CN1922210A - 可用作治疗剂的单价抗体片段 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含稳定化单价抗体片段的方法和组合物，所述片段由单个抗原结合臂和Fc区组成，所述Fc区提高稳定性但不诱导二聚化，且包含第一和第二Fc多肽的复合体，其中只有Fc多肽之一是N端截短的重链。

Description

可用作治疗剂的单价抗体片段
                         相关申请
本申请是根据37 CFR 1.53(b)(1)提交的非临时申请，要求2003年12月19日提交的临时申请号60/531,409的优先权利益，并将其内容完整收入本文作为参考。
                         技术领域
一般而言，本发明涉及分子生物学和抗体治疗学领域。更具体的说，本发明涉及具有用作治疗剂的独特特征的新型单价抗体片段以及所述抗体片段的用途。
                         背景技术
近年来发现，在多种紊乱和疾病中使用抗体作为诊断和治疗剂的前途越来越大。大体上，已经做出了大量努力，研究在天然抗体中发现的抗体序列和结构，并对其进行修饰以获取期望特征，这反映了抗体对于诊断、研究和治疗目的的重要性。
普遍的观点是，理想的治疗性抗体应具有某些最低限度特征，包括施用于受试患者后的靶特异性、生物稳定性和生物利用度，以及足以将治疗效果最大化的靶结合亲和力。不幸的是，生成具有所有这些最低限度特征或甚至其中大多数所述最低限度特性的抗体治疗剂的努力所获得的成就是有限的。例如，全长抗体诸如IgG展示期望的药动学(如实质性体内半衰期)和优良的靶结合亲和力，这是由于一个抗体分子中存在两个抗原结合臂而衍生的亲合效果(avidity effect)。但是，这些全长抗体由于其分子尺寸较大而遭遇生物利用度的问题。另外，全长抗体在有些情况中可能在与靶抗原结合后展示激动剂效果(agonistic effects)(这是不想要的)，即使作为Fab片段时它是拮抗性抗体。参阅如美国专利号6,468,529。在期望的治疗作用是拮抗效果(antagonistic effect)时，这种现象是不适宜的。在有些情况中，这种现象可能是由于在与细胞表面受体结合后促进受体二聚化从而导致受体活化的二价抗体的“交联”效果(“cross-linking”effect)。
尽管认为单价抗体不会具有“交联”效果，然而由于其结构/构造的某些内在限制，至今未曾希望单价抗体作为治疗剂。例如，Fab形式的单价抗体在用作治疗剂方面具有低劣的药效学(如在体内不稳定且在施用后迅速清除)。另外，与它们的多价对应物相比，单价抗体由于缺乏亲合结合效应通常具有较低的表观结合亲和力。
一般而言，用作治疗剂的抗体形式的选择是在接受了每种形式都具有不利限制这一事实的前提下做出决定的。尽管如此，显然全长抗体形式是近几年所选择的形式，这很可能是(至少部分)由于其体内生物稳定性。在生物稳定性不像生物利用度那般作为治疗功效的关键因素时，权衡之后，单价抗体可能是可接受的。例如，部分由于与全长抗体相比更好的组织穿透性，单价Fab抗体可能是将异源分子诸如毒素投递至靶细胞或组织使得异源分子在其中发挥治疗作用的较好载体。参阅如美国专利号5,169,939。开发单价抗体作为治疗剂的尝试的其它实例包括其中单价对于获得治疗效果是至关重要的背景，如在担心抗体的二价性可能诱导靶细胞进行抗原调节从而可能为靶细胞提供逃避细胞毒剂、效应物和补体的手段时。下列文献描述了这些抗体的实例：Cobbold和Waldmann，1984，Nature，308：460-462；EP 0 131 424；Glennie和Stevenson，1982，Nature，295：712-714；Nielsen和Routledge，2002，Blood，100：4067-4073；Stevenson等人，1989，Anticancer Drug Des.，3(4)：219-230；Routledge等人，1995，Transplantation，60：847-853；Clark等人，1989，Eur.J.Immunol.，19：381-388；Bolt等人，1993，Eur.J.Immunol.，23：403-411；Routledge等人，1991，Eur.J.Immunol.，21：2717-2725；Staerz等人，1985，Nature，314：628-631；及美国专利号5,968,509。值得注意的是，这些单价抗体片段含有功能性Fc序列，这是因为治疗作用需要它们的效应物功能(诸如补体介导的T细胞裂解)。除了上述情况以外，本领域似乎尚未认识到在作为治疗剂使用和/或开发的单价抗体中包含Fc区的需要或效用。获得这些抗体的实际困难加重了在Fc区不是治疗作用所必需时在单价抗体中包含Fc区的不情愿。现有的抗体生产技术不能提供有效的方法以较大数量且以充分纯化形式获得包含单个抗原结合构件(即单价)和Fc区的异二聚体。
值得注意的是，为了提高抗体片段的体内稳定性已经做出了一些努力并获得了不同程度的成功。例如，可以将Fab片段附着到稳定性部分诸如聚乙二醇或其它稳定化分子诸如异源肽上。参阅如Dennis等人，2002，J.Biol.Chem.，277：35035-35043；PCT发布号WO 01/45746。
综上所述，仍然非常需要改良的抗体形式以及生产和使用这些抗体的方法，例如用作治疗剂或预防剂。本文描述的发明致力于解决这种需要并提供了其它好处。
完整收录本文引用的所有参考文献(包括专利申请和出版物)作为参考。
                         发明公开
本发明提供了在其治疗效用、功能性和生产方法方面提供多种优势的抗体形式。一方面，本发明的抗体提供了对于某些非基于免疫应答的治疗方案至关重要的单价特征。例如，在需要拮抗作用的病理条件中和在抗体的二价性导致不利激动作用时，本发明抗体的单价特性导致和/或确保在抗体与靶分子结合后的拮抗作用。另外，与具有相似/基本上相同的抗原结合特征的Fab形式相比，本发明抗体的特征有上佳的药动学属性(诸如半衰期延长和/或体内清除率减慢)，由此克服了使用常规单价Fab抗体的主要缺点。一方面，本发明的抗体具有少许免疫效应物功能至完全没有免疫效应物功能，这种特性在治疗免疫效应物应答是有害的病理状况中特别有用。另一方面，本发明抗体的特征有大大提高产量的改变。另外，与用于生产单价抗体片段的某些常规方法(如酶促消化，在有些情况中继以化学偶联)相反，本发明生产方法的重组本质使之有可能获得具有足够高度的同质性和/或纯度的可作为治疗剂开发和/或商品化的抗体群。
因此，一方面，本发明提供了包含单个靶分子结合臂和Fc区(即Fc多肽的复合体)的单价抗体片段，其中所述单价抗体片段在体内比缺乏所述Fc区的对应抗体片段更加稳定。一方面，本发明提供了包含单个抗原结合臂和Fc区的抗体片段，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比，所述Fc区提高抗体片段的稳定性(即更加稳定，例如展示更长的体内半衰期)，且所述Fc区包含第一和第二Fc多肽的复合体，其中只有所述一种Fc多肽而不是二种Fc多肽是N端截短的重链。在一个实施方案中，N端截短的重链由或基本上由铰链序列组成，它与重链CH2和/或CH3结构域中的至少一部分连续相连，足以与第一Fc多肽形成复合物，并赋予所述提高的稳定性。在一个实施方案中，N端截短的重链由或基本上由铰链序列组成，它与能够与第一Fc多肽形成复合物的重链CH2和/或CH3结构域连续相连，并赋予所述提高的稳定性。在一个实施方案中，N端截短的重链的N端序列是部分或整个铰链序列(即截短的重链所包含的N端包含部分或整个铰链序列)。在一个实施方案中，N端截短的重链是IgG重链。在一个实施方案中，Fc区能够结合FcRn。在一个实施方案中，Fc区不具有FcRn结合以外的免疫效应物功能。通常且优选的是，N端截短的重链不特异结合抗原。
正如本文所述，本发明抗体片段的特征是与其Fab片段对应物相比稳定性显著增强。在有些实施方案中，本发明的抗体片段展示的体内半衰期是其Fab对应物的至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约200倍、至少约300倍、至少约350倍、至少约400倍、至少约450倍、至少约500倍。可以通过本领域知道的多种方法来测量体内半衰期，本文描述了其中一些。在一个实施方案中，体内半衰期是通过对合适哺乳动物(诸如小鼠)施用一定量的抗体并测量哺乳动物中所施用抗体数量的降低速率而测量的。
免疫效应物功能在某些临床背景中是不必要的或甚至有害的。在有些实施方案中，本发明的抗体是未糖基化的。这些抗体不展示依赖Fc区糖基化的实质性免疫效应物功能。通常且优选的是，本发明的未糖基化抗体不展示实质性免疫效应物功能，除了结合FcRn。在有些实施方案中，本发明的抗体片段不具有实质性效应物功能或完全缺乏FcRn结合以外的效应物功能。在一个实施方案中，所述效应物功能指补体裂解。在一个实施方案中，所述效应物功能指抗体依赖性细胞毒性作用(ADCC)。在一个实施方案中，抗体片段结合FcRn。可以通过本领域知道的多种方法生产未糖基化抗体。方便的方法包括在原核宿主细胞诸如大肠杆菌中表达抗体。
在一个实施方案中，本发明的抗体片段是糖基化的。可以通过本领域知道的方法来完成糖基化，如通过在哺乳动物宿主细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中生成抗体。
在有些实施方案中，本发明的抗体片段不靶向免疫应答的成分，因此其治疗作用的机制不包括免疫应答的调节和/或参与。例如，在一个实施方案中，本发明的抗体片段具有少许免疫抑制特性至没有免疫抑制特性。例如，所述免疫抑制特性可以包括直接或间接招致T细胞耗损的能力。在一个实施方案中，所述抗体片段不特异结合T细胞表面抗原，它在有些实施方案中指CD3或CD4。在一个实施方案中，所述T细胞表面抗原指CD3。在另一个实施方案中，抗体片段不特异结合免疫球蛋白多肽，例如它不特异结合表面免疫球蛋白λ链上的恒定决定簇或表面免疫球蛋白上的独特型决定簇。
本发明的抗体片段能够特异结合目的靶分子。例如，在有些实施方案中，抗体片段特异结合肿瘤抗原。在有些实施方案中，抗体片段特异结合在受体多聚化(如二聚化)后活化的细胞表面受体。在有些实施方案中，本发明抗体与靶分子的结合抑制另一种分子(诸如配体，在靶分子是受体时)与所述靶分子的结合。由此，在一个实施例中，本发明的抗体片段在与靶分子结合后抑制相关结合配偶体结合靶分子。相关结合配偶体可以是配体或是异二聚体或同二聚体。在一个实施方案中，本发明的抗体片段在与靶分子结合后抑制靶分子多聚化。例如，在本发明抗体片段是拮抗物的有些实施方案中，抗体片段与细胞表面受体的结合可能抑制受体与受体另一单位的二聚化，由此抑制受体的活化(至少部分由于缺乏受体二聚化)。本领域知道许多受体分子能够和/或需要二聚化(或是同二聚化或是异二聚化)来实现其正常功能。这些受体包括酪氨酸激酶受体诸如成纤维细胞生长因子受体和HGF受体c-met。其它蛋白质-蛋白质相互作用包括受体-配体相互作用，诸如与flt、flk等结合的VEGF(血管内皮生长因子)和与c-met结合的肝细胞生长因子(HGF)。在一个实施方案中，本发明的抗体片段能够与HGF竞争与c-met的结合。在另一个实施方案中，本发明的抗体片段能够与VEGF竞争与VEGF受体的结合。
一方面，本发明提供了单臂形式(正如本文所定义的)的拮抗剂但以双臂形式(即其中两个臂具有相同的抗原结合能力)作为激动剂或具有激动剂活性的抗体片段。
一方面，本发明提供了包含下列各项的抗体片段：(i)包含轻链可变结构域(且在有些实施方案中还包含轻链恒定结构域)的第一多肽；(ii)包含重链可变结构域、第一Fc多肽序列(且在有些实施方案中还包含非Fc重链恒定结构域序列)的第二多肽；和(iii)包含第二Fc多肽序列的第三多肽。通常，所述第二多肽是包含重链可变结构域、重链恒定结构域(如整个或部分CH1)、和第一Fc多肽的单链多肽。例如，通常通过肽键(即不是非肽键)将第一Fc多肽序列与重链恒定结构域相连。在一个实施方案中，所述第一多肽包含与人轻链恒定结构域融合的非人轻链可变结构域。在一个实施方案中，所述第二多肽包含与人重链恒定结构域融合的非人重链可变结构域。在一个实施方案中，所述第三多肽包含N端截短的重链，它在其N端包含至少部分铰链序列。在一个实施方案中，所述第三多肽包含N端截短的重链，它在其N端不包含功能性或野生型铰链序列。在有些实施方案中，本发明抗体片段的两种Fc多肽共价连接。例如，两种Fc多肽可以经由分子间二硫键例如经由铰链区半胱氨酸残基之间的分子间二硫键连接。
一方面，本发明提供了包含免疫球蛋白群的组合物，其中至少(或至少约)50％、75％、85％、90％、95％的免疫球蛋白是本发明的抗体片段。包含所述免疫球蛋白群的组合物可以是多种形式，包括但不限于宿主细胞裂解物、细胞培养物的培养液、宿主细胞浆、或其半纯化或纯化形式。纯化方法在本领域是众所周知的，本文描述了其中一些。
一方面，本发明提供了具有至少一项特征的抗体片段，即在将抗体片段内的Fc序列的同二聚化降至最低的同时促进异二聚化。这些特征改善了可通过本文所述本发明方法获得的免疫球蛋白群的产量和/或纯度和/或同质性。在一个实施方案中，第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面处相遇/相互作用。在第一和第二Fc多肽在界面处相遇的有些实施方案中，第二Fc多肽(序列)的界面包含的突起(protuberance)可位于第一Fc多肽(序列)的界面的腔(cavity)中。在一个实施方案中，第一Fc多肽已经由模板/原始多肽改变以编码腔或第二Fc多肽已经由模板/原始多肽改变以编码突起或者二者兼之。在一个实施方案中，第一Fc多肽已经由模板/原始多肽改变以编码腔且第二Fc多肽已经由模板/原始多肽改变以编码突起。在一个实施方案中，第二Fc多肽的界面包含的突起可位于第一Fc多肽的界面的腔中，其中所述腔或突起或二者已经分别导入第一和第二Fc多肽的界面。在第一和第二Fc多肽在界面处相互作用的有些实施方案中，第一Fc多肽(序列)的界面包含的突起可位于第二Fc多肽(序列)的界面的腔中。在一个实施方案中，第二Fc多肽已经由模板/原始多肽改变以编码腔或第一Fc多肽已经由模板/原始多肽改变以编码突起，或者二者兼之。在一个实施方案中，第二Fc多肽已经由模板/原始多肽改变以编码腔且第一Fc多肽已经由模板/原始多肽改变以编码突起。在一个实施方案中，第一Fc多肽的界面包含的突起可位于第二Fc多肽的界面的腔中，其中所述突起或腔或二者已经分别导入第一种和第二Fc多肽的界面。
在一个实施方案中，突起和腔各自包含天然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中，包含突起的Fc多肽是通过用具有比原始残基更大侧链体积的输入残基替代来自模板/原始多肽界面的原始残基而生成的。在一个实施方案中，包含突起的Fc多肽是通过包括如下步骤的方法生成的，其中用编码具有比原始残基更大侧链体积的输入残基的核酸替代编码来自所述多肽界面的原始残基的核酸。在一个实施方案中，原始残基是苏氨酸。在一个实施方案中，原始残基是T366。在一个实施方案中，输入残基是精氨酸(R)。在一个实施方案中，输入残基是苯丙氨酸(F)。在一个实施方案中，输入残基是酪氨酸(Y)。在一个实施方案中，输入残基是色氨酸(W)。在一个实施方案中，输入残基是R、F、Y或W。在一个实施方案中，突起是通过替代模板/原始多肽中的两个或多个残基而生成的。在一个实施方案中，包含突起的Fc多肽在第366位苏氨酸处包含色氨酸替代，氨基酸编号依照Katat等人(《Sequences of proteins of immunological interest》第5版，第1卷，第688-696页，1991，NIH，Bethesda，MD)的EU编号方案。
在有些实施方案中，包含腔的Fc多肽是通过用具有比原始残基更小侧链体积的输入残基替代模板/原始多肽界面中的原始残基而生成的。例如，可以通过包括如下步骤的方法来生成包含腔的Fc多肽，其中用编码具有比原始残基更小侧链体积的输入残基的核酸替代编码来自所述多肽界面的原始残基的核酸。在一个实施方案中，原始残基是苏氨酸。在一个实施方案中，原始残基是亮氨酸。在一个实施方案中，原始残基是酪氨酸。在一个实施方案中，输入残基不是半胱氨酸(C)。在一个实施方案中，输入残基是丙氨酸(A)。在一个实施方案中，输入残基是丝氨酸(S)。在一个实施方案中，输入残基是苏氨酸(T)。在一个实施方案中，输入残基是缬氨酸(V)。可以通过替代模板/原始多肽的一个或多个原始残基来生成腔。例如，在一个实施方案中，包含腔的Fc多肽包含两个或多个选自下组的原始氨基酸的替代：苏氨酸、亮氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，包含腔的Fc多肽包含两个或多个选自下组的输入残基：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。在有些实施方案中，包含腔的Fc多肽包含两个或多个选自下组的原始氨基酸的替代：苏氨酸、亮氨酸和酪氨酸，且其中所述原始氨基酸用选自下组的输入残基替代：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。在有些实施方案中，替代的原始氨基酸是T366、L368和/或Y407。在一个实施方案中，包含腔的Fc多肽在第366位苏氨酸处包含丝氨酸替代，氨基酸编号依照Katat等人(见上文)的EU编号方案。在一个实施方案中，包含腔的Fc多肽在第368位亮氨酸处包含丙氨酸替代，氨基酸编号依照Katat等人(见上文)的EU编号方案。在一个实施方案中，包含腔的Fc多肽在第407位酪氨酸处包含缬氨酸替代，氨基酸编号依照Katat等人(见上文)的EU编号方案。在一个实施方案中，包含腔的Fc多肽包含两个或多个选自下组的替代：T366S、L368A和Y407V，氨基酸编号依照Katat等人(见上文)的EU编号方案。在这些抗体片段的有些实施方案中，包含突起的Fc多肽在第366位苏氨酸处包含色氨酸替代，氨基酸编号依照Katat等人(见上文)的EU编号方案。
一方面，本发明的抗体片段包含Fc区，其存在是相对于包含相同抗原结合臂(序列)的Fab片段提高抗体片段的稳定性所要求的。所述Fc区是经由不同Fc多肽序列的复合(多聚化)而形成的。所述不同Fc多肽序列可以包含或不含相同序列和/或结构域，倘若它们能够二聚化而形成Fc区(正如本文所定义的)的话。第一Fc多肽通常以一条多肽链的形式与免疫球蛋白重链一个或多个结构域连续相连，例如与铰链、恒定和/或可变结构域序列相连。在一个实施方案中，第一Fc多肽包含至少部分铰链序列、至少部分CH2结构域和/或至少部分CH3结构域。在一个实施方案中，第一Fc多肽包含免疫球蛋白的铰链序列和CH2和CH3结构域。在一个实施方案中，第二Fc多肽(即作为N端截短的重链的一部分的Fc多肽)包含至少部分铰链序列、至少部分CH2结构域和/或至少部分CH3结构域。在一个实施方案中，第二Fc多肽包含免疫球蛋白的铰链序列和CH2和CH3结构域。在一个实施方案中，本发明的抗体片段包含第一和第二Fc多肽，它们各自包含至少一个抗体恒定结构域的至少一部分。在一个实施方案中，抗体恒定结构域指CH2和/或CH3结构域。在本发明抗体片段包含恒定结构域的任何实施方案中，抗体恒定结构域可以来自任何免疫球蛋白类型，例如IgG。免疫球蛋白来源可以是任何合适的物种起源(如IgG可以是人IgG1)或是合成形式。
本发明的抗体包含单个抗原结合臂。与一种抗原的结合可能牵涉与一种或多种结合靶(如决定簇/表位)的结合。在一个实施方案中，本发明的抗体是单特异性的。在另一个实施方案中，本发明的抗体是免疫粘附素，它在一个实施方案中是单特异性的。
本发明的抗体片段可以与异源部分缀合。任何异源部分都将是合适的，只要它与抗体的缀合不会实质性的降低抗体的期望功能和/或特征。例如，在有些实施方案中，免疫偶联物包含的异源部分是细胞毒剂。在有些实施方案中，所述细胞毒剂选自下组：放射性同位素、化疗剂和毒素。在有些实施方案中，所述毒素选自下组：加利车霉素(calicheamicin，calichemicin)、美登素(maytansine)和单端孢菌素(trichothecene，trichothene)。在有些实施方案中，免疫偶联物包含的异源部分是可检测标记物。在有些实施方案中，所述可检测标记物选自下组：放射性同位素、配体-受体对的一个成员、酶-底物对的一个成员和荧光共振能量转移对的一个成员。
在多种背景中，非常希望获得包含高度同质的本发明抗体片段群的组合物。这可以通过本领域知道的多种方法来完成。例如，通常重组表达构成本发明抗体片段的多肽(与例如酶促消化全长免疫球蛋白不同)。在有些实施方案中，本发明的组合物包含就结合臂的N端和/或Fc区的C端而言基本上同质的抗体片段。若组合物中所含有的至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％的本发明抗体片段在结合臂的N端和/或Fc区的C端具有相同氨基酸残基，则说它是“本质上同质的”。所述组合物可以是最初生成抗体片段的来源组合物的未纯化、半纯化或纯化形式。
一方面，本发明提供了包含本发明抗体片段和载体的组合物，所述载体在一个实施方案中是制药学可接受载体。在一个实施方案中，抗体片段与异源部分缀合。
另一方面，本发明提供了包括容器及其中所含有的组合物的产品，其中组合物包含本发明的抗体片段。在有些实施方案中，这些产品还包括使用所述组合物的指示。在一个实施方案中，抗体片段是以治疗有效量提供的。
又一方面，本发明提供了编码本发明抗体片段的多核苷酸。可以由单个多核苷酸或分开的(多种)多核苷酸编码本发明抗体片段的构件。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码(a)抗原结合臂的轻链和重链构件，和(b)N端截短的重链多肽。在一个实施方案中，单个多核苷酸编码抗原结合臂的轻链和重链构件，且另一种多核苷酸编码N端截短的重链多肽。在一个实施方案中，分开的多核苷酸分别编码抗原结合臂的轻链构件、抗原结合臂的重链构件和N端截短的重链多肽。
一方面，本发明提供了用于表达本发明抗体的重组载体。
一方面，本发明提供了包含本发明多核苷酸或重组载体的宿主细胞。在一个实施方案中，宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌。在一个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，例如哺乳动物细胞，诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
一方面，本发明提供了生成本发明抗体片段的方法，所述方法包括在容许二聚化从而导致抗体片段形成的条件下在合适宿主细胞(如大肠杆菌或CHO)中表达编码抗体片段的核酸。在一个实施方案中，宿主细胞培养物中所生成的至少50％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的免疫球蛋白多肽是本发明的抗体片段。在一个实施方案中，通过本发明方法生成的抗体片段在一种Fc多肽中包含突起且在另一种Fc多肽中包含腔，正如本文所述。在一个实施方案中，本发明提供了包括在宿主细胞中表达三种多核苷酸的方法，其中第一种多核苷酸编码抗原结合臂的第一种构件(如重链CDR序列或可变结构域(且在有些实施例中还包含非Fc重链恒定结构域序列))和第一Fc多肽，第二种多核苷酸编码抗原结合臂的第二种构件(如轻链CDR序列或可变结构域(且在有些实施例中还包含轻链恒定结构域))，且第三种多核苷酸编码包含第二Fc多肽的N端截短的重链，其中通过这些多肽的异多聚化形成本发明的抗体片段。在一个实施方案中，该方法包括将所述多核苷酸导入合适的宿主细胞。在一个实施方案中，该方法包括由细胞培养物(如由细胞裂解物或培养物的培养液)回收本发明的抗体片段。
一方面，本发明提供了包括在合适宿主细胞中表达编码本发明抗体片段构件的核酸的方法，其中编码一种构件的每个顺反子包含与编码所述构件的核酸序列可操作连接的翻译起始区(TIR)，且其中调节每个TIR的强度以获得合适的构件表达水平比率，由此生成期望量的所述抗体片段。在一个实施方案中，TIR具有近似相等的强度。在一个实施方案中，相对TIR强度是1，例如依照Simmons和Yansura，1996，Nature Biotechnol.，14：629-634及Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263：133-147。在有些实施方案中，TIR包含原核分泌信号序列或其变体。在有些实施方案中，原核分泌信号序列选自下组：STII、OmpA、PhoE、LamB、MBP和PhoA分泌信号序列。
本发明的抗体可在多种背景中找到多种用途。例如，本发明的抗体通常是治疗性抗体。本发明的抗体可以通过多种机制来发挥其治疗效果。例如，本发明的抗体可以是激动性抗体(agonist antibody)。在另一个实施例中，本发明的抗体可以是拮抗性抗体(antagonistic antibody)。在还有一个实施例中，本发明的抗体可以是阻断性抗体(blocking antibody)。在另一个实施例中，本发明的抗体可以是中和性抗体(neutralizing antibody)。
一方面，本发明提供了治疗或延迟疾病发展的方法，包括对患病的受试者施用有效量的有效治疗或延迟疾病发展的本发明抗体片段。在一个实施方案中，疾病指肿瘤或癌症。在一个实施方案中，疾病指免疫学紊乱，如自身免疫病，如类风湿性关节炎、免疫性血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、银屑病(牛皮癣)、Sjogren氏综合症、胰岛素依赖性糖尿病等。在另一个实施方案中，疾病与异常血管化(诸如血管发生)有关。在又一个实施方案中，疾病与生长因子-受体信号调节异常有关。在一个实施例中，所述生长因子-受体信号与酪氨酸激酶有关。在一个实施例中，所述生长因子-受体信号与HGF-c-met轴有关。
本发明的抗体适用于治疗或预防由多种细胞、遗传和/或生物化学异常引起的多种病理学状况。例如，本发明的抗体特别适用于治疗和/或预防与HGF/c-met信号途径内的异常有关的病理学状况。在一个实施方案中，本发明的抗体是c-met拮抗物。在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体，例如包含嫁接到异源非人、人、或人源化序列(如框架和/或恒定结构域序列)中的来自非人供体的抗原结合序列的抗体。在一个实施方案中，非人供体是小鼠。在一个实施方案中，抗原结合序列是合成的，如通过诱变(如噬菌体展示筛选等)获得的。在一个实施方案中，本发明的嵌合抗体具有鼠源V区和人源C区。在一个实施方案中，鼠源轻链V区与人源κ轻链融合。在一个实施方案中，鼠源重链V区与人源IgG1 C区融合。在一个实施方案中，抗原结合序列包含轻链和/或重链的至少一种、至少两种或所有三种CDR。在一个实施方案中，抗原结合序列包含重链CDR3。在一个实施方案中，抗原结合序列包含由下述杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体的部分或所有CDR和/或可变结构域序列，即以美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)编号ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)保藏的杂交瘤细胞系。在一个实施方案中，抗原结合序列至少包含由杂交瘤细胞系1A3.3.13或5D5.11.6生成的单克隆抗体的重链CDR3。本发明的人源化抗体包括在FR中具有氨基酸替代的抗体和在嫁接的CDR中有变化的亲和力成熟变体。CDR和FR中替代的氨基酸不限于供体或受体抗体中存在的氨基酸。在其它实施方案中，本发明的抗体还在Fc区的氨基酸残基中包含变化，导致效应物功能改善，包括CDC和/或ADCC功能和B细胞杀伤增强。本发明的其它抗体包括具有改善稳定性的特殊变化的抗体。本发明的抗体还包括在体内具有改善的ADCC功能的岩藻糖缺失变体。
在一个实施方案中，本发明抗体片段包含的抗原结合臂所包含的重链包含至少一种、至少两种或所有三种选自下组的CDR序列：SYWLH(SEQ IDNO：1)、MIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO：2)和YGSYVSPLDY(SEQID NO：3)。在一个实施方案中，抗原结合臂包含的重链CDR-H1具有氨基酸序列SYWLH。在一个实施方案中，抗原结合臂包含的重链CDR-H2具有氨基酸序列MIDPSNSDTRFNPNFKD。在一个实施方案中，抗原结合臂包含的重链CDR-H3具有氨基酸序列YGSYVSPLDY。在一个实施方案中，本发明抗体片段包含的抗原结合臂所包含的轻链包含至少一种、至少两种或所有三种选自下组的CDR序列：KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO：4)、WASTRES(SEQ ID NO：5)和QQYYAYPWT(SEQ ID NO：6)。在一个实施方案中，抗原结合臂包含的轻链CDR-L1具有氨基酸序列KSSQSLLYTSSQKNYLA。在一个实施方案中，抗原结合臂包含的轻链CDR-L2具有氨基酸序列WASTRES。在一个实施方案中，抗原结合臂包含的轻链CDR-L3具有氨基酸序列QQYYAYPWT。在一个实施方案中，本发明抗体片段包含的抗原结合臂所包含的重链包含至少一种、至少两种或所有三种选自下组的CDR序列：SYWLH(SEQ ID NO：1)、MIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQ ID NO：2)和YGSYVSPLDY(SEQ ID NO：3)且轻链包含至少一种、至少两种或所有三种选自下组的CDR序列：KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQ ID NO：4)、WASTRES(SEQ ID NO：5)和QQYYAYPWT(SEQ ID NO：6)。
本发明提供了结合人c-met的人源化抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体在体内有效抑制HGF/c-met活性，且在重链可变区(VH)中至少包含由以美国典型培养物保藏中心编号ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)保藏的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体的CDR3序列和基本上人共有序列(如基本上人重链亚组III(VHIII)的人共有框架(FR)残基)。在一个实施方案中，抗体还包含由以美国典型培养物保藏中心编号ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)保藏的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体的重链CDR1序列和/或CDR2序列。在另一个实施方案中，前述抗体包含由以美国典型培养物保藏中心编号ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)保藏的杂交瘤细胞系生成的单克隆抗体的轻链CDR1序列、CDR2序列和/或CDR3序列和基本上人轻链κ亚组I(VκI)的人共有框架(FR)残基。
在一个实施方案中，本发明抗体片段包含抗原结合臂，该抗原结合臂包含具有如下序列的重链可变结构域：
QVQLQQSGPELVRPGASVKMSCRASGYTFTSYWLHWVKQRPGQGLEWI
GMIDPSNSDTRFNPNFKDKATLNVDRSSNTAYMLLSSLTSADSAVYYCAT
YGSYVSPLDYWGQGTSVTVSS(SEQ ID NO：7)。
在一个实施方案中，本发明抗体片段包含抗原结合臂，该抗原结合臂所包含具有如下序列的轻链可变结构域：
DIMMSQSPSSLTVSVGEKVTVSCKSSQSLLYTSSQKNYLAWYQQKPGQSP
KLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTITSVKADDLAVYYCQQYYAY
PWTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO：8)。
一方面，本发明提供了本发明抗体片段(例如本发明的c-met拮抗性抗体片段)在制备用于诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱等疾病的治疗和/或预防的药物中的用途。
一方面，本发明提供了本发明核酸(例如编码本发明c-met拮抗性抗体片段的核酸)在制备用于诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱等疾病的治疗和/或预防的药物中的用途。
一方面，本发明提供了本发明表达载体(例如编码本发明c-met拮抗性抗体片段的载体)在制备用于诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱等疾病的治疗和/或预防的药物中的用途。
一方面，本发明提供了本发明宿主细胞(例如包含编码本发明c-met拮抗性抗体片段的载体的宿主细胞)在制备用于诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱等疾病的治疗和/或预防的药物中的用途。
一方面，本发明提供了本发明制品(例如包含本发明c-met拮抗性抗体片段和/或编码本发明c-met拮抗性抗体片段的核酸的制品)在制备用于诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱等疾病的治疗性和/或预防性处理的药物中的用途。
一方面，本发明提供了本发明试剂盒(例如包含本发明c-met拮抗性抗体片段和/或编码本发明c-met拮抗性抗体片段的核酸的试剂盒)在制备用于诸如癌症、肿瘤、细胞增殖性紊乱、免疫(诸如自身免疫)紊乱和/或血管发生相关紊乱等疾病的治疗性和/或预防性处理的药物中的用途。
一方面，本发明提供了抑制c-met活化的细胞增殖的方法，所述方法包括使细胞或组织接触有效量的本发明c-met拮抗性抗体片段，由此抑制与c-met活化有关的细胞增殖。
一方面，本发明提供了治疗受试者中与c-met活化调节异常有关的病理学状况的方法，所述方法包括对受试者施用有效量的本发明c-met拮抗性抗体片段，由此治疗所述病症。
一方面，本发明提供了抑制表达c-met或肝细胞生长因子或二者的细胞生长的方法，所述方法包括使所述细胞接触本发明的c-met拮抗性抗体片段，由此引起所述细胞的生长抑制。在一个实施方案中，使所述细胞接触由不同细胞表达的HGF(如经由旁分泌效应)。
一方面，本发明提供了治疗性处理具有癌性肿瘤的哺乳动物的方法，其中肿瘤包含表达c-met或肝细胞生长因子或二者的细胞，所述方法包括对所述哺乳动物施用有效量的本发明c-met拮抗性抗体片段，由此有效治疗所述哺乳动物。在一个实施方案中，使肿瘤接触由不同细胞表达的HGF(如经由旁分泌效应)。
一方面，本发明提供了用于治疗或预防与c-met或肝细胞生长因子或二者表达升高或活性升高有关的细胞增殖性紊乱的方法，所述方法包括对需要这种治疗的受试者施用有效量的本发明c-met拮抗性抗体片段，由此有效治疗或预防所述细胞增殖性紊乱。在一个实施方案中，所述增殖性紊乱是癌症。
一方面，本发明提供了用于抑制细胞生长的方法，其中所述细胞的生长至少部分依赖于c-met或肝细胞生长因子或二者的生长加强效应(growthpotentiating effect)，所述方法包括使所述细胞接触有效量的本发明c-met拮抗性抗体片段，由此抑制所述细胞的生长。在一个实施方案中，使细胞接触由不同细胞表达的HGF(如经由旁分泌效应)。
一方面，本发明提供了治疗性处理哺乳动物中的肿瘤的方法，其中所述肿瘤的生长至少部分依赖于c-met或肝细胞生长因子或二者的生长加强效应，所述方法包括使所述肿瘤接触有效量的本发明c-met拮抗性抗体片段，由此抑制所述肿瘤的生长。在一个实施方案中，使肿瘤接触由不同细胞表达的HGF(如经由旁分泌效应)。
本发明的方法可用于影响任何合适的病理学状态，例如与HGF/c-met信号途经调节异常有关的细胞和/或组织。在一个实施方案中，本发明方法所靶向的细胞是癌细胞。例如，癌细胞可以是选自下组的细胞：乳腺癌细胞、结肠直肠癌细胞、肺癌细胞、乳头状癌细胞(如甲状腺的)、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、宫颈癌细胞、中枢神经系统癌细胞、骨肉瘤细胞、肾癌细胞、肝细胞癌细胞、膀胱癌细胞、胃癌细胞、头和颈鳞状细胞癌细胞、黑素瘤细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞(如多发性骨髓瘤)、神经胶质瘤/成胶质细胞瘤细胞(如多形性星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、多形性少突胶质细胞瘤、多形性少突星形细胞瘤)和白血病细胞。在一个实施方案中，本发明方法所靶向的细胞是过度增殖和/或增生细胞。在一个实施方案中，本发明方法所靶向的细胞是发育异常细胞。在又一个实施方案中，本发明方法所靶向的细胞是转移细胞。
本发明的方法还可以包括额外的治疗步骤。例如，在一个实施方案中，该方法还包括使所靶向的细胞和/或组织(如癌细胞)暴露于放疗或化疗剂的步骤。
c-met的活化是重要的生物学过程，其调节异常导致多种病理学状况。因此，在本发明方法的一个实施方案中，所靶向的细胞(如癌细胞)是其中c-met的活化与相同组织起源的正常细胞相比增强的细胞。在一个实施方案中，本发明的方法引起所靶向细胞的死亡。例如，与本发明拮抗性抗体片段的接触可能导致细胞不能经由c-met途经发信号，继而导致细胞死亡。
c-met活性(及由此的信号)的调节异常可能是由多种细胞变化引起的，包括例如HGF(c-met相关配体)和/或c-met自身的过度表达。因此，在有些实施方案中，本发明的方法包括靶向这样的细胞，在所述细胞(如癌细胞)中c-met或肝细胞生长因子或二者的表达与相同组织起源的正常细胞相比更加丰富。表达c-met的细胞可以受到来自多种来源的HGF的调节，即自分泌或旁分泌方式。例如，在本发明方法的一个实施方案中，使所靶向的细胞接触/结合由不同细胞表达的肝细胞生长因子(如经由旁分泌效应)。所述不同细胞可以是相同或不同的组织起源。在一个实施方案中，使所靶向的细胞接触/结合由所靶向细胞自身表达的HGF(如经由自分泌效应/环)。在一个实施方案中，所靶向细胞中的c-met活性(或活化)依赖于配体。在一个实施方案中，c-met活性(或活化)不依赖配体。
                    附图简述
图1显示了抗c-met Fab/c抗体(单臂抗体)表达的抗Fab Western印迹结果。
图2显示了抗c-met Fab/c抗体(单臂抗体)表达的抗Fc Western印迹结果。
图3显示了在Fc区中包含突起和腔的抗c-met Fab/c抗体(单臂抗体)的表达的抗Fab Western印迹结果。
图4显示了在Fc区中包含突起和腔的抗c-met Fab/c抗体(单臂抗体)的表达的抗Fc Western印迹结果。
图5显示了竞争性结合测定法的结果，其中单臂抗c-met抗体阻断HGF结合c-met。
图6显示了在使用或未用HGF和/或抗c-met 5D5单臂抗体处理的U87细胞中进行的KIRA测定法的结果。
图7显示了BaF3-hMet细胞在存在不同数量的抗c-met 5D5抗体时的细胞增殖。
图8显示了细胞迁移测定法，其中单臂抗c-met抗体阻断HGF功能。
图9A-B显示了单臂抗c-met抗体的药物动力学分析结果。
图10A-B显示了用单臂抗c-met抗体治疗肿瘤的结果。在图10B中，“OA”指示单臂。
                     执行本发明的模式
本发明提供了使用具有独特特征的单价抗体片段的方法、组合物、试剂盒和产品，所述特征使得所述单价抗体片段特别有利于用于治疗某些病理状况。此外，可以容易的以实用产量和期望纯度制备所述抗体片段。与现有的单价抗体相比，本发明抗体片段的特征有上佳的物理化学和/或治疗性能。一般而言，本发明的单价片段片段包含单个抗原结合臂和Fc区，其中与包含所述抗原结合臂但缺乏所述Fc区的Fab抗体片段相比，所述抗体片段展示增强的体内稳定性。在有些实施方案中，本发明的抗体片段在每种Fc序列的一个或多个残基处包含改变，所述Fc序列在构成Fc区的Fc多肽间形成多聚化介面。本发明提供了生产和使用本发明抗体片段的方法。本发明使得本发明新型抗体片段的高效且商业可行性生产成为可能。所述抗体片段可用于治疗非常希望和/或需要使用本质是单价且高度稳定的治疗性抗体的病理状况。本文提供了本发明方法、组合物、试剂盒和产品的详细情况。
通用技术
除非另有说明，本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域技术范围之内。文献中充分阐明了这些技术，诸如《Molecular Cloning：ALaboratory Manual》第2版(Sambrook等人，1989)；《Oligonucleotide Synthesis》(M.J.Gait编著，1984)；《Animal Cell Culture》(R.I.Freshney编著，1987)；《Methods in Enzymology》(Academic Press Inc.)；《Current Protocols inMolecular Biology》(F.M.Ausubel等人编著，1987，以及定期更新)；《PCR：The Polymerase Chain Reaction》(Mullis等人编著，1994)；《A Practical Guideto Molecular Cloning》(Perbal Bernard V.，1988)。
定义
术语“载体”在用于本文时意图指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可以连接额外DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可以将额外DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们所导入的宿主细胞中自主复制(如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其它载体(如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。这些载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“重组载体”)。一般而言，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是载体的最常用形式。
“多核苷酸”和“核酸”在本申请中可以交互使用，是指任一长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者可以通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应引入聚合物的任一取代物。多核苷酸可以包括经过修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在所述聚合物装配之前或之后加入。所述核苷酸序列可以被非一核苷酸组分阻断。多核苷酸还可以在合成后修饰，例如通过与标记物偶联。其他类型的修饰包括，例如，″帽子″，将一个或多个天然生成核苷酸用类似物取代，核苷酸之间修饰例如，含不带电连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidates)，氨基甲酸酯，等)和含带电连接(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，等)的修饰，含有附加基元，例如，蛋白质(例如，核酸酶、毒素、抗体、信号肽、ply-L-赖氨酸，等)的修饰，带有嵌入剂(例如，吖啶，补骨脂素，等)的修饰，含有螯合剂(例如，金属，放射性金属，硼，氧化的金属等)的修饰，含有烷化剂(alkylators)的修饰，带有经修饰连接(例如，α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)，等)的修饰，以及未经修饰形式的多核苷酸。另外，通常出现于糖类的任一羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团取代，用常见保护基保护，或者经过活化制备与其他核苷酸间的其他连接，或者可以偶联至固相或半固相支持物。5′和3′末端的OH可以用长度为1-20个碳原子的胺或有机封端基团(organic capping group)磷酸化或取代。另外还可以将其他羟基衍生至常规的保护基。多核苷酸还可以含有本领域普遍已知的核糖或脱氧核糖糖类的类似形式，包括，例如，2′-氧-甲基，2′-氧-烯丙基，2′-烯丙基-，2′-氟-或2′-叠氮基核糖，碳环形的糖类似物，α-端基异构糖，差向立体异构糖例如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，非环形的类似物以及脱碱基的核苷类似物例如甲基核糖核苷。可以用其他连接基团替代一个或多个磷酸二酯键。这些其他的连接基团包括但不限于这样的实例，其中磷酸酯基被P(O)S(″硫代酸酯基(thioate)″)，P(S)S(″二硫代酸酯基(dithioate)″)，″(O)NR2(″酰胺基团(amidate)″)，P(O)R，P(O)OR′，COCH2(″formacetal″)替代，其中R或R′各自独立地为H或者取代或未被取代的烷基(1-20个C)，任选含有醚(-O-)键、芳香基、链烯基、环烷基、环烯基(cycloalkenyl)或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。上述描述适用于所有本申请所述多核苷酸，包括RNA及DNA。
“寡核苷酸”在用于本文时一般指短多核苷酸，通常是单链，通常是合成的，长度通常但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。
除非另有明确说明或上下文相关的说明，术语“肝细胞生长因子”或“HGF”在用于本文时指能够在容许HGF/c-met信号途经发生的条件下激活所述过程的任何天然或变异的(或是天然存在的或是合成的)HGF多肽。术语“野生型HGF”通常指包含天然存在HGF蛋白质的氨基酸序列的多肽。术语“野生型HGF序列”通常指在天然存在HGF中发现的氨基酸序列。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在广义上可互换使用，且包括单克隆抗体(如全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(如双特异性抗体，只要它们展示期望的生物学活性)和本文描述的抗体片段。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。
“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常相关的至少一种、优选大多数或所有功能。
短语“抗原结合臂”在用于本文时指有能力与目的分子特异结合的本发明抗体片段的组成部分。一般且优选的是，抗原结合臂是免疫球蛋白多肽序列的复合体，例如免疫球蛋白轻链和重链的CDR和/或可变结构域序列。
短语“N端截短的重链”在用于本文时指包含部分但非整个全长免疫球蛋白重链的多肽，其中缺失的部分通常位于重链的N端区域。缺失部分可以包括但不限于可变结构域、CH1、和部分或整个铰链序列。通常，如果不存在野生型铰链序列，那么N端截短的重链中的剩余恒定结构域将包含能够连接另一种Fc序列(即本文所述“第一”Fc多肽)的构件。例如，所述构件可以是经修饰的残基或能够形成二硫键的外加半胱氨酸残基。
术语“单克隆抗体”在用于本文时指由本质上同质的抗体群中获得的抗体，即组成该抗体群的单个抗体是相同的，只是可能以最小数量存在可能的天然存在突变。单克隆抗体是高度特异的，即针对一种抗原。此外，与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中部分重链和/或轻链与衍生自特定物种或属于特定抗体类型或亚型的抗体中的对应序列相同或同源，而该链的剩余部分与衍生自另一种物种或属于另一种抗体类型或亚型的抗体中的对应序列相同或同源，以及这些抗体的片段，只要它们展示期望的生物学活性(美国专利号4,816,567；及Morrison等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851-6855)。
非人抗体(如鼠源)的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最低限度序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体高变区的残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区的残基替换。在有些情况中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包含没有在受体抗体中或在供体抗体中发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一种且通常两种基本上整个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应非人免疫球蛋白中的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列中的FR。人源化抗体还任选包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的Fc。更多详情参阅Jones等人，1986，Nature，321：522-525；Riechmann等人，1988，Nature，332：323-329；及Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596。还可参阅下列综述性论文及其引用的参考文献：Vaswani和Hamilton，1998，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.，1：105-115；Harris，1995，Biochem.Soc.Transactions，23：1035-1038；Hurle和Gross，1994，Curr.Op.Biotech.，5：428-433。
“人抗体”指具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于制备人抗体的任何技术制备的抗体。人抗体的这种定义明确排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“亲和力成熟”的抗体指在一种或多种CDR中具有一处或多处改变从而导致抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。优选的亲和力成熟的抗体将具有纳摩尔或甚至皮摩尔水平的针对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知流程生成。Marks等人，1992，Bio/Technology，10：779-783描述了经由VH和VL结构域改组的亲和力成熟。下列文献描述了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，91：3809-3813；Schier等人，1995，Gene，169：147-155；Yelton等人，1995，J.Immunol.，155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.，154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992，J.Mol.Biol.，226：889-896。
在用于本文时，术语“免疫粘附素”指将异源蛋白(“粘附素”，如受体、配体或酶)的“结合结构域”与免疫球蛋白恒定结构域的效应物构件(effectorcomponent)结合起来的抗体样分子。在结构上，免疫粘附素包含具有不同于抗体的(即是“异源的”)抗原识别和结合位点(抗原结合位点)的期望结合特异性的粘附素氨基酸序列和免疫球蛋白恒定结构域序列的融合体。免疫粘附素中的免疫球蛋白恒定结构域序列可以由任何免疫球蛋白获得，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM。
“异多聚体”、“异多聚复合体”、或“异多聚多肽”指至少包含第一多肽和第二多肽的分子，其中第二多肽的氨基酸序列因至少一个氨基酸残基而与第一多肽不同。异多聚体可以包括由第一和第二多肽形成的“异二聚体”，或者可以形成更高等级的三级结构，其中存在第一种和第二多肽以外的多肽。
在用于本文时，“多肽”通常指具有超过约10个氨基酸的肽和蛋白质。
短语“免疫抑制特性”或其变体在用于本文时指抗体直接或间接导致对一种或多种牵涉免疫系统的正常活性和/或功能(包括但不限于体液和细胞介导的免疫)的抑制的特性。
术语“Fc区”在用于本文时通常指包含免疫球蛋白重链C端多肽序列的二聚复合体，其中C端多肽序列可通过木瓜蛋白酶消化完整抗体得到。Fc区可以包含天然或变异的Fc序列。虽然免疫球蛋白重链Fc序列的边界可以变化，但是人IgG重链Fc序列通常限定为由Cys226附近位置或Pro230附近位置的氨基酸残基至Fc序列羧基末端的区段。免疫球蛋白的Fc序列通常包含两个恒定结构域，CH2结构域和CH3结构域，且任选包含CH4结构域。“Fc多肽”在本文中指构成Fc区的多肽之一。Fc多肽可以由任何合适免疫球蛋白获得，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM。在有些实施方案中，Fc多肽包含部分或整个野生型铰链序列(通常位于其N端)。在有些实施方案中，Fc多肽不含功能性或野生型铰链序列。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒细胞(如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞裂解。
术语“Fc受体”和“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。例如，FcR可以是天然序列人FcR。通常，FcR与IgG抗体结合(γ受体)，且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚型的受体，包括这些受体的等位基因变体和可选剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“激活受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，且主要在其细胞质结构域中有所不同。其它同种型的免疫球蛋白也可以由某些FcR结合(参阅如Janeway等人，《Immuno Biology：the immune system in health and disease》，Elsevier ScienceLtd.，NY，第4版，1999)。激活受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(综述见Daron，1997，Annu.Rev.Immunol.，15：203-234)。FcR的综述见Ravetch和Kinet，1991，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92；Capel等人，1994，Immunomethods，4：25-34；及de Haas等人，1995，J.Lab.Clin.Med.，126：330-41。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括将来鉴定的FcR。该术语还包括新生儿受体FcRn，它负责将母亲的IgG转移给胎儿(Guyer等人，1976，J.Immunol.，117：587；及Kim等人，1994，J.Immunol.，24：249)。
“铰链区”、“铰链序列”及其变体在用于本文时包含本领域知道的含义，下列文献中有图解：例如Janeway等人，《Immuno Biology：the immune systemin health and disease》，Elsevier Science Ltd.，NY，第4版，1999；Bloom等人，1997，Protein Science，6：407-415；Humphreys等人，1997，J.Immunol.Methods，209：193-202。
术语“顺反子”在用于本文时意图指与翻译单元粗略相当的遗传元件，包含编码多肽链的核苷酸序列和邻近的控制区。“邻近的控制区”包括例如翻译起始区(TIR；如下文定义)和终止区。
“翻译起始区”或TIR在用于本文时指为目的基因提供翻译起始功效的核酸区。通常，特定顺反子内的TIR涵盖核糖体结合位点(RBS)及RBS的5’和3’序列。RBS限定为最低限度含有Shine-Dalgamo区和起始密码子(AUG)。因此，TIR还包括至少部分待翻译核酸序列。在有些实施方案中，本发明的TIR在顺反子内在编码轻链或重链的序列的前面包含编码信号肽的分泌信号序列。TIR变体在TIR区内含有改变TIR特性(诸如其翻译强度，如下文定义)的序列变异(特别是替代)。优选的是，本发明的TIR变体在分泌信号序列的前2至约14个、优选约4至12个、更优选约6个密码子内含有序列替代，所述分泌信号序列位于顺反子内位于编码轻链或重链的序列的前面。
术语“翻译强度”在用于本文时指分泌多肽在对照系统中的度量，其中将一种或多种TIR变体用于指导多肽的分泌，并将结果与相同培养和测定条件下的野生型TIR或某些其它对照进行比较。不限于任何一种理论，“翻译强度”在用于本文时包括例如mRNA稳定性、核糖体与核糖体结合位点结合的效率、和穿膜转运模式的度量。
“分泌信号序列”或“信号序列”指编码可用于指导新合成的目的蛋白穿过细胞膜(例如原核生物的内膜或内外膜二者)的短信号肽的核酸序列。因此，目的蛋白(诸如免疫球蛋白轻链或重链多肽)可以分泌到原核宿主细胞的周质或进入培养基。由分泌信号序列编码的信号肽对于宿主细胞可以是内源的，或者它们可以是外源的，包括对于待表达多肽是天然的信号肽。分泌信号序列通常位于待表达多肽的氨基末端，且通常在多肽的生物合成与由细胞质分泌之间酶促切除。由此，成熟的蛋白质产物中通常不存在信号肽。
“封闭性抗体”或“拮抗性(antagonist)”抗体指抑制或降低它所结合的抗原(如c-met和VEGF受体)的生物学活性的抗体。
“激动性抗体(agonist antibody)”在用于本文时指模拟目的多肽(如HGF和VEGF)的至少一种功能性活性的抗体。
“肿瘤抗原”在用于本文时包括本领域知道的含义，包括与正常细胞相比在肿瘤细胞上差异表达的任何分子。在有些实施方案中，所述分子在肿瘤细胞中以可检测的或者显著高于或低于正常细胞的水平表达。在有些实施方案中，所述分子在肿瘤细胞中展示可检测的或者显著高于或低于正常细胞的水平的生物学活性。在有些实施方案中，已知或认为所述分子有助于肿瘤细胞的致瘤特征。本领域已知许多肿瘤抗原。还可以依照本领域技术人员熟知的技术和试验来确定某种分子是否是肿瘤抗原，诸如例如产克隆试验(clonogenic assays)、转化试验、体外或体内肿瘤形成试验、凝胶迁移试验、基因敲除分析等。
“紊乱”指将受益于本发明抗体或方法的治疗的任何状况。这包括慢性和急性紊乱或疾病，包括使哺乳动物易患所讨论紊乱的病理状况。本文中待治疗紊乱的非限制性实例包括恶性和良性肿瘤；非白血病性和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体的、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔病症；及炎性、免疫学和其它血管发生相关紊乱。
术语“癌症”和“癌症的”指的是或描述哺乳动物中特征通常为不受调节的细胞生长/增殖的生理状况。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、和白血病。这些癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌症、骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤/神经胶质瘤(如多形性星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、多形性少突胶质细胞瘤、多形性少突星形细胞瘤)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝的癌(hepatic carcinoma)及各种类型的头和颈癌。
“自身免疫病”在本文中指源于且针对个体自身组织的非恶性疾病或紊乱。自身免疫病在本文中明确排除恶性或癌性疾病或紊乱，尤其排除B细胞淋巴瘤、急性成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、多毛细胞白血病和慢性成髓细胞白血病。自身免疫疾病或紊乱的实例包括但不限于炎性应答，诸如炎性皮肤病，包括银屑病(牛皮癣)和皮炎(如特应性皮炎)；系统性硬皮病和硬化症；与炎性肠病有关的应答(诸如Crohn氏病和溃疡性结肠炎)；呼吸窘迫综合症(包括成人呼吸窘迫综合症；ARDS)；皮炎；脑膜炎；脑炎；葡萄膜炎；结肠炎；肾小球肾炎；过敏状况，诸如湿疹和哮喘及牵涉T细胞浸润和慢性炎性应答的其它状况；动脉硬化；白细胞粘着缺陷；类风湿性关节炎；系统性红斑狼疮(SLE)；糖尿病(如I型糖尿病和胰岛素依赖性糖尿病)；多发性硬化症；Reynaud氏综合症；自身免疫性甲状腺炎；特应性脑脊髓炎；Sjorgen氏综合症；幼发型糖尿病；通常在肺结核、结节病、多肌炎、肉芽肿病和脉管炎中发现的与细胞因子和T-淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应有关的免疫应答；恶性贫血(Addison氏病)；牵涉白细胞渗出的疾病；中枢神经系统(CNS)炎性紊乱；多种器官损伤综合症；溶血性贫血(包括但不限于冷球蛋白血症(cryoglobinemia)或Coombs氏反应阳性贫血(Coombs positive anemia))；重症肌无力；抗原-抗体复合物介导的疾病；抗肾小球基膜病；抗磷脂综合症；过敏性神经炎；Graves氏病；Lambert-Eaton肌无力综合症；大疱性类天疱疮；天疱疮；自身免疫性多种内分泌腺病；Reiter氏病；僵体综合症(stiff-man syndrome)；Behcet氏病；巨细胞动脉炎；免疫复合物肾炎；IgA肾病；IgM多神经病；免疫性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫性血小板减少症等。
在用于本文时，“治疗”指试图改变受治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括防止疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或紊乱的发展。在一个实施方案中，本发明的抗体和方法实现了肿瘤消退。在一个实施方案中，本发明的抗体和方法实现了对肿瘤/癌生长的抑制。
“有效量”指在必需的剂量和时间上有效达到期望的治疗或预防效果的数量。本发明抗体的“治疗有效量”可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及抗体在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指抗体的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效达到期望的预防效果的数量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量将低于治疗有效量。
在用于本文时，短语“不具有实质性的效应物功能”就本发明的抗体片段而言指对本领域技术人员显而易见的是本发明抗体片段的可检测效应物功能活性的数量与所述抗体的野生型糖基化对应物所展示的活性数量之间的差异在统计学上是显著的，其中本发明抗体片段的活性数量低于野生型对应物所展示的活性数量。在一个实施方案中，本发明的抗体片段不展示在统计学上显著的超过背景水平的效应物功能活性水平(除了FcRn结合以外)。在用于本文时，短语“具有少许免疫抑制特性至没有免疫抑制特性”就本发明的抗体片段而言指抗体在施用于受试者后不引发生物学有意义的数量的免疫抑制。正如本领域所理解的，可以定量或定性的测定活性的数量，只要能够在本发明的抗体与参照对应物之间进行比较。可以依照本领域知道的任何试验或技术来测量或检测活性，包括如本文所述。可以平行地或分别地测定本发明抗体及其参照对应物的活性的数量。
短语“基本上(本质上)相似的”、“基本上(本质上)同一的”、“基本上(本质上)相同的”及其变化的相应描述在用于本文时指两个数值(通常一个与本发明的抗体有关而另一个与其参照对应物有关)之间足够高度的相似性，使得本领域技术人员将认为两个数值之间的差异在由所述数值测量的生物学、物质或数量特征的语境内没有或具有极少生物学意义。所述两个数值之间的差异优选小于约50％、优选小于约40％、优选小于约30％、优选小于约20％、优选小于约10％，上述百分比为参照对应物数值的函数。
本发明的抗体片段比另一种抗体形式(诸如Fab片段对应物)“更加稳定”或具有“提高的稳定性”及其变体在用于本文时指与参照抗体(诸如Fab片段对应物)相比本发明的抗体片段展示可检测的/可测量的体内稳定性升高。稳定性可以以半衰期、清除速率和/或本领域看作在将本发明的抗体片段施用于受试者后的特定时间点有多少抗体片段保留在受试者体内的指标的任何其它参数为基础。测定稳定性参数诸如半衰期和/或清除速率的方法在本领域众所周知，本文描述了其中一些。
“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”指存在补体时目标的裂解。补体激活途经是由补体系统的第一种构件(C1q)结合与相关抗原复合的分子(如抗体)而发起的。
“结合亲和力”通常指分子(如抗体)的一个结合位点与其结合配对物(如抗原或FcRn受体)之间非共价相互作用的总和强度。分子X对其配对物Y的亲和力通常可以表述为解离常数(Kd)。可以通过本领域知道的通用方法来测量亲和力，包括本文所述。低亲和力抗体微弱地结合抗原(或FcRn受体)，且倾向易于解离；而高亲和力抗体更加紧密的结合抗原(或FcRn受体)，且更久的保持结合。
术语“细胞毒性剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞毁灭的物质。该术语意图包括放射性同位素(如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的小分子毒素或有酶活性的毒素，包括其片段和/或变体。
“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂，诸如噻替哌(thiotepa)和CYTOXAN环磷酰胺(cyclophosphamide)；烷基磺酸盐，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类，诸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimine)和甲基蜜胺(methylamelamine)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫化磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；acetogenin(番荔枝内酯)类(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚类(曲大麻酚(dronabinol)，MARINOL)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicine)；白桦脂酸(betulinic acid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓扑替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东茛菪素(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；鬼臼噻吩苷(teniposide)；隐藻素(cryptophycin)类(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他丁(dolastatin)；duocarmycin(包括合适类似物KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥，诸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、磷雌氮芥(estramustine)、异磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamineoxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥(prednimustine)、三芥环磷酰胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；硝基脲类(nitrosurea)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参阅如Agnew，1994，Chem.Intl.Ed.Engl.，33：183-186))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新抑癌菌素发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素类(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素类(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素类(chromomycin)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN、吗啉阿霉素、氰吗啉阿霉素、2-吡咯啉阿霉素、盐酸阿霉素脂质体注射液(DOXIL)和脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycin)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素类(olivomycin)、培来霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine，GEMZAR)、喃氟啶(tegafur，UFTORAL)、卡培他滨(capecitabine，XELODA)、埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、曲麦克特(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、氮杂胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷、脱氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、羟甲雄酮丙酸酯(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid，frolinic acid)；醋葡内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基酮戊酸；蒽尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；醋酸羟哔咔唑(elliptinium acetate)；环氧甘醚(etoglucid)；硝酸镓；羟脲；蘑菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine，lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoid)，诸如美登素(maytansine)和美坦西醇类(ansamitocin)；丙米腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫匹达谋(mopidamol，mopidanmol)；nitraerine；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；甲基苄肼(procarbazine)；PSK多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；丙亚胺(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西作非兰(裂裥多糖，sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细格孢氮杂酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecene)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidin，anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(ELDISINE、FILDESIN)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；硫替哌；类紫杉醇类(taxoid)，如紫杉醇(paclitaxel，TAXOL)、紫杉醇的清蛋白改造纳米颗粒剂型(ABRAXANETM)和多西他塞(doxetaxel，TAXOTERE)；苯丁酸氮芥(chlorambucil，chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine，VELBAN)；铂；鬼臼乙叉苷(etoposide，VP-16)；异磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine，ONCOVIN)；奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin，leucovovin)；长春瑞滨(vinorelbine，NAVELBINE)；米托蒽醌(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄醇类，诸如视黄酸；任何上述试剂的制药学可接受盐、酸或衍生物；以及上述两种或多种的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)联合5-FU和亚叶酸(leucovovin)的治疗方案的缩写)。
该定义还包括起调节、降低、阻断、或抑制能够促进癌生长的激素发挥作用的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可能是激素。实例包括抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene，EVISTA)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲奥昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那斯酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene，FARESTON)；抗孕酮；雌激素受体下调剂(ERD)；雌激素受体拮抗剂，诸如氟维司群(fulvestrant，FASLODEX)；作用于抑制或关闭卵巢的试剂，例如促黄体生成素释放激素(LHRH)激动剂，诸如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate，LUPRON和ELIGARD)、醋酸戈舍瑞林(醋酸性瑞林，goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin，tripterelin)；其它抗雄激素，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate，MEGASE)、依西美坦(exemestane，AROMASIN)、福美司坦(formestane，formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏罗唑(vorozole，RIVISOR)、来曲唑(letrozole，FEMARA)和阿纳托唑(anastrozole，ARIMIDEX)。另外，化疗剂的这些定义包括二膦酸盐，诸如氯屈膦酸二钠(clodronate)(例如BONEFOS或OSTAC)、依替膦酸钠(etidronate，DIDROCAL)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸钠(zoledronic acid/zoledronate，ZOMETA)、阿伦膦酸钠(alendronate，FOSAMAX)、帕米膦酸钠(pamidronate，AREDIA)、替鲁膦酸钠(tiludronate，SKELID)或利塞膦酸钠(risedronate，ACTONEL)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制牵涉粘着细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如THERATOPE疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN疫苗和VAXID疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(如LURTOTECAN)；rmRH(如ABARELIX)；lapatinib ditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；COX-2抑制剂，诸如塞来昔布(celecoxib，CELEBREX；4-(5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺；及任何上述试剂的制药学可接受盐、酸或衍生物。
除非文中另有说明，术语“第一种(第一)”多肽和“第二种(第二)”多肽及其变体只是一般称谓，并非指定具体多肽或本发明的抗体构件。
“突起”指例如由第一多肽的界面突出并因此可位于邻近界面(即第二多肽的界面)的补偿腔中从而稳定异多聚体且由此对同多聚体形成而言有助于形成异多聚体的至少一个氨基酸侧链。突起可以存在于原始界面中，或者可以人为导入(如通过改变编码界面的核酸)。通常，改变编码第一多肽的界面的核酸以编码突起。为此，将编码第一多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个比原始氨基酸残基具有更大侧链体积的“输入”氨基酸残基的核酸替代。可以理解，可以存在超过一个原始残基和相应的输入残基。所替代原始残基的数目上限是第一多肽的界面中的残基总数。下表显示了各种氨基酸残基的侧链体积。
表1：氨基酸残基的特性
  氨基酸   单字母缩写   质量a(道尔顿)   体积b(埃3)   可及表面积c(埃2)
  丙氨酸(Ala)   A   71.08   88.6   115
  精氨酸(Arg)   R   156.20   173.4   225
  天冬酰胺(Asn)   N   114.11   117.7   160
  天冬氨酸(Asp)   D   115.09   111.1   150
  半胱氨酸(Cys)   C   103.14   108.5   135
  谷氨酰胺(Gln)   Q   128.14   143.9   180
  谷氨酸(Glu)   E   129.12   138.4   190
  甘氨酸(Gly)   G   57.06   60.1   75
  组氨酸(His)   H   137.15   153.2   195
  异亮氨酸(Ile)   I   113.17   166.7   175
  亮氨酸(Leu)   L   113.17   166.7   170
  赖氨酸(Lys)   K   128.18   168.6   200
  甲硫氨酸(Met)   M   131.21   162.9   185
  苯丙氨酸(Phe)   F   147.18   189.9   210
  脯氨酸(Pro)   P   97.12   122.7   145
  丝氨酸(Ser)   S   87.08   89.0   115
  苏氨酸(Thr)   T   101.11   116.1   140
  色氨酸(Trp)   W   186.21   227.8   255
  酪氨酸(Tyr)   Y   163.18   193.6   230
  缬氨酸(Val)   V   99.14   140.0   155
a氨基酸的分子量减去了水的分子量。数值来自《Handbook of Chemistryand Physics》，第43版，Cleveland，Chemical Rubber Publishing Co.，1961。
b数值来自A.A.Zamyatnin，1972，Prog.Biophys.Mol.Biol.，24：107-123。
c数值来自C.Chothia，1975，J.Mol.Biol.，105：1-14。可及表面积如该参考文献的图6-20定义。
为了形成突起而优选的输入残基通常是天然存在氨基酸残基，且优选选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。最优选的是色氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，用于形成突起的原始残基具有较小侧链体积，诸如丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。
“腔”指至少一个氨基酸侧链陷入第二多肽的界面并因此可容纳第一多肽邻近界面上的相应突起。腔可以存在于天然界面中，或者可以人为导入(如通过改变编码界面的核酸)。通常，改变编码第二多肽的界面的核酸以编码腔。为此，将编码第二多肽的界面中的至少一个“原始”氨基酸残基的核酸用编码至少一个比原始氨基酸残基具有更小侧链体积的“输入”氨基酸残基的DNA替代。可以理解，可以存在超过一个原始残基和相应的输入残基。所替代原始残基的数目上限是第二多肽的界面中的残基总数。上文表1显示了各种氨基酸残基的侧链体积。为了形成腔而优选的输入残基通常是天然存在氨基酸残基，且优选选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和缬氨酸(V)。最优选的是丝氨酸、丙氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，用于形成腔的原始残基具有较大侧链体积，诸如酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
“原始”氨基酸残基指用比原始残基具有更小或更大侧链体积的“输入”残基所替代的氨基酸残基。输入氨基酸残基可以是天然存在的或非天然存在的氨基酸残基，但优选前者。“天然存在的”氨基酸残基指由遗传密码编码的残基，正如上文表1所列。“非天然存在的”氨基酸残基指不是由遗传密码编码的残基，但是它们能够与多肽链中的邻近氨基酸残基共价连接。非天然存在氨基酸残基的实例有正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，诸如例如Ellman等人，1991，Meth.Enzym.，202：301-336中所述。为了生成这些非天然存在氨基酸残基，可以使用Noren等人，1989，Science，244：182和Ellman等人，见上文的流程。简而言之，这牵涉用非天然存在氨基酸残基化学活化抑制型tRNA，然后体外转录并翻译RNA。本发明的方法牵涉替代至少一个原始氨基酸残基，但可以替代超过一个原始残基。通常，所替代的原始氨基酸残基不超过第一或第二多肽的界面中的全部残基。通常，所替代的原始残基是“掩埋的”。“掩埋的”指溶剂基本上达不到该残基。通常，输入残基不是半胱氨酸以防止可能的氧化或二硫键错配。
突起“可位于”腔中指第一多肽和第二多肽各自界面上的突起和腔的空间位置及突起和腔的大小容许突起可以位于腔中且不会显著干扰第一与第二多肽在界面处的正常结合。由于突起(诸如Tyr、Phe和Trp)通常不会由界面的轴垂直伸出且具有优选的构象，因此突起与对应腔的排列取决于以三维结构(诸如通过X射线结晶学或核磁共振(NMR)得到的)为基础的突起/腔对的建模。这可以使用本领域广泛接受的技术来完成。
“原始或模板核酸”指编码目的多肽的核酸，它可以“改变”(即遗传工程改造或突变)以编码突起或腔。原始或起始核酸可以是天然存在的核酸，或者可以包含进行了上述改变的核酸(如人源化抗体片段)。“改变”核酸指原始核酸通过插入、删除或替代至少一个编码目的氨基酸残基的密码子而进行了突变。通常，将编码原始残基的密码子用编码输入残基的密码子替代。用于以这种方式遗传修饰DNA的技术的综述见《Mutagenesis：a PracticalApproach》，M.J.McPherson编，IRL Press，Oxford，UK，1991，且包括例如定点诱变、盒式诱变和聚合酶链式反应(PCR)诱变。通过突变原始/模板核酸，由此就相应改变了由原始/模板核酸编码的原始/模板多肽。
可以通过合成手段将突起或腔“导入”第一或第二多肽的界面，如通过重组技术、体外肽合成、先前所述用于导入非天然存在氨基酸残基的那些技术、通过肽的酶促或化学偶联或这些技术的一些组合。因此，“导入”的突起或腔是“非天然存在的”或“非天然的”，这意味着它不存在于天然或原始多肽中(如人源化单克隆抗体)。
通常，用于形成突起的输入氨基酸残基具有相对较小数目的“旋转异构体”(如约3-6种)。“旋转异构体”指氨基酸侧链的热力学有利构象。各种氨基酸残基的旋转异构体数目的综述见Ponders和Richards，1987，J.Mol.Biol.，193：775-791。
“分离的”异多聚体指已经由其天然细胞培养物环境的成分鉴定且分开和/或回收的异多聚体。其天然环境的污染性成分指将会干扰异多聚体的诊断性或治疗性用途的物质，可以包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在有些实施方案中，异多聚体纯化(1)超过95％(以重量计)的蛋白质(通过Lowry法测定)，或超过99％(以重量计)，(2)达到足以获得至少15个残基的N端或内部氨基酸序列(使用转杯式测序仪)的程度，或(3)根据SDS-PAGE(使用还原或非还原条件，使用考马斯蓝或银染)达到同质。
本发明的异多聚体通常纯化至本质上同质。短语“基本上(本质上)同质的”、“基本上(本质上)同质的形式”和“基本上(本质上)同质”用于指产物本质上不含源自非期望多肽组合体(如同多聚体)的副产物。就表述成纯度而言，基本上(本质上)同质意味着副产物的数量不超过10％、或低于5％、或低于1％、或低于0.5％，其中百分数指重量。
表述“控制序列”指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。例如，适于原核生物的控制序列包括启动子、任选的操纵子序列、核糖体结合位点、可能还有目前了解不多的序列。已知真核细胞利用启动子、多腺苷酸化信号、和增强子。
当一种核酸与另一种核酸序列处于功能性相互关系中时，则它们是“可操作连接的”。例如，若前序列或分泌前导序列的DNA表达成参与多肽分泌的前蛋白，则它与多肽的DNA可操作连接；若启动子或增强子影响编码序列的转录，则它与编码序列可操作连接；或者，若核糖体结合位点的位置促进翻译，则它与编码序列可操作连接。通常，“可操作连接”指DNA序列邻近相连，且在分泌前导序列的情况中指邻近且以读码状态相连。然而，增强子不必邻近。连接可以通过在方便的限制性位点处的连接反应来完成。如果没有这些位点，那么使用与常规实践一致的合成寡核苷酸衔接头或接头。
载体、宿主细胞和重组方法
为了重组生产本发明的抗体，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可以使用常规流程容易的分离编码抗体的DNA并测序(如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针)。可以获得许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核(通常是哺乳动物)起源。
使用原核宿主细胞生成抗体：
载体构建
可以使用标准重组技术获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可以由抗体生成细胞(诸如杂交瘤细胞)分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可以使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可以使用本领域知道的且可获得的许多载体。合适载体的选择主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体都含有多种构件。载体构件通常包括但不限于复制起点、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段、和转录终止序列。
一般而言，与宿主细胞一起使用的质粒载体含有源自与所述宿主相容物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标记序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322含有编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体也可以含有或在修饰后含有能够被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利号5,648,237中详细描述了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。
另外，可以将含有与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可以使用噬菌体诸如λGEM.TM.-11来构建可用于转化敏感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。
本发明的表达载体可以包含两种或多种启动子-顺反子对，编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游(5′)的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型和组成性。诱导型启动子指应答培养条件的变化(如营养物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。
众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化清除源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可以将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可以用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，采用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。
适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶启动子和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，因此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接(Siebenlist等人，1980，Cell，20：269)。
在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。
在另一个方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可以发生在宿主细胞的细胞质中，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(如大肠杆菌trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配(Proba和Pluckthun，1995，Gene，159：203)。
本发明提供了可以调控所表达多肽构件的数量比率的表达系统，从而将分泌且正确装配的本发明抗体的产量最大化。这种调控是至少部分通过同时调控多肽构件的翻译强度而完成的。
Simmons等人，美国专利号5,840,523中公开了用于调控翻译强度的一种技术。它在顺反子内采用翻译起始区(TIR)的变体。对于指定TIR，可以创建具有一定范围翻译强度的一系列氨基酸或核苷酸序列变体，由此提供针对特定链的期望表达水平调节此因素的方便手段。可以通过常规诱变技术导致能够改变氨基酸序列的密码子变化(尽管优选核苷酸序列中的沉默变化)从而生成TIR变体。TIR中的改变可以包括例如Shine-Dalgarno序列的数目或间距的改变，以及信号序列的改变。用于生成突变型信号序列的一种方法是在编码序列的开端生成不改变信号序列氨基酸序列的“密码子库”(即变化是沉默的)。这可以通过改变每个密码子的第三个位置核苷酸来完成；另外，有些氨基酸，诸如亮氨酸、丝氨酸、和精氨酸，具有多种第一个和第二个位置核苷酸，这能够为建库增加复杂性。Yansura等人，1992，METHODS：A Companion to Methods in Enzymol.，4：151-158中详细描述了这种诱变方法。
优选的是，对于载体中的每个顺反子，生成具有一定范围TIR强度的一组载体。这个有限集合提供了每条链的表达水平以及期望抗体产物的产量在各种TIR强度组合下的比较。可以通过量化报道基因的表达水平来测定TIR强度，Simmons等人，美国专利号5,840,523中有详细描述。根据翻译强度的比较，选择期望的个别TIR在本发明的表达载体构建物中进行组合。
适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细菌(Eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌(Escherichia)(如大肠埃希氏菌E.coli)、芽孢杆菌(Bacilli)(如枯草芽孢杆菌B.subtilis)、肠杆菌(Enterobacteria)、假单胞菌(Pseudomonas)物种(如铜绿假单胞菌P.aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、变形菌(Proteus)、志贺氏菌(Shigella)、根瘤菌(Rhizobia)、透明颤菌(Vitreoscilla)、或副球菌(Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110(Bachmann，《Cellular and MolecularBiology》，第2卷，Washington，D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR的菌株33D3(美国专利号5,639,635)。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294(ATCC 31,446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌RV308(ATCC 31,608)也是合适的。这些实例只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，见例如Bass等人，1990，Proteins，8：309-314。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适当的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌、或沙门氏菌物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。
抗体生产
用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。
转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够或是作为染色体外元件或是通过染色体成分而复制。根据所用宿主细胞，使用适合这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。采用的还有一种技术是电穿孔。
在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生产本发明多肽的原核细胞。合适培养基的实例包括添加了必需营养补充物的LB培养基。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的、选择性容许携带表达载体的原核细胞生长的选择剂。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。
除了碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可以含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可以含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。
在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌而言，优选的温度范围是约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。主要根据宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌而言，pH优选约6.8至约7.4，更优选约7.0。
如果本发明的表达载体中所使用的是诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，在用于诱导的磷酸盐限制培养基中培养经转化宿主细胞。优选的是，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基(参阅如Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263：133-147)。根据所采用的载体构建物，可以采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。
在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质且由此回收。蛋白质回收通常牵涉破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰、超声处理或裂解等手段。一旦细胞破裂，可以通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可能转运到培养液中且由此分离。可以由培养液清除细胞，并将培养液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可以使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表达蛋白质。
在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵流程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。
在发酵过程中，通常在细胞在合适条件下生长至期望密度(如OD550约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表的诱导。根据所采用的载体构建物，可以使用多种诱导物，正如本领域知道的且上文所述的。可以在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可以使用更长或更短的诱导时间。
为了改善本发明多肽的产量和质量，可以修改多个发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可以使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式，反式-异构酶)的额外载体共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白的正确折叠和溶解性(Chen等人，1999，J.Biol.Chem.，274：19601-19605；Georgiou等人，美国专利号6,083,715；Georgiou等人，美国专利号6,027,888；Bothmann和Pluckthun，2000，J.Biol.Chem.，275：17100-17105；Ramm和Pluckthun，2000，J.Biol.Chem.，275：17106-17113；Arie等人，2001，Mol.Microbiol.，39：199-210)。
为了将所表达异源蛋白(尤其是对蛋白水解敏感的蛋白质)的蛋白水解降至最低，可以将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可以修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参阅例如Joly等人，1998，见上文；Georgiou等人，美国专利号5,264,365；Georgiou等人，美国专利号5,508,192；Hara等人，1996，Microbial Drug Resistance，2：63-72。
在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。
抗体纯化
在一个实施方案中，进一步纯化此处生成的抗体蛋白以获得基本上(本质上)同质的制剂，用于进一步的测定和使用。可以采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的流程是合适纯化流程的例示：在免疫亲和或离子交换柱上分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、在硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。
在一个方面，将固定在固相上的蛋白A用于本发明全长抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区(Lindmark等人，1983，J.Immunol.Meth.，62：1-13)。蛋白A固定其上的固相优选具有玻璃或石英表面的柱子，更优选可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，试图防止污染物的非特异粘附。
作为纯化的第一步，将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗体特异结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异结合的污染物。最后通过洗脱由固相回收目的抗体。
使用真核宿主细胞生成抗体：
载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。
(i)信号序列构件
用于真核宿主细胞的载体还可以在目的成熟蛋白质或多肽的N端含有信号序列或具有特异切割位点的其它多肽。优选受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导例如单纯疱疹病毒gD信号。
将这些前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。
(ii)复制起点
通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因含有早期启动子才使用。
(iii)选择基因构件
表达和克隆载体可以含有选择基因，也称为选择标记。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予抗生素或其它毒素抗性，如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的关键营养物。
选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。这些显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
适于哺乳动物细胞的选择标记的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标记，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。
例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，合适的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(如ATCC CRL-9096)。
或者，可以通过在含有针对选择标记的选择剂诸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标记诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是含有内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利号4,965,199。
(iv)启动子构件
表达和克隆载体通常含有受到宿主生物体识别的启动子，且与抗体多肽核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加聚腺苷酸尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体中。
在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如由病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、细胞巨化病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40))基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的话。
方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还含有SV40病毒复制起点。方便地以HindIII E限制性片段的形式获得人细胞巨化病毒的立即早期启动子。美国专利号4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利号4,601,978中描述了该系统的一种修改。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参阅Reyes等人，1982，Nature，297：598-601。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
(v)增强子元件构件
常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体多肽的DNA的转录。已知来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧的增强子(bp 100-270)、细胞巨化病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参阅Yaniv，1982，Nature，297：17-18。增强子可以剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5′或3′位置，但是优选位于启动子的5′位点。
(vi)转录终止构件
用于真核宿主细胞的表达载体通常还含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常可以由真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域含有在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参阅WO94/11026及其中公开的表达载体。
(vii)宿主细胞的选择和转化
适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例有经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾系(293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham等人，1977，J.Gen.virol.，36：59)、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216)、小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.，23：243-251)、猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL 1587)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)、牛鼠(buffalorat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)、TRI细胞(Mather等人，1982，Annals N.Y.Acad.Sci.，383：44-68)、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝细胞瘤系(Hep G2)。
为了生产抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规培养基中进行培养。
(viii)宿主细胞的培养
可以在多种培养基中培养用于生产本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏修改Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中描述的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等人，1979，Meth.Enz.，58：44；Barnes等人，1980，Anal.Biochem.，102：255；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利再审号(U.S.Patent Re.)30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适当浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员而言是显然的。
(ix)抗体的纯化
在使用重组技术时，可以在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先需要通过例如离心或超滤清除宿主细胞或裂解片段的微粒碎片。如果将抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这些表达系统的上清液。在任何上述步骤中，可以包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF来抑制蛋白水解，而且可以包括抗生素来防止外来污染物的生长。
可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(优选的纯化技术是亲和层析)来纯化由细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体(Lindmark等人，1983，J.Immunol.Meth.，62：1-13)。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人，1986，EMBO J.，5：1567-1575)。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能够获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。对于包含CH3结构域的抗体而言，可使用Bakerbond ABXTM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSETM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
在任何初步纯化步骤之后，可以将包含目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(如约0-0.25M盐)进行。
活性测定法
可以通过本领域知道的多种测定法对本发明的抗体鉴定它们的物理/化学特性和生物学功能。
可以通过一系列测定法进一步鉴定纯化的免疫球蛋白，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。
在本发明的某些实施方案中，对本文生产的免疫球蛋白分析它们的生物学活性。在有些实施方案中，对本发明的免疫球蛋白测试它们的抗原结合活性。本领域知道的且可用于本文的抗原结合测定法包括但不限于使用诸如Western印迹、放射免疫测定法、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“三明治”免疫测定法、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法等技术的任何直接或竞争性结合测定法。下文在实施例部分中提供了例示性的抗原结合测定法。
在一个实施方案中，本发明涵盖具有一些但非所有效应物功能的改良抗体，这使得它在抗体体内半衰期是重要的但某些效应物功能(诸如补体和ADCC)是不必要的或有害的许多应用中成为期望的候选物。在某些实施方案中，测量所生产免疫球蛋白的Fc活性以确保只保留了期望的特性。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法来确认CDC和/或ADCC活性的降低/耗损。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法来确保抗体缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性)但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，1991，Annu.Rev.Immunol.，9：457-92第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国专利号5,500,362或5,821,337中描述了用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的实例。这些测定法的有用效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估目的分子的ADCC活性，如在动物模型中，诸如Clynes等人，199g，PNAS(USA)，95：652-656中所公开的。还可以进行C1q结合测定法来确认抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可以如Gazzano-Santoro等人，1996，J.Immunol.Methods，202：163中所述进行CDC测定法。还可以使用本领域知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定，如实施例部分中所描述的。
人源化抗体
本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可以具有一个或多个由非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常来自“输入”可变结构域。基本上可以遵循Winter及其同事的方法进行人源化(Jones等人，1986，Nature，321：522-525；Riechmann等人，1988，Nature，332：323-327；Verhoeyen等人，1988，Science，239：1534-1536)，即用非人高变区序列替代人抗体的对应序列。因此，这些“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中完整人可变结构域的很少一部分用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是人的抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用来自啮齿类抗体的类似位点的残基替代。
用于制备人源化抗体的人轻链和重链可变结构域的选择对于降低抗原性是非常重要的。根据所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变结构域序列对已知人可变结构域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(Sims等人，1993，J.Immunol.，151：2296；Chothia等人，1987，J.Mol.Biol.，196：901)。另一种方法使用由特定轻链或重链亚群的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于几种不同的人源化抗体(Carter等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4285；Presta等人，1993，J.Immunol.，151：2623)。
更重要的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲合力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，根据一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可以获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像能够分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白与其抗原结合的能力的残基。通过这种方法，可以由受体和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质的牵涉对抗原结合的影响。
抗体变体
一方面，本发明提供了在构成Fc区的Fc多肽界面中包含修饰的抗体片段，其中该修饰推动和/促进异多聚化。这些修饰包括将突起导入第一Fc多肽和将腔导入第二Fc多肽，其中突起可位于腔中，从而促进第一和第二Fc多肽的复合。本领域知道生成含有这些修饰的抗体的方法，如美国专利号5,731,168中所述。
在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。通过将合适的核苷酸变化导入抗体核酸或通过肽合成来制备抗体的氨基酸序列变体。这些修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。进行任何删除、插入和替代组合以达到最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可以在制备序列时将氨基酸改变导入抗体氨基酸序列。
可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的特定残基或区域的方法有Cunningham和Wells，1989，Science，244：1081-1085描述的所谓“丙氨酸扫描诱变”。这里，鉴定一个残基或一组靶残基(如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或多聚丙氨酸)替代，从而影响抗原内氨基酸的相互作用。然后通过在或对替代位点导入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽管用于导入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析在指定位点处的突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达的免疫球蛋白筛选预期的活性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合(长度范围由一个残基至含有100个或更多残基的多肽)，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体或与细胞毒性多肽融合的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶(如ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。
另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用不同残基替代。最有兴趣进行替代诱变的位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。表2中“优选替代”栏显示了保守替代。如果这些替代导致生物学活性变化，那么可以导入表2中称为“例示替代”的较实质性变化，或下文参照氨基酸分类进一步所述，并筛选产物。
                      表2
  原始残基  例示替代   优选替代
  Ala(A)  val、leu、ile   val
  Arg(R)  lys、gln、asn   lys
  Asn(N)  gln、his、asp、lys、arg   gln
  Asp(D)  glu、asn   glu
  Cys(C)  ser、ala   ser
  Gln(Q)  asn、glu   asn
  Glu(E)  asp、gln   asp
  Gly(G)  ala   ala
  His(H)  asn、gln、lys、arg   arg
  Ile(I)  leu、val、met、ala、phe、正亮氨酸   leu
  Leu(L)  正亮氨酸、ile、val、met、ala、phe   ile
  Lys(K)  arg、gln、asn   arg
  原始残基  例示替代   优选替代
  Met(M)  leu、phe、ile   leu
  Phe(F)  leu、val、ile、ala、tyr   tyr
  Pro(P)  ala   ala
  Ser(S)  thr、cys   cys
  Thr(T)  ser   ser
  Trp(W)  tyr、phe   tyr
  Tyr(Y)  trp、phe、thr、ser   phe
  Val(V)  ile、leu、met、phe、ala、正亮氨酸   leu
对抗体的生物学特性的实质性修饰可通过选择在维持(a)替代区域多肽主链的结构，例如(折叠)片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积这几方面的效果中有显著差异的替代来完成。天然存在的残基可根据共有的侧链特性分组：
(1)疏水性的：正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile；
(2)中性亲水性的：cys、ser、thr；
(3)酸性的：asp、glu；
(4)碱性的：asn、gln、his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro；和
(6)芳香族的：trp、tyr、phe。
非保守替代将限定为用上述某一类的成员替代另一类。
一类替代变体牵涉替代亲本抗体(如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于其来源的亲本抗体将具有改善的生物学特性。生成这些替代变体的方便方法牵涉使用噬菌体展示的亲和力成熟。简单的说，将高变区的数个位点(如6-7个位点)突变，从而在每一个位点生成所有可能的氨基酸替代。将由此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与每个颗粒内包装的M13基因III产物的融合体。然后对噬菌体展示变体筛选它们的生物学活性(如结合亲和力)，正如本文所公开的。为了鉴定候选高变区修饰位点，可以进行丙氨酸扫描诱变来鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以确定抗体与抗原之间的接触点可能也是有利的。这些接触残基及邻近残基是根据本文详述技术进行替代的候选位点。一旦生成这些变体，如本文所述对这组变体进行筛选，可以选择在一种或多种相关测定法中具有上佳特性的抗体用于进一步开发。
通过本领域知道的多种方法制备编码抗体氨基酸序列变体的核酸。这些方法包括但不限于由天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或是由较早制备的抗体的变体或非变体形式通过寡核苷酸诱导的(或定点)诱变、PCR诱变、和盒式诱变制备。
可能希望在本发明免疫球蛋白多肽的Fc区中导入一个或多个氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可以包括在一个或多个氨基酸位置(包括铰链半胱氨酸)包含氨基酸修饰(如替代)的人Fc区序列(如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。
依照此描述和本领域的教导，预料在有些实施方案中，本发明方法中所用的抗体与野生型对应抗体相比可以在如Fc区中包含一处或多处改变。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍将基本上(本质上)保留治疗功效所需要的相同特征。例如，认为可以在Fc区中进行导致Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即或是增强或是削弱)的某些改变，例如WO99/51642中所述。还可参阅关注Fc区变体其它实施例的Duncan和Winter，1988，Nature，322：738-40；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；及WO94/29351。
免疫偶联物
本发明还关于包含与细胞毒剂偶联的抗体的免疫偶联物或抗体-药物偶联物(ADC)，细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性偶联物)。
抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递毒害细胞或抑制细胞试剂(即用于杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的用途(Syrigos和Epenetos，1999，Anticancer Research，19：605-614；Niculescu-Duvaz和Springer，1997，Adv.Drg.Del.Rev.，26：151-172；美国专利号4,975,278)理论上容许药物部分靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些未缀合的药物试剂在试图消除肿瘤细胞的同时可能导致不可接受的对正常细胞的毒性水平(Baldwin等人，1986年5月15日，Lancet，603-05；Thorpe，1985，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，在《MonoclonalAntibodies′84：Biological And Clinical Applications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页)。由此试图获得最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体二者都有报道可用于这些策略(Rowland等人，1986，Cancer Immunol.Immunother.，21：183-87)。这些方法中所用的药物包括道诺霉素、阿霉素、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland等人，1986，见上文)。抗体-毒素偶联物中所用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒素、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler等人，2000，Jour.of the Nat.CancerInst.，92(19)：1573-1581；Mandler等人，2000，Bioorganic & Med.Chem.Letters，10：1025-1028；Mandler等人，2002，Bioconjugate Chem.，13：786-791)、美登木素生物碱类(EP 1391213；Liu等人，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8618-8623)、和加利车霉素(Lode等人，1998，Cancer Res.，58：2928；Hinman等人，1993，Cancer Res.，53：3336-3342)。毒素可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其毒害细胞和抑制细胞的效果。有些细胞毒剂在与大的抗体或蛋白质受体配体缀合时趋于失活或活性降低。
ZEVALIN(ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1 κ单克隆抗体与由硫脲接头-螯合剂结合的111In或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等人，2000，Eur.Jour.Nucl.Med.，27(7)：766-77；Wiseman等人，2002，Blood，99(12)：4336-42；Witzig等人，2002，J.Clin.Oncol.，20(10)：2453-63；Witzig等人，2002，J.Clin.Oncol.，20(15)：3262-69)。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非Hodgkin氏淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血球减少。MYLOTARGTM(gemtuzumabozogamicin，Wyeth Pharmaceuticals)，即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future，2000，25(7)：686；美国专利号4970198；5079233；5585089；5606040；5693762；5739116；5767285；5773001)。Cantuzumabmertansine(Immunogen公司)，即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠、胰腺、胃和其它癌的II期试验。MLN-2704(Millennium Pharm.，BZL Biologics，Immunogen Inc.)，即由抗前列腺特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物部分DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于前列腺癌潜在治疗的开发。将多拉司他汀(auristatin)的合成类似物多拉司他肽、多拉司他E(AE)和单甲基多拉司他(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96(对癌上的Lewis Y特异)和cAC10(对恶性血液肿瘤上的CD30特异)缀合(Doronina等人，2003，NatureBiotechnology，21(7)：778-784)，且正在进行治疗性开发。
上文已经描述了可用于生成这些免疫偶联物的化疗剂。可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链(abrin A chain)、蒴莲根毒素A链(modeccin A chain)、α-帚曲霉素(alpha-sarcin)、油桐(Aleutitesfordii)蛋白质、香石竹毒(dianthin)蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白质(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(tricothecenes)。还可参阅如1993年10月28日公布的WO 93/21232。多种放射性核素可用于生成放射性缀合抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白偶联剂来制备，双功能蛋白偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(iminothiolane，IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如盐酸二甲基己二酰亚胺酯)、活性酯类(诸如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人，1987，Science，238：1098中所述制备蓖麻毒素免疫毒素。C14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参阅WO94/11026。
本文还涵盖抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、单端孢霉素和CC1065及这些毒素具有毒素活性的片段的偶联物。
美登素和美登木素生物碱类
在一个实施方案中，本发明的抗体(全长或片段)与一个或多个美登木素生物碱分子缀合。
美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初由东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利号3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登木醇和C-3美登木醇酯(美国专利号4,151,042)。例如下列专利公开了合成美登木醇及其衍生物和类似物：美国专利号4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533，其公开内容收入本文作为参考。
美登木素生物碱-抗体偶联物
在改进其治疗指数的尝试中，已经将美登素和美登木素生物碱类与特异结合肿瘤细胞抗原的抗体缀合。例如下列专利公开了含有美登木素生物碱类的免疫偶联物及其用途：美国专利号5,208,020、5,416,064及欧洲专利EP 0425 235 B1，将其内容收入本文作为参考。Liu等人，2996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8618-8623描述了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari等人，1992，Cancer Research，52：127-131描述了美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1缀合的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3×105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似的一定程度的细胞毒性，这可以通过增加每个抗体分子缀合的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低的系统性细胞毒性。
抗体-美登木素生物碱偶联物(免疫偶联物)
抗体-美登木素生物碱偶联物是通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性而制备的。每个抗体分子缀合平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个毒素分子/抗体也将相对于裸露抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可以通过已知技术合成或由天然来源分离。例如美国专利号5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中描述了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登木醇和美登木醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登木醇类似物，诸如各种美登木醇酯。
本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利号5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1及Chari等人，1992，Cancer Research，52：127-131中所公开的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，双功能蛋白质偶联剂诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如盐酸二甲基己二酰亚胺酯)、活性酯类(诸如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人，1978，Biochem.J.，173：723-737)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键。
可以将接头附着在美登木素生物碱分子上，根据连接的类型可以在多个位置处。例如，可以使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可以发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登木醇或美登木醇类似物的C-3位置形成键。
加利车霉素
另一种感兴趣的免疫偶联物包含与一个或多个加利车霉素分子缀合的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参阅美国专利5,712,374、5,714,586、5,739,116、5,767,285、5,770,701、5,770,710、5,773,001、5,877,296(都授予美国Cyanamid公司)。可以使用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1 I、α2 I、α3 I、N-乙酰基-γ1 I、PSAG和θI 1(Hinman等人，1993，Cancer Research，53：3336-3342；Lode等人，1998，Cancer Research，58：2925-2928；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可以与抗体缀合的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA二者都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的毒害细胞效果。
其它细胞毒性剂
可以与本发明抗体缀合的其它抗肿瘤试剂包括BCNU、链脲菌素(streptozoicin)、长春新碱、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中描述的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利5,877,296)。
可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌)、蓖麻毒素A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-帚曲霉素、油桐蛋白质、香石竹毒蛋白、美洲商陆蛋白质(PAPI、PAPII、和PAP-S)、苦瓜抑制物、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制物、白树毒蛋白、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依诺霉素和单端孢菌素。参阅例如1993年10月28日公布的WO93/21232。
本发明还涵盖抗体和具有核酸降解活性的化合物(如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成的免疫偶联物。
为了选择性破坏肿瘤，抗体可以包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合抗体。实例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，可以包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc99m或I123，或是包含自旋标记物用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像，mri)，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可以生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用牵涉例如氟-19取代氢的合适氨基酸前体。可以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc99m或I123、Re186、Re188和In111。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker等人，1978，Biochem.Biophys.Res.Commun.，80：49-57)可用于掺入碘-123。《Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy》(Chatal，CRCPress，1989)详细描述了其它方法。
可以使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)还己烷-1-羧酸酯、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(诸如盐酸二甲基己二酰亚胺酯)、活性酯类(诸如二琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人，1987，Science，238：1098中所述制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参阅WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放毒害细胞药物的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头(Chari等人，1992，Cancer Research，52：127-131；美国专利号5,208,020)。
本发明的化合物明确涵盖但不限于用下列交联试剂制备的ADC：商品化(如购自Pierce Biotechnology公司，Rockford，IL，美国)的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯)。见2003-2004年度应用手册和产品目录(ApplicationsHandbook and Catalog)第467-498页。
抗体-药物偶联物的制备
在本发明的抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物基元(moity)(D)缀合，如每个抗体约1个至约20个药物基元。可以采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物基元D反应；和(2)药物基元的亲和基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲和基团反应。
Ab-(L-D)p            I
抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头分子上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可以通过还原剂诸如DTT(二硫苏糖醇)处理使抗体具有与接头试剂缀合的反应活性。由此，每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应活性硫醇亲核体。可以经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷(Traut氏试剂)的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团导入抗体。
还可以通过修饰抗体来生成本发明的抗体-药物偶联物，即导入能够与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。可以用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可以与接头试剂或药物基元的胺基反应的醛或酮基。由此生成的亚胺Schiff碱基可以形成稳定的键，或者可以被例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺键。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可以在蛋白质中生成羰(醛和酮)基，它能够与药物上的合适基团反应(Hermanson，BioconjugateTechniques)。在另一个实施方案中，含有N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质能够与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛(Geoghegan和Stroh，1992，Bioconjugate Chem.，3：138-146；US 5362852)。这些醛能够与药物基元或接头亲核体反应。
同样，药物基元上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头分子上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。
或者，可以通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可以包含编码偶联物两个部分的各自区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。
在又一个实施方案中，可以将抗体与“受体”(诸如链霉亲和素)缀合从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(如放射性核苷酸)缀合的“配体”(如生物素)。
抗体衍生物
可以进一步修饰本发明的抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质成分。具体而言，适于抗体衍生的成分是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1，3-二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或随机共聚物)、右旋糖苷(重复)、聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可以根据如下考虑来确定用于衍生的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。
抗体特异性
本发明适用于具有任何合适抗原结合特异性的抗体。优选的是，本发明方法中所使用的抗体对这样的抗原特异，即生物学重要的多肽。更优选的是，本发明的抗体可用于哺乳动物中疾病或紊乱的治疗或诊断。本发明的抗体包括但不限于阻断性抗体、激动性抗体、中和性抗体、或抗体偶联物。治疗性抗体的非限制性实例包括抗c-met、抗VEGF、抗IgE、抗CD11、抗CD18、抗CD40、抗组织因子(TF)、抗HER2和抗TrkC抗体。还涵盖针对非多肽抗原(诸如肿瘤相关糖脂抗原)的抗体。
当抗原是多肽时，它可以是跨膜分子(如受体)或配体诸如生长因子。例示性抗原包括诸如以下分子：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；甲状腺刺激激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素A链；胰岛素B链；胰岛素原；卵泡刺激激素；降钙素；黄体生成素；高血糖素；凝血因子，诸如因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)、和von Willebrand因子；抗凝血因子，诸如蛋白C；心房钠尿肽；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，诸如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(由正常T细胞表达和分泌的、在激活时受调节的因子，regulated on activation normally T-cell expressed and secreted)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清清蛋白，诸如人血清清蛋白；Muellerian抑制物质；松弛素A链；松弛素B链；松弛素原；小鼠促性腺激素相关肽；微生物蛋白质(microbial protein)，诸如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T淋巴细胞相关抗原(CTLA)，诸如CTLA-4；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子的受体；蛋白A或D；类风湿因子；神经营养因子，诸如骨衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或者神经生长因子，诸如NGF-β；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子，诸如aFGF和bFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白，诸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD40；促红细胞生成素；骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素，诸如干扰素-α、-β、和-γ；集落刺激因子(CSF)，如M-CSF、GM-CSF、和G-CSF；白介素(IL)，如IL-1至IL-10；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原，诸如例如HIV包膜的一部分；转运蛋白；归巢受体；地址素；调节蛋白；整联蛋白，诸如CD11a、CD11b、CD11c、CD18、ICAM、VLA-4和VCAM；肿瘤相关抗原，诸如HER2、HER3或HER4受体；以及任何上文所列多肽的片段。
本发明一个实施方案所涵盖的抗体的抗原包括CD蛋白，诸如CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34、和CD46；ErbB受体家族成员，诸如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞粘附分子，诸如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整联蛋白、和αv/β3整联蛋白，包括其α或β亚基(如抗CD11a、抗CD18、或抗CD11b抗体)；生长因子，诸如VEGF；组织因子(TF)；TGF-β；α-干扰素(α-IFN)；白介素，诸如IL-8；IgE；血型抗原Apo2，死亡受体；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C等。在有些实施方案中，此处的靶是VEGF、TF、CD19、CD20、CD40、TGF-β、CD11a、CD18、Apo2和C24。
在有些实施方案中，本发明的抗体能够与肿瘤抗原特异结合。在有些实施方案中，本发明的抗体能够与肿瘤抗原特异结合，其中该肿瘤抗原不是簇分化因子(cluster differentiation factor)(即CD蛋白)。在有些实施方案中，本发明的抗体能够与CD蛋白特异结合。在有些实施方案中，本发明的抗体能够与CD3或CD4以外的CD蛋白特异结合。在有些实施方案中，本发明的抗体能够与CD19或CD20以外的CD蛋白特异结合。在有些实施方案中，本发明的抗体能够与CD40以外的CD蛋白特异结合。在有些实施方案中，本发明的抗体能够与CD19或CD20特异结合。在有些实施方案中，本发明的抗体能够与CD40特异结合。在有些实施方案中，本发明的抗体能够与CD11特异结合。在一个实施方案中，本发明的抗体结合在免疫细胞中不表达的抗原。在一个实施方案中，本发明的抗体结合在T细胞中不表达的抗原。在一个实施方案中，本发明的抗体结合在B细胞中不表达的抗原。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够与细胞存活调节因子特异结合。在有些实施方案中，本发明的抗体能够与细胞增殖调节因子特异结合。在有些实施方案中，本发明的抗体能够与牵涉细胞周期调节的分子特异结合。在其它实施方案中，本发明的抗体能够与牵涉组织发育或细胞分化的分子特异结合。在有些实施方案中，本发明的抗体能够与细胞表面分子特异结合。在有些实施方案中，本发明的抗体能够结合不是细胞表面受体多肽的肿瘤抗原。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够与淋巴因子特异结合。在另一个实施方案中，本发明的抗体能够与细胞因子特异结合。
在一个实施方案中，本发明的抗体能够与牵涉脉管发生(vasculogenesis)的分子特异结合。在另一个实施方案中，本发明的抗体能够与牵涉血管形成(angiogenesis)的分子特异结合。
可溶性抗原或其片段，任选与其它分子缀合的，可以作为免疫原用于生成抗体。对于跨膜分子，诸如受体，这些分子的片段(如受体的胞外结构域)可以用作免疫原。或者，表达跨膜分子的细胞可以用作免疫原。这些细胞可以衍生自天然来源(如癌细胞系)，或者可以是经重组技术转化而表达跨膜分子的细胞。可用于制备抗体的其它抗原及其形式对于本领域技术人员是显而易见的。
药物制剂
可以通过将具有期望纯度的抗体与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合来制备包含本发明抗体的治疗用配剂，其形式是水溶液、冻干或其它干燥配剂(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》第16版，Osol，A.编，1980)。可接受载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对受者没有毒性，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、组氨酸和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶、或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸、或赖氨酸；单糖、二糖、和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、岩藻糖、或山梨醇；成盐反离子，诸如钠；金属复合物(如锌-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
此处的配剂还可以含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的那些。合适的是，这些分子以对于预定目的有效的量组合存在。
例如在胶态药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗滴乳状液中，活性成分还可以包裹在通过例如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊。这些技术公开于《Remington′s PharmaceuticalSciences》第16版，Osol，A.编，1980。
用于体内施用的配剂必需是无菌的。这可以通过使用无菌滤膜过滤而容易实现。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明免疫球蛋白的固体疏水聚合物半透基质，该基质采取定型产品的形式，如膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-异丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)、以及聚D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露在37℃的潮湿环境中而变性或聚集，导致生物活性损失且免疫原性可能改变。可以根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可以通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用合适添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
用途
本发明的免疫球蛋白可用于例如体外、离体和体内治疗方法。本发明提供了以使用与常规单价抗体相比具有上佳特性的单价抗体片段为基础的多种方法。在某些病理学状况中，必须和/或希望利用单价抗体。同样，在有些情况中，治疗性抗体可以实现其治疗作用但不牵涉免疫系统介导的活性，诸如效应物功能ADCC、吞噬和CDC。在这些情况中，希望生成这些活性实质性降低或消除的抗体形式。如果抗体是能够高效制备且具有高产量的形式，那么这也是有利的。本发明提供了这些抗体，它们可用于多种目的，例如治疗剂、预防剂和诊断剂。例如，本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包括对需要治疗的受试者施用高度稳定的包含单个抗原结合臂的抗体片段，由此治疗疾病。本文描述的任何本发明抗体片段可用于本文描述的治疗(或预防或诊断)方法。
本发明的抗体可用作拮抗剂，从而在体外、离体和/或体内部分或完全阻断特异抗原活性。此外，至少有些本发明抗体能够中和来自其它物种的抗原活性。因此，本发明的抗体可用于抑制特异抗原活性，例如在含有抗原的细胞培养物中、在人受试者中或在具有本发明抗体与之交叉反应的抗原的哺乳动物受试者(如黑猩猩、狒狒、狨猴、猕猴和恒河猴、猪或小鼠)中。在一个实施方案中，本发明的抗体可用于抑制抗原活性，即通过使抗体接触抗原从而抑制抗原活性。优选的是，抗原是人蛋白质分子。
在一个实施方案中，本发明的抗体可用于在患有某种紊乱的受试者中抑制抗原的方法，在所述紊乱中抗原活性是有害的，包括对受试者施用本发明的抗体，从而抑制受试者中的抗原活性。优选的是，抗原是人蛋白质分子且受试者是人受试者。或者，受试者可以是表达本发明抗体所结合的抗原的哺乳动物。又或者，受试者可以是其中导入了抗原(如通过施用抗原或通过表达抗原转基因)的哺乳动物。可以出于治疗目的将本发明的抗体施用于人受试者。此外，可以出于兽医目的将本发明的抗体施用于表达免疫球蛋白与之交叉反应的抗原的非人哺乳动物(如灵长类、猪或小鼠)，或是人疾病的动物模型。关于后者，这些动物模型可用于评估本发明抗体的治疗功效(如测试施药的剂量和疗程)。在治疗上有用的本发明阻断性抗体包括但不限于例如抗c-met、抗VEGF、抗IgE、抗CD11、抗干扰素和抗组织因子抗体。本发明的抗体可用于治疗、抑制、延迟其发展、预防/延迟其复发、改善、或预防与一种或多种抗原分子的异常表达和/或活性有关的疾病、紊乱或状况，包括但不限于恶性和良性肿瘤；非白血病淋巴恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚的疾病；及炎性、血管发生性和免疫紊乱。
一方面，本发明的阻断性抗体对配体抗原特异，而且通过阻断或干扰牵涉配体抗原的配体-受体相互作用来抑制抗原活性，由此抑制相应的信号途经和其它分子或细胞事件。本发明的特色还有受体特异抗体，它们不必阻止配体结合但干扰受体活化，由此抑制通常由配体结合启动的任何应答。本发明还涵盖优选或专门结合配体-受体复合物的抗体。本发明的抗体还可担当特定抗原受体的激动剂，由此加强、增强或激活配体介导的受体活化的全部或部分活性。
在某些实施方案中，将包含与细胞毒剂缀合的抗体的免疫偶联物施用于患者。在有些实施方案中，免疫偶联物和/或它所结合的抗原由细胞内化，导致免疫偶联物杀伤它所结合的靶细胞的治疗功效提高。在一个实施方案中，细胞毒剂靶向或干扰靶细胞中的核酸。这些细胞毒剂的实例包括本文所述任何化疗剂(诸如美登木素生物碱或加利车霉素)、放射性同位素、或核糖核酸酶或DNA内切核酸酶。
在治疗中，本发明的抗体可以单独使用，或是联合其它组合物使用。例如，本发明的抗体可以与另一种抗体、化疗剂(包括化疗剂的鸡尾酒样混合物)、其它细胞毒剂、抗血管发生剂、细胞因子、和/或生长抑制剂联合施用。当本发明的抗体抑制肿瘤生长时，可能特别希望将其联合一种或多种同样抑制肿瘤生长的其它治疗剂。例如，在转移性乳腺癌治疗中可以将阻断VEGF活性的抗VEGF抗体联合抗ErbB抗体(HERCEPTIN抗HER2抗体)。或者/另外，患者可以接受联合放射疗法(如外部射束照射或使用放射性标记试剂诸如抗体的疗法)。上文所述这些联合疗法包括联合施药(当相同或不同剂型中包含两种或多种试剂时)和分开施药，在后一种情况中，本发明抗体的施用可以发生在附属疗法的施用之前和/或之后。
可以通过任何合适手段来施用本发明的抗体(和附属治疗剂)，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内，以及损伤内(如果希望局部治疗的话)。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施药。另外，脉冲输注抗体也是合适的，特别是抗体剂量衰减时。可以通过任何合适路径服药，例如通过注射，诸如静脉内或皮下注射，这部分取决于施药是短期的还是长期的。
可以以与优良医学实践一致的方式配制、服用和施用本发明的抗体组合物。在此内容中考虑的因素包括所治疗的具体病症、所治疗的具体哺乳动物、患者个体的临床状况、病症的起因、投递试剂的部位、施药的方法、施药的日程安排、和医学从业人员知道的其它因素。不是必需而是任选将抗体与目前用于预防或治疗所讨论病症的一种或多种试剂一起配制。这些其它试剂的有效量取决于配制剂中存在的本发明抗体的数量、病症或治疗的类型、和上文讨论的其它因素。这些通常是以与上文所述相同剂量和施用路径使用，或是所述采用剂量的大约1至99％。
对于疾病的预防或治疗，本发明抗体的合适剂量(在单独使用或联合其它试剂诸如化疗剂时)将取决于所治疗疾病的类型、抗体的类型、疾病的严重程度和发展阶段、施用抗体是出于预防或治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对抗体的应答、及主治医师的判断。合适的是，一次性或通过一系列治疗将抗体施用于患者。根据疾病的类型和严重程度，施用于患者的初始候选剂量是约1μg/kg至15mg/kg(如0.1mg/kg-10mg/kg)抗体，例如或是通过一次或多次分开施药或是通过连续输注。根据上文所述因素，典型日剂量的范围可以是约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于持续数天或更长的重复施药，根据状况，持续治疗直至疾病症状发生期望的抑制。抗体的例示剂量的范围可以是约0.05mg/kg至约10mg/kg。由此，可以对患者施用约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任意组合)的一个或多个剂量。这些剂量可以间歇施用，例如每周或每三周(例如使得患者接受由约2个至约20个例如约6个剂量的抗体)。可以施用初始较高加载剂量，后续一个或多个较低剂量。例示性服药方案包括施用约4mg/kg抗体的初始加载剂量，后续每周约2mg/kg的维持剂量。但是，其它剂量方案也可能是有用的。这种疗法的进程易于通过常规技术和测定法来监测。
产品
在本发明的另一个方面，提供了含有可用于上文所述病症的治疗、预防和/或诊断的物质的产品。该产品包含容器和与容器有关的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器等。容器可以由多种材料构成，诸如玻璃或塑料。容器中装有其自身或在联合另外的组合物时有效治疗、预防和/或诊断病症的组合物，而且可以具有无菌进入端口(例如容器可以是具有能够被皮下注射针头刺穿的阻塞物的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性试剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示组合物用于治疗选择的病症，诸如癌症。此外，该产品可以包含(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含其它细胞毒制剂。本发明这个实施方案中的产品还可以包含指示第一和第二抗体组合物可用于治疗特定病症如癌症的包装插页。或者/另外，该产品还可以包含装有制药学可接受缓冲液的第二(或第三)容器，诸如无菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、Ringer氏液和右旋糖溶液。它还可以包含商业和用户立场希望的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
下面是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的一般描述，可以实行多种其它实施方案。
                         实施例
实施例1：本发明抗体的生成和鉴定(下文也称为“单臂抗体”或“Fab/c抗体”)
表达载体的构建
用于表达全长或Fab/c抗-c-met抗体的所有质粒都是基于分开的顺反子系统(Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263：133-147)，它们依赖分开的phoA启动子(AP)(Kikuchi等人，1981，Nucleic Acids Res.，9：5671-5678)来转录重链和轻链和Fc片段，后继trp Shine-Dalgarno序列来启动翻译(Yanofsky等人，1981，Nucleic Acids Res.，9：6647-6668；及Chang等人，1987，Gene，55：189-196)。另外，将热稳定肠毒素II信号序列(STII)(Picken等人，1983，Infect.Immun.，42：269-275；及Lee等人，1983，Infect.Immun.，42：264-268)用于重链和轻链和Fc片段的周质分泌。对两条链和Fc片段的精细翻译控制是用先前所述具有实测的相对翻译力度的STII信号序列变体而达到的，它们在翻译起始区(TIR)中含有沉默密码子改变(Simmons和Yansura，1996，Nature Biotechnol.，14：629-634；及Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263：133-147)。最后，将λt0转录终止子(Schlosstissek和Grosse，1987，Nucleic Acids Res.，15：3185)置于两条链和Fc片段编码序列的下游。所有质粒都采用基于pBR322的载体系统的读码框(Sutcliffe，1978，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.，43：77-90)。抗c-met抗体源是美国专利号5,686,292、5,646,036、6,207,152、6,214,344和6,468,529中描述的5D5抗体。SDS源抗体的杂交瘤细胞系先前保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，12301 ParklawnDrive，Rockville，Md.，USA)，ATCC编号HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)(保藏日期：1995年5月23日)。
质粒pxcM11C
生成编码嵌合5D5抗c-met抗体的期望质粒pxcM11C需要两种中间质粒。首先，为了表达每条链，将5D5重链和轻链的可变结构域分开转移到基于pBR322的质粒上。下文描述了这些中间质粒pxcMLC和pxcMHC的制备，接着是pxcM11C的构建。
pxcMLC
为了将5D5抗体的鼠源轻链可变结构域转移到与生成全长抗体相容的人源轻链框架中而构建该质粒。该质粒的构建牵涉三种DNA片段的连接。第一个是消除了MluI-BamHI小片段的pPho51载体(Simmons和Yansura，1996，Nature Biotechnol.，14：629-634，变体1)。连接的第二个部分是来自pST7LC的约516个碱基对的AlwNI-BamHI片段，编码轻链最后15个氨基酸、λt0终止子和tet基因开端。质粒pST7LC是变体6(见上文参考文献)的衍生物，在STII信号序列下游具有人κ轻链。连接的第三个部分是使用如下引物由含有5D5 Fab序列(下文实施例2中“5D5 Fab的克隆和重组表达”中所述)的质粒生成的约623个碱基对的MluI-AlwNIPCR片段：
5’-TAAATTTAACGCGTACGCTGACATTATGATGTCCCAGTCTCCATCC(SEQ ID NO：9)
5’-GGGCGAGCTCAGGCCCTGATGGGTGACTTCGCAGGC(SEQ ID NO：10)
pxcMHC
为了将5D5抗体的鼠源重链可变结构域导入与生成全长抗体相容的人源重链框架而构建该质粒。PxcMHC的构建牵涉两种DNA片段的连接。第一个是消除了MluI-BstEII小片段的pST2HC载体。质粒pST2HC是变体3(见上文参考文献)的衍生物，其中人源IgG1重链融合在STII信号序列的下游。连接的第二个部分是使用如下引物由含有5D5Fab序列(下文实施例2中“5D5 Fab的克隆和重组表达”中所述)的质粒生成的约346个碱基对的MluI-BstEII PCR片段：
5’-GCTACAAACGCGTACGCTCAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGGG(SEQ ID NO：11)
5’-AAGAGACGGTGACCGAGGTTCCTTGACC(SEQ ID NO：12)
pxcM11C
为了表达全长5D5嵌合抗体而构建质粒pxcM11C。该质粒的构建牵涉四种DNA片段的连接。第一个是消除了MluI-BstEII小片段的paTF20载体(Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263：133-147，paTF20是具有1-轻链和1-重链TIR的多顺反子载体)。连接的第二个部分是来自pxcMLC的约623个碱基对的MluI-AlwNI片段。第三个部分是来自paTF50(见上文参考文献；paTF50是具有1-轻链和1-重链TIR的分开顺反子载体)的约547个碱基对的AlwNI-BsiWI片段。连接的最后一个部分是来自pxcMHC的约349个碱基对的BsiWI-BstEII片段。
质粒pxcM11C-Fc
为了构建pxcM11C-Fc，将编码Fc片段表达的盒以及所有上文所述控制元件(包括AP启动子、STII信号序列和λt0转录终止子)加入质粒pxcM11C。首先需要描述通向pxcM11c-Fc构建的两种质粒，pBR322.VNERK.HC和pBR322.Fc。
pBR322.VNERK.HC
质粒pBR322.VNERK.HC是变体1(Simmons和Yansura，1996，NatureBiotechnol.，14：629-634)的衍生物，在STII信号序列下游具有人源重链。该质粒是通过将两种DNA片段连接起来而构建的。第一个是清除了EcoRI-ClaI小片段的载体pBR322。连接的第二个部分是使用如下引物由pVG11.VNERK生成的约1885个碱基对的EcoRI-ClaI PCR片段，编码AP启动子、STII信号序列、重链、λt0终止子和tet基因的开端：
5’-TTTCCCTTTGAATTCTTGGTTGTTAACGTTGCCGACGCGCATC(SEQ ID NO：13)
5’-TTTCCCTTTATCGATGATAAGCTGTCAAACATGAGTAAACAATAAAAAACGCCC(SEQ ID NO：14)
质粒pVG11.VNERK是具有1-轻链和1-重链TIR的分开顺反子载体的衍生物(Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods 263：133-147)，其中轻链和重链可变结构域变成抗VEGF抗体(VNERK)。
pBR322.Fc
质粒pBR322.Fc是质粒pBR322.VNERK.HC的衍生物，它编码Fc片段的表达以及上文所述所有控制元件。
质粒pBR322.Fc是通过将两种DNA片段连接起来而构建的。第一个是清除了MluI-NsiI小片段的载体pBR322.VNERK.HC。连接的第二个部分是来自pJAL226的约1319个碱基对的MluI-NsiI片段，编码氨基酸SGTT，继以人IgG1的氨基酸221至429。pJAL226是变体3(Simmons和Yansura，1996，Nature Biotechnol.，14：629-634)的衍生物，在STII信号序列下游具有人Fc片段。
pxcM11C-Fc
pxcM11C-Fc是通过将两种DNA片段连接起来而构建的。第一个是清除了HpaI-ClaI小片段的载体pxcM11C。连接的第二个部分是来自pBR322.Fc的约1198个碱基对的HpaI-ClaI片段。该连接导致命名为pxcM11C-Fc的期望质粒。
质粒pxcM11C.H-Fc.K
质粒pxcM11C.H-Fc.K是pxcM11C-Fc的衍生物，其中pxcM11C重链的CH3结构域用具有“穴(hole)”(本文也称为“腔”)突变(T366S、L368A、Y407V)的CH3结构域置换(Merchant等人，1998，Nature Biotechnology，16：677-681)。另外，Fc片段的CH3结构域用具有“隆起(knob)”(本文也称为“突起”)突变(T366W)的CH3结构域置换(见上文参考文献)。
pxcM11C.H
该质粒以两个步骤构建。第一步，通过将两种DNA片段连接起来而导入“穴”突变。第一个是清除了SacII-NsiI小片段的载体pxcM11C。连接的第二个部分是来自pBR322.VNERK.HC.H的约411个碱基对的SacII-NsiI片段。pBR322.VNERK.HC.H是质粒pBR322.VNERK.HC(见上文)的衍生物其中导入了“穴”突变(T366S、L368A、Y407V)(Merchant等人，1998，Nature Biotechnology，16：677-681)。将该中间质粒命名为pxcM11C.H。
pxcM11C.H-Fc.K
第二步，将“隆起”突变导入Fc片段，且牵涉两种DNA片段的连接。第一个是清除了ClaI-HpaI小片段的载体pxcM11C.H。连接的第二个部分是来自pBR322.Fc.K的约1198个碱基对的ClaI-HpaI片段，编码具有“隆起”突变的Fc片段的表达盒。pBR322.Fc.K是质粒pBR322.Fc(见上文)的衍生物，它编码具有“隆起”突变(T366W)的Fc片段的表达(Merchant等人，1998，Nature Biotechnology，16：677-681)以及上文所述所有控制元件。该连接导致命名为pxcM11C.H-Fc.K的期望质粒。
抗c-Met单臂Fab/c抗体的表达和鉴定
使用亲本构建物(5D5抗c-Met的pxcM11C)和单臂Fab/c抗体构建物(pxcM11C-Fc)进行抗体的小规模诱导。对于每种构建物的小规模表达，使用大肠杆菌菌株33D3(W3110 ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kanR)作为宿主细胞。转化后，用所选转化子挑取物接种5ml补充羧苄青霉素(50μg/ml)的Luria-Bertani培养基，并于30℃在培养轮上培养过夜。然后在C.R.A.P.磷酸盐限制培养基(Simmons等人，2002，J.Immunol.Methods，263：133-147)中稀释(1∶100)每份培养物。然后以50μg/ml浓度向诱导培养物中添加羧苄青霉素，并将培养物于30℃在培养轮上培养约24小时。除非另有注释，所有摇瓶诱导以5ml体积进行。
如下所述由诱导培养物制备非还原的全细胞裂解物：(1)将1ml OD600诱导样品在微量离心管中离心；(2)将每份沉淀重悬于90μl TE(10mM TrispH 7.6，1mM EDTA)；(3)向每份样品中添加10μl 100mM碘乙酸(SigmaI-2512)以封闭任何游离半胱氨酸和预防二硫键改组；(4)向每份样品中添加20μl 10％ SDS。将样品旋涡震荡，加热至约90℃达3分钟，然后再次旋涡震荡。在样品冷却至室温后，加入750μl丙酮来沉淀蛋白质。将样品旋涡震荡，并于室温放置约15分钟。在微量离心机中离心5分钟后，吸走每份样品的上清液，并将每份蛋白质沉淀重悬于50μl dH2O+50μl 2X NOVEXSDS样品缓冲液。然后将样品加热至约90℃达4分钟，充分旋涡震荡，并使之冷却至室温。然后进行最后的5分钟离心，并将上清液转移到干净的管中。
如下所述由诱导培养物制备还原的全细胞裂解物：(1)将1ml OD600诱导样品在微量离心管中离心；(2)将每份沉淀重悬于90μl TE(10mM Tris pH7.6，1mM EDTA)；(3)向每份样品中添加10μl 1M二硫苏糖醇(SigmaD-5545)以还原二硫键；(4)向每份样品中添加20μl 10％ SDS。将样品旋涡震荡，加热至约90℃达3分钟，然后再次旋涡震荡。在样品冷却至室温后，加入750μl丙酮来沉淀蛋白质。将样品旋涡震荡，并于室温放置约15分钟。在微量离心机中离心5分钟后，吸走每份样品的上清液，并将每份蛋白质沉淀重悬于10μl 1M二硫苏糖醇+40μl dH2O+50μl 2X NOVEX SDS样品缓冲液。然后将样品加热至约90℃达4分钟，充分旋涡震荡，并使之冷却至室温。然后进行最后的5分钟离心，并将上清液转移到干净的管中。
制备后，将5-8μl每份样品加载到NOVEX制造的10孔1.0mm 12％ Tris-甘氨酸SDS-PAGE上，并以～120伏特电泳1.5-2小时。然后将由此得到的凝胶用考马斯蓝染色或用于Western印迹分析。
对于Western印迹分析，在10mM CAPS缓冲液pH 11+3％甲醇中将SDS-PAGE凝胶电转印到硝酸纤维素膜(NOVEX)上。然后将膜用溶液1XNET(150mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris pH 7.4，0.05％ Triton X-100)+0.5％明胶封闭约30分钟至1小时，于室温摇动。封闭步骤后，为了抗FabWestern印迹分析，将膜置于溶液1X NET+0.5％明胶+抗Fab抗体(过氧化物酶缀合的针对人IgG Fab的山羊IgG馏分；CAPPEL #55223)中。根据抗体的批次，抗Fab抗体的稀释范围由1∶50,000至1∶1,000,000。或者，为了抗FcWestern印迹分析，将膜置于溶液1X NET+0.5％明胶+抗Fc抗体(过氧化物酶缀合的针对人Fc片段的山羊IgG馏分；BETHYL#A80-104P-41)中。根据抗体的批次，抗Fc抗体的稀释范围由1∶50,000至1∶250,000。在每种情况中，将膜置于抗体溶液中过夜，于室温摇动。第二天上午，将膜用1X NET+0.5％明胶清洗3×10分钟，接着用TBS(20mM TrispH 7.5，500mM NaCl)清洗1×15分钟。使用Amersham Pharmacia Biotech ECL检测并将膜暴露于X射线胶片来显现抗Fab抗体和抗Fc抗体所结合的蛋白质条带。
图1显示了抗c-Met Fab/c抗体表达的抗Fab Western印迹结果。它们揭示了完全折叠和装配的全长抗体(泳道1)和单臂Fab/c抗体(泳道2)的表达。注意，抗Fab抗体不能结合Fc片段，因此没有检出。对于非还原样品，Fc片段与全长抗c-Met抗体的共表达导致完全折叠和装配的全长抗体实质性转变为完全折叠和装配的单臂Fab/c抗体。对于还原样品，对全长抗c-Met抗体和单臂抗c-Met Fab/c抗体检出的重链和轻链数量是相似的。单臂抗c-Met Fab/c构建物的轻链前体的数量略有增加，可能是由于分泌途经的轻微倒退(back up)。
类似的，图2显示了抗Fc Western印迹结果，它们也揭示了完全折叠和装配的单臂Fab/c抗体的表达(泳道2)。抗Fc抗体不能结合轻链，因此没有检出。对于非还原样品，Fc区与全长抗c-Met抗体的共表达显示完全折叠和装配的全长抗体转变为完全折叠和装配的单臂Fab/c抗体。另外，在抗FcWestern印迹上还检出Fc多肽的单体和二聚体。对于还原样品，对全长抗c-Met抗体和单臂抗c-Met Fab/c抗体表达检出的重链数量是相似的。单臂Fab/c抗体构建物也有少量的Fc片段前体，可能是由于分泌途经的一些倒退。
根据上述资料显而易见的是，有可能生成其中主要抗体种类是期望的单臂Fab/c抗体的免疫球蛋白群体。然而，通过抗Fab和抗Fc两种Western印迹分析仍能检出完整形式的抗体(即完全折叠和装配的抗c-Met全长抗体)。由于完整形式的抗c-met 5D5抗体是c-met受体的激动剂，它在需要拮抗作用的治疗方案中是不合需要的，因此通常希望将生成的完整形式抗体的数量降至最低。
包含突起和腔(下文也称为“隆起嵌入穴”)的单臂Fab/c抗c-Me抗体的表达和鉴定
为了进一步将抗c-Met Fab/c抗体制备中全长抗c-Met抗体的形成降至最低，基本上如Merchant等人(1998，Nature Biotechnology，16：677-681)所述，在Fc的CH3结构域中进行“隆起嵌入穴”突变。制备单臂Fab/c抗c-Met抗体的构建物(pxcM11C.H-Fc.K)，即将“穴”突变(T366S、L368A、Y407V)导入全长重链，并将“隆起”突变(T366W)导入Fc片段。
然后如上所述以相同方式表达全长抗c-Met抗体(pxcM11C)、单臂Fab/c抗c-Met抗体(pxcM11C-Fc)、和单臂Fab/c“隆起嵌入穴”抗c-Met抗体(pxcM11C.H.Fc.K)构建物。制备全细胞裂解物，通过SDS-PAGE分离，转移到硝酸纤维素上，并用先前所述山羊抗人Fab缀合抗体和山羊抗人Fc缀合抗体检测。
图3显示了抗Fab Western印迹结果，它们显示了单臂Fab/c“隆起嵌入穴”抗c-Met抗体的折叠和装配有显著改善。另外，抗Fab Western印迹结果显示了全长抗c-Met抗体降至不能检出的水平。再次，重要的是要注意，抗Fab抗体不能结合Fc片段。对于非还原样品，单臂“隆起嵌入穴”抗c-Met抗体的表达导致完全折叠和装配的全长抗体实质性转变为完全折叠和装配的单臂Fab/c抗体。由野生型Fc移至“隆起嵌入穴”Fc，单臂Fab/c抗体的折叠和装配也有显著改善。对于还原样品，对全长、单臂Fab/c、和单臂Fab/c“隆起嵌入穴”抗c-Met抗体检出的重链的数量是相似的。单臂Fab/c“隆起嵌入穴”抗c-Met构建物似乎也是加工后的轻链数量增加和轻链前体数量减少。
类似的，图4中的抗Fc Western印迹结果显示了单臂Fab/c“隆起嵌入穴”比野生型单臂Fab/c抗c-Met抗体的折叠和装配有显著改善。再次，抗Fc Western印迹结果显示了全长抗c-Met抗体降至不能检出的水平。抗Fc抗体不能结合轻链，因此没有检出。对于还原样品，对全长、野生型单臂Fab/c、和单臂Fab/c“隆起嵌入穴”抗c-Met抗体检出的重链数量是相似的。
实施例2：本发明抗体的药物动力学特征和治疗功效
材料和方法
材料
HGF和c-Met-IgG在Genentech生产，正如先前所述。Maxisorb微量滴定板购自NUNC(Rosklide，丹麦)。抗hFc购自Jackson Immunochemical(WestGrove，PA)。HRP-链霉亲和素购自Zymed(South San Francisco，CA)。3H-胸苷购自Amersham Inc.(Arlington Heights，IL)。MDA-MB-435细胞由ATCC(Rockville，MD)获得。焦谷氨酸氨肽酶购自Takara Biochemicals(Berkeley，CA)。NHS-X-生物素购自Research Organics(Cleveland，OH)。Immobilon-PSQPVDF购自Millipore(Marlborough，MA)。Superscript II RNA酶H-逆转录酶购自Gibco-BRL(Gaithersburg，MD)。Taq聚合物购自Perkin Elmer-Cetus(Foster City，CA)，Bakerbond ABX(40μ粒度)来自J.T.Baker(Phillipsburg，NJ)，而SP-Sepharose高效树脂来自Pharmacia Biotech Inc.(Piscataway，NJ)。生物素-抗P-tyr来自Upstate Biotech(Lake Placid，NY)，TMB过氧化物酶底物购自KPL(Gaithersburg，MD)。
抗体和Fab片段的生成
抗c-Met单克隆抗体的生成
抗c-met单克隆抗体，包括5D5抗体的生成，已有描述。参阅如美国专利5,686,292；5,646,036；6,207,152；6,214,344；和6,468,529。第0、7、14、21、28、266、273、和279天将BALB/c小鼠每只后足垫免疫2.5μg悬浮在MPL/TDM佐剂中的可溶性c-Met-IgG(Mark等人，1982，J.Biol.Chem.，267：26166-26171)。最后一次免疫后4天，收获淋巴结细胞，并如(Laskov等人，1980，Cell.Immunol.，55：251)所述使用35％聚乙二醇与P3/X63-Ag8U1骨髓瘤细胞融合(Yelton等人，1978，Curr.Top.Microbio.Immunol.，81：1)。首先通过捕捉ELISA选择分泌对c-Met特异的抗体的杂交瘤细胞系，然后使用表达c-Met的BAF3转染细胞通过流式细胞术进行后续筛选。如下文所述，对选择的杂交瘤进一步测试它们抑制生物素-HGF结合c-Met-IgG的能力。通过有限稀释将杂交瘤克隆两次，然后进一步鉴定它们的拮抗和激动能力。在balb/c小鼠中生成腹水，并使用蛋白G亲和柱纯化单克隆抗体。采用消光系数1.4，通过280nm吸光度测定蛋白质浓度。
天然Fab的生成和纯化
将抗体5D5在20mM磷酸盐，10mM EDTA缓冲液中透析过夜，然后在Centricon 30中浓缩至7mg/ml。将0.5ml固定化木瓜蛋白酶(Pierce，Rockford，Il)用消化缓冲液清洗，然后加入10mg 5D5并于37℃温育过夜，以200rpm摇动。向混合液中加入1.5ml结合缓冲液，然后将上清液与珠子分开并流过事先用结合缓冲液平衡的蛋白A柱。使额外的结合缓冲液流过柱子，并以1ml馏分收集洗脱液。读取每个馏分的280nm吸光度，合并含有Fab片段的洗脱液。将蛋白质在PBS中透析过夜，并通过280nm吸光度测定蛋白质浓度，采用消光系数1.53。通过凝胶过滤进一步纯化Fab片段以清除残余的F(ab’)2。
5D5 Fab的N端测序
将一小份5D5 Fab在4-20％梯度SDS凝胶上解析，并在BioRadTrans-Blot转移槽(Matsudaira，1987，J.Biol.Chem.，262：10035-10038)中以250mA恒流1小时电转印到PVDF(Immobilon-PSQ)膜上。将膜用溶于50％甲醇的0.1％考马斯蓝R-250染色0.5分钟，并用溶于50％甲醇的10％乙酸脱色2-3分钟。将膜用水彻底清洗，并使之干燥，然后使用Blott柱体(Applied Biosystem)在473A型自动化蛋白质测序仪上测序。用JusticeInnovation软件使用Nelson Analytical 760界面整合峰。在DECα(Henzel等人，1996，J.Chromatog.，404：41-52)上进行序列解读。
获得5D5重链的序列需要如下进行去封闭。将Fab片段用7mM DTT于45℃还原1小时，并用180mM异丙基乙酰胺于25℃烷化20分钟(Krutzsch和Inman，1993，Anal.Biochem.，209：109-116)。然后将烷化Fab片段在Microcon-10中与含10mM DTT的0.1M磷酸钠(消化缓冲液)交换3次，并在20μl消化缓冲液中用1mU焦谷氨酸氨肽酶于45℃消化3小时。然后如上所述将去封闭Fab转移至PVDF并测序。
5D5 Fab的克隆和重组表达
根据N端序列资料设计对轻链和重链可变区5’端特异的PCR引物，而3’引物设计成与每条链的共有框架4退火(Kabat等人，1991，《Sequences ofproteins of immunological interest》，Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD)。引物的设计中还添加用于克隆的限制性位点。将用Stratagene RNA分离试剂盒由108个杂交瘤5D5细胞提取的总RNA用作RT-PCR的底物。在标准条件下使用框架4特异引物和Superscript II RNA酶H-逆转录酶进行逆转录(Kawasaki，Amplification of RNA，在《PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications》中，第21-27页，M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky、和T.J.White编，Academic Press Inc.，San Diego，1990)。如(Kawasaki，Amplification of RNA，在《PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications》中，第21-27页，M.A.Innis、D.H.Gelfand、J.J.Sninsky、和T.J.White编，Academic Press Inc.，San Diego，1990)所述，PCR扩增采用Taq聚合酶，只是反应混合液中含有2％ DMSO。用限制酶SfiI和RsrII(轻链)或Mlu I和Apa I(重链)消化扩增得到的DNA片段，凝胶纯化，并克隆到表达质粒pAK19(Carter等人，1992，Bio/Technol.，10：163-167)的衍生物中。此载体pXCA730经过定点诱变的修饰(Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82：488)后在ST II信号序列与可变结构域之间和在每条链的可变与恒定结构域接合处含有独特限制性位点。将轻链和重链可变结构域cDNA插入人Cκ和CH1结构域的上游且同一读码框中。消除pAK19中重链C末端半胱氨酸，它能够形成二硫键而生成F(ab’)2分子，从而能够只表达抗体的Fab形式。
如(Carter等人，1992，Bio/Technol.，10：163-167)所述，在大肠杆菌K12菌株33B6(W3110 tonA phoA E15 deoC KanR ilvGR degPD)argF-lac)169)(Rodriques等人，1995，Cancer Res.，55：63-70)中表达重组5D5 Fab。通过连续补料离心由10升发酵液收获细胞沉淀，冷冻并保存于-70℃。将一部分沉淀悬浮于提取缓冲液(120mM MES pH 6，5mM EDTA)中(5ml/g细胞沉淀)。于4℃使用ultraturrax(Janke and Kunkel)约15分钟，将悬浮液彻底混匀。然后两次通过安装了冷却旋管的细胞匀浆器(Microfluidizer，Microfluidics Corporation，Newton，MA)，破坏完整细胞。然后用调至pH 6的5％(v/v)储存液将悬浮液调至0.1％(v/v)聚乙烯亚胺。通过25,400xg离心30分钟，将完整细胞和PEI絮凝碎片与可溶馏分分开。通过添加纯化的水将上清液的电导率调至低于4mS，并加载到Bakerbond ABX柱(1×10cm，40μ粒度)上。柱子已经用50mM MES，5mM EDTA pH 6平衡。所有步骤都以线性流速100cm/h进行。加载条件上清液后，用平衡缓冲液清洗柱子，直至流出液的吸光度等于基线。使用16个柱体积、由0至100mM线性梯度的溶于平衡缓冲液的硫酸铵进行洗脱。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析馏分，并合并含有Fab的馏分。将来自ABX柱的合并液的电导率降至低于4mS，并加载到经过25mM MOPS缓冲液pH 6.9平衡的SP-Sepharose高效树脂柱(1×10cm)上。所有步骤都以线性流速100cm/h进行。加样后，用一个柱体积的平衡缓冲液清洗柱子。然后使用16个柱体积、0至200mM线性梯度的溶于平衡缓冲液的乙酸钠由柱上洗脱5D5 Fab。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析馏分，并合并含有Fab的馏分。
单臂5D5小规模蛋白质生产
将表达质粒pxcM11C.H-Fc.K(如上所述)用于转化大肠杆菌菌株33D3(W3110 kanR ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lacIq lacL8 ompTΔ(nmpc-fepE)degP)，然后将转化子于30℃在添加羧苄青霉素(50μg/ml)的LB培养基中培养过夜。将LB培养液在含有羧苄青霉素(50μg/ml)的C.R.A.P.培养基中稀释100倍，并于30℃摇动培养24小时。取出等量小份样品通过SDS-PAGE和Western分析使用抗Fab抗体(过氧化物酶缀合的针对人IgG Fab的山羊IgG馏分；CAPPEL #55223)或抗Fc抗体(过氧化物酶缀合的针对人Fc片段的山羊IgG馏分；Bethyl #A08-104P-41)检验抗体表达。然后将剩余培养物离心，并将细胞团冷冻于-70℃，直至开始抗体纯化步骤。
单臂5D5的纯化
将冷冻细胞团融化，并悬浮于10倍体积(w/v)的裂解缓冲液(25mMtris-HCl，5mM EDTA pH7.5)中，然后离心。使用Polytron匀浆器(KinematicaA.G，瑞士)将不溶沉淀重悬于裂解缓冲液中，并通过两次流过Microfluidizer(Microfluidics，Newton，Mass)来破坏细胞。向裂解物中添加聚乙烯亚胺(Sigma)0.1％(v/v)，随后于4℃搅动1小时，然后以15,000xg离心。将由此得到的上清液与蛋白A亲和树脂混合并于4℃搅动过夜。让树脂沉降，倒出上清液，并将树脂倒入连接液相层析系统(Varian Inc，Palo Alto，CA)的柱子。先用10mM tris-HCl，1mM EDTA缓冲液pH 7.5后用溶于相同缓冲液的0.5M NaCl清洗柱子，然后用50mM柠檬酸钠，0.1M NaCl缓冲液的pH6至pH2梯度洗脱。将洗脱馏分立即调至终浓度2M尿素和pH 5.4，并通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。合并含有单臂抗cMet的馏分，并在用25mM MES，2M尿素pH 5.4平衡的SP Sepharose柱(AmershamBiosciences，Piscataway，NJ)上进行阳离子交换层析。用溶于25mM MES pH5.4的0至1M NaCl梯度洗脱柱子。SDS-PAGE分析后，将合并的洗脱液调至0.4M硫酸钠pH6，并加载到用0.4M硫酸钠，25mM MES pH6平衡的Hi-Propyl(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)柱上。用溶于25mM MES pH6的0.4M至0M硫酸钠梯度洗脱柱子。SDS-PAGE分析后，使用CentriPrep 10(Millipore Corp，Bedford，MA)浓缩由此得到的洗脱液，然后再用10mM琥珀酸钠，0.15M NaCl pH 5.0平衡的Superdex 200柱(Amersham Biosciences)上进行大小排阻层析。
通过定量氨基酸分析测定蛋白质浓度。通过LAL测定法测定内毒素水平。这些抗体制备物可用于后续分析。
测定法
细胞培养
在补充了10％ FBS的MEM中培养A549肺癌细胞。在补充了10％ FCS、5％ WEHI-231的细胞培养条件培养基(含有IL-3)、2mM谷氨酸盐、4μl/Lβ-巯基乙醇、0.5mg/ml G418的RPMI 1640中培养如先前所述(Schwall等人，1996，J.Cell Biol.，133：709-718)经人cMet转染的BaF3-cMet细胞和经载体转染的BaF3-neo细胞。在含有10％ FCS的RPMI 1640中培养U87和U118成胶质细胞瘤细胞、786-0肾癌细胞。
HGF-cMet结合
在固相系统中使用生物素-HGF进行HGF结合研究，其中经由IgG结构域将c-Met-IgG捕捉到微量滴定板上。通过与20倍摩尔过量的NHS-X-生物素在0.1M NaHCO3 pH 8.5中一起保温将HGF生物素化。将NHS-X-生物素分成4个增量，间隔15分钟添加，并于室温搅动。通过透析清除未缀合的生物素，并将经标记物质保存于4℃。将微量滴定板用2μg/ml AffiniPure兔抗人IgG Fc(Jackson ImmunoResearch)在包被缓冲液(0.05M碳酸盐/碳酸氢盐pH 9.6)中于4℃包被过夜。将板用含有0.5％ BSA的PBS pH 7.4于室温(RT)封闭1小时，然后与2μg/ml cMet-IgG一起保温2小时。然后加入53ng/ml生物素标记的HGF，加入或不加0.01-1,000nM竞争物即冷的HGF、抗c-Met 5D5 mAb、Fab或单臂抗体，于室温放置1小时。向板中加入辣根过氧化物酶(HRP)-链霉亲和素(1∶10,000稀释，Amersham)，于室温放置1小时，然后是磷酸酶底物CP-磷酸硝基苯酯(Kirkegaard & PerryLaboratories)，并测量405nm吸光度。
结果显示于图5。在竞争性结合测定法中，单臂抗c-met 5D5抗体的表现与抗c-met Fab相似。
KIRA对c-Met的酪氨酸磷酸化
根据Sadick等人的方法，其中将溶解的受体捕捉到用抗受体抗体包被的板上并用抗P-Tyr检测(Sadick等人，1996，Anal.Biochem.，235：207-214)，通过三明治ELISA测量c-Met的酪氨酸磷酸化。将U87细胞以106/ml分配到96孔板中并于37℃培养过夜。然后将培养基换成含有HGF和/或抗体的MEM、0.1％ FBS，放置10分钟。然后将细胞用100μl细胞裂解缓冲液(20mMTris pH 7.5，150mM NaCl，1mM Na2EDTA，1nM EGTA，1％ Triton，1x蛋白酶抑制剂鸡尾酒样混合物(Sigma)，1x磷酸酶抑制剂鸡尾酒样混合物II(Sigma))在摇板机上于室温抽提30分钟，并保存在冰上或-70℃。将裂解物加到经抗c-Met mAb 1949(Genentech)包被过夜的板上。用1∶4000稀释的生物素化抗磷酸酪氨酸(4G10，Upstate)及后续HRP-链霉亲和素和TMB显色来检测磷酸-酪氨酸c-Met。使用1∶10,000抗c-Met抗体类似地测量总c-Met。
结果显示于图6。
细胞增殖、迁移测定法
BaF3是正常情况下不表达c-Met且不应答HGF的鼠IL-3依赖性淋巴样细胞。然而，在通过用人c-Met的正常全长cDNA转染衍生的BaF3-hMet(Schwall等人，1996，J.Cell Biol.，133：709-718)中，HGF在缺乏IL-3时刺激增殖和存活。将BaF3-hMet和BaF3-neo细胞在RPMI 1640，5％胎牛血清，4μl/L β-ME，100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸链霉素，2mM L-谷氨酸盐，和作为IL-3来源的5％ WEHI条件培养基中常规传代。为了测量HGF依赖性增殖，通过添加25μl Alarma蓝(Trek Diagnostic Systems)并测量4小时后的荧光强度来量化处理3天后的细胞数目。作为特异性的对照，单臂5D5也在用IL-3刺激的BaF3-hMet细胞中进行测试。
结果显示于图7。
使用经过改良的Boyden室测定法评估MDAMB-435-PGL细胞和U87细胞的迁移。将细胞分配到安有用10μg/ml纤连蛋白包被的5μm孔聚碳酸酯滤器的上层室(2×104/孔)中。向下层室的培养基中加入100ng/ml HGF，加入或不加指定数量的5D5 Fab或单臂抗体。将细胞培养过夜。使用专用海绵刷刮下滤膜顶面的细胞，并用YO-PRO-3碘化物(Molecular Probes)固定和染色迁移到滤器底表面的细胞，然后通过荧光显微镜计数。
结果显示于图8。
药物动力学
将OA-5D5或5D5 Fab(5mg/kg)静脉内注射到裸鼠中。在指定时间点，由4只小鼠采集血清样品并通过三明治ELISA进行测定，其中将它捕捉到用cMet-IgG包被的板上，然后用轻链特异性二抗检测。
结果显示于图9A。单臂5D5抗体的半衰期与其Fab对应物相比显著延长。
为了测定OA-5D5在体内是否降解，将根据ELISA相当于40ng OA-5D5的来自第7天样品的一定体积血清在还原或非还原条件下进行SDS-PAGE凝胶电泳。将凝胶转移到硝酸纤维素上并通过HRP缀合的抗人Fc(1∶5,000，对人特异的，Jackson Labs)显示印迹。平行运行等体积的来自未处理小鼠的血清作为对照。
结果显示于图9B。血清单臂5D5抗体在施用后第7天是完整的。
体内肿瘤功效研究
使用皮下接种2.5×106个A549(人肺癌)或U87MG细胞(分泌自分泌HGF且表达c-Met的人成胶质细胞瘤)的4-6周龄雌性无胸腺裸鼠进行功效研究。在接种肿瘤细胞时(即辅助治疗)或容许肿瘤生长至～150mm3时开始使用单臂5D5抗体、5D5 Fab抗体或对照抗体(抗gp120)的治疗。所有抗体腹膜内施用，每周一次，持续4周。注意，只对单臂5D5抗体测试辅助治疗方案(抗gp120作为对照)。
图10显示了通过接种U87 MG细胞生成的肿瘤的结果。如图10A(辅助治疗)和图10B(肿瘤建立后治疗)所示，单臂5D5抗体能够抑制或引起肿瘤衰退。如图10B所示，与其Fab对应物相比，单臂5D5抗体具有上佳的治疗功效。(有趣的是，单臂5D5抗体在100nM时在体外展示对U87细胞数目的最低功效。)
对于由接种A549细胞生成的肿瘤的治疗结果是阴性的，这提供了特异性对照，证实单臂5D5抗-c-met抗体针对U87肿瘤的效果不是由于非特异细胞毒性作用。
使用其它本领域已建立的体内肿瘤模型，例如美国专利6,271,342中描述的Oncotest模型，还对单臂5D5抗c-met抗体测试了调控肿瘤发展的能力。与MRC-5成纤维细胞(ATCC CCL-171)共接种的BxPC-3(胰腺)(ATCCCRL-1687)细胞的肿瘤生长在每周两次以30mg/kg施用单臂5D5抗体后显示抑制50％。其它例示性数据列于下文：
●在Oncotest RXF1220(肾)，以10mg/kg q7d(即每7天一次)施用单臂5D5抗体中，抑制肿瘤生长～30％；
●在(i)Oncotest PAXF736(胰腺)、10mg/kg、q7d；(ii)Oncotest GXF97(胃)、10mg/kg、q7d；(iii)Oncotest LXFA526(肺)、30mg/kg、q7d；(iv)Oncotest LSFA297(肺)、30mg/kg、q7d中，抑制肿瘤生长＜20％；
●在A549异种移植物中，用10mg/kg、q7d单臂5D5抗体没有观察到活性；
●在Oncotest LXFA650(肺)中，30mg/kg、q7d没有观察到活性。

Claims (97)

1.包含单个抗原结合臂和Fc区的抗体片段，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比，所述Fc区提高所述抗体片段的稳定性，其中Fc区包含第一和第二Fc多肽的复合体，其中所述的Fc多肽之一而不是二者是N端截短的重链。
2.权利要求1的抗体片段，其中所述抗体片段未糖基化。
3.权利要求1或2的抗体片段，其中所述抗体片段没有或具有少许免疫抑制特性。
4.权利要求3的抗体片段，其中所述免疫抑制特性包括招致T细胞耗损的能力。
5.权利要求1-4任一项的抗体片段，它不具有FcRn结合以外的实质性效应物功能。
6.权利要求5的抗体片段，其中所述效应物功能指补体裂解。
7.权利要求1-6任一项的抗体片段，其中所述抗体片段结合FcRn。
8.权利要求1-7任一项的抗体片段，它不特异结合T细胞表面抗原。
9.权利要求8的抗体片段，其中所述T细胞表面抗原指CD3或CD4。
10.权利要求9的抗体片段，其中所述T细胞表面抗原指CD3。
11.权利要求1-10任一项的抗体片段，它特异结合肿瘤抗原。
12.权利要求1-11任一项的抗体片段，它特异结合在受体二聚化后活化的细胞表面受体。
13.权利要求1-12任一项的抗体片段，其中所述抗体片段包含第一多肽、第二多肽和第三多肽，所述第一多肽包含轻链可变结构域，第二多肽包含重链可变结构域和所述第一Fc多肽，而第三多肽包含所述第二Fc多肽。
14.权利要求13的抗体片段，其中所述第一多肽包含与人轻链恒定结构域融合的非人轻链可变结构域。
15.权利要求13的抗体片段，其中所述第一多肽包含与人源化或人框架序列融合的来自非人物种的CDR。
16.权利要求13的抗体片段，其中所述第二多肽包含与人重链恒定结构域融合的非人重链可变结构域。
17.权利要求13的抗体片段，其中所述第二多肽包含与人源化或人框架序列融合的来自非人物种的CDR。
18.权利要求13的抗体片段，其中所述第三多肽包含N端截短的重链，该重链在N端包含至少部分铰链序列。
19.权利要求1-18任一项的抗体片段，其中所述两种Fc多肽共价连接。
20.权利要求1-19任一项的抗体片段，其中所述两种Fc多肽在铰链区经由分子间二硫键连接。
21.权利要求1-20任一项的抗体片段，其中所述抗体片段在与靶分子结合后抑制靶分子多聚化。
22.权利要求1-21任一项的抗体片段，其中所述抗体片段在与靶分子结合后抑制相关结合配偶体结合靶分子。
23.权利要求1-22任一项的抗体片段，其中所述第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面相遇，且第二Fc多肽的界面包含突起，该突起可位于第一Fc多肽的界面的腔中。
24.权利要求1-23任一项的抗体片段，其中所述第二Fc多肽已经由模板/原始多肽改变以编码所述突起或所述第一Fc多肽已经由模板/原始多肽改变以编码所述腔，或者二者兼之。
25.权利要求1-24任一项的抗体片段，其中所述第二Fc多肽已经由模板/原始多肽改变以编码所述突起且所述第一Fc多肽已经由模板/原始多肽改变以编码所述腔，或者二者兼之。
26.权利要求1-25任一项的抗体片段，其中所述第一Fc多肽和第二Fc多肽在界面相遇，其中第二Fc多肽的界面包含突起，该突起可位于第一Fc多肽的界面的腔中，且其中所述腔或突起或者二者已经分别导入第一和第二Fc多肽的界面。
27.权利要求24-26任一项的抗体片段，其中所述突起和腔已经导入各自Fc多肽的界面。
28.权利要求24-27任一项的抗体片段，其中所述突起和腔各自包含天然存在的氨基酸残基。
29.权利要求24-28任一项的抗体片段，其中包含突起的Fc多肽是通过用具有比原始残基更大侧链体积的输入残基替代来自模板/原始多肽界面的原始残基而生成的。
30.权利要求24-29任一项的抗体片段，其中包含突起的Fc多肽是通过包括如下步骤的方法生成的，其中用编码具有比原始残基更大侧链体积的输入残基的核酸替代编码来自所述多肽界面的原始残基的核酸。
31.权利要求29或30的抗体片段，其中所述原始残基是苏氨酸。
32.权利要求29-31任一项的抗体片段，其中所述输入残基是精氨酸(R)。
33.权利要求29-31任一项的抗体片段，其中所述输入残基是苯丙氨酸(F)。
34.权利要求29-31任一项的抗体片段，其中所述输入残基是酪氨酸(Y)。
35.权利要求29-31任一项的抗体片段，其中所述输入残基是色氨酸(W)。
36.权利要求23-28任一项的抗体片段，其中包含腔的Fc多肽是通过用具有比原始残基更小侧链体积的输入残基替代模板/原始多肽界面中的原始残基而生成的。
37.权利要求23-28和36任一项的抗体片段，其中包含腔的Fc多肽是通过包括如下步骤的方法生成的，其中用编码具有比原始残基更小侧链体积的输入残基的核酸替代编码来自所述多肽界面的原始残基的核酸。
38.权利要求36或37的抗体片段，其中所述原始残基是苏氨酸。
39.权利要求36或37的抗体片段，其中所述原始残基是亮氨酸。
40.权利要求36或37的抗体片段，其中所述原始残基是酪氨酸。
41.权利要求36-40任一项的抗体片段，其中所述输入残基不是半胱氨酸(C)。
42.权利要求36-40任一项的抗体片段，其中所述输入残基是丙氨酸(A)。
43.权利要求36-40任一项的抗体片段，其中所述输入残基是丝氨酸(S)。
44.权利要求36-40任一项的抗体片段，其中所述输入残基是苏氨酸(T)。
45.权利要求36-40任一项的抗体片段，其中所述输入残基是缬氨酸(V)。
46.权利要求36-45任一项的抗体片段，其中包含腔的Fc多肽包含两个或多个选自下组的原始氨基酸的替代：苏氨酸、亮氨酸和酪氨酸。
47.权利要求36-46任一项的抗体片段，其中包含腔的Fc多肽包含两个或多个选自下组的输入残基：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。
48.权利要求36-47任一项的抗体片段，其中包含腔的Fc多肽包含两个或多个选自下组的原始氨基酸的替代：苏氨酸、亮氨酸和酪氨酸，且其中所述原始氨基酸用选自下组的输入残基替代：丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸。
49.权利要求23-48任一项的抗体片段，其中包含腔的Fc多肽在第366位包含用丝氨酸替代苏氨酸，氨基酸编号依照Katat的EU编号方案。
50.权利要求23-48任一项的抗体片段，其中包含腔的Fc多肽在第368位亮氨酸处包含丙氨酸替代，氨基酸编号依照Katat的EU编号方案。
51.权利要求23-50任一项的抗体片段，其中包含腔的Fc多肽包含缬氨酸替代酪氨酸。
52.权利要求23-51任一项的抗体片段，其中包含腔的Fc多肽包含两个或多个选自下组的氨基酸替代：T366S、L368A和Y407V。
53.权利要求23-52任一项的抗体片段，其中包含突起的Fc多肽在第366位苏氨酸处包含色氨酸替代，氨基酸编号依照Katat的EU编号方案。
54.权利要求1-53任一项的抗体片段，其中所述第一和第二Fc多肽各自包含抗体恒定结构域。
55.权利要求54的抗体片段，其中所述抗体恒定结构域指CH2和/或CH3结构域。
56.权利要求54或55的抗体片段，其中所述抗体恒定结构域来自IgG。
57.权利要求56的抗体片段，其中所述IgG指人IgG1。
58.权利要求1-57任一项的抗体片段，它具有单特异性。
59.权利要求1-58任一项的抗体片段，它是单特异性免疫粘附素。
60.权利要求1-59任一项的抗体片段，它是抗体-免疫粘附素嵌合体。
61.包含免疫球蛋白群的组合物，其中至少75％的免疫球蛋白是权利要求1-60任一项的抗体片段。
62.制备权利要求1-60任一项的抗体片段的方法，包括如下步骤：
(a)培养包含编码抗体片段的核酸的宿主细胞；并
(b)由宿主细胞培养物回收抗体片段。
63.权利要求62的方法，其中包含抗体片段的多肽以这样的比率表达，该比例导致由此产生的免疫球蛋白群中至少50％的免疫球蛋白是权利要求1-60任一项的抗体片段。
64.权利要求63的方法，其中所述多肽以近似等摩尔量表达。
65.权利要求64的方法，其中编码多肽的核酸与近似相等长度的翻译起始区(TIR)可操作连接。
66.权利要求62-65任一项的方法，其中所述宿主细胞是原核的。
67.权利要求66的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
68.权利要求67的方法，其中所述大肠杆菌是内源蛋白酶活性缺陷的菌株。
69.权利要求62-65任一项的方法，其中所述宿主细胞是真核的。
70.权利要求69的方法，其中所述宿主细胞是CHO。
71.权利要求62-70任一项的方法，其中由培养物的培养液回收抗体片段。
72.权利要求62-70任一项的方法，其中由细胞裂解物回收抗体片段。
73.制备权利要求23-60任一项的抗体片段的方法，包括如下步骤：
(a)培养包含编码抗体片段的核酸的宿主细胞，其中编码第二Fc多肽的界面的核酸已经由编码第二Fc多肽的原始界面的核酸改变以编码突起或编码第一Fc多肽的界面的核酸已经由编码第一Fc多肽的原始界面的核酸改变以编码腔，或者二者兼之；并
(b)由宿主细胞培养物回收抗体片段。
74.权利要求73的方法，其中编码第二Fc多肽的核酸已经由原始核酸改变以编码突起且编码第一Fc多肽的核酸已经由原始核酸改变以编码腔。
75.权利要求73的方法，其中步骤(a)之前还有步骤，其中编码来自第二Fc多肽界面的原始氨基酸残基的核酸用编码具有比原始氨基酸残基更大侧链体积的输入氨基酸残基的核酸替代，其中具有更大侧链体积的输入残基包含突起。
76.权利要求73的方法，其中步骤(a)之前还有步骤，其中编码第一Fc多肽界面中的原始氨基酸残基的核酸用编码具有比原始氨基酸残基更小侧链体积的输入氨基酸残基的核酸替代以形成腔。
77.权利要求73的方法，其中步骤(a)之前还有步骤，其中将编码第一和第二Fc多肽的核酸导入宿主细胞。
78.制备权利要求1-60任一项的抗体片段的方法，包括如下步骤：
(a)制备形成抗体片段的多肽；并
(b)容许发生异多聚化，由此形成抗体片段。
79.权利要求62-78任一项的方法，其中至少50％所形成的免疫球蛋白多肽复合体是权利要求1-60任一项的抗体片段。
80.权利要求62-78任一项的方法，其中至少50％所形成的免疫球蛋白多肽复合体是异三聚体。
81.权利要求62-78任一项的方法，其中步骤(b)包括将第一Fc多肽和第二Fc多肽在体外偶联。
82.权利要求62-78任一项的方法，其中原始界面的氨基酸序列已经改变，从而在改造后界面中生成突起和腔。
83.编码权利要求1-60任一项的抗体片段的分离核酸。
84.包含两种或多种集体编码权利要求1-60任一项的抗体片段的重组核酸的组合物。
85.包含权利要求83或84的核酸的宿主细胞。
86.权利要求85的宿主细胞，其中编码抗原结合臂的核酸存在单个载体中。
87.权利要求85的宿主细胞，其中编码抗原结合臂的核酸存在于不同载体中。
88.权利要求85的宿主细胞，其中编码抗原结合臂和N端截短的重链的核酸存在于单个载体中。
89.制备权利要求1-60任一项的抗体片段的方法，包括培养包含权利要求83或84的核酸的宿主细胞使得多肽表达，并由细胞培养物回收抗体片段。
90.权利要求89的方法，其中由细胞裂解物回收抗体片段。
91.权利要求89的方法，其中由细胞培养物的培养液回收抗体片段。
92.权利要求89的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。
93.权利要求89的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
94.权利要求89的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物的。
95.包含权利要求1-60任一项的抗体片段和载体的组合物。
96.生成包含单个抗原结合臂和Fc区的抗体片段的方法，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比，所述Fc区提高所述抗体片段的稳定性，所述方法包括在容许抗原结合臂形成和第一和第二Fc多肽二聚化而形成所述Fc区的条件下在合适宿主细胞中表达编码抗原结合臂和第一和第二Fc多肽的核酸，其中所述的Fc多肽之一而不是二者是N端截短的重链。
97.权利要求96的方法，其中所述方法生成异质免疫球蛋白群，且其中至少50％的免疫球蛋白包含单个抗原结合臂和Fc区，与包含所述抗原结合臂的Fab分子相比，所述Fc区提高所述抗体片段的稳定性。
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