CN104520327B - 单臂单价抗体构建体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供单价抗体构建体。在具体实施方案中是一种包含以下的单价抗体构建体：单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体；和包含CH3结构域的二聚Fc多肽构建体，所述构建体包含两个单体Fc多肽，其中一个所述单体Fc多肽与至少一个来自所述抗原结合多肽构建体的多肽融合。这些治疗新型分子涵盖与具有两个抗原结合区的相应单特异性二价抗体构建体相比展示与展示所述抗原的靶细胞的结合密度和Bmax(在靶标与抗体比为1:1时的最大结合)增加的单价构建体。本文提供制造在等摩尔浓度下与相应二价抗体构建体相比显示优越效应功效的单价抗体构建体的方法。本文提供制造出乎意料地抑制肿瘤细胞生长并可以被内化，而且在等摩尔饱和浓度下与二价抗体构建体相比显示较大功效的单价抗体构建体的方法。提供用于治疗HER2表达疾病的单价抗体构建体。

Description

单臂单价抗体构建体及其用途
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§1 19(e)要求2012年5月10日提交的美国临时专利申请号61/645547、2012年11月2日提交的美国临时专利申请号61/722070、 2012年7月13日提交的美国临时专利申请号61/671640和2013年2月8日提交的美国临时专利申请号61/762812的权益，所述临时专利申请各自以引用的方式整体并入本文中。
发明领域
本发明的领域是用于定制开发生物治疗药物的支架的合理设计。
相关领域描述
在治疗性蛋白质的领域中，具有多价靶标结合特征的抗体是用于设计药物候选物的优良支架。目前市场上的抗体治疗药物是经过优化和选择由两个抗体FAB赋予的高亲和力结合和亲合力的二价单特异性抗体。已采用通过诱变进行去岩藻糖基化或增强FcgR结合来通过抗体Fc依赖性细胞介导的细胞毒性机制使抗体更有效。无岩藻糖基化的抗体或FcgR结合增强的抗体在临床检验中仍遭受不完全的治疗功效，而且任何这些抗体仍有待实现市场上的药物状态。
治疗性抗体将理想地具备某些最低限度的特征，包括在施用于目标患者后的靶标特异性、生物稳定性、生物利用度和生物分布，以及足够的靶标结合亲和力和高的靶标占有率以及对靶细胞的抗体装饰从而使抗体依赖性治疗作用最大化。对于产生具备所有这些最低限度特征的抗体治疗药物，尤其是在1:1的抗体与靶标的比率下可完全占有靶标的抗体所做的努力仅获得了有限的成功。举例而言，即使在饱和浓度下，全长二价单特异性IgG抗体在1:1 比率下仍无法完全占有靶标。就理论角度而言，在饱和浓度下，预期传统的单特异性二价抗体在1个抗体:2个靶标的比率下最大限度地结合靶标，这是因为与单价抗体片段相比存在两个一致的可以赋予亲合力作用的抗原结合 FAB。另外，所述全长抗体由于分子尺寸更大而具有更有限的生物利用度和/ 或生物分布。此外，全长抗体在一些情况下可抑制在与靶抗原结合时的激动性作用，这在拮抗性作用是需要的治疗功能的情况下是不利的。在一些情况下，这种现象是因为二价抗体在与细胞表面受体结合时促使导致受体活化的受体二聚化作用的”交联”作用。另外，传统的二价抗体具有有限的治疗功效，这是因为在允许抗体依赖性细胞毒性作用或其它治疗活性机制的最大治疗安全剂量下，在1:2的抗体与靶抗原比率下有限的抗体结合和靶细胞的装饰。
发明概要
本文提供一种分离的单价抗体构建体，其包含：单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体；和二聚Fc多肽构建体，所述Fc多肽构建体包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽，其中一个所述单体Fc多肽与至少一个来自抗原结合多肽构建体的多肽融合；其中所述单价抗体构建体以以下参数选择性地和/或特异性地结合展示所述抗原的靶细胞：与具有两个抗原结合区的相应单特异性二价抗体构建体相比增加的结合密度和Bmax；与所述单特异性二价抗体构建体相当的解离常数(Kd)；与所述单特异性二价抗体构建体相当或较慢的解离速率；且其中所述单价抗体构建体展示与所述单特异性二价抗体构建体相当的生物物理学和体内稳定性；和与所述单特异性二价抗体构建体相当或较大的细胞毒性。
在某些实施方案中提供本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述单价抗体构建体阻断同源配体与靶抗原的结合。在某些实施方案中是本文提供的分离的单价抗体构建体，其中所述单价抗体构建体不阻断同源配体与靶抗原的结合。在一个实施方案中是分离的单价抗体构建体，其中在抗体与靶标比率为1:1时，在大于观察到的抗体的平衡常数(Kd)直到饱和浓度的浓度下观察到结合密度和Bmax相对于单特异性二价抗体的增加。在一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中在大于观察到的抗体的平衡常数(Kd)直到饱和浓度的浓度下，所述单价抗体构建体与所述相应二价抗体构建体相比展示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC功效中的至少一种。
在一些实施方案中提供本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述构建体是包含参与效应物活性的Fc结构域的单价裂解性抗体构建体，其中所述裂解性抗体构建体是非激动性的、阻断同源配体与靶抗原结合、抑制细胞生长；且其中所述裂解性抗体构建体以与具有两个抗原结合区的相应单特异性二价抗体构建体相比增加的Bmax、快速的结合速率和相当的解离速率结合所述靶细胞并使其饱和。
在一个实施方案中是分离的单价抗体构建体，其中所述构建体未经内化。在一些实施方案中是分离的单价抗体构建体，其中所述构建体经内化。
本文提供一种本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述构建体是经有效内化的单价内化抗体构建体；其中所述内化抗体是非激动性的、阻断同源配体与靶抗原结合且不引发细胞生长；且其中所述内化抗体构建体以与具有两个抗原结合区的相应单特异性二价抗体构建体相比增加的Bmax、快速的结合速率和较慢的解离速率结合所述靶细胞。
在一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述构建体的内化大于、等于或小于相应单特异性二价抗体的内化。在一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述结合密度和Bmax的增加与靶细胞上的抗原的密度无关。在一个实施方案中提供本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述结合密度和Bmax的增加与靶抗原表位无关。
在一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述构建体不展现亲合力。
在一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述二聚 Fc多肽构建体是异源二聚体的。在一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述单价抗原结合多肽构建体是能结合抗原的Fab片段、 scFv、sdAb、抗原结合肽或蛋白质结构域。在一个实施方案中是分离的单价抗体构建体，其中所述Fab片段包含重链多肽和轻链多肽。
在一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中靶细胞是表达同源抗原的细胞，所述细胞选自包括以下的清单：癌细胞和表达HER2 的病变细胞。在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述抗原结合多肽构建体结合HER2且其中靶细胞是以下中的至少一种：低、中或高HER2表达细胞、孕酮受体阴性细胞或雌激素受体阴性细胞。在一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述抗原结合多肽构建体结合HER2胞外结构域，其中所述胞外结构域是ECR 1、2、3和4中的至少一种。
本文提供一种结合HER2的分离的单价抗体构建体，其包含：单价地结合HER2的抗原结合多肽构建体；和包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc 多肽的二聚Fc多肽构建体，其中所述单体Fc多肽中的一个与抗原结合多肽构建体融合；其中在等摩尔浓度下，所述抗体构建体与结合HER2的相应二价抗体构建体相比展示与FcγR的结合密度增加。
本文提供一种结合HER2的分离的单价抗体构建体，其包含：单价地结合HER2的抗原结合多肽构建体；和包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc 多肽的二聚Fc多肽构建体，其中所述单体Fc多肽中的一个与抗原结合多肽构建体融合；其中所述抗体构建体由靶细胞内化，其中所述构建体与结合 HER2的相应二价抗体构建体相比展示出与靶细胞上展示的HER2的结合密度和Bmax增加，且其中在等摩尔浓度下，所述构建体与所述相应二价HER2 结合抗体构建体相比展示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一种。
在一个实施方案中是一种结合HER2的分离的单价抗体构建体，其包含：单价地结合HER2的抗原结合多肽构建体；和包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中所述单体Fc多肽中的一个与抗原结合多肽构建体融合；其中所述抗体构建体结合FcRn，但与具有两个抗原结合区的相应单特异性二价抗体构建体相比展示较高的Vss。
在一些实施方案中是一种本文所述的分离的单价HER2结合抗体构建体，其中所述单价HER2结合多肽构建体是Fab、scFv、sdAb或多肽中的至少一种。
本文提供一种本文所述的分离的单价抗体构建体，其中二聚Fc构建体是包含变体CH3结构域的异源二聚Fc构建体。在一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，所述变体CH3结构域包含促使形成与天然同源二聚Fc区具有相当的稳定性的所述异源二聚体的氨基酸突变。在一个实施方案中是分离的单价抗体构建体，其中所述变体CH3结构域具有约70℃或更高的熔解温度(Tm)。在另一个实施方案中是分离的单价抗体，其中变体CH3结构域具有约75℃或更高的熔解温度(Tm)。还提供一种本文所述的分离的单价抗体构建体，其中变体CH3结构域具有约80℃或更高的熔解温度(Tm)。在另一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中二聚Fc构建体还包含含有促使选择性结合Fcγ受体的氨基酸修饰的变体CH2结构域。在一个相关实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中异源二聚体Fc构建体相对于野生型Fc区而言在CH3结构域中不包含另外的二硫键。在一个实施方案中是本文提供的分离的单价抗体构建体，其中异源二聚体Fc构建体相对于野生型Fc区而言在变体CH3结构域中包含另外的二硫键，且其中变体 CH3结构域具有至少约77.5℃的熔解温度(Tm)。在一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中二聚Fc构建体是以大于约75％的纯度形成的异源二聚Fc构建体。在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体，其中二聚Fc构建体是以大于约80％的纯度形成的异源二聚Fc构建体。还提供分离的单价抗体构建体，其中二聚Fc构建体是以大于约90％的纯度形成的异源二聚Fc构建体。在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中二聚Fc构建体是以大于约95％的纯度形成的异源二聚Fc构建体。
本文提供一种本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述单体Fc多肽与抗原结合多肽构建体通过连接子融合。在某些实施方案中，连接子是多肽连接子。
在一个实施方案中提供本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述构建体具备的ADCC、ADCP和CDC中的至少一种大于具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗体构建体的约105％。在一个实施方案中，构建体具备的 ADCC、ADCP和CDC中的至少一种是具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗体构建体的至少约125％。在另一个实施方案中，构建体具备的ADCC、 ADCP和CDC中的至少一种是相应二价抗体构建体的至少约150％。在一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述构建体具备的 ADCC、ADCP和CDC中的至少一种是具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗体构建体的至少约300％。
在一个实施方案中提供本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述结合密度和Bmax的增加是相应二价抗体构建体的结合密度和Bmax的至少约 125％。在一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述结合密度和Bmax的增加是相应二价抗体构建体的结合密度和Bmax的至少约 150％。还提供本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述结合密度和Bmax的增加是相应二价抗体构建体的结合密度和Bmax的至少约200％。
在一个实施方案中是一种包含编码本文所述的分离的单价抗体构建体的核酸的宿主细胞。在一些实施方案中是一种宿主细胞，其中编码抗原结合多肽构建体的核酸和编码Fc构建体的核酸存在于单一载体中。还提供一种制备本文所述的分离的单价抗体构建体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)培养包含编码抗体片段的核酸的宿主细胞；和(b)从宿主细胞培养物回收抗体片段。
在一个实施方案中是一种在稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体或糖基化工程改造的无岩藻糖基化单价抗体构建体的方法，其包括：用以下物质转染至少一种稳定的哺乳动物细胞：编码包含重链可变结构域和第一Fc结构域多肽的第一重链多肽的第一DNA序列；编码包含第二Fc结构域多肽的第二重链多肽的第二DNA序列，其中所述第二重链多肽无可变结构域；和编码包含轻链可变结构域的轻链多肽的第三DNA序列，以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳动物细胞中以预定比率转染；在至少一种哺乳动物细胞中翻译所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重链和轻链多肽在所述至少一种稳定的哺乳动物细胞中被表达成需要的糖基化单价不对称抗体。
在一个实施方案中提供产生本文所述的糖基化单价抗体构建体或糖基化工程改造的无岩藻糖基化单价抗体构建体的方法，其包括用不同预定比率的所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列转染至少两种不同细胞以便至少两种细胞各自以不同的比率表达重链多肽和轻链多肽。在一个实施方案中是产生糖基化单价抗体构建体或糖基化工程改造的无岩藻糖基化单价抗体构建体的方法，其包括用包含所述第一、第二和第三DNA序列中至少两种的多顺反子载体转染至少一种哺乳动物细胞。在一个实施方案中，所述至少一种哺乳动物细胞选自VERO、HeLa、HEK、NS0、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7、Caco-2和MDCK细胞及其子类和变体。
在一个实施方案中提供产生糖基化单价抗体构建体或糖基化工程改造的无岩藻糖基化单价抗体构建体的方法，其中所述第一DNA序列:第二DNA序列:第三DNA序列的预定比率是约1:1:1。
在另一个实施方案中是产生本文所述的糖基化单价抗体构建体或糖基化工程无岩藻糖基化单价抗体构建体的方法，其中所述第一DNA序列:第二 DNA序列:第三DNA序列的预定比率使得所翻译的第一重链多肽的量约等于第二重链多肽的量和轻链多肽的量。在一个实施方案中是本文所述的方法，其中至少一种稳定的哺乳动物细胞的表达产物与单体重链或轻链多肽或其它抗体相比包含更大百分比的需要的糖基化单价抗体。
在一个实施方案中提供产生本文所述的糖基化单价抗体构建体或糖基化工程改造的无岩藻糖基化单价抗体构建体的方法，其包括鉴定和纯化需要的糖基化单价抗体。在某些实施方案中，所述鉴定是通过液相色谱法和质谱分析法中的一者或两者来进行。
本文提供一种产生具有改善的ADCC的抗体构建体的方法，其包括：用以下物质转染至少一种稳定的哺乳动物细胞：编码包含重链可变结构域和第一Fc结构域多肽的第一重链多肽的第一DNA序列；编码包含第二Fc结构域多肽的第二重链多肽的第二DNA序列，其中所述第二重链多肽无可变结构域；和编码包含轻链可变结构域的轻链多肽的第三DNA序列，以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳动物细胞中以预定比率转染；在至少一种哺乳动物细胞中翻译所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重链和轻链多肽在所述至少一种稳定的哺乳动物细胞中被表达成糖基化单价抗体，其中所述糖基化单价不对称抗体与相应野生型抗体相比具有较高的ADCC。
本文提供的一种产生具有改善的ADCC、ADCP和CDC中的至少一种的 HER2结合抗体构建体的方法，其包括：用以下物质转染至少一种稳定的哺乳动物细胞：编码包含重链可变结构域和第一Fc结构域多肽的第一重链多肽的第一DNA序列；编码包含第二Fc结构域多肽的第二重链多肽的第二DNA 序列，其中所述第二重链多肽无可变结构域；和编码包含轻链可变结构域的轻链多肽的第三DNA序列，以便所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳动物细胞中以预定比率转染；在所述至少一种哺乳动物细胞中翻译所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三 DNA序列以便所述重链和轻链多肽在所述至少一种稳定的哺乳动物细胞中被表达成不对称的糖基化单价HER2结合抗体，其中所述糖基化单价HER2 结合抗体与相应野生型HER2结合抗体相比具有改善的ADCC、ADCP和CDC 中的至少一种。
提供一种增加至少一种靶细胞上的抗体浓度的方法，其向靶细胞提供包含以下的单价抗体构建体：单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体；二聚Fc 区；其中所述单价抗体构建体与具有两个抗原结合区的相应二价抗体构建体相比展示出与展示所述抗原的靶细胞的结合密度和Bmax的增加，且其中所述单价抗体构建体与相应二价抗体构建体相比显示改善的功效，且其中所述改善的功效并非通过抗原的交联、抗原二聚化、防止抗原调节、抗原内化或抗原下调、或抗原活化而引发。
本文提供一种包含本文所述的单价抗体构建体和药学上可接受的载剂的药物组合物。在某些实施方案中是一种还包含与单价抗体构建体偶联的药物分子的本文所述的药物组合物。
本文提供一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的药物组合物。提供一种治疗HER信号传导紊乱的方法，其向有需要的患者提供有效量的本文所述的药物组合物。本文提供一种抑制肿瘤生长的方法，其包括使肿瘤与包含有效量的本文所述的单价抗体构建体的组合物接触。提供一种使肿瘤萎缩的方法，其包括使肿瘤与包含有效量的本文所述的单价抗体构建体的组合物接触。
提供一种治疗乳癌的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的单价抗体构建体。在一个实施方案中是一种在对用曲妥珠单抗 (Trastuzumab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、TDM1和抗HER二价抗体中的一种或多种的治疗具有部分反应的患者中治疗乳癌的方法，所述方法包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的单价抗体构建体。在一个实施方案中是一种在对用曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、TDM1(ADC)和抗HER二价抗体中的一种或多种的治疗无反应的患者中治疗乳癌的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的单价抗体构建体。提供一种本文所述的治疗乳癌的方法，其中所述方法包含除了另一种治疗剂以外还提供所述抗体构建体。在一个实施方案中是一种本文所述的治疗乳癌的方法，其中所述抗体构建体与所述治疗剂同时提供。还提供一种本文提供的治疗乳癌的方法，其中所述抗体构建体与所述治疗剂偶联。
提供本文所述的分离的单价抗体构建体，其中单价抗体构建体与一个或多个药物分子偶联。
提供一种抑制抗原分子多聚化的方法，其包括使抗原与包含有效量的本文所述的单价抗体构建体的组合物接触。还提供一种抑制抗原与其同源结合配偶体的结合的方法，其包括使抗原与包含足以与抗原结合的量的本文所述的单价抗体构建体的组合物接触。
还提供经过修饰以含有本文所述的核酸分子以编码和表达本文所述的单价抗体构建体的转基因生物体。
在结合附图审阅本发明具体实施方案的以下描述后，本发明的其它方面和特征对本领域普通技术人员来说将显而易见。
附图简述
在说明本发明的实施方案的图中，
图1描绘对抗体Fc依赖性细胞毒性即补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的说明。
图2A至2B描绘与抗原结合的单价和二价抗体。图2A描绘本文所述的以1:1的化学计量结合抗原的单价抗体构建体。图2B描绘以1:2的化学计量结合抗原的二价抗体构建体。如本文所述，单价抗体构建体在每个细胞的基础上导致较高的抗体浓度/装饰并导致更多由ADCC、CDC、ADCP引起的Fc 介导的细胞杀伤。
图3描绘示例性的单价抗HER2抗体与SKOV3细胞结合的能力：A.非线性拟合结合曲线；B.对数变换曲线。
图4描绘示例性的单价抗HER2抗体在不同的密度下与表达HER2的细胞结合的能力：A.MDA-MB-231细胞；B.SKOV3细胞；C.SKBR3细胞。
图5描绘示例性的单价抗HER2抗体与二价全尺寸抗体(FSA)相比介导增强的ADCC的能力。
图6描绘示例性的单价抗HER2抗体与二价全尺寸抗体(FSA)相比介导增强的CDC的能力。
图7描绘示例性的单价抗HER2抗体与二价全尺寸抗体(FSA)相比介导增强的CDC的能力：A.和B.各自代表其中使用两种PBMC供体的实验。C.具有OA2-Fab-HER2和4PBMC供体的两个独立实验的综述，根据供体表示CD 16+细胞的百分比。将数据标准化成WT FSA Hcptn的最大溶胞作用，并呈现出OA2-Fab-HER2相对于WT FSA Hcptn的最大溶胞作用的倍数差异。
图8描绘对示例性的单价抗HER2抗体在蛋白A纯化后的产量和纯度的分析。A.对纯化单价抗HER2抗体的SDS-PAGE分析；B.对OA1-Fab-HER2 的LCMS分析；C.对OA2-Fab-HER2的LCMS分析；D.在约0.8％两条轻链+1条短重链(72,898Da)、单独的约0.7％短重链(25,907Da)下显示较低质量肽的OA2-Fab-HER2的LCMS光谱的展开图。
图9描绘单价抗HER2抗体被内化的能力。A.结果以内化％的形式绘图；B .结果以相对于对照的作用％的形式绘图。
图10描绘单价抗HER2抗体抑制SKBR3细胞生长的能力。
图11描绘单价抗HER2抗体与FcRn受体结合的能力。
图12描绘另一种示例性的单价抗HER2抗体与SKOV3细胞结合的能力。
图13描绘FSA-scFv-HER2的DNA和氨基酸序列。A.(SEQ ID NO：3) 和C(SEQ ID NO：5).分别是链A和链B的DNA序列；B.(SEQ ID NO： 4)和D(SEQ ID NO：6).分别是链A和链B的氨基酸序列。
图14描绘OA3-scFv-HER2的DNA和氨基酸序列。A.(SEQ ID NO：7) 和C(SEQ ID NO：9).分别是链A和链B的DNA序列；B.(SEQ ID NO： 8)和D.(SEQ ID NO：10)分别是链A和链B的氨基酸序列。
图15描绘OA1-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列。A.(SEQ ID NO：11)、 C.(SEQ ID NO：13)和E.(SEQ ID NO：15)分别是重链A、轻链和重链B的DNA序列；B.(SEQ ID NO：12)、D.(SEQID NO：14)和F.(SEQ ID NO：16)分别是重链A、轻链和重链B的氨基酸序列。
图16描绘OA2-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列。A.(SEQ ID NO：17)、 C.(SEQ ID NO：19)和E.(SEQ ID NO：21)分别是重链A、轻链和重链B的DNA序列；B.(SEQ ID NO：18)、D.(SEQID NO：20)和F.(SEQ ID NO：22)分别是重链A、轻链和重链B的氨基酸序列。
图17描绘wt FSA Hcptn的DNA和氨基酸序列。A.(SEQ ID NO：23) 和C.(SEQ IDNO：25)重链和轻链的DNA序列；B.(SEQ ID NO：24) 和D.(SEQ ID NO：26)重链和轻链的氨基酸序列。
图18描绘FSA-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列。A.(SEQ ID NO：27)、 C.(SEQ ID NO：29)和E.(SEQ ID NO：31)分别是重链A、轻链和重链B的DNA序列；B.(SEQ ID NO：28)、D.(SEQID NO：30)和F.(SEQ ID NO：32)分别是重链A、轻链和重链B的氨基酸序列。
图19描绘FSA-scFv-BID2的DNA和氨基酸序列。A.(SEQ ID NO：33) 链A和链B的DNA序列；B.(SEQ ID NO：34)链A和链B的氨基酸序列。
图20描绘OA4-scFv-BID2的DNA和氨基酸序列。A.(SEQ ID NO： 35)和C.(SEQ IDNO：37)分别是链A和链B的DNA序列；B.(SEQ ID NO：36)和D.(SEQ ID NO：38)分别是链A和链B的氨基酸序列。
图21A至21E描绘示例性的单价抗体构建体在不同细胞系中介导ADCC 的能力。图21A、C、D和E描绘MCF7细胞中的结果，而图21B描绘 MDA-MB-231细胞中的结果。
图22描绘示例性的单价抗体构建体在小鼠体内的药物动力学概况。
图23A至23B描绘用示例性的单价抗Her2抗体(OA1-Fab-Her2)处理 SKBr3细胞对信号传导分子的磷酸化作用的影响。图A显示对ErbB2的磷酸化作用的影响，而图B显示对MAPK和AKT的磷酸化作用的影响。
图24A至24 B显示对在15分钟(图A)和30分钟(图B)时由ELISA 测量的Akt的磷酸化作用程度的定量评估。
图25A至25C 描绘根据本发明的示例性单价抗体构建体结合JIMT-1细胞(图A)、BT474细胞(图B)和MCF-7细胞(图C)的能力。
图26A至26B描绘示例性的单价抗Her2抗体抑制BT-474细胞(图A， OA1-Fab-Her2OA2-Fab-HER2；图B，OA5-Fab-HER2,OA6-Fab-Her2)生长的能力。
图27A至27B描绘示例性的单价抗体构建体OA1-Fab-Her2和 OA5-Fab-Her2(在200nM下)在BT-474细胞(图A)或JIMT-1细胞(图B) 中内化的能力。
图28描绘示例性的单价抗体构建体结合MALME-3M细胞的能力。
图29描绘示例性的单价抗体构建体-抗体药物偶联物(ADC)杀伤BT474 细胞的能力。
图30A至30B描绘构建体的纯度。图30A描绘示例性的单价抗体构建体 OA5-Fab-Her2和OA6-Fab-Her2在蛋白A纯化后的纯度。图30B显示通过 LC/MS的异源二聚体纯度分析，其表明OA5-Fab-Her2和OA6-Fab-Her2在蛋白A和尺寸排阻色谱法后都可以被纯化成大于99％的纯度。
图31A至31F描绘OA5-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列；图31A(SEQ ID NO：39)和图31B(SEQ ID NO：40)分别是链A的DNA和氨基酸序列；图31C(SEQ ID NO：41)和图31D(SEQ IDNO：42)分别是链B的DNA 和氨基酸序列；且图31E(SEQ ID NO：43)和图31F(SEQ ID NO：44)分别是轻链的DNA和氨基酸序列。
图32A至32F描绘OA6-Fab-HER2的DNA和氨基酸序列；图32A(SEQ ID NO：45)和图32B(SEQ ID NO：46)：分别是链A的DNA和氨基酸序列；图32C(SEQ ID NO：47)和图32D(SEQID NO：48)：分别是链B的 DNA和氨基酸序列；且图32E(SEQ ID NO：49)和图32F(SEQ ID NO：50)：分别是轻链的DNA和氨基酸序列。
图33A至33F描绘FSA-Fab-pert的DNA和氨基酸序列；图33A(SEQ ID NO：51)和图33B(SEQ ID NO：52)分别是链A的DNA和氨基酸序列；图33C(SEQ ID NO：53)和图33D(SEQ IDNO：54)分别是链B的DNA 和氨基酸序列；且图33E(SEQ ID NO：55)和图33F(SEQ ID NO：56)分别是轻链的DNA和氨基酸序列。
详述
本文提供单价抗体构建体，其包含单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体；和包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽与至少一个来自抗原结合多肽构建体的多肽融合；其中所述单价抗体构建体与具有两个抗原结合区的相应单特异性二价抗体构建体相比展示出与展示所述抗原的靶细胞的结合密度和Bmax的增加，且其中所述单价抗体构建体与相应二价抗体构建体相比显示优越的功效和/或生物活性，且其中所述优越的功效和/或生物活性是结合密度增加的结果且导致靶细胞的装饰增加。由本文提供的单价抗体构建体导致Bmax或结合密度增加并导致靶标装饰增加是特异性靶标结合的作用而并非由于非特异性结合。在某些实施方案中，在1:1的靶标与抗体比率下发生最大结合。
在某些实施方案中，本文提供的单价抗体构建体具备以下属性中的至少一种或多种：与相应单特异性二价抗体构建体(FSA)相比增加的Bmax；与相应 FSA相当的Kd；与相应FSA相比相同或较慢的解离速率；激动性减少或部分激动性；靶标无交联和二聚；对所关注靶细胞的特异性和/或选择性；对靶细胞生长完全或部分抑制或无抑制；能引发效应物活性的完整Fc；和被靶细胞内化的能力。
在某些实施方案中，本文提供的单价抗体构建体具备以下最低限度的属性：与相应FSA相比增加的Bmax；与相应FSA相当的Kd；与相应FSA相比相同或较慢的解离速率；激动性减少或部分激动性；靶标无交联和二聚；对所关注靶细胞的特异性和/或选择性；对靶细胞生长完全或部分抑制或无抑制；能引发效应物活性的完整Fc；和任选地被靶细胞内化的能力。
本文提供一种单价抗体构建体，其中所述构建体是以下中的至少一种：单价裂解性抗体、单价内化抗体及其组合。在一些实施方案中，抗体构建体视这些抗体在以下功效因素之间展示的平衡而定是单价裂解性抗体和/或单价内化抗体：a)单价抗体构建体被内化的能力、b)单价抗体构建体增加的Bmax和Kd/结合-解离速率、和c)单价抗体构建体的激动性/部分激动性的程度。
本文提供一种增加至少一种靶细胞中的抗体浓度的方法，其包括向靶细胞提供包含以下的单价抗体构建体：单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体；二聚Fc区；其中所述单价抗体构建体与具有两个抗原结合区的相应二价抗体构建体相比展示出与展示所述抗原的靶细胞的结合密度和Bmax(最大结合) 的增加，且其中所述单价抗体构建体与相应二价抗体构建体相比显示更佳的治疗功效，且其中所述功效并非由抗原交联、抗原二聚、防止抗原调节或防止抗原活化引发。相反，另一个事实是功效可以由抗原调节或抗原活化引发，只要这些不超过净杀伤作用即可。
在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述抗体构建体不显示亲合力。
单价裂解性(Mv-L)抗体
提供本文所述的单价抗体构建体，其中所述构建体与FSA相比具备增加的Bmax和相当或较慢的解离速率(因此导致MV-L对靶细胞的装饰较高和抗体依赖性的细胞毒性)。在一些实施方案中，本文所述的MV-L抗体构建体以与FSA相比增加的Bmax和快速的结合速率与缓慢的解离速率结合靶细胞。在一些实施方案中，本文所述的MV-L抗体构建体阻断同源配体与靶抗原结合。在一些实施方案中，本文所述的MV-L抗体构建体不显示内化，由此导致抗体在细胞上的最大装饰和对路径的功能性阻塞。
在某些实施方案中，MV-L抗体构建体1)以与FSA相比增加的Bmax和快速的结合速率与类似或较慢的解离速率结合靶细胞并使其饱和；2)是非激动性的；3)抑制细胞生长；4)阻断同源配体与靶抗原结合；5)不显示内化和6) 包含参与效应物活性的Fc结构域。在某些实施方案中，MV-L抗体构建体最大限度地装饰靶细胞表面，且阻断靶抗原对靶细胞的活化，而不抵消可导致细胞存活和生长的活性。
在一个实施方案中，根据本发明的单价裂解性抗体构建体1)以与单特异性二价抗体构建体相比增加的Bmax结合靶细胞且具有快速的结合速率和类似或缓慢的解离速率，2)是非激动性的；3)抑制细胞生长，4)阻断同源配体与靶抗原结合，5)显示最小限度的内化和6)包含与Fc受体相互作用的Fc结构域和参与免疫系统的补体系统。
在某些实施方案中，MV-L抗体构建体能结合FcγR受体和补体蛋白，且在高的细胞表面浓度下对于引发抗体依赖性的细胞毒性更有效。在某些实施方案中是一种MV-L抗体构建体，其适用于通过诸如ADCC、ADCP或CDC 的Fc效应功能来杀伤靶细胞。
在一个实施方案中，MV-L抗体构建体由于相对于由FSA实现的参与的空间差异而能够优先地参与效应系统。在某些实施方案中，MV-L基本上阻断配体与靶抗原结合，同时不显示激动性，然而与FSA相比增加的Bmax和快速的结合速率加上类似或缓慢的解离速率可以克服配体的部分阻塞、一定程度的激动性和细胞生长以及内化，从而导致仍优于FSA的净有效作用。在一些实施方案中，本文提供的MV-L抗体构建体结合HER2。在一些实施方案中，抗体构建体结合至少一种HER2胞外结构域。在某些实施方案中，胞外结构域是ECD1、ECD2、ECD3和ECD4中的至少一种。在某些实施方案中，HER2结合MV-L是本文提供的OA5-Fab-Her2(4182)或OA1-Fab-Her2 (1040)。
在某些实施方案中，单价裂解性抗体构建体(MV-L)对病变细胞的装饰增加导致通过ADCC、CDC或ADCP去除靶细胞比单特异性二价抗体构建体 (FSA)更有效。
单价内化(MV-Int)抗体
本文提供单价抗体构建体，其包含单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体；和包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，且其中所述单价抗体构建体是单价内化(MV-Int)抗体构建体。在某些实施方案中，增加的Bmax和内化程度是对MV-Int种类中的单价抗体构建体进行分类的关键驱动因素。在某些实施方案中，MV-Int抗体构建体以与FSA相比增加的 Bmax和快速的结合速率加上类似或缓慢的解离速率来结合靶细胞。在一些实施方案中，Mv-Int致使以下中的至少一种：对靶细胞的较高装饰、阻断同源配体与靶抗原结合和有效内化，以及抑制或不引发任何细胞生长。在一些实施方案中，本文提供的MV-L抗体结合HER2。在某些实施方案中，HER2结合MV-Int是本文提供的OA5-Fab-Her2(4182)或OA1-Fab-Her2(1040)。
在某些实施方案中，本文提供与MV-L和FSA相比具有高Bmax和高内化的MV-Int构建体，由此导致MV-Int的胞内浓度较高。在一些实施方案中，本文提供的MV-L抗体结合HER2。在一些实施方案中，抗体构建体结合至少一种HER2胞外结构域。在某些实施方案中，胞外结构域是ECD1、ECD2、 ECD3和ECD4中的至少一种。在一些实施方案中，MV-L抗体抑制HER2胞外结构域的二聚化。在一些实施方案中，抗体构建体结合至少一种HER2胞外结构域。在某些实施方案中，胞外结构域是ECD1、ECD2、ECD3和ECD4 中的至少一种。
在一些实施方案中，MV-Int抗体可以部分地活化受体，使用它作为特洛伊(Trojan)来运送本文所述的抗体构建体，任选地与有效负荷一起到细胞中。所述MV-Int抗体适用于制备抗体-药物偶联物(ADC)，而且可用于治疗需要向靶细胞递送毒性药物的适应症。在这种形态下，导致急性细胞死亡的高毒性的有效负荷的递送将克服在MV-Int中所赋予的一些激动性活性。在一些实施方案中，本文提供的MV-Int抗体结合HER2。在某些实施方案中是HER2结合单价抗体构建体，它们是MV-L和MV-Int。举例而言，OA1-Fab-Her2(1040)—v1040对于MV-L和MV-Int展示充分的特性。
在一个实施方案中，由MV-Int实现的相对于FSA的较高装饰和Bmax 可补偿内化水平的差异。
在一个实施方案中，Mv-Int抗体构建体1)以与FSA相比增加的Bmax和快速的结合速率加上相当或缓慢的解离速率来结合靶细胞(因此导致MV-Int对靶细胞的装饰较高)，2)阻断同源配体与靶抗原结合；3)是非激动性的；4)不引发细胞生长，和5)比单特异性二价抗体构建体在更大程度上有效内化。在另一个实施方案中，单价内化抗体构建体1)以与FSA相比增加的Bmax和快速的结合速率加上缓慢的解离速率来结合靶细胞(因此导致MV-Int对靶细胞的装饰较高)，2)阻断同源配体与靶抗原结合；3)只是部分激动性的；4)不引发细胞生长，和5)比单特异性二价抗体构建体在更大程度上有效内化。
在一些实施方案中，通过免疫T和B细胞以及病变细胞和耐药病变细胞增加单价内化抗体构建体(MV-Int)的装饰和内化导致通过ADC比FSA更有效地去除靶细胞。在一个实施方案中，与药物分子偶联的单价内化抗体构建体 (MV-Int)适用于治疗药物治疗无效和耐药的患者以及无法对一线治疗作出反应的患者。在一些实施方案中，本文提供的MV-Int抗体结合HER2。在某些实施方案中是HER2结合单价抗体构建体，它们是MV-L和MV-Int。例如OA1-Fab-Her2(1040)
在一个实施方案中，本文所述的单价裂解性抗体构建体(MV-L)使诸如病毒的病原体的装饰增加导致病原体去除比单特异性二价抗体构建体(FSA)更有效。举例而言，诸如HIV的病毒已演变成通过具有低密度的包膜刺突来回避二价抗体和二价结合，这是在与针对其一致地产生保护性中和抗体反应的病毒相比时的区分性特征。结果是亲合力最小化，通常被抗体用来实现高亲和力结合和有效中和，由此使病毒可回避抗体。本文所述的单价抗体构建体不受影响，显著地是因为结合是针对单一的表位。在某些实施方案中，本文所述的单价抗体构建体可单独或以组合形式用来涵盖所有独特的病毒表位。
在某些实施方案中，本文所述的MV_L抗体构建体通过病原体的调理作用而用于直接靶向和抗体介导的清除。在某些实施方案中，MV-L和MV-Int 抗体两者都适合受病原体感染的细胞的抗体依赖性清除。在一些实施方案中， MV-L和MV-Int抗体构建体高度装饰受HIV感染的T细胞并标记用于通过 ADCC、CDC、ADCP或ADC杀伤而去除的这些细胞。在某些实施方案中，本文所述的单价抗体构建体可单独或以与其它单价抗体构建体的组合形式使用。
本文提供一种分离的单价抗体构建体，其包含单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体；和包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽与至少一个来自抗原结合多肽构建体的多肽融合；其中所述单价抗体构建体与具有两个抗原结合区的相应FSA构建体相比展示出与展示所述抗原的靶细胞的结合密度和Bmax(最大结合)的增加，其中所述单价抗体构建体与相应二价抗体构建体相比显示优越的功效和/ 或生物活性，且其中所述优越的功效和/或生物活性是结合密度增加的结果。
在某些实施方案中提供一种本文所述的分离的单价抗体构建体，其中在大于观察到的平衡常数(Kd)的浓度下和在抗体的饱和浓度下，观察到相对于单特异性二价抗体而言结合密度和Bmax增加。在一些实施方案中，优越的功效和/或生物活性是与所述相应二价抗体构建体相比FcγR或补体(C1q)结合增加和较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中至少一种的结果。在具体实施方案中，分离的单价抗体构建体是抗增殖的并经过内化。在某些实施方案中是一种本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述相对于FSA而言的结合密度和Bmax的增加与靶细胞上的抗原密度无关。在一些实施方案中提供一种本文所述的分离的单价抗体构建体，其中靶细胞是癌细胞或表达HER2 的病变细胞。在一个实施方案中，本文所述的分离的单价抗体构建体不显示亲合力。
定义
应了解，本发明不限于特定的实验方案；本文所述的细胞系、构建体和试剂同样可以改变。还应了解，本文所用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，且不打算限制本发明的范畴，本发明的范畴仅受附加的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在实践或检验本发明中可以使用与本文所述类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选的方法、装置和材料。
本文提到的所有公布和专利以引用的方式并入本文中，目的在于描述和公开例如在公布中描述的可能结合目前描述的发明使用的构建体和方法。本文论述的公布仅提供在本申请提交日之前的公开内容。本文中的内容都不应解释为承认发明人无权根据先前的发明或出于任何其它原因提前所述公开内容的日期。
“二聚体”或”异源二聚体”是包含至少第一单体多肽和第二单体多肽的分子。在异源二聚体的情形下，所述单体之一的至少一个氨基酸残基与另一单体不同。在某些实施方案中，表面区域掩埋驱使二聚体聚集。在一些实施方案中，单体多肽借助于通过有利于需要的二聚体形成和/或不利于其它不需要的样品形成来驱使二聚体形成的静电相互作用和/或盐桥相互作用来彼此相互作用。在一些实施方案中，单体多肽借助于通过有利于需要的二聚体形成和/或不利于其它聚集类型形成来驱使需要的二聚体形成的疏水相互作用来彼此相互作用。在某些实施方案中，单体多肽借助于共价键形成来彼此相互作用。在某些实施方案中，在天然存在的半胱氨酸或驱使需要的二聚体形成的引进半胱氨酸之间形成共价键。在本文所述的某些实施方案中，单体之间不形成共价键。在一些实施方案中，多肽借助于通过有利于需要的二聚体形成和/或不利于其它不需要的实施方案形成来驱使二聚体形成的装填 (packing)/尺寸互补(size-complementarity)/球入洞(knob-into-hole)/隆凸-腔 (protruberance-cavity)型相互作用来彼此相互作用。在一些实施方案中，多肽借助于驱使二聚体形成的阳离子-π相互作用来彼此相互作用。在某些实施方案中，个别的单体多肽在溶液中无法以分离的单体形式存在。
如本文所用的术语“Fc区”一般是指包含免疫球蛋白重链的C端多肽序列的二聚体复合物，其中C端多肽序列是可以通过木瓜蛋白酶消化完整抗体获得的。Fc区可包含天然或变体Fc序列。尽管免疫球蛋白重链的Fc序列的边界可变化，但人IgG重链Fc序列通常定义为从大致Cys226位置或大致Pro230 位置的氨基酸残基延伸到Fc序列的羧基端。免疫球蛋白的Fc序列一般包含两个恒定结构域、一个CH2结构域和一个CH3结构域，且任选地包含一个CH4结构域。本文中“Fc多肽”意思是构成Fc区的多肽之一。Fc多肽可以从任何合适的免疫球蛋白获得，诸如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、 IgD或IgM。在一些实施方案中，Fc多肽包含部分或全部野生型铰链序列(一般在其N端)。在一些实施方案中，Fc多肽不包含功能型或野生型铰链序列。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指其中表达Fc受体(FcR) 的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并接着致使靶细胞溶解的细胞介导的反应。
“补体依赖性细胞毒性”和“CDC”是指在补体存在下溶解靶标。补体活化路径通过补体系统的第一组分(C1q)和与同源抗原复合的分子(例如，抗体) 结合来引发。
“抗体依赖性细胞吞噬作用”和“ADCP”是指通过单核细胞或巨噬细胞介导的吞噬作用破坏靶细胞。
术语“Fc受体”和“FcR”用来描述与抗体的Fc区结合的受体。举例而言， FcR可以是天然序列人FcR。FcR一般是结合IgG抗体的受体(γ受体)且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体或者拼接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有主要在其细胞质结构域中不同的类似氨基酸序列。某些FcR也可以结合其它同种型的免疫球蛋白(参见例如，Janeway等人,ImmunoBiology:the immune system in health and disease,(Elsevier Science Ltd.,NY)(第4版, 1999))。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)(在Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997) 中综述)。FcR在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel 等人,Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等人,J.Lab.Clin.Med. 126:330-41(1995)中综述。本文中的术语“FcR”涵盖其它FcR，包括将来识别的那些FcR。此术语还包括新生儿受体FcRn，它负责向胚胎输送母系IgG (Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)；和Kim等人,J.Immunol.24:249 (1994))。
“病症”是可由本发明的抗体或方法治疗获益的任何病况。此病症包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物具有论及病症倾向的那些病理状况。在本文中将要治疗的病症的非限制性实例包括恶性和良性肿瘤；非白血病和恶性淋巴肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮细胞、基质和囊胚病症；和炎症性、免疫性和其它血管生成相关的病症。
术语“癌症”和“癌性”是指或描述通常特征在于细胞生长/增殖失调的哺乳动物中的生理状况。癌症的实例包括(但不限于)癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。所述癌症的更具体实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤/神经胶质瘤(例如，间变型星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、间变型少突神经胶质瘤、间变型少突星形细胞瘤)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头颈癌。
如本文所用的术语“炎症性疾病”或“炎症性病症”涵盖特征为结缔组织发炎或这些组织退化的病况。在某些实施方案中，炎症性疾病或病症包括(但不限于)阿尔茨海默症(Alzheimer's)、强直性脊柱炎、关节炎(包括(但不限于)骨关节炎、类风湿性关节炎(RA)和牛皮癣性关节炎)、哮喘、动脉粥样硬化、克罗恩氏病(Crohn's disease)、结肠炎、皮炎、憩室炎、纤维肌痛、肝炎、肠易激综合症(IBS)、系统性红斑狼疮(SLE)、肾炎、帕金森氏病和溃疡性结肠炎。
如本文所用，“治疗”是指临床干预试图改变受治疗个体或细胞的自然过程，而且可以进行用以预防或在临床病理学的过程期间进行。有利的治疗作用包括预防疾病发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减小疾病进展速率、改善或缓和疾病状态和缓解或改进预后。在一些实施方案中，使用本发明的抗体来延缓疾病或病症的发展。在一个实施方案中，本发明的抗体和方法影响肿瘤消退。在一个实施方案中，本发明的抗体和方法影响对肿瘤/癌症生长的抑制。
术语“基本上纯化”是指可基本上或大体上不含通常伴有如在其天然产生的环境中发现的蛋白质或与蛋白质相互作用的组分(即，天然细胞或在重组产生的异源多聚体的情形下是宿主细胞)的本文所述的构建体或其变体，即在某些实施方案中，基本上不含细胞材料，包括具有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重量计)污染性蛋白质的蛋白质制剂。当异源多聚体或其变体由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中蛋白质以细胞干重量的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少存在。当异源多聚体或其变体由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中，蛋白质在培养基中以细胞干重量的约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约 100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更少存在。在某些实施方案中，如通过诸如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳的适当方法测定，由本文所述的方法产生的“基本上纯化的”异源多聚体具有至少约 30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，特定而言至少约75％、 80％、85％的纯度水平，和更特定而言至少约90％的纯度水平、至少约95％的纯度水平、至少约99％的纯度水平或更大的纯度水平。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源多核苷酸的细胞，而与用来插入的方法无关，所述用来插入的方法例如直接吸收、转导、f-杂合或本领域中已知用于制造重组宿主细胞的其它方法。外源多核苷酸可保持为非整合载体形式，例如质粒，或者可以整合到宿主基因组中。
如本文所用的术语“培养基(medium/media)”包括可支撑或含有任何宿主细胞的任何培养基、溶液、固体、半固体或硬性支撑物，所述宿主细胞包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞、原核宿主细胞、大肠杆菌(E.coli)或假单胞菌宿主细胞以及细胞内含物。因此，此术语可涵盖其中已生长宿主细胞的培养基，例如蛋白质已分泌到其中的培养基，包括增殖步骤之前或之后的培养基。此术语还可以涵盖含有宿主细胞溶解产物的缓冲剂或试剂，诸如在胞内产生本文所述的异源多聚体和宿主细胞被溶解或破坏而释放异源多聚体的情形下。
如本文所用的“重折叠”描述将含有二硫键的多肽从不当折叠或未折叠状态转变为就二硫键而言天然或适当折叠的构型的任何过程、反应或方法。
如本文所用的“共折叠”具体是指采用至少两种彼此相互作用的单体多肽并导致未折叠或不当折叠的多肽转变为天然、适当折叠的多肽的重折叠过程、反应或方法。
如本文所用，术语“已调节血清半衰期”意思是本文所述的抗体构建体相对于其天然形式而言所包含的抗原结合多肽的循环半衰期的正向或负向变化。通过在施用构建体后获取各个时间点的血液样本并测定每个样本中的该分子的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相关性使得可计算血清半衰期。血清半衰期的增加理想地是至少约两倍，但较小的增加也是适用的，例如在它能进行令人满意的给药方案或避免毒性作用的情况中。在一些实施方案中，增加是至少约三倍、至少约五倍或至少约十倍。
如本文所用的术语“已调节治疗半衰期”意思是本文所述的单价抗体构建体相对于其未修饰形式而言所包含的治疗有效量的抗原结合多肽的半衰期的正向或负向变化。通过测量分子在施用后各个时间点的药物动力学和/或药效学特性来测量治疗半衰期。治疗半衰期增加理想地使得能进行特别有益的给药方案、特别有益的总剂量或避免不利的作用。在一些实施方案中，治疗半衰期增加是由于效能增加、经修饰的分子与其靶标的结合增加或减少、诸如蛋白酶的酶对分子的分解增加或减少、或未经修饰的分子的另一参数或作用机制增加或减少、或受体介导的分子清除率增加或减少。
术语“分离的”在用于核酸或蛋白质时表示核酸或蛋白质不含至少一些在自然状态下与其相关的细胞组分，或核酸或蛋白质已被浓缩到大于其在体内或体外产生的浓度的水平。这可以是同质状态。分离的物质可以处于干燥或半干燥状态，或在溶液中(包括但不限于水溶液)。其可以是药物组合物的一种组分，其包括其它药学上可接受的载剂和/或赋形剂。纯度和同质性通常使用诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法的分析化学技术来测定。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质是基本上纯化的。具体而言，分离的基因从侧接基因并编码除所关注基因以外的蛋白质的开放阅读框分开。术语“纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中基本上产生一个条带。具体来说，它的意思是核酸或蛋白质至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％或在更大程度上纯。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核苷酸、脱氧核苷、核苷或核苷酸及其聚合物。除非具体限制，否则此术语涵盖含有与参考核酸具有类似的结合特性并以与天然产生的核苷酸类似的方式代谢的天然核苷酸的已知类似物的核酸。除非另外具体限制，否则此术语还指包括PNA(肽核酸)的寡核苷酸类似物、反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸盐等)。除非另外指示，否则特定的核酸序列还暗示性地涵盖其保守性修饰的变体(包括但不限于简并密码子替换)和互补序列以及明确指出的序列。特定而言，可以通过产生其中一个或多个选定的(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替换的序列来实现简并密码子替换(Batzer等人, Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608 (1985)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述和对蛋白质的描述，且反之亦然。所述术语适用于天然产生的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基由共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然产生的和非天然产生的氨基酸以及以与天然产生的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、果仁糖、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指与天然产生的氨基酸具有相同的基本化学结构的化合物，即与氢结合的碳、羧基、氨基和R基，诸如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。所述类似物具有经修饰的R基(诸如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保持与天然产生的氨基酸相同的基本化学结构。提到的氨基酸包括例如天然产生的蛋白质源性L-氨基酸； D-氨基酸，经过化学修饰的氨基酸，诸如氨基酸变体和衍生物；天然产生的非蛋白质源性氨基酸，诸如β-丙氨酸、鸟氨酸等；和具有本领域技术中已知的作为氨基酸特征的特性的化学合成化合物。非天然产生的氨基酸的实例包括(但不限于)α-甲基氨基酸(例如，α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如，2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸)、侧链中具有额外亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)和侧链中的羧酸官能团被磺酸基团取代的氨基酸(例如，磺基丙氨酸)。向本发明的蛋白质中并入非天然氨基酸(包括合成非天然氨基酸、经取代的氨基酸或一种或多种D-氨基酸)可在多种不同方面有利。含有D-氨基酸的肽等与含有L-氨基酸的对应物相比展示增加的体外或体内稳定性。因此，合并有D-氨基酸的肽构造等在需要或要求较大的胞内稳定性时可尤其适用。更具体而言，D-肽等对内源性肽酶和蛋白酶具有抗性，由此在这些特性合意时提供分子的改善的生物利用度和延长的体内寿命。另外，D-肽等无法被有效处理用于主要组织相容性复合物II级限制呈现给T 辅助细胞，且因此更不可能在整个生物体中引发引发体液免疫反应。
在本文中氨基酸可由其通常已知的三个字母符号或由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的一个字母符号提及。同样，核苷酸可由其通常被接受的单字母代码提及。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于具体的核酸序列，“保守修饰的变体”是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的那些核酸，或在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上一致的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能一致的核酸编码任何给定的蛋白质。举例而言，密码子GCA、 GCC、GCG和GCU全部编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每个位置，密码子可变成所述的任何相应的密码子而不改变编码的多肽。所述核酸变化是“沉默变化”，这是保守修饰变化的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列也描述核酸的每种可能的沉默变化。本领域普通技术人员将意识到，核酸中的每个密码子(除了AUG(它一般是蛋氨酸的唯一密码子)和 TGG(它一般是色氨酸的唯一密码子)以外)都可以被修饰来产生功能一致的分子。因此，每个描述序列中都暗含编码多肽的核酸的每个沉默变化。
关于氨基酸序列，本领域普通技术人员将意识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行的改变、增加或缺失编码序列中的单一氨基酸或小百分比的氨基酸的个别取代、缺失或增加是“保守修饰变体”，其中改变导致氨基酸的缺失、氨基酸的增加或用化学上类似的氨基酸取代氨基酸。本领域普通技术人员已知提供功能类似氨基酸的保守取代表。所述保守修饰变体是除了本发明的多态变体、种间同系物和等位基因以外且不排除这些。
本领域普通技术人员已知提供功能类似氨基酸的保守取代表。以下八组各自含有作为另一种的保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)； 5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸 (Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和[0139]8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸 (M)(参见例如，Creighton,Proteins:Structures andMolecular Properties(W H Freeman&Co.；第2版(1993年12月)
术语“一致”或“同一性百分比”在两个或更多个核酸或多肽序列的情形中是指相同的两个或更多个序列或子序列。，当在比较窗口内或如使用以下序列比较算法(或本领域普通技术人员可用的其它算法)之一测量的指定区或通过手动比对和视觉观察比较并比对最大对应性时，如果序列具有一定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同，就认为它们是“基本上一致的”(即，在指定区内约60％同一性、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约 95％同一性)。此定义也指检验序列的互补序列。可在长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上或在长度为75至100个氨基酸或核苷酸的区域上，或 (在不指定时)在多核苷酸或多肽的整个序列上存在同一性。编码本发明的多肽的多核苷酸(包括来自除类以外的物种的同系物)可以通过包含以下步骤的方法来获得：在严格的杂交条件下用具有本发明的多核苷酸序列或其片段的标记探针筛选文库并分离全长cDNA和含有所述多核苷酸序列的基因组克隆。本领域技术人员熟知所述杂交技术。
对于序列比较而言，通常一个序列充当参考序列，检验序列与其进行比较。在使用序列比较算法时，将检验和参考序列输入计算机，接着指定座标，如果必要并指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，或者可以指定替代参数。序列比较算法随后基于程序参数来计算检验序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用的“比较窗口”包括提及选自20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150的连续位置数中的任一个的区段，其中可以在使两个序列最佳对准后将一个序列与具有相同连续位置数的参考序列进行比较。本领域普通技术人员已知用于比较的序列对准方法。用于比较的最佳序列对准可以通过(包括但不限于)Smith和Waterman的局部同源算法(1970)Adv.Appl. Math.2:482c、通过Needleman和Wunsch的同源比对算法(1970)J.Mol.Biol. 48:443、通过Pearson和Lipman对类似性方法的搜寻(1988)Proc.Nat'l.Acad. Sci.USA 85:2444、通过计算机执行这些算法(GAP、BESTFIT、FASTA和 TFASTA，在Wisconsin Genetics软件包中，Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.)或通过手动对比对和视觉观察(参见例如，Ausubel 等人,Current Protocols inMolecular Biology(1995增刊))来进行。
适合测定序列同一性百分比和序列类似性的算法的一个实例是BLAST 和BLAST2.0算法，分别在Altschul等人(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402 和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中进行描述。用于进行BLAST 分析的软件可以通过在万维网ncbi.nlm.nih.gov上可用的国家生物技术信息中心公开获得。BLAST算法参数W、T和X决定比对的敏感性和速度。BLASTN 程序(对于核苷酸序列而言)使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4 和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用字长为3、且预期值(E)为10、且BLOSUM62计分矩阵(参见Henikoff和Henikoff (1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)为50、预期值(E)为10、 M＝5、N＝-4和两条链的比较作为默认值。BLAST算法通常在“低复杂性”过滤器关闭的情形下进行。
BLAST算法也在两个序列之间进行对类似性的统计学分析(参见例如， Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。由BLAST 算法提供的类似性的一个量度是最小概率和(P(N))，它对于两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率提供指示。举例而言，如果检验核酸与参考核酸比较中的最小概率和小于约0.2、或小于约0.01、或小于约0.001，就认为核酸与参考序列类似。
短语“选择性地(或特异性地)杂交”是指当复合混合物(包括(但不限于)总的细胞或文库DNA或RNA)中存在特定的核苷酸序列时，分子只与此序列在严格的杂交条件下结合、成双链或杂交。
短语“严格的杂交条件”是指DNA、RNA或其它核酸或其组合的序列在如本领域已知的低离子强度和高温条件下杂交。通常，在严格条件下，探针将与核酸复合混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中的其靶标子序列杂交，但不与复合混合物中的其它序列杂交。严格的条件是序列依赖性的且在不同环境下将不同。较长的序列在较高温度下特异性地杂交。关于核酸杂交的广泛指导可见于Tijssen,Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassays” (1993)中。
如本文所用，术语“真核生物”是指属于原核生物(Eucarya)系统发育域的生物体，诸如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。
如本文所用，术语“原核生物”是指原核生物体。举例而言，非-真核生物体可属于真细菌(Eubacteria)(包括(但不限于)大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热细菌(Thermusthermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、绿脓假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等)系统发育域或古生菌(Archaea)(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、盐杆菌属(Halobacterium)(诸如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferaxvolcanii)和盐杆菌属物种NRC-1)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)、极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)等)系统发育域。
如本文所用的术语“受治疗者”是指动物，在一些实施方案中是指哺乳动物，且在其它实施方案中是指人，它们是治疗、观察或实验的目标。动物可以是同伴动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，奶牛、绵羊、猪、马等) 或实验室动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。
如本文所用的术语“有效量”是指施用的将在一定程度上减轻接受治疗的疾病、病况或病症的一种或多种症状的单价抗体构建体的量。含有本文所述的构建体的组合物可被施用来用于预防性、增强性和/或治疗性治疗。
术语“增强(enhance或enhancing)”意思是增加或延长所需作用的效能或持续时间。因此，关于增强药物分子或治疗剂的作用而言，术语“增强”是指增加或延长治疗剂对系统作用的效能或持续时间的能力。如本文所用的“增强有效量”是指足以增强另一种治疗剂或药物在所需系统中的作用的量。当用在患者中时，对此用途有效的量将取决于疾病、病症或病况的严重程度和过程、先前的治疗、患者的健康状态和对药物的反应以及治疗医师的判断。
如本文所用的术语“修饰”是指对给定多肽进行的任何改变，诸如改变多肽的长度、多肽的氨基酸序列、化学结构、共翻译修饰或翻译后修饰。“(修饰)”形式的术语意思是讨论的多肽任选地经修饰，即讨论的多肽可以是修饰的或未修饰的。
术语“翻译后修饰”是指在天然或非天然氨基酸被并入多肽链中之后此种氨基酸发生的任何修饰。仅举例而言，此术语涵盖共翻译体内修饰、共翻译体外修饰(诸如在无细胞翻译系统中)、翻译后体内修饰和翻译后体外修饰。
如本文所用的术语“单特异性二价抗体构建体”是指具有两个与相同表位/ 抗原结合(单特异性)的抗原结合结构域(二价)的抗体构建体。抗原结合结构域可以是(但不限于)诸如Fab(片段抗原结合)、scFv(单链Fv)核sdab (单结构域抗体)的蛋白质构建体。单特异性二价抗体构建体在本文中也称为“全尺寸抗体”或“FSA”。单特异性二价抗体构建体是测量单价抗体构建体特性的参考。
术语“亲合力”在本文中用来指治疗性单特异性二价抗体的结合亲和力和重要结构与生物属性的组合协同强度。缺乏亲合力和丧失协同结合强度可导致表观靶标结合亲和力减小。另一方面，在具有固定抗原数的靶细胞上，由多价(或二价)结合产生的亲合力导致在相对于展示单价结合的抗体而言较少的抗体分子数时对靶抗原的占有率增加。在较少数目的抗体分子与靶细胞结合时，在二价裂解性抗体的应用中，抗体依赖性的细胞毒性杀伤机制可能无法有效进行，导致功效减小。无足够的抗体结合来介导ADCC，因为ADCC、 CDC、ADCP一般被认为具有Fc浓度阈值依赖性。在激动性抗体的情形下，亲合力减小使其交联和二聚抗原且活化路径的效率减小。
“单结构域抗体”或“Sdab”-单结构域抗体(诸如Camelid VhH结构域)是个别免疫球蛋白结构域。Sdab相当稳定且易于表达成具有抗体Fc链的融合配偶体(Harmsen MM,DeHaard HJ(2007).“Properties,production,and applications of camelid single-domain antibody fragments”.Appl.Microbiol Biotechnol.77(1):13-22)。
“HER受体”是属于人表皮生长因子受体(HER)家族的受体蛋白酪氨酸激酶且包括EGFR、HER2、HER3和HER4受体。HER受体一般将包含胞外结构域，其可结合HER配体；亲脂性跨膜结构域；保守的胞内酪氨酸激酶结构域；和具有几个可经磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号传导结构域。
HER2的胞外(ecto)结构域包括四个结构域，结构域I(ECD1，约1至195 的氨基酸残基)、结构域II(ECD2，约196至319的氨基酸残基)、结构域III (ECD3，约320至488的氨基酸残基)和结构域IV(ECD4，约489至630 的氨基酸残基)(残基编号不含信号肽)。参见Garrett等人,Mol.Cell. 11:495-505(2003)、Cho等人,Nature 421:756-760(2003)、Franklin等人,Cancer Cell 5:317-328(2004)、Tse等人,Cancer Treat Rev.2012年4月；38(2):133-42 (2012)或Plowman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.90:1746-1750(1993)。
表达“ErbB2”和“HER2”在本文中可互换使用且是指例如在Semba等人, PNAS(USA)82:6497-6501(1985)和Yamamoto等人,Nature 319:230-234(1986) (基因库登录号X03363)中所述的人HER2蛋白。术语“erbB2”和“neu”是指编码人ErbB2蛋白的基因。p185或p185neu是指neu基因的蛋白质产物。优选的HER2是天然序列人HER2。
“HER配体”意思是结合和/或活化HER受体的多肽。在本文中特别关注的HER配体是天然序列人HER配体，诸如表皮生长因子(EGF)(Savage等人, J.Biol.Chem.247:7612-7621(1972))；转化生长因子α(TGF-α)(Marquardt等人, Science 223:1079-1082(1984))；双调蛋白，也称为神经鞘瘤或角化细胞自分泌生长因子(Shoyab等人,Science 243:1074-1076(1989)；Kimura等人,Nature 348:257-260(1990)；和Cook等人,Mol.Cell.Biol.11:2547-2557(1991))；β细胞素(Shing等人,Science 259:1604-1607(1993)；和Sasada等人,Biochem. Biophys.Res.Commun.190:1173(1993))；肝素-结合表皮生长因子(HB-EGF)(Higashiyama等人,Science 251:936-939(1991))；上皮调节蛋白(Toyoda等人,J.Biol.Chem.270:7495-7500(1995)；和Komurasaki等人,Oncogene 15:2841-2848(1997))；调蛋白(heregulin)(参见下文)；神经调节蛋白-2(NRG-2) (Carraway等人,Nature 387:512-516(1997))；神经调节蛋白-3(NRG-3) (Zhang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.94:9562-9567(1997))；神经调节蛋白-4 (NRG-4)(Harari等人,Oncogene 18:2681-89(1999))或畸胎瘤衍化生长因子 (cripto，CR-1)(Kannan等人,J.Biol.Chem.272(6):3330-3335(1997))。结合 EGFR的HER配体包括EGF、TGF-α、双调蛋白、β细胞素、HB-EGF和上皮调节蛋白。结合HER3的HER配体包括调蛋白。能结合HER4的HER配体包括β细胞素、上皮调节蛋白、HB-EGF、NRG-2、NRG-3、NRG-4和调蛋白。
“调蛋白”(HRG)在本文中使用时是指如美国专利号5,641,869或 Marchionni等人,Nature,362:312-318(1993)中公开的由调蛋白基因产物编码的多肽。调蛋白的实例包括调蛋白-α、调蛋白-β1、调蛋白-β2和调蛋白-β3 (Holmes等人,Science,256:1205-1210(1992)；和美国专利号5,641,869)；neu 分化因子(NDF)(Peles等人,Cell 69:205-216(1992))；乙酰胆碱受体-诱发活性(ARIA)(Falls等人,Cell 72:801-815(1993))；神经胶质生长因子(GGF) (Marchionni等人,Nature,362:312-318(1993))；感觉和运动神经元衍生因子 (SMDF)(Ho等人,J.Biol.Chem.270:14523-14532(1995))；γ-调蛋白(Schaefer 等人,Oncogene 15:1385-1394(1997))。此术语包括天然序列HRG多肽的生物活性片段和/或氨基酸序列变体，诸如其EGF样结构域片段(例如， HRGβ1177-244)。
“HER活化”或“HER2活化”是指任一种或多种HER受体或HER2受体的活化或磷酸化。HER活化一般导致信号转导(例如，由HER受体或基质多肽中的HER受体磷酸化酪氨酸残基的胞内激酶结构域引起)。HER活化可由与包含所关注HER受体的HER二聚体结合的HER配体来介导。与HER二聚体结合的HER配体可活化二聚体中一个或多个HER受体的激酶结构域且由此导致一个或多个HER受体中的酪氨酸残基的磷酸化作用和/或另外基质多肽(诸如Akt或MAPK胞内激酶)中的酪氨酸残基的磷酸化作用。
抗体“效应功能”是指由抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体 Fc区)引起的那些生物活性。抗体效应功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。
抗体的“Fab片段”(也称为片段抗原结合)含有轻链的恒定结构域(CL) 和重链的第一恒定结构域(CH1)以及分别位于轻链和重链上的可变结构域VL 和VH。可变结构域包含在抗原结合中涉及的互补决定环(CDR，也成为高变区)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基端加入几个残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单多肽链中。在一个实施方案中，Fv多肽另外在VH与VL结构域之间包含多肽连接子，这使得scFv形成抗原结合所需要的结构。关于scFv 的综述参见Pluckthun在The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,第113 卷中,Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag,NewYork,第269-315页(1994)。 HER2抗体scFv片段在WO93/16185；美国专利号5,571,894；和美国专利号 5,587,458中描述。
“人源化”形式的非人(例如，啮齿动物)抗体是含有源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在大多数的情况下，人源化抗体是其中受体高变区的残基由来自诸如小鼠、大鼠、兔子或非人灵长动物的非人物种(供体抗体)的高变区的具有所需特异性、亲和力和能力的残基取代的人免疫球蛋白 (受体抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基由相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰来进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、且通常是两个可变结构域，其中全部或基本上全部的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地也将包含至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的免疫球蛋白的恒定区。关于进一步详情，参见Jones 等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
人源化HER2抗体包括如以引用的方式明确并入本文中的美国专利号 5,821,337的表3中所述的huMAb4D5-1、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、 huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8 或曲妥珠单抗如美国专利公布号2006/0018899中所述的人源化520C9(WO93/21319)和20'人源化2C4抗体。
“表位2C4”是抗体2C4结合的HER2的胞外结构域中的区。为了筛选结合2C4表位的抗体，可进行诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,编者Harlow和David Lane(1988)中所述的常规交叉阻断分析。或者，可以进行表位定位来评估是否使用本领域已知的方法使抗体与 HER2的2C4表位结合和/或可以研究抗体-HER2结构(Franklin等人,Cancer Cell 5:317-328(2004))来确定抗体结合HER2的哪个结构域。表位2C4包含来自HER2的胞外结构域中的结构域II的残基。2C4和帕妥珠单抗在结构域 I、II和III的接合处结合HER2的胞外结构域。Franklin等人,Cancer Cell 5:317-328(2004)。
“表位4D5”是抗体4D5(ATCC CRL 10463)和曲妥珠单抗结合的HER2的胞外结构域中的区。此表位接近HER2的跨膜结构域且在HER2的结构域IV 中。为了筛选结合4D5表位的抗体，可进行诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,编者Harlow和David Lane(1988)中所述的常规交叉阻断分析。或者，可以进行表位定位来评估抗体是否结合HER2 的4D5表位(例如，大约残基529至大约残基625(包括残基529和残基625 在内)区内的任一个或多个残基，参考美国专利公布号2006/0018899的图1)。
“表位7C2/F3”是7C2和/或7F3抗体(各自以ATCC寄存，参考下文)结合的HER2的胞外结构域的结构域I内N端的区。为了筛选结合7C2/7F3表位的抗体，可进行诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,编者Harlow和David Lane(1988)中所述的常规交叉阻断分析。或者，可以进行表位定位来确定抗体是否结合HER2上的7C2/7F3表位(例如， HER2的大约残基22至大约残基53区内的任一个或多个残基，参见美国专利公布号2006/0018899的图1)。
如本文所用的术语“抗原调节”是指诸如在ADC中的表面受体密度通过内化或下调)的变化或损失。
抗原结合多肽构建体
单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体可源自已知的抗体或抗原结合结构域，或可源自新型的抗体或抗原结合结构域。识别用于单价抗体构建体的抗原结合多肽构建体是基于靶细胞的选择和基于在靶细胞表面上表达的抗原的选择。举例而言，一旦选定靶细胞，就选择a)在靶细胞的细胞表面上表达，而不在其它细胞的表面上表达，或b)在靶细胞的细胞表面上以较高水平表达，而在其它细胞的表面上以较低水平表达的抗原。这样可以选择性地来靶向靶细胞。
靶细胞的选择
基于单价抗体构建体的预期用途来选择靶细胞。在一个实施方案中，靶细胞是在癌症、感染性疾病、自体免疫疾病或炎症性疾病中活化或扩增的细胞。
在一个实施方案中，当单价抗体构建体打算用于治疗癌症时，靶细胞源自展示HER23+过度表达的肿瘤。在一个实施方案中，靶细胞源自展示HER2 低表达的肿瘤。在一个实施方案中，靶细胞源自展示HER2抗性的肿瘤。在一个实施方案中，靶细胞源自为三阴性(ER/PR/HER2)肿瘤的肿瘤。
在单价抗体构建体打算用于治疗癌症的实施方案中，靶细胞是代表HER2 3+过度表达的癌细胞系，例如SKBR3、BT474。在一个实施方案中，靶细胞是代表HER2低表达的癌细胞系，例如MCF7。在一个实施方案中，靶细胞是代表HER2抗性的癌细胞系，例如JIMT1。在一个实施方案中，靶细胞是代表乳癌三阴性的癌细胞系，例如MDA-MD-231细胞。
在一个实施方案中，根据本发明的单价抗体构建体被设计成靶向乳癌细胞。示例性种类的乳癌细胞包括(但不限于)以下：孕酮受体(PR)阴性和雌激素受体(ER)阴性细胞、低HER 2表达细胞、中HER2表达细胞、高HER2 表达细胞或抗HER2抗体抗性细胞。
在一个实施方案中，本文所述的单价抗体构建体被设计成靶向胃腺癌和食管腺癌。示例性的组织学类型包括：具有肠表型的HER2阳性近端胃癌和 HER2阳性远端弥漫性胃癌。示例性种类的胃癌细胞包括(但不限于)(N-87、 OE-19、SNU-216和MKN-7)。
在另一个实施方案中，本文所述的单价抗体构建体被设计成靶向脑中的转移性HER2+乳癌肿瘤。示例性种类的胃癌细胞包括(但不限于)BT474(如上文关于乳癌)。
抗原的选择
如上文所示，抗原结合多肽构建体结合的抗原是取决于单价抗体构建体打算结合的靶细胞来选择。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体结合的抗原是基于与其它细胞表面相比1)在靶细胞表面上的表达增加或b)在靶细胞表面上的选择性表达来选择。因此，在一个实施方案中，单价抗体构建体被设计成靶向表A1中列出的靶细胞类型之一。
表A1：抗体和各自靶细胞的清单
表A1另外识别可用来靶向所列细胞类型的已知抗体，而且引申开来也识别在所需靶细胞上表达的抗原。举例而言，表A1中的“αCD16a”表示CD16a 的抗体可用来靶向NK细胞和巨噬细胞。在某些实施方案中，本文所述的单价抗体构建体包含源自表A1中所列抗体之一的抗原结合结构域的抗原结合多肽构建体。
在根据本发明的单价抗体构建体被设计成靶向乳癌细胞的实施方案中，抗原结合多肽构建体单价结合在乳癌细胞表面上表达的抗原。合适的抗原包括(但不限于)HER2。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体与靶细胞上的靶抗原的胞外结构域结合的表位。
在单价抗体构建体包含与HER2结合的抗原结合多肽构建体的实施方案中，抗原结合多肽构建体与HER2结合或与HER2的特定结构域或表位结合。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体与HER2的胞外结构域结合。如本领域中已知，HER2抗原包含多个胞外结构域(ECD)。
在一个实施方案中是本文所述的单价抗体构建体，其包含与选自ECD1、 ECD2、ECD3和ECD4的HER2的ECD结合的抗原结合多肽构建体。在另一个实施方案中，单价抗体构建体包含与选自ECD1、ECD2和ECD4的HER2 的ECD结合的抗原结合多肽构建体。在一个实施方案中，单价抗体构建体包含与ECD1结合的抗原结合多肽构建体。在一个实施方案中，单价抗体构建体包含与ECD2结合的抗原结合多肽构建体。在一个实施方案中，单价抗体构建体包含与ECD4结合的抗原结合多肽构建体。在另一个实施方案中，单价抗体构建体包含与选自2C4(例如，OA1-Fab-Her2)、4D5(OA3-scFv-Her2) 和C6.5(OA4-scFv-BID2)的HER2的表位结合的抗原结合多肽构建体。
抗体的选择
在单价抗体构建体包含与HER2结合的抗原结合多肽构建体的实施方案中，抗原结合多肽构建体可以包括Fab片段、scFv和sdab的各种形式源自已知的抗HER2抗体或抗HER2结合结构域。在某些实施方案中，抗原结合多肽构建体可源自这些抗体的人源化或嵌合形式。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体源自曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或其人源化形式的Fab片段。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体源自scFv。所述抗原结合多肽构建体的非限制性实例包括在单价抗体构建体OA3-scFv-Her2和OA4-scFv-BID2中发现的那些。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体源自sdab。
二聚/异源二聚Fc构建体
根据本发明的单价抗体构建体包含二聚Fc多肽构建体，其包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽。在本发明的一个实施方案中，二聚Fc多肽构建体是异源二聚体且包含经过修饰以促使形成异源二聚Fc的单体Fc多肽。在一个实施方案中，单体Fc多肽包含具有促使形成异源二聚Fc结构域的氨基酸修饰的变体CH3结构域。合适的变体CH3结构域在本领域中已知且例如包括在国际专利公布号WO 2012/058768、美国专利号5,821,333、7,695,936 [KiH]中所述的那些。在一个实施方案中，根据本发明的异源多聚体包含IgG FcD构建体，其中所述第一和第二Fc多肽中的一者包含CH3氨基酸修饰 T366L/N390R/K392R/T394W，而另一种Fc多肽包含CH3氨基酸修饰 L351Y/S400E/F405A/Y407V。
尽管本领域中已知诸如scFv、Fab、结构域抗体的单价构建体，但这些单价构建体缺乏对于效应物活性具有活性的Fc结构域。包含不二聚(同源二聚或异源二聚)的Fc单链的单价抗原结合构建体在文献中也是已知的 [Engineering a Monomeric Fc Modality byN-Glycosylation for the Half-Life Extension of Biotherapeutics.Ishino T,WangM,Mosyak L,Tam A,Duan W, Svenson K,Joyce A,O'Hara DM,Lin L,Somers WS,Kriz R.JBiol Chem.2013 年4月24日.PMID:23615911]，但与根据本发明的构建体不同，这些构建体也缺乏依赖于二聚Fc结构域的免疫效应功能性。
用于修饰单体Fc多肽以促使形成异源二聚Fc的其它方法在国际专利公布号WO96/027011(球入洞)中、在Gunasekaran等人(Gunasekaran K.等人 (2010)J BiolChem.285,19637-46,electrostatic design to achieve selectiveheterodimerization)中、在Davis等人(Davis,JH.等人(2010)Prot Eng Des Sel； 23(4):195-202,strand exchange engineered domain(SEED)technology)中和在 Labrijn等人[Efficient generation of stable bispecific IgG1by controlled Fab-armexchange.Labrijn AF,Meesters JI,de Goeij BE,van den Bremer ET,Neijssen J, vanKampen MD,Strumane K,Verploegen S,Kundu A,Gramer MJ,van Berkel PH,van deWinkel JG,Schuurman J,Parren PW.Proc Natl Acad Sci U S A.2013 年3月26日；110(13):5145-50中有所描述。
在一些实施方案中，经修饰的单体Fc多肽还包含如由其熔解温度所测定，使异源二聚Fc多肽构建体的稳定性增加的氨基酸修饰。合适的氨基酸修饰在本领域中已知且例如包括国际专利申请号PCT/CA2012/050780中所述的那些。特定而言，在一个实施方案中，异源二聚Fc多肽构建体包含在两种肽中具有氨基酸修饰T350V的经修饰单体Fc多肽。
在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其包含单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体；和包含变体CH3结构域的二聚Fc多肽构建体。在一些实施方案中，变体CH3结构域包含促使形成与天然同源二聚Fc 区具有相当的稳定性的所述异源二聚体的氨基酸突变。在一些实施方案中，变体CH3结构域具有约70℃或更高的熔解温度(Tm)。在一些实施方案中，变体CH3结构域具有约75℃或更高的熔解温度(Tm)。在选定的实施方案中，变体CH3结构域具有约80℃或更高的熔解温度(Tm)。
在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其包含单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体；和包含CH3结构域的二聚Fc多肽构建体，其中Fc构建体相对于野生型Fc区而言在CH3结构域中不包含另外的二硫键。在某些实施方案中，Fc构建体相对于野生型Fc区而言在变体CH3结构域中包含另外的二硫键，且其中变体CH3结构域具有至少约77.5℃的熔解温度 (Tm)。在具体实施方案中，二聚Fc构建体是以大于约75％的纯度形成的异源二聚Fc构建体。在一些实施方案中，二聚Fc构建体是以大于约80％的纯度形成的异源二聚Fc构建体。在某些实施方案中，二聚Fc构建体是以大于约 90％的纯度形成的异源二聚Fc构建体。在一些其它实施方案中，二聚Fc构建体是以大于约95％的纯度形成的异源二聚Fc构建体。
在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其包含单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体；和相对于不与Fc多肽融合的单价抗原结合多肽而言具有优越的生物物理特性(如稳定性)且易于制造的二聚Fc多肽构建体。
FcRn结合与PK参数
如本领域中已知，与FcRn结合使内吞抗体从核内体循环回血流中(Raghavan等人,1996,Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220；Ghetie等人,2000, Annu Rev Immunol 18:739-766)。此过程与由于全长分子的大尺寸而排除肾脏过滤相结合导致一至三周的有利抗体血清半衰期。Fc与FcRn结合在抗体输送中也具有重要作用。因此，在一个实施方案中，本发明的单价抗体构建体能够结合FcRn。
额外修饰来改善效应功能。
在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其包含单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体；和包含CH3结构域且还包含变体CH2结构域的二聚Fc多肽构建体。在一些实施方案中，变体CH2结构域包含不对称的氨基酸修饰来促使选择性地结合FcγR。在一些实施方案中，变体CH2 结构域使得可以分离和纯化本文所述的分离的单价抗体。
在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其包含单价地结合抗原的抗原结合多肽；且其中抗原结合多肽通过多肽与包含CH2和CH3 结构域的单体Fc多肽融合。
在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其包含单价地结合抗原的抗原结合多肽；且其中抗原结合多肽是Fab，其中Fab的重链通过多肽与包含CH2和CH3结构域的单体Fc多肽融合且Fab的轻链通过多肽与包含CH2和CH3结构域的第二单体Fc多肽融合。
在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其包含单价地结合抗原的抗原结合多肽；且其中抗原结合多肽与包含CH2和CH3结构域的单体Fc多肽及不能结合任何抗原的第二多肽融合；其中第二多肽与包含 CH2和CH3结构域的第二单体Fc多肽融合；其中两个单体Fc多肽配对形成二聚体。
在一些实施方案中，根据本发明的单价抗体构建体可经修饰来改善其效应功能。所述修饰在本领域中已知且包括岩藻糖基化或使抗体的Fc部分的亲和力工程改造为活化受体(对于ADCC而言主要是FCGR3a)和C1q(对于 CDC而言)。下表综述文献中报道的关于效应功能工程改造的不同设计。
因此，在一个实施方案中，单价抗体构建体可包括包含一种或多种如上表中标注的赋予改善的效应功能的氨基酸修饰的二聚Fc多肽构建体。在另一个实施方案中，单价抗体构建体经无岩藻糖基化来改善效应功能。
在需要增加抗原结合多肽构建体对其同源抗原的亲和力的情况下，可使用本领域中已知的方法来增加抗原结合多肽构建体对其抗原的亲和力。所述方法的实例在以下参考文献中描述，Birtalan等人,(2008)JMB 377, 1518-1528；Gerstner等人,(2002)JMB 321,851-862；Kelley等人,(1993) Biochem 32(27),6828-6835；Li等人,(2010)JBC 285(6),3865-3871,和Vajdos 等人,(2002)JMB 320,415-428。
所述方法的一种实例是亲和力成熟。如下描述HER2抗原结合结构域的亲和力成熟的一种示例性方法。使用曲妥珠单抗/HER2(PDB代码1N8Z)复合物和帕妥珠单抗/HER2复合物(PDB代码1S78)的结构进行建模。可采用分子动力学(MD)来评估WT复合物在水性环境中的固有动力学性质。可使用平均场(mean field)和死胡同消除方法(dead-endelimination method)以及柔性骨架来最优化和制备用于将要筛选的突变体的模型结构。装填后将记录多种特征，包括接触密度、撞击分数、疏水性和静电。广义波恩(generalizedBorn) 方法将允许对溶剂环境的作用进行准确建模并计算蛋白质中特定位置突变成替代的残基类型后的自由能差异。接触密度和撞击分数将提供互补性的度量，这是有效蛋白质装填的一个重要方面。筛选程序采用以知识为基础的潜能以及依赖于成对残基相互作用能和熵计算的耦合分析流程。在下表中综述已知增强HER2结合的文献突变及其组合：
表1B.已知对于曲妥珠单抗-HER2系统而言增加与HER2结合的曲妥珠单抗突变。
表1C.已知对于帕妥珠单抗-HER2系统而言增加与HER2结合的帕妥珠单抗突变。
本文所述的单价抗体构建体一经与靶细胞结合即被内化。在一个实施方案中，单价抗体构建体以与相应单特异性二价抗体构建体相比类似的程度内化。在一些实施方案中，单价抗体构建体比相应单特异性二价抗体构建体更有效地内化。
增加的Bmax和KD/结合-解离速率
Bmax在饱和抗体浓度下实现且Kd(抗体的结合与解离速率)有助于 Bmax。具有缓慢结合和快速解离的抗体与具有快速结合和缓慢结合解离速率的抗体相比将具有较低的表观Bmax。对于根据本发明的单价抗体构建体而言，在饱和浓度下且在Bmax不再随FSA增加时，Bmax相对于FSA发生最明确分离。此显著性在非饱和浓度下较小。在一个实施方案中，单价抗体构建体的Bmax和KD/结合-解离速率与单特异性二价抗体构建体相比增加同靶细胞上的靶抗原表达水平无关。在一个实施方案中，当单价抗体构建体包含与HER2结合的抗原结合多肽构建体时，单价抗体构建体的Bmax和KD/结合-解离速率与单特异性二价抗体构建体相比增加同靶细胞上的HER2表达水平无关。
在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述单价抗体构建体与具有两个抗原结合区的相应单特异性二价抗体构建体相比展示出与展示所述抗原的靶细胞的结合密度和Bmax(最大结合)的增加。在一些实施方案中，所述结合密度和Bmax的增加是相应二价抗体构建体的结合密度和Bmax的至少约125％。在某些实施方案中，结合密度和Bmax的增加是相应二价抗体构建体的结合密度和Bmax的至少约150％。在一些实施方案中，结合密度和Bmax的增加是相应二价抗体构建体的结合密度和Bmax的至少约200％。在一些实施方案中，结合密度和Bmax的增加大于相应二价抗体构建体的结合密度和Bmax的约110％。
简单来说，激动性是具有固有活性的药剂与细胞上触发生物化学/生物作用的一些受体结合的结果。已识别多种细胞表面蛋白家族(包括TRK(酪氨酸受体激酶))的激动剂。对于TRK而言，激动剂结合促使触发下游信号传导事件的受体异源二聚化作用。生物作用的程度称为功效。激动性可以通过近端生物化学标记(诸如受体磷酸化)或远端生物标记(诸如细胞增殖)来评估。在MV-L或MV-Int的情形下，某种程度的激动性如果被抗体介导的细胞毒性杀伤MOA克服，就是可以接受的。在MV-Int的情形下，某种程度的激动性可增加内化速率和程度，由此增加MV-Int的胞内水平和用来杀伤细胞的毒性有效负荷的递送。
二价抗体使受体交联和二聚模拟同源激动剂在靶标受体上的作用。交联效率通常与功效相关。在MV-L和MV-Int的情形下，单价结合无法交联FSA 形式的受体。然而，数据显示单价抗体可引发一些激动剂作用，诸如对受体磷酸化或细胞增殖的影响。
在某些实施方案中，本文提供的单价抗体构建体缺乏二价抗体的内置亲合力，且无法在空间上以相同的方式限制两个靶抗原。
优越的功效/生物活性
如本文中所示，本文所述的单价抗体构建体与相应单特异性二价抗体构建体相比展示优越的功效和/或生物活性。根据本发明的单价抗体构建体的功效和/或生物活性的一个非限制性实例由单价抗体构建体抑制靶细胞生长的能力来代表。在一个实施方案中，单价抗体构建体的优越功效和/或生物活性主要是单价抗体构建体的效应功能与单特异性二价抗体构建体相比增加的结果。此类型单价抗体构建体的实例由单价裂解性抗体(MV-L)来代表。
ADCC
增加的效应功能包括ADCC、ADCP或CDC中的至少一种。因此，在一个实施方案中，单价抗体构建体比相应单特异性二价抗体构建体展现ADCC 杀伤细胞的程度更高。根据此实施方案，单价抗体构建体展现ADCC活性比相应单特异性二价抗体构建体增加约1.2至1.6倍之间。在一个实施方案中，单价抗体构建体比相应单特异性二价抗体构建体展现的ADCC杀伤细胞增加约1.3倍。在一个实施方案中，单价抗体构建体比相应单特异性二价抗体构建体展现的ADCC杀伤细胞增加约1.4倍。在一个实施方案中，单价抗体构建体比相应单特异性二价抗体构建体展现的ADCC杀伤细胞增加约1.5倍。
在一个实施方案中，单价抗体构建体包含与HER2结合的抗原结合多肽构建体且展现比相应单特异性二价抗体构建体增加约1.2至1.6倍的ADCC 活性。在一个实施方案中，单价抗体构建体包含与HER2结合的抗原结合多肽构建体且展现比相应单特异性二价抗体构建体增加约1.3倍的ADCC杀伤细胞。在一个实施方案中，单价抗体构建体包含与HER2结合的抗原结合多肽构建体且展现比相应单特异性二价抗体构建体增加约1.5倍的ADCC杀伤细胞。
ADCP
在一个实施方案中，单价抗体构建体比相应单特异性二价抗体构建体展现ADCP杀伤细胞的程度更高。
CDC
在一个实施方案中，单价抗体构建体比相应单特异性二价抗体构建体展现CDC杀伤细胞的程度更高。在一个实施方案中，单价抗体构建体包含与 HER2结合的抗原结合多肽构建体且展现比相应单特异性二价抗体构建体增加约1.5倍的CDC杀伤细胞。
在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述构建体具备具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗体构建体的ADCC、ADCP 和CDC中至少一种的至少约125％。在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述构建体具备具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗体构建体的ADCC、ADCP和CDC中至少一种的至少约150％。在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述构建体具备具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗体构建体的ADCC、ADCP和CDC 中至少一种的至少约300％。
与FcγR的结合能力增加
在一些实施方案中，单价抗体构建体展现与一个或多种FcγR较高的结合能力(Rmax)。在单价抗体构建体包含与HER2结合的抗原结合多肽构建体的一个实施方案中，单价抗体构建体展现与相应单特异性二价抗体构建体相比，与一个或多种FcγR的Rmax增加约1.3至2倍。在单价抗体构建体包含与 HER2结合的抗原结合多肽构建体的一个实施方案中，单价抗体构建体展现与相应单特异性二价抗体构建体相比，与CD16FcγR的Rmax增加约1.3至 1.8倍。在单价抗体构建体包含与HER2结合的抗原结合多肽构建体的一个实施方案中，单价抗体构建体展现与相应单特异性二价抗体构建体相比，与 CD32FcγR的Rmax增加约1.3至1.8倍。在单价抗体构建体包含与HER2结合的抗原结合多肽构建体的一个实施方案中，单价抗体构建体展现与相应单特异性二价抗体构建体相比，与CD64FcγR的Rmax增加约1.3至1.8倍。
对于FcγR的亲和力增加
本文提供的单价抗体构建体与相应二价抗体构建体相比，对于FcγR具有意外增加的亲和力。由装饰导致的Fc浓度增加与ADCC、ADCP、CDC活性增加一致。
在一些实施方案中，单价抗体构建体展现对于一种或多种FcγR的亲和力增加。在单价抗体构建体包含与HER2结合的抗原结合多肽构建体的一个实施方案中，单价抗体构建体展现对于至少一种FcγR的亲和力增加。根据此实施方案，单价抗体构建体展现对于CD32的亲和力增加。
在另一个实施方案中是本文所述的单价抗体构建体，其与相应单特异性二价抗体构建体相比展示内化增加，由此产生优越的功效和/或生物活性。
药物动力学参数
在某些实施方案中，本文提供的单价抗体构建体展现与市售的治疗性抗体相当的药物动力学(PK)特性。在一个实施方案中，本文所述的单价抗体构建体展现就血清浓度、t1/2、β半衰期和/或CL而言与已知治疗性抗体类似的 PK特性。在一个实施方案中，单价抗体构建体展示与所述单特异性二价抗体构建体相当或更大的体内稳定性。所述体内稳定性参数包括血清浓度、t1/2、β半衰期和/或CL。
在一个实施方案中，本文提供的单价抗体构建体显示与相应单特异性二价抗体构建体相比较高的分布体积(Vss)。抗体的分布体积涉及血清或血液的体积(Vp)、组织的体积(VT)和组织与血清的划分(kP)。在线性条件下，在动物或人体中血管内施药后，IgG抗体主要分布到血清区室和血管外流体中。在一些实施方案中，主动输送过程(诸如被新生Fc受体(FcRn)吸收)也影响抗体在其它结合蛋白中的生物分布。
在另一个实施方案中，根据本发明的单价抗体构建体与相应单特异性二价抗体构建体相比显示较高的体积分布(Vss)并以类似的亲和力结合FcRn。
HER2结合构建体
在本文所述的单价抗体构建体的一些实施方案中，二聚Fc多肽构建体是异源二聚体。在一个实施方案中，本文所述的单价抗体构建体被设计成靶向表达HER2的细胞且抗原结合多肽构建体结合HER2。HER2是属于人表皮生长因子受体(EGFR)家族的原癌基因且常在乳癌子集中过度表达。HER2蛋白也作为neu基因、EGFR2、CD340、ErbB2和p185的产物被提到。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2且靶细胞是低、中或高HER2表达细胞。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2且靶细胞是低 HER2表达细胞。在另一个实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2且靶细胞是与二价HER2结合抗体的结合减小的低HER2表达细胞。在另一个实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2且靶细胞是与曲妥珠单抗的结合减小的低HER2表达细胞。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体结合 HER2且靶细胞是癌细胞。在某一实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2且靶细胞是乳癌细胞。
在本文所述的单价抗体构建体的一些实施方案中，二聚Fc多肽构建体是异源二聚的。在所述单价抗体构建体的一些实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2。在一些实施方案中，抗原结合多肽构建体结合至少一个HER2 胞外结构域。在某些实施方案中，胞外结构域是ECD1、ECD2、ECD3和ECD4 中的至少一个。在某些实施方案中，抗原结合多肽构建体结合由作为低、中或高HER2表达细胞的靶细胞表达的HER2。在某些实施方案中，HER2表达细胞展示与二价HER2结合抗体的结合减小。在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体结合HER2且靶细胞是雌激素受体阴性细胞、孕酮受体阴性细胞和与二价HER2结合抗体的结合减小的抗HER2抗体抗性肿瘤细胞中的至少一种。
在本文所述的单价抗体构建体的一些实施方案中，二聚Fc多肽构建体是异源二聚的。在本文所述的单价抗体构建体的某些实施方案中，单价抗原结合多肽构建体是Fab片段、scFv和sdAb、能结合抗原的抗原结合肽或蛋白质结构域。在一些实施方案中提供如本文所述的分离的单价抗体构建体，其中单价抗原结合多肽构建体是包含重链多肽和轻链多肽的Fab片段。
本文提供一种结合HER2的分离的单价抗体构建体，其包含：单价地结合HER2的抗原结合多肽构建体；和包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc 多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽与至少一个来自抗原结合多肽构建体的多肽融合；其中所述抗体构建体是抗增殖性的且由靶细胞内化，其中所述构建体与结合HER2的相应二价抗体构建体相比展示出与在靶细胞上展示的HER2的结合密度和Bmax(最大结合)的增加，且其中所述构建体与所述相应二价HER2结合抗体构建体相比展示较高ADCC、较高 ADCP和较高CDC中的至少一种。
在某些实施方案中提供一种在具有低HER2表达的靶细胞上结合HER2 的分离的单价抗体构建体，其包含：单价地结合HER2的抗原结合多肽构建体；和包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽与至少一个来自抗原结合多肽构建体的多肽融合；其中所述抗体构建体是抗增殖性的且由靶细胞内化，其中所述构建体与结合HER2的相应二价抗体构建体相比展示出与靶细胞上展示的HER2的结合密度和Bmax(最大结合)的增加，且其中所述构建体与所述相应二价HER2 结合抗体构建体相比展示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一种。在某些实施方案中，具有低HER2表达的靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，具有低HER2表达的靶细胞是乳癌细胞。
本文提供一种结合HER2的分离的单价抗体构建体，其包含：在作为ECD 1、ECD 2和ECD 3-4中至少一种的胞外结构域(ECD)上单价地结合HER2的抗原结合多肽构建体；和包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽与至少一个来自抗原结合多肽构建体的多肽融合；其中所述抗体构建体是抗增殖性的且由靶细胞内化，其中所述构建体与结合HER2的相应二价抗体构建体相比展示出与靶细胞上展示的HER2ECD 1、2和3-4中至少一种的结合密度和Bmax(最大结合)的增加，且其中所述构建体与所述相应二价HER3结合抗体构建体相比展示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一种。
本文提供一种结合HER2的分离的单价抗体构建体，其包含：在作为ECD 1、ECD 2、ECD 3和ECD 4中至少一种的胞外结构域(ECD)上单价地结合 HER2的抗原结合多肽构建体；和包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc 多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽与至少一个来自抗原结合多肽构建体的多肽融合；其中所述抗体构建体是抗增殖性的且由靶细胞内化，其中所述构建体与结合HER2的相应二价抗体构建体相比展示出与靶细胞上展示的HER2ECD 1、2、3和4中至少一种的结合密度和Bmax(最大结合)的增加，且其中所述构建体与所述相应二价HER2结合抗体构建体相比展示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一种。
在一个实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中抗体构建体抑制靶细胞增殖。在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述单价HER2结合多肽构建体是Fab、scFv、sdAb或多肽中的至少一种。在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述构建体具备的ADCC、ADCP和CDC中的至少一种比具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗体构建体的程度更高。在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述构建体具备的ADCC、ADCP和CDC中的至少一种至少是具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗体构建体的约105％。在一些实施方案中是本文所述的分离的单价抗体构建体，其中所述构建体具备的ADCC、ADCP和CDC中的至少一种大于具有两个抗原结合多肽构建体的相应二价抗体构建体的约110％。
重组和合成产生抗体构建体的方法：
在某些实施方案中提供一种在稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体的方法，其包括：用以下物质转染至少一种稳定的哺乳动物细胞：编码包含重链可变结构域和第一Fc结构域多肽的第一重链多肽的第一DNA 序列；编码包含第二Fc结构域多肽的第二重链多肽的第二DNA序列，其中所述第二重链多肽无可变结构域；和编码包含轻链可变结构域的轻链多肽的第三DNA序列，以便所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三 DNA序列在所述哺乳动物细胞中以预定比率转染；在至少一种哺乳动物细胞中翻译所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重链和轻链多肽在所述至少一种稳定的哺乳动物细胞中被表达成需要的糖基化单价不对称抗体。在一些实施方案中是本文所述的在稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体的方法，其包括以不同预定比率的所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列转染至少两种不同的细胞，以便两种细胞各自以不同的比率表达重链多肽和轻链多肽。在一些实施方案中是本文所述的在稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体的方法，其包括以包含所述第一、第二和第三DNA序列的多顺反子载体转染至少一种哺乳动物细胞。在一些实施方案中，至少一种哺乳动物细胞选自 VERO、HeLa、HEK、NS0、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7、 Caco-2和MDCK细胞及其子类和变体。
在一些实施方案中是本文所述的在稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体的方法，其中第一DNA序列:第二DNA序列:第三DNA序列的预定比率是约1:1:1。在一些实施方案中，第一DNA序列:第二DNA序列:第三DNA序列的所述预定比率使得翻译的第一重链多肽的量约等于第二重链多肽的量和轻链多肽的量。
在一些实施方案中是本文所述的在稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体的方法，其中至少一种稳定的哺乳动物细胞的表达产物包含与单体重链或轻链多肽或其它抗体相比更大百分比的需要的糖基化单价抗体。
在一些实施方案中是本文所述的在稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体的方法，所述方法包括识别和纯化需要的糖基化单价抗体。在一些实施方案中，所述鉴定是通过液相色谱法和质谱分析法中的一种或两种来进行。
本文提供一种产生具有改善ADCC的抗体构建体的方法，其包括：用以下物质转染至少一种稳定的哺乳动物细胞：编码包含重链可变结构域和第一 Fc结构域多肽的第一重链多肽的第一DNA序列；编码包含第二Fc结构域多肽的第二重链多肽的第二DNA序列，其中所述第二重链多肽无可变结构域；和编码包含轻链可变结构域的轻链多肽的第三DNA序列，以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳动物细胞中以预定比率转染；在至少一种哺乳动物细胞中翻译所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重链和轻链多肽在所述至少一种稳定的哺乳动物细胞中被表达成糖基化单价抗体，其中所述糖基化单价不对称抗体与相应野生型抗体相比具有较高ADCC、CDC和ADCP中的至少一种。
在某些实施方案中是从酵母、诸如细菌的微生物、或人或动物细胞系分泌的以重组分子形式产生的抗体构建体。在实施方案中，多肽是从宿主细胞分泌的。
实施方案包括细胞，诸如经转化来表达本文所述的异源多聚体蛋白质的酵母细胞。除了转化的宿主细胞本身以外，还提供那些细胞在营养培养基中的培养物，优选的是单克隆(均质克隆的)培养物或源自单克隆培养物的培养物。如果分泌多肽，培养基就将含有多肽，含细胞或不含细胞(如果已被滤除或离心掉)。已知且可使用多种表达系统，包括细菌(例如大肠杆菌(E.coli) 和枯草杆菌(Bacillus subtilis))、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)和毕赤酵母(Pichia pastoris))、丝状真菌(例如曲霉属真菌)、植物细胞、动物细胞和昆虫细胞。
本文所述的抗体构建体以常规方式产生，例如从插在宿主染色体中或游离质粒上的编码序列产生。酵母通过任何常用方式(例如电穿孔)经所需要蛋白质的编码序列转化。通过电穿孔转化酵母的方法在Becker&Guarente (1990)Methods Enzymol.194,182中公开。
成功转化的细胞(即，含有本发明的DNA构建体的细胞)可以通过熟知的技术来鉴定。例如，由引入表达构建体而产生的细胞可以生长来产生需要的多肽。可以收获细胞并使其溶解，且使用诸如Southern(1975)J.Mol.Biol.98, 503或Berent等人,(1985)Biotech.3,208所述的方法来检查细胞的DNA内容物是否存在DNA。或者，可使用抗体来检测上清液中是否存在蛋白质。
适用的酵母质粒载体包括pRS403-406和pRS413-416且一般是可得的。质粒pRS403、pRS404、pRS405和pRS406是酵母基因组整合质粒(YIp)且合并有酵母可选性标记HIS3、7RP1、LEU2和URA3。质粒pRS413-416是酵母着丝粒质粒(Ycp)。
已开发各种方法通过互补的粘性末端使DNA与载体操作性地连接。举例而言，可以向DNA区段中加入互补的均聚物束来插在载体DNA中。载体和 DNA区段然后通过互补均聚尾端之间的氢键接合而形成重组DNA分子。
含有一个或多个限制位点的合成连接子提供一种使DNA区段与载体接合的替代方法。由核酸内切酶限制消化产生的DNA区段用噬菌体T4DNA 聚合酶或大肠杆菌DNA聚合酶1进行处理，这些酶以其3'5'-核酸外切活性除去突出的_单链末端并以其聚合活性填充凹陷的3'-末端。
因此，这些活性组合产生平端的DNA区段。然后在能催化平端DNA分子连接的酶(诸如噬菌体T4DNA连接酶)存在下使这些平端区段与大摩尔过量的连接子分子孵育。因此，反应产物是在其末端带有聚合连接子序列的 DNA区段。然后用适当的限制酶裂解这些DNA区段并与已用产生与DNA 区段的末端相容的末端的酶裂解的表达载体连接。
含有各种限制核酸内切酶位点的合成连接子可从多种来源商购。
所涵盖的在本发明的实践中适合作为用于表达白蛋白、融合蛋白的宿主的示例性酵母属是毕赤酵母属(早前分类为汉逊酵母属(Hansenula))、酵母属 (Saccharomyces)、克鲁维酵母属、曲霉属真菌、假丝酵母属(Candida)、球拟酵母属(Torulopsis)、有孢圆酵母属(Torulaspora)、裂殖酵母属 (Schizosaccharomyces)、固囊酵母属(Citeromyces)、管囊酵母属(Pachysolen)、接合酵母属(Zygosaccharomyces)、德巴里酵母属(Debaromyces)、木霉属 (Trichoderma)、头孢霉属(Cephalosporium)、腐质霉属(Humicola)、毛霉属 (Mucor)、脉孢菌(Neurospora)、耶氏酵母属(Yarrowia)、梅奇酵母属 (Metschunikowia)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、白冬孢酵母属 (Leucosporidium)、葡状子囊菌属(Botryoascus)、锁孢酵母属(Sporidiobolus)、拟内孢霉属(Endomycopsis)等等。优选的属是选自酵母属、裂殖酵母属、克鲁维酵母菌属、毕赤酵母属和有孢圆酵母属的那些属。酵母属的实例是酿酒酵母(S.cerevisiae)、意大利酵母(S.italicus)和鲁氏酵母(S.rouxii)。
克鲁维酵母菌属的种的实例是脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)。合适的有孢圆酵母属物种是德布尔有孢酵母(T.delbrueckii)。毕赤酵母(汉逊酵母)的种的实例是安格斯毕赤酵母(P.angusta)(以前是多形汉逊酵母(H.polymorpha))、异常毕赤酵母(P.anomala)(以前是异常汉逊酵母(H.anomala))和巴斯德毕赤酵母(P. pastoris)。酿酒酵母的转化方法一般在EP 251744、EP 258067和WO 90/01063 中教导，它们全部以引用的方式并入本文中。
提供含有编码本文所述的抗体构建体蛋白质的多核苷酸的载体、宿主细胞和通过合成与重组技术生产异源多聚体蛋白质。载体例如可以是噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以是具有复制能力的或具有复制缺陷的。在后者情形中，一般只在互补宿主细胞中发生病毒繁殖。
在某些实施方案中，使编码本文所述的抗体构建体的多核苷酸与含有用于在宿主中繁殖的可选标记的载体相连接。一般将质粒载体引入沉淀物(诸如磷酸钙沉淀物)中或引入与带电脂质的复合物中。如果载体是病毒，就可使用适当包装细胞系将其进行体外包装，然后转导至宿主细胞中。
在某些实施方案中，使多核苷酸插入物与适当启动子(诸如噬菌体λPL 启动子、大肠杆菌lac、trp、phoA和rac启动子、SV40早期和晚期启动子及逆转录病毒LTR的启动子(仅举几例)可操作性连接。其它合适的启动子将为本领域技术人员所知。表达构建体将还含有转录起始位点、转录终止位点，且在转录区中还含有用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的转录物的编码部分将优选地包括开始处的翻译起始密码子和适当地位于待翻译多肽末端的终止密码子(UAA、UGA或UAG)。
如所示，表达载体将优选地包括至少一个可选标记。这些标记包括二氢叶酸还原酶、G418、谷氨酰胺合酶或对真核细胞培养物具有抗性的新霉素以及用于在大肠杆菌和其它细菌中培养的四环素、卡那霉素或氨苄西林抗性基因。适当宿主的代表性实例包括(但不限于)细菌细胞，诸如大肠杆菌、链霉菌属和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞，诸如酵母细胞(例如，酿酒酵母或毕赤酵母(ATCC登录号201178))；昆虫细胞，诸如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞；动物细胞，诸如CHO、COS、NSO、293和人黑素瘤细胞；和植物细胞。用于上述宿主细胞的适当培养基和条件在本领域中已知。
优选用于细菌中的载体包括pQE70、pQE60和pQE-9，可获自QIAGEN, Inc.；pBluescript载体、Phagescript载体、pNH8A、pNH16a、pNH18A；pNH46A，可获自StratageneCloning Systems,Inc.；和ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、 pDR540、pRIT5，可获自Pharmacia Biotech,Inc。优选的真核载体是pWLNEO、 pSV2CAT、pOG44、pXT1和pSG，可获自Stratagene；和pSVK3、pBPV、 pMSG和pSVL，可获自Pharmacia。用于酵母系统的优选表达载体包括(但不限于)pYES2、pYD1、pTEF1/Zeo、pYES2/GS、pPICZ、pGAPZ、pGAPZalph、 pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2、pHIL-S1、pPIC3.5K、pPIC9K和PAO815(全部可获自Invitrogen,Carlbad,CA)。其它合适的载体将为本领域技术人员显而易见。
在一个实施方案中，编码本文所述的抗体构建体的多核苷酸与将指导本发明的蛋白质定位于原核或真核细胞的特定区室和/或指导从原核或真核细胞分泌本发明的蛋白质的信号序列融合。举例而言，在大肠杆菌中，可能希望将蛋白质的表达导向周质空间。抗体构建体与其融合以将多肽的表达导向细菌的周质空间的信号序列或蛋白质(或其片段)的实例包括(但不限于) pelB信号序列、麦芽糖结合蛋白(MBP)信号序列、MBP、ompA信号序列、周质大肠杆菌热不稳定的肠毒素B-亚单位的信号序列和碱性磷酸酶的信号序列。可商购用于构建指导蛋白质定位的融合蛋白的几种载体，诸如可获自New England Biolabs的pMAL系列载体(尤其是pMAL-.rho系列)。在一个具体实施方案中，本发明的多核苷酸白蛋白融合蛋白可与pelB果胶裂解酶信号序列融合以增加所述多肽在革兰氏阴性细菌中的表达和纯化效率。参见美国专利号5,576,195和5,846,818，其内容全部以引用的方式并入本文中。
与抗体构建体融合来指导其在哺乳动物细胞中分泌的信号肽的实例包括 (但不限于)MPIF-1信号序列(例如，GenBank登录号AAB51134的氨基酸 1-21)、斯钙素信号序列(MLQNSAVLLLLVISASA)和共有信号序列 (MPTWAWWLFLVLLLALWAPARG)。可结合杆状病毒表达系统使用的合适的信号序列是gp67信号序列(例如，GenBank登录号AAA72759的氨基酸 1-19)。
使用谷氨酰胺合酶(GS)或DHFR作为可选标记的载体可分别在药物氨基亚砜蛋氨酸或甲氨喋呤的存在下扩增。基于谷氨酰胺合酶的载体的优势在于具有谷氨酰胺合酶阴性的细胞系(例如，鼠骨髓瘤细胞系，NSO)的可用性。谷氨酰胺合酶表达系统也可以通过提供另外的抑制剂防止内源基因的功能而在谷氨酰胺合酶表达细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中起作用。谷氨酰胺合酶表达系统及其组分在以下PCT公布中详述：WO87/04462；WO86/05807；WO89/10036；WO89/10404；和WO91/06657，其都以全文引用的方式并入本文中。另外，谷氨酰胺合酶表达载体可以从Lonza Biologies, Inc.(Portsmouth,N.H.)获得。在鼠骨髓瘤细胞中使用GS表达系统表达和产生单克隆抗体在Bebbington等人,Bio/technology 10:169(1992)和Biblia and Robinson Biotechnol.Prog.11:1(1995)中进行描述，它们以引用的方式并入本文中。
本文提供一种包含编码本文所述的分离的单价抗体构建体的核酸的宿主细胞。在某些实施方案中是本文所述的宿主细胞，其中编码抗原结合多肽构建体的核酸与编码Fc构建体的核酸存在于单一载体中。
本文提供一种制备本文所述的分离的单价抗体构建体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)培养包含编码抗体构建体的核酸的宿主细胞；和(b)从宿主细胞培养物回收抗体构建体。
还提供含有本文所述的载体构建体的宿主细胞，且另外还提供含有使用本领域中已知的技术与一种或多种异源控制区(例如，启动子和/或增强子) 可操作连接的核苷酸序列的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核细胞，诸如哺乳动物细胞(例如，人衍生细胞)或低等真核细胞，诸如酵母细胞，或宿主细胞可以是原核细胞，诸如细菌细胞。可选择调节插入的基因序列表达或以所需的特定方式修饰和加工基因产物的宿主菌株。来自某些启动子的表达在某些诱导物的存在下可提高；因此可控制基因工程改造多肽的表达。此外，不同的宿主细胞具有用于翻译和翻译后加工和修饰(例如，磷酸化、裂解) 蛋白质的特征和特异性机制。可选择适当的细胞系来确保对表达的外源蛋白质所需要的修饰和加工。
可以通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖苷介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其它方法来实现将本发明的核酸和核酸构建体引入宿主细胞中。所述方法在许多标准实验室手册里有描述，诸如Davis等人,Basic Methods In Molecular Biology(1986)。特别设想本发明的多肽实际上可由缺乏重组载体的宿主细胞来表达。
除了涵盖本文中论述的含有载体构建体的宿主细胞以外，本发明还涵盖脊椎动物起源的，特别是哺乳动物起源的原代、继代和永生化宿主细胞，它们经工程改造以删除或置换内源遗传物质和/或包含遗传物质。与内源多核苷酸可操作连接的遗传物质可激活、改变和/或扩增内源多核苷酸。
另外，本领域已知的技术可用于通过同源重组使异源多核苷酸和/或异源控制区(例如，启动子和/或增强子)与编码治疗性蛋白的内源多核苷酸序列可操作连接(参见例如，1997年6月24日颁布的美国专利号5,641,670；国际公布号WO 96/29411；国际公布号WO94/12650；Koller等人,Proc.Natl. Acad.Sci.USA 86:8932-8935(1989)；和Zijlstra等人,Nature 342：435-438 (1989)，每一篇的公开内容全部以引用的方式并入本文中)。
本文所述的抗体构建体可以通过众所周知的方法从重组细胞培养物回收和纯化，这些方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水性相互作用色谱法、亲合色谱法、羟磷灰石色谱法、疏水性电荷相互作用色谱法和凝集素色谱法。最优选的是采用高效液相色谱法(“HPLC”)进行纯化。
在某些实施方案中，本发明的异源多聚体蛋白使用阴离子交换色谱法来纯化，包括(但不限于)在Q-琼脂糖、DEAE琼脂糖、poros HQ、poros DEAF、 Toyopearl Q、ToyopearlQAE、Toyopearl DEAE、Resource/SourceQ和DEAE、 Fractogel Q和DEAE柱上进行的色谱法。
在具体实施方案中，本文所述的蛋白质使用阳离子交换色谱法来纯化，包括(但不限于)SP-琼脂糖、CM琼脂糖、poros HS、poros CM、Toyopearl SP、 Toyopearl CM、Resource/Source S和CM、Fractogel S和CM柱及其等效物和可比物。
另外，本文所述的抗体构建体可以使用本领域中已知的技术来化学合成 (例如参见，Creighton,1983,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H. Freeman&Co.,N.Y和Hunkapiller等人,Nature,310:105-111(1984))。举例而言，对应于多肽片段的多肽可以通过使用肽合成器来合成。此外，如果需要，非典型的氨基酸或化学氨基酸类似物可以作为取代或添加被引入多肽序列中。非典型的氨基酸包括(但不限于)常见氨基酸的D-异构体、2,4二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸、设计氨基酸(诸如β-甲基氨基酸)、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和一般而言的氨基酸类似物。此外，氨基酸可以是D(右旋的)或L(左旋的)。
单价抗体构建体的检验。FcγR、FcRn和C1q结合
根据本发明的单价抗体构建体与相应单特异性二价抗体构建体相比展现增强的效应功能。单价抗体构建体的效应功能可如下进行检验。可进行体外和/或体内细胞毒性测定来评估ADCP、CDC和/或ADCC活性。举例而言，可进行Fc受体(FcR)结合测定来测量FcγR结合。用于介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。造血细胞上的FcR表达概括在Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991) 第464页上的表3中。用于评估所关注分子的ADCC活性的体外测定的一个实例在美国专利号5,500,362或5,821,337中有描述。适用于所述测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。或者，或另外，可以体内评估所关注分子的ADCC活性，例如在如Clynes等人,PNAS(USA) 95:652-656(1998)中公开的动物模型中。也可以进行C1q结合测定来确定单价抗体构建体是否能结合C1q并因此活化CDC。为了评估补体活化，可进行如Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述的CDC分析。也可以使用本领域中熟知的方法来进行诸如通过SPR的FcRn结合和对抗体的体内PK测定。
生物和治疗用途：
在某些实施方案中，在测定中使用本文所述的构建体来检验一种或多种生物活性。如果构建体在特定的分析中展现活性，在与生物活性相关的疾病中就可能涉及抗体构建体所包含的抗原结合构建体。因此，构建体可用于治疗相关疾病。
在某些实施方案中是本文所述的单价抗体构建体用于制造用以抑制抗原分子多聚的药物的用途。在某些实施方案中是单价抗体构建体用于抑制抗原与其同源结合配偶体结合的用途。
在某些实施方案中，提供一种治疗疾病或病症的方法，其包括向需要所述治疗、预防或改善的患者施用有效治疗、预防或改善疾病或病症的量的本文所述的抗体构建体。
在某些实施方案中，本文所述的抗体构建体用于诊断、预后、预防和/或治疗内分泌系统的疾病和/或病症。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体用于诊断、预后、预防和/或治疗神经系统的疾病和/或病症。
在某些实施方案中，本文所述的抗体构建体用于诊断、预后、预防和/或治疗免疫系统的疾病和/或病症。在某些实施方案中，本文所述的抗体构建体用于诊断、预后、预防和/或治疗呼吸系统的疾病和/或病症。
在某些实施方案中，本文所述的抗体构建体用于诊断、预后、预防和/或治疗心血管系统的疾病和/或病症。在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体用于诊断、预后、预防和/或治疗生殖系统的疾病和/或病症。
在某些实施方案中，本文所述的抗体构建体用于诊断、预后、预防和/或治疗消化系统的疾病和/或病症。在某些实施方案中，本文所述的抗体构建体用于诊断、预后、预防和/或治疗与血液有关的疾病或病症。
在一些实施方案中，本文所述的抗体构建体和/或编码本文所述的抗体构建体的多核苷酸用于诊断、检测和/或治疗与包括(但不限于)激素原活化、神经递质活性、细胞信号传导、细胞增殖、细胞分化和细胞迁移的活性相关的疾病和/或病症。
在一个方面，本文所述的抗体构建体是针对基于抗体的疗法，其涉及向患者施用抗体构建体用于治疗一种或多种所公开的疾病、病症或病况。本文所述的治疗化合物包括(但不限于)本文所述的抗体构建体、编码本文所述的抗体构建体的核酸。
在一个具体实施方案中是基于抗体的疗法，其涉及向患者施用包含至少抗体的片段或变体的本文所述的抗体构建体用于治疗一种或多种疾病、病症或病况，包括(但不限于)：神经障碍、免疫系统障碍、肌肉失常、生殖障碍、肠胃失调、肺病症、心血管病症、肾病症、增殖性病症和/或癌性疾病和病况和/或如本文其它处所述。
包含至少抗体的片段或变体的本文所述的抗体构建体可单独或与其它类型的治疗(例如，辐射疗法、化学疗法、激素疗法、免疫疗法和抗肿瘤剂) 组合施用。一般优选的是施用与患者相同物种的物种来源或物种反应性(在抗体的情形下)的产物。因此，在一个实施方案中，向人患者施用人抗体、片段衍生物、类似物或核酸用于治疗或预防。
还提供一种治疗患者的感染性疾病的方法，所述方法包括向患者施用治疗有效量的本文所述的单价抗体构建体。在某些实施方案中，感染性疾病由病毒剂引起。在某些实施方案中，感染性疾病由细菌剂或真菌剂引起。可以通过提供一定量的本文所述的单价抗体构建体来治疗的细菌剂包括且不限于：白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、大肠杆菌、链球菌、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、产后梭状芽胞杆菌(C.parvum)、万古霉素抗性肠球菌(vancomycin-resistant enterococcus)、甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistant S.aureus)和其它。可以通过提供一定量的本文所述的单价抗体构建体来治疗的病毒剂包括(但不限于)：流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)A群、巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、狂犬病、牛痘、水疱性口炎病毒(VZV)、HIV、WNV、SAR。可以通过提供一定量的本文所述的单价抗体构建体来治疗的真菌剂包括(但不限于)：隐球菌脑膜炎、新型隐球菌(CN)、荚膜组织胞浆菌(HC)。
提供一种用于检测个体中所关注的生物标记的存在的试剂盒，所述试剂盒包含(a)本文所述的分离的单价抗体构建体；和(b)使用说明书。在某些实施方案中是用于检测HER2及其可溶性ECD中至少一种的试剂盒，所述试剂盒包含(a)本文所述的分离的单价HER2结合抗体构建体；和(b)使用说明书。在一些实施方案中是一种用于确定HER2及其可溶性ECD中至少一种的浓度的试剂盒，所述试剂盒包含(a)本文所述的分离的单价HER2结合抗体构建体；和(b)使用说明书。
癌症的治疗
本文提供本文所述的单价抗体构建体用于制造用以治疗癌症的药物的用途。还提供本文所述的单价抗体构建体用于制造用于免疫系统障碍的药物的用途。在某些实施方案中是本文所述的单价抗体构建体用于制造用以抑制肿瘤生长的药物的用途。在某些实施方案中是本文所述的单价抗体构建体用于制造用以使肿瘤萎缩的药物的用途。
本文提供本文所述的单价HER2结合抗体构建体用于制造用以治疗癌症的药物的用途。在某些实施方案中，癌症是低HER2表达癌症。在某些实施方案中，癌症对用二价HER2抗体治疗具有抗性。本文提供本文所述的单价 HER2结合抗体构建体用于制造用以治疗对用曲妥珠单抗治疗具有抗性的癌症的药物的用途。
在一个实施方案中，本文所述的单价抗体构建体用于治疗癌症。在一个实施方案中，本文所述的包含HER2结合多肽构建体的单价抗体构建体适用于治疗与HER功能障碍(包括HER1功能障碍、HER2功能障碍、HER3功能障碍和/或HER4功能障碍)相关的癌症或任何增殖性疾病。在某些实施方案中，癌症是乳癌、胃癌、脑癌、肺癌或至少一种类型癌瘤中的至少一种。
在一个实施方案中，本文所述的HER2结合单价抗体构建体用于治疗乳癌细胞。在某些实施方案中，HER2结合单价抗体构建体用于制备用以向罹患乳癌的个体施用的药物组合物。在一些实施方案中是通过向个体提供有效量的至少一种本文所述的HER2结合单价抗体构建体来治疗所述个体的乳癌。
在一个实施方案中，本文所述的HER2结合单价抗体构建体用于治疗对目前的抗HER2疗法具有部分反应的患者。在一个实施方案中，本文所述的 HER2结合单价抗体构建体用于治疗对目前的抗HER2疗法具有抗性的患者。在另一个实施方案中，本文所述的HER2结合单价抗体构建体用于治疗正对目前的抗HER2疗法发展抗性的患者。
在一个实施方案中，本文所述的HER2结合单价抗体构建体适用于治疗对目前的抗HER2疗法无反应的患者。在某些实施方案中，这些患者罹患三阴性癌症。在一些实施方案中，三阴性癌症是雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR) 和Her2的基因具有低表达至可忽视的表达的乳癌。在某些其它实施方案中，任选地与一种或多种目前的抗HER2疗法组合向对目前的抗HER2疗法无反应的患者提供本文所述的HER2结合单价抗体构建体。在一些实施方案中，目前的抗HER2疗法包括(但不限于)抗HER2或抗HER3单特异性二价抗体、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、T-DM1、双特异性HER2/HER3scFv或其组合。在一个实施方案中，本文所述的单价抗体构建体用于治疗对单独或组合的曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、T-DM1、抗HER2或抗HER3无反应的患者。
在一个实施方案中，包含结合HER2的抗原结合多肽构建体的HER2结合单价抗体构建体可用于治疗患有转移性乳癌的患者。在一个实施方案中， HER2结合单价抗体适用于治疗患有局部晚期或晚期转移性乳癌的患者。在一个实施方案中，HER2结合单价抗体适用于治疗患有难治性乳癌的患者。在一个实施方案中，在患者进行前述抗HER2疗法时，向所述患者提供HER2 结合单价抗体用于治疗转移性乳癌。在一个实施方案中，本文所述的HER2 结合单价抗体可用于治疗患有三阴性乳癌的患者。在一个实施方案中，本文所述的HER2结合单价抗体用于治疗患有晚期、难治性HER2扩增的调蛋白阳性癌症的患者。
提供将与其它已知的疗法组合施用来治疗癌症的HER2结合单价抗体构建体。根据此实施方案，单价抗体构建体可与其它单价抗体构建体或具有非重叠结合靶标表位的多价抗体组合施用以使Bmax和抗体依赖性的细胞毒性活性显著增加高于FSA。举例而言，根据本发明的单价抗HER2抗体可如下组合施用：1)单价抗体构建体，诸如OA1-Fab-Her2(基于赫塞汀)与OA5-Fab-Her2(基于帕妥珠单抗)组合；2)OA1-Fab-Her2和/或OA5-Fab-Her2 与西妥昔单抗(cetuximab)二价EGFR抗体组合；和3)针对相同靶细胞上的相同和不同表面抗原的非竞争性抗体的多个组合。在某些实施方案中，本文所述的单价抗体构建体与选自HerceptinTM、TDM1、无岩藻糖基化抗体或Perjeta 的疗法组合施用来治疗患有晚期HER2扩增的调蛋白阳性乳癌的患者。在某一实施方案中，本文所述的单价抗体构建体与HerceptinTM或Perjeta组合施用于患有远端食管、胃食管(GE)连接部和胃部HER2表达癌症的患者。
基因疗法：
在一个具体实施方案中，施用包含编码本文所述的抗体构建体的序列的核酸通过基因疗法来治疗、抑制或预防与蛋白质的异常表达和/或活性相关的疾病或病症。基因疗法是指通过对具有表达或可表达核酸的受治疗者施药所进行的治疗。在本发明的此实施方案中，核酸产生其介导治疗作用的编码蛋白。可使用本领域中可用的任何基因疗法方法。
治疗性/预防性施用和组合物
提供通过对受治疗者施用有效量的本文所述的抗体构建体或药物组合物来进行治疗、抑制和预防的方法。在一个实施方案中，抗体构建体基本上经纯化(例如，基本上不含限制其作用或产生不需要的副作用的物质)。在某些实施方案中，受治疗者是动物，包括(但不限于)诸如奶牛、猪、马、鸡、猫、狗等的动物，且在某些实施方案中是哺乳动物，且最优选的是人。
各种递送系统是已知的并且可用来施用本文所述的抗体构建体制剂，例如封装在脂质体、微粒、微胶囊、能表达化合物的重组细胞中、受体介导的内吞作用(参见例如，Wu和Wu,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))、构建核酸作为逆转录病毒或其它载体的一部分等。引入方法包括(但不限于)皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。化合物或组合物可通过任何方便的途径施用，例如通过输注或推注、通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身性或局部的。另外，在某些实施方案中，需要通过任何合适的途径向中枢神经系统中引入本文所述的抗体构建体组合物，所述途径包括心室内和鞘内注射；通过例如与贮器(诸如奥马耶贮器(Ommaya reservoir))相连的心室内导管可以促进心室内注射。也可以采用肺部施药，例如通过使用吸入器或雾化器以及含烟雾剂的制剂。
在一个具体实施方案中，希望在需要治疗的区域局部施用本文所述的抗体构建体或组合物；这可以通过下列方法实现，所述方法例如且不限于通过在手术期间局部输注、例如在手术后与伤口敷料结合局部涂覆、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入物，所述植入物是多孔的、无孔的或凝胶状的材料，包括膜(诸如硅橡胶膜)或纤维。优选的是在施用本发明的蛋白质(包括抗体)时，必须谨慎使用蛋白质不吸附的材料。
在另一个实施方案中，可以在囊泡，尤其是脂质体中递送抗体构建体或组合物(参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treat等人,在Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(编), Liss,New York,第353-365页(1989)；Lopez-Berestein,ibid.,第317-327页；一般参见同上)。
在又一个实施方案中，可以在控释系统中递送抗体构建体或组合物。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，前文；Sefton,CRC Crit.Ref. Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等人,Surgery 88:507(1980)；Saudek等人,N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一个实施方案中，可使用聚合材料 (参见Medical Applications ofControlled Release,Langer和Wise(编),CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design and Performance,Smolen和Ball(编),Wiley,New York(1984)；Ranger 和Peppas,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)；还参见Levy 等人,Science 228:190(1985)；During等人,Ann.Neurol.25:351(1989)；Howard 等人,J.Neurosurg.71:105(1989))。在又一个实施方案中，控释系统可接近治疗靶标(例如，脑部)放置，因此只需要全身剂量的一部分(参见例如，Goodson, 在Medical Applications of Controlled Release中，增刊，第2卷，第115-138 页(1984))。
在一个包含编码本文所述的抗体构建体的核酸的具体实施方案中，核酸可以通过将其构建成适当核酸表达载体的一部分并施用从而使其变成细胞内的来体内施用以促进其编码的蛋白质的表达，例如通过使用逆转录病毒载体 (参见美国专利号4,980,286)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic，Dupont)，或用脂质或细胞表面受体或转染剂涂布，或通过将其与已知进入核的同源异型框样肽连接施用(参见例如，Joliot等人,Proc. Natl.Acad.Sci.USA 88:1864-1868(1991))等。或者，通过同源重组，核酸可以被引入细胞内且并入宿主细胞DNA中以供表达。
在某些实施方案中，本文所述的单臂单价抗体构建体以与具有非重叠结合靶标表位的其它单臂单价或多价抗体组合的形式施用。
本文还提供药物组合物。所述组合物包含治疗有效量的化合物和药学上可接受的载剂。在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受”意思是经联邦或州政府管理机构批准的或在美国药典或其他普遍公认的药典中列出的用于动物且更具体而言用于人的。术语“载剂”是指稀释剂、佐剂、赋形剂或用其施用治疗剂的媒介物。所述药物载剂可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当药物组合物经静脉内施用时，水是优选的载剂。也可以采用盐水溶液和右旋糖与甘油水溶液作为液体载剂，尤其用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。需要时，组合物还可含有少量湿润剂或乳化剂或pH 缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、散剂、持续释放制剂等的形式。组合物可配制成含传统的粘合剂和载剂(诸如甘油三酯)的栓剂。口服制剂可包括标准载剂，诸如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适药物载剂的实例由E.W. Martin在“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述。所述组合物将含有治疗有效量的优选纯化形式的化合物以及合适量的载剂，从而提供适合对患者施用的形式。制剂应适合施药模式。
在某些实施方案中，将包含抗体构建体的组合物根据常规程序配制成适合对人静脉内施用的药物组合物形式。用于静脉内施用的组合物通常是在无菌等张水性缓冲剂中的溶液。必要时，组合物还可以包括溶解剂和局部麻醉剂(诸如利诺卡因(lignocaine))以减轻注射部位的疼痛。这些成分一般独立供应或一起混合于单位剂型中，例如在诸如安瓿或药囊的指示活性剂的量的密封容器中的干燥冻干粉末或无水浓缩物形式。当组合物将通过输注施用时，可以用含有无菌药物级别的水或盐水的输注瓶进行分配。当组合物通过注射施用时，可提供一安瓿无菌注射用水或盐水以便这些成分可在施用之前混合。
在某些实施方案中，本文所述的组合物被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与诸如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐和与诸如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等的阳离子形成的盐。
本文所述的组合物对于治疗、抑制和预防与治疗性蛋白的异常表达和/或活性相关的疾病或病症有效的量可以通过标准临床技术来确定。另外，可任选地采用体外测定以有助于鉴定最佳的剂量范围。制剂中采用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重性，且应根据执业医师的判断和每个患者的情况来决定。由来自体外或动物模型检验系统的剂量-响应曲线来外推有效剂量。
与药物分子偶联：
在某些实施方案中是一种包含与药物分子偶联的本文所述的单价抗体构建体的药物组合物。在某些实施方案中，至少一种药物分子是治疗剂。在某些实施方案中，药物分子是毒素。在某些实施方案中，药物分子是抗原类似物。在一个实施方案中，药物分子是天然产物、其类似物或前药。
在某些实施方案中，药物分子是生物分子。在一个实施方案中，药物分子是天然或合成核酸。在一些实施方案中，至少一种药物分子是DNA、PNA 和/或RNA低聚物中的一种或多种。
治疗性或预防性活性的证明：
本文所述的抗体构建体或药物组合物在用于人之前经体外检验、然后经体内检验所需要的治疗或预防活性。举例而言，证明化合物或药物组合物的治疗性或预防性用途的体外测定包括化合物对细胞系或患者组织样本的作用。化合物或组合物对细胞系和/或组织样本的作用可利用本领域技术人员已知的技术来确定，所述技术包括(但不限于)花环形成测定(rosette formation assay)和细胞溶解测定。根据本发明，可用来确定是否指示施用特定化合物的体外测定包括体外细胞培养物测定，其中患者的组织样本在培养物中生长且暴露于或另外施用的抗体构建体，并观察所述抗体构建体对组织样本的作用。
提供在翻译期间或之后被不同修饰的抗体构建体，例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、由已知保护基/阻断基衍生、蛋白水解裂解、与抗体分子或其它细胞配体连接等。可以通过已知技术进行任何多种化学修饰，所述技术包括(但不限于)由溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、 V8蛋白酶、NaBH4特异性地化学裂解；乙酰化、甲酰化、氧化、还原；在衣霉素存在下代谢合成等。
本文涵盖的其它翻译后修饰例如包括N连接或O连接的碳水化合物链、加工N末端或C末端、化学部分连接至氨基酸骨架、化学修饰N连接或O 连接的碳水化合物链和由于原核宿主细胞表达而添加或缺失N端蛋氨酸残基。用诸如酶标记、荧光标记、同位素标记或亲和力标记的可检测标记来修饰抗体构建体以便可检测并分离蛋白质。
合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素生物素和亲和素/生物素；合适的荧光材料的实例包括伞形花内酯、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明(rhodamine)、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母素；且合适的放射性材料的实例包括碘、碳、硫、氚、铟、锝、铊、镓、钯、钼、氙、氟。
在具体的实施方案中，抗体构建体或其片段或变体连接至与射电金属离子缔合的大环螯合剂。
如上文提到的，本文所述的抗体构建体通过天然过程(诸如翻译后加工) 或通过本领域中熟知的化学修饰技术进行修饰。应了解，在给定多肽的数个位点可以存在相同或不同程度的同一类型的修饰。本发明的多肽例如由于泛素化而可以分枝，而且可以是有分枝或无分枝的环状。环状、分枝和分枝环状多肽可以来自翻译后的天然过程或可由合成方法制得。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物的、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、十四烷基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、转移RNA介导的在蛋白上添加氨基酸，诸如精氨酰化和泛素化。(参见例如，PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES,第2版，T.E.Creighton,W.H.Freeman和 Company,New York(1993)；POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS,B.C.Johnson编,Academic Press,New York, 第1-12页(1983)；Seifter等人,Meth.Enzymol.182:626-646(1990)；Rattan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(1992))。
在某些实施方案中，抗体构建体也可以连接至固体支持物，其尤其适用于本发明的白蛋白融合蛋白所结合的、与之结合的、或与之缔合的多肽的免疫分析或纯化。所述固体支持物包括(但不限于)玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
本文还提供抗体构建体的化学修饰衍生物，它们可提供其它优点，诸如多肽的溶解性、稳定性和循环时间增加，或免疫原性降低(参见美国专利号 4,179,337)。用于衍生的化学部分可选自水溶性聚合物，诸如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖酐、聚乙烯醇等。蛋白质可在分子内的随机位置，或在分子内的预定位置进行修饰，且可包括一个、两个、三个或更多个连接的化学部分。
聚合物可具有任何分子量，并且可以是分枝或不分枝的。对于聚乙二醇而言，优选的分子量在约1kDa和约100kDa之间(术语“约”表示在制备聚乙二醇中，一些分子将比规定的分子量更重、轻一些)，以易于操作和制造。视需要的治疗概况(例如，所需持续释放的持续时间，作用(如果对生物活性具有任何作用)、操作简易性、抗原性的程度或缺乏以及聚乙二醇对治疗性蛋白或类似物的其它已知作用)而定，可使用其它尺寸。举例而言，聚乙二醇可具有约200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、 10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、 15,000、105,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、 19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、 60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000 kDa的平均分子量。
可使用本领域中众所周知的免疫测定ELISA来确定本文所述的抗体构建体的存在性和数量。在一种适用于检测/定量本文所述的异源多聚体的ELISA 方案中包括以下步骤：用抗人血清白蛋白抗体涂布ELISA板、阻断此板以防非特异性结合、洗涤ELISA板、添加含有本文所述蛋白质的溶液(以一种或多种不同浓度)、添加与可检测标记偶合的二抗-抗体构建体多肽特异性抗体 (如本文中已述或本领域中已知)并检测二抗的存在。
在某些实施方案中是一种包含本文所述的单价抗体构建体和佐剂的药物组合物。在某些实施方案中是本文所述的药物组合物，它还包含与单价抗体构建体偶联的药物分子。在某些实施方案中，药物分子用于治疗自体免疫病症。在一些实施方案中，药物分子用于治疗癌症。在一些实施方案中，药物分子是化学治疗剂。
本文提供一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的药物组合物。在一个实施方案中，需要治疗的癌症是乳癌。在另一个实施方案中，需要治疗的癌症是乳癌，其中乳癌细胞以高、中或低密度表达HER2蛋白。HER2属于EGFR受体家族且在乳癌子集中倾向于过度表达。 HER2蛋白也称为neu基因、EGFR2、CD340、ErbB2和p185的产物。下表 A描述HER2在几种代表性乳癌细胞系上的表达水平(Subik等人,(2010) BreastCancer:Basic Clinical Research:4；35-41；Prang等人,(2005)British Journal ofCancer Research:92；342-349)。如表中所示，认为MCF-7和 MDA-MB-231细胞是低HER2表达细胞；认为SKOV3细胞是中HER2表达细胞，且认为SKBR3细胞是高HER2表达细胞。
表A2：
在一些实施方案中是一种治疗免疫系统障碍的方法，其包括向有需要的患者提供有效量的本文所述的药物组合物。在某些实施方案中是一种抑制肿瘤生长的方法，其包括使肿瘤与包含有效量的本文所述的单价抗体构建体的组合物接触。提供一种使肿瘤萎缩的方法，其包括使肿瘤与包含有效量的本文所述的单价抗体构建体的组合物接触。在一些实施方案中是一种抑制抗原分子多聚化的方法，其包括使抗原与包含有效量的本文所述的单价抗体构建体的组合物接触。本文提供一种抑制抗原与其同源结合配偶体结合的方法，其包括使抗原与包含足以与抗原结合的量的单价抗体构建体的组合物接触。
在某些实施方案中提供一种在稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体的方法，其包括：用以下物质转染至少一种稳定的哺乳动物细胞：编码包含重链可变结构域和第一Fc结构域多肽的第一重链多肽的第一DNA 序列；编码包含第二Fc结构域多肽的第二重链多肽的第二DNA序列，其中所述第二重链多肽无可变结构域；和编码包含轻链可变结构域的轻链多肽的第三DNA序列，以便所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三 DNA序列在所述哺乳动物细胞中以预定比率转染；在至少一种哺乳动物细胞中翻译所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重链和轻链多肽在所述至少一种稳定的哺乳动物细胞中被表达成需要的糖基化单价不对称抗体。在一些实施方案中是在本文所述的稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体的方法，其包括以不同预定比率的所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列转染至少两种不同细胞以便两种细胞各自以不同的比率表达重链多肽和轻链多肽。在一些实施方案中是在本文所述的稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体的方法，其包括用包含所述第一、第二和第三DNA序列的多顺反子载体转染至少一种哺乳动物细胞。在一些实施方案中，至少一种哺乳动物细胞选自 VERO、HeLa、HEK、NS0、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7、 Caco-2和MDCK细胞及其子类和变体。
在一些实施方案中是在本文所述的稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体的方法，其中第一DNA序列:第二DNA序列:第三DNA序列的预定比率是约1:1:1。在一些实施方案中，第一DNA序列:第二DNA序列:第三DNA序列的所述预定比率使得翻译的第一重链多肽的量约等于第二重链多肽的量和轻链多肽的量。
在一些实施方案中是在本文所述的稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体的方法，其中至少一种稳定的哺乳动物细胞的表达产物包含与单体重链或轻链多肽或其它抗体相比更大百分比的需要的糖基化单价抗体。
在一些实施方案中是在本文所述的稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体的方法，所述方法包括鉴定和纯化需要的糖基化单价抗体。在一些实施方案中，所述鉴定是通过液相色谱法和质谱分析法中的一种或两种来进行。
本文提供一种产生具有改善ADCC的抗体构建体的方法，其包括：用以下物质转染至少一种稳定的哺乳动物细胞：编码包含重链可变结构域和第一 Fc结构域多肽的第一重链多肽的第一DNA序列；编码包含第二Fc结构域多肽的第二重链多肽的第二DNA序列，其中所述第二重链多肽无可变结构域；和编码包含轻链可变结构域的轻链多肽的第三DNA序列，以便所述第一 DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳动物细胞中以预定比率转染；在至少一种哺乳动物细胞中翻译所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重链和轻链多肽在所述至少一种稳定的哺乳动物细胞中被表达成糖基化单价抗体，其中所述糖基化单价不对称抗体与相应野生型抗体相比具有较高的ADCC。
本文提供一种增加至少一种靶细胞中的抗体浓度的方法，其包括向靶细胞提供包含以下的单价抗体构建体：单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体；二聚Fc区；其中所述单价抗体构建体与具有两个抗原结合区的相应二价抗体构建体相比展示出与展示所述抗原的靶细胞的结合密度和Bmax(最大结合) 的增加，且其中所述单价抗体构建体与相应二价抗体构建体相比显示更佳的治疗功效，且其中所述功效并非由抗原交联、抗原二聚、防止抗原调节、或防止抗原活化引起。
本文提供分离的单价抗体构建体，其包含单价地结合抗原的抗原结合多肽构建体；和包含CH3结构域的二聚Fc多肽构建体；其中所述单价抗体构建体与具有两个抗原结合区的相应二价抗体构建体相比展示出与展示所述抗原的靶细胞的结合密度和Bmax(最大结合)的增加，且其中所述单价抗体构建体与相应二价抗体构建体相比显示更佳的治疗功效，且其中所述功效并非由抗原交联、抗原二聚、防止抗原调节或防止抗原活化引起。
本文提供结合HER2的分离的单价抗体构建体，其包含：单价地结合 HER2的抗原结合多肽构建体；和包含CH3结构域的二聚Fc多肽构建体；其中所述抗体构建体由靶细胞内化，其中所述构建体与二价结合HER2的相应二价抗体构建体相比展示出与靶细胞上展示的HER2的结合密度和Bmax(最大结合)的增加，且其中所述构建体与所述相应二价HER2结合抗体构建体相比展示较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一种。
本文提供一种在稳定的哺乳动物细胞中产生糖基化单价抗体构建体的方法，其包括：用以下物质转染至少一种稳定的哺乳动物细胞：编码包含重链可变结构域和第一Fc结构域多肽的第一重链多肽的第一DNA序列；编码包含第二Fc结构域多肽的第二重链多肽的第二DNA序列，其中所述第二重链多肽无可变结构域；和编码包含轻链可变结构域的轻链多肽的第三DNA序列，以便所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列在所述哺乳动物细胞中以预定比率转染；在至少一种哺乳动物细胞中翻译所述第一DNA序列、所述第二DNA序列和所述第三DNA序列以便所述重链和轻链多肽在所述至少一种稳定的哺乳动物细胞中被表达成需要的糖基化单价不对称抗体。
提供一种用于检测个体中所关注的生物标记的存在的试剂盒，所述试剂盒包含(a)本文所述的分离的单价抗体构建体；和(b)使用说明书。
还提供经过修饰以含有本文所述的用于编码和表达本文所述的单价抗体构建体的核酸分子的转基因生物体。
在某些实施方案中提供一种在具有低HER2表达的靶细胞上结合HER2 的分离的单价抗体构建体，其包含：单价地结合HER2的抗原结合多肽构建体；和包含两个各自包含CH3结构域的单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中一个所述单体Fc多肽与至少一个来自抗原结合多肽构建体的多肽融合；其中所述抗体构建体是抗增殖的且由靶细胞内化，其中所述构建体与结合 HER2的相应二价抗体构建体相比展示出与在靶细胞上展示的HER2的结合密度和Bmax(最大结合)的增加，且其中所述构建体展示与所述相应二价 HER2结合抗体构建体相比较高ADCC、较高ADCP和较高CDC中的至少一种。在某些实施方案中，具有低HER2表达的靶细胞是癌细胞。在一些实施方案中，具有低HER2表达的靶细胞是乳癌细胞。
还提供一种通过使抗原与本文提供的单价抗体构建体结合来防止抗原胞外结构域蛋白水解裂解的方法。
本文中引用各种公布，其公开内容全部以引用的方式并入。
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实施例
下文给出实施例来说明本发明的实践。它们并非打算限制或约束本发明的整个范畴。
实施例1：构建体的制备和表达
制备并检验以下单价抗Her2抗体和对照物：
1.OA1-Fab-Her2，一种单价抗Her2抗体，其中Her2结合结构域是链A 上的Fab，且Fc区是链A中具有突变T350V_L351Y_F405A_Y407V且链B 中具有突变T350V_T366L_K392L_T394W的异源二聚体；抗原结合结构域的表位是Her2的结构域4。
2.OA2-Fab-Her2，一种单价抗Her2抗体，其中Her2结合结构域是链A 上的Fab，且Fc区是链B中具有突变T350V_L351Y_F405A_Y407V且链A 中具有突变T350V_T366L_K392L_T394W的异源二聚体；抗原结合结构域的表位是Her2的结构域4。
3.OA3-scFv-Her2，一种单价抗Her2抗体，其中Her2结合结构域是scFv，且Fc区是链A中具有突变L351Y_S400E_F405A_Y407V且链B中具有突变 T366I_N390R_K392M_T394W的异源二聚体；抗原结合结构域的表位是Her2 的结构域4。
4.FSA-scFv-Her2，一种二价抗Her2抗体，其中两个Her2结合结构域都是scFv形式，且Fc区是链A中具有突变L351Y_S400E_F405A_Y407V且链 B中具有突变T366I_N390R_K392M_T394W的异源二聚体；抗原结合结构域的表位是Her2的结构域4。
5.FSA-Fab-Her2，一种二价抗Her2抗体，其中两个Her2结合结构域都是Fab形式，且Fc区是链A中具有突变T350V_L351Y_F405A_Y407V且链 B中具有突变T350V_T366L_K392L_T394W的异源二聚体；抗原结合结构域的表位是Her2的结构域4。
6.wt FSA Hcptn，一种作为对照的在CHO内部产生的野生型赫赛汀 (Herceptin)。抗原结合结构域的表位是Her2的结构域4。
6A.市售赫赛汀，一种作为对照的从Roche购买的野生型赫赛汀。抗原结合结构域的表位是Her2的结构域4。
7.OA4-scFv-BID2，一种单价抗Her2抗体，其中Her2结合结构域是链A 上的scFv，且Fc区是链A中具有突变L351Y_F405A_Y407V且链B中具有突变T366L_K392M_T394W的异源二聚体。抗原结合结构域的表位是Her2 的结构域1。
8.FSA-scFv-BID2，一种二价抗Her2抗体，其中两个Her2结合结构域都是scFv形式，且Fc区是WT。抗原结合结构域的表位是Her2的结构域1。
除了从Roche购买的市售赫赛汀以外，在CHO中表达且在实施例1和实施例16中描述的所有抗体都是岩藻糖基化抗体。市售的赫赛汀抗体相对于 CHO产生的抗体而言含有较大百分比的无岩藻糖基化。
如下克隆并表达这些抗体和对照物。通过使用对于人/哺乳动物表达而言最优化的密码子的基因合成来构建编码抗体重链和轻链的基因。Fab序列由已知的Her2/neu结合Ab产生(Carter P.等人(1992)Humanization of an anti P185Her2antibody for humancancer therapy.Proc Natl Acad Sci 89,4285.)且Fc是IgG1同种型。scFv序列FSA-scFv-Her2和OA3-scFv-Her2由已知的 Her2/neu结合Ab产生(Findley等人,(1990)Characterization of murine monoclonal antibodies reactive to either the humanepidermal growth factor receptor or HER2/neu gene product.Cancer Res.,50:1550)。scFv序列 FSA-scFv-BID2和OA4-scFv-BID2由已知的Her2/neu结合Ab产生(SchierR. 等人(1995)In vitro and in vivo characterization of a human anti-c-erbB-2single-chain Fv isolated from a filamentous phage antibody library.Immunotechnology 1,73)。
将最终基因产物亚克隆到哺乳动物表达载体pTT5中(NRC-BRI,Canada) 并在CHO细胞中表达(Durocher,Y.、Perret,S.和Kamen,A.High-level and high-throughputrecombinant protein production by transient transfection of suspension-growing CHO cells.Nucleic acids research 30,E9(2002))。
在指数生长期(1.5至2百万个细胞/mL)用1mg/mL 25kDa聚乙烯亚胺水溶液(PEI，Polysciences)以2.5:1的PEI:DNA比率转染CHO细胞。(Raymond C.等人,A simplifiedpolyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications.Methods.55(1):44-51(2011))。为确定形成异源二聚体的最佳浓度范围，以允许异源二聚体形成的重链A(HC-A)、轻链(LC)和重链B的最佳DNA比率转染DNA(例如，HC-A/HC-B/LC比率＝25:25:50％(OAA)、50:0:50％(WT hcptn)、25:25:50(FSA-Fab-Her2)、50:50:0 (FSA-scFv-BID2)和50:50:0(OA4-scFv-BID2))。5至6天后用在以4000rpm离心后收集的培养基收集转染的细胞并使用0.45μm的过滤器澄清。
实施例2：抗体的纯化和分析
如下纯化上文所述的单价抗Her2抗体和对照抗体。将澄清的培养基负载至MabSelect SuRe(GE Healthcare)蛋白-A柱上并用10柱体积的pH 7.2的PBS 缓冲液洗涤。用10柱体积的pH 3.6的柠檬酸盐缓冲液洗脱抗体，收集的部分含有用pH 11的TRIS中和的抗体。图8A描绘在蛋白-A纯化后对于wt FSA Hcptn、FSA-Fab-Her2、OA1-Fab-Her2和OA2-Fab-Her2的SDS-PAGE分析的结果。标记有“FSA”的泳道上样有全尺寸抗体(两个Fab臂和一个Fc区)。标记有“无关”的泳道上样有无关的蛋白质样本。抗Her2OAA以与抗Her2 FSA相当的量和纯度来表达和纯化。
通过凝胶过滤(SEC)进一步纯化蛋白-A抗体洗脱液。对于凝胶过滤而言，将3.5mg抗体混合物浓缩至1.5mL并通过AKTA Express FPLC以1mL/分钟的流速上样至Sephadex200HiLoad 16/600200pg柱(GE Healthcare)上。以1 mL/分钟的流速使用pH 7.4的PBS缓冲液。收集对应于纯化抗体的部分，浓缩至约1mg/mL并储存在-80℃下。如实施例8中所述，通过LCMS分析纯化的蛋白质。
通过蛋白A色谱法和SEC纯化的抗体用于以下实施例中所述的测定。
实施例3：单价抗HER2抗体(scFv)显示与SKOV3细胞中的二价抗HER2 抗体相比，浓度依赖性结合密度(Bmax)增加
如下文所述，将示例性的单价抗Her2抗体(OA3-scFv-Her2)的结合与二价抗Her2抗体(FSA-scFv-Her2)在Her2表达细胞系SKOV3中的结合相比较。 SKOV细胞系以2+水平表达Her2受体，且被认为是以每个细胞计的中等密度来表达受体。此实施例中检验的单价抗体包含作为scFv的抗体结合区。
通过流式细胞术确定检验抗体与SKOV3细胞表面的结合。用PBS洗涤细胞并以1×105个细胞/100μl再悬浮于DMEM中。向每个微量离心管中添加 100μl细胞悬浮液，接着每管添加10μl抗体变体。将管在4℃旋转器上孵育2 小时。将微量离心管在室温下以2000RPM离心2分钟，并用500μl培养基洗涤细胞沉淀。将每个细胞沉淀再悬浮于100μl在培养基中稀释成每份样本2μg 的经过荧光染料标记的二抗中。然后将样本在4℃旋转器上孵育1小时。孵育之后，将细胞以2000RPM离心2分钟并在培养基中洗涤。将细胞再悬浮于500μl培养基中，在含有5μl碘化丙啶(PI)的管中过滤并在BD LSRII流式细胞仪上根据制造商的说明进行分析。
结果在图3A和B中进行描绘且显示抗Her2OA抗体以浓度依赖性方式，以与抗Her2FSA(全尺寸抗体)相比较高的结合密度和Bmax结合SKOV3细胞。因此，在与二价抗体相同的浓度下，更多的OA抗体分子结合且装饰展示Her2抗原的细胞。在此实施例中检验的OA抗Her2抗体包含以与具有二价scFv抗原结合结构域的FSA相比较高的Bmax结合的scFv抗原结合结构域。
实施例4：单价抗Her2抗体(Fab)显示与二价抗体相比较高的Bmax，而与细胞上的Her2密度无关
将示例性的单价抗Her2抗体(OA1-Fab-Her2和OA2-Fab-Her2)的结合与二价抗Her2抗体(FSA-Fab-Her2)和野生型HerceptinTM(wt FSA Hcptn) 在如下文所述的三种Her2表达细胞系MDA-MB-231、SKOV3和SKBR3中的结合进行比较。认为MDA-MB-231细胞系以低密度(0-1+)表达Her2，认为SKOV3细胞系以中等密度(2+)表达Her2且认为SKBR3细胞系以高密度(3+) 表达Her2(参见subik等人，(2010)Breast cancer：Basic clinical Research：4；35-41，和Prang等人，(2005)British Journal of Cancer Research：92；342-349)。此实施例中检验的单价抗体包含作为Fab的抗体结合区。
如实施例2中所述，通过流式细胞术确定检验抗体与SKBR3细胞的表面的结合。
结果在图4A至C中描绘且下表中显示KD和Bmax的值。
表1：MDA-MB-231细胞中的结合数据
抗体 K<sub>D</sub>(nM) B<sub>max</sub>
wt FSA Hcptn 2.263 295
FSA-Fab-Her2 2.717 269
OA1-Fab-Her2 8.410 382
OA2-Fab-Her2 9.973 412
表2：SKOV3细胞中的结合数据
表3：SKBR3细胞中的结合数据
表4：结合的倍数差异-FSA-Fab-Her2相对于OA1-Fab-Her2
表4综述FSA-Fab-Her2相对于OA1-Fab-Her2在饱和时针对具有1+、2+ 和3+Her2受体密度的细胞系结合的KD和Bmax的倍数差异。OA1-Fab-Her2 相对于FSA-Fab-Her2而言，Bmax具有一致约1.4倍的增加，且所检验的所有细胞系的KD具有3倍的增加。
图4示出了单价抗Her2抗体在二价抗体结合饱和的浓度下具有较高的结合密度和Bmax；OA结合密度增加与细胞上的Her2密度无关。在展示低 (MDA-MB-231)、中(SKOV3)和高(SKBr3)Her2密度的细胞上，抗Her2OAA (单臂抗体)与抗Her2FSA相比具有较高的Bmax。
具有Fab抗原结合结构域的抗Her2OAA与具有二价Fab抗原结合结构域的FSA相比以较高的Bmax结合。
实施例5：单价抗HER2抗体与二价抗HER2抗体相比显示增加的ADCC
如下在SKBR3细胞中确定示例性的单价抗Her2抗体(OA1-Fab-Her2)与 wt FSAHcptn和FSA-Fab-Her2相比介导ADCC的能力。
概述：将靶细胞与检验抗体(从45μg/mL开始10倍递减的浓度)预孵育30分钟，接着添加效应物/靶细胞比率为5:1的效应细胞，并在37℃/5％CO2培养箱中再孵育6小时。从45ug/ml开始以10倍递减的8种浓度检验样本，同时从10μg/ml开始以10倍递减来滴定内部对照物赫塞汀(wt FSA Hcptn)。使用LDH测定试剂盒来测量LDH释放。
在预先优化的效应物/靶标(E/T)比率(5:1)下，用各种浓度的样本来进行剂量-响应研究。通过GraphPad Prism的S形(Sigmoidal)剂量响应非线性回归拟合对半数最大有效浓度(EC50)值进行分析。
将细胞在37℃/5％CO2下保持在McCoy的5A完整培养基中并根据来自 ATCC的实验方案用补充有10％FBS的合适培养基进行传代培养。分析中使用传代次数小于P10的细胞。在用于分析中之前，用补充有1％FBS和1％ Pen/strep的无酚红MEM培养基将样本稀释到0.3至300nM之间的浓度。
ADCC测定
通过以800rpm离心3分钟收集SKBR3靶细胞(ATCC，目录号HTB-30)。将细胞用测定培养基洗涤一次并离心；完全除去沉淀上方的培养基。用测定培养基轻柔悬浮细胞制成单一细胞溶液。将SKBR3细胞的数量调整至4×细胞储备液(50μl测定培养基中10,000个细胞)。然后如上所示将检验抗体稀释至需要的浓度。
如下将SKBR3靶细胞接种在测定板中。向96孔测定板的孔中添加50μl 的4×靶细胞储备液和50μl的4×样本稀释剂，并将板在室温下在细胞培养物培养箱中孵育30分钟。添加效应细胞(NK92/FcRγ3a(158V/V),100μl,E/T＝5:l, 即每孔中50,000个效应细胞)来引发反应并通过横摇轻柔混合。将板在37℃ /5％CO2培养箱中孵育6小时
向不含效应细胞和抗体的细胞对照物中添加Triton X-100至1％的终浓度来溶解靶细胞且这些对照物充当最大溶解对照物。向不含效应细胞和抗体的细胞对照物中添加ADCC测定缓冲液(98％无酚红MEM培养基、1％Pen/Strep 和1％FBS)且其充当最小LDH释放对照物。在靶细胞和效应细胞两者一起孵育时，将在不存在抗体下与效应细胞孵育的靶细胞设定为非特异性LDH释放的背景对照物。用LDH试剂盒(Roche,目录号11644793001)测定细胞活力。在Flexstation 3上读取OD492nm和OD650nm时的吸光度数据。
数据分析
根据下式计算细胞溶解的百分比：
细胞溶解％＝100*(实验数据-(E+T))/(最大释放-最小释放)。由Graphpad (4.0版)对数据进行呈现和分析。
图5中描绘剂量响应曲线且在下表5中示出了所检验抗体的EC50和最大溶解。
表5：
抗体 EC<sub>50</sub>(ng/mL) 最大溶解(％)
FSA-Fab-Her2 8.46 18.0
wt FSA Hcptn 2.83 17.4
OA1-Fab-Her2 9.05 25.4
这些结果表明单价不对称抗Her2抗体OA1-Fab-Her2显示浓度依赖性溶解和与二价抗体对照物相比较高的最大溶解。单价不对称抗Her2抗体 OA1-Fab-Her2与二价抗体对照物(FSA)相比显示较高的NK细胞介导的靶细胞溶解最大％。
实施例6：单价抗HER2抗体与二价抗HER2抗体相比显示增加的CDC
如下确定单价抗Her2抗体与二价抗体相比介导SKBR3细胞的CDC的能力。
在25mL含有10％胎牛血清的DMEM/F-12中，在T150细胞培养物烧瓶中以2.5×106个活力细胞接种SKBR-3细胞。通过在37℃和5％CO2下孵育对细胞进行预培养。
SKBR3预培养五天后，使细胞胰蛋白酶化并收集。在分离过滤器上冲洗细胞悬浮液以避免可能使测定结果出现偏斜的细胞集群。将细胞以每mL中 1×106个活力细胞接种在T25悬浮液细胞培养烧瓶中。以每5×106个活力细胞 10μg抗体向细胞悬浮液中添加抗CIPS(补体抑制因子)抗体(例如，大鼠抗CD59和小鼠抗CD55)。将细胞悬浮液与抗CIP抗体在5％CO2下孵育45 分钟。
制备测定抗Her2抗体的稀释液并添加至白色发光96孔板中。此板包括含有用于总细胞溶解的对照物和用于自发溶解的对照物的孔。
从悬浮液烧瓶收集SKBR3细胞并测定细胞密度和活力。产生具有4.0×105个活力细胞/mL的浓度的细胞悬浮液。适当时，将50μL此悬浮液接种至白色发光96孔板的孔中。将此板在37℃和5％CO2下孵育30分钟。向所有孔中添加10μL血清并将此板在37℃和5％CO2下孵育3:30小时。
如下诱发总的细胞溶解。使用CytoTox-Glo试剂盒(Promega)，将2mL 测定缓冲液与33.0μL的洋地黄皂苷(Digitonin)混合。向总细胞溶解对照物的每个孔中添加10μL此溶液。将此板在37℃和5％CO2下孵育30分钟。
如下进行读取和分析。根据CytoTox Glo试剂盒说明(Promega)用5mL测定缓冲液使冻干的基质复水。向板的所有72个孔中添加50μL此溶液。将板在室温下孵育15分钟，并使用TECAN Infinite F200酶标仪测定发光强度。
如下计算特异性细胞溶解：
特异性细胞溶解[％]＝[MFI(样本)-MFI(自发)]/[MFI(总)-MFI(自发)]×100。
结果在图6中示出，且在下表6中示出EC50、R2和最大溶解。
表6
这些结果表明检验的单价抗体与二价抗体在相同的检验浓度下相比显示增加的浓度依赖性和较高的CDC功效。抗Her2OAA与抗Her2FSA相比的确导致较高的针对靶细胞的补体依赖性细胞毒性。
实施例7：单价抗HER2抗体与二价抗HER2抗体相比显示增加的ADCP
如下确定单价抗Her2抗体与二价抗体相比介导SKBR3细胞的ADCP的能力。
ADCP实验方案
概述：此实验方案使用与先前与抗体的连续稀释液孵育的经PKH26标记的靶细胞共同培养的体外分化巨噬细胞。孵育24小时后，用APC(别藻蓝蛋白)-偶联的抗CD45和/或CD11b抗体对巨噬细胞进行染色。接着通过流式细胞术分析靶细胞的吞噬作用。
如下进行此方法。通过从健康人供体的白细胞去除材料进行密度梯度离心来制备PBMC。使用磁珠分离CD14阳性细胞并以2×106个活力细胞/mL接种在细胞培养基中。通过添加500U/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF)来诱发巨噬细胞分化。将细胞总计培养7天，并在第3天时添加 GM-CSF。
通过流式细胞术分析，用抗CD45、抗CD11b、抗CD14和抗CD16抗体来检查细胞的标记表达。
使用的靶细胞系是SKBR3。通过流式细胞术，用HerceptinTM(Roche)和 FITC偶联的抗人IgG二抗证实HER-2的存在。用PKH26(Sigma-Aldrich)对靶细胞进行染色。用1:6连续稀释的检验抗Her2抗体促进靶细胞的调理作用 (60分钟)并与巨噬细胞以1:1的比率孵育22小时。
用APC偶联的抗CD45和抗CD11b抗体对单核细胞进行染色并通过流式细胞术进行分析。由PKH26荧光强度确定CD45阳性细胞的吞噬作用。
每板中的对照物包括(一式两份)：只有PKH26染色的SK-BR-3细胞的靶细胞对照物；只有单核细胞的效应细胞对照物；和具有非特异性IgG1抗体的效应物和靶细胞对照物。(板特异性背景减法＝与非特异性同种型对照抗体孵育的效应物和靶细胞对照物)。
通过1)将靶细胞对照物的背景减除平均荧光强度设定为％100，且2)将效应物和靶细胞同种型对照物的平均荧光强度设定为0％来确定抗体依赖性吞噬作用的百分比。
使用以下等式来计算抗体依赖性吞噬作用的百分比：
BSMFI＝背景减除平均荧光强度
此实验的结果在图7A至C中示出，表明检验的单价抗Her2抗体与二价抗Her2抗体相比显示增加的ADCP。图5示出了(A)供体1的代表性ADCP (91％CD16+细胞)、(B)来自供体1研究2的代表性ADCP数据(45％CD 16+ 细胞)、(C)在基于CD 16+细胞/供体百分比的WT-FSAHcptn上比较 OA1-Fab-Her2和OA2-Fab-Her2的倍数差异的所有数据点(研究1和2的所有供体)。抗Her2OAA以体外分化巨噬细胞作为效应细胞的确介导更大百分比的抗体依赖性细胞吞噬作用(SKBr3靶细胞)；ADCP功效也与效应物:靶细胞比率有关，在较高的效应物巨噬细胞数目下观察到较大的功效，图7C。
表7提供从图7A的图表获得的数据。
表7：供体1和2的平均值(供体1，91％；供体2，93％CD16+)
表8和9提供从图7B的图表获得的数据
表8：供体1(43％CD16+富集)
表9：供体2(14％CD16+富集)
实施例8：具有异源二聚Fc区的单价抗Her2抗体的纯化和产率
如实施例2中所述在蛋白A和SEC纯化后通过LCMS检验单价 OA1-Fab-Her2和OA2-Fab-Her2的纯化和产率。
异源二聚体纯度的LCMS分析
在标准条件下使用LCMS确定示例性的单价抗Her2抗体的纯度。用N- 糖酰胺酶F使抗体去糖基化，之后上样到LC-MS上。在以下条件下在Agilent 1100系列HPLC上进行液相色谱法：
流速：1mL/分钟分体后柱至100u L/分钟至MS
溶剂：A＝ddH2O中的0.1％甲酸，B＝65％乙腈、25％THF、9.9％ddH2O、 0.1％甲酸
柱：2.1×30mm PorosR2
柱温度：80℃；溶剂也经过预热
梯度：20％B(0-3分钟)、20-90％B(3-6分钟)、90-20％B(6-7分钟)、20％B (7-9分钟)
接着在以下条件下在LTQ-Orbitrap XL质谱仪上进行质谱分析法(MS)：
电离方法：离子最大电喷射
校准和调整方法：以10μL/分钟的流速灌注2mg/mL的CsI溶液。随后使用自动调整功能(观察到的总CsI离子范围：1690至2800)在m/z 2211上调整轨道阱(Orbitrap)。
锥电压：40V
透镜电压：115V
FT分辨率：7,500
扫描范围m/z 400-4000
扫描延迟：1.5分钟
使用Thermo的Promass解卷积软件产生数据的分子量概况。
LC-MS结果在图8B至D中示出，其中图8B示出了OA1-Fab-Her2的 LCMS分析；图8C示出了OA2-Fab-Her2的LCMS分析；且图8D是 OA2-Fab-Her2的LCMS光谱展开图以显示在约0.8％两条轻链+1条短重链 (72,898Da)处、单独约0.7％短重链(25,907Da)处检测到的污染物。关于图8B，单臂异源二聚体的计算MW是98,653Da(OA1-Fab-Her2或OA2-Fab-Her2)；单臂同源二聚体的计算MW是52,159Da(仅一条重链)；且全链同源二聚体的计算MW是145,147Da(两条成对全尺寸重链，A/A(在OA1-Fab-Her2的情形下)或B/B(在OA2-Fab-Her2的情形下))。
关于图8C，单臂异源二聚体的计算MW是98,653Da；单臂同源二聚体的计算MW是51,815Da；全链同源二聚体的计算MW是145,492Da；1个短臂和2条轻链的计算MW是72,898Da；且单独的较短重链的计算MW是 25,907Da。
总而言之，图8B至C证实如由LCMS分析所确定，蛋白A和尺寸排阻色谱法后纯化单价抗Her2抗体的产率为&gt;95％纯度。如由LCMS分析所确定，蛋白A和尺寸排阻色谱法后OA1-Fab-Her2的产率是100％的异源二聚体。 OA2-Fab-Her2的产率是&gt;98.5％的异源二聚体，其中0.8％的物质具有两条轻链和1条短重链，且0.7％是单独的短重链物质。
表10：OA1-Fab-Her2的纯化数据综述
实施例9：单价抗Her2抗体被内化且抑制靶细胞的生长
如下检验单价抗Her2抗体被SKBR3细胞内化的能力。
将SKBR3细胞以每孔2000至4000个细胞涂在96孔板中，在DMEM中每孔100μl。在37℃O/N下孵育板。
细胞毒性研究/生长抑制测定
将检验抗体在培养基中稀释并以每孔10μl一式三份添加到孔中。将板在 37℃下孵育3天。使用alamarBlueTM(BIOSOURCE#DAL1100)测量细胞活力。每孔添加10μlalamarBlueTM且将板在37℃下孵育2小时。读取530/580nm下的吸光度。
内化研究
根据制造商的实验方案(Advanced Targeting Systems,San Diego,CA)，将抗人肥皂草素偶联的二抗(Fab-Zap人，目录号#IT-51)与人一抗以等摩尔浓度一起孵育，然后添加到细胞中。不除去细胞培养物上清液，添加25μl持续 1小时。将板用自来水洗涤4次并在室温下风干。历时30分钟向每孔中添加 100μl 0.057％(重量/体积)的SRB(磺酰罗丹明B)。将板用1％(体积/体积)的乙酸快速冲洗4次，并在室温下风干。添加100μl的10mM Tris碱溶液(pH 10.5)，并将板震荡5分钟。在酶标仪中测量510nm下的OD。
图9A和B示出了内化实验的结果。图9a示出了所检验抗体的内化百分比，而图9b示出了以作用百分比相对于对照物作图的数据。此数据表明所检验的单价抗Her2抗体被靶细胞内化。抗Her2OAA和抗Her2FSA在10nM 下具有60％的等同内化％。
表11示出了数据综述。
表11：内化数据
抗体 最大作用％ 最大作用(nM)
wt FSA Hcptn 60 1
FSA-Fab-Her2 60 1
OA1-Fab-Her2 60 10
OA2-Fab-Her2 60 10
图10示出了细胞生长测定的结果。单价抗Her2抗体与抗Her2FSA在1 nM下45％的最大生长抑制作用相比，展现在30nM下35％的最大生长抑制作用(SKBR3靶细胞)。表12提供数据的综述。
表12
(a)实施例10：单价抗Her2抗体以相等的KD与FcRn结合
如下由SPR检验单价抗Her2抗体与FcRn结合的能力。
通过标准NHS/EDC偶合到BioRad GLM晶片上将FcRn固定为约3000 RU。以50ul/分钟的流速注射抗体变体持续120秒钟，其中300秒解离。以 100nM、33.3nM、11.1nM、3.7nM、1.23nM和缓冲液空白的浓度系列用于双重参考。在Proteon Manager中使用平衡拟合模型分析传感图。
结果在图11A(wt FSA Hcptn)、9B(FSA-Fab-Her2)和11C(OA1-Fab-Her2) 中示出。这些图表明单价抗Her2抗体和二价抗Her2抗体以相等的KD与FcRn 结合。结果综述见于下表13中。
表13：
实施例11：单价抗HER2抗体(scFv)与二价抗HER2抗体相比在SKOV3 细胞中显示增加的浓度依赖性结合密度(Bmax)
如下文所述，将另一种示例性的单价抗Her2抗体(OA4-scFv-BID2)的结合与相应二价抗Her2抗体(FSA-scFv-BID2)和其它单价抗Her2抗体在Her2 表达细胞系SKOV3中的结合进行比较。如其它处所示，SKOV细胞系以2+ 水平表达Her2受体，这被认为是根据细胞计的中等密度。如实施例3中所述进行结合测定。
结果在图12中示出且在表14和15中综述。结果证实单价抗Her2抗体 OA4-scFv-BID2与二价FSA-scFv-BID2相比具有较高的Bmax，且 OA1-Fab-Her2相对于OA4-scFv-BID2而言在等摩尔浓度下具有较高的 Bmax。
表14：检验抗体的结合特征综述
抗体 K<sub>D</sub>(nM) B<sub>max</sub>
792 2.117 7038
1040 6.005 9321
876 6.123 4048
878 12.45 7946
表15：检验抗体的结合的倍数差异
比较 K<sub>D</sub> B<sub>max</sub>
FSA-Fab-Her2相对于OA1-Fab-Her2 2.83↑ 1.32↑
FSA-scFv-BID2相对于OA4-scFv-BID2 2.03↑ 1.96↑
实施例12：单价抗Her2抗体显示在三阴性和Her2 1+细胞系中的ADCC 增加
根据实施例5中所述的实验方案，在三阴性细胞系MDA-MD-231和Her2 1+细胞系MCF7中确定示例性的单价抗Her2抗体(OA1-Fab-Her2)与wt FSA Hcptn和FSA-Fab-Her2相比介导ADCC的能力。MDA-MD-231细胞在DMEM 培养基中生长，而MCF7细胞在伊格氏最低必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium)(Gibco#11095)中生长；两者中都补充有0.01mg/ml人重组胰岛素(Invitrogen)、10％FBS(Gibco#10099)和1％非必需氨基酸(Gibco#11140)。
图21A(MCF7细胞)和图21B(MDA-MD-231)中描绘剂量响应曲线且所检验抗体的EC50和最大溶解在表16和17中示出。
表16：EC50和最大溶解(MCF7细胞)
这些结果表明FSA-Fab-Her2相对于OA1-Fab-Her2的EC50的倍数差异是 10.3(增加)，而最大溶解的倍数增加是1.3(增加)。
表17：EC50和最大溶解(MDA-MD-231细胞)
FSA-Fab-Her2相对于OA1-Fab-Her2的EC50的倍数差异是1.8(增加)，而在MDA-MD-231细胞中的最大溶解的倍数增加是1.5(增加)。
实施例13：单价抗Her2抗体与FSA相比具有较宽的分布(Vss)和t1/2β
检查示例性的单价抗Her2抗体(OA1-Fab-Her2)的药物动力学(PK)并与对照二价抗Her2抗体(wt FSA Hcptn)的药物动力学进行比较。如下文所述进行这些研究。
菌株/性别：CD-1裸/雄性
动物在处理时的靶标体重：0.025kg
动物数量：12
体重：在处理前之日进行记录用于计算将要施用的体积。
临床迹象观察：注射后长达2小时，然后从第1天至第11天每天两次。
在第1天通过用试验物质以10mg/kg的剂量向尾静脉中静脉内(IV)注射来向小鼠施药。根据下表，在给药后长达240小时中的选定时间点(每个时间点3个动物)从下颌下或隐静脉收集约0.060mL的血液样本。从初始动物获得预处理血清样本(Pre-Rx)。使血液样本可以在室温下凝结15至30分钟。将血液样本在室温下以2700rpm离心10分钟以获得血清并将血清储存在 -80℃下。对于末梢采血而言，通过心脏穿刺来收集血液。
剂量水平：10mg/kg
√T：通过心脏穿刺进行末梢采血
通过ELISA确定血清浓度。简而言之，将在PBS中0.5ug/ml的Her2以每孔25ul涂在HighBind 384板(Corning 3700)中并在4℃下孵育过夜。用 PBS-0.05％吐温20将孔洗涤3次并在室温下用含有1％BSA的PBS以每孔 80ul阻断1至2小时。用含有1％BSA的PBS制备抗体血清和标准物的稀释液。阻断后，除去阻断液并将抗体稀释液转移到孔中。将ELISA板在1000g 下离心30秒以除去气泡，并将板在室温下孵育2小时。用PBS-0.05％吐温20 将板洗涤3次并每孔添加25ul AP偶联的山羊抗人IgG，Fc(Jackson ImmunoResearch)_(在含有1％BSA的PBS中1:5000稀释)并在室温下孵育 1小时。用PBS-0.05％吐温20将板洗涤4次并每孔添加25ul AP基质(5.5mL pNPP缓冲剂中1块片剂)。使用Perkin Elmer Envision读取器，以不同的时间间隔(0至30分钟)读取405nm下的OD。在OD405达到2.2之前，通过添加5ul 3NNaOH使反应停止。使板在1000g下离心2分钟，之后进行最后读数。
使用5.3版WinnonLin软件分析血清浓度来获得PK参数。在两组多次稀释液中分析血清样本，且接受经过验证的范围内的结果并进行平均。在ELISA 分析后，低于定量下限(Lower Limit of Quantification，LLOQ)的血清浓度值对于计算平均血清浓度而言视为0。由ELISA测定获得的LLOQ约为1.2 μg/mL。
结果在图22中示出且所检验的PK参数在表18中示出。
表18：PK参数
图22中所示的结果表明所检验的单价抗Her2抗体对于人给药而言具有合理的PK参数。显然，单价抗Her2抗体具有较大的Vss(稳态体积)，表明抗体以更大的体积分布且在组织中具有更大的分布。
实施例14：单价抗Her2抗体治疗减少Erb2和MAPK在SKBr3细胞中的磷酸化作用
如下文所述确定用示例性的单价抗Her2抗体(OA1-Fab-Her2)治疗SKBr3 对信号传导分子的磷酸化作用的影响。
对于通过western免疫印迹检测磷酸化作用而言，将12孔板以每孔50,000 个细胞在含有血清的培养基中接种并在37℃下孵育。24小时后，更换培养基并向孔中添加抗体处理，最终浓度为100nM，并将板在37℃下孵育30分钟。抗体孵育后，将适当孔用rhHRGβ1在培养基中以1nM处理15分钟。通过将板放置在冰上、抽出培养基并用冰冷dPBS洗涤孔来停止处理。添加溶解-M 缓冲液(每孔50μl)并在室温下伴随轻缓震荡孵育5分钟。
将细胞溶解产物在14,000g下离心10分钟且除去细胞溶解产物并储存在还原性或非还原性缓冲液中且煮沸5分钟(还原样本)。根据制造商的说明，用剩余的粗细胞溶解产物完成BCA蛋白测定。以每孔3μg上样到SDS-PAGE 凝胶并转移至止动剂-P PVDF膜上。将膜在zenopure水中洗涤，在甲醇中浸没2分钟并风干过夜(或室温下1小时)。将膜与适当的一抗(小鼠抗PY20 ZYMED,Invitrogen；兔抗ErbB2；兔抗总Akt；兔抗P-Akt(Ser473)；兔抗 p44/p42；兔抗P-p44/p42，Cell Signaling Technologies)在4℃下孵育过夜。将膜在TBS-T中洗涤4次，每次20分钟并与二抗(HRP偶联山羊抗小鼠IgG； HRP偶联驴抗兔IgG；JacksonImmunoResearch)在室温下伴随轻缓回旋式震荡孵育30分钟。将膜在TBS-T中洗涤4次，每次20分钟并用水冲洗，然后添加ECL基质。薄膜在各个时间曝光并用AFP mini-med 90显影。
对于检测p-AKT而言，使用PathScan Phospo-AKT夹心ELISA试剂盒 (CellSignaling Technology，目录号7252)且实验方案遵循如制造商说明中所详述。
图23A和B示出了关于ErbB、MAPK和Akt磷酸化作用的结果。这些结果表明OA1-Fab-Her2治疗相对于hIgG对照物而言减少了p-MAPk和 p-ErbB2的总量。在三种检验的抗Her2抗体中，用OA1-Fab-Her2可见p-MAPk 和p-ErbB2的减少最大。在图24A和B中示出了对如由ELISA所测量的Akt 的磷酸化程度的定量评估。这些结果表明OA1-Fab-Her2治疗相对于未经治疗的对照物('CTL')和hIgG对照物而言减少了p-AKT的总量。在三种检验的抗 Her2抗体中，用OA1-Fab-Her2可见p-AKT的减少最大。
实施例15：单价抗Her2抗体与二价抗Her2抗体相比显示与CD16a和 CD32a/b的结合增加。
使用表面等离子体共振(SPR)检查示例性的单价抗Her2抗体与FcγR CD 16a和CD32a/b结合的能力。
表面等离子体共振分析：使用来自BIO-RAD的ProteOn XPR36系统，通过SPR(表面等离子体共振)来测量FcγR与抗体Fc的亲和力。通过胺偶合将缓冲液(10mM Hepes pH6.8)中的HER-2固定在CM5晶片上直至3000RU。将含有抗HER2F(ab)2的抗体形式的Fc变体固定到HER-2表面上直至300 RU。使运行缓冲液和表面活性剂维持在pH 6.8。将纯化的分析物FcR在其运行缓冲液中稀释并以20-30mul/分钟的流速注射2分钟，接着再解离4分钟。一式三份分析五份从20nM开始两倍稀释的每种抗体。使传感图与1:1的朗缪尔结合模型全面拟合。所有实验都在室温下进行。
表19中示出了SPR结合研究的结果。
表19：单价抗Her2抗体的结合能力
表19中的结果表明OA1-Fab-Her2与对照物FSA-Fab-Her2相比在与FcγR 结合中展示较高的Rmax，这是由于可用于与抗原(Her2)固定抗体结合的Fc 区的数量更大。此外，OA1-Fab-Her2展示对于CD32的亲和力增加1.4至2.0 倍。
实施例16：其它构建体的制备和表达
除了如实施例1中所述的构建体1至8以外，制备并检验以下其它的单价抗Her2抗体和对照物：
9.OA5-Fab-Her2，一种单价抗Her2抗体，其中Her2结合结构域是链A 上的Fab，且Fc区是链A中具有突变T350V_L351Y_F405A_Y407V且链B 中具有突变T350V_T366L_K392L_T394W的异源二聚体；抗原结合结构域的表位是Her2的结构域2。
10.OA6-Fab-Her2，一种单价抗Her2抗体，其中Her2结合结构域是链B 上的Fab，且Fc区是链A中具有突变T350V_L351Y_F405A_Y407V且链B 中具有突变T350V_T366L_K392L_T394W的异源二聚体；抗原结合结构域的表位是Her2的结构域2。
11.FSA-Fab-Pert，一种二价抗Her2抗体，其中两个Her2结合结构域是 Fab形式的帕妥珠单抗，且Fc区是链A中具有突变L351Y_S400E_F405A_Y407V且链B中具有突变 T366I_N390R_K392M_T394W的异源二聚体。抗原结合结构域的表位是Her2 的结构域2。
根据实施例1中所述的方法来制备和表达这些构建体。
实施例17：单价抗Her2抗体OA5-Fab-Her2和OA6-Fab-Her2的纯化
根据实施例1中所述的方法来制备和表达这些构建体。图30A示出了 OA5-Fab-Her2和OA6-Fab-Her2在蛋白A纯化后的纯度。图30B示出了通过LC/MS对5种异源二聚体纯度的分析，表明OA5-Fab-Her2和OA6-Fab-Her2 在蛋白A和尺寸排阻色谱法后都可以被纯化至大于99％的纯度。根据实施例 8中所述的方法进行异源二聚体纯度。
实施例18：单价抗Her2抗体(Fab)相对于FSA而言在JIMT-1和BT-474 细胞中具有较高的Bmax。
将示例性单价抗Her2抗体(OA5-Fab-Her2和OA6-Fab-Her2)的结合与二价形式的这些抗Her2抗体(FSA-Fab-pert)在Her2表达细胞系JIMT-1和 BT-474中的结合进行比较。在异种移植模型中使用这些细胞系来检验候选抗癌治疗剂的功效。JIMT-1细胞系以2+水平表达Her2受体，且因此被认为是以每个细胞计的中等密度来表达受体。BT-474细胞系是赫赛汀抗性细胞系且以3+水平表达Her2受体，且因此被认为是以每个细胞计的高密度来表达受体。此实施例中检验的单价抗体包含作为Fab的抗体结合区。通过如实施例 3中所述的流式细胞术确定这些抗体与这些细胞表面结合的能力，除了使用含有10％FBS培养基的DMEM来培养JIMT-1细胞和BT-474细胞以外。
结果在图25A(JIMT-1细胞)和图25B(BT-474细胞)中描绘，且KD和Bmax的值在下表20和21中示出。
表20：JIMT-1细胞中的结合数据
图25A和表20中所示的数据显示OA1-Fab-Her2相对于FSA-Fab-Her2 的KD的倍数差异是2.57(增加)，而OA1-Fab-Her2相对于FSA-Fab-Her2的 Bmax的倍数差异是1.43(增加)。OA5-Fab-Her2相对于FSA-Fab-pert的KD的倍数差异是2.26(增加)，而OA5-Fab-Her2相对于FSA-Fab-pert的Bmax的倍数差异是1.46(增加)。
表21：BT-474细胞的结合数据
变体 K<sub>D</sub>(nM) B<sub>max</sub>(MFI)
OA1-Fab-Her2 11.5 42033
FSA-Fab-Her2 1.81 27548
OA5-Fab-Her2 9.47 47072
OA6-Fab-Her2 8.20 44578
FSA-Fab-Pert 2.22 32295
图25B和表21中所示的数据显示OA1-Fab-Her2相对于FSA-Fab-Her2 的KD的倍数差异是6.35(增加)，而OA1-Fab-Her2相对于FSA-Fab-Her2的 Bmax的倍数差异是1.52(增加)。OA5-Fab-Her2相对于FSA-Fab-pert的KD的倍数差异是4.66(增加)，而OA5-Fab-Her2相对于FSA-Fab-pert的Bmax的倍数差异是1.45(增加)。
总而言之，在此实施例中检验的两种细胞类型中，所检验的单价抗Her2 抗体与相关的二价对照抗体相比具有较高的Bmax。这些结果也表明基于帕妥珠单抗的单价抗Her2抗体(OA5-Fab-Her2和OA6-Fab-Her2)比基于赫赛汀的抗体(OA1-Fab-Her2)具有较高的Bmax。
实施例19：单价抗Her2抗体抑制BT-474细胞的生长
使用实施例9中所述的方法检验单价抗Her2抗体抑制在含有10％FBS 的DMEM中生长的BT-474细胞和JIMT-1细胞生长的能力。
BT-474细胞的结果在图26A和B中示出，且所检验抗体的最大生长抑制％在表22中示出。
表22：最大生长抑制
变体 最大生长抑制％
比较性Hcptn 46
Wt FSA Hcptn 46
FSA-Fab-Her2 48
OA1-Fab-Her2 41
OA2-Fab-Her2 35
FAS-Fab-Pert 17
OA5-Fab-Her2 14
OA6-Fab-Her2 18
所检验的抗体(FSA-Fab-Her2、wt FSA Hcptn、OA1-Fab-Her2、 OA2-Fab-Her2、OA5-Fab-Her2、OA6-Fab-Her2、FSA-Fab-pert或市售的 HerceptinTM都无法抑制JIMT-1细胞的生长(数据未显示)。
实施例20：内化单价抗Her2抗体
使用与实施例9中所用的“间接”方法不同的“直接”方法确定示例性的单价抗Her2抗体被BT-474细胞内化的能力。
根据Schmidt,M.等人,Kinetics of anti-carcinoembryonic antigen antibodyinternalization:effects of affinity,bivalency,and stability.Cancer ImmunolImmunother(2008)57:1879-1890中详述的实验方案进行直接内化方法。具体而言，根据制造商说明，使用488蛋白标记试剂盒(Invitrogen,目录号A10235)直接标记抗体。
对于内化测定而言，以每孔1×105个细胞接种12孔板并在37℃+5％CO2下孵育过夜。次日，将标记抗体以10和200nM添加到DMEM+10％FBS中并在37℃+5％CO2下孵育24小时。在黑暗条件下，抽出培养基并将孔用PBS 洗涤2次，每次500μL。为收集细胞，在37℃下添加细胞解离缓冲液(250μL)。将细胞沉淀并悬浮在不含或以50μg/mL含有抗Alexa Fluor 488、兔IgG部分 (Molecular Probes,A11094，批号1214711)的100μL DMEM+10％FBS中，且在冰上孵育30分钟。分析之前，添加300μL DMEM+10％FBS过滤样本 4ul碘化丙啶。使用LSRII流式细胞仪分析样本。
结果在图27A和B中示出。图27A说明OA1-Fab-Her2和OA5-Fab-Her2 (在200nM下)能在BT-474细胞中以与亲本FSA抗体相当的百分比内化。在OA5-Fab-Her2的情形下，OA与其FSA，FSA-Fab-Pert(51％)相比，可见更高的总体内化(62％)。图27B说明OA1-Fab-Her2和OA5-Fab-Her2(在 200nM下)能在JIMT-1(赫赛汀抗性)细胞中以与亲本FSA抗体相当的百分比内化。在BT-474和JIMT-1中，OA5-Fab-Her2与OA1-Fab-Her2相比具有较高的内化％。
实施例21：单价抗Her2抗体显示在Her2 1+细胞系(MCF7细胞)中的 ADCC增加
除了在(OA1-Fab-Her2)中检验的示例性单价抗Her2抗体以外，检验其它单价抗HER2抗体OA4-scFv-BID2、OA5-Fab-Her2和OA6-Fab-Her2与相关对照FSA抗体相比介导ADCC的能力。其它对照物包括市售的HerceptinTM抗体、wt FSA Hcptn和FSA-Fab-Her2。根据实施例5和12中所述的实验方案，在Her2 1+细胞系MCF7中测量ADCC活性。
结果在图21C、D和E中示出。图21C显示OA1-Fab-Her2、OA4-scFv-BID2 和OA5-Fab-Her2在MCF-7(Her2 1+)细胞中的ADCC测定中的比较。图21C 中的结果显示用OA1-Fab-Her2治疗介导最大程度上的最大靶细胞溶解且此最大靶细胞溶解大于市售赫赛汀的靶细胞溶解。市售赫赛汀具有少于约18％的核心岩藻糖残基；已知不存在核心岩藻糖或核心岩藻糖减少与岩藻糖基化抗体相比可增强体外靶细胞溶解(通过ADCC)(Suzuki E.等人,2007,Anon-fucosylated anti-HER2antibody augments antibody-dependent cellularcytotoxicity in breast cancer patients Clin Cancer Res.13:1875-1882)。尽管OA1-Fab-Her2相对于市售赫赛汀而言具备更大百分比的岩藻糖基化肽序列，但它能够介导更大程度上的靶细胞溶解。图21D中的结果将FSA抗Her2变体进行比较并显示相对于市售赫赛汀而言减少的最大靶细胞溶解。比较市售赫赛汀与FSA-Fab-Her2(除岩藻糖基化差异以外，分子相同)说明糖基化所赋予的大影响。图21E中的结果显示与亲本FSA抗体FSA-Fab-Her2相比和与市售赫赛汀相比，OA1-Fab-Her2所介导的优越杀伤性。在三种OA抗Her2 抗体中，OA1-Fab-Her2在MCF-7细胞中介导最大的靶细胞溶解％。
实施例22：单价抗Her2抗体(scFv)在MALME-3M细胞中相对于FSA具有较高的Bmax。
将示例性单价抗HER2OA4-scFv-BID2的结合与二价形式的此抗Her2抗体FSA-scFv-BID2在MALME-3M细胞中的结合进行比较。如实施例3中所述通过流式细胞术进行测定。结果在图28中示出。数据表明OA4-scFv-BID2 与FSA-scFv-BID2抗体相比展示与MALME-3M细胞的优越结合。
实施例23：单价抗体构建体-ADC杀伤细胞的能力
如下制备与毒性药物分子(OA-Fab-MCC-DM1)偶联的单价抗体构建体 OA1-Fab-Her2：如Chari等人,1992,Immunoconjugates containing novel maytansinoids:promising anti-cancer drugs.Cancer Res 1992；52:127-31中所述，使用4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)用于硫醚键联来制备抗体-药物偶联物。使用实施例9中所述的方法，检验此分子生长抑制BT474细胞的能力。结果在图29中示出且表明在治疗72小时后， OA1-Fab-Her2-MCC-DM1在100nM下，在BT-474中导致63％的生长抑制作用，相比而言OA1-FSA-Her2为38％的生长抑制作用。此数据表明 OA-Fab-MCC-DM1展示与OA1-Fab-Her2相比优越的生长抑制作用。
实施例24：确定示例性单价抗体构建体的结合动力学和亲和力
如下使用来自BIO-RAD的ProteOn XPR36系统，通过SPR来确定 OA2-Fab-Her2对于HER2的结合动力学和亲和力。使用标准胺偶合将约3300 RU的抗人IgG 25u g/ml固定在GLC晶片上。在抗人IgG固定晶片上捕获 Wt FSA Hcptn或OA2-Fab-Her2(20u g/ml在PBST中，25u l/分钟)以捕获约 700RU的水平。将重组人HER2在PBST中以60、20、6.66、2.22、0.74nM稀释并以50μl/分钟的流速注射2分钟，接着再解离4分钟。一式三份分析 HER2稀释液。使传感图与1:1的朗缪尔结合模型全面拟合。所有实验都在室温下进行。
结果在下表23中示出并提供对于ka(结合速率，动态结合速率)、kd(解离速率，动态解离速率)和KD(平衡解离常数)的测量值。
表23：OA2-Fab-HER2与相应单特异性二价抗体构建体相比的结合动力学和亲和力的综述。
这些结果表明所检验示例性单价抗体构建体的结合速率、解离速率和平衡解离常数与相应单特异性二价抗体构建体相当。
实施例中采用的试剂在市场上有售或可以使用市售的仪器、方法或本领域中已知的试剂来制备。前述实施例说明本发明的各个方面和本发明方法的实践。这些实施例并非旨在提供对本发明多个不同实施方案的详尽描述。因此，尽管前述本发明已通过说明和实施例在某种程度上详细描述以供清楚理解的目的，但本领域普通技术人员将容易意识到，在不偏离随附权利要求书的精神或范畴下可对其进行多种变化和修改。
本说明书中提到的所有公布、专利和专利申请都以引用的方式并入说明书中，其程度如同每个个别的公布、专利或专利申请都明确且个别地以引用的方式并入本文中一般。

Claims (24)

1.分离的单价抗体构建体，其中所述单价抗体构建体包含：
含有如SEQ ID NO:14所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的轻链多肽；
含有如SEQ ID NO:12所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第一重链多肽；和
含有如SEQ ID NO:16所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第二重链多肽。
2.分离的单价抗体构建体，其中所述单价抗体构建体包含：
含有如SEQ ID NO:20所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的轻链多肽；
含有如SEQ ID NO:18所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第一重链多肽；和
含有如SEQ ID NO:22所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第二重链多肽。
3.分离的单价抗体构建体，其中所述单价抗体构建体包含：
含有如SEQ ID NO:44所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的轻链多肽；
含有如SEQ ID NO:40所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第一重链多肽；和
含有如SEQ ID NO:42所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第二重链多肽。
4.分离的单价抗体构建体，其中所述单价抗体构建体包含：
含有如SEQ ID NO:50所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的轻链多肽；
含有如SEQ ID NO:46所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第一重链多肽；和
含有如SEQ ID NO:48所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第二重链多肽。
5.分离的单价抗体构建体，其中所述单价抗体构建体包含：
含有如SEQ ID NO:36所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第一多肽；和
含有如SEQ ID NO:38所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第二多肽。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的单价抗体构建体，其中所述抗体构建体是无岩藻糖基化的。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的单价抗体构建体，其中所述抗体构建体是糖基化的。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的单价抗体构建体，其中所述抗体构建体与一个或多个药物分子偶联。
9.一种宿主细胞，其包含编码根据权利要求1至5中任一项所述的分离的单价抗体构建体的一种或多种核酸。
10.一种制备根据权利要求1至7中任一项所述的分离的单价抗体构建体的方法，所述方法包括以下步骤：(a)培养包含编码所述单价抗体构建体的核酸的宿主细胞；和(b)从所述宿主细胞培养物回收所述单价抗体构建体。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述宿主细胞选自VERO、HeLa、HEK、NS0、中国仓鼠卵巢(CHO)、W138、BHK、COS-7、Caco-2和MDCK细胞及其子类和变体。
12.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至8中任一项所述的单价抗体构建体和药学上可接受的载剂。
13.单价抗体构建体在制备用于治疗表达HER2的癌症的药物中的用途，其中所述单价抗体构建体包含：
单价地结合至HER2且包含曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的Fab片段、曲妥珠单抗的scFv或抗体B1D2的scFv的抗原结合多肽构建体，包含两个单体Fc多肽的二聚Fc多肽构建体，其中所述单体Fc多肽中的一个与所述抗原结合多肽构建体融合，其中所述表达HER2的癌症以0-1+水平或2+水平表达HER2，并且其中所述单价抗体构建体显示出与结合HER2的相应单特异性二价抗体构建体相比更高的通过ADCC的表达HER2的细胞的最大溶解，
其中所述二聚Fc多肽构建体是异源二聚Fc多肽构建体，其具有包含促使形成具有与天然同源二聚Fc区相当的稳定性的所述异源二聚Fc多肽构建体的氨基酸取代的变体CH3结构域，并且其中促使形成所述异源二聚Fc多肽构建体的氨基酸取代是：
a.在一个单体Fc多肽中，在382位置处的T被替换为V、在383位置处的L被替换为Y、在437位置处的F被替换为A以及在439位置处的Y被替换为V和在另一单体Fc多肽中，在382位置处的T被替换为V、在398位置处的T被替换为L、在424位置处的K被替换为L以及在426位置处的T被替换为W；
b.在一个单体Fc多肽中，在383位置处的L被替换为Y、在437位置处的F被替换为A以及在439位置处的Y被替换为V和在另一单体Fc多肽中，在398位置处的T被替换为L、在424位置处的K被替换为L以及在426位置处的T被替换为W；
c.在一个单体Fc多肽中，在383位置处的L被替换为Y、在437位置处的F被替换为A以及在439位置处的Y被替换为V和在另一单体Fc多肽中，在398位置处的T被替换为L、在424位置处的K被替换为M以及在426位置处的T被替换为W；或
d.在一个单体Fc多肽中，在383位置处的L被替换为Y、在432位置处的S被替换为E、在437位置处的F被替换为A以及在439位置处的Y被替换为V和在另一单体Fc多肽中，在398位置处的T被替换为I、在422位置处的N被替换为R、在424位置处的K被替换为M以及在426位置处的T被替换为W，并且
其中所述氨基酸残基的位置是根据SEQ ID NO:24确定的。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌。
15.根据权利要求13或14所述的用途，其中所述癌症对用曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、TDM1和抗HER二价抗体中的一种或多种的治疗具有部分反应或没有反应。
16.根据权利要求13或14所述的用途，其中所述癌症是孕酮受体阴性或雌激素受体阴性。
17.根据权利要求13或14所述的用途，其中所述单价抗体构建体是除了另一种用于治疗癌症的疗法之外被提供的。
18.根据权利要求13或14所述的用途，其中所述二聚Fc多肽构建体包含含有促使选择性结合Fcγ受体的氨基酸取代的变体CH2结构域。
19.根据权利要求13或14所述的用途，其中所述单价抗体构建体包含：
a.含有如SEQ ID NO:14所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的轻链多肽；
含有如SEQ ID NO:12所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第一重链多肽；和
含有如SEQ ID NO:16所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第二重链多肽；
b.含有如SEQ ID NO:20所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的轻链多肽；
含有如SEQ ID NO:18所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第一重链多肽；和
含有如SEQ ID NO:22所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第二重链多肽；
c.含有如SEQ ID NO:44所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的轻链多肽；
含有如SEQ ID NO:40所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第一重链多肽；和
含有如SEQ ID NO:42所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第二重链多肽；
d.含有如SEQ ID NO:50所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的轻链多肽；
含有如SEQ ID NO:46所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第一重链多肽；和
含有如SEQ ID NO:48所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第二重链多肽；或
e.含有如SEQ ID NO:36所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第一多肽；和
含有如SEQ ID NO:38所示的最终蛋白产物序列而无信号肽序列的第二多肽。
20.根据权利要求13或14所述的用途，其中所述单价抗体构建体是无岩藻糖基化的。
21.根据权利要求13或14所述的用途，其中所述单价抗体构建体是糖基化的。
22.根据权利要求13或14所述的用途，其中所述单价抗体构建体与一个或多个药物分子偶联。
23.一种载体，包含编码根据权利要求1-5中任一项所述的分离的单价抗体构建体的一种或多种核酸。
24.编码根据权利要求1-5中任一项所述的分离的单价抗体构建体的一种或多种核酸。
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