CN1289668C

CN1289668C - 一种用于抗体改形的体外分子定向进化方法

Info

Publication number: CN1289668C
Application number: CN 03141156
Authority: CN
Inventors: 王祥武; 黄华樑; 周炳; 林晴
Original assignee: Beijing ABT Genetic Engineering Technology Co Ltd; Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Beijing ABT Genetic Engineering Technology Co Ltd; Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2003-06-12
Filing date: 2003-06-12
Publication date: 2006-12-13
Anticipated expiration: 2023-06-12
Also published as: CN1566341A

Abstract

本发明涉及一种用于抗体改形的体外分子定向进化方法，通过设计改形抗体分子、将核糖体展示技术和DNA改组技术相结合，在鼠源单链抗体的基础上直接获得改形单链抗体的抗体改形的体外分子定向进化方法。本发明还提供用此方法获得的一个抗4-1BB改形抗体的氨基酸序列及其编码核苷酸序列，含有该核苷酸序列的载体以及含有这些载体的宿主细胞。

Description

一种用于抗体改形的体外分子定向进化方法

技术领域

本发明涉及一种用于抗体改形的体外分子定向进化方法，更具体地，本发明涉及通过设计改形抗体分子、将核糖体展示技术和DNA改组技术相结合，在鼠源单链抗体的基础上直接获得改形单链抗体的抗体改形的体外分子定向进化方法。本发明还提供用此方法获得的一个抗4-1BB改形抗体的氨基酸序列及其编码核苷酸序列，含有该苷酸序列的载体以及含有这些载体的宿主细胞。

背景技术

与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有良好的特异性和更高的亲和力；能够进行可重复性的大量生产；在应用中，更易于进行标准化和定量操作，因此在疾病诊断和治疗、科学研究等领域被广泛应用。然而，在应用过程中，尤其是用于疾病治疗时，鼠源单克隆抗体作为异源物质，进入人体后将激起机体的免疫反应：HAMA(人抗鼠抗体反应)。HAMA反应能够加速抗体从血液中的清除速度，影响治疗效果；HAMA反应产生的IgE抗体能够引起机体的超敏反应；由于鼠源单克隆抗体在循环系统中的半衰期较短，需要重复注射用药。

解决单克隆抗体的鼠源性问题的根本途径是制备人源单克隆抗体。但是，由于以下几方面原因，很难获得人杂交瘤细胞。首先，没有合适的入骨髓瘤细胞(在长期传代培养过程中不发生染色体丢失)用于细胞融合；其次，由于伦理方面的考虑，大多数抗原不能用于人体免疫；最后，即使某些抗原允许进行人体免疫，很难获得人脾细胞，而淋巴结细胞不是人B细胞的最佳来源。通过构建全人抗体库，然后采用合适的筛选技术从中“钓”取针对某种抗原的人源抗体，被认为是抗体工程发展的又一个里程碑。由于全人抗体库的构建和筛选技术还没有完全推广，利用该途径获得的抗体还未广泛应用。采用转基因技术，将部分人抗体基因转入小鼠体内，然后采用杂交瘤技术制备人单克隆抗体。这种实验思路目前仅限于研究阶段。

另一个解决单克隆抗体鼠源性的途径是“抗体人源化”，即替换鼠源单克隆抗体的部分片段，或个别氨基酸残基，使其在氨基酸序列和结构上更接近人抗体。该途径充分利用了现有鼠源单克隆抗体的丰富资源，因此受到普遍重视。

由于抗体的结构和一级序列决定其激起机体排异反应的能力，在保持抗体的特异性和亲和力的同时，将鼠源抗体的部分序列替换为人源抗体的序列，即可以达到抗体人源化的目的。

随着蛋白分子设计手段的不断丰富和对抗体的结构、功能的认识的不断深入，抗体人源化策略经历了一系列演变过程。最初人们将鼠源抗体的可变区与人源抗体的恒定区嵌合在一起，制备了第一代人源化抗体：嵌合抗体(chimeric antibody)。随后，人们认识到每个可变区(VH或VL)还可以分为3个超变区(即CDRs)和3个FR区，CDR区在抗原与抗体之间的特异性结合方面；起着主要作用，其中CDR3的作用更为关键，因此在构建单链抗体或单域抗体时，将鼠源抗体的CDR区与人源抗体的FR区嵌合在一起，构建第二代人源化抗体：CDR移植抗体(CDR-graftingantibody)。抗体结构与功能的研究的不断深入，导致人们发现FR区的某些关键氨基酸残基参与抗原、抗体之间的相互作用。因此在进行CDR区移植后，还需要在FR区某些位置保留鼠源的氨基酸残基，从而构建第三代人源化抗体：“改形”抗体(reshaping antibody)。这些关键氨基酸残基的选择是获得高活性改形抗体的关键。

有证据表明，与鼠源抗体相比，嵌合抗体引起的HAMA反应大幅度降低。但是，目前由于实验方法的限制，还没有实验结果验证移植抗体和改形抗体的人源化程度。

抗体改形一般经过以下几个步骤：首先确定移植受体抗体序列。通常采用同源搜索的办法，从genebank或现有的人抗体序列库(如Kabat序列库、V-base等)寻找与鼠源单克隆抗体最为同源的人抗体序列，作为移植受体。其次，在进行CDR移植后，根据抗体结构或定点突变等已有的实验结果，确定鼠源抗体FR区中的关键氨基酸残基(即影响抗体亲和力的FR区残基)，并在改形抗体中加以保留。最后，按照上述改形方案，构建改形抗体，并采用原核表达的方式验证改形抗体的特异性和亲和力。

按照上述策略已经成功进行了几种抗体的改形。由于操作比较烦琐，尤其需要反复优化和调整关键FR区氨基酸残基，因此在此基础上有人提出采用定向进化策略进行抗体改形。Baca M等人在确定一系列候选关键氨基酸残基后，采用定点突变的方法在这些位置引入随机突变，然后采用噬菌体展示的技术，从中筛选高亲和力的改形抗体。Barbas CF 3^rd等人则采用了另外一种策略，在已有的鼠源单克隆抗体的基础上，构建基因工程抗体Fab，然后分别从人外周血细胞中扩增人抗体VH和VL基因，分别构建人抗体VH库和VL库，进一步先后固定鼠抗体的VH基因和VL基因，依次与人抗体VL库和VH库组合，进行定向筛选(guidedselection)，最终将鼠源抗体序列完全替换为人抗体序列，保持原有特异性，提高亲和力或保持不变。采用这两种策略均成功进行了抗体的改形。

4-1BB是一种诱导型T细胞辅刺激因子，表达在经过激活剂的诱导(如抗CD3抗体、ConA、PMA、PHA、ionomycin等)的T细胞表面。4-1BB分子含有富含半胱氨酸的基序，因此属于NGFR/TNFR(神经生长因子受体/肿瘤坏死因子受体)超家族。该家族成员还包括NGFR、TNFR-I、TNF-II、CD30、CD27、OX40、CD40、FAS/APO-1等。4-1BB辅刺激信号细胞免疫和体液免疫中发挥着非常关键的作用。在T细胞激活的早期，CD28、LFA-1、LFA-2等辅刺激信号分子参与T细胞活化，同时诱导4-1BB、CTLA4的表达。CTLA4与CD28共用配体B7。由于CTLA4与B7的亲和力更高，而且两者相互作用为T细胞提供抑制信号，因此CD28辅刺激信号对活化后的T细胞不能发挥持续活化的作用；这时4-1BB等诱导型辅刺激因子与其配体相互作用，继续为T细胞提供活化信号。还有证据表明：4-1BB可以采用不依赖CD28的方式发挥辅刺激活化作用，活化T细胞。活化的辅助性T细胞通过分泌细胞因子，如IL-2、IL-4、IFN-γ、等调节T细胞和B细胞的增殖和分化，调节细胞免疫和体液免疫；活化的CTL细胞将直接对靶细胞(如肿瘤细胞或病毒感染细胞等)发挥杀伤作用。综上所述，4-1BB辅刺激信号的作用特点在于长期高效活化T细胞，在细胞免疫和体液免疫过程中发挥着非常关键的作用。(参考文献：Schellekens H.Immolunogenicity of therapeuticproteins：clinical implications and future prospects.Clin Ther.2002 Nov；24(11)：1720-40；discussion 1719.2.Huston JS，George AJ.Engineeredantibodies take center stage.Hum Antibodies.2001；10(3-4)：127-42.3.DillmanRO.The history and rationale for monoclonal antibodies in the treatment ofhematologic malignancy.Curr Pharm Biotechnol.2001 Dec；2(4)：293-300.4.Clark M.Antibody humanization：a case of the′Emperor′s new clothes′？Immolunol Today.2000 Aug；21(8)：397-402.5.Morea V，Lesk AM，Tramontano A.Antibody modeling：implications for engineering and design.Methods.2000 Mar；20(3)：267-79.6.Klingbeil C，Hsu DH.Pharmacology andsafety assessment of humanized monoclonal antibodies for therapeuticuse.Toxicol Pathol.1999 Jan-Feb；27(1)：1-3.7.Baca M，Presta LG，O′ConnorSJ，Wells JA.Antibody humanization using monovalent phage display.J BiolChem 1997 Apr 18；272(16)：10678-84.Steinberger P，Sutton JK，Rader C，EliaM，Barbas CF 3rd.Generation and characterization of a recombinant humanCCR5-specific antibody.A phage display approach for rabbit antibodyhumanization.J Biol Chem.2000 Nov 17；275(46)：36073-8.8.Rader C，RitterG，Nathan S，Elia M，Gout I，Jungbluth AA，Cohen LS，Welt S，Old LJ，BarbasCF 3rd.The rabbit antibody repertoire as a novel source for the generation oftherapeutic human antibodies.J Biol Chem.2000 May 5；275(18)：13668-76.9.Rader C，Cheresh DA，Barbas CF 3rd.A phage display approach for rapidantibody humanization：designed combinatorial V gene libraries.Proc NatlAcad Sci USA.1998 Jul 21；95(15)：8910-5.10.Baca M，Presta LG，O′ConnorSJ，Wells JA.Antibody humanization using monovalent phage display.J BiolChem.1997 Apr 18；272(16)：10678-84.11.Salih HR，Kiener PA，Nussler V.4-1 BB ligand--just another costimulating molecule？Int J Clin Pharmacol Ther.2002 Aug；40(8)：348-53.12.Kwon B，Lee HW，Kwon BS.New insights intothe role of 4-1BB in immolune responses：beyond CD8+T cells.TrendsImmolunol.2002 Aug；23(8)：378-80.13.Sica G，Chen L.Modulation of theimmolune response through 4-1BB.Adv Exp Med Biol.2000；465：355-62.Review.No abstract available.14.Tan JT，Whitmire JK，Ahmed R，Pearson TC，Larsen CP.4-1BB ligand，a member of the TNF family，is important for thegeneration of antiviral CD8 T cell responses.J Immolunol.1999 Nov1；163(9)：4859-68.15.Watts TH，DeBenedette MA.T cell co-stimulatorymolecules other than CD28.Curr Opin Immolunol.1999 Jun；11(3)：286-93.16.Vinay DS，Kwon BS.Role of 4-1BB in immolune responses.SeminImmolunol.1998 Dec；10(6)：481-9.17.Hurtado JC，Kim SH，Pollok KE，LeeZH，Kwon BS.Potential role of 4-1BB in T cell activation.Comparison withthe costimulatory molecule CD28.J Immolunol.1995 Oct 1；155(7)：3360-7.18.Zhou Z，Kim S，Hurtado J，Lee ZH，Kim KK，Pollok KE，Kwon BS.Characterization of human homologue of 4-1BB and its ligand.ImmolunolLett.1995 Feb；45(1-2)：67-73.19.Alderson MR，Smith CA，Tough TW，Davis-Smith T，Armitage RJ，Falk B，Roux E，Baker E，Sutherland GR，Din WS.Molecular and biological characterization of human 4-1BB and its ligand.EurJ Immolunol.1994 Sep；24(9)：2219-27.20.Schwarz H，Tuckwell J，Lotz M.Areceptor induced by lymphocyte activation(ILA)：a new member of the humanNGFR/TNFR family.Gene.1993 Dec 8；134(2)：295-8.21.Goodwin RG，DinWS，Davis-Smith T，Anderson DM，Gimpel SD，Sato TA，Maliszewski CR，Brannan CI，Copeland NG，Jenkins NA，et al.Molecular cloning of a ligandfor the inducible T cell gene 4-1BB：a member of an emerging family ofcytokines with homology to tumor necrosis factor.Eur J Immolunol.1993Oct；23(10)：2631-41.22.Pollok KE，Kim YJ，Zhou Z，Hurtado J，Kim KK，Pickard RT，Kwon BS.Inducible T cell antigen 4-1BB.Analysis of expressionand function.J Immolunol.1993 Feb 1；150(3)：771-81.23.Kwon BS，Weissman SM.cDNA sequences of two inducible T-cell genes.Proc NatlAcad Sci USA.1989 Mar；86(6)：1963-7)。

发明内容

本发明是在上述各种策略的基础上，建立了一套具有特色的体外分子定向进化策略，用于抗体改形。首先，在Kabat抗体可变区序列库中进行同源搜索，确定序列高度相似的人抗体序列作为移植受体序列。将移植受体序列和鼠源抗体序列在Kabat抗体可变区序列库中进行亚群分类，确定亚群共有序列以及高度保守位点。在进行CDR移植之后，保留在鼠源抗体序列、鼠源亚群共有序列、移植受体序列及其人源亚群共有序列之间一致的FR区的氨基酸残基。不一致的位点根据保守性进行取舍。无法取舍的位点位点“简并”鼠源氨基酸残基和人源氨基酸残基，分别设计成改形VH库和改形VL库。在两者之间添加一段连接肽(GGGGSGGGGSGGGGS)后设计成改形单链抗体库。通常氨基酸“简并”位点达到30个左右，当翻译成DNA水平的改形单链抗体库后，碱基“简并”位点达到40个左右，因此该改形单链抗体库中重组体个数约为2³⁰-2⁴⁰，即10⁹-10¹²。如此大的库容超过了噬菌体展示的极限，因此在采用重叠PCR和DNA shuffling技术构建完成上述改形单链抗体库后，我们采用体外筛选技术：核糖体展示，筛选改形单链抗体。应用该策略，我们成功进行抗4-1BB单链抗体的改形。

该策略与结构为基础的抗体改形策略不同，可以从一个由大量突变体组成的改形抗体库中筛选改形抗体。与采用噬菌体展示等体内筛选技术的体内分子定向进化策略相比，该策略的整个过程完全在体外进行，不需经过细菌转化的步骤，操作简便、快捷，尤其适于进行大容量改形抗体库(≥10¹⁴)的筛选。该策略具有相当的独创性，在抗体改形中具有广泛的应用前景。

发明概述

本发明的一个方面是提供一种用于抗体改形的体外分子定向进化方法，包括下列步骤：

(1)根据抗体序列在进化上的保守性确定抗体序列的种属特异性和个体特异性，确定FR区关键氨基酸残基的位置，并通过简并关键氨基酸残基的方式，设计成改形单链抗体库抗体库；

(2)通过简并合成寡聚核苷酸片段以及重叠PCR技术构建初级改形抗体库，并且采用DNA改组技术随机重组简并位点和引进随机突变，形成次级改形抗体库；和

(3)通过PCR的方法构建核糖体展示模板，进行核糖体展示筛选，实现分子定向进化。

本发明的另一个方面是提供用于抗4-1BB抗体改形的体外分子定向进化方法，包括下列步骤：

(1)根据抗体序列在进化上的保守性确定抗体序列的种属特异性和个体特异性，确定FR区关键氨基酸残基的位置，并通过简并关键氨基酸残基的方式，设计成抗4-1BB改形单链抗体库抗体库；

(3)通过PCR的方法构建核糖体展示模板，进行核糖体展示筛选，实现分子定向进化，获得抗4-1BB改形单链抗体。

本发明的另一个方面是提供使用上述方法构建的适合在大肠杆菌中表达的抗4-1BB改形单链抗体的氨基酸序列及其编码核苷酸序列。

本发明的另一个方面是提供一种用于表达抗4-1BB改形单链抗体的载体，其含有上述的核苷酸序列。优选地，它是4-1BB-pFUW802。

本发明的再一个方面是提供一种含有上述载体，优选地，含有载体4-1BB-pFUW802的大肠杆菌宿主细胞。

另外，需要指出的是，在本申请的上下文的公开内容的基础上，本发明的其它具有实质性特点的方面和具有创造性的有益效果对本领域的普通技术人员来说是可以理解的。

附图说明

图1.体外分子定向进化策略用于抗4-1BB单链抗体改形的实验路线

图2-1.改形抗41BB VH的设计，

图2-2.改形抗41BB VL的设计，

其中MSUBV-K\HSUBIII\MSUBIIB\HSUBI：亚群共有序列；M4B4VL\M4B4VH：鼠源抗体轻链和重链序列；RE4B4VL和RE4B4VH：改形抗体轻链和重链序列，其中并排序列为兼并序列；阴影序列：亚群高度保守序列；000001，000040和000760：VH候选移植受体序列；004983：VL候选移植受体序列。

图3.改形抗4-1BB单链抗体库的核苷酸和氨基酸序列，阴影并行碱基为简并位点。

图4.重叠PCR构建抗4-1BB抗体初级抗体库流程图。

图5.琼脂糖电泳监测重叠PCR构建抗4-1BB初级改形抗体库的过程，其中A：步骤3.所得各PCR产物。泳道1-4分别对应反应产物I、II、III、IV。泳道5为DL2000分子量标准，由上而下依次为100bp，250bp，500bp，750bp，1000bp，2000bp；B：步骤4所得各PCR产物。泳道1、2分别对应反应产物VH part和VL part，泳道3为DL2000分子量标准；C：步骤5所得PCR产物。泳道1为PCR产物，初级改形抗4-1BB单链抗体库，泳道2为DL2000分子量标准。

图6.琼脂糖电泳监测采用DNA shuffling技术构建次级改形抗体库的过程，其中A：DNase I酶切初级抗体库DNA片段的结果。泳道1-4依次为酶切3min、2min、1min、30sec的结果。泳道5为DL2000分子量标准；B：经过自身延伸和PCR后得到的改形次级抗体库DNA片段的鉴定。泳道1为DL2000分子量标准，泳道2为全长改形次级抗体库DNA片段。

图7-1.核糖体展示模板简图。

图7-2.核糖体展示元件-1：T7元件(引入T7启动子、5’颈环结构和核糖体结合位点)。

图7-3.核糖体展示元件-2：Spacer元件(引入spacer和3’颈环结构)。

图8-1.PCR构建核糖体展示模板，其中泳道1为全长核糖体展示模板，泳道2为DL2000分子量标准。

图8-2.琼脂糖电泳鉴定体外转录的结果，其中泳道1为RT-PCR产物；泳道2为DL2000分子量标准。

图8-3.琼脂糖电泳鉴定RT-PCR的结果，其中泳道1为RT-PCR产物；泳道2为DL2000分子量标准。

图8-4.Western-blotting鉴定体外翻译产物，其中36KD为完整的体外翻译产物；22.5KD为大肠杆菌内源性生物素化蛋白。

图9.pFUW802质粒简图。

图10.ELISA检测改形抗4-1BB抗体的结合活性，其中，对于每个克隆的三个结果而言(包括空载体对照)，第一个柱形代表包被1μg/ml4-1BB时的测定结果；第二个柱形代表不加任何抗原(4-1BB)时的测定结果；第三条柱形代表前两个测量结果的差值。因此第三条柱形的数值代表该改形抗体对4-1BB的相对结合能力。

图11-1.Re-3的VH区的序列比对结果，

图11-2.Re-3的VL区的序列比对结果。

图11-3抗4-1BB改形单链抗体(re-3)突变位点的分析结果

图12.Re-3的VH区的结构比对结果，其中A：re-3和m4b4-1scFv的结构比对结果；B：m4b4-1 scFv的结构，与re-3的明显不匹配区已经标出；C-E：region-1、region-2、region-3的放大图。

发明详述

在进行抗体改形时，需要综合考虑以下几方面因素：亲和力、特异性和免疫原性。抗体的特异性一般认为是由CDR区决定。而CDR区是决定抗体亲和力的主要因素，FR区为CDR区提供支撑骨架，间接影响抗体的亲和力。抗体的免疫原性是指其作为异源物质，进入人体后，激起机体免疫反应的性质，如激起机体HAMA反应的能力。抗体序列的种属特异性及个体特异性与其免疫原性直接相关。在Kabat抗体序列手册中，将鼠源抗体序列和人源抗体序列分别分为不同的亚群(subgroup)，每个亚群的共有序列为该亚群中最为保守的氨基酸残基，代表着抗体的种属特异性。其中某些氨基酸(如大多数CDR区氨基酸残基和部分FR区氨基酸残基)的保守性非常低，代表抗体的个体特异性。这些氨基酸残基有可能是抗体序列重排或体细胞突变的结果，与抗体的亲和力和特异性相关。因此这些代表抗体个体特异性的FR区氨基酸残基是进行抗体改形时，需要进行调整和优化的部位。

基于上述理论基础，本发明提供了一整套用于抗体改形新策略。具体内容如下：

(1)以鼠源抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列为模板，采用同源搜索的方法，从已有的免疫球蛋白序列库(Kabatdatabase：http://www.hgmp.mrc.ac.Uk/Bioinformatics/Databases/kabatn-help.html和http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Bioinformatics/Databases/kabatp-help.html；V-base：http://www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase-ok.php？menu＝901)中寻找CDR移植受体。在确定了同源性较高的候选移植受体抗体序列后，将每条序列均在Kabat抗体序列库中进行亚群分类，并确定亚群共有序列。通常这些移植受体序列均属于同一个亚群。同时将鼠源抗体序列也在Kabat抗体序列库中进行亚群分类，并确定亚群共有序列。

(2)将鼠源抗体序列及其亚群共有序列、候选移植受体抗体序列及其亚群共有序列进行比对(alignment)，保留鼠源抗体的CDR区和FR区内一致的序列。我们认为，鼠源抗体亚群共有序列和移植受体抗体亚群共有序列，在一定程度上分别代表鼠种属保守性和人种属保守性。如果鼠源抗体序列的氨基酸残基在移植受体抗体亚群共有序列相应位置出现，并且属于高度保守(出现几率大于90％)，则该氨基酸残基可能在维持抗体的特征性结构(如Ig fold)方面，具有重要意义，在改形抗体的序列中必须保留。其他的氨基酸残基有可能是体细胞突变的结果，代表该抗体的个体特异性，有可能与抗体本身的特异性和亲和力相关，所以在改形抗体的序列中，将鼠源氨基酸残基与移植受体抗体亚群共有序列的相应氨基酸残基简并。至此，设计完成VH和VL改形抗体库。

(3)在两者之间添加一段重复性连接肽(GGGGSGGGGSGGGGS)设计成改形单链抗体库。由于在氨基酸水平上，该改形单链抗体库共存在30个左右“简并”位点。

(4)按照大肠杆菌喜好的密码子表，将该改形单链抗体库翻译成DNA序列。由于选用简并密码，在DNA水平上，约存在40个左右的兼并位点。这些位点如果自由重组将产生2⁴⁰(约10¹²)个重组体。而在进行单域抗体的改形时，简并位点减半。单域改形抗体库的重组体个数最多为10⁶，采用噬菌体展示技术就可以完成筛选，此过程即体内分子定向进化。而单链抗体改形抗体库的重组体个数最多可以达到10¹²，因此应该选择核糖体展示作为筛选手段，进行体外分子定向进化。

(5)按照重叠PCR的要求，将改形单链抗体库(DNA)“拆分”成60个核苷酸以下的单链寡聚核苷酸片段，进一步采用重叠PCR技术构建初级改形单链抗体库。

(6)由于某些单链寡聚核苷酸片段含有不止一个简并位点，因此通过采用DNA改组技术，进行随机重组，构建次级改形单链抗体库。

(7)采用一步PCR反应，引入核糖体展示元件，如T7启动子(Promoter)，核糖体结合位点(RBS)，空间间隔区(Spacer)，5’颈环(Stem loop)和3’Stem loop等。进行核糖体展示。

(8)经过3轮核糖体展示筛选后，筛选产物(即RT-PCR产物)直接经过酶切反应连入分泌型表达载体pFUW802，转化大肠杆菌HB2151(购自发玛西亚公司)，进行分泌型表达和活性测定，鉴定与抗原具有较高结合活性的克隆。经过测序验证后，得到改形单链抗体。

与现有的抗体改形策略相比，本发明提出的体外分子定向进化策略具有以下特点：

1.FR区的关键氨基酸残基的确定方式的特点：其他的改形策略均是按照抗体结构和定点突变的实验结果确定关键氨基酸残基，可以确定的关键氨基酸残基数目较少。按照本发明的设计思路，根据抗体序列在进化上的保守性确定抗体序列的种属特异性和个体特异性，确定关键氨基酸残基的位置。

2.构建改形抗体库的方式的特点：通过简并合成寡聚核昔酸片段以及重叠PCR技术构建初级改形抗体库，并且采用DNA shuffling技术随机重组简并位点和引进随机突变，形成次级改形抗体库。

3.筛选方式的特点：与体内筛选方式(如噬菌体展示技术)相比，核糖体展示技术完全在体外操作，不需要进行转化，可以进行大库容筛选。按照本发明确定关键氨基酸残基位置和简并位点数目的方案，在进行单链抗体的改形时，通常在氨基酸水平上共存在15-30个“兼并”位点。在“翻译”成DNA序列时，由于选用兼并密码，在DNA水平上约存在40个左右的兼并位点。这些位点如果自由重组将产生2⁴⁰(约10¹²)个重组体。单链抗体改形抗体库的重组体个数最多可以达到10¹⁴，噬菌体展示技术是无法满足这一要求的，因此只能选择核糖体展示作为筛选手段。

4.将DNA shuffling与核糖体展示结合，进行体外分子定向进化筛选改形抗体时，不经过转化的步骤，因此操作更为简便。采用自主构建的大肠杆菌分泌型表达载体(pFUW802)，进行阳性克隆的分泌型表达和鉴定。

可以采用该策略进行改形的抗体包括，Fab(fragment of antigenbinding)，单链抗体(scFv：single chain antibody)，单域抗体(single dimnainantibody)。

本发明采用上述体外分子定向进化策略成功进行了改形，获得了具有较高结合活性的抗4-1BB改形单链抗体(re-3)。该抗体具有如下氨基酸序列：

1 QVQLVQSGAE VVKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMHWVNQR PGQGLEWMGE

51 INPGNGHTNY NEKFKSSVTI TADTSSSTAY MQLSPLSSED SAVYYCARSF

101 TTACAFAYWG QGTLVTVSST SGGGGSGGGS GGGGSSRDIV MTQSPATLSV

151 TPGDRATLSC RASQTISDYL HWYQQKSHES PRLLIKYASQ SISGIPNRFS

201 GSGSGSDFTL TINSVEPEDF AVYYCQDGHS FPPTFGGGTK LEIK

(SEQ ID NO.：2)。

本发明的抗4-1BB改形单链抗体(re-3)具有如下核苷酸序列：

1 CAG GTT CAG CTG GTG CAA TCG GGT GCG GAA GTG GTG AAA CCG GGT

46 GCA TCT GTT AAA GTG TCT TGC AAA GCG AGC GGT TAC ACC TTC ACC

91 TCT TAC TGG ATG CAC TGG GTT AAT CAG CGT CCG GGT CAG GGT CTG

136 GAA TGG ATG GGT GAA ATC AAC CCG GGT AAC GGC CAC ACC AAC TAC

181 AAC GAA AAA TTC AAA AGC AGT GTG ACC ATT ACC GCG GAC ACG TCT

226 AGC AGC ACC GCG TAC ATG CAG CTG AGC CCC CTG AGC AGC GAA GAC

271 AGC GCT GTT TAC TAC TGC GCA CGT TCT TTC ACC ACC GCT TGT GCG

316 TTC GCC TAC TGG GGT CAG GGC ACC CTG GTG ACC GTT TCC TCC ACT

361 AGT GGA GGC GGT GGG AGC GGC GGT GGT TCT GGG GGT CGC GGC AGC

406 TCT AGA GAC ATC GTT ATG ACC CAG AGC CCG GCG ACC CTG AGC GTG

451 ACC CCG GGT GAT CGT GCG ACC CTG TCT TGC CGT GCG TCT CAG ACC

496 ATC AGC GAC TAC CTG CAC TGG TAC CAA CAG AAA AGC CAC GAA TCC

541 CCG CGT CTG CTG ATC AAA TAC GCA TCT CAG TCT ATC AGC GGT ATC

586 CCG AAC CGT TTC TCT GGT TCC GGT AGC GGT TCT GAC TTC ACC CTG

631 ACC ATC AAC AGC GTG GAA CCG GAA GAC TTT GCC GTG TAC TAC TGC

676 CAG GAC GGT CAC TCT TTC CCG CCG ACC TTC GGA GGT GGT ACC AAA

721 CTG GAA ATC AAA(SEQ ID NO.：1)。

本发明还提供可用于鉴定筛选产物的含有本发明的抗4-1BB改形单链抗体：re-3的核苷酸序列的表达载体。优选地，该载体为为pFUW802，其具备以下优点：具有合适的多克隆位点，用于表达单链抗体；该质粒适合进行周质腔分泌表达，周质腔抽提物可直接用于ELISA检测；该质粒含有c-myc检测标签，方便用抗c-mye标签的抗体(如9E10)进行ELISA检测。

本发明还提供了含有上述载体的宿主细胞，所述的宿主细胞优选地为大肠杆菌。

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例：

根据抗体结构和氨基酸序列的进化保守性，设计简并改形抗4-1BB单链抗体库，然后将核糖体展示技术和DNA改组技术结合，实现体外分子定向进化。从改形单链抗体库中筛选改形抗4-1BB单链抗体。该分子定向进化方法的实验路线见图1。

1.初级改形抗4-1BB单链抗体库的分子设计

(1)将文献(Garni-Wagner BA，et al.，4-1BB is expressed onCD45RAhiROhi transitional T cell in humans.Cell Immunol.1996Apr 10；169(1)：91-8.)报道的具有激动活性的鼠抗4-1BB抗体(4b4-1克隆)的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的氨基酸序列(见图2.1M4B4VH和图2.2M4B4VL)，按照同源搜索的方法，分别从Kabat序列库和V-base库中寻找同源程度最高的人抗体序列(VH见图2.1：000001，000040，000760；VL见图2.2：004983)作为候选移植受体序列。进一步将原鼠源抗体序列和候选抗体序列在Kabat序列库中进行亚群归类，并确定各自的亚群共有序列(VH见图2.1：HSUBIII；VL见图2.2：HSUBI)。在每个亚群中，FR区内出现几率为90％以上的氨基酸残基定为高度保守残基(图2.1和图2.2中阴影部分)。

(2)进行CDR区移植，保留鼠抗4-1BB抗体(4b4-1)的CDR区，以及在鼠源抗体序列、鼠源亚群共有序列、候选移植受体亚群共有序列之间，完全一致的FR区氨基酸残基。三者之间不一致的氨基酸位点，如果鼠源抗体的氨基酸残基与鼠源亚群共有序列一致，并且是高度保守残基，则将其替代为候选移植受体亚群共有序列的相应氨基酸残基。否则保留该氨基酸残基或者将其与候选移植受体亚群共有序列的相应氨基酸残基简并。至此，改形抗4-1BB VH(图2-1)和改形抗4-1BB VL(图2-2)设计完成。将两者以一段连接肽连接起来即设计完成初级改形抗4-1BB单链抗体库(见图3)。

(3)进一步，按照大肠杆菌偏向的遗传密码(http://www.kazusa.or.jp/codon/)将该氨基酸水平的改形抗体库转换为DNA水平的改形抗4-1BB单链抗体库(见图3)。

(4)将DNA水平的改形抗4-1BB单链抗体库拆分成24条寡聚核苷酸片段，以便于使用重叠PCR技术拼接成全长的初级改形抗4-1BB单链抗体库DNA片段。由于每个单链寡聚核苷酸片段含有不止一个简并位点，因此需要进一步通过DNA改组技术进行随机重组，构建次级改形抗4-1BB单链抗体库。以下为用于拼接全长初级改形抗4-1BB单链抗体库的寡聚核苷酸片段，括号内的核苷酸与前一个核苷酸简并。

1.5’-GGCCATGGACTACAAAGACCTC-3’；

2.5’-CAGCTGACCGTGAGGTCTTTGTAGTCCAT；

3.5’-CTCGAGCAGGTTCAGCTGC(G)A(T)GCAAC(T)CGGGTGCGGAAC(G)TGG(A)T(A)GAAACCGG GTGCATCTG-3’；

4.5’-TGAAGGTGTAACCGCTCGCTTTGCAAGACAG(C)TTTAACAGATGCACCCGGTTTC-3’：

5.5’-CGAGCGGTTACACCTTCAC(G)CTCTTACTGGATGCACTGGGTT-3’；

6.5’-CCTG ACCCGGACGCTGT(A)T(C)T(G)AACCCAGTGCATCCAGTA-3’；

7.5’-AGCGTCCGGGTCAGGG(T)TCTGGAATGGATC(G)GGTGAAATCAACCCGGGTAACGGCCAC-3’；

8.5’-GCTTTTGAA TT T TTCGTTGTAGTTGGTGTGGCCGTTACCCGGG-3’；

9.5’-CGAAAAATTCAAAAGCA(C)A(G)A(T)GC(T)GACCC(A)TTACCGT(C)GGACAA(C)GTCTC(G)CAGACCGTACA-3’；

10.5’-CAGGGAGCTCAGCTGCATGTA CGCGGTGCTG-3’；

11.5’-GCAGCTGAGCCTGA(C)C(G)CAGCGAAGACAG(C)CGCTGTTTACTACTGCGC-3’；

12.5’-CCCAGTAGGCGAACGCACGAGCGGTGGTGAAAGAACGTGCGCAGTAGTAAACAGCG-3’；

13.5’-GCGTTCGCCTACTGGGGTCAGGGCACCCTGGTGACCGTTTCCTCCACTAGTGGAGGC-3’；

14.5’-TAGAGCTACCGCCACCCCCAGAACCACCACCGCCGCTCCCACCGCCTCCACTAGTGGAG-3’；

15.5’-GGTGGCGGAAGCTCTAGAGACATCGTTATGACCCAGAGCC-3’；

16.5’-GACGCACGGCAAGACAGGC(G)TCA(G)CACGA(T)TCACCCGGGG(C)TCACGCTCT(A)GGGTCGCCT(G)GGCTCTGGGTCATAAC-3’；

17.5’-CCTGTCTTGCCGTGCGTCTCAGACCATCAGCGACTACCTGCACTGGTACCAACAGAAA-3’；

18.5’-TGATCAGCAGACGCGGGGA(C)TTC(G)GTGGCTTTTCTGTTGGTACCAGTG-3’；

19.5’-CCCGCGTCTGCTGATCAAATACGCATCTCAGTCTATCAGCGGTATCCCG-3’；

20.5’-GGGTGAAGTCAGAACCGCTACCGGAACCAGAGAAACGGC(T)T(C)CGGGATACCGCTGATAGA-3’；

21.5’-CGGTTCTGACTTCACCCTGAG(C)CATCAACAGCGTGGAACCGGAAGAC-3’；

22.5’-GCGGGAAAGAGTGACCGTCCTGGCAGTAGTACACGC(G)CAAC(A)GTCTTCCGGTTCCACGC-3’；

23.5’-CGGTCACTCTTTCCCGCCGACCTTCGGTGGTGGTACCAAA-3’；

24.5’-ACCGAATTCTTTGATTTCCAG(C)TTTGGTACCACCACCGAA-3’。

2.重叠PCR构建抗4-1BB抗体初级抗体库(操作过程见图4)：

步骤1：

方法：按照图4将片段1-24各自配对重叠延伸，不加引物，反应产物((1)-(12))不需要回收，直接进行下一步反应。

混合物：按照图4将片段1-24两两配对，各1μl(10pmol)；2μl 10×PCR缓冲液(500mM KCl，50mM Tris pH 8.5，25mM Mg(Cl)₂下同)；2μldNTP(2mM dATP，dTTP，dCTP，dGTP)(购自大连宝生物技术公司，下同)；0.3μl Taq酶(1U)(购自大连宝生物技术公司，下同)；水14μl。

反应条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；10个循环。

步骤2：

方法：按照图4将反应产物(2)-(11)各自配对重叠延伸，不加引物。反应产物(A-E)不需要回收，直接进行下一步反应。

混合物：按照图4将反应产物(2)-(11)进行配对，各10μl。

步骤3：

方法：按照图4将反应产物(1)、A、B、C、E、(12)分别配对，单独使用反应产物D，添加各自小引物(引物1和6对应(1)和A的配对，引物7和14对应B和C的配对，引物15和18对应D，引物19和24对应E和(12)的配对)，PCR扩增。反应产物(I-IV)1％琼脂糖凝胶电泳回收(见图5-A)。

混合物：按照图4将反应产物(1)、A、B、C、E、(12)分别配对，各1μl；2μl 10×PCR缓冲液；2μl dNTP(2mM each)；引物各1μl，约10pmol；0.3μl Taq酶(1U)；水12μl(或13μl)。

反应条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；25个循环。

步骤4：按照图4将反应产物I-IV分别配对，添加各自引物(1和14对应I和II的配对，15和24对应III和IV的配对)，PCR扩增。反应产物(VH part和VL part)1％琼脂糖凝胶电泳回收(见图5-B)。

混合物：按照图4将反应产物I-IV分别配对，各1μl；2μl 10×PCR缓冲液；2μl dNTP(2mM each)；引物各1μl(10pmol)；0.3μl Taq酶(1U)；水12μl。反应条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸30sec；25个循环。

步骤5：按照图4将反应产物VH part和VL part配对，添加引物1和24，PCR扩增。反应产物1％琼脂糖凝胶电泳回收750bpDNA片段，即初级改形抗4-1BB单链抗体库(见图5-C)。

混合物：反应产物VH part和反应产物VL part各1μl；2μl 10×PCR缓冲液；2μl dNTP(2mM each)；引物各1μl(pmol)，约10pM；0.3μl Taq酶(1U)；水12μl。反应条件：94℃预变性1min；94℃变性30sec；45℃退火30sec；72℃延伸1min；25个循环。

3：DNA改组技术构建次级改形抗4-1BB单链抗体库

(1)将2-5μg 750bp DNA片段溶于20μl水中，加入2.5μl缓冲液I(1MTris-HCl pH7.5)2.5μl缓冲液II(200mM MnCl₂).。15℃平衡5min。

(2)同时将1μl RQI DNase I(I型DNA酶)(购自普洛麦格公司)与24μl水混合，15℃平衡5min。

(3)将上述两种溶液混合均匀，于30sec、1min、2min、3min、分别取10μl立即加入到已有5μl冰预冷的缓冲液III(50mM EDTA，30％甘油)的EP管内。

(4)最后以2％琼脂糖凝胶电泳鉴定(见图6-A)，采用小片段DNA高效胶回收试剂盒(购自上海华舜公司)回收50-100bp的小片段，溶解在10μl水中。

(5)自身PCR或无引物PCR：PCR反应混合物：5μl 10×PCR缓冲液；5μl dNTP(2mM each)；2.5U pfu酶(购自上海博亚生物技术有限公司)；10μl回收小片段；水29.5μl。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30sec；55℃退火1min；72℃延伸1min 30sec；30-40个循环。回收片段越小，退火温度越低，循环数越多。不用回收。

(6)PCR扩增：PCR扩增：PCR反应混合物：2μl 10×PCR缓冲液；2μldNTP(2mM each)；引物1和24(参照图4)各加1μl(10pmol)；0.5μlpfu(2.5U)；上一轮PCR产物1μl；水13μl。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30sec；58℃退火30sec，72℃延伸1min，20个循环，最后72℃延伸2.5min。1％琼脂糖凝胶电泳回收750bp附近的特异片段(见图6-B)，溶于30μl ddH₂O，即次级改形抗体库。

4：采用PCR方法构建核糖体展示模板(简图见图7-1)

采用PCR技术，引进核糖体展示元件：PCR反应混合物：2μl 10×PCR缓冲液；2μl dNTP(2mM each)；引物T7-primer和T5te各加1μl(10pmol)；0.5μl pfu酶(2.5U)；T7和spacer元件(提前制备，序列见图7-2和图7-3，具体序列来自文献：Hanes J，et al.，Selecting and evolving functional proteins in vitro by ribosome display.Methods Enzymol.2000；328：404-30.)各1μl(约10pmol)；次级改形抗体库1μl；水11μl。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30sec；40℃退火30sec，8个循环，然后58℃退火30sec，22个循环；72℃延伸2.5min。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定(见图8-1)，回收1,000bp附近的特异片段。将PCR产物直接用于体外转录。

T7-primer.

ATACGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGG；

T5te.CCGCACACCTTACTGGTGTGCGGATCACCAGTAGC。

5：体外转录

(1)去除RNase：PCR产物中加入等体积酚-氯仿-异戊醇(25/24/1)，摇匀后12,000g，4℃离心15秒；取水相，加入2倍体积的氯仿，摇匀后再次12,000g，4℃离心15sec；取水相，加入1/10体积的1mol NaCl和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min，12,000g，4℃离心30min；70％乙醇洗涤，干燥后溶于无RNA酶水中。

(2)体外转录：依次加入以下各种组分：30μl 5×T7 RNA聚合酶缓冲液(1MHEPES-KOH pH7.6；150mM醋酸镁；10mM精胺；0.2mM DTT)；60μl DTT(100mM)(二硫苏糖醇，购自Sigma公司)；120U RNasin(RNA酶抑制剂，下同)(购自大连宝生物技术公司)；20μl NTP(50mM)(购自大连宝生物技术公司)；1.5-3μg DNA模板；300U T7RNA聚合酶(购自普洛麦格公司)；用水补足至150μl。在37℃水浴2个hr，进行体外转录反应。

(3)LiCl选择性沉淀RNA：将转录产物置于冰上冷却后，加入等体积的冰预冷的6M LiCl，轻轻混匀后，冰上放置30min；16,000g，4℃离心30min；加入500μl 70％乙醇洗涤沉淀，不用干燥，加入100μl无RNA酶水溶解沉淀；加入1/10体积的1M NaCl和2倍体积的无水乙醇，-20℃放置过夜；16,000g，4℃离心30min；加入500μl 70％乙醇洗涤沉淀，加入无RNA酶水溶解沉淀，并立即进行体外翻译。否则直接将沉淀悬浮在70％乙醇中，置-70℃或液氮保存。

(4)采用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定体外转录产物(见图8-2)

6：体外翻译

(1)准备冰预冷的洗涤缓冲液：WBTH缓冲液(250mM Tris-HAc pH7.5，150mM NaCl，50mM Mg(Ac)₂.0.1％Tween-20 and 2.5mg/ml肝素)

(2)在冰上混合下列组分：预混合物(250mM Tris-HAc pH7.5，氨基酸混合物(除蛋氨酸外，每种氨基酸1.75mM)10mM ATP，2.5mM GTP，5mMcAMP，150mM乙酰磷酸，2.5mg/ml E.coli tRNA，0.1mg/ml叶酸，7.5％PEG 8000)：22μl；蛋氨酸(200mM)：1.1μl；谷氨酸钾(2M)：11μl；Mg(Ac)₂(100mM)：7.6μl；anti-ssrA(200μM)：2μl；真核分子伴侣PDI(44μM)(购自Sigma公司)：1.5μl；S-30抽提物(购自普洛麦格公司)40μl。补水至100μl。

备注：大肠杆菌具有一个10S-RNA多肽标记系统，该系统以10S-RNA为模板翻译出一个10肽，该10肽能够标记不含终止密码的mRNA的翻译产物，从而使后者被胞内蛋白酶所识别而降解。anti-ssrA与10S-RNA互补，能够抑制以其为模板的翻译过程，从而抑制10S-RNA多肽标记系统的作用。anti-ssrA(CTTAAGCACACCA GTAAGGTGTGCGGTCAGGATATTC ACCACAATCC C)。

(3)加入10μg/10μl mRNA库，轻轻混匀后，37℃水浴放置7分钟。

(4)将上述混合物与440μl WBTH混合，轻轻混匀后冰浴放置，准备进行亲和筛选。

7.液相亲和筛选

(1)使用冰预冷的WBT缓冲液将链亲和素-磁珠(购自普洛麦格公司下同)洗4次，然后与等体积的WBT缓冲液(250mM Tris-HAc pH7.5，150mM NaCl，50mM Mg(Ac)₂，0.1％Tween-20)混合，冰上保存。

(2)封闭筛选管：将5ml的筛选管注满4％的脱脂奶粉水溶液，室温反复倒转1hr，进行封闭。然后使用PBS(137mM NaCl，2.7mM KCl，Na₂HPO₄1.8mM KH₂PO₄)洗3次，注满WBT，冰上保存。

(3)制备无生物素的脱脂奶粉溶液：将1ml 12％的灭菌脱脂奶粉水溶液与100μl链亲和素-磁珠混合后，室温反复倒转1hr。去除链亲和素-磁珠后，冰上保存

(4)将体外翻译产物与4倍体积(200μl)WBTH混合，轻轻摇匀。16,000g，4℃离心5min，去除不溶性成分，上清与50μl的无生物素的12％脱脂奶粉溶液和一定量生物素化4-1BB(购自R&D公司)混合，使脱脂奶粉的浓度达到2％。将上述溶液转移到准备好的筛选管中，在冰室中反复倒转1小时。使抗原和抗体充分结合。

(5)加入100μl链亲和素-磁珠，继续冰上反复倒转10-15min，捕获抗原-抗体-核糖体-mRNA复合物。

(6)以冰预冷的WBT缓冲液洗5次，加入200μl冰预冷的EB20缓冲液(50mM Tris-HAc pH 7.5，150mM NaCl，20mM EDTA 50μg/ml酵母tRNA(购自Sigma公司)，继续冰上反复倒转5min，使核糖体大小亚基分离，释放mRNA。解离下来的mRNA液氮保存或立即分离。

8：分离纯化mRNA及RT-PCR

(1)采用Roche公司的高纯度mRNA纯化试剂盒纯化mRNA。纯化过程中使用DNase I(I型DNA酶)消化残留的DNA转录模板，以避免干扰对下一步的RT-PCR反应。

(2)向洗脱下来的mRNA中，补加2μl T5te(约20pmol)引物，立即70℃水浴10min。然后室温10min。

(3)同时准备cDNA第一条链合成预混合物：10μl 5第一条链合成缓冲液()；10μl dNTP(2mM each)；5μl DTT(100mM)；50U RNasin；250Ustratascript逆转录酶(购自stratagene公司)。补水至27μl的总体积。将处理好的mRNA样品(约23μl)加入到上述预混合物中，42℃水浴放置1hr后，75℃放置3min，使逆转录酶失活。

(4)合成第二条链：PCR反应混合物：2μl 10×PCR缓冲液；2μl dNTP(2mMeach)；引物P1和P22各加1μl；0.5μl Taq酶(2.5U)；5μl第一条链合成反应产物，水9.5μl。PCR反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30sec；60℃退火30sec；72℃延伸2.5min；30个循环。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收750bp附近的特异片段(见图8-3)。回收片段采用PCR方法重新引进核糖体展示元件，再次进行核糖体展示，即重复实施例4-7。经过三轮核糖体展示后，最后一轮筛选的RT-PCR产物，按照实施例10的操作进行表达和鉴定。

9.体外翻译产物的鉴定

在进行亲和筛选之前，需要对是否成功进行体外翻译和体外翻译的完整性进行鉴定。由于体外翻译体系较小，翻译产物的量较少，因此普通的SDS-PAGE电泳和Western-blotting的灵敏度能满足检测要求。我们采用普洛麦格公司的Transcend^TM Biotinlated Lysine tRNA作为翻译底物，用于体外翻译使翻译产物生物素化，以便进一步采用HRP标记链亲和素显色系统进行Western-blotting进行检测。该方法的灵敏度与放射自显影Western-blotting相当。

(1)在冰上混合下列组分：预混合物(250mM Tris-HAc pH7.5，氨基酸混合物(除蛋氨酸外，每种氨基酸1.75mM)10mM ATP，2.5mM GTP，5mM cAMP，150mM乙酰磷酸，2.5mg/ml E.coli tRNA，0.1mg/ml叶酸，7.5％PEG 8000)：22μl；蛋氨酸(200mM)：1.1μl；谷氨酸钾(2M)：11μl；Mg(Ac)₂(100mM)：7.6μl；anti-ssrA(200μM)：2μl；真核分子伴侣PDI(44μM)(购自Sigma公司)：1.5μl；S-30抽提物(购自普洛麦格公司)40μl；Transcend^TM Biotinlated Lysine tRNA(购自普洛麦格公司)：1-2μl。补水至100μl。

(2)加入10μg/10μl mRNA库，轻轻混匀后，37℃水浴放置7分钟。

(3)进行变性非连续SDS-PAGE电泳，分离胶浓度8％。

(4)电泳结束后，将凝胶用清水漂洗，放入电转缓冲液中浸泡，剪裁比凝胶稍大的纤维素膜和较之略小的滤纸一同在电转缓冲液中浸泡。在电转夹上依次加：滤纸-凝胶-纤维素膜-滤纸，除净各层间气泡。

(5)电转：恒流0.3-0.4A电转1-2hr后，取下纤维膜和凝胶，用TBS缓冲液(100mM Tris-Cl，0.9％(w/v)NaCl，pH 7.5)洗净纤维膜。

(6)封闭：将纤维素膜浸泡在封闭液中，轻轻振摇2hr。

(7)添加HRP标记的链亲和素：用TBST缓冲液(100mM Tris-Cl，0.9％(w/v)NaCl，pH 7.5，0.05-0.1％(V/V)Tween-100)洗膜三次，每次5min。将纤维素膜浸泡在含适当浓度HRP标记的链亲和素的封闭液中。轻轻振摇1hr，

(8)显色：洗膜方法如上。加入DAB显色液(5ml 100mM Tris-Cl，pH7.5；100μl DAB贮存液(DAB：3.3‘二氨基联苯胺，购自Sigma公司。溶于水(40mg/ml)后，分装成100μl，-20℃保存)；25μl NiCl贮存液(溶于水，80g/ml，分装成100μl，-20℃保存)；15μl 30％H₂O₂)。

(9)待显色至理想程度时用清水冲洗，终止反应，充分冲洗后避光保存纤维素膜。(结果见图8-4)

10.分泌型表达载体pFUW802的构建

本实验室在载体pCOMB3(Huse WD，et al.，Generation of a largecombinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda.Science.1989 Dec；246(4935)：1275-81.)的基础上构建了分泌型表达载体pFUW80(张卫国等，噬菌体呈示单链抗体表达载体及小鼠非特异抗体库的构建，遗传学报，26(2)99-106，1999)。该载体在多克隆位点之后带有His纯化标签(His)₆，因此可以采用金属螯合亲和层析对使用该载体表达的外源蛋白直接进行纯化。为了对该载体表达的外源蛋白直接进行ELISA检测，我们将His纯化标签替换为c-myc检测标签(EQKLISEEDL)(c-myc检测标签序列来自公开发表的文献：Hilpert K.et al.，Anti-c-myc antibody 9E10：epitope key positions and variability characterizedusing peptide spot synthesis on cellulose.Protein Eng.2001 Oct；14(10)：803-6.)，构建成分泌型表达载体pFUW802，实验结果未发表。pFUW802的简图见图9。

11：抗体的分泌型表达及盐休克法提取周质腔组分

(1)将最后一轮筛选获得的RT-PCR产物，XhoI/EcoRI双切后连入分泌型表达载体pFUW802(简图见图9)，转化大肠杆菌HB2151(购自发玛西亚公司)，涂LB-A平板(10g/l tryptone(购自GIBCO公司，下同)，5g/l yeast extract(购自GIBCO公司，下同)，5g/l NaCl，15g/l琼脂and 100μg/ml氨苄青霉素，pH7.5)，37℃培养过夜。

(2)挑取单克隆，接种96孔深孔培养板，1ml SBAG-2％液体培养基/孔(35g/l tryptone，20g/l yeast extract，5g/l NaCl，and 100μg/ml氨苄青霉素，pH7.5，2％葡萄糖)，30℃摇床过夜培养，250rpm。

(3)1/100转接大试管中，5ml SBAG-0.1％液体培养基/管(35g/l tryptone，20g/l yeast extract，5g/l NaCl，and 100μg/ml氨苄青霉素，pH7.5，0.1％葡萄糖)，30℃摇床培养2-3hr，250rpm，至OD600＝0.8-0.9，补加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(购自大连宝生物技术公司)至终浓度1mM。继续30℃摇床培养20-24hr，250rpm。1,500g离心20min，收集所有菌体。小心吸除上清。每管添加100μl 1×TES缓冲液(0.2M Tris-HCl pH8.0，0.5mM EDTA，0.5M蔗糖)，混匀后补加150μl冰预冷的1/5×TES，再次混匀，冰上放置30min，进行盐休克，12,000g离心10min保留上清。

(4)采用同样的条件诱导表达鼠抗4-BB单链抗体(m4b4-1 scFv)以及提取周质腔组分。m4b4-1scFv为本实验室将公开发表文献(Hong HJ，et al.，A humanized anti--4-1BB monoclonal antibody suppressesantigen-induced humoral immune response in nonhuman primates.JImmunother.2000 Nov-Dec；23(6)：613-21.)所列的VH和VL序列，以单链抗体通用连接肽(GGGGSGGGGSGGGG S)相连，构建而成的，实验结果未发表。

(5)采用直接ELISA检测上述周质腔抽提物中的抗体结合活性。ELISA操作按照常规方法进行。其中需要指出的是：抗原(4-1BB购自R&D公司)包被浓度：1μg/ml；抗c-myc标签抗体(9E10)作为一级检测抗体(购自R&D公司)；HRP--羊抗鼠IgG作为二级检测抗体(购自R&D公司)；OPD(邻苯二胺)(购自Sigma公司)显色。周质腔抽提物不经稀释，直接进行检测。我们一共挑取了20个克隆，经过ELISA测活，确定其中5个克隆为阳性克隆。经过DNA测序(上海博亚生物技术有限公司)后，发现这5个克隆分别具有三种抗体序列：re-1(1个克隆)，re-2(1个克隆)和re-3(3个克隆)。Re-1改形抗体序列缺失大段VH序列，结合活性最低；re-2改形抗体序列缺失轻链CDR3，结合活性居中：re-3抗体的序列完整，结合活性最高。图10列出了三个阳性克隆的ELISA测定结果结果见。Re-3克隆VH和VL的氨基酸序列见图11-1和图11-2。

12.改形抗4-1BB单链抗体的序列和结构分析

将改形抗4-1BB单链抗体re-3的VH和VL序列分别与鼠抗4-1BB单克隆抗体(4b4-1)，鼠源亚群共有序列和人源模板亚群共有序列的VH和VL序列进行比对(见图11-1和图11-2)。结果发现改形抗4-1BB单链抗体re-3的VH的设计简并位点中，有11个选择了人源残基(V5，S7，V11，V20，T30，G44，M48，V68，I70，A72，T74)，3个选择鼠源残基(V12，M76，S91)，4个发生突变(N38，S67，P85，S87)；VL的设计简并位点中，有7个选择了人源残基(P8，L11，A19，T20，T74，F83，A84)，5个选择鼠源残基(T14，D17，E42，S43，L104)，1个发生突变(N6O)。对上述5个突变进行分析后发现(分析结果见如图11-3)，四个突变(VH：N38，S67，S87；VL：N6O)是简并核苷酸随机重组的结果。另外一个突变(VH：P85)是在非简并位点发生核苷酸随机突变所致。这说明我们在成功进行抗4-1BB单链抗体的改形的同时，通过引进突变和筛选，实现了分子定向进化。

将re-3和m4b4-1 scFv分别进行在线结构模拟(网址为http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)和在线结构比对(网址为http://cl.sdsc.edu/ce.html)。比对结果见图12-A。在re-3和m4b4-1 scFv之间的明显不匹配区(regionl，region2，region3)均位于VH内(见图12-B，图12-C，图12-D，图12-E)，而且HFR2区的两个突变(P85，S87)对CDR3的构像产生了远程影响。这两个位点将是进一步进行抗体亲和力成熟时，需要进行重点优化的位点。

SEQUENCE LISTING

<110>北京安波特基因工程技术有限公司

中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>一种用于抗体改形新的体外分子定向进化方法

<130>I030369

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>732

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(732)

<223>

<400>1

cag gtt cag ctg gtg caa tcg ggt gcg gaa gtg gtg aaa ccg ggt gca 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

tct gtt aaa gtg tct tgc aaa gcg agc ggt tac acc ttc acc tct tac 96

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

tgg atg cac tgg gtt aat cag cgt ccg ggt cag ggt ctg gaa tgg atg 144

Trp Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

ggt gaa ate aac ccg ggt aac ggc cac acc aac tac aac gaa aaa ttc 192

Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

aaa agc agt gtg acc att acc gcg gac acg tct agc agc acc gcg tac 240

Lys Ser Ser Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

atg cag ctg agc ccc ctg agc agc gaa gac agc gct gtt tac tac tgc 288

Met Gln Leu Ser Pro Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

gca cgt tct ttc acc acc gct tgt gcg ttc gcc tac tgg ggt cag ggc 336

Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Cys Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

acc ctg gtg acc gtt tcc tcc act agt gga ggc ggt ggg agc ggc ggt 384

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

ggt tct ggg ggt ggc ggc agc tct aga gac ate gtt atg acc cag agc 432

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asp Ile Val Met Thr Gln Ser

130 135 140

ccg gcg acc ctg agc gtg acc ccg ggt gat cgt gcg acc ctg tct tgc 480

Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys

145 150 155 160

cgt gcg tct cag acc atc agc gac tac ctg cac tgg tac caa cag aaa 528

Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

agc cac gaa tcc ccg cgt ctg ctg atc aaa tac gca tct cag tct atc 576

Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile

180 185 190

agc ggt atc ccg aac cgt ttc tct ggt tcc ggt agc ggt tct gac ttc 624

Ser Gly Ile Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe

195 200 205

acc ctg acc atc aac agc gtg gaa ccg gaa gac ttt gcc gtg tac tac 672

Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

tgc cag gac ggt cac tct ttc ccg ccg acc ttc gga ggt ggt acc aaa 720

Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

ctg gaa atc aaa 732

Leu Glu Ile Lys

<210>2

<211>244

<212>PRT

<213>Artificial

<400>2

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Asn Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Ser Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Pro Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Phe Thr Thr Ala Cys Ala Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Asp Ile Val Met Thr Gln Ser

130 135 140

Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly Asp Arg Ala Thr Leu Ser Cys

145 150 155 160

Arg Ala Ser Gln Thr Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile

180 185 190

Ser Gly Ile Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe

195 200 205

Thr Leu Thr Ile Asn Ser Val Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr

210 215 220

Cys Gln Asp Gly His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Glu Ile Lys

Claims

1.一种用于抗体改形的体外分子定向进化方法，包括下列步骤：

(1)根据根据抗体序列在进化上的保守性确定抗体序列的种属特异性和个体特异性，确定关键氨基酸残基的位置；

(3)通过PCR的方法构建核糖体展示模板，进行核糖体展示筛选。

2.根据权利要求1的方法，包括下列步骤：

(1)以鼠源抗体的重链可变区VH和轻链可变区VL的氨基酸序列为模板，采用同源搜索的方法，从已有的免疫球蛋白序列库中寻找CDR移植受体；

(2)将鼠源抗体序列及其亚群共有序列、候选移植受体抗体序列及其亚群共有序列进行比对，保留鼠源抗体的CDR区和FR区内一致的序列；

(3)在两者之间添加一段重复性连接肽GGGGSGGGGSGGGGS设计成改形单链抗体库；

(4)按照大肠杆菌喜好的密码子表，将该改形单链抗体库翻译成DNA序列；

(5)按照重叠PCR的要求，将改形单链抗体库DNA“拆分”成60个核苷酸以下的单链寡聚核苷酸片段，进一步采用重叠PCR技术构建初级改形单链抗体库，

(6)通过采用DNA改组技术，进行随机重组，构建次级改形单链抗体库，

(7)采用一步PCR反应，引入核糖体展示元件进行核糖体展示，

(8)经过3轮核糖体展示筛选后，筛选产物直接经过酶切反应连入分泌型表达载体，转化大肠杆菌，进行分泌型表达和活性测定，鉴定与抗原具有较高结合活性的克隆，经过测序验证后，得到改形单链抗体。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于采用该策略进行改形的抗体包括，Fab，单链抗体，单域抗体。

4.权利要求3的方法，其中所改形的抗体为抗4-1BB单链抗体。

5.一种使用权利要求4的方法构建的适合在大肠杆菌中表达的抗4-1BB改形单链抗体。

6.权利要求5的抗4-1BB改形单链抗体，其特征在于具有如下氨基酸序列：

1 QVQLVQSGAE VVKPGASVKV SCKASGYTFT SYWMHWVNQR PGQGLEWMGE

51 INPGNGHTNY NEKFKSSVTI TADTSSSTAY MQLSPLSSED SAVYYCARSF

101 TTACAFAYWG QGTLVTVSST SGGGGSGGGS GGGGSSRDIV MTQSPATLSV

151 TPGDRATLSC RASQTISDYL HWYQQKSHES PRLLIKYASQ SISGIPNRFS

201 GSGSGSDFTL TINSVEPEDF AVYYCQDGHS FPPTFGGGTK LEIK。

7.编码权利要求6的抗4-1BB改形单链抗体的核苷酸序列。

8.权利要求7的核苷酸序列，其特征在于具有如下核苷酸序列：

1 CAG GTT CAG CTG GTG CAA TCG GGT GCG GAA GTG GTG AAA CCG GGT

46 GCA TCT GTT AAA GTG TCT TGC AAA GCG AGC GGT TAC ACC TTC ACC

91 TCT TAC TGG ATG CAC TGG GTT AAT CAG CGT CCG GGT CAG GGT CTG

136 GAA TGG ATG GGT GAA ATC AAC CCG GGT AAC GGC CAC ACC AAC TAC

181 AAC GAA AAA TTC AAA AGC AGT GTG ACC ATT ACC GCG GAC ACG TCT

226 AGC AGC ACC GCG TAC ATG CAG CTG AGC CCC CTG AGC AGC GAA GAC

271 AGC GCT GTT TAC TAC TGC GCA CGT TCT TTC ACC ACC GCT TGT GCG

316 TTC GCC TAC TGG GGT CAG GGC ACC CTG GTG ACC GTT TCC TCC ACT

361 AGT GGA GGC GGT GGG AGC GGC GGT GGT TCT GGG GGT GGC GGC AGC

406 TCT AGA GAC ATC GTT ATG ACC CAG AGC CCG GCG ACC CTG AGC GTG

451 ACC CCG GGT GAT CGT GCG ACC CTG TCT TGC CGT GCG TCT CAG ACC

496 ATC AGC GAC TAC CTG CAC TGG TAC CAA CAG AAA AGC CAC GAA TCC

541 CCG CGT CTG CTG ATC AAA TAC GCA TCT CAG TCT ATC AGC GGT ATC

586 CCG AAC CGT TTC TCT GGT TCC GGT AGC GGT TCT GAC TTC ACC CTG

631 ACC ATC AAC AGC GTG GAA CCG GAA GAC TTT GCC GTG TAC TAC TGC

676 CAG GAC GGT CAC TCT TTC CCG CCG ACC TTC GGA GGT GGT ACC AAA

721 CTG GAA ATC AAA

9.一种抗4-1BB改形单链抗体的载体，其含有权利要求7或8的核苷酸序列。

10.权利要求9的载体，它是4-1BB-pFUW802。

11.一种宿主细胞，含有权利要求9或10的载体。

12.权利要求11的宿主细胞，其是大肠杆菌细胞。

13.权利要求12的宿主细胞，其是大肠杆菌HB2151细胞。