JP6727379B2 - Her2を標的とする二重特異性抗原結合性コンストラクト - Google Patents
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Description
本出願は、すべて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる2013年11月27日出願の米国特許仮出願第61/910,026号;2014年5月20日出願の米国特許仮出願第62/000,908号;および2014年6月6日出願の米国特許仮出願第62/009,125号の利益を請求する。
本出願は、EFSウェブを介して提出され、かつその全体が参照によって本明細書に組み込まれる配列表を含む。2015年1月8日に作成された上記ASCIIコピーは、28087PCT_CRF_sequencelisting.txtと名付けられ、275,091バイトのサイズである。
現在市販されている抗体治療薬の大部分は、2つの抗原結合性ドメインによって付与される高い親和性結合および結合活性について最適化および選択された二価単一特異性抗体である。抗体Fc依存性細胞傷害性機構によって抗体をより有効にするために、変異誘発によるFcgR結合の非フコシル化(afucosylation)または増強が用いられている。非フコシル化抗体、またはFcgR結合を増強された抗体も未だ、治験において不完全な治療効力に甘んじており、薬物を市販する状況は、これらの抗体のいずれについても、まだ達成されていない。毒素にコンジュゲートされた典型的な二価抗体(抗体薬物コンジュゲート)はさらに有効であるが、より広い臨床的有用性は、用量を限定する毒性によって限定される。
[本発明1001]
HER2(ヒト上皮成長因子受容体2)発現細胞上のHER2 ECD2(細胞外ドメイン2)抗原に一価で特異的に結合する第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクト;
HER2発現細胞上のHER2 ECD4(細胞外ドメイン4)抗原に一価で特異的に結合する第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクト;
第1および第2のリンカーポリペプチド
を含む、抗原結合性コンストラクトであって、
第1のリンカーポリペプチドは第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトに機能的に連結されており、第2のリンカーポリペプチドは第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトに機能的に連結されており、
前記リンカーポリペプチドが相互に共有結合を形成することができ、
第1または第2の抗原結合性ポリペプチドの一方または両方がscFvである、前記抗原結合性コンストラクト。
[本発明1002]
第1および第2のリンカーポリペプチドがそれぞれ、IgG1、IgG2、またはIgG4ヒンジ領域から選択される免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドを含む、本発明1001の抗原結合性コンストラクト。
[本発明1003]
第1および/または第2のリンカーポリペプチドが骨格、任意選択によりFcに、機能的に連結されている、本発明1001または1002の抗原結合性コンストラクト。
[本発明1004]
第1および第2のリンカーポリペプチドが、CH3配列をそれぞれ含む第1および第2のFcポリペプチドを含む二量体Fcに機能的に連結されており、第1のFcポリペプチドが、第1のリンカーポリペプチドに機能的に連結されていて、第2のリンカーポリペプチドが第2のリンカーポリペプチドに機能的に連結されている、本発明1001または1002の抗原結合性コンストラクト。
[本発明1005]
(i)第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがscFvであり、第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがFabであるか;または(ii)第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがFabであり、第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがscFvであるか;または(iii)第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトおよび第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトの両方がscFvである、前記本発明のいずれかの抗原結合性コンストラクト。
[本発明1006]
i. 第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがFabであり、第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがscFvであり、第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトFabが、
a. v5019(SEQ ID NO:221)、v5020(SEQ ID NO:205)、v7091(SEQ ID NO:221)、v6717(SEQ ID NO:267)、またはv10000(SEQ ID NO:99)のペルツズマブアームのVHを含む第1の重鎖可変ポリペプチドVH1および
b. v5019(SEQ ID NO:35)、v5020(SEQ ID NO:35)、v7091(SEQ ID NO:35)、v6717(SEQ ID NO:259)、またはv10000(SEQ ID NO:71)のペルツズマブアームのVLを含む第1の軽鎖可変ポリペプチドVL1
を含み、
第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトscFvが、
(a) v5019(SEQ ID NO:179)、v5020(SEQ ID NO:157)、v7091(SEQ ID NO:305)、v6717(SEQ ID NO:179)、またはv10000(SEQ ID NO:305)のトラスツズマブアームのVHを含む第2の重鎖可変ポリペプチドVH2および
(b) v5019(SEQ ID NO:171)、v5020(SEQ ID NO:149)、v7091(SEQ ID NO:297)、v6717(SEQ ID NO:171)、またはv10000(SEQ ID NO:297)のトラスツズマブアームのVLを含む第2の軽鎖可変ポリペプチドVL2
を含むか;または
ii. 第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがscFvであり、第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがFabであり、第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトscFvが、
(a) v5019(SEQ ID NO:221)、v5020(SEQ ID NO:205)、v7091(SEQ ID NO:221)、v6717(SEQ ID NO:267)、またはv10000(SEQ ID NO:99)のペルツズマブアームのVHを含む第1の重鎖可変ポリペプチドVH1および
(b) v5019(SEQ ID NO:35)、v5020(SEQ ID NO:35)、v7091(SEQ ID NO:35)、v6717(SEQ ID NO:259)、またはv10000(SEQ ID NO:71)のペルツズマブアームのVLを含む第1の軽鎖可変ポリペプチドVL1
を含み;
第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトFabが、
(a) v5019(SEQ ID NO:179)、v5020(SEQ ID NO:157)、v7091(SEQ ID NO:305)、v6717(SEQ ID NO:179)、またはv10000(SEQ ID NO:305))のトラスツズマブアームのVHを含む第2の重鎖可変ポリペプチドVH2および
(b) v5019(SEQ ID NO:171)、v5020(SEQ ID NO:149)、v7091(SEQ ID NO:297)、v6717(SEQ ID NO:171)、またはv10000(SEQ ID NO:297)のトラスツズマブアームのVLを含む第2の軽鎖可変ポリペプチドVL2
を含むか;または
iii. 第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがscFvであり、第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがscFvであり、第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトscFvが、
(a) v5019(SEQ ID NO:221)、v5020(SEQ ID NO:205)、v7091(SEQ ID NO:221)、v6717(SEQ ID NO:267)、またはv10000(SEQ ID NO:99)のペルツズマブアームのVHを含む第1の重鎖可変ポリペプチドVH1および
(b) v5019(SEQ ID NO:35)、v5020(SEQ ID NO:35)、v7091(SEQ ID NO:35)、v6717(SEQ ID NO:259)、またはv10000(SEQ ID NO:71)のペルツズマブアームのVLを含む第1の軽鎖可変ポリペプチドVL1
を含み;
第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトscFvが、
(a) v5019(SEQ ID NO:179)、v5020(SEQ ID NO:157)、v7091(SEQ ID NO:305)、v6717(SEQ ID NO:179)、またはv10000(SEQ ID NO:305)のトラスツズマブアームのVHを含む第2の重鎖可変ポリペプチドVH2および
(b) v5019(SEQ ID NO:171)、v5020(SEQ ID NO:149)、v7091(SEQ ID NO:297)、v6717(SEQ ID NO:171)、またはv10000(SEQ ID NO:297)のトラスツズマブアームのVLを含む第2の軽鎖可変ポリペプチドVL2
を含む、
前記本発明のいずれかの抗原結合性コンストラクト。
[本発明1007]
第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトが、
i. アミノ酸配列SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、およびSEQ ID NO:337か、またはSEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、およびSEQ ID NO:348を含む3つのVH CDR配列を含むポリペプチドコンストラクト;
ii. SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、およびSEQ ID NO:337か、またはSEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、およびSEQ ID NO:348の3つのVH CDR配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む3つのVH CDR配列を含むポリペプチドコンストラクト;
iii. SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:339、およびSEQ ID NO:340か、またはSEQ ID NO:338、SEQ ID NO:347、およびSEQ ID NO:340の3つのVL CDR配列のアミノ酸配列を含む3つのVL CDR配列を含むポリペプチドコンストラクト;
iv. SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:339、およびSEQ ID NO:340か、またはSEQ ID NO:338、SEQ ID NO:347、およびSEQ ID NO:340と少なくとも90%同一である3つのVL CDR配列のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である3つのVL CDR配列を含むポリペプチドコンストラクト;
v. SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:337、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:339、およびSEQ ID NO:340か;またはSEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:347、およびSEQ ID NO:340の6つのCDR配列のアミノ酸配列を含む6つのCDR配列を含むポリペプチドコンストラクト;または
vi. SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:337、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:339、およびSEQ ID NO:340か;またはSEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:347、およびSEQ ID NO:340の6つのCDR配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む6つのCDR配列を含むポリペプチドコンストラクト
から選択され、かつ、
第2の抗原結合性ポリペプチドが、
vii. SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:342、およびSEQ ID NO:343の3つのVH CDR配列のアミノ酸配列を含む3つのVH CDR配列を含むポリペプチドコンストラクト;
viii. SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:342、およびSEQ ID NO:343の3つのVH CDR配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む3つのVH CDR配列を含むポリペプチドコンストラクト;
ix. SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345、およびSEQ ID NO:346の3つのVL CDR配列のアミノ酸配列を含む3つのVL CDR配列を含むポリペプチドコンストラクト;
x. SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345、およびSEQ ID NO:346の3つのVL CDR配列のアミノ酸配列と少なくとも90%同一である3つのVL CDR配列を含むポリペプチドコンストラクト;
xi. SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:342、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345、およびSEQ ID NO:346の6つのCDR配列のアミノ酸配列を含む6つのCDR配列を含むポリペプチドコンストラクト;または
xii. SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:342、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345、およびSEQ ID NO:346の6つのCDR配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む6つのCDR配列を含むポリペプチドコンストラクト
から選択される、
前記本発明のいずれかの抗原結合性コンストラクト。
[本発明1008]
第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトが(i)ECD2へのペルツズマブの結合を50%以上遮断し、かつ/または(ii)第2の抗原結合性ポリペプチドがECD4へのトラスツズマブの結合を50%以上遮断する、前記本発明のいずれかの抗原結合性コンストラクト。
[本発明1009]
第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトが、HER2 ECD2に特異的な前記v5019、v10000、v7091、v5020、またはv6717抗原結合性ポリペプチドコンストラクトの1つを含み、第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトが、HER2 ECD4に特異的な前記v5019、v10000、v7091、v5020、またはv6717抗原結合性ポリペプチドコンストラクトの1つを含む、前記本発明のいずれかの抗原結合性コンストラクト。
[本発明1010]
第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトが、HER2 ECD2に特異的な前記v5019、v10000、v7091、v5020、またはv6717抗原結合性ポリペプチドコンストラクトと少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を含み、第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトが、HER2 ECD4に特異的な前記v5019、v10000、v7091、v5020、またはv6717抗原結合性ポリペプチドコンストラクトと少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を含む、前記本発明のいずれかの抗原結合性コンストラクト。
[本発明1011]
v5019、v10000、v7091、v5020、およびv6717から選択される、前記本発明のいずれかの抗原結合性コンストラクト。
[本発明1012]
第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがFabであり、第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがscFvであり、前記抗原結合性コンストラクトが、2つのFabを有する基準二重パラトピック抗原結合性コンストラクトと比較して、
(i)HER2 3+細胞において受容体内部移行の増大を誘導し、かつ/または
(ii)ADCC(antibody directed cellular cytotoxicity)アッセイにおいて、HER2 1+細胞に対して、より高い効力を示す、
前記本発明のいずれかの抗原結合性コンストラクト。
[本発明1013]
第1および第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがscFvであり、前記抗原結合性コンストラクトが、2つのFabを有する基準抗原結合性コンストラクトと比較して、HER2 1+、2+、および3+細胞において受容体内部移行の増大を誘導する、前記本発明のいずれかの抗原結合性コンストラクト。
[本発明1014]
HER2 ECD2に一価で特異的に結合する1つまたは複数の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトを含み、各ポリペプチドコンストラクトがVHおよびVLを含み、該VHが、SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、およびSEQ ID NO:348の3つのVH CDR配列のアミノ酸配列を含む3つのCDR配列を含み、該VLが、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:347、およびSEQ ID NO:340の3つのVL CDR配列のアミノ酸配列を含む3つのCDR配列を含む、修飾ペルツズマブコンストラクト。
[本発明1015]
前記VHがv9996のVHを含み、前記VLがv9996のVLを含む、本発明1014の修飾ペルツズマブコンストラクト。
[本発明1016]
前記抗原結合性ポリペプチドコンストラクトが、v9996のVHおよびv9996のVLと少なくとも80%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一のアミノ酸配列を含む、本発明1014または1015の修飾ペルツズマブコンストラクト。
[本発明1017]
一価、二価、または多価である、本発明1014から1016のいずれかの修飾ペルツズマブコンストラクト。
[本発明1018]
(i)一価であり、FabまたはscFvを含むか、(ii)二価であり、FabおよびscFvを含むか、または(iii)二価であり、2つのscFvを含む、本発明1014から1017のいずれかの修飾ペルツズマブコンストラクト。
[本発明1019]
一価であり、HER2 ECD2について、ペルツズマブと比較して7〜9倍の親和性の増大を示す、本発明1014から1017のいずれかの修飾ペルツズマブコンストラクト。
[本発明1020]
リンカーを用いてまたは用いずに前記抗原結合性ポリペプチドコンストラクトに連結されている二量体Fcを含む、本発明1014から1019のいずれかの修飾ペルツズマブコンストラクト。
[本発明1021]
第1および第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクト、ならびにそれぞれCH3配列を含む第1および第2のFcポリペプチドを含み、第1のFcポリペプチドが、第1のリンカーを用いてまたは用いずに第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトに機能的に連結されていて、第2の単量体Fcポリペプチドが、第2のリンカーを用いてまたは用いずに第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトに機能的に連結されている、本発明1014から1020のいずれかの修飾ペルツズマブコンストラクト。
[本発明1022]
ポリペプチドリンカーを含む、本発明1020および1021のいずれかの修飾ペルツズマブコンストラクト。
[本発明1023]
前記リンカーがIgG1ヒンジ領域を含む、本発明1022の修飾ペルツズマブコンストラクト。
[本発明1024]
前記FcがヒトFcである、本発明1020および1021のいずれかの修飾ペルツズマブコンストラクト。
[本発明1025]
前記FcがヒトIgG1 Fcである、本発明1020および1021のいずれかの修飾ペルツズマブコンストラクト。
[本発明1026]
ヘテロ二量体Fcを含み、二量体化されたCH3配列が、約68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84、または85℃以上の融解温度(Tm)を有する、前記本発明のいずれかのコンストラクト。
[本発明1027]
発現させた場合に、約75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%超の純度で形成されるヘテロ二量体Fcを含む、前記本発明のいずれかのコンストラクト。
[本発明1028]
単一の細胞によって発現させた場合に、約75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99%超の純度で形成されるヘテロ二量体Fcを含む、前記本発明のいずれかのコンストラクト。
[本発明1029]
前記CH3配列の少なくとも1つにおいて、1つまたは複数の修飾を含むヘテロ二量体Fcを含む、前記本発明のいずれかのコンストラクト。
[本発明1030]
前記CH3配列の少なくとも1つにおいて、野生型ホモ二量体Fcに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進する1つまたは複数の修飾を含むヘテロ二量体Fcを含む、前記本発明のいずれかのコンストラクト。
[本発明1031]
野生型ホモ二量体Fcと比較して、EU付番に従うと、
i. 第1のFcポリペプチドにおいてT350V_L351Y_F405A_Y407Vの修飾、および第2のFcポリペプチドにおいてT366I_N390R_K392M_T394Wの修飾を有するヘテロ二量体IgG1 Fc;または
ii. 第1のFcポリペプチドにおいてL351Y_S400E_F405A_Y407Vの修飾、および第2のFcポリペプチドにおいてT350V_T366L_K392L_T394Wの修飾を有するヘテロ二量体IgG1 Fc、
iii. 第1のFcポリペプチドにおいてL351Y_F405A_Y407Vの修飾、および第2のポリペプチドにおいてT366L_K392M_T394Wの修飾を有するヘテロ二量体IgG1 Fc;
iv. 第1のFcポリペプチドにおいてL351Y_F405A_Y407Vの修飾、および第2のFcポリペプチドにおいてT366L_K392L_T394Wの修飾を有するヘテロ二量体IgG1 Fc;
v. 第1のFcポリペプチドにおいてT350V_L351Y_F405A_Y407Vの修飾、および第2のFcポリペプチドにおいてT350V_T366L_K392L_T394Wの修飾を有するヘテロ二量体IgG1 Fc;
vi. 第1のFcポリペプチドにおいてT350V_L351Y_F405A_Y407Vの修飾、および第2のFcポリペプチドにおいてT350V_T366L_K392M_T394Wの修飾を有するヘテロ二量体IgG1 Fc;または
vii. 第1のFcポリペプチドにおいてT350V_L351Y_S400E_F405A_Y407Vの修飾、および第2のFcポリペプチドにおいてT350V_T366L_N390R_K392M_T394Wの修飾を有するヘテロ二量体IgG1 Fc
を含む、前記本発明のいずれかのコンストラクト。
[本発明1032]
少なくとも1つのCH2ドメインを含むヘテロ二量体Fcを含む、前記本発明のいずれかのコンストラクト。
[本発明1033]
前記ヘテロ二量体Fcの前記CH2ドメインが1つまたは複数の修飾を含む、本発明1032のコンストラクト。
[本発明1034]
Fc−ガンマ受容体の選択的結合を促進する1つまたは複数の修飾を含むヘテロ二量体Fcを含む、前記本発明のいずれかのコンストラクト。
[本発明1035]
グリコシル化されている、前記本発明のいずれかのコンストラクト。
[本発明1036]
薬物にコンジュゲートされている、前記本発明のいずれかのコンストラクト。
[本発明1037]
前記薬物がメイタンシン(DM1)である、本発明1036のコンストラクト。
[本発明1038]
SMCCリンカーでDM1にコンジュゲートされている、本発明1036のコンストラクト。
[本発明1039]
前記本発明のいずれかのコンストラクトと薬学的担体とを含む、薬学的組成物。
[本発明1040]
前記薬学的担体が、緩衝剤、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート化剤、安定剤、または添加剤を含む、本発明1039の薬学的組成物。
[本発明1041]
本発明1001から1038のいずれかのコンストラクトを含む、医療において使用するための薬学的組成物。
[本発明1042]
本発明1001から1038のいずれかのコンストラクトを含む、癌を処置する際に使用するための薬学的組成物。
[本発明1043]
本発明1001から1038のいずれかのコンストラクトまたは本発明1039から1042のいずれかの薬学的組成物の有効量を対象に投与することを含む、HER2発現(HER2+)腫瘍を有する対象を処置する方法。
[本発明1044]
前記処置の結果が、前記腫瘍の縮小、前記腫瘍の増殖の阻害、前記腫瘍が進行するまでの時間の増大、前記対象の無病生存期間の延長、転移の低減、前記対象の無進行生存期間の増大、または前記対象の全生存期間の増大である、本発明1043の方法。
[本発明1045]
前記腫瘍が、膵臓癌、頭頚部癌、胃癌、結腸直腸癌、乳癌、腎臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮癌、悪性黒色腫、咽頭癌、口腔癌、または皮膚癌である、本発明1043または1044の方法。
[本発明1046]
前記腫瘍が、腫瘍細胞1個当たり平均10,000以上のHER2のコピーを発現する細胞を含む、本発明1043から1045のいずれかの方法。
[本発明1047]
前記腫瘍が、免疫組織化学(IHC)によって判定した場合にHER2 1+、HER2 2+、またはHER2 3+である、本発明1043から1046のいずれかの方法。
[本発明1048]
前記腫瘍がHER2を、IHCによって判定した場合に2+以下のレベルで発現する、本発明1047の方法。
[本発明1049]
前記HER2+腫瘍が、IHCによって判定した場合にHER2 2+/3+を発現し、遺伝子増幅されていて、かつトラスツズマブに対して中程度に感受性がある卵巣癌である、本発明1043の方法。
[本発明1050]
前記HER2+腫瘍が、免疫組織化学(IHC)によって判定した場合にHER2を2+レベル以下で発現する乳癌である、本発明1043の方法。
[本発明1051]
前記HER2+腫瘍が、(i)HER2 3+、エストロゲン受容体陰性(ER−)、プロゲステロン受容体陰性(PR−)、トラスツズマブ抵抗性、化学療法抵抗性の侵襲性導管性乳癌、(ii)HER2 3+、ER−、PR−、トラスツズマブ抵抗性の炎症性乳癌、(iii)HER2 3+、ER−、PR−の侵襲性腺管癌、または(iv)HER2 2+、HER2遺伝子増幅、トラスツズマブおよびペルツズマブ抵抗性乳癌である、本発明1043の方法。
[本発明1052]
前記対象が、抗HER2抗体で以前に処置されていない、本発明1043から1051のいずれかの方法。
[本発明1053]
前記腫瘍が、ペルツズマブ、トラスツズマブ、および/またはTDM1に対して抵抗性または難治性である、本発明1043から1051のいずれかの方法。
[本発明1054]
前記対象が、ペルツズマブ、トラスツズマブ、および/またはTDM1で以前に処置されている、本発明1043から1051のいずれかの方法。
[本発明1055]
前記コンストラクトが、v5019、v10000、v7091、v5020、またはv6717から選択される、本発明1043から1054のいずれかの方法。
[本発明1056]
投与を注射または注入によって行う、本発明1043から1055のいずれかの方法。
[本発明1057]
前記対象に、追加の薬剤、任意選択で化学療法薬を投与することをさらに含む、本発明1043から1056のいずれかの方法。
[本発明1058]
i. 前記腫瘍が非小細胞肺癌であり、前記追加の薬剤が、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、アルブミン結合パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、ビノレルビン、イリノテカン、エトポシド、ビンブラスチン、またはペメトレキセドのうちの1種または複数種であり;
ii. 前記腫瘍が胃癌であり、前記追加の薬剤が、5−フルオロウラシル(フォリン酸を含むか、または含まない)、カペシタビン、カルボプラチン、シスプラチン、ドセタキセル、エピルビシン、イリノテカン、オキサリプラチン、またはパクリタキセルのうちの1種または複数種であり;
iii. 前記腫瘍が膵臓癌であり、前記追加の薬剤が、ゲムシタビン、フォルフィリノックス、アブラキサン、または5−フルオロウラシルのうちの1種または複数種であり;
iv. 前記腫瘍がエストロゲンおよび/またはプロゲステロン陽性乳癌であり、前記追加の薬剤が、(a)ドキソルビシンおよびエピルビシンの組み合わせ、(b)パクリタキセルおよびドセタキセルの組み合わせ、または(c)フルオロウラシル、シクロホスファミド、およびカルボプラチンの組み合わせのうちの1つまたは複数であり;
v. 前記腫瘍が頭頚部癌であり、前記追加の薬剤が、パクリタキセル、カルボプラチン、ドキソルビシン、またはシスプラチンのうちの1種または複数種であり;
vi. 前記腫瘍が卵巣癌であり、前記追加の薬剤が、シスプラチン、カルボプラチン、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルなどのタキサンのうちの1種または複数種である、
本発明1057の方法。
[本発明1059]
前記対象がヒトである、本発明1043から1058のいずれかの方法。
[本発明1060]
本発明1001から1038のいずれかの抗原結合性コンストラクトに試料を接触させ、結合した複合体を検出または測定することを含む、試料中のHER2を検出または測定する方法。
[本発明1061]
本発明1001から1038のいずれかの抗原結合性コンストラクトの有効量を細胞に投与することを含む、細胞においてHER2シグナル伝達を阻害、低減、または遮断する方法。
[本発明1062]
HER2発現腫瘍細胞を死滅させるか、またはその増殖を阻害する方法であって、前記細胞を、本発明1001から1038のいずれかの抗原結合性コンストラクトと接触させること含む、前記方法。
[本発明1063]
前記腫瘍細胞が、HER2 1+もしくは2+ヒト膵臓癌細胞、HER2 3+ヒト肺癌細胞、HER2 2+白色人種気管支肺胞癌細胞、ヒト咽頭癌細胞、HER2 2+ヒト舌扁平上皮細胞癌細胞、咽頭のHER2 2+扁平上皮細胞癌細胞、HER2 1+または2+ヒト結腸直腸癌細胞、HER2 3+ヒト胃癌細胞、HER2 1+ヒト乳房腺管ER+(エストロゲン受容体陽性)癌細胞、HER2 2+/3+ヒトER+、HER2増幅乳癌細胞、HER2 0+/1+ヒト三重陰性乳癌細胞、HER2 2+ヒト子宮内膜様癌細胞、HER2 1+肺転移悪性黒色腫細胞、HER2 1+ヒト子宮頸癌細胞、Her2 1+ヒト腎細胞癌細胞、またはHER2 1+ヒト卵巣癌細胞である、本発明1062の方法。
[本発明1064]
前記腫瘍細胞が、HER2 1+もしくは2+もしくは3+ヒト膵臓癌細胞、HER2 2+転移性膵臓癌細胞、HER2 0+/1+、+3+ヒト肺癌細胞、HER2 2+白色人種気管支肺胞癌細胞、HER2 0+未分化肺癌、ヒト非小細胞肺癌細胞、ヒト咽頭癌細胞、HER2 2+ヒト舌扁平上皮細胞癌細胞、咽頭のHER2 2+扁平上皮細胞癌細胞、HER2 1+もしくは2+ヒト結腸直腸癌細胞、HER2 0+、1+、もしくは3+ヒト胃癌細胞、HER2 1+ヒト乳房腺管ER+(エストロゲン受容体陽性)癌細胞、HER2 2+/3+ヒトER+、HER2増幅乳癌細胞、HER2 0+/1+ヒト三重陰性乳癌細胞、HER2 0+ヒト乳房腺管癌(Basal B、間葉状三重陰性)細胞、HER2 2+ ER+乳癌、HER2 0+ヒト転移性乳癌細胞(ER−、HER2増幅、ルミナールA、TN)、ヒト子宮中胚葉腫瘍(混合グレードIII)細胞、2+ヒト子宮内膜様癌細胞、HER2 1+ヒト皮膚類表皮癌細胞、HER2 1+肺転移悪性黒色腫細胞、HER2 1+悪性黒色腫細胞、ヒト子宮頸類表皮癌細胞、HER2 1+ヒト膀胱癌細胞、HER2 1+ヒト子宮頸癌細胞、Her2 1+ヒト腎細胞癌細胞、またはHER2 1+、2+、もしくは3+ヒト卵巣癌細胞であり、前記抗原結合性コンストラクトがメイタンシン(DM1)にコンジュゲートされている、本発明1062の方法。
[本発明1065]
前記腫瘍細胞が、膵臓腫瘍細胞系のBxPC3、Capan−1、MiaPaca2;肺腫瘍細胞系のCalu−3、NCI−H322;頭頚部腫瘍細胞系のDetroit 562、SCC−25、FaDu;結腸直腸腫瘍細胞系のHT29、SNU−C2B;胃腫瘍細胞系のNCI−N87;乳房腫瘍細胞系のMCF−7、MDAMB175、MDAMB361、MDA−MB−231、BT−20、JIMT−1、SkBr3、BT−474;子宮腫瘍細胞系のTOV−112D;皮膚腫瘍細胞系のMalme−3M;子宮頸部腫瘍細胞系のCaski、MS751;膀胱腫瘍細胞系のT24、卵巣腫瘍細胞系のCaOV3、およびSKOV3から選択される細胞である、本発明1062の方法。
[本発明1066]
前記腫瘍細胞が、膵臓腫瘍細胞系のBxPC3、Capan−1、MiaPaca2、SW1990、Panc1;肺腫瘍細胞系のA549、Calu−3、Calu−6、NCI−H2126、NCI−H322;頭頚部腫瘍細胞系のDetroit562、SCC−15、SCC−25、FaDu;結腸直腸腫瘍細胞系のColo201、DLD−1、HCT116、HT29、SNU−C2B;胃腫瘍細胞系のSNU−1、SNU−16、NCI−N87;乳房腫瘍細胞系のSkBr3、MCF−7、MDAMB175、MDAMB361、MDA−MB−231、ZR−75−1、BT−20、BT549、BT−474、CAMA−1、MDAMB453、JIMT−1、T47D;子宮腫瘍細胞系のSK−UT−1、TOV−112D;皮膚腫瘍細胞系のA431、Malme−3M、SKEMEL28;子宮頸部腫瘍細胞系のCaski、MS751;膀胱腫瘍細胞系のT24、腎臓腫瘍細胞系のACHN;卵巣腫瘍細胞系のCaOV3、Ovar−3、およびSKOV3から選択される細胞であり、前記抗原結合性コンストラクトがメイタンシンにコンジュゲートされている、本発明1062の方法。
[本発明1067]
前記腫瘍細胞が、HER2 2/3+遺伝子増幅卵巣癌細胞、HER2 0+/1+三重陰性乳癌細胞;ER+、HER2 1+乳癌細胞;トラスツズマブ抵抗性HER2 2+乳癌細胞;ER+、HER2+乳癌細胞;またはHER2 3+乳癌細胞から選択される、本発明1062の方法。
[本発明1068]
本発明1001から1038のいずれかのコンストラクトを製造する方法であって、前記抗原結合性コンストラクトを発現させるために適した条件下で、本発明1001から1038のいずれかの抗原結合性コンストラクトをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、前記コンストラクトを精製することを含む、前記方法。
[本発明1069]
本発明1001から1038のいずれかの抗原結合性コンストラクトの少なくとも1つのポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸配列を含む単離ポリヌクレオチドまたは単離ポリヌクレオチドのセット。
[本発明1070]
前記ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットがcDNAである、本発明1069のポリヌクレオチド。
[本発明1071]
v5019、v7091、v10000、v5020、またはv6717をコードするポリヌクレオチドまたは単離ポリヌクレオチドのセット。
[本発明1072]
本発明1069から1071のいずれかのポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットのうちの1つまたは複数を含むベクターまたはベクターのセット。
[本発明1073]
プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、発現ベクター、および組換え発現ベクターからなる群から選択される、本発明1072のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのセットのうちの1つまたは複数を含むベクターまたはベクターのセット。
[本発明1074]
本発明1069から1071のいずれかのポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット、または本発明1072もしくは1073のベクターもしくはベクターのセットを含む、単離細胞。
[本発明1075]
ハイブリドーマ、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはHEK293細胞である、本発明1074の単離細胞。
[本発明1076]
本発明1001から1038のいずれかのコンストラクトと使用説明書とを含むキット。
[本発明1077]
非フコシル化されている、本発明1035のコンストラクト。
HER2(ヒト上皮成長因子受容体2)発現細胞上のHER2 ECD2(細胞外ドメイン2)抗原に一価で特異的に結合する第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトと、HER2発現細胞上のHER2 ECD4(細胞外ドメイン4)抗原に一価で特異的に結合する第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトとを含み、ECD2またはECD4結合性ポリペプチドコンストラクトの少なくとも1つがscFvである抗原結合性コンストラクトを本明細書において記載する。ある特定の実施形態では、ECD2結合性ポリペプチドコンストラクトはscFvであり、ECD4結合性ポリペプチドコンストラクトはFabである。ある特定の実施形態では、ECD2結合性ポリペプチドコンストラクトはFabであり、ECD4結合性ポリペプチドコンストラクトはscFvである。いくつかの実施形態では、ECD2およびECD4結合性ポリペプチドコンストラクトは両方ともscFvである。いくつかの実施形態では、抗原結合性コンストラクトは、CH3配列を含む二量体Fcを有する。いくつかの実施形態では、Fcは、CH3配列において、野生型ホモ二量体Fcに匹敵する安定性を有するヘテロ二量体の形成を促進する1つまたは複数の修飾を有するヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体CH3配列は、68℃以上の融解温度(Tm)を有する。
HER2に結合する二重特異性抗原結合性コンストラクトを、本明細書において提供する。二重特異性抗原結合性コンストラクトは、HER2の異なるエピトープにそれぞれ特異的に結合する2つの抗原結合性ポリペプチドコンストラクトを含む。いくつかの実施形態では、抗原結合性コンストラクトは、既知の抗体または抗原結合性コンストラクトから誘導されている。下記でより詳細に記載するとおり、抗原結合性ポリペプチドコンストラクトは、限定されないが、Fab(抗原結合性フラグメント)、scFv(一本鎖Fv)、およびsdab(シングルドメイン抗体)などのタンパク質コンストラクトであり得る。典型的には、抗原結合性コンストラクトはFcを含む。
二重特異性抗原結合性コンストラクトは、HER2の特定のドメインまたはエピトープにそれぞれ結合する2つの抗原結合性ポリペプチドコンストラクトを含む。一実施形態では、各抗原結合性ポリペプチドコンストラクトは、HER2の細胞外ドメイン、例えば、ECD2またはECD4に結合する。抗原結合性ポリペプチドコンストラクトは、用途に応じて、例えば、FabまたはscFvであり得る。
2つの抗原結合性ポリペプチドコンストラクトを有し、その第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがHER2 ECD2に特異的に結合し、その第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトがHER2 ECD4に特異的に結合する二重パラトピックHER2抗原結合性コンストラクトを本明細書において提供する。抗原結合性コンストラクトの形式は、第1または第2の抗原結合性ポリペプチドの少なくとも1つがscFvであるような形式である。抗原結合性コンストラクトの形式は、scFv−scFv、またはFab−scFv、またはscFv−Fabであり得る(それぞれ、第1の抗原結合性ポリペプチドコンストラクト−第2の抗原結合性ポリペプチド)。
本明細書に記載の抗原結合性コンストラクトは、HER2のECD2およびECD4に結合する抗原結合性ポリペプチドコンストラクトを有する。
抗原結合性ポリペプチドコンストラクトは、ドメインの種類に関わらず、公知の抗HER2抗体または抗HER2結合性ドメインから誘導され得る。ドメインの種類の例には、Fab断片、scFv、およびsdAbが含まれる。さらに、公知の抗HER2抗体の抗原結合性部分または結合性ドメインがFabであるならば、そのFabを、scFvに変換することができる。同様に、公知の抗HER2抗体の抗原結合性部分または結合性ドメインがscFvであるならば、そのscFvをFabに変換することができる。抗原結合性ドメインの種類を変換する方法は、当技術分野で公知である(例えば、例えばZhou et al (2012) Mol Cancer Ther 11:1167−1476に記載のscFvをFab形式に変換するための方法を参照されたい。そこに記載の方法は、参照によって組み込まれる)。
いくつかの実施形態では、抗原結合性コンストラクトは、親和性成熟を使用する公知のHER2結合抗体から誘導されている。
表A4. トラスツズマブ−HER2系についてHER2への結合を増大させることが知られているトラスツズマブ変異
表A5. ペルツズマブ−HER2系についてHER2への結合を増大させることが知られているペルツズマブ変異
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性コンストラクトは、Fc、例えば、二量体Fcを含む。
いくつかの態様では、本明細書に記載の抗原結合性コンストラクトは、非対称に修飾されている修飾CH3ドメインを含むヘテロ二量体Fcを含む。ヘテロ二量体Fcは、2つの重鎖定常ドメインポリペプチド、すなわち、第1のFcポリペプチドおよび第2のFcポリペプチドを含むことができ、これらは、Fcが1つの第1のFcポリペプチドおよび1つの第2のFcポリペプチドを含むという条件で、互換的に使用され得る。一般に、第1のFcポリペプチドは、第1のCH3配列を含み、第2のFcポリペプチドは、第2のCH3配列を含む。
表A:IgG1 Fc配列
いくつかの実施形態では、抗原結合性コンストラクトのFcは、CH2ドメインを含む。FcのCH2ドメインの一例は、表Aにおいて示した配列のアミノ酸231〜340である。複数のエフェクター機能が、抗体のFcに結合するFc受容体(FcR)によって媒介される。
S298A/E333A/K334A、S298A/E333A/K334A/K326A(Lu Y, Vemes JM, Chiang N, et al. J Immunol Methods. 2011 Feb 28;365(1−2): 132−41);
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(Stavenhagen JB, Gorlatov S, Tuaillon N, et al. Cancer Res. 2007 Sep 15;67(18):8882−90; Nordstrom JL, Gorlatov S, Zhang W, et al. Breast Cancer Res. 2011 Nov 30;13(6):R123);
F243L(Stewart R, Thom G, Levens M, et al. Protein Eng Des Sel. 2011 Sep;24(9):671−8)、S298A/E333A/K334A(Shields RL, Namenuk AK, Hong K, et al. J Biol Chem. 2001 Mar 2;276(9):6591−604);
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S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E、S239D/I332E/S298A、S239D/K326E/A330L/I332E/S298A、G236A/S239D/D270L/I332E、S239E/S267E/H268D、L234F/S267E/N325L、G237F/V266L/S267D、ならびに参照によって本明細書に組み込まれるWO2011/120134およびWO2011/120135に列挙されている他の変異。Therapeutic Antibody Engineering(William R. Strohl and Lila M. Strohl, Woodhead Publishing series in Biomedicine No 11, ISBN 1 907568 37 9, Oct 2012)は、283頁において変異を列挙している。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性コンストラクトは、エフェクター機能を媒介するその能力を改善するための修飾を含む。そのような修飾は、当技術分野で公知であり、それらには、非フコシル化、またはADCCのための受容体、主にFCGR3aの活性化およびCDCのためのC1qに向けてのFcの親和性の操作が含まれる。次の表Bに、エフェクター機能を操作するために文献において報告された様々な設計をまとめる。
表B:CH2ドメインおよびエフェクター機能操作
抗原結合性コンストラクトの抗原結合性ポリペプチドコンストラクトのそれぞれは、相互に共有結合を形成し得るリンカーポリペプチドに機能的に連結されている。本明細書に記載の二重特異性抗原結合性コンストラクトの内容において、2個の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトは、Fab−scFvまたはscFv−scFv形式であるが、第1および第2の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトをリンカーポリペプチドと共に含む抗原結合性コンストラクトの空間的コンホメーションは、パパイン分解によって生じるF(ab')2断片のパラトープの相対的空間的コンホメーションに相似している。
いくつかの実施形態では、抗原結合性コンストラクトは、限定されないが、解離定数および最大結合を含む機能特性によって記載される。
一実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗原結合性コンストラクトは、それぞれ対応する単一特異性二価抗原結合性コンストラクトと比較して(すなわち、ECD2に結合する単一特異性二価抗原結合性コンストラクトまたはECD4に結合する単一特異性二価抗原結合性コンストラクトと比較して)、かつ/または2つの単一特異性二価抗原結合性コンストラクトの組み合わせと比較して、エフェクター機能の増大を示す。抗体「エフェクター機能」は、抗体のFcドメイン(天然配列Fcドメインまたはアミノ酸配列変異型Fcドメイン)に帰せられる生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、C1q結合;補体依存性細胞傷害性(CDC);Fc受容体結合;抗体依存性細胞媒介細胞傷害性(ADCC);抗体依存性細胞食作用(ADCP);細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体;BCR)のダウンレギュレーションなどが含まれる。
したがって一実施形態では、二重特異性抗原結合性コンストラクトは、Fab−scFv形式であり、ADCCアッセイにおいて、1+レベルでHER2を発現する細胞において、Fab−Fab形式である形式基準抗原結合性コンストラクトよりも高い効力を示す。
本明細書に記載の二重特異性抗原結合性コンストラクトは、受容体HER2への結合によって、HER2+細胞に内部移行される。したがって、本明細書に記載の二重特異性抗原結合性コンストラクトは、HER2+細胞において受容体内部移行を誘導し得る。一実施形態では、二重特異性抗原結合性コンストラクトは、Fab−scFv形式であり、3+レベルでHER2を発現する細胞において、Fab−Fab形式である形式基準抗原結合性コンストラクトよりも大きいHER2内部移行を誘導する。一実施形態では、二重特異性抗原結合性コンストラクトは、Fab−scFv形式であり、2+または3+レベルでHER2を発現する細胞において、Fab−Fab形式である形式基準抗原結合性コンストラクトよりも大きなHER2内部移行を誘導する。一実施形態では、二重特異性抗原結合性コンストラクトは、scFv−scFv形式であり、1+、2+、または3+レベルでHER2を発現する細胞において、Fab−Fab形式である形式基準抗原結合性コンストラクトよりも大きなHER2内部移行を誘導する。
二重特異性抗原結合性コンストラクトは、本明細書の他の箇所で記載されているとおりADCとして調製され得、細胞に対して細胞傷害性である。一実施形態では、二重特異性抗原結合性コンストラクトADCは、HER2+乳癌細胞における細胞傷害性または細胞生存アッセイにおいて、HER2 1+、2+、2+/3+、または3+細胞において、トラスツズマブもしくはその類似体である基準抗原結合性コンストラクト、またはT−DM1およびペルツズマブの組み合わせである基準抗原結合性コンストラクトよりも高い効力を示す。
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合性コンストラクトは、1種または複数種のFcγRへの、より高い結合能(Rmax)を示す。一実施形態では、二重特異性抗原結合性コンストラクトは、ホモ二量体Fcを有するv506またはv6246である基準抗原結合性コンストラクトと比較して約1.3〜2倍の1種または複数種のFcγRに対するRmaxの増大を示す。一実施形態では、二重特異性抗原結合性コンストラクトは、基準二価抗原結合性コンストラクトと比較して約1.3〜1.8倍のCD16 FcγRに対するRmaxの増大を示す。一実施形態では、二重特異性抗原結合性コンストラクトは、基準二価抗原結合性コンストラクトと比較して約1.3〜1.8倍のCD32 FcγRに対するRmaxの増大を示す。一実施形態では、二重特異性抗原結合性コンストラクトは、基準二価抗原結合性コンストラクトと比較して約1.3〜1.8倍のCD64 FcγRに対するRmaxの増大を示す。
本明細書において提供する二重特異性抗原結合性コンストラクトは、トラスツズマブなどの基準抗原結合性コンストラクトと比較して、FcγRについての親和性の増大を有する。結合から生じるFc濃度の上昇は、ADCCおよび/または他の免疫エフェクターの死滅機構の増大と一致する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性コンストラクトは、FcRnに結合し得る。当技術分野で公知のとおり、FcRnへの結合は、細胞内取り込みされた抗体をエンドソームから血流へと戻して再循環させる(Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181− 220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739−766)。このプロセスは、全長分子のサイズが大きいことによる腎臓濾過の除外と結びついて、1〜3週間の範囲の好ましい抗体血清半減期をもたらす。FcRnへのFcの結合も、抗体輸送において重要な役割を果たす。
ある特定の実施形態では、本明細書において提供する二重特異性抗原結合性コンストラクトは、市販の治療用抗体に匹敵する薬物動態(PK)特性を示す。一実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗原結合性コンストラクトは、血清濃度、t1/2、ベータ半減期、および/またはCLに関して既知の治療用抗体と同等のPK特性を示す。一実施形態では、二重特異性抗原結合性コンストラクトは、上記単一特異性二価抗原結合性コンストラクトに匹敵するか、それ以上のin vivo安定性を示す。そのようなin vivo安定性パラメータには、血清濃度、t1/2、ベータ半減期、および/またはCLが含まれる。
二重特異性抗原結合性コンストラクトのエフェクター機能を、次のとおりに試験することができる。in vitroおよび/またはin vivo細胞傷害性アッセイを、ADCP、CDC、および/またはADCC活性を評価するために行うことができる。例えば、Fc受容体(FcR)結合アッセイを、FcγR結合を測定するために行うことができる。ADCCを媒介するための一次細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現するが、単球は、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。造血細胞上でのFcR発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457−92 (1991)の464頁の表3においてまとめられている。対象分子のADCC活性を評価するためのin vitroアッセイの例は、米国特許第5,500,362号または同第5,821,337号に記載されている。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。別法では、または加えて、対象分子のADCC活性は、in vivoで、例えば、Clynes et al. PNAS (USA) 95:652−656 (1998)において開示されているものなどの動物モデルにおいて評価することができる。二重特異性抗原結合性コンストラクトがC1qに結合し得るか、したがって、CDCを活性化し得るかどうかを決定するために、C1q結合アッセイを実施することもできる。補体活性化を評価するために、例えば、Gazzano−Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)において記載されているとおりのCDCアッセイを行うことができる。抗体の、SPRなどによるFcRn結合およびin vivo PK決定も、当技術分野で周知の方法を使用して行うことができる。
本明細書に記載の抗原結合性コンストラクトまたは薬学的組成物を、ヒトにおいて使用する前に、所望の治療活性または予防活性についてin vitroで、次いでin vivoで試験する。例えば、化合物または薬学的組成物の治療有用性または予防有用性を実証するためのin vitroアッセイには、細胞系または患者組織試料での化合物の効果が含まれる。細胞系および/または組織試料に対する化合物または組成物の効果は、限定されないが、ロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイを含む、当業者に知られている技術を利用して決定することができる。本発明に従って、具体的な抗原結合性コンストラクトの投与が適応であるかどうかを決定するために使用することができるin vitroアッセイには、in vitro細胞培養アッセイ、または患者組織試料を培養において増殖させ、抗原結合性コンストラクトに曝露するか、または別の方法でそれを投与し、その組織試料に対するそのような抗原結合性コンストラクトの効果を観察するin vitroアッセイが含まれる。
表D 対象細胞系におけるHER2の相対的発現レベル
表E:HER2結合性抗原結合性コンストラクトを試験するための動物モデル
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の二重特異性抗原結合性コンストラクトの機能特性を、基準抗原結合性コンストラクトの機能特性と比較する。基準抗原結合性コンストラクトが何であるかは、測定される機能特性、または成される識別に依存する。例えば、例示的な二重特異性抗原結合性コンストラクトの機能特性を比較する場合、基準抗原結合性コンストラクトは、例えば、v506などのトラスツズマブ類似体であり得るか、またはトラスツズマブおよびペルツズマブ(v4184)などの抗体の組合せであり得る。二重特異性抗原結合性コンストラクトの形式が比較されている実施形態では、基準抗原結合性コンストラクトは、例えば、両方の抗原結合性部分がFab−Fab形式(形式基準抗原結合性コンストラクト)である二重パラトピック抗HER2抗体である。後者のコンストラクトの例には、v6902およびv6903が含まれる。
ある特定の実施形態では、抗原結合性コンストラクトは、薬物、例えば、毒素、化学療法薬、免疫変調薬、または放射性同位体にコンジュゲートされている。ADC(抗体薬物コンジュゲートまたは抗原結合性コンストラクト薬物コンジュゲート)を調製するいくつかの方法が、当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第8,624,003号(ポット方法)、同第8,163,888号(1ステップ)、および同第5,208,020号(2ステップ法)に記載されている。
ADCの様々な実施形態において使用される薬物またはペイロードの非限定的例には、DM1(メイタンシン、N2'−デアセチル−N2'−(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−またはN2'−デアセチル−N2'−(3−メルカプト−1−オキソプロピル)−メイタンシン)、mc−MMAD(6−マレイミドカプロイル−モノメチルオーリスタチン−DまたはN−メチル−L−バリル−N−[(1S,2R)−2−メトキシ−4−[(2S)−2−[(1R,2R)−1−メトキシ−2−メチル−3−オキソ−3−[[(1S)−2−フェニル−1−(2−チアゾリル)エチル]アミノ]プロピル]−1−ピロリジニル]−1−[(1S)−1−メチルプロピル]−4−オキソブチル]−N−メチル−(9Cl)−L−バリンアミド)、mc−MMAF(マレイミドカプロイル−モノメチルオーリスタチンFまたはN−[6−(2,5−ジヒドロ−2,5−ジオキソ−1H−ピロル−1−イル)−1−オキソヘキシル]−N−メチル−L−バリル−L−バリル−(3R,4S,5S)−3−メトキシ−5−メチル−4−(メチルアミノ)ヘプタノイル−(αR,βR,2S)−β−メトキシ−α−メチル−2−ピロリジンプロパノイル−L−フェニルアラニン)およびmc−Val−Cit−PABA−MMAE(6−マレイミドカプロイル−ValcCit−(p−アミノベンジルオキシカルボニル)−モノメチルオーリスタチンEまたはN−[[[4−[[N−[6−(2,5−ジヒドロ−2,5−ジオキソ−1H−ピロール−1−イル)−1−オキソヘキシル]−L−バリル−N5−(アミノカルボニル)−L−オルニチル]アミノ]フェニル]メトキシ]カルボニル]−N−メチル−L−バリル−N−[(1S,2R)−4−[(2S)−2−[(1R,2R)−3−[[(1R,2S)−2−ヒドロキシ−1−メチル−2−フェニルエチル]アミノ]−1−メトキシ−2−メチル−3−オキソプロピル]−1−ピロリジニル]−2−メトキシ−1−[(1S)−1−メチルプロピル]−4−オキソブチル]−N−メチル−L−バリンアミド)が含まれる。DM1は、チューブリン阻害薬メイタンシンの誘導体であり、MMAD、MMAE、およびMMAFは、オーリスタチン誘導体である。
上で示したとおり、いくつかの実施形態では、薬物はメイタンシノイドである。例示的なメイタンシノイドには、DM1、DM3(N2'−デアセチル−N2'−(4−メルカプト−1−オキソペンチル)メイタンシン)、およびDM4(N2'−デアセチル−N2'−(4−メチル−4−メルカプト−1−オキソペンチル)メチルメイタンシン)(米国特許出願公開第20090202536を参照されたい)が含まれる。
いくつかの実施形態では、薬物は、オーリスタチンE(ドラスタチン−10の誘導体としても当技術分野で公知)またはその誘導体などのオーリスタチンである。オーリスタチンは、例えば、オーリスタチンEおよびケト酸との間で形成されるエステルであってよい。例えば、オーリスタチンEを、パラアセチル安息香酸またはベンゾイル吉草酸と反応させて、それぞれAEBおよびAEVBを生じさせることができる。他の典型的なオーリスタチンには、AFP、MMAF、およびMMAEが含まれる。例示的なオーリスタチンの合成および構造は、それぞれ、その全体があらゆる目的について参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第6,884,869号、同第7,098,308号、同第7,256,257号、同第7,423,116号、同第7,498,298号、および同第7,745,394号において記載されている。
いくつかの実施形態では、抗原結合性コンストラクトを、化学療法薬にコンジュゲートさせる。例には、限定されないが、シスプランチン(Cisplantin)およびラパチニブが含まれる。「化学療法薬」は、癌を治療する際に有用な化学化合物である。
いくつかの実施形態では、薬物は、リンカーによって抗原結合性コンストラクト、例えば、抗体に連結されている。抗体へのリンカーの結合は、表面リシン、酸化炭水化物への還元的カップリングによる方法、および鎖間ジスルフィド連結を還元することによって遊離されたシステイン残基による方法などの様々な方法で達成することができる。ヒドラゾン−、ジスルフィド−、およびペプチドベースの連結を含む様々なADC連結系が、当技術分野で公知である。
ADCは、(1)共有結合によって抗体−リンカー中間体Ab−Lを形成するための、抗体の求核性基または求電子性基と二価リンカー試薬との反応、続く、活性化薬物部分Dとの反応;および(2)共有結合によって、薬物−リンカー中間体D−Lを形成するための、薬物部分の求核性基または求電子性基とリンカー試薬との反応、続く、抗体の求核性基または求電子性基との反応を含む、当業者に知られている有機化学の反応、条件、および試薬を使用するいくつかの経路によって調製することができる。コンジュゲーション方法(1)および(2)を、様々な抗体、薬物部分、およびリンカーで使用して、本明細書に記載の抗体−薬物コンジュゲートを調製することができる。
本明細書に記載の抗原結合性コンストラクトは、例えば、米国特許第4,816,567号に記載されているとおりの組換え方法および組成物を使用して生成することができる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合性コンストラクトは、翻訳の間、またはその後に差別的に修飾される。
本明細書に記載の抗原結合性コンストラクトを含む薬学的組成物も、本明細書において提供する。薬学的組成物は、コンストラクトおよび薬学的に許容される担体を含む。
ある特定の実施形態では、処置、予防、または寛解が望まれる対象に、疾患または障害を処置、予防、または寛解するために有効な量の本明細書に記載の抗原結合性コンストラクトを投与することを含む、疾患または障害を処置する方法を提供する。
本明細書に記載の抗原結合性コンストラクトを使用して、対象においてHER2+癌または腫瘍を処置する方法、およびHER2+腫瘍細胞の増殖を阻害するか、またはHER2+腫瘍細胞を死滅させる方法を本明細書において記載する。
スコア0
染色が観察されないか、または膜染色が、腫瘍細胞の10%未満において観察される。
スコア1+
かすかに/かろうじて認知可能な膜染色が、腫瘍細胞の10%超で検出される。細胞は、それらの膜の一部において染色されるだけである。
スコア2+
弱から中程度の膜全体の染色が、腫瘍細胞の10%超において観察される。
スコア3+
中程度から強度の膜全体の染色が、腫瘍細胞の10%超において観察される。
また、1種または複数種の抗原結合性コンストラクトを含むキットを本明細書において記載する。キットの個々の構成要素は、別々の容器に包装され、かつそのような容器に付随して、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって指示された形態での注意書であってよく、その際、その注意書は、製造、使用、または販売についての機関による認可を反映する。キットは、任意選択により、抗原結合性コンストラクトの使用方法または投与レジメンを概説する説明書または指示書を含むことができる。
本明細書に記載の抗原結合性コンストラクトは、少なくとも1種のポリペプチドを含む。本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも記載する。抗原結合性コンストラクトは典型的には、単離されている。
いくつかの例示的な抗HER2二重パラトピック抗体(または抗原結合性コンストラクト)および対照を、下記のとおりに調製した。抗体および対照を種々の形式で調製し、例示的な二重パラトピック形式の表現を図1において示す。図1に示されている形式のすべてにおいて、ヘテロ二量体Fcは、黒色で示されている一方の鎖(鎖A)および灰色で示されている他方の鎖(鎖B)で図示されており、一方の抗原結合性ドメイン(1)は、斜線を掛けて示されており、他方の抗原結合性ドメイン(2)は白色で示されている。
例示的な抗HER2二重パラトピック抗体を、表1において示すとおりに調製した。
(表1)例示的な抗HER2二重パラトピック抗体
注釈:
・EU抗体の付番を参照しての、KabatでのEUインデックスによるCH3付番(Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78−85);
・KabatによるFabまたは可変ドメイン付番(Kabat and Wu, 1991; Kabat et al, Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition − US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91−3242, p 647 (1991));
・「エピトープを含有するドメイン」=抗原結合性部分が結合するHER2のドメイン;
・「抗体名称」=抗原結合性部分が由来する抗体は、存在する場合には野生型と比較される置換を含む;
・「Fab置換」=正確な軽鎖対形成を促進する、Fabにおける置換;
・「CH3配列置換」=ヘテロ二量体Fcの形成を促進する、CH3ドメインにおける置換。
v1040:HER2結合性ドメインが、鎖A上の、トラスツズマブから誘導されたFabであり、Fc領域が、鎖AにT350V_L351Y_F405A_Y407Vの変異を有し、鎖BにT350V_T366L_K392L_T394Wの変異を有するヘテロ二量体であり、鎖Bのヒンジ領域がC226Sの変異を有し;抗原結合性ドメインがHER2のドメイン4に結合する一価抗HER2抗体。
v506は、対照として、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞において自家生成した野生型抗HER2である。HER2結合性ドメインは両方とも、Fab形式でトラスツズマブから誘導されており、Fcは、野生型ホモ二量体であり;抗原結合性ドメインは、HER2のドメイン4に結合する。この抗体は、トラスツズマブ類似体とも称される。
(表2)抗体の発現および精製
次の抗HER2二重パラトピック抗体薬物コンジュゲート(抗HER2二重パラトピック−ADC)を調製した。変異体5019、7091、10000、および506のADCを調製した。これらのADCは、次のとおりに特定される:
v6363(DM1にコンジュゲートさせたv5019)
v7148(DM1にコンジュゲートさせたv7091)
v10553(DM1にコンジュゲートさせたv10000)
v6246(DM1にコンジュゲートさせたv506、T−DM1、トラスツズマブ−エムタンシンと類似)
v6249(DM1にコンジュゲートさせたヒトIgG)。
実施例1において記載した抗HER2二重パラトピック抗体(v5019、v7091、およびv10000)を、10Lおよび/または25L体積で発現させ、次のとおりにプロテインAおよびサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって精製した。
例示的なプロテインAおよびSEC精製された二重パラトピック抗HER2ヘテロ多量体の純度および凝集率を、上記の方法によるUPLC−SECによって決定した。
実施例1に記載の例示的な抗HER2二重パラトピック抗体v5019を25L規模で発現させ、次のとおりに精製した。
様々なレベルのHER2を発現する細胞に結合する例示的な二重パラトピック抗HER2抗体の能力を対照と比較して測定するために、次の実験を行った。使用した細胞系は、SKOV3(HER2 2+/3+)、JIMT−1(HER2 2+)、MDA−MB−231(HER2 0/1+)、およびMCF7(HER2 1+)であった。試験した二重パラトピック抗HER2抗体には、v5019、v7091、およびv10000が含まれる。HER2発現(HER2+)細胞に結合する二重パラトピック抗HER2抗体の能力を、Bmaxおよび見掛けKD(平衡解離定数)の具体的な測定と共に、以下に記載するとおりに決定した。
(表4)SKOV3細胞への結合
(表5)SKOV3への結合
(表6)JIMT−1細胞への結合
(表7)MCF7細胞への結合
(表8)MCF7細胞への結合
(表9)MDA−MB−231細胞への結合
(表10)WI−38細胞への結合
3+および2+レベルでHER2を発現する細胞の増殖を阻害する例示的な二重パラトピック抗HER2抗体の能力を測定した。実験を、HER2 3+細胞系のBT−474、SKBr3、SKOV3、およびHER2 2+ JIMT−1で実施した。二重パラトピック抗HER2抗体のv5019、v7091、およびv10000を試験した。BT−474細胞(200nM抗体);SKOV3、SKBr3、およびJIMT−1細胞(300nM抗体)の増殖を阻害する二重パラトピック抗HER2抗体の能力を下記のとおりに測定した。
(表11A)HER2 3+癌細胞の増殖阻害
(表11B)HER2 3+癌細胞の増殖阻害
膜結合HER2(HER2−Fc)とshed HER2 ECDとの間の結合差の代理として、二量体HER2およびHER2 ECDに結合する例示的な二重パラトピック抗HER2抗体の個々のパラトープの能力を決定するために、この実験を行った。実験を次のとおりに実施した。
(表11C)HER2 ECDおよびHER2−FC(「HER2 mem」)への結合における、フルサイズ抗HER2抗体(FSA)と比較しての一価抗HER2抗体(OA)のka(1/Ms)およびkd(1/s)値
(表11D)
HER2 2+細胞へ内部移行される例示的な二重パラトピック抗HER2抗体の能力を評価するために、この実験を行った。直接的な内部移行方法は、Schmidt, M. et al., Kinetics of anti−carcinoembryonic antigen antibody internalization: effects of affinity, bivalency, and stability. Cancer Immunol Immunother (2008) 57:1879−1890において詳述されているプロトコルに従った。具体的には、抗体を、製造元指示書に従ってAlexaFluor(登録商標)488 Protein Labeling Kit(Invitrogen、cat. no. A10235)を使用して直接的に標識した。
種々の時点でのHER2+ JIMT−1細胞への例示的な抗HER2二重パラトピック抗体の内部移行を分析するために、細胞全体負荷および内部移行を分析するために実施例9において提示した方法に直交する方法として、この実験を行った。
SKOV3細胞(卵巣癌、HER2 2+/3+)においてADCCを媒介する例示的な二重パラトピック抗HER2抗体の能力を測定するために、この実験を行った。
(表12)
(表13)
(表14)
例示的な抗HER2二重パラトピック抗体がHER2 ECDに結合する機構を評価するために、具体的には、1個の二重パラトピック抗体分子のパラトープの両方が、1個のHER2 ECDに結合(シス結合;抗体とHER2分子とが1:1)し得るか、または1個の二重パラトピック抗体の各パラトープが2個の異なるHER2 ECDに結合(トランス結合;抗体とHER2分子とが1:2)し得るかを理解するために、SPRアッセイを使用した。シス対トランス結合の表現を図14において図示する。オフ速度が低下する(ゆっくりになる)と、抗体捕捉レベル(表面密度)が上昇するという相関が、トランス結合(すなわち、2個のHER2分子への1個の抗体分子の結合)の指標である。
BT−474細胞においてpAKTシグナル伝達を低減する例示的な抗HER2二重パラトピック抗体の能力を、AKT Colorimetric In−Cell ELISA Kit(Thermo Scientifiic; cat no. 62215)を製造元指示書に従って、ただし次の変更を加えて使用して試験した。細胞を5×103/ウェルで播種し、37℃+5%CO2で24時間にわたってインキュベートした。細胞を、100nM抗体と共に30分間にわたってインキュベートし、続いて、rhHRG−β1と共に15分間にわたってインキュベートした。細胞を洗浄し、固定化し、指示書に従って透過処理した。二次抗体(1:5000;Jackson ImmunoReasearch、HRP−ロバ抗マウスIgG、JIR、Cat#715−036−150、HRP−ロバ抗ウサギIgG、JIR、Cat#711−036−452)を添加し、アッセイを、製造元指示書に従ってプロセシングした。
潜在的な心臓毒性作用の予兆を得るために、心筋細胞生存率に対する例示的な二重パラトピック抗HER2抗体およびADCの効果を測定した。
HER2+細胞において細胞毒性を媒介する例示的な二重パラトピック抗HER2−ADC抗体(v6363、v7148、およびv10553)の能力を測定した。いくつかの場合、DM1にコンジュゲートされたヒトIgG(v6249)を対照として使用した。実験を、HER2+乳房腫瘍細胞系JIMT−1、MCF7、MDA−MB−231、HER2+卵巣腫瘍細胞系SKOV3、およびHER2+胃細胞系NCI−N87において実施した。HER2+細胞における例示的な二重パラトピック抗HER2−ADC抗体の細胞毒性を評価し、単一特異性抗HER2 FSA−ADC(v6246)および抗HER2−FSA−ADC+抗HER2−FSA対照(v6246+v4184)と比較した。この方法を、実施例7において記載したとおりに、ただし、次の変更を加えて行った。抗HER2 ADCを、ターゲットSKOV3およびJIMT−1(図17AおよびB)細胞と共に24時間にわたってインキュベートし、細胞を洗浄し、培地を取り換え、37℃で5日間のインキュベーション後に細胞生存率を評価した。抗HER2 ADCを、ターゲットMCF7およびMDA−MB−231ターゲット細胞と共に6時間にわたってインキュベートし(図17CおよびD)、細胞を洗浄し、培地を取り換え、細胞生存率を、37℃でのインキュベーションの5日目に評価した。図17E〜Gでは、抗HER2 ADCを、ターゲットSKOV3、JIMT−1、NCI−N87細胞と共に5日間にわたって連続してインキュベートした。細胞生存率を、AlamarBlue(商標)(図17A〜D)またはCelltiter−Glo(登録商標)(図17E〜G)のいずれかを使用して、実施例7において記載したとおりに測定した。
(表15)
(表16)
例示的な二重パラトピック抗HER2抗体の抗腫瘍有効性を評価するために、ヒト卵巣癌細胞由来の樹立された異種移植片モデルSKOV3を使用した。
(表17)
DM1にコンジュゲートさせた例示的な二重パラトピック抗HER2抗体(v6363)の抗腫瘍有効性を評価するために、ヒト卵巣癌細胞由来の樹立された異種移植片モデルSKOV3を使用した。
(表18)
DM1にコンジュゲートさせた例示的な二重パラトピック抗HER2抗体の抗腫瘍有効性を評価するために、トラスツズマブ抵抗性患者由来のヒト乳癌からの異種移植片モデルHBCx−13Bを使用した。
(表19)
例示的な二重パラトピック抗HER2−ADCの抗腫瘍有効性を評価するために、患者由来のヒト乳癌からのトラスツズマブ抵抗性異種移植片モデルT226を使用した。
(表20)
例示的な二重パラトピック抗HER2−ADCの抗腫瘍有効性を評価するために、患者由来のヒト乳癌からのトラスツズマブ抵抗性異種移植片モデルHBCx−5(侵襲性腺管癌、ルミナールB)を使用した。
(表21)
抗HER2治療抵抗性腫瘍における例示的な二重パラトピック抗HER2−ADCの抗腫瘍有効性を評価するために、実施例17において記載したヒト卵巣癌細胞由来の樹立された異種移植片モデルSKOV3を使用した。
DM1にコンジュゲートさせた例示的な二重パラトピック抗HER2抗体の抗腫瘍有効性を評価するために、トラスツズマブ抵抗性患者由来のヒト乳癌からの異種移植片モデルHBCx−13Bを使用した。
例示的な二重パラトピック抗HER2抗体(v5019、v7091、およびv10000)のN−連結グリカンのフコース含有率を定量化するために、グリコペプチド分析を行った。
(表22)FcN−連結グリコペプチド分析
例示的な二重パラトピック抗HER2抗体(v5019、v7091、およびv10000)およびADC(v6363、v7148、およびv10533)の熱安定性を、下記のとおりにDSCによって測定した。
HER2陽性3+、2+、および0/1+HER2発現(三重陰性)乳癌細胞系の用量依存性ADCCを誘発する例示的な二重パラトピック抗体(v5019)の能力を検査した。ADCC実験を、NKエフェクター細胞とターゲット細胞との比を5:1で一定なままにすることを除いて、実施例11において記載したとおりに行った。
(表23)HER2 3+、2+、および0/1+HER2発現乳癌細胞のADCC
HER2陽性2/3+、2+、および0/1+ HER2発現(三重陰性)乳癌細胞系の用量依存性ADCCを誘発する非フコシル化された例示的な二重パラトピック抗体(非フコシル化v5019、非フコシル化10000)の能力を検査した。5:1の一定のNKエフェクター細胞またはPBMCエフェクター細胞とターゲット(E:T)細胞比との比を使用したことを除いて、実施例11において記載したとおり、ADCC実験を、SKOV3細胞、MDA−MB−231細胞、およびZR75−1細胞において行った。von Horsten et al. 2010 Glycobiology 20:1607−1618において記載されているとおりに一過性に発現されたRMD酵素を使用して、実施例1において記載したとおりに、非フコシル化された例示的な二重パラトピック抗体をCHO細胞において一過性に生成した。非フコシル化v5019および非フコシル化v10000のフコース含有率を、実施例23において記載したとおりに測定したところ、それらは、2%未満とより少なくフコシル化されていることが決定された(データは図示せず)。NKエフェクター細胞を使用したデータを図28A〜Bにおいて示し、PBMCを使用したデータを図28Cにおいて示す。
(表24)HER2 2/3+および基礎HER2発現(三重陰性)乳癌細胞のADCC
(表25)HER2 2/3+乳癌細胞のADCC
外因性増殖刺激リガンド(EGFおよびHRG)の存在下でHER2 3+乳癌細胞の増殖を阻害する5019の能力を検査した。
(表26)HER2 3+癌細胞の増殖阻害
侵襲性腺管ヒト乳癌からのHER2 3+(ER−PR陰性)患者由来の異種移植片モデルHBCx−13Bを、例示的な二重パラトピック抗HER2抗体v7187の抗腫瘍有効性を評価するために使用した。v7187は、v5019の非フコシル化バージョンである。
(表27)
HER2陽性3+、2+乳房および卵巣腫瘍細胞系に結合し、それらを飽和させる例示的な二重パラトピック抗HER2 ADCの能力を、実施例6において記載されているとおり、FACSによって分析した。
例示的な二重パラトピック抗HER2 ADC、v6363の抗腫瘍有効性を評価するために、HER2 3+(ER−PR陰性)患者由来の侵襲性腺管ヒト乳癌からの異種移植片モデルHBCx−13Bを使用した。このモデルは、単一薬剤のトラスツズマブ、トラスツズマブおよびペルツズマブの組み合わせ(実施例31を参照されたい)、カペシタビン、ドセタキセル、ならびにアドリアマイシン/シクロホスファミドに対して抵抗性である。
(表28)
ER−PR陰性トラスツズマブ抵抗性患者由来のHER2 3+乳癌異種移植片モデル(HBCx−13b)におけるv6363の有効性を評価し、Herceptin(商標)+Perjeta(商標);およびHerceptin(商標)+ドセタキセルの組み合わせと比較した。
(表29)
HER2 3+トラスツズマブ抵抗性乳癌細胞由来の(JIMT−1、HER2 2+)異種移植片モデルにおけるv6363の有効性を評価した(Tanner et al. 2004. Molecular Cancer Therapeutics 3: 1585−1592)。
(表30)
ヒトFcγRへの、ヘテロ二量体Fcを有する抗HER2二重パラトピック抗体(v5019、v7019、v10000)およびADC(v6363、v7148、およびv10553)の結合を評価し、ホモ二量体Fcを有する抗HER2 FSA(v506)およびADC(v6246)と比較した。
(表31)SPRによるヒトFcγR結合
例示的な二重パラトピック抗HER2抗体v5019、v7091、およびv10000の抗腫瘍有効性を評価するために、実施例17において記載したヒト卵巣癌細胞由来の確立された異種移植片モデルSKOV3を使用した。
(表32)
例示的な二重パラトピック抗HER2抗体v10000の用量依存性有効性を評価するために、実施例17において記載したヒト卵巣癌細胞由来の樹立された異種移植片モデルSKOV3を使用した。
(表33)
IHCによって定義されているとおり、HER2、ならびにEGFRおよび/またはHER3を3+、2+、1+、または0+レベルで発現する乳房、結腸直腸、胃、肺、皮膚、卵巣、腎臓、膵臓、頭頚部、子宮、および膀胱腫瘍細胞系から選択されたものの増殖を阻害する例示的な二重パラトピック抗HER2抗体(v10000)および対応する二重パラトピック抗HER2 ADC(v10553)の能力を測定するために、次の実験を行った。
HER2を2+、1+、および/または0/1+レベルで発現し、かつEGFRおよび/またはHER3を2+または1+レベルで同時発現する腫瘍細胞のADCCを媒介する抗HER2二重パラトピック抗体の能力を決定するために、次の実験を行った。試験した抗HER2二重パラトピック抗体は、対照としてのHerceptin(商標)およびv506と共に、5019、10000、および10154(v10000の非フコシル化バージョン)であった。
実施例1において示したとおり、種々の抗原結合性部分の形式を有する抗HER2二重パラトピック抗体を、表1において記載したとおりに構築した。それらの形式には、scFv−scFv形式(v6717)、Fab−Fab形式(v6902およびv6903)の他にも、Fab−scFv形式(v5019、v7091、およびv10000)が含まれた。次の実験を、これらの例示的な抗HER2二重パラトピック抗体形式のHER2結合親和性および反応速度を比較するために行った。
(表34)
次の実験を、種々の分子形式(例えば、v6717ではscFv−scFv IgG1;v6903およびv6902ではFab−Fab IgG1;v5019、v7091、およびv10000ではFab−scFv IgG1)を有する例示的な抗HER2 ECD2×ECD4二重パラトピック抗体の細胞全体結合特性(Bmaxおよび見掛けKD)を比較するために行った。
(表35)FACS結合BT−474
(表36)FACS結合JIMT−1
(表37)FACS結合MCF7
(表38)FACS結合MDA−MB−231
様々なレベルでHER2を発現するHER2+細胞において内部移行する、種々の分子形式(例えば、v6717ではscFv−scFv IgG1;v6903およびv6902ではFab−Fab IgG1;v5019、v7091、およびv10000ではFab−scFv IgG1)を有する例示的な抗HER2 ECD2×ECD4二重パラトピック抗体の能力を比較するために、次の実験を行った。
(表39)内部移行BT−474
(表40)内部移行JIMT−1
(表41)内部移行MCF7
HER2を様々なレベルで発現するHER2+細胞においてADCCを媒介する、種々の分子形式を有する例示的な抗HER2 ECD2×ECD4二重パラトピック抗体(例えば、v6717ではscFv−scFv IgG1;v6903およびv6902ではFab−Fab IgG1;v5019、v7091、およびv10000ではFab−scFv IgG1)の能力を比較するために、次の実験を行った。
(表42)LC−MSトリプシンペプチド分析
(表43)JIMT−1 ADCC
(表44)MCF7 ADCC
(表45)MDA−MB−231 ADCC
基礎増殖か、またはリガンド刺激されたHER2 3+、2+、および1+腫瘍細胞の増殖に対する抗HER2二重パラトピック抗体形式の効果を比較するために、次の実験を行った。基礎増殖は、実施例15において記載したとおりに測定し、リガンド刺激増殖は、実施例27において記載したとおりに測定した。両方の種類の実験において、増殖を、対照処理に対する生存%として測定した。
(表46)
SPRによって、様々な表面密度で捕捉された場合の例示的な抗HER2 ECD2×ECD4二重パラトピック抗体のHER2結合反応速度(kd、オフ速度)を比較するために、次の実験を行った。オフ速度が低下する(ゆっくりになる)と、抗体捕捉レベル(表面密度)が上昇するという相関が、トランス結合(すなわち、実施例12において記載されている、2個のHER2分子への1個の抗体分子結合)の指標である。この実験において、Fab−Fab形式(v6903)をFab−scFv形式(v7091)と比較して、変異体の内で、トランス結合における潜在的な差異を決定した。抗原結合性ドメイン間の比較的広い空間的距離に起因して、Fab−Fab形式はシス結合し得る(1個のHER2分子上のECD2および4を連結する)のに対して;Fab−scFvは、その抗原結合性ドメイン間の比較的短い距離に起因して、シス結合し得ないであろうと仮定される。抗HER2単一特異性v506が、対照として含まれた。
表1において示したとおり、1種の変異体(v10000)は、ペルツズマブFabにおいて変異を含む。このFabは、in silicoでの尽力による親和性および安定性の操作に由来し、一価またはワンアーム(One−Armed)抗体(OAA)として実験的に測定された。
(表47A)
(表47B)
Claims (30)
- a.重鎖1が、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:105、およびSEQ ID NO:103でそれぞれ示されるCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3配列を含み;
b.重鎖2が、SEQ ID NO:299、SEQ ID NO:303、SEQ ID NO:301、SEQ ID NO:307、SEQ ID NO:311、およびSEQ ID NO:309でそれぞれ示されるCDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3、ならびにCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3配列を含み;および
c.軽鎖1が、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:77、およびSEQ ID NO:75でそれぞれ示されるCDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3配列を含み、
前記重鎖1および前記軽鎖1を含む、HER2 ECD2に特異的に結合する第1の抗原結合ポリペプチド、および
前記重鎖2を含む、HER2 ECD4に特異的に結合する第2の抗原結合ポリペプチド、
を含む、抗原結合性コンストラクト。 - a.前記重鎖1が、SEQ ID NO:99で示されるVH配列を含み;
b.前記重鎖2が、SEQ ID NO:297で示されるVL配列、およびSEQ ID NO:305で示されるVH配列を含み;および
c.前記軽鎖1が、SEQ ID NO:71で示されるVL配列を含む、
請求項1に記載の抗原結合性コンストラクト。 - a.前記重鎖1が、SEQ ID NO:97で示される配列を含み;
b.前記重鎖2が、SEQ IDNO:295で示される配列を含み;および
c.前記軽鎖1が、SEQ ID NO:69で示される配列を含む、
請求項2に記載の抗原結合性コンストラクト。 - a.前記重鎖1が、SEQ ID NO:97で示される配列からなり;
b.前記重鎖2が、SEQ IDNO:295で示される配列からなり;および
c.前記軽鎖1が、SEQ ID NO:69で示される配列からなる、
請求項3に記載の抗原結合性コンストラクト。 - グリコシル化されている、請求項1乃至4のいずれか一項に記載の抗原結合性コンストラクト。
- 非フコシル化されている、請求項1乃至5のいずれか一項に記載の抗原結合性コンストラクト。
- 薬物にコンジュゲートされている、請求項1乃至6のいずれか一項に記載の抗原結合性コンストラクト。
- 前記薬物が、メイタンシン(DM1)である、請求項7に記載の抗原結合性コンストラクト。
- SMCCリンカーでDM1にコンジュゲートされている、請求項8に記載の抗原結合性コンストラクト。
- 請求項1乃至9のいずれか一項に記載のコンストラクトおよび薬学的担体を含む、薬学的組成物。
- 前記薬学的担体が、緩衝剤、抗酸化剤、低分子量分子、薬物、タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、キレート化剤、安定剤、または添加剤を含む、請求項10の薬学的組成物。
- 請求項2に記載のコンストラクトおよび薬学的担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項3に記載のコンストラクトおよび薬学的担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項4に記載のコンストラクトおよび薬学的担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項7に記載のコンストラクトおよび薬学的担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項8に記載のコンストラクトおよび薬学的担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項9に記載のコンストラクトおよび薬学的担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項1乃至4のいずれか一項に記載の抗原結合性コンストラクトをコードする、単離ポリヌクレオチドまたは単離ポリヌクレオチドのセット。
- 請求項18に記載の単離ポリヌクレオチドまたは単離ポリヌクレオチドのセットを含む、ベクターまたはベクターのセット。
- 請求項18に記載の単離ポリヌクレオチドまたは単離ポリヌクレオチドのセットを含む、単離細胞。
- VHが、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:335、およびSEQ ID NO:336でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むCDR−H1、CDR−H2およびCDR−H3を含み、および
VLが、SEQ ID NO:340、SEQ ID NO:338、およびSEQ ID NO:347でそれぞれ示されるアミノ酸配列を含むCDR−L1、CDR−L2およびCDR−L3を含み、
前記VHおよび前記VLを含む、HER2 ECD2に一価で特異的に結合する1つまたは複数の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトを含む、修飾コンストラクト。 - 一価、二価、または多価である、請求項21に記載の修飾コンストラクト。
- (i)一価であり、FabまたはscFvを含むか、(ii)二価であり、FabおよびscFvを含むか、または(iii)二価であり、2つのscFvを含む、請求項21に記載の修飾コンストラクト。
- リンカーを用いてまたは用いずに1つまたは複数の抗原結合性ポリペプチドコンストラクトに連結されているFcを含む、請求項21に記載の修飾コンストラクト。
- ポリペプチドリンカーを含む、請求項24に記載の修飾コンストラクト。
- 前記リンカーが、IgG1ヒンジ領域を含む、請求項25に記載の修飾コンストラクト。
- 前記Fcが、ヒトFcである、請求項24に記載の修飾コンストラクト。
- 前記ヒトFcが、ヒトIgG1 Fcである、請求項27に記載の修飾コンストラクト。
- 請求項21に記載の修飾コンストラクトおよび薬学的担体を含む、薬学的組成物。
- 請求項21に記載の修飾コンストラクトをコードする単離ポリヌクレオチドまたは単離ポリヌクレオチドのセット。
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