cDNA克隆。筛选方法包括根据已知的DNA序列合成寡核苷酸探针，并使用含有与本发明的基因互补之DNA序列的标记的寡核苷酸筛选人cDNA基因组DNA或RNA文库，以分离出文库中与探针杂交的核苷酸序列。

本发明还涉及与上述序列至少有70％，较好90％，最好95％序列相同性的序列杂交的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。所说的“严格条件”是指只有当序列间至少有95％相同性时才发生杂交的杂交条件。与上述多核苷酸杂交的多核苷酸最好是编码与图1中所示cDNA编码的成熟多肽有基本上相同生物学功能或活性之多肽的多核苷酸。

另外，与本发明的多核苷酸杂交的多核苷酸可以是至少有10碱基，最好有30个碱基的连续序列，并且可以是有或没有保留活性的。可使用这样的多核苷酸作为回收图1所示多核苷酸的探针，或作为诊断探针，或作为聚合酶链反应(PCR)引物。

因此，本发明涉及与编码图1(下行)(SEQ ID NO：2)所示多肽的多核苷酸至少有70％，最好有90％相同性的多核苷酸及其至少有10个碱基，最好有30个碱基的片段，以及由这样的多核苷酸编码的多肽。

本发明进一步涉及具有细胞凋亡促进活性的本发明命名为AAP14的多肽，该多肽具有如图1(下行)所示的推测的氨基酸序列或具有由已保藏的重组体大肠杆菌所携带的多核苷酸序列编码的氨基酸序列，以及这些多肽的具有基本上相同功能或活性的片段、类似物和衍生物，并且其中所说的衍生物包括提高了或降低了生物学功能的多肽。

本发明的多肽可以是重组的多肽，天然多肽或合成的多肽，但最好是重组的多肽。

具有图1(下行)(SEQ ID NO：2)所示氨基酸序列的多肽或由已保藏的生物学材料携带的cDNA编码的多肽的片段、衍生物或类似物可以是其中的一个或多个氨基酸残基包括有取代基，或者其中成熟的多肽是与其他化合物，如用于提高该多肽之半寿期的化合物(如聚乙二醇或脂质)融合的，或者其中为纯化该成熟多肽而在其侧翼融合有附加氨基酸序列的多肽片段、衍生物或类似物。

本发明的多肽或多核苷酸最好是以分离的形式提供的，并且最好是纯化成均质材料的。所说的“分离的”是指已离开了其原有环境，如离开了活的生物体的或已离开其部分或全部共存材料的多肽或多核苷酸即为“分离的”多肽或多核苷酸。这样的多核苷酸可以是某种载体的一部分，和/或这样的多核苷酸可以是某种组合物的一部分，因为此时这样的载体或组合物已不是其天然环境的一部分，所以所说的多肽或多核苷酸仍是被分离的。

本发明的多肽包括如图1(下行)(SEQ ID NO：2)所示的多肽，以及与之至少有70％同源性，较好有90％同源性，最好有95％同源性或相似性的多肽，并且包括这些多肽的一部分，其中所说多肽的一部分一般至少包括20个氨基酸，较好包括至少40个氨基酸。如众所周知，两个多肽的“同源性”或“相似性”是通过将一种多肽的氨基酸序列和其保守的氨基酸取代物与第二种多肽的序列相比较而确定的。

可使用本发明多肽的片段或其一部分作为中间体，以肽合成法制备相应的全长度多肽，也可使用本发明多核苷酸的片段或其部分来合成本发明的全长度多核苷酸。

本发明还涉及携带所说的多核苷酸的载体、用该载体转化或转染的宿主细胞，以及以重组DNA技术生产本发明多肽的方法。

可用携带本发明多核苷酸的克隆载体或表达载体转导、转化或转染适当的宿主细胞。所用的载体例如可以是质粒、病毒颗粒或噬菌体形式的。可在为活化启动子、选择转化体或扩增所需的AAP14基因而适当修饰的常规营养培养基中培养被转导、转染或转化的宿主细胞。培养中所使用的温度、pH等培养条件一般都是由所选用的表达特定蛋白质的宿主细胞决定的，并且这些条件都是本领域技术人员熟知的。

可按重组DNA技术使用本发明的多核苷酸生产本发明具有细胞凋亡促进活性的多肽。为此，可将所说的多核苷酸插入到各种用于表达该多肽的适当表达载体中。这样的载体包括染色体、非染色体来源的或合成的DNA序列，例如SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA、酵母质粒、噬菌粒(由质粒和噬菌体DNA组合体衍生的载体)、以及病毒(如杆状病毒、牛痘病毒、腺病毒、家畜痘病毒)DNA，条件是这些载体能够在所选择的宿主细胞中复制并存活。

可用各种已知的方法将适当的DNA序列插入到载体的适当限制性核酸内切酶位点中。插入到表达载体中的DNA序列被可操作地连接到适当的表达控制序列即启动子上，以指导mRNA合成。这样的启动子的例子包括RSV、HIV、CMV或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp启动子、噬菌体λP_L启动子及在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的其他启动子。

此外，表达载体可含有启动翻译的核糖体结合位点及转录终止子，并含有一个或多个选择标志基因，以提供被转化之宿主细胞的可选择表型特征，如适用于真核细胞的新霉素抗性或二氢叶酸还原酶基因，或适用于大肠杆菌中的氨苄青霉素或四环素抗性基因。

可用含有上文所述适当DNA序列，以及适当启动子或其他转录与翻译控制序列的载体转化适当的宿主细胞，以使宿主表达所需的蛋白质。

可使用任何适当的宿主细胞表达本发明的多核苷酸，可提到的适当宿主的例子有：细菌细胞如大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等；真菌细胞如酵母细胞；昆虫细胞如果蝇和中国家蚕细胞；动物细胞如CHO、COS和HEK293细胞；以及人细胞如TF-1细胞、MGC-803和Hela细胞。

具体地说，本发明涉及包括上述一个或多个多核苷酸序列的重组构建体，该构建体包括在其中以正向或反向插入了本发明的多核苷酸序列的载体，如质粒或病毒载体，并且在所说的多核苷酸序列的上游可操作地连接了适当的调节序列如启动子序列。

适用的载体的例子包括用于真核细胞的pMT-hIL-3(马大龙，狄春辉，庞健等，(1991)高技术通讯11：26-29)、pQE-9(Qiagen)、pD10、pNH18A(Stratagene)、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；以及适用于真核细胞的pcDNA3、pCI、pWLNEO、pSG(Stratagene)、pSVL(Pharmacia)。适用的启动子包括lacI、lacII、T7、λP_L和trp等细菌启动子，以及CMV、SV40、HSV胸苷激酶等真核细胞启动子。

在一个实施方案中，本发明进一步涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞如哺乳动物细胞或人肿瘤细胞，或者是低等真核细胞如酵母细胞，或者是原核细胞如大肠杆菌细胞。可用本领域已知的方法如氯化钙转染法、脂质体转染法、电穿孔法或微粒轰击法将所说的构建体导入宿主细胞内。

可按常规方法使用包含在宿主细胞中的构建体产生由重组DNA序列编码的多肽产物。或者，也可使用常规的肽合成仪化学合成本发明的多肽。或者，也可使用衍生于本发明的DNA构建体的mRNA，在无细胞翻译系统中产生所需的蛋白质。

必要时，为了增强编码本发明多肽的DNA在高等真核细胞中的转录效率，可在载体中插入增强子序列。增强子是一般约含10-300个碱基对并作用于启动子以增强DNA转录的顺式作用元件。另外，必要时也可在启动子和下游结构序列之间插入一个能指导翻译产物向周质或细胞外培养基中分泌的前导序列(分泌信号)。或者，可根据需要导入编码融合蛋白质的异源DNA序列，所说的融合蛋白质可包括一个赋予所需特征，如用于稳定被表达之产物的或简化其纯化步骤的N未端识别肽。

可适用于原核细胞的市售表达载体一般均带有可选择标志和细胞复制原点，以及已知克隆载体pBR322(ATCC 37017)的其他遗传元件。这样的市售载体包括pGEM(Promega)和pKK223-3(Pharmacia)。可根据所选用的适当启动子和待表达的结构基因序列来选择衍生于pBR322的适当载体。

在转化宿主细胞并在被转化的宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法(如温度变动或化学物质诱导)诱导启动子，然后继续培养之。培养完成后，可用离心法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。

也可用各种哺乳动物细胞表达本发明的重组蛋白质。哺乳动物表达系统的例子包括人肿瘤细胞系，如Hela、TF-1和MGC-803细胞系，以及COS、CHO和BHK细胞系。哺乳动物表达载体可含有复制原点、适当的启动子和增强子、多聚腺苷酸化位点、切接供体和受体位点、转录终止序列，及5′侧翼非编码序列。可使用衍生于SV40切接和聚腺苷酸化位点的DNA序列来提供必要的遗传元件。

可以用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的AAP14多肽，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。

本发明的多肽可以是从天然来源纯化的或化学合成的，或以重组DNA技术由原核或真核宿主产生的。根据重组生产方法中所用宿主的不同，本发明的多肽可以是糖基化的或非糖基化的，并且包括一个起始蛋氨酸残基。然而，对本发明的推测的氨基酸序列的计算机分析却发现其不带有信号肽和跨膜序列，也没有DNA结合位点和N-糖基化位点。

我们利用Prostite计算机软件对本发明的推测的AAP14多肽氨基酸序列所作的分析表明，该多肽没有信号肽和跨膜的序列，也没有发现DNA结合位点和N-糖基化位点。另外，发现序列中第100位上的Ser可能是cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点，而且有4个潜在的蛋白激酶C磷酸化位点(位置51，84，103和108)。计算的AAP14蛋白质的分子量约为14,285道尔顿，等电点为pH5.65。

对本发明AAP14多肽的氨基酸序列所作的同源性分析显示，AAP14在人、小鼠、线虫和某些酵母及真菌种属之间有相当程度的保守性。另外发现，其与来自酵母的一个未知功能的16KD蛋白质间具有大约59％的同源性，这些结果表明AAP14基因可能是在真核生物进化中稳定保留的并对细胞凋亡过程起着重要调节作用的基因。以mRNA斑点杂交法检测AAP14 mRNA在人各种组织样品中的分布，证明AAP14在大多数成人组织如心脏、睾丸、胃、肾脏、脑垂体、肾上腺、肾脏、肺脏中，以及造血系统中均表现有高水平表达。相反，AAP14在胚胎组织如胎儿脑、胎儿心脏、胎儿肾、胎儿肝、胎儿脾、胎儿胰脏及胎儿胸腺等组织中则只有很微弱的表达或完全没有可检测的表达。用同样方法检测AAP14在人肿瘤细胞系(Hela细胞、K562细胞和MGC-803细胞)和正常组织细胞系(滑膜细胞)中的表达，发现AAP14在人肿瘤细胞内的表达显著高于其在正常细胞中的表达。

在一个实验实例中，用一个前已构建的携带编码AAP14多肽之多核苷酸序列的重组表达载体(pEGFPC3AAP14)转染Hela细胞后，以萤光染色法进行AAP14的细胞内定位分析，结果显示AAP14多肽定位在细胞核内。

上述这些结果提示该多肽可能在细胞凋亡中发挥负调节作用。在调节基因转录中，进而可能在调节成熟组织细胞的增殖分化和细胞内环境稳定中发挥作用。

另一方面，在对本发明的AAP14多肽的进一步功能研究中发现，当存在细胞因子时，AAP14基因转染的TF-1细胞可高水平表达AAP14多肽，然而该表达产物并没有明显地影响TF-1细胞的存活性，也不能诱导TF-1细胞的凋亡。但在去除细胞因子后，AAP14的高表达则明显地加速了包括TF-1细胞在内的人肿瘤细胞系(如MGC-803胃癌细胞和Hela细胞)的凋亡(图6，图7)。因此推测AAP14可能是一种以前没有发现的新的细胞凋亡促进因子，其可能辅助其他细胞凋亡诱导因子发挥细胞凋亡促进作用，但似乎没有细胞凋亡诱导作用。

应特别指出的是，用AAP14基因稳定地转染某些人肿瘤细胞系的实验结果显示，AAP14可显著地抑制MGC-803胃癌细胞的体外生长，而对Hela细胞则表现有一定程度的生长抑制作用，尽管这种作用较小。另外，当从营养培养者中去除血清以诱导细胞凋亡时，用AAP14的编码序列稳定地转染这些细胞系，可见MGC-803细胞和Hela细胞均显著地加速了细胞凋亡的发生。同样，借助脂质体转染技术，将我们利用大肠杆菌表达系统产生的重组AAP14导入上述肿瘤细胞系内，可见该蛋白质对这些细胞有明显的凋亡促进效应，而对正常细胞系(如HEK293)则未见有这种促进效应。

这些结果是令人惊奇的，因为基于上述这些研究，有可能利用本发明的AAP14多肽促进肿瘤细胞凋亡或变应性免疫活性细胞凋亡的功能，将其用作治疗剂，用于治疗某种肿瘤、自身免疫病、病毒感染及其他细胞编程性死亡相关疾病或病理状态。鉴于已证实本发明的AAP14没有直接诱发正常细胞凋亡的功能，故可能使这一潜在应用具有更大的应用价值。

因此，可应用AAP14多肽纠正和调整受异常控制的编程性细胞死亡。受异常控制的编程性死亡可能是以细胞过度生长和不完善分化为特征的肿瘤的根本原因。由于已表明AAP14可能参与细胞凋亡过程的某个未知的环节或步骤，因此可将其用于定向控制或加速某些异常生长的细胞如肿瘤细胞的凋亡进程。因其促进细胞凋亡的能力，也可使用AAP14控制脊椎动物，特别是高等哺乳动物的发育及组织内环境稳定。另外，由于编程性细胞死亡可能是细胞的抗病毒防御机制之一，所以也可能使用本发明的AAP14克服受抑制的编程性细胞死亡，以对抗许多病毒感染性疾病。

本发明进一步涉及包括抗体或寡肽在内的AAP14多肽的潜在拮抗剂。这些拮抗剂可与AAP14多肽结合，从而阻止本发明多肽的作用。

可使用本发明的多肽，其片段或类似物或衍生物，或表达这些多肽的细胞作为免疫原，以生产该多肽的抗体。这些抗体可以是多克隆或单克隆抗体，并且包括嵌合的、单链的和人源化的抗体及其Fab片段。可用各种已知的方法生产这些抗体和其片段。以常规方法得到的抗体可与多肽本身结合。一般说来，使用只编码本发明的多肽之一部分的序列产生的抗体也能够与整个天然多肽结合。然后可用这样的抗体从表达本发明多肽的组织材料中分离所需的多肽。

可用杂交瘤技术(Kohler and Milstein，Nature 256：495-497，1975)或人B细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.，Immunology Today 4：72，1983)生产人单克隆抗体。另外，可用转基因小鼠来表达抗本发明的免疫原性多肽产物的人源化抗体。

另外，可用反义技术制备反义构建体，通过三股螺旋形成反义DNA或RNA来控制基因表达。例如，可使用编码本发明多肽之多核苷酸序列的5′编码部分设计10-30bp长度的反义RNA寡核苷酸。也可设计与基因的转录区域互补的DNA寡核苷酸，从而借以阻止表达产物的转录和产生(参见Cooney et al.，Science241：456，1988；Dervan et al。Science 251：1360，1991)。反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交并阻断mRNA分子的翻译。

可使用拮抗剂治疗与心血管病、卒中、肝坏死、创伤有关的非编程性坏死性细胞死亡，以及因AAP14基因的异常调节导致病理性细胞死亡的其他退化性疾病，如早老性痴呆(阿尔茨海默氏病)、帕金森氏病和类风湿性关节炎。

可使用本发明的多肽或其拮抗剂作为基本活性成分，与一种或多种医药上可接受的载体或赋形剂混合，制成药物组合物。根据治疗目的和给药途径的不同，以及使用方法的不同，可使用不同的载体或赋形剂将本发明的药物组合物制成多种不同的剂型。例如可制成适于各种给药途径，特别是胃肠道外途径给药的溶液剂、脂质体包裹剂、微胶囊剂及其他缓释制剂。使用的载体或赋形剂包括但不只限于生理盐水、等渗葡萄糖溶液、缓冲盐水、甘油、乙醇和其组合。可根据需要，在本发明的组合物中加入一种或多种其他辅助成分，例如有与本发明的AAP14有协同作用的其他天然的、合成的或重组的活性化合物，以及选自人血清白蛋白、低分子量肽，氨基酸(如甘氨酸或赖氨酸)和金属阳离子(如Zn²⁺，Mn²⁺，Mg²⁺和Ca²⁺)的蛋白质保护剂；选自聚乙二醇、羧甲基纤维素、多聚甘氨酸、谷胱甘肽的稳定剂；以及适当的蛋白酶抑制剂。在粘膜或皮肤局部给药的情况下，所说的组合物可含有例如选自二甲基亚砜和月桂氮卓酮的皮肤渗透剂，以及适当的自由基清除剂。

为了使用上的方便和便于维持组合物各成分特别基本活性成分的生物学活性，可将本发明的药物组合物制作成药盒的包装形式，这样的药盒可包括一个或多个装有本发明药物组合物之一种或多种成分的容器，并在每个容器上按政府制药管理机构指定的形式注明有关药物的使用或销售的审批情况。

可通过常规途径，特别是胃肠道外途径投用本发明的药物组合物，例如通过静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下或粘膜内途径给药。本发明药物组合物的有效剂量范围可从几微克到几毫克/公斤体重/天，但针对每个特定病人的具体用药剂量应根据待治疗疾病或病理状态的性质及严重程度、病人的年龄、体重、一般健康状况及给药方式等因素由临床医生来确定。

也可以根据本发明在体内表达本发明的多肽，即以所谓的“基因治疗”方法使用这些多肽。例如，可以用编码本发明。多肽的多核苷酸于体外基因工程化处理病人的细胞，然后再将工程化改造的细胞导入欲用所说的多肽治疗的病人体内。例如可使用含有编码本发明多肽的RNA反转录病毒颗粒来转染并工程化改造所说的在体内表达本发明多肽的细胞。可按已知方法将产生含有编码本发明多肽之反转录病毒颗粒的生产细胞投用于病人体内，以在体内对细胞进行基因工程化改造并在体内表达所说的多肽。

上述这些方法以及用于这些方法的反转录病毒、包含在载体内的适当的启动子、包括启动子和处于适当启动子控制下之多核苷酸编码序列的载体、用于转录包装细胞系以形成生产细胞系的逆转录病毒质粒载体，以及适当的可被转染的包装细胞都是基因治疗领域中已知的。

可借助各种已知的方法用携带本发明多肽之核酸编码序列的载体体外或体内转导包装细胞或靶细胞。这些方法包括但不只限于电穿孔、微粒轰击(例如使用Biolistic装置)、脂质体转染法(例如使用脂质体)，以及CaPO4沉淀法或这些方法的联合使用(例如机械或电穿孔+微粒轰击)。另外，也可以将反转录病毒质粒载体包裹在脂质体中，或者偶联到脂质体上，然后再运送到宿主体的适当靶细胞内。

总之，可由生产细胞系产生包含本发明多肽之核酸编码序列的感染性反转录病毒载体颗粒，然后使用这样的载体颗粒于体外或体内转导宿主真核细胞。被转导的真核细胞将表达编码所说多肽的核酸序列。可被转导的真核细胞包括但不只限于胚胎干细胞、胚胎癌细胞和成人癌细胞，以及造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细胞、间质细胞、上皮细胞及表皮细胞。

本发明还涉及使用本发明的多核苷酸作为诊断试剂，检测突变形式的基因以诊断因体内AAP14表达不足所导致的疾病或病理状态。

可用各种技术在DNA水平上检测携带AAP14基因突变的个体。可从病人的细胞中，如血液、尿液、唾体或活体或尸检材料中得到用于诊断试验的核酸。可以使用基因DNA或RNA直接进行检测，也可以使用PCR方法(Saiki et al.，Nature 324：163-166，1986)扩增DNA后再进行检测。例如，可使用与编码本发明多肽的核酸互补的PCR引物鉴定和分析待检材料中相应基因的突变，如可与正常基因型相比较并根据扩增产物的大小改变来确定待检基因的缺失或插入。可将扩增的DNA与放射标记的AAP14 RNA或反义DNA序列杂交，以鉴定点突变。

可用直接DNA测序法分析参考基因和突变基因之间的序列差异。另外，也可利用克隆的DNA片段作为探针并结合PCR方法，以高敏感性和特异性来检测特定的DNA片段，例如可联合使用测序引物和由扩增的PCR产物产生的单链PCR产物或单链模板分子。

可以在含有或不含变性剂的凝胶，特别是高分辨率凝胶中检测DNA的电泳迁移率来完成基于DNA序列差异的遗传学试验。可在变性甲酰胺梯度凝胶上区分不同序列的DNA片段(如参见Myers et al.，Science 230：1242，1985)。另外，也可用核酸酶保护检测法或化学裂解法(如参见Cotton et al.，PNAS，USA，85：4397-4401，1985)揭示特定部位的序列改变。

本发明还涉及检测各种组织中AAP14蛋白质水平改变的诊断试验法。用于检测得自宿主体内之样品中的AAP14蛋白质水平的检测法是本领域技术人员已知的，并包括放射免疫法、竞争性结合法、Western印迹分析法及酶联免疫吸附法(ELISA)。其中优选的方法是ELISA法。

本发明的多核苷酸序列对于染色体鉴定也是有价值的。该序列可特异地定位于个别人染色体的特定位置并可与之杂交。按照本发明，对本发明的DNA进行染色体作图是将这些序列与疾病相关基因联系起来的第一个重要步骤。

可从cDNA制备PCR引物以进行序列的染色体作图。对基因的3′非翻译区进行计算机分析，以迅速选择出跨越基因组DNA中一个以上外显子并从而卷入扩增过程中的引物。然后使用这些引物以PCR法筛选含有个别人染色体的体细胞杂种。只有那些含有对应于引物之人类基因的杂种才产生扩增的片段。对体细胞杂种进行PCR作图是一种指定特定DNA在特定染色体上的位置的便利方法。在按照本发明使用同样的寡核苷酸引物的情况下，可用一组得自特定染色体的片段或大的基因组克隆群体按相似方法完成亚定位。然后再用萤光原位杂交法(FISH)对cDNA克隆进行精确的染色体定位(参见Verma et al.，Humanchromosomes：A Manual of Basic Techniques，Pergamon Press，NY(1988))。

一旦完成了序列的精确染色体定位作图，即可将该序列的物理位置与遗传图数据联系起来。然后通过连锁分析(物理相邻基因的共遗传)来鉴定作图定位于同一染色体区域上的基因与疾病之间的关系。然后，可确定受损或未受损个体间的cDNA或基因组DNA的差异。如果在某些或全部受损个体中观察到突变，而正常个体中没有观察到这种突变，则该突变便很可能是致病因素。随着物理作图和遗传作图技术的进展，估计精确地定位于疾病相关染色体区域的cDNA可能是50至500个潜在病原基因之一。

以下借助实施例进一步举例描述本发明，但应明确的是，这些实施例并不以任何方式构成对本发明待批权利要求范围的限制。

实施例1：从凋亡的TF-1细胞基因组中扩增凋亡相关基因

利用文献中报导的cDNA-呈现性差异分析(cDNA-RDA)技术(参见HubankM，Schatz DG.Nucleic Acids Research 22(25)：5640-5648，1994)，从去除细胞因子诱导凋亡的人白血病前髓细胞系TF-1细胞(Kitamura，T.，et al，J.Cell.Physiol.140：323-334，1989)中鉴定并分离细胞凋亡相关基因。

将TF-1细胞(由中国药品生物制品检定所丁锡申教授提供)培养在含有10％胎牛血清(FCS)和100U/ml氨苄青霉素+链霉素的RPMI1640培养基中。在细胞培养物中加入细胞因子GM-CSF(100U/ml)，待细胞生长到密度约为2×10⁷/ml时离心收集细胞并用Hank氏液洗3次，然后重新悬浮于不加GM-CSF，但含FCS的同样培养基中继续培养8小时。

培养完成后，收集细胞并按已知方法从加或不加细胞因子条件下培养的TF-1细胞中分别提取总RNA和mRNA。其中总RNA用于狭线杂交和Northern印迹分析。mRNA用于合成cDNA。

用上述分别从加有或不加细胞因子培养得到的TF-1细胞中提取的mRNA作为模板，使用SuperscriptTM cDNA合成试剂盒(GIBCO-BRL Co.)并按制造商推荐的方法合成单股和双股cDNA。

然后按附图2中所示的策略进行呈现差异分析或称差式杂交，以期从处于条件凋亡早期的TF-1细胞基因组DNA中找到凋亡相关基因。

为此，首先用核酸内切酶DpnII消化按上述方法制备的cDNA(各2μg)，然后在T4 DNA连接酶作用下，将各cDNA片段连接到合成的寡核苷酸(R-连接子)：

RBg124：5′-AGCACTCTCCAACCTCTCACCGCA-3′(SEQ ID NO：3)，和

RBg112：5′-GATCTTGGGGTGA-3′(SEQ ID NO：4)上，使用寡核苷酸RBg124(SEQ ID NO：4)作为引物，对连接产物进行PCR扩增，分别得到试验者cDNA(Tester cDNA)和驱动者cDNA(Driver cDNA)的扩增子。用DpnII酶消化该扩增产物以除R-连接子(RBg124和RBg112)并回收200-1600bp片段。然后将所得到的试验者cDNA(2μg)连接到J-连接子：

JBg124：5′-ACCGACGTCGACTATCCATGAACA-3′(SEQ ID NO：5)，和

JBg112：5′-GATCTGTTCATG-3′(SEQ ID NO：6)上，使加入新的J-连接子的试验者cDNA(0.4ng)与过量驱动者cDNA(1∶100 W/W)于65℃下杂交约20小时。在此条件下，试验者cDNA序列中特异表达的部分(图2，空心部分)将退火形成同源双链，并且两端均连有J-连接子(JBg124和JBg112)。驱动者和试验者cDNA中均得以表达的部分(图2，涂黑部分)则退火形成异源双链。使用寡核苷酸JBg124(SEQ ID NO：5)作为引物进行PCR扩增，可见上述同源双链发生了有效的双链扩增，而异源双链则只有单链延伸。用绿豆核酸酶消化扩增产物并用DpnII酶切除J-连接子后，用此PCR反应产物转染适当的质粒；或者分离相应片段(DP1)并分别连接到另一对寡核苷酸(N-连接子)：

NBg124：5′-AGGCAACTGTGCTATC CGAGGGAA-3′(SEQ ID NO：7)，和

NBg112：5′-GATCTTTCCCTCG-3′(SEQ ID NO：8)上，并以NBg124或JBg112作为引物进行第二次和第三次扩增(分别得到DP2和DP3)。第三次RDA分析时，驱动者和试验者cDNA的杂交反应物比例(W/W)高达4000∶1。对第三次RDA差式杂交的反应产物进行电泳分离，凝胶上显示出明显的基因差异表达趋势。

用DpnII消化第三次扩增得到的产物(DP3)，并将所得片段连接到质粒载体pGEM-3ZF(Promega Co.)中。用此连接产物转化大肠杆菌XL1-Blue菌株(由中国海军总医院王琰教授提供)，并筛选出20个白色阳性克隆。以荧光素标记的反向引物作为测序引物，使用ALIF^TM DNA序列仪和Auto Read^TM测序试剂盒(均购自Pharmacia Biotech Co.)，在T7 DNA聚合酶作用下对选择的克隆进行DNA序列分析。将其中一个可能有某些重要功能的基因定名为TFAR19(刘红涛等，生物化学与生物物理进展，待出版)(该基因在GenBank的登记号为AF014955)。本文中将该基因称为AAP14基因。

使用TriZ0L^TM试剂盒(GIBCO-BRI Co.)提取各大约1×10⁷个去GM-CSF培养8小时后的TF-1细胞及相同数目不去GM-CSF培养的TF-1细胞的总RNA。提取的总RNA经分光光度计(Beckman 640)定量后，按文献(Sambrook J.FritschEF，Maniatic T(1989)″Molecular cloning-a Laboratory manual″2^nd edition，pp343-374，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA)所述方法并使用随机引物荧光素标记试剂盒(Dupont NEN NEL803)进行狭线或Northem杂交。狭线和Northern杂交结果显示第19号克隆(TFAR19)在去GM-CSF培养8小时后的TF-1细胞中高表达，提示它在TF-1细胞去GM-CSF所致凋亡中发挥某些作用。

实施例2：AAP14全长cDNA序列的克隆、其结构特征及组织分布分析

依据实施例1中获得的AAP14(TFAR19)的部分cDNA序列设计并合成引物：正向引物：5′-GGCCCGGGCCAGGTTAAGTAACTTAGC-3′(SEQ ID NO：11)；反向引物：5′-GCTAAGTTACTTAACCTGGCCCGGGCC-3′(SEQ ID NO：12)。利用快速cDNA末端扩增技术(RACE法)克隆编码AAP14的全长cDNA序列。使用Marathon cDNA扩增试剂盒(CLONTECH公司)提供的AP1连接子引物和上述正向和反向引物进行扩增，从去GM-CSF 8小时后出现凋亡的TF-1细胞文库中扩增出AAP14的全长cDNA。将扩增的PCR产物纯化后克隆至pGEM-TEasy载体(Promega公司)中进行序列测定。在此基础上得到长度为559bp，包括Poly A序列及“AATAA”加尾信号的全长AAP14 cDNA序列(图1，上行)。根据序列分析，AAP14从25-399bp有一个编码125个氨基酸的读码框架(图1)。ATG起始子周边序列(GCCATGG)完全符合Kozak规律。利用Prosite计算机软件分析推测的氨基酸序列，没有发现信号肽、穿膜区序列、也没有发现DNA结合位点及N-糖基化位点。第100位的丝氨酸为可能的cAMP和cGMP依赖蛋白激酶磷酸化位点。计算分子量为14,285道尔顿，等电点为pH5.65。对氨基酸序列进行同源性分析发现该基因与酵母的一个分子量约16.0KD的功能未知蛋白有一定同源性并发现AAP14在各种属(鼠、线虫、酵母、真菌等)之间有较高的保守性。这提示AAP14在进化中相当保守，与其他凋亡相关分子的保守特性相一致。

使用Human RNA Master Blot^TM试剂盒(CLONTECH公司)，对大约50种人体组织中的AAP14 mRNA进行了斑点杂交检测，同时提取多种人类细胞系的总RNA，检测这些细胞中AAP14 mRNA的表达。实验结果发现，人AAP14在人类50种组织中均有表达，而不只限于造血系统，其中在成年心脏、睾丸、肾脏、脑垂体、肾上腺及胎盘等组织中以高水平表达，而在各个胚胎组织中的表达则远低于成年组织。此外，检测发现AAP14在人类细胞株K562，U937，293中均有表达，但在HL-60细胞中无表达，而且发现其在凋亡的TF-1细胞中表达明显高于非凋亡的TF-1细胞(数据未示出)。

实施例3：AAP14蛋白质的原核细胞表达及纯化

依据对AAP14之DNA编码序列的测序结果，设计并合成用于扩增AAP14编码区cDNA的PCR寡核苷酸引物。这些引物分别相应于加工后的AAP14蛋白质的5′和3′编码序列。5′寡核苷酸引物具有序列5′-ATGGCGGACGAGCTTGAG-3′(SEQ ID NO：9)；3′寡核苷酸引物具有序列5′-AAGCTCGAGTCT GTGCACTTGTAGTTC-3′，并含有一个Xho I限制性酶切位点(划下线部分)。将PCR扩增产物直接连接到测序载体pGEM-T-Easy(PromegaCo.)上得到测序质粒pGEM-TTFAR19并进行核苷酸序列测定，所测得的序列与实施例2中测得的序列完全一致。按照用于专利程序的国际公认微生物保藏布达佩斯条约的规定，携带重组质粒pGEM-TTFAR19的大肠杆菌菌株已于1998年5月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(CGMCC)，其保藏登记号为CGMCC NO.0350。

用Klenow酶消化PCR扩增产物以除去3′端突出的腺苷酸(A)尾部，然后再用Xho I酶消化以除去3′侧翼序列。电泳分离并纯化扩增的AAP14编码序列，然后将其连接到预先用Stu I-Xho I酶切的质粒载体pMTY4中，得到含有AAP14编码序列的重组表达质粒pMTY4 AAP14(图3)。质粒pMTY4是在本实验室原来用于表达人IL-3的重组质粒pMTY-hIL-3(马大龙等，高技术通讯11：26-29，1991)中插入得自质粒pcDNA-3(Invitrogen Co.)的多克隆位点(MCS)而构建的。

用于表达本发明的AAP14蛋白质的宿主是大肠杆菌菌株pop2136。该菌株为大肠杆菌C600的衍生菌株，其含有编码温度敏感性λ阻遏蛋白的DNA序列(CI 857)，故可在提高培养温度(42℃)后诱导P_L启动子，启动目的产物的表达。以氯化钙转化法用重组载体pMTY4AAP14转化大肠杆菌pop2136。。在添加氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中将携带所需构建体的克隆培养过夜(SambrookJ.Fritsch EF and Maniatic T，(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2ndedition，ppl.76-1.81，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA)。然后将过夜培养物接种到大的培养物中(1∶100-200)。当细胞生长到OD 600光密度约0.5时，将培养温度由37℃提高到42℃，以诱导P_L启动子，并启动表达融合形式的MS2-AAP14蛋白质(两多肽之间为带有凝血酶切割位点的衔接序列)。

培养48小时后，离心收集细胞并经超声处理以裂解之。分离包涵体后，使之在8M尿素+20mM甘氨酸/NaOH(pH10.0)中37℃变性30分钟。然后用水将变性溶液中的尿素稀释到1M以使蛋白质产物复性。27℃下用凝血酶裂解融合蛋白质(约12小时)后，在裂解反应溶液中加入20mM甘氨酸/氢氧化钠溶液(pH10.0)，并将此混合溶液上样于DEAE离子交换层析柱。用含有NaCl梯度的50mM Tris-HCl(pH8.9)洗脱，当Nacl浓度的为0.04M时洗出目的蛋白质AAP14。

实施例4：AAP14蛋白质在TF-1细胞中的瞬时表达及其对细胞凋亡的影响

为了观察本发明的AAP14蛋白质在培养的人肿瘤细胞系中的表达及其对这些细胞系，特别TF-1细胞编程性细胞死亡的影响，首先构建适于在真核细胞中表达AAP14的重组表达载体。为此，用EcoR I酶切割实施例3中所述的重组质粒pGEM-T，以得到编码AAP14的DNA片段(长度约420bp)。然后将所得片段插入到用同一内切酶消化，并用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)处理的质粒pcDI(刘红涛等，中国肿瘤生物治疗杂志，3(2)：135-138，1996)中，得到携带AAP14之DNA编码序列的重组质粒pcDI-AAP14(参见图4)。本实施例使用的起始质粒pcDI是用质粒pC1(Promega公司)中的Bgl I-Kpn I片段取代质粒pcDNA3(购自Invitrogen Co.)中的Bgl I-Kpn I片段后得到的。

按已知方法(Sambrook J.Fritsch EF and Maniatic T，(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual 2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，USA)用以正确方向连接有AAP14基因的重组表达质粒pcDI-AAP14(+)瞬时转染培养的TF-1细胞。并使用不携带AAP14编码序列的质粒pcDI和以反向连接有AAP14DNA编码序列的反向质粒pcIDAAP14(-)转化的TF-1细胞作为对照。转染后，将各组转化细胞分成三份，分加于三个装有含10％FCS和100μg/ml氨苄青霉素之RPMI1640培养基的微量培养管中。37℃保温2小时后，第一管内加入100μg/ml细胞因子GM-CSF(50μl)、第二管加入50μg/ml GM-CSF(50μl)、第三管内加入等体积的生理盐水。37℃继续培养48小时后，离心收集细胞并用20mMPBS洗细胞3次。将细胞重新悬浮于1×结合缓冲液(200μl)中，然后向各管内的细胞悬液中加入10μl Annexin V-异硫氰酸荧光素(FITC)、5μl PI。染色并于室温下避光放置15分钟后向各管内加入300μl PBS。使用流式细胞仪(BECTONDICKINSON FACScan)测定488nm波长吸光率(A480)，以检测被转染后细胞的平均荧光强度。可使用市售的ApoAlert^TM凋亡检测试剂盒(CLONTECH CO.)完成这一实验。

在加有细胞因子GM-CSF(100μg/ml和50μg/ml)的营养培养基中生长的转化体细胞，无论是被编码AAP14的多核苷酸序列转染的，还是被空质粒(pcDI)或反义质粒(pcDIAAP14(-))转染的，在该系统中均测得相似的平均荧光强度(结果未示出)。因此可以推测AAP14蛋白质在TF-1细胞中的瞬时表达并不能诱导TF-1细胞的凋亡，而且对TF-1细胞的存活性也没有影响。然而，在去除细胞因子GM-CSF的同样培养基中培养细胞以诱导细胞凋亡的情况下，用质粒pcDIAAP14(+)转化之细胞的平均荧光强度增高(约高45％)(图5)。因此，推测本发明的AAP14蛋白质(或其核苷酸编码序列)可能在细胞内参与编程性细胞死亡过程并表现有促进细胞凋亡的功能。

分别在加有GM-CSF存在和去除GM-CSF培养TF-1细胞的培养基中加入按实施例4所述方法制备的纯化的AAP14蛋白质，使其终浓度分别为3μg/ml，6μg/ml，12μg/ml。作用4小时后收集两组细胞，利用上述的Annexin V试剂盒(CLONTECH公司)检测TF-1细胞的凋亡，结果发现在GM-CSF的存在下，AAP14蛋白质对TF-1细胞凋亡没有作用，而去除GM-CSF 4小时后，AAP14蛋白能显著加速TF-1细胞的凋亡(图6)，此结果与质粒转染的结果相符，进一步证实AAP14是TF-1细胞凋亡的促进剂而不是诱导剂。

实施例6：AAP14对其他肿瘤细胞生长的影响

为了进一步研究AAP14对肿瘤细胞生长和凋亡的影响，将实施例5中构建的AAP14真核表达载体瞬时转染至人胃癌细胞株MGC-803细胞和人卵巢癌细胞株Hela细胞中，利用MTT方法(Sargent JM，Taylor CG，BrJ.Cancer，60：206-210，1989)检测细胞增殖能力，结果发现AAP14正义表达载体转染的上述两种细胞的生长能力受到抑制。

用pcDI、pcDIAAP14(+)、pcDIAAP14(-)质粒转染的Hela和MGC-803细胞培养48小时后，在其培养中加入G418(起始浓度为400μg/ml)继续培养，每隔3-4天换一次培养基，并逐渐增加G418的浓度直至1mg/ml。培养开始时大部分细胞脱落死亡，2周后少数存活的细胞逐渐增殖形成克隆。一个月后得到稳定地表达pcDI、pcDIAAP14(-)的MGC-803细胞株和Hela细胞株，以及稳定地表达pcDIAP14(-)的Hela细胞株。以狭缝RNA及基因组DNA杂交法鉴定所得的稳定表达株。

将上述稳定表达株以2×10⁴/ml铺敷于24孔微量滴定板中，每个稳定表达株各铺3×6孔。每天取3孔各稳定表达株，经过胰酶消化后在计数板上进行细胞计数，连续计数6天后绘制各个细胞株的生长曲线。结果发现pcDIAAP14(+)稳定转染的803细胞的体外生长明显减慢，而Hela细胞的同一种稳定表达株的体外生长则没有明显改变，这说明AAP14的胞内表达可抑制某些肿瘤的生长(图7)。

另一方面，将上述稳定表达株铺敷于6孔微量滴定板中(2×10⁵/孔)，37℃培养过夜并用(0.01M)PBS(pH7.4)洗三次后，加入不含胎牛血清(FCS)的RMPI-1640培养基，继续培养48或者96小时。然后用胰酶消化并离心收集细胞。将收集的细胞用0.01M PBS洗三次后再用70％乙醇固定过夜。离心收集过夜后培养的细胞并用0.01M PBS洗一次后，调整细胞浓度至1-3×10⁶/ml并加入PI染液(终浓度为50μg/ml)，然后加入RNase A 100U/ml，室温下作用30分钟。按已知方法用流式细胞仪(BECTON DICKINSON FACSCAN)同时分析前射光(FSC)和侧向光(SSC)以确定凋亡细胞的百分数(Nicolett I.，Migliorati G，Pagliacai MC etal.(1991)J.Immanol.Methods，139：271-279)。

从图8所示的结果可以看出，pcDIAAP14(+)稳定转染的MGC-803和Hela细胞株在去除血清培养48和96小时后，凋亡程度远远高于对照细胞株，说明AAP14的高表达可促进肿瘤细胞在去血清细胞所致凋亡的发生。

                 序列表(1)、一般信息

(i)申请人：北京医科大学、北京北医联合生物工程公司

(ii)发明名称：具有细胞凋亡促进活性的多肽

(iii)序列数：12

(iv)通讯地址：

(A)联系人：马大龙

(B)街道：海淀区学院路38号

(C)城市：北京

(D)国家：中华人民共和国

(E)邮编：100083

(v)计算机可读形式：

(A)介体类型：3.5英寸软盘

(B)计算机：AST Premium III+4/66d

(C)操作系统：WINDOWS 95

(D)软件：WORD 97

(vi)电讯信息：

(A)电话：86-10-62091149

(B)电传：86-10-62091149(2)SEQ ID NO：1的信息

(i)序列特征：

(A)长度：559个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA(iii)序列描述：SEQ ID NO：1

    10           20           30            40            50           60CTGCTCCAGC   GCTGACGCCG   AGCCATGGCG    GACGAGGAGC    TTGAGGCGCT   GAGGAGACAG

    70           80           90           100           110          120AGGCTGGCCG   AGCTGCAGGC   CAAACACGGG    GATCCTGGTG    ATGCGGCCCA   ACAGGAAGCA

   130          140          150           160           170          180AAGCACAGGG   AAGCAGAAAT   GAGAAACAGT    ATCTTAGCCC    AAGTTCTGGA   TCAGTCGGCC

   190          200          210           220           230          240CGGGCCAGGT   TAAGTAACTT   AGCACTTGTA    AAGCCTGAAA    AAACTAAAGC   AGTAGAGAAT

   250          260          270           280           290          300TACCTTATAC   AGATGGCAAG   ATATGGACAA    CTAAGTGAGA    AGGTATCAGA   ACAAGGTTTA

   310          320          330           340           350          360ATAGAAATCC   TTAAAAAAGT   AAGCCAACAA    ACAGAAAAGA    CAACAACAGT   GAAATTCAAC

   370          380          390           400           410          420AGAAGAAAAG   TAATGGACTC   TGATGAAGAT    GACGATTATT    GAACTACAAG   TGCTCACAGA

   430                       440           450           460          470                       480CTAGAACTTA   ACGGAACAAG   TCTAGGACAG    AAGTTAAGAT    CTGATTATTT   ACTTTGTTTA

   490          500          510           520           530          540TTGTCTATAT   GCCTTTTAAA   AAAATAAACT    TGTTATGCAA    AAAAAAAAAA   AAAAAAAAAA

   550AAAAAAAAAAAAAAAAAAA(2)SEQ ID NO：2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：125个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(iii)序列描述：SEQ ID NO：2MET Ala Asp Glu Glu Leu Glu Ala Leu Arg   Arg Gln Arg Leu Ala Glu Leu Gln Ala Lys

                                 10                                        20His Gly Asp Pro Gly Asp Ala Ala Gln Gln   Glu Ala Lys His Arg Glu Ala Glu MET Arg

                                 30                                       40Asn Ser Ile Leu Ala Gln Val Leu Asp Gln  Ser Ala Arg Ala Arg Leu Ser Asn Leu Ala

                                 50                                       60Leu Val Lys Pro Glu Lys Thr Lys Ala Val  Glu Asn Tyr Leu Ile Gln MET Ala Arg Tyr

                                 70                                       80Gly Gln Leu Ser Glu Lys Val Ser Glu Gln  Gly Leu Ile Glu Ile Leu Lys Lys Val Ser

                                 90                                      100Gln Gln Thr Glu Lys Thr Thr Thr Val Lys  Phe Asn Arg Arg Lys Val MET Asp Ser Asp

                                110                                      120Glu Asp Asp Asp Tyr END(2)SEQ ID NO：3的信息

(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO：3

     AGCACTCTCC AGCCTCTCAC CGCA

             10         20(2)SEQ ID NO：4的信息

(i)序列特征：

(A)长度：12个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO：4

GATCTGCGGT GA

        10(2)SEQ ID NO：5的信息

(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO：5

ACCGACGTCG ACTATCCATG AACA

        10         20(2)SEQ ID NO：6的信息

(i)序列特征：

(A)长度：12个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO：6

GATCTGTTCA TG

        10(2)SEQ ID NO：7的信息

(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO：7

AGGCAACTGT GCTATCCGAG GGAA

        10         20(2)SEQ ID NO：8的信息

(i)序列特征：

(A)长度：12个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO：8

GATCTTCCCT CG

        10(2)SEQ ID NO：9的信息

(i)序列特征：

(A)长度：18个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO：9

ATGGCGGACG AGCTTGAG

        10(2)SEQ ID NO：10的信息

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO：10

AAGCTCGAGT CTGTGCACTT GTAGTTC

        10         20(2)SEQ ID NO：11的信息

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO：11

GGCCCGGGCC AGGTTAAGTA ACTTAGC

        10         20(2)SEQ IDNO：12的信息

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(iii)序列描述：SEQ ID NO：12

GCTAAGTTAC TTAACCTGGC CCGGGCC

        10         20

Claims (11)

1.一种编码促进细胞凋亡的多肽AAP14的DNA序列，其具有SEQ ID NO：1所述的核甘酸序列。

2.根据权利要求1的分离的多核苷酸，其中所说的多核苷酸编码具有由保藏登记号为CGMCC No.0350的生物学样品所包含的DNA表达之氨基酸序列的成熟多肽。

3.根据权利要求1或2的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是DNA。

4.根据权利要求1或2的多核苷酸，其中所说的多核苷酸是RNA。

5.含有权利要求1或2所述之DNA的载体。

6.用权利要求5的载体转化、转染或转导的宿主细胞。

7.一种具有SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列的多肽。

8.生产权利要求7的多肽的方法，包括在适于表达所说的多肽的

条件下培养含有编码多肽之核酸序列的宿主细胞，然后回收所说的多肽。

9.含有作为活性成分的权利要求7的多肽及一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂药物组合物。

10.根据权利要求7的多肽或根据权利要求1的多核苷酸在生产用于体外和/或体内诊断或治疗细胞凋亡程序紊乱相关疾病的药物中的用途。

11.根据权利要求10的用途，其中所说的药物包括抗肿瘤剂、抗病毒剂和胚胎发育及组织内环境稳定控制剂。

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