BR112020016169A2 - Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, métodos para produzir a molécula de ligação, conjunto de ácidos nucleicos isolados, conjunto de vetores, conjunto de células hospedeiras, imunoconjugado, composição, uso da molécula de ligação, métodos para tratar ou retardar a progressão de um câncer, métodos para aperfeiçoar a função imune e kit - Google Patents

Moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, ácido nucleico isolado, vetor, célula hospedeira, métodos para produzir a molécula de ligação, conjunto de ácidos nucleicos isolados, conjunto de vetores, conjunto de células hospedeiras, imunoconjugado, composição, uso da molécula de ligação, métodos para tratar ou retardar a progressão de um câncer, métodos para aperfeiçoar a função imune e kit Download PDF

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Abstract

a presente invenção fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas tendo um braço monovalente específico para um primeiro antígeno alvo (por exemplo, um antígeno de célula t, tal como cd3) e um braço bivalente específico para um segundo antígeno alvo (por exemplo, um antígeno tumoral, tal como her2). as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas são úteis no tratamento de distúrbios, tais como câncer (por exemplo, câncer positivo para her2). a invenção também apresenta métodos para produzir moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, métodos para tratar distúrbios usando moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas e composições incluindo moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas.

Description

“MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICAS, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, VETOR, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODOS PARA PRODUZIR A MOLÉCULA DE LIGAÇÃO, CONJUNTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS ISOLADOS, CONJUNTO DE VETORES, CONJUNTO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS, IMUNOCONJUGADO, COMPOSIÇÃO, USO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO, MÉTODOS PARA TRATAR OU RETARDAR A PROGRESSÃO DE UM CÂNCER, MÉTODOS PARA APERFEIÇOAR A FUNÇÃO IMUNE E KIT” LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0001] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi enviada eletronicamente no formato ASCII e é incorporada por referência em sua totalidade. A referida cópia ASCII, criada em 6 de fevereiro de 2019, é nomeada 50474-162WO2_Sequence_Listing_02.06.19_ST25 e tem
293.645 bytes de tamanho.
CAMPO DE INVENÇÃO
[0002] A presente invenção refere-se geralmente a moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas, composições das mesmas e métodos para tratar doenças, tais como câncer.
ANTECEDENTES
[0003] A manipulação do contato célula a célula entre tipos de células específicos em um paciente representa uma abordagem promissora para o tratamento de várias condições de doença. Por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas (por exemplo, anticorpos biespecíficos) tendo dois braços, cada um específico a um antígeno alvo diferente, estão em desenvolvimento por sua capacidade de colocar células imunes em contato com células alvo. Tais anticorpos biespecíficos mostraram-se promissores em vários distúrbios, tais como o câncer, nos quais foi observada uma potente morte imunomediada de células alvo tumorais em ensaios clínicos. Para conferir especificidade ao tumor, os braços direcionados ao tumor de anticorpos biespecíficos foram projetados para direcionar antígenos que são superexpressos em células tumorais.
[0004] Os anticorpos biespecíficos existentes podem ter várias limitações, incluindo meias-vidas curtas e toxicidade a tecidos saudáveis.
Anticorpos biespecíficos que dependem da superexpressão de células não tumorais de antígeno alvo geralmente matam células saudáveis, não tumorais, que expressam níveis normais do antígeno. Tais efeitos fora do tumor, no alvo, limitam o índice terapêutico da terapia com anticorpos biespecíficos, restringindo a dose máxima tolerada pelo paciente. Assim, existe uma necessidade não atendida no campo para o desenvolvimento de moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas (por exemplo, anticorpos biespecíficos) com seletividade aperfeiçoada a uma célula ou tecido alvo.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[0005] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas tendo um braço monovalente e um braço bivalente (por exemplo, anticorpos biespecíficos dependentes de células T (TDB) tendo um braço monovalente e um braço bivalente).
[0006] Em um aspecto, a invenção apresenta uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma primeira ação de ligação ao antígeno, em que o terminal C da primeira fração de ligação ao antígeno é fundido ao terminal N de uma primeira subunidade Fc; (b) o braço bivalente compreende uma segunda fração de ligação ao antígeno e uma terceira fração de ligação ao antígeno, em que o terminal C da terceira fração de ligação ao antígeno é fundido ao terminal N da segunda fração de ligação ao antígeno e o terminal C da segunda fração de ligação ao antígeno é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc, em que a primeira fração de ligação ao antígeno é capaz de especificamente se ligar a um primeiro antígeno alvo e a segunda fração de ligação ao antígeno e a terceira fração de ligação ao antígeno é capaz de especificamente se ligar a um segundo antígeno de célula alvo. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno de célula alvo é um antígeno de ativação de célula T, tal como CD3, e/ou o segundo antígeno de célula alvo é um antígeno tumoral (por exemplo, HER2). Em algumas modalidades, o antígeno tumoral é expresso em (a) uma célula tumoral em um paciente e (b) pelo menos um tipo de célula não tumoral no paciente.
[0007] Em algumas modalidades, a proporção do número de cópias de antígeno tumoral nas células não tumorais para as células tumorais é de 1:10 a 1:1.000 (por exemplo, de 1:100 a 1:200). Em algumas modalidades, o número de cópias de antígeno tumoral é de 10 2 a 105 em uma célula não tumoral e de 103 a 107 em uma célula tumoral.
[0008] Em algumas modalidades, o número de cópias de antígeno tumoral (por exemplo, número médio de cópias de antígeno tumoral, por exemplo, número de cópias de HER2, por exemplo, número médio de cópias de HER2) nas células tumorais (por exemplo, células tumorais positivas para HER2) é superior a 105 por célula (por exemplo, de 105 a 107 por célula ou de 105 a 106 por célula). Em algumas modalidades, o número de cópias de antígeno tumoral (por exemplo, número médio de cópias de antígeno tumoral, por exemplo, número de cópias de HER2, por exemplo, número médio de cópias de HER2) é ≥ 200.000 por célula tumoral (por exemplo, célula tumoral positiva para HER2). Em algumas modalidades, o número de cópias de antígeno tumoral (por exemplo, número médio de cópias de antígeno tumoral, por exemplo, número de cópias de HER2, por exemplo, número médio de cópias de HER2) é ≤ 200.000 por célula não tumoral (por exemplo, célula não cancerígena, por exemplo, célula saudável).
[0009] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação (K D) monovalente da segunda fração de ligação ao antígeno e/ou da terceira fração de ligação ao antígeno é de 10 nM a 100 nM (por exemplo, de 20 nM a 90 nM, de 30 nM a 80 nM, de 40 nM a 60 nM, por exemplo, de 25 nM a 55 nM). Em uma modalidade, a afinidade de ligação (KD) monovalente da segunda fração de ligação ao antígeno e/ou da terceira fração de ligação ao antígeno é de 20 nM a 50 nM. Em uma modalidade, a afinidade de ligação (K D) monovalente da segunda fração de ligação ao antígeno e da terceira fração de ligação ao antígeno é de 20 nM a 50 nM.
[0010] Em algumas modalidades, a KD monovalente da segunda fração de ligação ao antígeno é a KD da segunda fração de ligação ao antígeno em formato Fab medida ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, ressonância plasmônica de superfície BIACORE®) e em que a K D monovalente da terceira fração de ligação ao antígeno é a K D da terceira fração de ligação ao antígeno em formato Fab medida usando ressonância plasmônica de superfície (por exemplo, ressonância plasmônica de superfície BIACORE®).
[0011] Em algumas modalidades, a taxa de dissociação monovalente da segunda fração de ligação ao antígeno e/ou da terceira fração de ligação ao antígeno é de 10-3/segundo a 10-1/segundo (por exemplo, de 10-2/segundo a 30-2/segundo). Em algumas modalidades, a KD monovalente da primeira fração de ligação ao antígeno é de 10 nM a 100 nM (por exemplo, de 20 nM a 90 nM, de 20 nM a 80 nM, de 30 nM a 70 nM ou de 40 nM a 60 nM).
[0012] Em qualquer uma das modalidades anteriores, a primeira fração de ligação ao antígeno pode ser uma molécula Fab (FabA) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH A) e uma região variável de cadeia leve (VLA); a segunda fração de ligação ao antígeno é uma molécula Fab (FabB1) compreendendo uma região variável de cadeia pesada
(VHB1) e uma região variável de cadeia leve (VL B1); e/ou a terceira fração de ligação ao antígeno é uma molécula Fab (Fab B2) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHB2) e uma região variável de cadeia leve (VLB2).
Assim, em algumas modalidades, a primeira fração de ligação ao antígeno é uma FabA compreendendo uma região VHA e uma região VLA, a segunda fração de ligação ao antígeno é uma FabB1 compreendendo uma região VHB1 e uma região VLB1 e a terceira fração de ligação ao antígeno é uma FabB2 compreendendo uma região VHB2 e uma região VLB2.
[0013] Em algumas modalidades, a VHB1 e a VHB2 compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência. Adicional ou alternativamente, a VLB1 e a VLB2 compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência.
Adicional ou alternativamente, a VHB1 e a VHB2 compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência e/ou a VLB1 e a VLB2 compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência.
[0014] Em algumas modalidades, a região VHB1 e/ou a região VHB2 compreendem uma substituição de aminoácidos em um, dois, três ou todos os quatro resíduos de N54, D98, F100 e/ou Y102, de acordo com o sistema de numeração Kabat. Por exemplo, a região VHB1 e/ou a região VHB2 podem apresentar uma substituição de aminoácidos em um, dois, três, quatro ou todos os cinco dos seguintes resíduos: N54E, D98A, D98T, F100A e/ou Y102V, de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[0015] Em algumas modalidades, a região VLB1 e/ou a região VLB2 compreende uma substituição de aminoácidos em um, dois ou todos os três resíduos de N30, Y55 e/ou H91, de acordo com o sistema de numeração Kabat. Por exemplo, a região VLB1 e/ou a região VLB2 podem apresentar uma substituição de aminoácidos em um, dois ou todos os três dos seguintes resíduos: N30S, Y55E e/ou H91A.
[0016] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VHB1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, ou (c) HVR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.
[0017] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; e a VL B1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.
[0018] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, ou (c)
uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, ou (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.
[0019] Em algumas modalidades, a VHB2 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; e a VL B2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17); e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.
[0020] Em algumas modalidades, a região VLB1 e/ou a região VLB2 compreendem uma substituição de aminoácidos em H91. Por exemplo, em algumas modalidades, o resíduo H91 é substituído por um aminoácido tendo uma cadeia lateral não polar. Em algumas modalidades, a região VL B1 e/ou a região VLB2 compreendem a substituição de aminoácidos de H91A. Em algumas modalidades, a região VLB1 e/ou a região VLB2 compreendem uma substituição de aminoácidos em Y55. Por exemplo, em algumas modalidades, o resíduo Y55 é substituído por um aminoácido tendo uma cadeia lateral ácida. Em algumas modalidades, a região VLB1 e/ou a região VLB2 compreendem a substituição de aminoácidos de Y55E. Em algumas modalidades, a região VH B1 e/ou a região VHB2 compreendem uma substituição de aminoácidos em F100 e/ou Y102. Por exemplo, em algumas modalidades, o resíduo F100 e/ou o resíduo Y102 é substituído por um aminoácido tendo uma cadeia lateral não polar. Em algumas modalidades, a região VHB1 e/ou a região VHB2 compreendem a substituição de aminoácidos de F100A e/ou Y102V.
[0021] Em algumas modalidades, a região VLB1 e/ou a região VLB2 compreendem um ou mais resíduos corrigidos de deficiência, por exemplo, um ou mais resíduos corrigidos de deficiência compreendendo a substituição de aminoácidos de N30S. Adicionalmente ou alternativamente, a região VHB1 e/ou a região VHB2 podem apresentar um ou mais resíduos corrigidos de deficiência, por exemplo, um ou mais resíduos corrigidos de deficiência compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em N54E, D98A, e D98T.
[0022] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VHB1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- HER2 (por exemplo, 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB).
[0023] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; e a VL B1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 24; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- HER2 (por exemplo, 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB).
[0024] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB).
[0025] Em algumas modalidades, a VHB2 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; e a VL B2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24); e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB).
[0026] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VHB1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 33. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- HER2 (por exemplo, 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0027] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e a VLB1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos
97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- HER2 (por exemplo, 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0028] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0029] Em algumas modalidades, a VHB2 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e a VL B2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos
97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33); e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 33; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0030] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VHB1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- HER2 (por exemplo, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB).
[0031] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e a VL B1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- HER2 (por exemplo, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB).
[0032] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB).
[0033] Em algumas modalidades, a VHB2 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e s VLB2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41); e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 41; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB).
[0034] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VHB1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- HER2 (por exemplo, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0035] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; e s VLB1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos
95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- HER2 (por exemplo, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0036] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0037] Em algumas modalidades, a VHB2 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; e a VL B2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos
95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44); e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 44; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0038] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VHB1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- HER2 (por exemplo, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB).
[0039] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e a VL B1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- HER2 (por exemplo, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB).
[0040] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB).
[0041] Em algumas modalidades, a VHB2 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e s VLB2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41); e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 41; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB).
[0042] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VHB1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44,
pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- HER2 (por exemplo, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0043] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; e s VLB1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti- HER2 (por exemplo, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0044] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0045] Em algumas modalidades, a VHB2 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; e a VL B2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44); e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 44; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0046] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, apresenta uma região VHA que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a região VLA compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a região VLA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL A compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3 (por exemplo, um anti- CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB tendo um domínio de ligação a 40G5c CD3).
[0047] Em algumas modalidades, a VHA compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; e a VLA compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7); e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, a região VHA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7; e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3 (por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB tendo um domínio de ligação a 40G5c CD3).
[0048] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma FabA, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma
HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii)
uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2,
(iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um Fab B1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do
FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o
FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR-
H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, (iii) uma
HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, (iv)
uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14,
(v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
15 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 16; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade
Fc para formar um domínio Fc.
Em algumas modalidades, (a) a Fab A compreende uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região
VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 e a região
VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18; e (c) a FabB2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VH A compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 e a região VL B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; e (c) a região VH B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 e a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.
[0049] Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma Fab A, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um Fab B1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR-
H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc. Em algumas modalidades, (a) a Fab A compreende uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27; e (c) a Fab B2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VH A compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e a região VL B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27; e (c) a região VH B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.
[0050] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma FabA, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a Fab A compreende as seguintes
HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um FabB1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do
FabB1 e o terminal C do FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs:
(i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
11, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 19, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 32, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc.
Em algumas modalidades, (a) a FabA compreende uma região VHA e uma região
VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região
VLA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25; e (c) a FabB2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 e a região VL B2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VHA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; e (c) a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.
[0051] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma Fab A, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um Fab B1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do
FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o
FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR-
H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, (iii) uma
HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37, (iv)
uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21,
(v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
29 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 26; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade
Fc para formar um domínio Fc.
Em algumas modalidades, (a) a Fab A compreende uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região
VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e a região
VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48; e (c) a FabB2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VH A compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a região VL B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48; e (c) a região VH B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
[0052] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma Fab A, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um Fab B1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc. Em algumas modalidades, (a) a Fab A compreende uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48; e (c) a Fab B2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VH A compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região VL B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48; e (c) a região VH B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3/HER2 (por exemplo, um anti- CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB tendo um domínio de ligação a 40G5c CD3 e dois domínios de ligação a 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V HER2).
[0053] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma FabA, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a Fab A compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um FabB1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do
FabB1 e o terminal C do FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs:
(i) umA HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
11, (ii) umA HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 36, (iii) umA HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 37, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc.
Em algumas modalidades, (a) a FabA compreende uma região VHA e uma região
VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região
VLA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49; e (c) a FabB2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos
95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VHA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49; e (c) a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3/HER2 (por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB tendo um domínio de ligação a 40G5c CD3 e dois domínios de ligação a 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T HER2).
[0054] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma Fab A, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um Fab B1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do
FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o
FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR-
H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, (iii) uma
HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43, (iv)
uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38,
(v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
29 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 26; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade
Fc para formar um domínio Fc.
Em algumas modalidades, (a) a FabA compreende uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região
VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a região
VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49; e (c) a Fab B2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VH A compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região VL B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49; e (c) a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3/HER2 (por exemplo, um anti- CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB tendo um domínio de ligação a 40G5c CD3 e dois domínios de ligação a 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V HER2).
[0055] Em algumas modalidades de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores, o domínio Fc é um domínio Fc da IgG (por exemplo, um domínio Fc da IgG1 ou IgG4). O domínio Fc pode ser um domínio Fc humano. Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora. Por exemplo, em algumas modalidades, as uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora estão em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo que consiste em L234, L235 e P329 (por exemplo, em que a primeira subunidade FC e a segunda subunidade Fc compreendem as substituições de aminoácidos de L234A, L235A e P329G). Em algumas modalidades, as uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora estão em N297 (por exemplo, N297G). Em algumas modalidades, o receptor Fc é um receptor Fcγ. Em algumas modalidades, a função efetora é citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC).
[0056] Em algumas modalidades de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores, o domínio Fc compreende uma modificação configurada para promover a associação da primeira subunidade Fc com a segunda subunidade Fc. Em algumas modalidades, um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da segunda subunidade Fc é substituído por um resíduo de aminoácido tendo um volume maior de cadeia lateral, gerando assim uma protuberância dentro do domínio CH3 da segunda subunidade Fc que é posicionada em uma cavidade dentro do domínio CH3 da primeira subunidade Fc, e um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da primeira subunidade Fc é substituído por um resíduo de aminoácido tendo um volume menor de cadeia lateral, gerando assim uma cavidade no domínio CH3 da primeira Fc subunidade dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da segunda subunidade Fc é posicionada. Em algumas modalidades, o domínio CH3 da segunda subunidade Fc compreende a substituição de aminoácidos de T366, e o domínio CH3 da primeira subunidade Fc compreende substituições de aminoácidos em um, dois ou todos os três de T366, L368 e/ou Y407. Em algumas modalidades, o domínio CH3 da segunda subunidade Fc compreende a substituição de aminoácidos de T366W e o domínio CH3 da primeira subunidade Fc compreende uma, duas ou todas as três substituições de aminoácidos de T366S, L368A e/ou Y407V.
[0057] Em algumas modalidades de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores, o terminal C da terceira fração de ligação ao antígeno é fundido ao terminal N da segunda fração de ligação ao antígeno através de um ligante peptídico. O ligante peptídico pode ter 5 a 20 aminoácidos de comprimento (por exemplo, 5 a 10, 10 a 15 ou 15 a 20, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos de comprimento).
[0058] Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55,
pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 ou 100%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55). Em algumas modalidades,
a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59,
pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59, pelo menos
99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63 (por exemplo,
pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63, pelo menos 97% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 63, pelo menos 98%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 83 (por exemplo,
pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 83, pelo menos 97% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 83, pelo menos 98%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 83, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 83 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 83). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 85 (por exemplo,
pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 85, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 85, pelo menos
98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 85, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 85 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 85). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 87 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 87, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 87, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 87, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 87 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 87). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 89 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 89, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 89, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 89, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 89 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 89).
[0059] Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60,
pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60, pelo menos
99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64 (por exemplo,
pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64, pelo menos
98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 84 (por exemplo,
pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 84, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 84, pelo menos
98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 84, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 84 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 84). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 86 (por exemplo,
pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 86, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 86, pelo menos
98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 86, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 86 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 86). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 88 (por exemplo,
pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 88, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 88, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 88, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 88 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 88). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 90 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 90, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 90, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 90, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 90 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 90).
[0060] Em outro aspecto, a invenção apresenta um ácido nucleico isolado que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores.
[0061] Em outro aspecto, a invenção fornece um vetor compreendendo um ácido nucleico isolado que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores.
[0062] Em outro aspecto, a invenção fornece uma célula hospedeira (por exemplo, uma célula hospedeira isolada) compreendendo um vetor compreendendo um ácido nucleico isolado que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero (por exemplo, uma célula de ovário de hamster chinês (CHO)). Em outras modalidades, a célula hospedeira é uma célula procariótica (por exemplo, uma célula de E. coli).
[0063] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método para produzir a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores. Em algumas modalidades, o método compreende cultivar qualquer uma das células hospedeiras descritas acima (por exemplo, uma célula hospedeira compreendendo um vetor compreendendo um ácido nucleico isolado que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores) em um meio de cultura. Em algumas modalidades, o método compreende ainda recuperar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica a partir da célula hospedeira ou do meio de cultura.
[0064] Em outro aspecto, a invenção apresenta um conjunto de ácidos nucleicos isolados que codificam a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores (por exemplo, um conjunto compreendendo dois, três, quatro ou mais ácidos nucleicos isolados que codificam a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores). Em algumas modalidades, um conjunto de ácidos nucleicos isolados inclui um primeiro ácido nucleico isolado e um segundo ácido nucleico isolado, em que o primeiro ácido nucleico isolado codifica uma ou mais sequências de aminoácidos de um primeiro braço da molécula de ligação ao antígeno biespecífica e o segundo o ácido nucleico isolado codifica uma ou mais sequências de aminoácidos de um segundo braço da molécula de ligação ao antígeno biespecífica.
[0065] Em outro aspecto, a invenção fornece um conjunto de vetores, em que cada vetor do conjunto compreende um ácido nucleico isolado de um conjunto de ácidos nucleicos isolados, em que o conjunto de ácidos nucleicos isolados que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores (por exemplo, um conjunto compreendendo dois, três, quatro ou mais ácidos nucleicos isolados que codificam a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores).
[0066] Em outro aspecto, a invenção fornece um conjunto de células hospedeiras (por exemplo, um conjunto de células hospedeiras isoladas). Em algumas modalidades, cada célula hospedeira do conjunto compreende um ácido nucleico isolado de um conjunto de ácidos nucleicos isolados, em que o conjunto de ácidos nucleicos isolados codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores (por exemplo, um conjunto compreendendo dois, três, quatro ou mais ácidos nucleicos isolados que codificam a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores).
Em algumas modalidades, cada célula hospedeira do conjunto compreende um vetor compreendendo um ácido nucleico isolado de um conjunto de ácidos nucleicos isolados, em que o conjunto de ácidos nucleicos isolados que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores (por exemplo, um conjunto compreendendo dois, três, quatro ou mais ácidos nucleicos isolados que codificam a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores). Em algumas modalidades, o conjunto de células hospedeiras compreende células de mamíferos (por exemplo, células CHO). Em algumas modalidades, o conjunto de células hospedeiras compreende células procarióticas (por exemplo, células de E. coli).
[0067] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para produzir a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores, em que o método compreende cultivar o conjunto de células hospedeiras de acordo com o aspecto anterior em um meio de cultura. Em algumas modalidades, o método compreende ainda recuperar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica a partir do conjunto de células hospedeiras ou do meio de cultura.
[0068] Em outro aspecto, a invenção apresenta um imunoconjugado compreendendo a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores e um agente citotóxico.
[0069] Ainda em outro aspecto, a invenção fornece uma composição compreendendo a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um transportador farmaceuticamente aceitável, excipiente ou diluente. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição é uma composição farmacêutica. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um antagonista de ligação ao eixo PD-1 ou um agente terapêutico adicional.
[0070] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores para uso como um medicamento. Por exemplo, em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas descritas no presente documento são para uso no tratamento ou retardamento da progressão de um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer) ou um distúrbio autoimune em um paciente em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores é para uso no aperfeiçoamento da função imune em um paciente tendo um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer, por exemplo, um câncer positivo para HER2) ou um distúrbio autoimune.
[0071] Em outro aspecto, a invenção apresenta um uso da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores na fabricação de um medicamento para tratar ou retardar a progressão de um distúrbio. Em outro aspecto, a invenção apresenta um uso da molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores na fabricação de um medicamento para aperfeiçoar a função imune em um paciente tendo um distúrbio. Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer, por exemplo, um câncer positivo para HER2) ou um distúrbio autoimune.
[0072] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta um método para tratar ou retardar a progressão de um distúrbio em um paciente em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao paciente a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores. Em outro aspecto, a invenção fornece um método para aperfeiçoar a função imune em um paciente tendo um distúrbio, o método compreendendo administrar ao paciente a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores. Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer, por exemplo, um câncer positivo para HER2) ou um distúrbio autoimune.
[0073] Em outro aspecto, a invenção apresenta um método para tratar ou retardar a progressão de um distúrbio em um paciente em necessidade do mesmo, em que o método compreende: (a) determinar uma expressão de HER2 em uma célula tumoral, em que a célula tumoral expressa HER2 em um número médio de cópias de 200.000 cópias por célula ou mais; e (b) administrar ao paciente a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores. Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer, por exemplo, um câncer positivo para HER2) ou um distúrbio autoimune.
[0074] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para aperfeiçoar a função imune em um paciente tendo um distúrbio, em que o método compreende: (a) determinar uma expressão de HER2 em uma célula tumoral, em que a célula tumoral expressa HER2 em um número médio de cópias de 200.000 cópias por célula ou mais; e (b) administrar ao paciente a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores. Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer, por exemplo, um câncer positivo para HER2) ou um distúrbio autoimune.
[0075] Em algumas modalidades de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma, glioblastoma, câncer de endométrio e osteossarcoma. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer positivo para HER2 (por exemplo, um câncer de mama positivo para HER2, um câncer gástrico positivo para HER2, um câncer colorretal positivo para HER2, um câncer de pulmão de células não pequenas positivo para HER2, um câncer renal positivo para HER2, um câncer de bexiga positivo para HER2, um câncer de pâncreas positivo para HER2, um câncer de próstata positivo para HER2, um câncer de fígado positivo para HER2, um câncer de cabeça e pescoço positivo para HER2, um melanoma positivo para HER2, um câncer de ovário positivo para HER2, um mesotelioma positivo para HER2, um glioblastoma positivo para HER2, um câncer endometrial positivo para HER2 ou um osteossarcoma positivo para HER2).
[0076] Em algumas modalidades, o câncer positivo para HER2 (por exemplo, o câncer de mama positivo para HER2, o câncer gástrico positivo HER2, o câncer colorretal positivo para HER2, o câncer de pulmão de células não pequenas positivo para HER2, o câncer renal positivo para HER2, o câncer de bexiga positivo para HER2, o câncer de pâncreas positivo para HER2, o câncer de próstata positivo para HER2, o câncer de fígado positivo para HER2, o câncer de cabeça e pescoço positivo para HER2, o melanoma positivo para
HER2, o câncer de ovário positivo para HER2, o mesotelioma positivo para HER2, o glioblastoma positivo para HER2, o câncer endometrial positivo para HER2 ou o osteossarcoma positivo para HER2) é distinguido por células tumorais que expressam HER2 em um número de cópias (por exemplo, um número médio de cópias) de pelo menos 200.000 por célula (por exemplo, pelo menos 250.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 300.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 400.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos
500.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 600.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 700.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 750.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 800.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 900.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 1.000.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 1.200.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 1.500.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 2.000.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 2.500.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 3.000.000 cópias de HER2 por célula, ou mais, por exemplo, de
200.000 a 3.000.000 cópias de HER2 por célula, de 250.000 a 2.500.000 cópias de HER2 por célula, de 300.000 a 2.000.000 cópias de HER2 por célula, de 400.000 a 1.500.000 cópias de HER2 por célula, ou de 500.000 a 1.000.000 cópias de HER2 por célula, por exemplo, de 200.000 a 1.000.000 cópias de HER2 por célula (por exemplo, de 200.000 a 250.000 cópias de HER2 por célula, de 250.000 a 300.000 cópias de HER2 por célula, de 300.000 a 400.000 cópias de HER2 por célula, de 400.000 a 500.000 cópias de HER2 por célula, de 500.000 a 750.000 cópias de HER2 por célula, ou de 750.000 a 1.000.000 cópias de HER2 por célula) ou de 1.000.000 a 3.000.000 cópias de HER2 por célula (por exemplo, de 1.000.000 a 1.500.000 cópias de HER2 por célula, de
1.500.000 a 2.000.000 cópias de HER2 por célula, de 2.000.000 a 2.500.000 cópias de HER2 por célula ou de 2.500.000 a 3.000.000 cópias de HER2 por célula).
[0077] Em algumas modalidades de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada ao paciente em uma dosagem de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg (por exemplo, cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg, por exemplo, cerca de 1 mg/kg).
[0078] Em algumas modalidades, um antagonista de ligação ao eixo PD-1 e/ou um agente terapêutico adicional são administrados ao paciente.
Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo PD-1 ou agente terapêutico adicional são administrados antes ou após a administração da molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo PD-1 ou agente terapêutico adicional são administrados simultaneamente com a molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo PD-1 é selecionado a partir do grupo que consiste em um antagonista de ligação ao PD-L1 (por exemplo, atezolizumabe (MPDL3280A), YW243.55.S70, MDX- 1105, MEDI4736 (durvalumabe) e MSB0010718C (avelumabe)), um antagonista de ligação ao PD-1 (por exemplo, MDX-1106 (nivolumabe), MK- 3475 (pembrolizumabe), CT-011 (pidilizumabe), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 (espartalizumabe), REGN2810 (cemiplimabe) e BGB-108) e um antagonista de ligação ao PD-L2 (por exemplo, um anticorpo ou uma imunoadesina).
[0079] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada por via subcutânea, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, por implantação, por inalação, intratecal, intraventricular ou intranasal. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada por via subcutânea. Em outras modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada por via intravenosa.
[0080] Em algumas modalidades de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores, o paciente é um humano.
[0081] Em outro aspecto, a invenção apresenta um kit que compreende: (a) uma composição compreendendo a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores; e (b) uma bula que compreende instruções para administrar a composição a um paciente para tratar ou retardar a progressão de um distúrbio (por exemplo, um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer) ou um distúrbio autoimune).
Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um transportador farmaceuticamente aceitável, excipiente ou diluente.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0082] A Figura 1 é um imunoblot que mostra a expressão relativa da proteína HER2 por células SKBR3 e células MCF7.
[0083] As Figuras 2A a 2F são gráficos que mostram curvas de resposta à dose da morte relativa de células SKBR3 (quadrados abertos) e células MCF7 (pontos sólidos) por várias moléculas monovalentes HER2 TDB (IgG TDB). Os dados são representados como média ± desvio padrão. A Figura 2A é um gráfico que mostra as curvas de resposta à dose da morte de células alvo pelo anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem (trastuzumabe). A Figura 2B é um gráfico que mostra as curvas de resposta à dose da morte de células alvo pela variante de anticorpo 4D5, Y55E.Y102V-TDB. A Figura 2C é um gráfico que mostra as curvas de resposta à dose da morte de células alvo pela variante de anticorpo 4D5, Y55E.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB. A Figura 2D é um gráfico que mostra as curvas de resposta à dose da morte de células alvo pela variante de anticorpo 4D5, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB. A Figura 2E é um gráfico que mostra as curvas de resposta à dose da morte de células alvo pela variante de anticorpo de 4D5, H91A-IgG TDB. A Figura 2F é um gráfico que mostra as curvas de resposta à dose da morte de células alvo pela variante de anticorpo 4D5, Y100A-IgG TDB.
[0084] A Figura 3 é um desenho esquemático de um anticorpo trivalente representativo do formato 1Fab-IgG TDB. O anticorpo apresenta um braço bivalente com duas frações de ligação à anti-HER2 e um braço monovalente com uma fração de ligação ao anti-CD3.
[0085] A Figura 4A é um gráfico que mostra as curvas de resposta à dose quantificando a ligação de vários anticorpos 1Fab-IgG TDB, em relação ao anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem para SKBR3, conforme quantificado por citometria de fluxo. Triângulos sólidos apontando para baixo representam o anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem (trastuzumabe); quadrados sólidos representam a variante de anticorpo 4D5, H91A-IgG TDB; triângulos sólidos apontando para cima representam a variante de anticorpo 4D5, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB; triângulos abertos apontando para baixo representam a variante de anticorpo 4D5, Y102V-IgG TDB; e diamantes abertos representam a variante de anticorpo 4D5, Y55E.Y102V-IgG TDB.
[0086] A Figura 4B é um gráfico que mostra as curvas de resposta à dose quantificando a ligação de vários anticorpos 1Fab-IgG TDB, em relação ao anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem, a MCF7, conforme quantificado por citometria de fluxo. Triângulos sólidos apontando para baixo representam o anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem (trastuzumabe); quadrados sólidos representam a variante de anticorpo 4D5, H91A-IgG TDB; triângulos sólidos apontando para cima representam a variante de anticorpo 4D5, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB; triângulos abertos apontando para baixo representam a variante de anticorpo 4D5, Y102V-IgG TDB; e diamantes abertos representam a variante de anticorpo 4D5, Y55E.Y102V-IgG TDB.
[0087] A Figura 5A é um gráfico que mostra a indução de apoptose em células SKBR3 como um resultado de vários anticorpos 1Fab-IgG
TDB, em relação ao anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem, conforme quantificado pela atividade da caspase 3/7 ao longo do tempo. Pontos sólidos representam o anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem (trastuzumabe); quadrados abertos representam a variante de anticorpo 4D5, H91A-IgG TDB; triângulos sólidos representam a variante de anticorpo 4D5, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB; triângulos abertos representam a variante de anticorpo 4D5, Y102V-IgG TDB; e diamantes abertos representam a variante de anticorpo 4D5, Y55E.Y102V-IgG TDB. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0088] A Figura 5B é um gráfico que mostra a indução de apoptose em células MCF7 como um resultado de vários anticorpos 1Fab-IgG TDB, em relação ao anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem, conforme quantificado pela atividade da caspase 3/7 ao longo do tempo. Pontos sólidos representam o anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem (trastuzumabe); quadrados abertos representam a variante de anticorpo 4D5, H91A-IgG TDB; triângulos sólidos representam a variante de anticorpo 4D5, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB; triângulos abertos representam a variante de anticorpo 4D5, Y102V-IgG TDB; e diamantes abertos representam a variante de anticorpo 4D5, Y55E.Y102V-IgG TDB. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0089] A Figura 6A é um gráfico que mostra citotoxicidade em células SKBR3 em resposta à incubação com 50 ng/mL de vários anticorpos 1Fab-IgG TDB, em relação ao anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem, conforme medido por um ensaio CELLTITER-GLO®. A primeira barra (à esquerda) representa o anticorpo 4D5 TDB do tipo selvagem (trastuzumabe); a segunda barra representa a variante de anticorpo 4D5, H91A-IgG TDB; a terceira barra representa a variante de anticorpo 4D5, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB; a quarta barra representa a variante de anticorpo 4D5, Y102V-IgG TDB; e a quinta barra (à direita) representa a variante de anticorpo 4D5, Y55E.Y102V- IgG TDB. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0090] A Figura 6B é um gráfico que mostra citotoxicidade em células MCF7 em resposta à incubação com 50 ng/mL de vários anticorpos 1Fab-IgG TDB, em relação ao anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem, conforme medido por um ensaio CELLTITER-GLO®. A primeira barra (à esquerda) representa o anticorpo 4D5 TDB do tipo selvagem (trastuzumabe); a segunda barra representa a variante de anticorpo 4D5, H91A-IgG TDB; a terceira barra representa a variante de anticorpo 4D5, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB; a quarta barra representa a variante de anticorpo 4D5, Y102V-IgG TDB; e a quinta barra (à direita) representa a variante de anticorpo 4D5, Y55E.Y102V- IgG TDB. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0091] A Figura 6C é um gráfico que mostra citotoxicidade em células MCF7 em resposta à incubação com 50 µg/mL de vários anticorpos 1Fab-IgG TDB, em relação ao anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem, conforme medido por um ensaio CELLTITER-GLO®. A primeira barra (à esquerda) representa o anticorpo 4D5 TDB do tipo selvagem (trastuzumabe); a segunda barra representa a variante de anticorpo 4D5, H91A-IgG TDB; a terceira barra representa a variante de anticorpo 4D5, D98A.F100A.Y102V-IgG TDB; a quarta barra representa a variante de anticorpo 4D5, Y102V-IgG TDB; e a quinta barra (à direita) representa a variante de anticorpo 4D5, Y55E.Y102V- IgG TDB. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0092] A Figura 7A é um gráfico que mostra curvas de resposta à dose que quantificam a ligação de vários anticorpos 1Fab-IgG TDB a células SKBR3, em relação ao anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem (trastuzumabe; triângulos sólidos), conforme quantificado por citometria de fluxo. Triângulos abertos representam a variante de anticorpo 4D5, Y55E.H91A-1Fab-IgG TDB; quadrados representam a variante de anticorpo
4D5, Y100Aa-1Fab-IgG TDB; e círculos representam a variante de anticorpo 4D5, H91A.N30A-1Fab-IgG TDB.
[0093] A Figura 7B é um gráfico que mostra curvas de resposta à dose quantificando a ligação de vários anticorpos 1Fab-IgG TDB a células MCF7, em relação ao anticorpo 4D5 IgG TDB do tipo selvagem (trastuzumabe; triângulos sólidos), conforme quantificado por citometria de fluxo. Triângulos abertos representam a variante de anticorpo 4D5, Y55E.H91A-1Fab-IgG TDB; quadrados representam a variante de anticorpo 4D5, Y100Aa-1Fab-IgG TDB; e círculos representam a variante de anticorpo 4D5, H91A.N30A-1Fab-IgG TDB.
[0094] A Figura 8 é um gráfico que mostra curvas de resposta à dose quantificando a citotoxicidade de vários anticorpos 1Fab-IgG TDB para células SKBR3, conforme medido por um ensaio CELLTITER-GLO®.
Quadrados abertos representam a variante de anticorpo 4D5, H91A-1Fab-IgG TDB; quadrados sólidos representam a variante de anticorpo 4D5, Y100Aa- 1Fab-IgG TDB; e círculos representam a variante de anticorpo 4D5, H91A.N30A-1Fab-IgG TDB. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0095] A Figura 9 é um gráfico que mostra as curvas de resposta à dose comparando a citotoxicidade dos anticorpos 4D5 IgG TDB em relação aos anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB. A citotoxicidade induzida por anticorpos 4D5 IgG TDB em células SKBR3 e células MCF7 é representada por círculos sólidos e quadrados sólidos, respectivamente. A citotoxicidade induzida por anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB em células SKBR3 e células MCF7 é representada por triângulos e quadrados abertos, respectivamente. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0096] A Figura 10 é um gráfico que mostra os resultados de uma análise de sequenciamento de RNA da expressão do RNA de ErbB2 em 90 linhagens celulares de câncer de mama. As linhagens celulares foram classificadas como linhagens celulares com baixa expressão de ErbB2, média expressão de ErbB2 e alta expressão de ErbB2.
[0097] A Figura 11A é um gráfico que mostra citotoxicidade de anticorpos 4D5 IgG TDB a uma concentração de 50 ng/mL em linhagens celulares com baixa expressão de ErbB2 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034 e HT55), linhagens celulares com média expressão de ErbB2 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1 e MKN7) e linhagens celulares com alta expressão de Erb2 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3 e KPL4). Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0098] A Figura 11B é um gráfico que mostra citotoxicidade de anticorpos 4D5 IgG TDB a uma concentração de 50 µg/mL em linhagens celulares com baixa expressão de ErbB2 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034 e HT55), linhagens celulares com média expressão de ErbB2 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1 e MKN7) e linhagens celulares com média expressão de Erb2 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3 e KPL4). Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0099] A Figura 11C é um gráfico que mostra o efeito de anticorpos 4D5 TDB a uma concentração de 50 ng/mL na ativação de células T CD8 + humanas cultivadas com linhagens celulares com baixa de expressão de ErbB2 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034 e HT55), linhagens celulares com média expressão de ErbB2 (MDA-MB-453, MDA- MB- 175-VII, JIMT-1 e MKN7) e linhagens celulares com alta expressão de Erb2 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3 e KPL4). A ativação das células T foi medida pela expressão dupla de CD69 e CD45. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0100] A Figura 11D é um immunoblot que mostra a expressão da proteína HER2 por cada uma das linhagens celulares representadas nas Figuras 11A a 11C.
[0101] A Figura 12A é um gráfico que mostra citotoxicidade de anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB a uma concentração de 50 ng/mL em linhagens celulares com baixa expressão de ErbB2 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034 e HT55), linhagens celulares com média expressão de ErbB2 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1 e MKN7) e linhagens celulares com alta expressão de Erb2 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474 -M1, SK-OV-3 e KPL4). Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0102] A Figura 12B é um gráfico que mostra citotoxicidade de anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB1Fab-IgG TDB a uma concentração de 50 µg/mL em linhagens celulares com baixa expressão de ErbB2 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034 e HT55), linhagens celulares com média expressão de ErbB2 (MDA-MB-453, MDA-MB-175-VII, JIMT-1 e MKN7) e linhagens celulares com alta expressão de Erb2 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3 e KPL4). Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0103] A Figura 12C é um gráfico que mostra o efeito dos anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB a uma concentração de 50 ng/mL na ativação das células T CD8+ humanas cultivadas com linhagens celulares com baixa expressão de ErbB2 (MDA-MB-436, PC3, MCF7/neo-cl3, MDA-MB-231, LS1034 e HT55), linhagens celulares com média expressão de ErbB2 (MDA- MB-453, MDA- MB-175-VII, JIMT-1 e MKN7) e linhagens celulares com alta expressão de Erb2 (MDA-MB-361, SKBR3, BT474-M1, SK-OV-3 e KPL4). A ativação das células T foi medida pela expressão dupla de CD69 e CD45. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0104] A Figura 12D é um immunoblot que mostra a expressão da proteína HER2 por cada uma das linhagens celulares representadas nas Figuras 12A a 12C.
[0105] A Figura 13 é um gráfico que mostra as curvas de resposta à dose quantificando a citotoxicidade de anticorpos 4D5 H91A-IgG TDB (quadrados) e anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB (círculos) em células HBL-100.
[0106] A Figura 14A é um gráfico que mostra curvas de resposta à dose que quantificam a citotoxicidade de várias concentrações de anticorpos 4D5 H91A-IgG TDB em células HBL-100 ao longo do tempo. Círculos sólidos representam uma dose de 5.000 ng/mL de 4D5 H91A-IgG TDB, quadrados abertos representam uma dose de 500 ng/mL de 4D5 H91A-IgG TDB, triângulos sólidos apontando para cima representam uma dose de 50 ng/mL de 4D5 H91A-IgG TDB, triângulos abertos apontando para baixo representam uma dose de 5 ng/mL de 4D5 H91A-IgG TDB, diamantes abertos representam uma dose de 0,5 ng/mL de 4D5 H91A-IgG TDB e diamantes sólidos representam um controle não tratado.
[0107] A Figura 14B é um gráfico que mostra curvas de resposta à dose quantificando a citotoxicidade de várias concentrações de anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB em células HBL-100 ao longo do tempo. Círculos sólidos representam uma dose de 5.000 ng/mL de 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB, quadrados abertos representam uma dose de 500 ng/mL de 4D5 H91A-1Fab- IgG TDB, triângulos sólidos apontando para cima representam uma dose de 50 ng/mL de 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB, triângulos abertos apontando para baixo representam uma dose de 5 ng/mL de 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB, diamantes abertos representam uma dose de 0,5 ng/mL de 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB e diamantes sólidos representam um controle não tratado.
[0108] A Figura 15A é um conjunto de gráficos que mostram o efeito da morte de 4D5 H91A-IgG TDB e 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB em linhagens celulares que expressam quantidades crescentes de HER2, da esquerda para a direita, conforme mostrado pelo immunoblot e gráfico de barras subjacentes.
[0109] A Figura 15B é uma série de fotomicrografias que mostram os resultados dos ensaios de detecção de IHC e FISH da expressão relativa de HER2.
[0110] A Figura 15C é um gráfico que mostra a morte de células distinguidas na Figura 15B por 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB.
[0111] A Figura 16 é um immunoblot que mostra a expressão da proteína HER2 em células MCF7, células HT55 e células KPL4 amplificadas por HER2.
[0112] A Figura 17 é um gráfico de treliça que mostra o volume tumoral KPL4 ao longo do tratamento com várias doses de anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB ou anticorpos 4D5 TDB do tipo selvagem em camundongos suplementados com PBMCs humanas. Os camundongos com tumores KPL4 estabelecidos receberam uma dose intravenosa única no dia 0 nas doses indicadas. Cada painel na treliça mostra um grupo de doses, conforme indicado pelo cabeçalho do painel. Linhas pretas sólidas em negrito representam o volume tumoral ajustado para cada grupo de doses. Linhas em negrito tracejadas representam o volume tumoral ajustado para o grupo controle, que recebeu o veículo tamponado de histidina. Linhas tracejadas com círculos abertos representam animais individuais. Linhas sólidas com pontos sólidos representam animais que foram removidos do estudo. Linhas horizontais cinzentas tracejadas marcam um volume tumoral de 500 mm 3.
[0113] A Figura 18 é um gráfico de treliça que mostra o volume tumoral HT55 ao longo do tratamento com várias doses de anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB ou anticorpos 4D5 IgG TDB do tipo selvagem em camundongos suplementados com PBMCs humanas. Os camundongos com tumores HT55 estabelecidos receberam uma dose intravenosa única no dia 0 nas doses indicadas. Cada painel na treliça mostra um grupo de doses,
conforme indicado pelo cabeçalho do painel. Linhas pretas sólidas em negrito representam o volume tumoral ajustado para cada grupo de doses. Linhas em negrito tracejadas representam o volume tumoral ajustado para o grupo controle, que recebeu o veículo tamponado de histidina. Linhas tracejadas com círculos abertos representam animais individuais. Linhas sólidas com pontos sólidos representam animais que foram removidos do estudo. Linhas horizontais cinzentas tracejadas marcam um volume tumoral de 500 mm 3.
[0114] A Figura 19 é um gráfico de treliça que mostra o volume tumoral KPL4 ao longo do tratamento com várias doses de anticorpos 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB ou anticorpos do tipo selvagem 4D5 IgG TDB em camundongos suplementados com PBMCs humanas. Os camundongos com tumores KPL4 estabelecidos receberam uma dose intravenosa única no dia 0 nas doses indicadas. Cada painel na treliça mostra um grupo de doses, conforme indicado pelo cabeçalho do painel. Linhas pretas sólidas em negrito representam o volume tumoral ajustado para cada grupo de doses. Linhas em negrito tracejadas representam o volume tumoral ajustado para o grupo controle, que recebeu o veículo tamponado de histidina. Linhas tracejadas com círculos abertos representam animais individuais. Linhas sólidas com pontos sólidos representam animais que foram removidos do estudo. Linhas horizontais vermelhas tracejadas marcam um volume tumoral de 500 mm3.
[0115] A Figura 20 é um gráfico que mostra curvas de resposta à dose que quantificam a citotoxicidade dos anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB (círculos sólidos) e dos anticorpos 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB (quadrados abertos) nas células SKBR3. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0116] A Figura 21A é um gráfico que mostra a morte por anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB de linhagens celulares com alta expressão de HER2 (n = 20). As linhagens celulares com alta expressão de HER2 são distinguidas pela alta expressão do RNA de Erb2. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0117] A Figura 21B é um gráfico que mostra a morte por anticorpos 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB de linhagens celulares com alta expressão de HER2 (n = 20). As linhagens celulares com alta expressão de HER2 são distinguidas pela alta expressão do RNA de Erb2. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0118] A Figura 22 é um gráfico que mostra a potência relativa da morte de linhagens celulares com alta expressão de HER2 por anticorpos 4D5 D98A.F100.Y102V-1Fab-IgG TDB em relação a anticorpos 4D5 H91A- 1Fab-IgG TDB. Os dados são derivados das Figuras 20A e 20B.
[0119] A Figura 23A é um gráfico que mostra a morte por anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB de linhagens celulares com média expressão de HER2 (n = 12). A morte de células SKBR3 é fornecida como um controle positivo. As linhagens celulares com média expressão de HER2 são distinguidas pela expressão média do RNA de Erb2. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0120] A Figura 23B é um gráfico que mostra a morte por anticorpos 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB de linhagens celulares com média expressão de HER2 (n = 12). A morte de células SKBR3 é fornecida como um controle positivo. As linhagens celulares com média expressão de HER2 são distinguidas pela expressão média do RNA de Erb2. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0121] A Figura 24 é um gráfico que mostra a potência relativa da morte de linhagens celulares com expressão média de HER2 por anticorpos 4D5 D98A.F100.Y102V-1Fab-IgG TDB em relação a anticorpos 4D5 H91A- 1Fab-IgG TDB. Os dados são derivados das Figuras 22A e 22B.
[0122] A Figura 25A é um gráfico que mostra a morte por anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB de linhagens celulares com baixa expressão de HER2 (n = 12). A morte de células SKBR3 é fornecida como um controle positivo. As linhagens celulares com baixa expressão de HER2 são distinguidas pela baixa expressão do RNA de Erb2. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0123] A Figura 25B é um gráfico que mostra a morte por anticorpos 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB de linhagens celulares com baixa expressão de HER2 (n = 12). A morte de células SKBR3 é fornecida como um controle positivo. As linhagens celulares com baixa expressão de HER2 são distinguidas pela baixa expressão do RNA de Erb2. Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0124] A Figura 26 é um gráfico que mostra a potência relativa da morte de linhagens celulares com baixa expressão de HER2 por anticorpos 4D5 D98A.F100.Y102V-1Fab-IgG TDB em relação a anticorpos 4D5 H91A- 1Fab-IgG TDB. Os dados são derivados das Figuras 24A e 24B.
[0125] A Figura 27A é um desenho esquemático que mostra a posição e sequências dos dois ligantes peptídicos testados na Figura 27B.
Cada ligante peptídico funde o terminal C da região de cadeia pesada constante (CH) do Fab distal ao terminal N da região de cadeia pesada variável (VH) do Fab proximal. DKTHTGGGGSGG (SEQ ID NO: 52) é representado por quadrados abertos e DKTHT (SEQ ID NO: 50) é representado por círculos sólidos, na Figura 27B.
[0126] A Figura 27B é um gráfico que mostra curvas de resposta à dose que quantificam a ligação a células MCF7 de anticorpos 4D5 H91A- 1Fab-IgG TDB tendo o ligante DKTHTGGGGSGG (quadrados abertos), em relação aos anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB tendo o ligante DKTHT (círculos sólidos). Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0127] A Figura 27C é um gráfico que mostra curvas de resposta à dose que quantificam a morte de células SKBR3 por anticorpos 4D5 H91A- 1Fab-IgG TDB tendo o ligante DKTHTGGGGSGG (quadrados abertos), em relação aos anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB tendo o ligante DKTHT (círculos sólidos). Os dados são representados como média ± desvio padrão.
[0128] A Figura 28A é uma série de immunoblots que mostram o efeito de anti-HER2-CD3 1Fab-IgG na expressão de pAKTS473 e pHER3 por células SKBR3 ao longo do tempo.
[0129] A Figura 28B é um gráfico que mostra as curvas de resposta à dose quantificando a viabilidade das células SKBR3 em resposta ao tratamento com anti-HER2-CD3 1Fab-IgG, anti-HER2-CD3 IgG TDB e Trastuzumabe.
[0130] A Figura 29A é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 Fab do tipo selvagem à HER2 humana imobilizada diretamente (domínio extracelular; Novus Biologicals), conforme medido usando ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. As amostras 4D5 Fab do tipo selvagem variaram em concentrações de 0,27 nM a 200 nm, em diluições de 3 vezes.
[0131] A Figura 29B é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 Y55E.Y102V-Fab à HER2 humana imobilizada diretamente (domínio extracelular; Novus Biologicals), conforme medido usando ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. As amostras 4D5 Y55E.Y102V-Fab variaram em concentrações de 0,27 nM a 200 nm, em diluições de 3 vezes.
[0132] A Figura 29C é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 D98A.F100A.Y102V-Fab à HER2 humana imobilizada diretamente (domínio extracelular; Novus Biologicals), conforme medido usando ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. As amostras 4D5
D98A.F100A.Y102V-Fab variaram em concentrações de 0,27 nM a 200 nm, em diluições de 3 vezes.
[0133] A Figura 29D é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 H91A-Fab à HER2 humana imobilizada diretamente (domínio extracelular; Novus Biologicals), conforme medido usando ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. As amostras 4D5 H91A-Fab variaram em concentrações de 0,27 nM a 200 nm, em diluições de 3 vezes.
[0134] A Figura 30A é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 N30S-Fab à HER2 humana imobilizada diretamente (domínio extracelular; Novus Biologicals), conforme medido usando a ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. As amostras 4D5 N30S-Fab variaram em concentrações de 0,27 nM a 200 nm, em diluições de 3 vezes.
[0135] A Figura 30B é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 N54E.D98T-Fab à HER2 humana imobilizada diretamente (domínio extracelular; Novus Biologicals), conforme medido usando ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. As amostras 4D5 N54E.D98T-Fab variaram em concentrações de 0,27 nM a 200 nm, em diluições de 3 vezes.
[0136] A Figura 30C é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 N30S.N54E.D98T-Fab à HER2 humana imobilizada diretamente (domínio extracelular; Novus Biologicals), conforme medido usando ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. As amostras 4D5 N30S.N54E.D98T-Fab variaram em concentrações de 0,27 nM a 200 nm, em diluições de 3 vezes.
[0137] A Figura 31A é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 N30S.Y55E.N54E.D98T.Y102V-Fab à HER2 humana imobilizada diretamente (domínio extracelular; Novus Biologicals), conforme medido usando ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. As amostras 4D5 N30S.Y55E.N54E.D98T.Y102V-Fab variaram em concentrações de 0,27 nM a 200 nm, em diluições de 3 vezes.
[0138] A Figura 31B é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 N30S.N54E.D98T.F100A.Y102V-Fab à HER2 humana imobilizada diretamente (domínio extracelular; Novus Biologicals), conforme medido usando ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. As amostras 4D5 N30S.N54E.D98T.F100A.Y102V-Fab variaram em concentrações de 0,27 nM a 200 nm, em diluições de 3 vezes.
[0139] A Figura 31C é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 N30S.H91A.N54E.D98T-Fab à HER2 humana imobilizada diretamente (domínio extracelular; Novus Biologicals), conforme medido usando ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. As amostras 4D5 N30S.H91A.N54E.D98T-Fab variaram em concentrações de 0,27 nM a 200 nm, em diluições de 3 vezes.
[0140] As Figuras 32A a 32K é uma série de sensorgramas que mostram a cinética de ligação de anticorpos 4D5 IgG TDB à HER2 humana, conforme medido usando ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. A Figura 32A é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 IgG TDB do tipo selvagem; a Figura 32B é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 H91A-IgG TDB; a Figura 32C é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 Y55E.H91A-IgG TDB; a Figura 32D é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 Y55E.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB; a Figura 32E é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 D98A.F100A.Y102V-IgG TDB; a Figura 32F é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 H91A.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB; a Figura 32G é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 Y55E.H91A.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB; a Figura 32H é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5
Y55E.Y102V-IgG TDB; a Figura 32I é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 Y102V-IgG TDB; a Figura 32J é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 H91A.Y102V-IgG TDB; e a Figura 32K é um sensorgrama que mostra a cinética de ligação do 4D5 Y55E.H91A.Y102V- IgG TDB.
[0141] A Figura 33A é um gráfico que mostra curvas de resposta à dose que quantificam a morte de células SKBR3 por anticorpos 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (lote 1) (quadrados abertos); anticorpos 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB (quadrados sólidos); anticorpos 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (lote 2) (triângulos abertos voltados para baixo); ou anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB (triângulos sólidos voltados para cima).
[0142] A Figura 33B é um gráfico que mostra curvas de resposta à dose que quantificam a morte de células MCF7 por anticorpos 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (lote 1) (quadrados abertos); anticorpos 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB (quadrados sólidos); anticorpos 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (lote 2) (triângulos abertos voltados para baixo); ou anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB (triângulos sólidos voltados para cima).
[0143] A Figura 34A é um gráfico que mostra as curvas de resposta à dose quantificando a ligação de várias variantes 1Fab-IgG TDB para células SKBR8, conforme medido por citometria de fluxo. Os quadrados abertos representam os anticorpos 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab- IgG TDB (lote 1); quadrados sólidos representam anticorpos 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB; triângulos abertos voltados para baixo representam anticorpos 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (lote 2); e triângulos sólidos voltados para cima representam anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB.
[0144] A Figura 34B é um gráfico que mostra as curvas de resposta à dose quantificando a ligação de várias variantes 1Fab-IgG TDB para células MCF7, conforme medido por citometria de fluxo. Os quadrados abertos representam os anticorpos 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (lote 1); quadrados sólidos representam anticorpos 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB; triângulos abertos voltados para baixo representam anticorpos 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB (lote 2); e triângulos sólidos voltados para cima representam anticorpos 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB.
[0145] A Figura 35A é uma representação esquemática que mostra a ligação e a atividade de anti-HER2-CD3 IgG-TDBs com ligação monovalente de alta afinidade.
[0146] A Figura 35B é uma representação esquemática que mostra a ligação e a atividade de anti-HER2-CD3 IgG-TDBs com ligação monovalente de baixa afinidade.
[0147] A Figura 35C é uma representação esquemática que mostra que a ligação bivalente à HER2 com afinidade apropriada (20 a 50 nM de KD monovalente) resulta em alta ligação a células que expressam HER2 devido à avidez do anti-HER2-CD3 1Fab-IgG TDB.
[0148] A Figura 36 fornece a estrutura cristalina do domínio extracelular HER2 (ECD) e destaca as regiões às quais os diferentes anticorpos HER2 se ligam.
[0149] A Figura 37 é um gráfico que mostra curvas de resposta à dose que quantificam a morte de células alvo SKBR3 por 38E4v1 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (círculos abertos); células alvo SKBR3 por 40G5c 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (círculos sólidos); células alvo MCF7 por 38E4v1 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (quadrados abertos); e células alvo MCF7 por 40G5c 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB (quadrados fechados).
[0150] A Figura 38A é um gráfico que mostra o nível da ativação de células T independentes de HER2 induzida por 4D5 H91A 1Fab-IgG TDB e 4D5 IgG TDB, conforme testado na presença e na ausência de células que expressam HER2.
[0151] A Figura 38B é um gráfico que mostra o nível da ativação de células T independentes de HER2 induzida por 4D5 H91A 1Fab-IgG TDB e 4D5 IgG TDB, conforme como testado na presença e na ausência de anti-CD3 OKT3 bivalente.
[0152] A Figura 38C é uma série de gráficos que mostram marcadores sanguíneos para inflamação (proteína C reativa; PCR), ativação de células T (margem de linfócitos) e dano hepático (alanina e aspartato aminotransferases; ALT e AST), conforme medido dois dias e oito dias após dosar macacos cynomolgus com H91A 1Fab-IgG TDB ou controle veículo.
[0153] A Figura 38D é um gráfico e uma tabela do sumário que mostram os parâmetros de PK conforme detectados por ELISA a partir de macacos cinomolgos dosados com H91A 1Fab-IgG TDB nas doses de 20 mg/kg e 3 mg/kg.
[0154] A Figura 38E é um gráfico que mostra os níveis séricos de cynomolgus de H91A 1Fab-IgG TDB aos 7 dias e 14 dias após a dosagem e submetidos a células PBMC e SKBR3 de doadores saudáveis por 24 horas usando as diluições indicadas. Realizaram-se experimentos paralelos usando diluições de 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB fresco (controle).
[0155] A Figura 39 é um diagrama que mostra o efeito de várias substituições de aminoácidos na afinidade de ligação das variantes 4D5 anti- HER2 Fab.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES DA INVENÇÃO I.DEFINIÇÕES
[0156] O termo "sobre", conforme usado no presente documento,
refere-se à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pelo técnico no assunto neste campo técnico. A referência a "sobre" um valor ou parâmetro neste documento inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas para esse valor ou parâmetro em si.
[0157] “Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único local de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e o seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outro modo, conforme usado no presente documento, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X para seu parceiro Y pode geralmente ser representada pela constante de dissociação de equilíbrio (KD).
A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos no presente documento. Modalidades ilustrativas e exemplos específicos para medir a afinidade de ligação encontram-se descritos a seguir.
[0158] Conforme usado no presente documento, os termos “especificamente se liga a” ou "é específico para” referem-se às interações mensuráveis e reprodutíveis, tais como a ligação entre um alvo e um anticorpo, que é determinante da presença do alvo na presença de uma população heterogênea de moléculas, incluindo moléculas biológicas. Por exemplo, um anticorpo que especificamente se liga a um alvo (que pode ser um epítopo) é um anticorpo que se liga a este alvo com maior afinidade, avidez, mais prontamente e/ou com maior duração do que se liga aos outros alvos. Em uma modalidade, a extensão da ligação de um anticorpo a um alvo não relacionado é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo ao alvo tal conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que especificamente se liga a um alvo tem uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ou ≤ 0,1 nM. Em certas modalidades, um anticorpo especificamente se liga a um epítopo em uma proteína que é conservada entre a proteína a partir de espécies diferentes. Em outra modalidade, a ligação específica pode incluir, mas não necessita de ligação exclusiva.
[0159] O termo “anticorpo” é usado neste documento no sentido mais amplo e abrange várias estruturas de anticorpo, incluindo, mas não limitados a, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos), e fragmentos de anticorpo, contanto que exibam a atividade de ligação ao antígeno desejada.
[0160] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não se limitam a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; moléculas de anticorpos de cadeia simples (por exemplo, scFv); e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo.
[0161] Por "fração de ligação ao antígeno", entende-se uma parte de um composto ou molécula que especificamente se liga a um epítopo, antígeno, ligante ou receptor alvo. Moléculas que apresentam frações de ligação ao antígeno incluem, mas não estão limitadas a, anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais, policlonais, recombinantes, humanizados e quiméricos), fragmentos de anticorpo ou porções dos mesmos (por exemplo, fragmentos Fab, Fab'2, anticorpos scFv, SMIP, anticorpos de domínio, diacorpos, minicorpos, scFv-Fc, aficorpos, nanocorpos e domínios VHe/ou VL de anticorpos), receptores, ligantes, aptâmeros e outras moléculas tendo um parceiro de ligação identificado. Um anticorpo de "afinidade amadurecida" refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs), comparado a um anticorpo progenitor que não possui tais alterações, resultando em um aprimoramento na afinidade do anticorpo para antígeno.
[0162] Conforme usado no presente documento, o termo "monovalente", por exemplo, no contexto de um braço monovalente de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, refere-se a uma molécula ou a uma porção da mesma (por exemplo, uma porção de uma molécula de ligação ao antígeno, por exemplo, um dos dois braços de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica) que tem uma única fração de ligação ao antígeno.
Assim, uma molécula monovalente ou uma porção da mesma é capaz de especificamente se ligar a exatamente um antígeno. A “afinidade de ligação monovalente” ou “KD monovalente” de uma das duas frações de ligação ao antígeno de um braço bivalente de um anticorpo biespecífico (por exemplo, ums das frações de ligação ao antígeno HER2 de um 1Fab-IgG TDB) refere-se a afinidade de ligação da fração de ligação ao antígeno na forma monovalente, isto é, como um braço monovalente de um anticorpo biespecífico capaz de especificamente se ligar a dois antígenos diferentes ou como uma molécula Fab.
[0163] Conforme usado no presente documento, o termo "bivalente", por exemplo, no contexto de um braço bivalente de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, refere-se a uma molécula ou uma porção da mesma (por exemplo, uma porção de uma molécula de ligação ao antígeno, por exemplo, um dos dois braços de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica) que tem exatamente duas frações de ligação ao antígeno, cada uma das quais é capaz de especificamente se ligar a um antígeno. Assim, uma molécula bivalente ou uma porção da mesma é capaz de especificamente se ligar a dois antígenos ou a dois epítopos diferentes no mesmo antígeno (por exemplo, dois antígenos HER2 expressos na superfície de uma única célula tumoral).
[0164] O termo "agrupamento de diferenciação 3" ou "CD3", tal conforme usado no presente documento, refere-se a qualquer CD3 nativo a partir de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, tais como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma, incluindo, por exemplo, cadeias CD3ε, CD3γ, CD3α, e CD3β. O termo abrange CD3 não processado "de comprimento total" (por exemplo, CD3ε ou CD3γ não processados ou não modificados), bem como qualquer forma de CD3 resultante do processamento na célula. O termo também abrange variantes de CD3 de ocorrência natural, incluindo, por exemplo, variantes de splice ou variantes alélicas. O CD3 inclui, por exemplo, a proteína CD3ε humana (sequenciamento de referência de NCBI de nº NP_000724), que tem 207 aminoácidos de comprimento, e a proteína CD3γ humana (sequenciamento de referência de NCBI de nº NP_000064), que tem 182 aminoácidos de comprimento.
[0165] Os termos "anticorpo anti-CD3" e "um anticorpo que se liga ao CD3" referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar ao CD3 com afinidade suficiente, de tal modo que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico para direcionar o CD3. Em uma modalidade, a extensão da ligação de um anticorpo anti-CD3 a uma proteína não relacionada a CD3 é inferior a cerca de 10% da ligação do anticorpo ao CD3, conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas modalidades, um anticorpo que se liga ao CD3 tem uma constante de dissociação (K D) de ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM ou ≤ 0,001 nM (por exemplo, 10- 8M ou menos, por exemplo, de 10-8M a 10-13M, por exemplo, de 10-9M a 10-13 M). Em certas modalidades, um anticorpo anti-CD3 se liga a um epítopo de CD3 que é conservado entre CD3 de diferentes espécies.
[0166] Os termos "região Fc" ou "domínio Fc" são usados neste documento alternadamente para se referirem a uma região terminal do C de uma cadeia pesada da imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma modalidade, uma região Fc de cadeia pesada da IgG humana se estende de Cys226, ou de Pro230, até o terminal carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina do terminal C (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. O termo abrange regiões Fc truncadas, tais como aquelas tendo um truncamento do terminal C (por exemplo, um truncamento ΔGK, por exemplo, conforme descrito em Hu, et al., Biotechnol. Prog. 2017, 33: 786-794 e Jiang, et al., J. Pharm. Sci. 2016, 105: 2066-2072). A menos que especificado de outra forma neste documento, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante está de acordo com o sistema de numeração da UE, também chamado de índice da UE, como descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Uma "subunidade" de um domínio Fc, como usado no presente documento, refere- se a um dos dois polipeptídeos que formam o domínio Fc dimérico, isto é, um polipeptídeo compreendendo regiões constantes dos terminais C de uma cadeia pesada da imunoglobulina, capaz de autoassociação estável. Em uma modalidade, uma subunidade de um domínio Fc da IgG compreende um domínio constante da IgG CH2 e IgG CH3.
[0167] “Região estrutural” ("framework") ou “FR” referem-se aos resíduos de domínio variável diferentes dos resíduos de região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável consiste geralmente em quatro domínios FR: FR1, RF2, FR3, e FR4. Por conseguinte, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência na VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2- H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
[0168] Os termos "anticorpo de comprimento total", "anticorpo intacto" e "anticorpo inteiro" são usados neste documento de forma intercambiável para se referirem a um anticorpo tendo uma estrutura substancialmente semelhante a uma estrutura de anticorpo nativo ou tendo cadeias pesadas que contêm uma região Fc conforme definido aqui.
[0169] Um "anticorpo humano" é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde à de um anticorpo produzido por um humano ou uma célula humana ou derivado de uma fonte não humana que usa repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências que codificam anticorpos humanos. Esta definição de um anticorpo humano exclui especificamente um anticorpo humanizado compreendendo resíduos de ligação ao antígeno não humanos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo bibliotecas de exibição de fagos. Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). Também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos os métodos descritos em Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Vide também van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Os anticorpos humanos podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir tais anticorpos em resposta a um desafio antigênico, mas cujos locus endógenos foram desativados, por exemplo, xenomice imunizado (vide, por exemplo, as patentes dos EUA de nºs
6.075.181 e 6.150.584 em relação à tecnologia XENOMOUSE TM). Vide também, por exemplo, Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) em relação a anticorpos humanos gerados por meio de uma tecnologia de hibridoma de células B humanas.
[0170] Uma "região estrutural de consenso humana" é uma região estrutural que representa os resíduos de aminoácidos mais comuns em uma seleção de sequências de regiões estruturais de VL ou VH da imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de sequências de VL ou VH da imunoglobulina humana é a partir de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo conforme em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edição, NIH Publication 91-3242, Bethesda, MD, (1991), volumes 1 a 3. Em uma modalidade, para a VL, o subgrupo é o subgrupo kappa I, conforme em Kabat et al., supra. Em uma modalidade, para a VH, o subgrupo é o subgrupo kappa III, conforme em Kabat et al., supra.
[0171] Um anticorpo "humanizado" refere-se a um anticorpo quimérico compreendendo resíduos de aminoácidos de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em certas modalidades, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um e, normalmente, dois domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem a tais de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem a tais de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode compreender opcionalmente pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma "forma humanizada" de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que passou por humanização.
[0172] O termo "anticorpo monoclonal", conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis anticorpos de variantes, por exemplo, contendo mutações de ocorrência natural ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, tais variantes geralmente presentes em pequenas quantidades. Em contraste às preparações de anticorpo policlonal, que normalmente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante em um antígeno. Assim, o modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, entre outros, o método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição de fagos e métodos que usam animais transgênicos contendo todos ou parte dos locus da imunoglobulina humana, tais métodos e outros métodos exemplares para a produção de anticorpos monoclonais sendo descritos neste documento.
[0173] "Anticorpos nativos" referem-se a moléculas da imunoglobulina de ocorrência natural com estruturas variadas. Por exemplo, os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de
150.000 Daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que estão ligadas por dissulfeto. Do terminal N ao C, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também denominada domínio variável pesado ou domínio variável de cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). Da mesma forma, do terminal N ao C, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também denominada domínio variável leve ou domínio variável de cadeia leve, seguido por um domínio leve constante (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída a um dos dois tipos, chamados kappa (κ) e lambda (λ), com base na sequência de aminoácidos de seu domínio constante.
[0174] O termo "região hipervariável" ou "HVR", conforme usado neste documento, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável de anticorpo que são hipervariáveis em sequência ("regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs") e/ou formam alças estruturalmente definidas ("alças hipervariáveis”) e/ou contêm os resíduos que entram em contato com o antígeno (“contatos ao antígeno”). Geralmente, os anticorpos compreendem seis HVRs: três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). HVRs exemplificares do presente documento incluem: (a) alças hipervariáveis que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96- 101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) contatos ao antígeno que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2) e 93- 101 (H3) (MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); e (d) combinações de (a), (b) e/ou (c), incluindo os resíduos de aminoácidos HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3) e 94-102 (H3).
[0175] Salvo indicação em contrário, os resíduos HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos FR) são numerados aqui de acordo com Kabat et al., supra.
[0176] O termo "região variável" ou "domínio variável" refere-se ao domínio de um anticorpo de cadeia pesada ou leve que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais conservadas (FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Vide, por exemplo, Kindt et al., Kuby Immunology, 6 th ed., WH REeeman e Co., página 91 (2007)). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Vide, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150: 880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).
[0177] Um "imunoconjugado" é um anticorpo conjugado a uma ou mais molécula(s) heteróloga(s), incluindo, sem limitação, um agente citotóxico.
[0178] Um anticorpo “isolado” é um que foi separado de um componente do seu ambiente natural. Em algumas modalidades, um anticorpo é purificado com pureza superior a 95% ou 99%, conforme determinado por, por exemplo, eletroforético (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese capilar) ou cromatográfico (por exemplo, troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para revisão dos métodos para avaliação da pureza do anticorpo, vide, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848: 79-87 (2007).
[0179] "Identidade de sequência de aminoácidos em porcentagem (%)" em relação a uma sequência de polipeptídeo de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que é idêntica aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeo de referência, após o alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para atingir a porcentagem máxima de identidade de sequência e não considerar nenhuma substituição conservativa como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos pode ser alcançado de várias maneiras dentro da especialidade na técnica, por exemplo, usando software de computador disponível ao público, tal como o software BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para o alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo de todo o comprimento das sequências sendo comparadas.
Para os presentes fins, contudo, os valores d a% de identidade de sequência de aminoácidos são gerados usando o programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador para comparação de sequências ALIGN-2 foi criado pela Genentech, Inc., e o código-fonte foi depositado com documentação do usuário no Copyright Office dos EUA, Washington DC, 20559, em que está registrado sob o registro de direitos autorais dos EUA de nº TXU510087. O programa ALIGN-2 está disponível publicamente na Genentech, Inc., sul de São Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código-fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, incluindo UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são ajustados pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[0180] Em situações em que se usa ALIGN-2 para comparações de sequências de aminoácidos, a % da identidade de sequência de aminoácidos de uma determinada sequência de aminoácidos A para, com, ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma determinada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende uma determinada % da identidade de sequência de aminoácidos para, com, ou contra uma determinada sequência de aminoácidos B) é calculada como se segue: 100 vezes a fração X/Y em que X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como correspondências idênticas pelo programa de alinhamento de sequência ALIGN-2 no alinhamento desse programa de A e B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Será apreciado que em que o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % da identidade de sequência de aminoácidos de A a B não será igual à % da identidade de sequência de aminoácidos de B a A. os valores da identidade de sequência de aminoácidos usados neste documento são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior usando o programa de computador ALIGN-2.
[0181] Conforme usado no presente documento, o termo "correção de deficiência" (e qualquer derivação gramatical do mesmo) refere-se a uma substituição de aminoácidos configurada para aperfeiçoar a estabilidade química do anticorpo (por exemplo, taxa reduzida de desaminação e/ou isomerização), por exemplo, substituindo um resíduo de aminoácido propenso a desaminação ou isomerização por um resíduo de aminoácido comparativamente inerte ou substituindo um aminoácido que flanqueia o resíduo propenso a desaminação ou isomerização por um resíduo de aminoácido comparativamente inerte. Exemplos de correções de deficiência para reduzir a desaminação incluem a substituição de asparagina por serina ou ácido glutâmico (por exemplo, N30S ou N54E). Exemplos de correções de deficiência para reduzir a isomerização incluem a substituição de ácido aspártico por alanina ou treonina (por exemplo, D98A ou D98T).
[0182] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente do seu ambiente natural.
Um ácido nucleico isolado inclui uma molécula de ácido nucleico contida em células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente de forma extracromossômica ou em uma localização cromossômica diferente da sua localização cromossômica natural.
[0183] “Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti- CD3” refere-se a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam o anticorpo de cadeias pesadas e leves (ou fragmentos do mesmo), incluindo tal(is) molécula(s) de ácido nucleico em um único vetor ou em vetores separados, e tal(is) molécula(s) de ácido nucleico presentes em um ou mais locais em uma célula hospedeira.
[0184] O termo “vetor”, conforme usado no presente documento, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar um outro ácido nucleico ao qual ela está ligada. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico de autorreplicação, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual foi introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais estão operativamente ligados. Tais vetores são aqui referidos como “vetores de expressão”.
[0185] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem celular hospedeira”, e “cultura de células hospedeiras” são usados indiferentemente e referem-se às células hospedeiras nas quais o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem "transformantes" e "células transformadas", que incluem a célula transformada primária e a progênie derivadas delas, sem levar em consideração o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica no conteúdo de ácido nucleico a uma célula-mãe, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica conforme rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada é incluída neste documento.
[0186] O termo “bula” é usado para referir-se às instruções geralmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações acerca das indicações, uso, dosagem, administração, a terapia combinada, contraindicações e/ou avisos em relação ao uso de tais produtos terapêuticos.
[0187] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma preparação que é de tal forma para permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido nela seja eficaz e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um paciente ao qual a formulação seria administrada.
[0188] Um “transportador farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, diferente de um ingrediente ativo, que não é tóxico a um paciente. Um transportador farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a um tampão, excipiente, estabilizador ou conservante.
[0189] Como usado neste documento, "administrar" significa um método para fornecer uma dosagem de um composto (por exemplo, um anticorpo anti-CD3 da invenção ou um ácido nucleico que codifica um anticorpo anti-CD3 da invenção) ou uma composição (por exemplo, uma composição farmacêutica, por exemplo, uma composição farmacêutica incluindo um anticorpo anti-CD3 da invenção) a um paciente. As composições usadas nos métodos descritos no presente documento podem ser administradas, por exemplo, por via intramuscular, intravenosa, intradérmica, percutânea, intra- arterial, intraperitoneal, intralesional, intracraniana, intra-articular, intraprostaticamente, intrapleural, intratraqueal, intranasal, intravítrea, intravaginal, intramuscular, peritoneal, subcutânea, subconjuntival, intravesicular, mucosa, intrapericardial, intraumbilicamente, intraocular, oral, tópica, local, por inalação, por injeção, por infusão, por infusão contínua, por perfusão localizada, banhando as células alvo diretamente, por cateter, por lavagem, em cremes ou em composições lipídicas. O método de administração pode variar dependendo de vários fatores (por exemplo, o composto ou composição sendo administrado e a gravidade da condição, doença ou distúrbio sendo tratado).
[0190] Conforme usado neste documento, "tratamento" (e variações gramaticais dos mesmos, como "tratar" ou "tratado") refere-se à intervenção clínica na tentativa de alterar o curso natural do paciente sendo tratado e pode ser realizado para profilaxia ou durante a curso de patologia clínica. Efeitos desejáveis de tratamento incluem, mas não estão limitados a, prevenção de ocorrência ou de recorrência da doença, o alívio de sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção da metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou paliação do estado de doença e remissão ou prognóstico aprimorado. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção são usados para atrasar o desenvolvimento de uma doença ou para retardar a progressão de uma doença.
[0191] Conforme usado no presente documento, "retardar a progressão" de um distúrbio ou doença significa pausar, impedir, atrasar, desacelerar, estabilizar e/ou adiar o desenvolvimento da doença ou distúrbio (por exemplo, um distúrbio proliferativo celular, por exemplo, câncer). Esse retardamento pode ser de duração variável, dependendo do histórico da doença e/ou do paciente a ser tratado. Como é evidente para um técnico no assunto, um retardamento suficiente ou significativo pode, com efeito, abranger a prevenção, na medida em que o paciente não desenvolve a doença. Por exemplo, um câncer em estágio avançado, tal como o desenvolvimento de metástases, pode ser retardado.
[0192] Por "reduzir" ou "inibir" significa a capacidade de causar uma diminuição geral, por exemplo, de 20% ou mais, de 50% ou mais, ou de 75%, 85%, 90%, 95% ou mais. Em certas modalidades, reduzir ou inibir pode referir-se à função efetora de um anticorpo que é mediado pela região Fc do anticorpo, tais funções efetoras especificamente incluindo citotoxicidade dependente de complemento (CDC), citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) e fagocitose celular dependente de anticorpos (ADCP).
[0193] Um "paciente" ou um "indivíduo" é um mamífero.
Mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, humanos e primatas não humanos, tais como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas modalidades, o paciente ou indivíduo é um ser humano.
[0194] Um "distúrbio" é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento, incluindo, mas não limitado a, distúrbios ou doenças crônicas e agudas, incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão.
[0195] Os termos “doença proliferativa celular” e “distúrbio proliferativo” referem-se a distúrbios que estão associadas a algum grau de proliferação celular anormal. Em uma modalidade, o distúrbio proliferativo celular é câncer. Em uma modalidade, o distúrbio proliferativo celular é um tumor.
[0196] Os termos “câncer” e “cancerígeno” referem-se à ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é normalmente distinguida por crescimento celular desregulado. Incluídos nesta definição estão os cânceres benignos e malignos. Por "câncer em estágio inicial" ou "tumor em estágio inicial" significa um câncer que não é invasivo ou metastático, ou é classificado como um câncer nos estágios 0, 1 ou 2. Exemplos de câncer incluem, entre outros, câncer de mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de Hodgkin não linfoma (NHL), linfoma de células B, leucemia de células B, mieloma múltiplo, câncer renal, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço,
melanoma, câncer de ovário, mesotelioma, glioblastoma, linfoma difuso de grandes células B do centro germinativo (GCB), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL), DLBCL do tipo de célula B ativado (ABC), linfoma folicular
(FL), linfoma de células do manto (MCL), leucemia mielóide aguda (LMA),
leucemia linfoide crônica (LLC), linfoma de zona marginal (MZL), leucemia linfocítica pequena (SLL), linfoma linfoplasmocítico (LL), Macroglobulinemia de
Waldenström (WM), linfoma do sistema nervoso central (CNSL), linfoma de
Burkitt (BL), leucemia prolinocítica de células B, linfoma esplênico da zona marginal, leucemia de células cabeludas, linfoma/leucemia esplênico(a),
linfoma esplênico difuso da polpa vermelha de linfócitos B pequenos, variante de leucemia de células cabeludas, doença das cadeias pesadas α, doença das cadeias pesadas γ, doença das cadeias pesadas μ, mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma solitário do osso, plasmocitoma extraósseo,
linfoma do tecido linfoide associado à mucosa (linfoma MALT), linfoma nodal da zona marginal, linfoma pediátrico da zona marginal nodal, linfoma folicular pediátrico, linfoma cutâneo primário do centro folicular, linfoma difuso de grandes células b rico em células t/histiócitos, DLBCL primário do sistema nervoso central, DLBCL cutâneo primário (tipo perna), DLBCL positivo para o vírus Epstein-Barr (EBV) de idosos, DLBCL associado a inflamação crônica,
granulomatose linfomatóide, linfoma mediastinal primário de grandes células B,
linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de grandes células B positivo para quinase anaplásico (ALK), linfoma plasmático, linfoma de grandes células B surgido na doença de Castleman multicêntrica associada a infecção pelo HHV-8, linfoma primário de efusão, Linfoma de grandes células B, não classificável, com características intermediárias entre linfoma difuso de grandes células B e linfoma de Burkitt ou linfoma de grandes células B, não classificável, com características intermediárias entre linfoma difuso de grandes células B e linfoma de Hodgkin clássico. Em algumas modalidades, o câncer é um câncer positivo para HER2 (por exemplo, um câncer de mama positivo para HER2 ou um câncer gástrico positivo para HER2).
[0197] O termo câncer "positivo para HER2" compreende células cancerígenas que têm níveis mais altos do que o normal de HER2. Exemplos de câncer positivo para HER2 incluem câncer de mama positivo para HER2 e câncer gástrico positivo para HER2. Opcionalmente, o câncer positivo para HER2 tem uma pontuação de imuno-histoquímica (IHC) de 2 ou 3 e/ou uma taxa de amplificação de hibridização in situ (ISH) ≥2,0.
[0198] O termo "tumor", conforme usado neste documento, refere-se a todo crescimento e proliferação de células neoplásicas, malignas ou benignas, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos. Os termos “câncer”, “cancerígeno”, “doença proliferativa celular”, “distúrbio proliferativo” e “tumor” não são mutuamente exclusivos, conforme referido no presente documento.
[0199] O termo "antígeno tumoral", conforme usado no presente documento, pode ser entendido como aqueles antígenos que são apresentados nas células tumorais. Esses antígenos podem ser apresentados na superfície celular com uma parte extracelular, que geralmente é combinada com uma parte transmembrana e citoplasmática da molécula. Às vezes, esses antígenos podem ser apresentados apenas por células tumorais e nunca pelas normais.
Os antígenos tumorais podem ser expressos exclusivamente em células tumorais ou podem representar uma mutação específica do tumor em comparação com células normais. Nesse caso, eles são chamados de antígenos específicos para tumores. Mais comuns são os antígenos tumorais apresentados por células tumorais e células normais, e são chamados antígenos associados a tumores. Estes antígenos associados a tumores podem ser superexpressos em comparação com células normais ou são acessíveis para ligação de anticorpos em células tumorais devido à estrutura menos compacta do tecido tumoral em comparação com o tecido normal.
[0200] Uma "quantidade eficaz" de um composto, por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção ou uma composição (por exemplo, composição farmacêutica) da mesma, é pelo menos a quantidade mínima necessária para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado, tal como uma melhoria ou prevenção mensurável de um distúrbio específico (por exemplo, um distúrbio proliferativo celular, por exemplo, câncer). Uma quantidade eficaz neste documento pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do paciente e a capacidade do anticorpo de provocar uma resposta desejada no paciente. Uma quantidade eficaz é também aquela em que quaisquer efeitos tóxicos ou prejudiciais do tratamento são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos. Para uso profilático, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados tais como eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade ou retardar o início da doença, incluindo sintomas bioquímicos, histológicos e/ou comportamentais da doença, suas complicações e fenótipos patológicos intermediários que apresentam durante o desenvolvimento da doença. Para uso terapêutico, os resultados benéficos ou desejados incluem resultados clínicos, tais como diminuir um ou mais sintomas resultantes da doença, aumentar a qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, diminuir a dose de outros medicamentos necessários para tratar a doença, aperfeiçoar o efeito da outro medicamento, tal como direcionamento, retardar a progressão da doença e/ou prolongar a sobrevida. No caso de câncer ou tumor, uma quantidade eficaz do fármaco pode ter o efeito de reduzir o número de células cancerígenas; reduzir o tamanho do tumor; inibir (isto é, desacelerar até certo ponto ou desejavelmente parar) a infiltração de células cancerígenas nos órgãos periféricos; inibir (isto é, desacelerar até certo ponto e desejavelmente parar) a metástase tumoral; inibir até certo ponto o crescimento tumoral; e/ou aliviar até certo ponto um ou mais dos sintomas associados ao distúrbio. Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações. Para os fins desta invenção, uma quantidade eficaz de fármaco, composto ou composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para realizar o tratamento profilático ou terapêutico, tanto diretamente ou indiretamente. Como é entendido no contexto clínico, uma quantidade eficaz de um fármaco, composto ou composição farmacêutica pode ou não ser alcançada em conjunto com outro fármaco, composto ou composição farmacêutica. Assim, uma "quantidade eficaz" pode ser considerada no contexto de administrar um ou mais agentes terapêuticos, e um único agente pode ser considerado administrado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável puder ser ou é alcançado.
[0201] O termo “antagonista de ligação ao eixo PD-1” é uma molécula que inibe a interação de um parceiro de ligação ao eixo PD-1 com qualquer um ou mais de seus parceiros de ligação, de modo a remover a disfunção das células T resultante da sinalização no eixo de sinalização PD-1, com um resultado sendo restaurado ou aperfeiçoado na função das células T.
Conforme usado no presente documento, um antagonista de ligação ao eixo PD-1 inclui um antagonista de ligação ao PD-1 e um antagonista de ligação ao PD-L1, bem como moléculas que interferem na interação entre PD-L1 e PD-1 (por exemplo, uma fusão PD-L2-Fc).
[0202] O termo “antagonistas de ligação ao PD-1” é uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, anula ou interfere na transdução de sinal que resulta da interação de PD-1 com um ou mais dos seus parceiros de ligação, tais como PD-L1 e/ou PD-L2. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD-1 é uma molécula que inibe a ligação de PD-1 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, o antagonista de ligação ao PD-1 inibe a ligação de PD-1 para PD-L1 e/ou PD-L2. Por exemplo, antagonistas de ligação ao PD-1 incluem anticorpos anti-PD-1 e seus fragmentos de ligação ao antígeno, imunoadesinas, proteínas de fusão, oligopeptídeos, antagonistas de pequenas moléculas, antagonistas de polinucleotídeos e outras moléculas que diminuem, bloqueiam, inibem, anulam ou interferem na transdução de sinal que resulta da interação de PD-1 com PD- L1 e/ou PD-L2. Em uma modalidade, um antagonista de ligação ao PD-1 reduz o sinal negativo mediado por ou através das proteínas da superfície celular expressas nos linfócitos T e outras células através de PD-1 ou PD-L1, de modo a tornar uma célula T disfuncional menos disfuncional. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao PD-1 é um anticorpo anti-PD-1. Em um outro aspecto específico, um antagonista de ligação ao PD-1 é o MDX-1106 (nivolumabe), descrito no presente documento. Em um outro aspecto específico, um antagonista de ligação ao PD-1 é o MK-3475 (pembrolizumabe), descrito no presente documento. Em um outro aspecto específico, um antagonista de ligação ao PD-1 é o CT-011 (pidilizumabe), descrito no presente documento. Em um outro aspecto específico, um antagonista de ligação ao PD- 1 é o MEDI-0680 (AMP-514). Em um outro aspecto específico, um antagonista de ligação ao PD-1 é o PDR001 (espartalizumabe). Em um outro aspecto específico, um antagonista de ligação ao PD-1 é o REGN2810 (cemiplimabe).
Em um outro aspecto específico, um antagonista de ligação ao PD-1 é o BGB-
108. Em um outro aspecto específico, um antagonista de ligação ao PD-1 é o AMP-224.
[0203] Como usado aqui, um "antagonista de ligação ao PD-L1" é uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, revoga ou interfere na transdução de sinal resultante da interação do PD-L1 com um ou mais de seus parceiros de ligação, tais como PD-1 e/ou B7-1. Em algumas modalidades, um antagonista de ligação ao PD-L1 é uma molécula que inibe a ligação de PD-L1 aos seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, o antagonista de ligação ao PD-L1 inibe a ligação da PD-L1 para PD-1 e/ou B7-1. Em algumas modalidades, os antagonistas de ligação ao PD-L1 incluem anticorpos anti-PD- L1 e seus fragmentos de ligação ao antígeno, imunoadesinas, proteínas de fusão, oligopeptídeos, antagonistas de pequenas moléculas, antagonistas de polinucleotídeos e outras moléculas que diminuem, bloqueiam, inibem, anulam ou interferem na transdução de sinal que resulta da interação de PD-L1 com um ou mais dos seus parceiros de ligação, tais como PD-1 e/ou B7-1. Em uma modalidade, um antagonista de ligação ao PD-L1 reduz o sinal negativo mediado por ou através das proteínas da superfície celular expressas nos linfócitos T e outras células através de PD-L1 ou PD-1, de modo a tornar uma célula T disfuncional menos disfuncional (por exemplo, aperfeiçoar as respostas efetoras ao reconhecimento de antígeno). Em algumas modalidades, um antagonista de ligação ao PD-L1 é um anticorpo anti-PD-L1. Em um aspecto específico, um anticorpo anti-PD-L1 é YW243.55.S70 descrito no presente documento. Em ainda um outro aspecto específico, um anticorpo anti- PD-L1 é MDX-1105 descrito no presente documento. Ainda em outro aspecto específico, um anticorpo anti-PD-L1 é o atezolizumabe (número do registro CAS: 1422185-06-5), também conhecido como MPDL3280A, descrito no presente documento. Em ainda um outro aspecto específico, um anticorpo anti- PD-L1 é MEDI4736 (druvalumab) descrito no presente documento. Em ainda um outro aspecto específico, um anticorpo anti-PD-L1 é MSB0010718C (avelumabe) descrito no presente documento.
[0204] Os termos "ligante de morte programada 1" e "PD-L1" referem-se no presente documento a um polipeptídeo de sequência nativa PD- L1, variantes de polipeptídeo (ou seja, variantes de polipeptídeo PD-L1) e fragmentos de um polipeptídeo de sequência nativa e variantes de polipeptídeo
(que são definidos adicionalmente aqui). O polipeptídeo PD-L1 descrito no presente documento pode ser aquele que é isolado de uma variedade de fontes, tais como de tipos de tecidos humanos ou de outra fonte, ou preparado por métodos recombinantes ou sintéticos.
[0205] Um "polipeptídeo PD-L1 de sequência nativa" compreende um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácidos que o polipeptídeo PD-L1 correspondente derivado da natureza.
[0206] Uma "variante de polipeptídeo PD-L1", ou variações dos mesmos, significa um polipeptídeo PD-L1, geralmente um polipeptídeo PD-L1 ativo, conforme definido neste documento, tendo pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos com qualquer uma das sequências de polipeptídeo da sequência nativa PD-L1 conforme divulgadas aqui. Tais variantes de polipeptídeo PD-L1 incluem, por exemplo, polipeptídeos PD-L1 em que um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados ou excluídos no terminal N ou C de uma sequência de aminoácidos nativa. Normalmente, uma variante de polipeptídeo PD-L1 terá pelo menos cerca de 80% de identidade de sequência de aminoácidos, alternativamente, pelo menos, cerca de 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácidos com uma sequência de polipeptídeo PD-L1 da sequência nativa, como divulgado neste documento. Normalmente, as variantes de polipeptídeo PD-L1 têm pelo menos cerca de 10 aminoácidos de comprimento, alternativamente, pelo menos, cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288 ou 289 aminoácidos de comprimento ou mais. Opcionalmente, as variantes de polipeptídeo PD-L1 não terão mais do que uma substituição conservativa de aminoácidos em comparação com uma sequência de polipeptídeo PD-L1 nativa, ou, em alternativa, não mais do que 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9 ou 10 substituições conservativas de aminoácidos em comparação com uma sequência de polipeptídeo PD-L1 nativa.
[0207] O termo "antagonista de ligação ao PD-L2" refere-se a uma molécula que diminui, bloqueia, inibe, revoga ou interfere na transdução de sinal resultante da interação do PD-L2 com um ou mais de seus parceiros de ligação, tal como PD-1. Em algumas modalidades, um antagonista de ligação ao PD-L2 é uma molécula que inibe a ligação de PD-L2 a um ou mais de seus parceiros de ligação. Em um aspecto específico, o antagonista de ligação ao PD-L2 inibe a ligação do PD-L2 ao PD-1. Em algumas modalidades, os antagonistas de ligação ao PD-L2 incluem anticorpos anti-PD-L2, seus fragmentos de ligação ao antígeno, imunoadesinas, proteínas de fusão, oligopeptídeos e outras moléculas que diminuem, bloqueiam, inibem, revogam ou interferem na transdução de sinal resultante da interação de PD-L2 com um ou mais de seus parceiros de ligação, tal como PD-1. Em uma modalidade, um antagonista de ligação ao PD-L2 reduz o sinal coestimulador negativo mediado por ou através das proteínas da superfície celular expressas na sinalização mediada por linfócitos T através de PD-L2, de modo a tornar uma célula T disfuncional menos disfuncional (por exemplo, aperfeiçoando respostas efetoras ao reconhecimento de antígeno). Em algumas modalidades, um antagonista de ligação ao PD-L2 é uma imunoadesina.
II.COMPOSIÇÕES
[0208] Em um aspecto, a invenção é baseada, em parte, em moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas (por exemplo, anticorpos biespecíficos). Em certas modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas têm um braço monovalente capaz de especificamente se ligar a um primeiro antígeno (por exemplo, um antígeno de célula T, por exemplo, CD3) e um braço bivalente capaz de se ligar a dois antígenos adicionais (por exemplo, antígenos tumorais, por exemplo, dois antígenos HER2). Por exemplo, o braço bivalente pode compreender duas frações de ligação ao antígeno, cada uma capaz de especificamente se ligar a um antígeno alvo (por exemplo, HER2) para aumentar a avidez da molécula de ligação ao antígeno biespecífica a uma célula que expressa altos níveis do antígeno alvo. As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção são úteis, por exemplo, para tratar ou retardar a progressão de um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer) ou um distúrbio autoimune, ou para aperfeiçoar a função imune em um paciente tendo tal distúrbio.
[0209] Os 1Fab-IgG TDBs da presente invenção seletivamente matam células tumorais que superexpressam o antígeno tumoral direcionado com alta potência, enquanto poupam células que expressam quantidades baixas do antígeno tumoral alvo, por exemplo, células de tecidos humanos normais ou saudáveis. A seletividade é baseada na avidez de dois braços Fab de antígeno antitumoral de baixa afinidade para alta densidade alvo em células que superexpressam o antígeno tumoral. A maior seletividade para as células que superexpressam antígenos tumorais mitiga os efeitos adversos, no alvo, de TDB. Por exemplo, usando HER2 como antígeno tumoral direcionado, o anti- HER2-IgG TDB com ligação monovalente de alta afinidade à HER2 se liga a células que superexpressam HER2 e células que expressam baixo nível de HER2. O índice terapêutico deste TDB baseia-se na maior atividade nas células que superexpressam HER2 devido à alta densidade de HER2. Em doses altas de TDB, a IgG1 HER2-TDB de alta afinidade pode afetar células que expressam baixo nível de HER2 e, portanto, tem risco de autoimunidade fora do tumor, no alvo, em tecidos normais (Figura 35A). A engenharia do braço de ligação à HER2 para ter menor afinidade resulta em menor atividade de ligação e de TDB nas células que superexpressam HER2 e nas células que expressam baixo nível de HER2, mas não aprimora a seletividade (Figura 35B).
A ligação bivalente à HER2 com afinidade apropriada (K D monovalente de ~20 a 50 nM) resulta em alta ligação a células que expressam HER2 devido à avidez do anti-HER2 1Fab-IgG TDB. O efeito da avidez é dependente da alta densidade de HER2 e, portanto, o 1Fab-IgG TDB não se liga a células que expressam baixos níveis de HER2, por exemplo, células de tecidos humanos normais ou saudáveis. Como a ligação celular se correlaciona com a capacidade dos TDBs de recrutar a atividade das células T, o anti-HER2 1Fab- IgG TDB seletivamente mata somente células que superexpressam HER2 e reduz o risco de induzir autoimunidade fora do tumor, no alvo, em tecidos normais (Figura 35C).
MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICAS EXEMPLARES
[0210] Em um aspecto, a invenção fornece moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas isoladas (por exemplo, anticorpos biespecíficos) tendo um braço monovalente e um braço bivalente. Por exemplo, em um aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica tendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que (a) o braço monovalente compreende uma primeira fração de ligação ao antígeno e (b) o braço bivalente compreende uma segunda fração de ligação ao antígeno e uma terceira fração de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o terminal C da primeira fração de ligação ao antígeno é fundido ao terminal N de uma primeira subunidade Fc, o terminal C da terceira fração de ligação ao antígeno é fundido ao terminal N do segundo antígeno fração de ligação e o terminal C da segunda fração de ligação ao antígeno é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc. Em algumas modalidades, a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc. Em algumas modalidades, a primeira fração de ligação ao antígeno é capaz de especificamente se ligar a um primeiro antígeno de célula alvo, e a segunda fração de ligação ao antígeno e a terceira fração de ligação ao antígeno são capazes de especificamente se ligarem a um segundo antígeno de célula alvo (por exemplo, no mesmo epítopo ou em epítopos diferentes no segundo antígeno de célula alvo).
[0211] A primeira fração de ligação ao antígeno pode ser uma molécula Fab (FabA) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHA) e uma região variável de cadeia leve (VLA); a segunda fração de ligação ao antígeno pode ser uma molécula Fab (Fab B1) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHB1) e uma região variável de cadeia leve (VLB1); e/ou a terceira fração de ligação ao antígeno pode ser uma molécula Fab (FabB2) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH B2) e uma região variável de cadeia leve (VLB2). Assim, em alguns casos, a primeira fração de ligação ao antígeno pode ser uma FabA compreendendo uma região VHA e uma região VLA, a segunda fração de ligação ao antígeno pode ser uma FabB1 compreendendo uma região VHB1 e uma região VLB1, e a terceira fração de ligação ao antígeno pode ser uma FabB2 compreendendo uma região VHB2 e uma região VLB2. A VHB1 e a VHB2 podem compartilhar pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência). Adicional ou alternativamente, a VLB1 e a VLB2 podem compartilhar pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência).
[0212] Uma molécula 1Fab-IgG refere-se a uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica tendo uma primeira fração de ligação ao antígeno, uma segunda fração de ligação ao antígeno e uma terceira fração de ligação ao antígeno, em que a primeira fração de ligação ao antígeno é uma FabA compreendendo uma região VHA e uma região VLA, a segunda fração de ligação ao antígeno é uma FabB1 compreendendo uma região VHB1 e uma região VLB1 e a terceira fração de ligação ao antígeno é uma Fab B2 compreendendo uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a VHB1 e a VHB2 compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência) e a VL B1 e a VLB2 compartilham pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência). As moléculas 1Fab-IgG têm um braço monovalente compreendendo a primeira fração de ligação ao antígeno que se liga a um primeiro antígeno alvo e um braço bivalente compreendendo as segunda e terceira frações de ligação ao antígeno, em que cada uma das segunda e terceira frações de ligação ao antígeno especificamente se ligam a um segundo antígeno de célula alvo. Em algumas modalidades, uma molécula 1Fab-IgG é uma molécula biespecífica 1Fab-IgG dependente de célula T (1Fab-IgG TDB), em que o braço monovalente especificamente se liga a um antígeno na superfície de uma célula T e cada fração de ligação ao antígeno do braço bivalente especificamente se liga a um antígeno na superfície de uma segunda célula alvo (por exemplo, uma célula tumoral). Tal como acontece com um TDB com um formato IgG bivalente padrão (IgG TDB), as 1Fab-IgG TDBs recrutam células T citolíticas para matar as células que expressam o antígeno direcionado.
[0213] Por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB tem um braço monovalente que especificamente se liga a CD3 (por exemplo, uma molécula CD3 na superfície de uma célula T) e um braço bivalente que tem duas frações de ligação ao antígeno que cada uma especificamente se liga à HER2 (por exemplo, uma molécula HER2 na superfície de uma célula tumoral).
As duas frações de ligação ao antígeno no braço bivalente podem se ligar ao mesmo epítopo, ou cada fração de ligação ao antígeno no braço bivalente pode se ligar a um epítopo diferente no mesmo antígeno. Em uma modalidade, o braço bivalente se liga ao mesmo epítopo conforme 4D5. Em uma modalidade, o braço bivalente se liga ao domínio IV de HER2. Em uma modalidade, a fração de ligação ao antígeno no braço monovalente, específica para CD3, é um 40G5c Fab, e cada uma das duas frações de ligação ao antígeno no braço bivalente, específicas para HER2, é uma variante de um 4D5 Fab. Modalidades particulares são exemplificadas no presente documento.
[0214] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem fornecer sensibilidade aumentada às células que preferencialmente expressam uma alta densidade de antígeno (por exemplo, antígeno tumoral), que, em muitos casos, reduz os danos a tecidos saudáveis (por exemplo, ativando as células T para envolver células tumorais em vez de células saudáveis que expressam baixos níveis de antígeno tumoral). Por conseguinte, em algumas modalidades, um antígeno tumoral é expresso em (a) uma célula tumoral em um paciente e (b) pelo menos um tipo de célula não tumoral no paciente (por exemplo, em uma densidade mais baixa do que sua expressão em células tumorais). Em algumas modalidades, a proporção do número de cópias de antígeno tumoral nas células não tumorais para as células tumorais é de 1:2 a 1:1.000.000 (por exemplo, de 1:3 a 1:500.000, de 1:4 a 1:100.000, de 1:5 a 1:50.000, de 1:6 a 1:40.000, de 1:7 a 1: 20.000, de 1:8 a 1:10.000, de 1:9 a 1:5.000, de 1:10 a 1:1.000, de 1:20 a 1:500, de 1:50 a 1:400, ou de 1:100 a 1:200, por exemplo, de 1:2 a 1:10, de 1:10 a 1:20, de 1:20 a 1:50, de 1:50 a 1:100, de 1:100 a 1:200, de 1:200 a 1:300, de 1:300 a 1:400, de 1:400 a 1:500, de 1:500 a 1:600, de 1:600 a 1:700, de 1:700 a 1:800, de 1:800 a 1:900, de 1:900 a 1:1.000, de 1:1.000 a 1:5.000, de 1:5.000 a 1:10.000, de 1:10.000 a 1:50.000, de 1:50.000 a 1:100.000, de 1:100.000 a 1:500.000, ou de 1:500.000 a 1:1.000.000, por exemplo, cerca de 1:2, cerca de 1:3, cerca de 1:4, cerca de 1:5, cerca de 1:6, cerca de 1:7, cerca de 1:8, cerca de 1:9, cerca de 1:10, cerca de 1:15, cerca de 1:20, cerca de 1:25, cerca de 1:30, cerca de 1:35, cerca de 1:40, cerca de 1:50, cerca de 1:60, cerca de 1:70, cerca de 1:80, cerca de 1:90, cerca de 1:100, cerca de 1:125, cerca de 1:150, cerca de 1:175, cerca de 1:200, cerca de 1:300, cerca de 1:400, cerca de 1:500, cerca de
1:1.000, cerca de 1:10.000, cerca de 1:100.000, ou cerca de 1:1.000.000).
[0215] Em algumas modalidades, o número de cópias de antígeno tumoral em uma célula não tumoral é de 101 a 106 (por exemplo, de 101 a 106, de 101 a 105, de 101 a 104, de 101 a 103, de 101 a 102, de 102 a 106, de 102 a 105, de 102 a 104, de 102 a 103, de 103 a 106, de 103 a 105, de 103 a 104, de 104 a 106, de 104 a 105, ou de 105 a 106, por exemplo, cerca de 101, 102, 103, 104, 105 ou 106). Em algumas modalidades, o número de cópias de antígeno tumoral em uma célula tumoral é de 10 2 a 107 (por exemplo, de 102 a 107, de 102 a 106, de 102 a 105, de 102 a 104, de 102 a 103, de 103 a 107, de 103 a 106, de 103 a 105, de 103 a 104, de 104 a 107, de 104 a 106, de 104 a 105, de 105 a 107, de 105 a 106, ou de 106 a 107, por exemplo, cerca de 102, 103, 104, 105, 106 ou 107).
[0216] Em algumas modalidades, o número de cópias de antígeno tumoral é de 101 a 106 em uma célula não tumoral e de 102 a 108 em uma célula tumoral (por exemplo, de 102 a 105 em uma célula não tumoral e de 103 a 107 em uma célula tumoral, de 102 a 105 em uma célula não tumoral e de 104 a 107 em uma célula tumoral, de 103 a 105 em uma célula não tumoral e de 105 a 107 em uma célula tumoral, de 103 a 104 em uma célula não tumoral e de 105 a 106 em uma célula tumoral ou de 104 a 105 em uma célula não tumoral e de 106 a 107 em uma célula tumoral).
[0217] Em algumas modalidades, o número de cópias de antígeno tumoral (por exemplo, número médio de cópias de antígeno tumoral, por exemplo, número de cópias de HER2, por exemplo, número médio de cópias de HER2) é de 101 a 2,0 × 105 em uma célula não tumoral e pelo menos 2,0 × 105 em uma célula tumoral.
[0218] As células tumorais ligadas por uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção podem expressar HER2 em um número de cópias (por exemplo, um número médio de cópias) de pelo menos 200.000 por célula (por exemplo, pelo menos 250.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 300.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 400.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 500.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos
600.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 700.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 750.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 800.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 900.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 1.000.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 1.200.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 1.500.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 2.000.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 2.500.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 3.000.000 cópias de HER2 por célula ou mais, por exemplo, de 200.000 a 3.000.000 cópias de HER2 por célula, de
250.000 a 2.500.000 cópias de HER2 por célula, de 300.000 a 2.000.000 cópias de HER2 por célula, de 400.000 a 1.500.000 cópias de HER2 por célula ou de 500.000 a 1.000.000 cópias de HER2 por célula, por exemplo, de
200.000 a 1.000.000 cópias de HER2 por célula (por exemplo, de 200.000 a
250.000 cópias de HER2 por célula, de 250.000 a 300.000 cópias de HER2 por célula, de 300.000 a 400.000 cópias de HER2 por célula, de 400.000 a 500.000 cópias de HER2 por célula, de 500.000 a 750.000 cópias de HER2 por célula ou de 750.000 a 1.000.000 cópias de HER2 por célula) ou de 1.000.000 a
3.000.000 cópias de HER2 por célula (por exemplo, de 1.000.000 a 1.500.000 cópias de HER2 por célula, de 1.500.000 a 2.000.000 cópias de HER2 por célula, de 2.000.000 a 2.500.000 cópias de HER2 por célula ou de 2.500.000 a
3.000.000 cópias de HER2 por célula). Assim, as células tumorais positivas para HER2 tendo qualquer uma das características de expressão de HER2 acima mencionadas podem ser preferencialmente mortas (por exemplo, seletivamente mortas) por células T após a ligação de uma molécula de ligação ao antígeno da presente invenção, em relação a células não tumorais que têm pouco ou nenhuma expressão de HER2 (por exemplo, menos de 200.000 cópias de HER2 por célula, por exemplo, de 0 a 200.000 cópias de HER2 por célula, de 0 a 150.000 cópias de HER2 por célula, de 0 a 100.000 cópias de HER2 por célula, de 0 a 50.000 cópias de HER2 por célula, de 0 a 20.000 cópias de HER2 por célula, de 0 a 10.000 cópias de HER2 por célula, de 0 a
5.000 cópias de HER2 por célula ou de 0 a 1.000 cópias de HER2 por célula).
[0219] O número de cópias de antígeno tumoral (por exemplo, número médio de cópias de antígeno tumoral, por exemplo, número de cópias de HER2, por exemplo, número médio de cópias de HER2) pode ser quantificado usando qualquer meio adequado conhecido na técnica ou descrito no presente documento. Por exemplo, o número de cópias de HER2 pode ser quantificado usando quantificação de fluorescência por citometria de fluxo (por exemplo, usando esferas de Moléculas de Fluorocromo Solúvel Equivalente (MESF)).
[0220] Em algumas modalidades, a afinidade de ligação (K D) monovalente da segunda fração de ligação ao antígeno e/ou da terceira fração de ligação ao antígeno é de 10 nM a 100 nM (por exemplo, de 20 nM a 90 nM, de 30 nM a 80 nM, de 40 nM a 60 nM, por exemplo, de 25 nM a 55 nM). Em uma modalidade, a afinidade de ligação (KD) monovalente da segunda fração de ligação ao antígeno e/ou da terceira fração de ligação ao antígeno é de 20 nM a 50 nM. Em uma modalidade, a afinidade de ligação (KD) monovalente da segunda fração de ligação ao antígeno e da terceira fração de ligação ao antígeno é de 20 nM a 50 nM.
[0221] Em algumas modalidades, a taxa de dissociação monovalente da segunda fração de ligação ao antígeno e/ou da terceira fração de ligação ao antígeno é de 10-3/segundo a 10-1/segundo (por exemplo, de 10-2/segundo a 30-2/segundo).
[0222] Em algumas modalidades, um primeiro antígeno alvo é um antígeno de célula T ativador, tal como CD3. Várias frações de ligação ao antígeno de células T são conhecidas na técnica e adequadas para uso como parte da presente invenção. Por exemplo, em certas modalidades da presente invenção, uma primeira fração de ligação ao antígeno adequada é o clone de anticorpo 40G5c, ou um fragmento e/ou variante do mesmo, por exemplo, conforme descrito na publicação dos EUA de nº 2015/0166661, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Em modalidades particulares, a primeira fração de ligação ao antígeno é um anti- CD3 Fab (por exemplo, 40G5c) compreendendo uma HVR-H1 da SEQ ID NO: 1, uma HVR-H2 da SEQ ID NO: 2, uma HVR-H3 da SEQ ID NO: 3, uma HVR- L1 da SEQ ID NO: 4, uma HVR-L2 da SEQ ID NO: 5 e uma HVR-L3 da SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a primeira fração de ligação ao antígeno é um anti-CD3 Fab (por exemplo, 40G5c) compreendendo um VH da SEQ ID NO: 7 e uma VL da SEQ ID NO: 8. As sequências de aminoácidos de 40G5c também são fornecidas na Tabela 1.
TABELA 1
SEQ ID NOS CORRESPONDENTES ÀS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS DA REGIÃO HIPERVARIÁVEL (HVR) E DA REGIÃO VARIÁVEL PESADA (VH) E REGIÃO VARIÁVEL LEVE (VL) PARA DE CLONES DE ANTICORPOS EXEMPLARES.
HVR V H1 H2 H3 L1 L2 L3 VH VL 40G5c 1 2 3 4 5 6 7 8 Consenso 4D5 11 12 13 14 15 16 17 18 4D5 do tipo selvagem (trastuzumabe) 11 19 20 21 22 23 24 25 4D5-H91A 11 19 20 21 22 26 24 27 4D5-Y55E.Y102V 11 19 28 21 29 23 30 31 4D5-D98A.F100A.Y102V 11 19 32 21 22 23 33 25 4D5-D98T.F100A.Y102V 11 19 34 21 22 23 35 25 4D5-N30S.N54E.D98T 11 36 37 38 22 23 39 40 4D5-N30S.H91A.N54E.D98T 11 36 37 38 22 26 41 42 4D5-H91A.N54E.D98T 11 36 37 21 22 26 41 27 4D5-N30S.Y55E.N54E.D98T.Y102V 11 36 43 38 29 23 44 45 4D5-N30S 11 19 20 38 22 23 24 40 4D5-N54E.D98T 11 36 37 21 22 23 41 25 4D5-N30S.N54E.D98T.F100A.Y102V 11 36 34 38 22 23 46 40
HVR V H1 H2 H3 L1 L2 L3 VH VL 4D5-N30S.N54E.D98A.F100A.Y102V 11 36 32 38 22 23 47 40 4D5-Y55E.H91A.N54E.D98T 11 36 37 21 29 26 41 48 4D5-Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V 11 36 43 21 29 26 44 48 4D5-N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T 11 36 37 38 29 26 41 49 4D5- 11 36 43 38 29 26 44 49 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V 4D5-Y102V 11 19 28 21 22 23 30 25 4D5-N30A.H91A 11 19 20 53 22 26 24 54 4D5-Y55E.H91A 11 19 20 21 29 26 24 48 4D5-D98A.F100A.Y102V 11 19 32 21 22 23 33 25 4D5-Y55E.D98A.F100A.Y102V 11 19 32 21 29 23 33 31
[0223] Em algumas modalidades, a primeira fração de ligação ao antígeno se liga a um polipeptídeo CD3 humano ou a um polipeptídeo CD3 de macaco cynomolgus (cyno). Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD3 humano ou o polipeptídeo CD3 de cyno é um polipeptídeo CD3ε humano ou um polipeptídeo CD3ε de cyno, respectivamente. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD3 humano ou o polipeptídeo CD3 de cyno é um polipeptídeo CD3γ humano ou um polipeptídeo CD3γ de cyno, respectivamente. Frações adicionais de ligação ao antígeno (por exemplo, moléculas Fab) que se ligam a CD3 são conhecidas na técnica e descritas, por exemplo, na publicação dos EUA de nº 2015/0166661, e podem ser adaptadas para uso como parte da presente invenção.
[0224] Em algumas modalidades, a KD monovalente da primeira fração de ligação ao antígeno se liga ao polipeptídeo CD3ε humano com uma KD de 250 nM ou menos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 se liga ao polipeptídeo CD3ε humano com uma K D de 100 nM ou menos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 se liga ao polipeptídeo CD3ε humano com uma KD de 15 nM ou menos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 se liga ao polipeptídeo CD3ε humano com uma KD de 10 nM ou menos. Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CD3 se liga ao polipeptídeo CD3ε humano com uma KD de 5 nM ou menos. Em algumas modalidades, a KD monovalente da primeira fração de ligação ao antígeno é de 10 nM a 100 nM (por exemplo, de 20 nM a 90 nM, de 20 nM a 80 nM, de 30 nM a 70 nM ou de 40 nM a 60 nM).
[0225] Em algumas modalidades, o segundo antígeno de célula alvo é um antígeno tumoral.
[0226] O antígeno tumoral pode ser HER2. Uma segunda e/ou terceira fração de ligação ao antígeno adequada que se liga à HER2 é o anticorpo 4D5 ou um fragmento e/ou variante do mesmo. As sequências de aminoácidos de 4D5, e variantes de substituição das mesmas, são mostradas na Tabela 1 e descritas, por exemplo, na Publicação dos EUA de nº 2015/0166661, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Em uma modalidade, a segunda e/ou terceira fração de ligação ao antígeno se ligam ao mesmo epítopo conforme o anticorpo 4D5 (sua versão humanizada conhecida como trastuzumabe (HERCEPTIN®; Genentech, Inc., sul de São Francisco, CA), Molina, et al., Cancer Research 2001, 61 (12): 4744-4749). Em uma modalidade, as segunda e terceira frações de ligação ao antígeno se ligam ao mesmo epítopo conforme o anticorpo 4D5.
[0227] Em uma modalidade, a segunda e/ou terceira fração de ligação ao antígeno se ligam ao mesmo epítopo conforme o anticorpo 2C4 (sua versão humanizada conhecida como pertuzumabe (PERJETA®; Genentech, Inc., sul de São Francisco, CA), REanklin et al., Cancer Cell 2004, 5: 317-328).
Em uma modalidade, as segunda e terceira frações de ligação ao antígeno se ligam ao mesmo epítopo conforme o anticorpo 2C4.
[0228] Em uma modalidade, as segunda e terceira frações de ligação ao antígeno se ligam ao mesmo epítopo conforme o anticorpo 7C2 (Patente dos EUA de nº 9.518.118). Em uma modalidade, as segunda e terceira frações de ligação ao antígeno se ligam ao mesmo epítopo conforme o anticorpo 7C2.
[0229] A Figura 36 fornece a estrutura cristalina da HER2 ECD e destaca as regiões às quais os diferentes anticorpos HER2 se ligam. 4D5 se liga a um epítopo no domínio IV de HER2 que é a região da proteína mais próxima da membrana celular. 2C4 se liga a um epítopo no domínio II de HER2 que é de 50 Angstroms a partir da região à qual hu4D5 se liga. 7C2 se liga a um epítopo no domínio I de HER2 que é 100 Angstroms a partir da região HER2 ligada por hu4D5.
[0230] Em uma modalidade, a segunda e/ou terceira fração de ligação ao antígeno se ligam ao domínio IV de HER2. Em uma modalidade, a segunda e a terceira fração de ligação ao antígeno se ligam ao domínio IV de HER2. Em uma modalidade, a segunda e/ou terceira fração de ligação ao antígeno se ligam ao domínio II de HER2. Em uma modalidade, a segunda e a terceira fração de ligação ao antígeno se ligam ao domínio II de HER2.
[0231] Em uma modalidade, a segunda e/ou terceira fração de ligação ao antígeno se ligam ao domínio I de HER2. Em uma modalidade, a segunda e a terceira fração de ligação ao antígeno se ligam ao domínio I de HER2.
[0232] Em uma modalidade, a segunda fração de ligação se liga ao domínio IV de HER2 e a terceira fração de ligação ao antígeno se liga ao domínio I de HER2.
[0233] Em uma modalidade, a segunda fração de ligação se liga ao domínio IV de HER2 e a terceira fração de ligação ao antígeno se liga ao domínio II de HER2.
[0234] Em uma modalidade, a segunda fração de ligação se liga ao domínio II de HER2 e a terceira fração de ligação ao antígeno se liga ao domínio I de HER2.
[0235] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, apresenta uma região VHA que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos
95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, pelo menos 97%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 ou 100% de identidade de sequência com a
SEQ ID NO: 7). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7. Em algumas modalidades, a região VLA compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a região VLA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8 (por exemplo, pelo menos
96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8 ou 100% de identidade de sequência com a
SEQ ID NO: 8). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL A compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3 (por exemplo, um anti-
CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB tendo um domínio de ligação a 40G5c CD3).
[0236] Em algumas modalidades, a VHA compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; e a V LA compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7); e a região VLA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8). Em algumas modalidades, a região VHA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7; e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3 (por exemplo, um anti-CD3/HER2
1Fab-IgG TDB, por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB tendo um domínio de ligação a 40G5c CD3).
[0237] Em algumas modalidades, a região VHB1 e/ou a região VHB2 compreendem uma substituição de aminoácidos em um, dois, três ou todos os quatro resíduos de N54, D98, F100 e/ou Y102, de acordo com o sistema de numeração Kabat. Por exemplo, a região VHB1 e/ou a região VHB2 podem apresentar uma substituição de aminoácidos em um, dois, três, quatro ou todos os cinco dos seguintes resíduos: N54E, D98A, D98T, F100A e/ou Y102V, de acordo com o sistema de numeração Kabat.
[0238] Em algumas modalidades, a região VLB1 e/ou a região VLB2 compreende uma substituição de aminoácidos em um, dois ou todos os três resíduos de N30, Y55 e/ou H91, de acordo com o sistema de numeração Kabat. Por exemplo, a região VLB1 e/ou a região VLB2 podem apresentar uma substituição de aminoácidos em um, dois ou todos os três dos seguintes resíduos: N30S, Y55E e/ou H91A.
[0239] Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VHB1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, ou (c) HVR- L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.
[0240] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; e a VLB1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.
[0241] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13.
Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15, ou (c) HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.
[0242] Em algumas modalidades, a VHB2 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13; e a VL B2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 16. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17); e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ
ID NO: 18, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 17; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.
[0243] Em algumas modalidades, a região VLB1 e/ou a região VLB2 compreendem uma substituição de aminoácidos em H91. Por exemplo, em algumas modalidades, o resíduo H91 é substituído por um aminoácido tendo uma cadeia lateral não polar. Em algumas modalidades, a região VL B1 e/ou a região VLB2 compreendem a substituição de aminoácidos de H91A. Em algumas modalidades, a região VLB1 e/ou a região VLB2 compreendem uma substituição de aminoácidos em Y55. Por exemplo, em algumas modalidades, o resíduo Y55 é substituído por um aminoácido tendo uma cadeia lateral ácida.
Em algumas modalidades, a região VLB1 e/ou a região VLB2 compreendem a substituição de aminoácidos de Y55E. Em algumas modalidades, a região VH B1 e/ou a região VHB2 compreendem uma substituição de aminoácidos em F100 e/ou Y102. Por exemplo, em algumas modalidades, o resíduo F100 e/ou o resíduo Y102 é substituído por um aminoácido tendo uma cadeia lateral não polar. Em algumas modalidades, a região VHB1 e/ou a região VHB2 compreendem a substituição de aminoácidos de F100A e/ou Y102V.
[0244] Em algumas modalidades das frações de ligação ao antígeno biespecíficas, a região VLB1 e/ou a região VLB2 compreendem um ou mais resíduos corrigidos de deficiência, por exemplo, um ou mais resíduos corrigidos de deficiência compreendendo a substituição de aminoácidos de N30S. Adicionalmente ou alternativamente, a região VHB1 e/ou a região VHB2 podem apresentar um ou mais resíduos corrigidos de deficiência, por exemplo, um ou mais resíduos corrigidos de deficiência compreendendo uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em N54E, D98A, e D98T.
[0245] A molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode apresentar uma mutação no resíduo H91 de cadeia leve da segunda e/ou terceira fração de ligação ao antígeno (por exemplo, H91A). Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VHB1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VH B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.
[0246] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; e a VL B1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 24; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 27.
[0247] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.
[0248] Em alguns casos, a VHB2 compreende as seguintes
HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; e a VLB2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24); e a região VL B2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 H91A-1Fab- IgG TDB).
[0249] Em outros casos, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode apresentar mutações nos resíduos D98, F100 e Y102 de cadeia pesada da segunda e/ou terceira fração de ligação ao antígeno (por exemplo, D98A, F100A e Y102V). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VH B1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-
H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 ou (c) uma
HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 33 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ
ID NO: 33, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33,
pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 33. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 ou (c) uma
HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 25 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ
ID NO: 25, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25,
pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 25.
[0250] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e a VL B1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.
[0251] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.
[0252] Em algumas modalidades, a VHB2 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e a VLB2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33); e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 33; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 D98A.F100A.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0253] Em outras modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode apresentar mutações nos resíduos Y55 e H91 de cadeia leve e nos resíduos N54 e D98 de cadeia pesada da segunda e/ou terceira fração de ligação ao antígeno (por exemplo, Y55E, H91A, N54E e D98T). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VHB1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VH B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
[0254] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e a VL B1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
[0255] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
[0256] Em algumas modalidades, a VHB2 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e s VLB2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41); e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 41; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB).
[0257] Em outras modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode apresentar mutações nos resíduos Y55 e H91 de cadeia leve e nos resíduos N54, D98 e Y102 de cadeia pesada da segunda e/ou terceira fração de ligação ao antígeno (por exemplo, Y55E, H91A, N54E, D98T e Y102). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VHB1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VH B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
[0258] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; e s VLB1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
[0259] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ
ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
[0260] Em algumas modalidades, a VHB2 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; e a VL B2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos
95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44); e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 44; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0261] Em outras modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode apresentar mutações nos resíduos N30, Y55 e H91 de cadeia leve e nos resíduos N54 e D98 de cadeia pesada da segunda e/ou terceira fração de ligação ao antígeno (por exemplo, N30S, Y55E, H91A, N54E e D98T). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VHB1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos
95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VH B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
[0262] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e a VL B1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
[0263] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
[0264] Em algumas modalidades, a VHB2 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e s VLB2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41); e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 41; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T-1Fab-IgG TDB).
[0265] Em outras modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode apresentar mutações nos resíduos N30, Y55 e H91 de cadeia leve e nos resíduos N54, D98 e Y102 de cadeia pesada da segunda e/ou terceira fração de ligação ao antígeno (por exemplo, N30S, Y55E, H91A, N54E, D98T e Y102V). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica apresenta uma região VHB1 que compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44,
pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
[0266] Em algumas modalidades, a VHB1 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; e s VLB1 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos
95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44); e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44; e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
[0267] Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Por exemplo, em algumas modalidades, a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
[0268] Em algumas modalidades, a VHB2 compreende as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; e a VL B2 compreende as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44); e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49). Em algumas modalidades, a região VHB2 compreende a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 44; e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 (por exemplo, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB).
[0269] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 30 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
31.
[0270] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 35 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
25.
[0271] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 39 e a VLB1 e/ou VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
40.
[0272] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 41 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
42.
[0273] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma
HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 41 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
27.
[0274] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 44 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
45.
[0275] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 24 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
40.
[0276] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 41 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
25.
[0277] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 34; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 46 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
40.
[0278] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 47 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
40.
[0279] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 30 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
25.
[0280] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 53, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 24 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
54.
[0281] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma
HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 24 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
48.
[0282] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 33 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
25.
[0283] Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19 e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR- L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23. Em algumas modalidades, a VHB1 e/ou a VHB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO: 33 e a VLB1 e/ou a VLB2 compreendem uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência) com a SEQ ID NO:
31.
[0284] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma Fab A, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um FabB1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do
FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o
FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR-
H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 12, (iii) uma
HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 13, (iv)
uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 14,
(v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
15 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 16; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade
Fc para formar um domínio Fc.
Em algumas modalidades, (a) a FabA compreende uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região
VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 e a região
VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 18; e (c) a Fab B2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 17 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 18. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VH A compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 e a região VL B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18; e (c) a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 17 e a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 18.
[0285] Em outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma Fab A, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um FabB1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc. Em algumas modalidades, (a) a Fab A compreende uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24, e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27; e (c) a Fab B2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VHA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27; e (c) a região VH B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.
[0286] Em ainda outro aspecto, a invenção apresenta uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma FabA, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um FabB1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do
FabB1 e o terminal C do FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs:
(i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
11, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 19, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 32, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc.
Em algumas modalidades, (a) a FabA compreende uma região VHA e uma região
VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região
VLA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 25; e (c) a FabB2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos
95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 e a região VL B2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VHA compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; e (c) a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.
[0287] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma Fab A, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um Fab B1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc. Em algumas modalidades, (a) a FabA compreende uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48; e (c) a Fab B2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VH A compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a região VL B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48; e (c) a região VH B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
[0288] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma Fab A, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ
ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um Fab B1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do
FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o
FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR-
H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, (iii) uma
HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43, (iv)
uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21,
(v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
29 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 26; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade
Fc para formar um domínio Fc.
Em algumas modalidades, (a) a Fab A compreende uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região
VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a região
VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48; e (c) a Fab B2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VH A compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região VL B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48; e (c) a região VH B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3/HER2 (por exemplo, um anti- CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB tendo um domínio de ligação a 40G5c CD3 e dois domínios de ligação a 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V HER2).
[0289] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma FabA, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a Fab A compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um FabB1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) umA HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:
11, (ii) umA HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID
NO: 36, (iii) umA HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 37, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc.
Em algumas modalidades, (a) a FabA compreende uma região VHA e uma região
VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região
VLA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 49; e (c) a FabB2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos
95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e a região VL B2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VHA compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 41 e a região VLB1 compreende a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 49; e (c) a região VHB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a região VLB2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3/HER2 (por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB tendo um domínio de ligação a 40G5c CD3 e dois domínios de ligação a 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T HER2).
[0290] Em outro aspecto, a invenção apresenta uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, em que: (a) o braço monovalente compreende uma Fab A, em que o terminal C da FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc, e em que a FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreende um Fab B1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR- H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29 e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26; e (c) a primeira subunidade Fc está associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc. Em algumas modalidades, (a) a Fab A compreende uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreende uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49; e (c) a Fab B2 compreende uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, (a) a região VHA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região VL B1 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49; e (c) a região VH B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região VL B2 compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-CD3/HER2 (por exemplo, um anti- CD3/HER2 1Fab-IgG TDB, por exemplo, um anti-CD3/HER2 1Fab-IgG TDB tendo um domínio de ligação a 40G5c CD3 e dois domínios de ligação a 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V HER2).
LIGANTES PEPTÍDICOS QUE FUNDEM AS SEGUNDA E TERCEIRA FRAÇÕES DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
[0291] Em algumas modalidades, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção apresenta uma estrutura em que o terminal C da terceira fração de ligação ao antígeno é fundido ao terminal N da segunda fração de ligação ao antígeno através de um ligante peptídico. O ligante peptídico pode ter 5 a 20 aminoácidos de comprimento (por exemplo, 5 a 10, 10 a 15 ou 15 a 20, por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos de comprimento). Em algumas modalidades, o ligante peptídico é a sequência de aminoácidos natural da região da dobradiça variável de cadeia pesada (por exemplo, DKTHT; SEQ ID NO: 50). Alternativamente, em algumas modalidades, o ligante peptídico inclui o ligante G 4SG2 (SEQ ID NO: 51). Em algumas modalidades, o ligante peptídico compreende o ligante G4SG2 e a região da dobradiça (por exemplo, SEQ ID NO: 52).
[0292] As sequências de aminoácidos de polipeptídeos de cadeia pesada exemplares compreendendo as segunda e terceira frações de ligação ao antígeno, com e sem um ligante G4SG2, são fornecidas na Tabela 2.
TABELA 2
SEQ ID NOS CORRESPONDENTES AOS POLIPEPTÍDEOS QUE COMPREENDEM O DOMÍNIO FC, A SEGUNDA REGIÃO DE CADEIA PESADA DA FRAÇÃO DE LIGAÇÃO AO
ANTÍGENO E A TERCEIRA REGIÃO DE CADEIA PESADA DA FRAÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DAS MOLÉCULAS EXEMPLARES 1FAB-IGG TDB, COM E SEM UM LIGANTE G4SG2. AS SEQUÊNCIAS MOSTRADAS ABAIXO INCLUEM UMA SEQUÊNCIA DE
DOBRADIÇA COMO PARTE DO LIGANTE PEPTÍDICO QUE FUNDE AS CADEIAS PESADAS DAS SEGUNDA E TERCEIRA FRAÇÕES DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO.
Sem G4SG2 Com G4SG2 Consenso 4D5 55 56 4D5 do tipo selvagem (trastuzumabe) 57 58 4D5 H91A 59 60 4D5 Y55E.Y102V 61 62 4D5 D98A.F100A.Y102V 63 64
Sem G4SG2 Com G4SG2 4D5 D98T.F100A.Y102V 65 66 4D5 N30S.N54E.D98T 67 68 4D5 N30S.H91A.N54E.D98T 69 70 4D5 H91A.N54E.D98T 71 72 4D5 N30S.Y55E.N54E.D98T.Y102V 73 74 4D5 N30S 75 76 4D5 N54E.D98T 77 78 4D5 N30S.N54E.D98T.F100A.Y102V 79 80 4D5 N30S.N54E.D98A.F100A.Y102V 81 82 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T 83 84 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V 85 86 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T 87 88 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V 89 90
[0293] Em particular, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção pode apresentar um ligante peptídico compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 55). Em outros casos, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 59). Alternativamente, a molécula de ligação ao antígeno pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63 (por exemplo, pelo menos 96%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 63 ou 100% de identidade de sequência com a
SEQ ID NO: 63). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 83 (por exemplo, pelo menos 96%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 83, pelo menos 97% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 83, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 83, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 83 ou 100% de identidade de sequência com a
SEQ ID NO: 83). Em outros casos, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 85 (por exemplo, pelo menos 96%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 85, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 85, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 85, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 85 ou 100% de identidade de sequência com a
SEQ ID NO: 85). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 87 (por exemplo, pelo menos 96%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 87, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 87, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 87, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 87 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 87). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 89 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 89, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 89, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 89, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 89 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 89).
[0294] Em outros casos, o ligante peptídico compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51. A molécula de ligação ao antígeno pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno pode compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60, pelo menos 97% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 60, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 60). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 64 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 64). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 84 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 84, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 84, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 84, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 84 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 84). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 86 (por exemplo, pelo menos 96%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 86, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 86, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 86, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 86 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 86). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 88 (por exemplo, pelo menos 96% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 88, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 88, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 88, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 88 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 88). Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 90 (por exemplo, pelo menos 96%
de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 90, pelo menos 97% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 90, pelo menos 98% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 90, pelo menos 99% de identidade de sequência com a SEQ ID
NO: 90 ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 90).
DOMÍNIOS FC
[0295] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem apresentar um domínio Fc. O domínio Fc pode ser um domínio Fc da IgG (por exemplo, um domínio Fc da IgG1 ou IgG4). Por exemplo, o domínio Fc pode ser um domínio Fc humano. Em algumas modalidades, o domínio Fc compreende uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora. Por exemplo, em algumas modalidades, as uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora estão em uma ou mais posições selecionadas a partir do grupo de L234, L235 e P329 (por exemplo, em que a primeira subunidade Fc e a segunda subunidade Fc compreendem as substituições de aminoácidos de L234A, L235A e P329G). O receptor Fc pode ser, por exemplo, um receptor Fcγ.
Assim, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser configuradas para reduzir a citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC).
[0296] Em alguns casos, o domínio Fc compreende uma modificação configurada para promover a associação da primeira subunidade Fc com a segunda subunidade Fc. A engenharia "Knob-in-hole" de anticorpos biespecíficos pode ser usada para gerar um primeiro braço contendo um "knob" e um segundo braço contendo o "hole" no qual o "knob" do primeiro braço pode se ligar. O "knob" dos anticorpos multiespecíficos da invenção pode ser um braço monovalente (por exemplo, braço anti-CD3) em uma modalidade.
Alternativamente, o "knob" dos anticorpos multiespecíficos da invenção pode ser um braço bivalente (por exemplo, braço antitumoral). O "hole" dos anticorpos multiespecíficos da invenção pode ser um braço monovalente (por exemplo, braço anti-CD3) em uma modalidade. Alternativamente, o "hole" dos anticorpos multiespecíficos da invenção pode ser um braço bivalente (por exemplo, braço antitumoral). Os anticorpos biespecíficos também podem ser manipulados usando a tecnologia de cruzamento de imunoglobulina (também conhecida como troca de domínio Fab ou formato CrossMab) (vide, por exemplo, WO 2009/080253; Schaefer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108:11187-11192 (2011)). Os anticorpos biespecíficos também podem ser produzidos por efeitos de direção eletrostática de engenharia para produzir moléculas Fc-heterodiméricas de anticorpo (WO 2009/089004A1); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº 4.676.980, e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)); ou usando zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (vide, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992)).
[0297] Um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da segunda subunidade Fc pode ser substituído por um resíduo de aminoácido tendo um volume maior de cadeia lateral, gerando assim uma protuberância (por exemplo, um "knob") dentro do domínio CH3 da segunda subunidade Fc que é posicionada em uma cavidade (por exemplo, um hole) dentro do domínio CH3 da primeira subunidade Fc, e um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da primeira subunidade Fc pode ser substituído por um resíduo de aminoácido tendo um volume menor de cadeia lateral, gerando assim uma cavidade (por exemplo, um orifício) dentro do domínio CH3 da primeira subunidade Fc dentro da qual a protuberância (por exemplo, um "knob") dentro do domínio CH3 da segunda subunidade Fc pode ser posicionada. Em algumas modalidades, o domínio CH3 da segunda subunidade Fc compreende a substituição de aminoácidos de T366, e o domínio CH3 da primeira subunidade Fc compreende substituições de aminoácidos em um, dois ou todos os três de T366, L368 e/ou Y407. Em algumas modalidades, o domínio CH3 da segunda subunidade Fc compreende a substituição de aminoácidos de T366W e o domínio CH3 da primeira subunidade Fc compreende uma, duas ou todas as três substituições de aminoácidos de T366S, L368A e/ou Y407V.
[0298] É expressamente contemplado que tais moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas ou outros anticorpos descritos no presente documento para uso em qualquer um dos casos enumerados aqui possam ter qualquer uma das características, isoladamente ou em combinação, descritas nas Seções 1 a 6 abaixo.
1. AFINIDADE DE ANTICORPO
[0299] Em certas instâncias, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica tem uma constante de dissociação de equilíbrio (K D) de ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0,1 nM, ≤ 0,01 nM, ou ≤ 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M).
[0300] Em uma modalidade, a KD é medida por um ensaio radiomarcado de ligação ao antígeno (RIA). Em uma modalidade, um RIA é realizado com a versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno. Por exemplo, a afinidade de ligação da solução de Fabs para o antígeno é medida equilibrando o Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com 125I, na presença de uma série de titulação de antígeno não marcado, e então capturando o antígeno ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (vide, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Para estabelecer as condições para o ensaio, placas multipoços MICROTITER® (Thermo Scientific) são revestidas durante a noite com 5 μg/ml de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio a 50 mM (pH 9,6), e subsequentemente bloqueadas com 2% (p/v) de albumina de soro bovino em PBS durante duas a cinco horas à temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Em uma placa não adsorvente (Nunc # 269620), 100 pM ou 26 pM antígeno com 125I são misturadas com diluições em séries de um Fab de interesse (por exemplo, consistente com a avaliação do anticorpo anti-VEGF,
Fab-12, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). O Fab de interesse é então incubado durante a noite; no entanto, a incubação pode continuar durante um período mais longo (por exemplo, cerca de 65 horas) para assegurar que o equilíbrio seja atingido. Depois disso, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação em temperatura ambiente (por exemplo, durante uma hora). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com polissorbato 20 (TWEEN-20®) a 0,1% em PBS. Quando as placas estiverem secas, são adicionados 150 μl/poço de cintilante (MICROSCINT-20™; Packard) e as placas são contadas em um contador gama TOPCOUNT™ (Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab que são menos de ou igual a 20% da ligação máxima são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitivos.
[0301] De acordo com outra exemplo, a KD é medida usando um ensaio de ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. Por exemplo, um ensaio usando um BIACORE®-2000 ou BIACORE®-3000 (BIACORE®, Inc., Piscataway, NJ) é realizado a 25°C com chips de antígeno CM5 imobilizados em ~10 unidades de resposta (RU). Em um caso, os chips com biossensor de dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE®, Inc.) são ativados com cloridrato de N-etil-N’-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDC) e N-hidroxissuccinimida (NHS), de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com acetato de sódio de 10 mM, pH 4,8, a 5 μg/ml (~0,2 μM) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 μl/minuto para atingir cerca de 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção do antígeno, etanolamina de 1M é injetada para bloquear os grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições em série de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com tensoativo de polissorbato 20 a 0,05% (TWEEN-20™) (PBST) a 25°C a uma taxa de fluxo de cerca de 25 μl/min. As taxas de associação (k on) e as taxas de dissociação (koff) são calculadas usando um modelo simples de ligação Langmuir individual (BIACORE® Evaluation Software versão 3.2), ajustando simultaneamente os sensores de associação e dissociação. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) é calculada como a razão koff/kon.
Vide, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol., 293:865-881 (1999). Se a taxa de associação exceder 106 M-1s-1 pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície acima, então a taxa de associação pode ser determinada usando uma técnica de resfriamento fluorescente que mede o aumento ou diminuição da intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, passa-faixa de 16 nm) a 25°C de um anticorpo anti-antígeno de 20 nM (formato Fab) em PBS, pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno, conforme medido em um espectrômetro, tal como um espectrofômetro equipado com parada de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-AMINCO™ da série 8000 (ThermoSpectronic) com uma cubeta de agitar.
2. FRAGMENTOS DE ANTICORPO
[0302] Em certos casos, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica fornecida no presente documento inclui um ou mais fragmentos de anticorpo. Os fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, fragmentos de Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv e scF e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpo, vide Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para uma revisão dos fragmentos scFv, vide, por exemplo, Pluckthün, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer-Verlag, Nova Iorque), pp. 269-315 (1994); vide também WO 93/16185; e Patentes dos EUA de nºs
5.571.894 e 5.587.458. Para a discussão de fragmentos Fab e F(ab’) 2 compreendendo resíduos de epítopo de ligação ao receptor de salvamento e tendo um aumento na meia vida in vivo, vide Patente dos EUA de nº 5.869.046.
[0303] Os diacorpos são fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Vide, por exemplo, EP 404.097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9: 129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med., 9:129-134 (2003).
[0304] Os anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo compreendendo toda ou uma porção do domínio variável de cadeia pesada ou toda ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certos casos, um anticorpo de domínio único é um anticorpo humano de domínio único (Domantis, Inc., Waltham, MA; vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº 6.248.516).
[0305] Os fragmentos de anticorpo podem ser feitos através de várias técnicas, incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como a produção em células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), como descrito neste documento.
3. ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS
[0306] Em certos casos, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica fornecida neste documento é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na Patente dos EUA de nº
4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)).
Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho, ou primata não humano, tal como um macaco) e uma região constante humana. Em um outro exemplo, um anticorpo quimérico é um anticorpo de “classe trocada” em que a classe ou a subclasse foi alterada a partir do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação ao antígeno.
[0307] Em certas modalidades, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Normalmente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade a seres humanos, embora mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis nos quais HVRs, por exemplo, CDRs (ou porções dos mesmos) são derivadas de um anticorpo não humano e FRs (ou porções dos mesmos) são derivadas de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas modalidades, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou a afinidade do anticorpo.
[0308] Anticorpos humanizados e métodos para fabricá-los são revisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, REont. Biosci. 13:1619-1633 (2008), e são descritos adicionalmente, por exemplo, em Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989); Patentes dos EUA de nºs 5.821.337, 7.527.791,
6.982.321 e 7.087.409; Kashmiri et al., Methods, 36:25-34 (2005) (descrevendo o enxerto da região determinante da especificidade (SDR)); Padlan, Mol.
Immunol., 28:489-498 (1991) (descrevendo "ressurgimento"); Dall'Acqua et al., Methods, 36:43-60 (2005) (descrevendo "embaralhamento de FR"); e Osbourn et al., Methods, 36:61-68 (2005) e Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (descrevendo a abordagem de “seleção guiada” para embaralhamento de FR).
[0309] As regiões estruturais humanas que podem ser usadas para humanização incluem, mas não estão limitadas a: regiões estruturais selecionadas usando o método de “melhor ajuste” (vide, por exemplo, Sims et al., J. Immunol., 151:2296 (1993)); regiões estruturais derivadas da sequência de consenso de anticorpos humanos de um subgrupo particular de regiões variáveis de cadeia leve ou pesada (vide, por exemplo, Carter et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); e Presta et. al., J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiões estruturais maduras (mutadas somaticamente) humanas ou regiões estruturais da linhagem germinativa humana (vide, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci., 13:1619-1633 (2008)); e regiões estruturais derivadas da triagem de bibliotecas de FR (vide, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem., 272:10678-10684 (1997) e Rosok et al., J. Biol. Chem., 271:22611-22618 (1996)).
4. ANTICORPOS HUMANOS
[0310] Em certos casos, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica fornecida no presente documento é um anticorpo humano. Os anticorpos humanos podem ser produzidos usando várias técnicas conhecidas na técnica. Os anticorpos humanos são descritos geralmente em van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5:368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008).
[0311] Os anticorpos humanos podem ser preparados por administrar um imunógeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta ao desafio antigênico. Tais animais normalmente contêm toda ou uma porção do locus da imunoglobulina humana, que substitui o locus endógeno da imunoglobulina, ou que está presente de forma extracromossômica ou integrado aleatoriamente nos cromossomos do animal. Em tais camundongos transgênicos, o locus endógeno da imunoglobulina geralmente foi inativado. Para uma revisão de métodos para obter anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, vide Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Vide também, por exemplo, as patentes dos EUA de nº 6.075.181 e 6.150.584, que descrevem a tecnologia XENOMOUSE TM; patente dos EUA de nº 5.770.429, que descreve a tecnologia HUMAB ®; Patente dos EUA de nº 7.041.870, que descreve a tecnologia K-M MOUSE® e Publicação de Pedido de Patente dos EUA de nº 2007/0061900, que descreve a tecnologia ELOCIMOUSE®. As regiões variáveis humanas de anticorpos intactos geradas por tais animais podem ser adicionalmente modificadas, por exemplo, através da combinação com uma região constante humana diferente.
[0312] Os anticorpos humanos também podem ser produzidos por métodos à base de hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e de heteromieloma de camundongo-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos foram descritas. (Vide, por exemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1987); e Boerner et al., J.
Immunol., 147: 86 (1991)). Anticorpos humanos gerados por meio de tecnologia de hibridoma de células B humanas também são descritos em Li et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na Patente dos EUA de nº 7.189.826 (descrevendo a produção de anticorpos IgM humanos monoclonais a partir de linhagens celulares de hibridoma) e em Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4): 265-268 (2006) (descrevendo hibridomas humano-humano). A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia Trioma) é também descrita em Vollmers e Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) e Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
[0313] Os anticorpos humanos podem também ser gerados por isolamento de sequências de domínio variável de clones de Fv selecionados a partir de bibliotecas de exibição de fagos de origem humana. Tais sequências de domínio variável podem então ser combinadas com um domínio constante humano desejado. As técnicas para a seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritas abaixo.
5. ANTICORPOS DERIVADOS DE BIBLIOTECA
[0314] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser isoladas por triagem de bibliotecas combinatórias para anticorpos com a(s) atividade(s) desejada(s). Por exemplo, são conhecidos na técnica uma variedade de métodos para gerar bibliotecas de exibição de fagos e rastrear tais bibliotecas quanto a anticorpos que possuam as características de ligação desejadas. Tais métodos são revisados, por exemplo, em Hoogenboom et al., em Methods in Molecular Biology, 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) e descrito mais detalhadamente, por exemplo, em McCafferty et al., Nature, 348:552-554; Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1992); Marks e Bradbury, em Methods in Molecular Biology, 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol., 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol., 340 (5):1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 101 (34):12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods, 284(1- 2):119-132 (2004).
[0315] Em certos métodos de exibição de fagos, os repertórios dos genes de VH e VL são clonados separadamente por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fagos, que podem então ser rastreadas quanto a fagos de ligação ao antígeno, conforme descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12:433-455 (1994). Os fagos apresentam normalmente fragmentos de anticorpo, tanto como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab. Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos de alta afinidade ao imunógeno sem a necessidade de construir hibridomas. Alternativamente, o repertório não exposto pode ser clonado (por exemplo, a partir de humanos) para fornecer uma única fonte de anticorpos para uma ampla faixa de antígenos não próprios e próprios sem qualquer imunização, como descrito por Griffiths et al., EMBO J,
12:725 -734 (1993). Finalmente, bibliotecas não expostas também podem ser produzidas sinteticamente pela clonagem de segmentos do gene V não rearranjados de células-tronco e usando iniciadores de PCR contendo sequência aleatória para codificar as regiões CDR3 altamente variáveis e realizar rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol.
Biol., 227:381-388 (1992). As publicações de patentes que descrevem as bibliotecas de fagos de anticorpos humanos incluem, por exemplo: Patente dos EUA de nº 5.750.373 e Publicações de Patente dos EUA de nºs 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 e 2009/0002360.
[0316] Anticorpos ou fragmentos de anticorpo isolados de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpo humanos no presente documento.
6. VARIANTES DE MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
[0317] Em certos casos, são contempladas variantes de sequência de aminoácidos das moléculas de ligação a antígeno biespecíficas da invenção. Por exemplo, pode ser desejável aprimorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. As variantes da sequência de aminoácidos de um anticorpo podem ser preparadas através da introdução de modificações apropriadas na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos nas sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno.
[0318] Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende uma ou mais modificações na região VH/VL e/ou na região CH1/CL para facilitar o emparelhamento correto de cadeia pesada/leve. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção compreende uma ou mais modificações na região Fc para facilitar a heterodimerização dos dois braços da molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Tais modificações na região VH/VL, região CH1/CL e/ou região FC são descritas na Publicação de Patente Internacional de nº WO 2016/172485, que é incorporada no presente documento por referência em sua totalidade.
A. VARIANTES DE SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO E EXCLUSÃO
[0319] Em certas modalidades, variantes de anticorpo tendo uma ou mais substituições de aminoácidos são fornecidas. Locais de interesse para a mutagênese de substituição incluem as HVRs e FRs. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 3, sob o título "substituições preferidas". Alterações mais substanciais são fornecidas na Tabela 3, sob o título "substituições exemplares", e conforme descrito abaixo em referência às classes de cadeia lateral de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados quanto a uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao antígeno retida/aprimorada, imunogenicidade reduzida ou citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC) ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC).
TABELA 3
SUBSTITUIÇÕES DE AMINOÁCIDOS EXEMPLARES E PREFERIDAS Resíduo Substituições Substituições Exemplares Original Preferidas Ala (A) Val; Leu; Ile Val Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln Asp (D) Glu; Asn Glu
Resíduo Substituições Substituições Exemplares Original Preferidas Cys (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; Norleucina Leu Leu (L) Norleucina; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; Ile Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucina Leu
[0320] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades de cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbicos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: Gly, Pro; ou (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe.
[0321] As substituições não conservativas implicarão a troca de um membro de uma destas classes por outra classe.
[0322] Um tipo de variante substitucional envolve a substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para estudo adicional terá(ão) modificações (por exemplo, aprimoramentos) em certas propriedades biológicas (por exemplo, maior afinidade e/ou imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo parental/ou terá(ão) substancialmente retido certas propriedades biológicas do anticorpo parental. Uma variante substitucional exemplar é um anticorpo amadurecido por afinidade, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, usando técnicas de maturação por afinidade baseadas em exibição de fagos, tais como as descritas neste documento. Em suma, um ou mais resíduos de HVR são mutados e os anticorpos de variantes exibidos no fago e rastreados para uma atividade biológica específica (por exemplo, afinidade de ligação).
[0323] Alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para aprimorar a afinidade de anticorpos. Tais alterações podem ser feitas nos "pontos de acesso" ("hotspots") da HVR, isto é, resíduos codificados por códons que sofrem mutação em alta frequência durante o processo de maturação somática (vide, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol., 207:179-196 (2008)), e/ou resíduos que entram em contato com o antígeno, com a variante resultante de VH ou VL sendo testada quanto à afinidade de ligação. A maturação por afinidade através da construção e nova seleção de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom et al., em Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). Em alguns casos de maturação por afinidade, a diversidade é introduzida nos genes variáveis escolhidos para maturação por qualquer uma de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propenso a erros, embaralhamento de cadeia ou mutagênese direcionada a oligonucleotídeo). É então criada uma biblioteca secundária. A biblioteca é então rastreada para identificar as variantes de anticorpo com a afinidade desejada. Outro método para introduzir diversidade envolve abordagens direcionadas a HVR, nas quais vários resíduos de HVR (por exemplo, 4 a 6 resíduos de cada vez) são randomizados. Os resíduos de HVR envolvidos na ligação ao antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, usando mutagênese ou modelagem de varredura de alanina. CDR-H3 e CDR- L3 em particular são frequentemente direcionadas.
[0324] Em certos casos, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs, desde que tais alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo de se ligar ao antígeno.
Por exemplo, alterações conservativas (por exemplo, substituições conservativas como fornecidas neste documento) que não reduzem substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Tais alterações podem, por exemplo, estar fora dos resíduos que entram em contato com o antígeno nas HVRs. Em certas modalidades da variante de sequências de VH e VL fornecidas acima, cada HVR é inalterada, ou não contém mais do que uma, duas ou três substituições de aminoácidos.
[0325] Um método útil para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que pode ser direcionado para mutagênese é chamado "mutagênese de varredura de alanina", como descrito por Cunningham e Wells, (1989), Science, 244:1081-1085. Nesse método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados, tais como Arg, Asp, His, Lys e Glu) são identificados e substituídos por um aminoácido neutro ou carregado negativamente (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Substituições adicionais podem ser introduzidas nas localizações de aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional às substituições iniciais. Alternativamente, ou adicionalmente, é fornecida uma estrutura cristalina de um complexo antígeno-
anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Tais resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos à substituição. As variantes podem ser rastreadas para determinar se elas contêm as propriedades desejadas.
[0326] As inserções da sequência de aminoácidos incluem fusões com terminais amino e/ou carboxila variando em comprimento de um resíduo a polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como inserções de intrasequências de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila com terminal N. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão ao terminal N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida sérica do anticorpo.
B. VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO
[0327] Em certos casos, as moléculas de ligação ao antígeno da invenção podem ser alteradas para aumentar ou diminuir a extensão em que o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de locais de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada alterando a sequência de aminoácidos de tal modo que um ou mais locais de glicosilação sejam criados ou removidos.
[0328] Quando a molécula de ligação ao antígeno compreende uma região Fc, o carboidrato a ela ligado pode ser alterado. Os anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos compreendem, normalmente, um oligossacarídeo biantennário ramificado que geralmente é ligado por uma ligação N a Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Vide, por exemplo, Wright et al., TIBTECH, 15:26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glucosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a um GlcNAc no "tronco" ("stem") da estrutura de oligossacarídeo biantennário. Em alguns casos, as modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da invenção podem ser feitas para criar variantes de anticorpo com certas propriedades aprimoradas.
[0329] Em um exemplo, são fornecidas variantes de moléculas de ligação ao antígeno tendo uma estrutura de carboidratos que não possui fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose em tais anticorpo pode ser de 1% a 80%, de 1% a 65%, de 5% a 65% ou de 20% a 40%. A quantidade de fucose é determinada calculando a quantidade média de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicostruturas ligadas a Asn 297 (por exemplo, estruturas complexas, híbridas e de alta manose), conforme medido por espectrometria de massa MALDI-TOF, como descrito em WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado na posição 297 na região Fc (numeração da UE de resíduos da região Fc); no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de ± 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a pequenas variações de sequência nos anticorpos. Tais variantes de fucosilação podem ter aprimorado a função ADCC. Vide, por exemplo, as publicações dos EUA de nºs US 2003/0157108 e US 2004/0093621. Exemplos de publicações relacionadas a variantes de anticorpo "defucosilados" ou "deficientes em fucose" incluem: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al., J. Mol. Biol., 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87:614 (2004).
Exemplos de linhagens celulares capazes de produzir anticorpos desfucosilados incluem células Lec13 CHO deficientes em fucosilação de proteínas (Ripka et al., Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); Patente dos EUA de nº 2003/0157108 A1; e WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no Exemplo 11), e linhagens celulares de knockout, tais como o gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO de knockout (vide, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al., Biotech, Bioeng. 87:614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94 (4):680-688 (2006); e WO2003/085107).
[0330] As variantes de moléculas de ligação ao antígeno são ainda fornecidas com oligossacarídeos bissetados, por exemplo, nos quais um oligossacarídeo biantennário ligado à região Fc do anticorpo é bissecado por GlcNAc. Tais variantes de anticorpos podem ter fucosilação reduzida e/ou função ADCC aprimorada. Exemplos de tais variantes de anticorpos são descritos, por exemplo, no documento WO 2003/011878; Patente dos EUA de nº 6.602.684; e US 2005/0123546. Também são fornecidas variantes de anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo ligado à região Fc. Tais variantes de anticorpos podem ter uma função CDC aprimorada. Tais variantes de anticorpo são descritas, por exemplo, no documento WO 1997/30087; WO 1998/58964; e WO 1999/22764.
C. VARIANTES DA REGIÃO FC
[0331] Em certos casos, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo da invenção, gerando assim uma variante da região Fc. A variante da região Fc pode compreender uma sequência da região Fc humana (por exemplo, uma região Fc IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) compreendendo uma modificação de aminoácidos (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.
[0332] Em certos casos, a invenção contempla uma variante de anticorpo que possui algumas funções efetoras, mas não todas, o que a torna uma candidata desejável para aplicações nas quais a meia-vida do anticorpo in vivo é importante, mas algumas funções efetoras (tais como complemento e
ADCC) são desnecessárias ou deletérias. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser realizados para confirmar a redução/depleção das atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo, os ensaios de ligação ao receptor Fc (FcR) podem ser realizados para garantir que o anticorpo não possua ligação a FcγR (portanto, provavelmente sem atividade ADCC), mas mantém a capacidade de ligação a FcRn. As células primárias para mediar células ADCC e NK expressam somente FcγRIII, enquanto os monócitos expressam FcγRI, FcγRII e FcγRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está em suma na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-492 (1991). Exemplos não limitativos de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na Patente dos EUA de nº 5.500.362 (vide, por exemplo, Hellstrom, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 83:7059- 7063 (1986)) e Hellstrom, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:1499-1502 (1985); Patente dos EUA de nº 5.821.337 (vide Bruggemann, et al., J. Exp. Med., 166:1351-1361 (1987)). Como alternativa, métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (vide, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativa ACTI™ para citometria de fluxo (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; e ensaio de citotoxicidade não radioativa CYTOTOX 96® (Promega, Madison, WI))). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células Natural Killer (NK). Alternativamente, ou adicionalmente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal tal como o divulgado em Clynes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:652-656 (1998). Os ensaios de ligação a C1q também podem ser realizados para confirmar que o anticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, portanto, carece de atividade CDC. Vide, por exemplo, ELISA de ligação a C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar a ativação do complemento, pode ser realizado um ensaio CDC (vide, por exemplo,
Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996); Cragg et al., Blood. 101:1045-1052 (2003); e Cragg et al., Blood., 103:2738-2743 (2004)). A ligação a FcRn e as determinações de depuração/meia-vida in vivo também podem ser realizadas usando métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Petkova et al., Int'l. Immunol., 18(12):1759-1769 (2006)).
[0333] Anticorpos com função efetora reduzida incluem aqueles com substituição de um ou mais dos resíduos 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 da região Fc (Patentes dos EUA de nºs 6.737.056 e 8.219.149). Tais mutações Fc incluem mutações Fc com substituições em duas ou mais posições de aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo a chamada mutações Fc "DANA" com substituição de resíduos 265 e 297 a alanina (Patentes dos EUA de nºs 7.332.581 e 8.219.149).
[0334] Certas variantes de anticorpo com ligação aprimorada ou diminuída a FcRs são descritas. (Vide, por exemplo, Patente dos EUA de nº
6.737.056; WO 2004/056312, e Shields et al., J. Biol. Chem., 9(2):6591-6604 (2001)).
[0335] Em certos casos, uma variante de anticorpo compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que aprimoram a ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração da UE de resíduos).
[0336] Em alguns casos, são feitas alterações na região Fc que resultam na ligação a C1q alterada (isto é, aprimorada ou diminuída) e/ou citotoxicidade dependente do complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na Patente dos EUA de nº 6.194.551, WO 99/51642 e em Idusogie et al., J. Immunol., 164:4178-4184 (2000).
[0337] Anticorpos com meia-vida aumentada e ligação aprimorada ao receptor Fc neonatal (FcRn), responsável pela transferência de IgGs maternais para o feto (Guyer et al., J. Immunol., 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol., 24:249 (1994)), são descritos em US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições na mesma que aprimoram a ligação da região Fc ao FcRn. Tais variantes Fc incluem aquelas com substituições em um ou mais dos resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição de resíduo 434 da região Fc (Patente dos EUA de nº 7.371.826).
[0338] Vide também Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); Patente dos EUA de nº 5.648.260; Patente dos EUA de nº 5.624.821; e WO 94/29351 em relação a outros exemplos de variantes da região Fc.
D. VARIANTES DE ANTICORPO MANIPULADAS COM CISTEÍNA
[0339] Em certos casos, pode ser desejável criar anticorpos manipulados com cisteína, por exemplo, "tioMAbs", nos quais um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em modalidades particulares, os resíduos substituídos ocorrem em locais acessíveis do anticorpo. Substituindo esses resíduos por cisteína, os grupos tiol reativos são posicionados em locais acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outras frações, tais como frações de fármacos ou frações de ligantes e fármacos, para criar um imunoconjugado, conforme descrito mais adiante. Em certas modalidades, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos pode ser substituído por cisteína: V205 (numeração Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração UE) da cadeia pesada; e S400 (numeração da UE) da região Fc da cadeia pesada. Os anticorpos manipulados com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na Patente dos EUA de nº 7.521.541.
E. DERIVADOS DE ANTICORPO
[0340] Em certas modalidades, um anticorpo proporcionado aqui pode ser ainda modificado para conter frações não proteicas adicionais que são conhecidas na especialidade e prontamente disponíveis. As frações adequadas para derivatização do anticorpo incluem, mas não estão limitadas a, polímeros solúveis em água. Exemplos não limitativos de polímeros solúveis em água incluem, mas não estão limitados a, polietilenoglicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1,3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anidrido maleico, poliaminoácidos (tanto homopolímeros ou copolímeros aleatórios) e dextrano ou poli(n-vinilpirrolidona)polietilenoglicol, homopolímeros de propropilenoglicol, copolímeros de óxido de propipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas destes. O propionaldeído de polietilenoglicol pode ter vantagens na fabricação devido à sua estabilidade na água. O polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar e, se mais de um polímero estiver ligado, eles podem ser as mesmas moléculas ou diferentes.
Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização podem ser determinados com base em considerações que incluem, mas não estão limitadas a, as propriedades ou funções particulares do anticorpo a ser aprimorado, se o derivado de anticorpo será usado em uma terapia sob condições definidas, etc.
[0341] Em outro exemplo, são fornecidos conjugados de um anticorpo e uma fração não proteica que pode ser seletivamente aquecida por exposição à radiação. Em um exemplo, a fração não proteica é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102:11600-11605 (2005)).
A radiação pode ter qualquer comprimento de onda, e inclui, mas não está limitada a, comprimentos de onda que não prejudicam as células comuns, mas que aquecem a fração não proteica, a uma temperatura na qual as células proximais à fração não proteica de anticorpo são mortas.
F. IMUNOCONJUGADOS
[0342] A invenção também fornece imunoconjugados que compreendem uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica conjugada com um ou mais agentes citotóxicos, tais como agentes ou fármacos quimioterapêuticos, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal ou fragmentos das mesmas) ou isótopos radioativos.
[0343] Em um exemplo, um imunoconjugado é um conjugado anticorpo-fármaco (ADC) no qual um anticorpo é conjugado com uma ou mais fármacos, incluindo, mas não se limitando a, um maitansinóide (vide Patentes dos EUA de nºs 5.208.020, 5.416.064 e Patente Europeia EP 0 425 235 B1); uma auristatina, tal como frações de fármacos DE e DF de monometilauristatina (MMAE e MMAF) (vide Patentes dos EUA de nºs
5.635.483 e 5.780.588, e 7.498.298); uma dolastatina; uma caliqueamicina ou derivado da mesma (vide Patentes dos EUA de nºd 5.712.374, 5.714.586,
5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 e 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); e Lode et al., Cancer Res., 58:2925- 2928 (1998)); uma antraciclina, tal como daunomicina ou doxorrubicina (vide Kratz et al., Current Med. Chem., 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters, 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem., 16:717- 721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Letters, 12:1529-1532 (2002); King et al., J.
Med. Chem., 45:4336-4343 (2002); e Patente dos EUA de nº 6.630.579); metotrexato; vindesina; um taxano, tal como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel; um tricoteceno; e CC1065.
[0344] Em outro exemplo, um imunoconjugado compreende um anticorpo descrito no presente documento, conjugado com uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento da mesma, incluindo, entre outros, cadeia de difteria A, fragmentos ativos não ligados da toxina da difteria, cadeia de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia de ricina A, cadeia de abrina A, cadeia de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diatina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII e PAP- S), inibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrinocina, fenomicina, enomicina e tricotecenos.
[0345] Em outro exemplo, um imunoconjugado compreende um anticorpo como descrito neste documento conjugado a um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Os exemplos incluem At 211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu.
Quando o radioconjugado é usado para detecção, ele pode compreender um átomo radioativo para estudos cintilográficos, por exemplo, tc99m ou I123, ou um rótulo de rotação para imagens por ressonância magnética nuclear (RMN) (também conhecida como ressonância magnética, MRI), tal como iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[0346] Os conjugados de um anticorpo e agente citotóxico podem ser feitos usando uma variedade de agentes bifuncionais de acoplamento de proteína, tais como N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclo-hexano-1-carboxilato (SMCC), iminotiolano (IT), derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como adipimidato de dimetila de HCl), ésteres ativos (tais como suberato de disuccinimidila), aldeídos (tais como glutaraldeído), compostos de bis-azido (tais como bis(p- azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazônio (tais como bis-(p- diazônio-benzoil)-etilenodiamina), di-isocianatos (tais como 2,6-di-isocianato de tolueno) e compostos bis-ativos de flúor (tais como 1,5-difluoro-2,4-
dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987). O ácido 1- isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminapenta-acético (MX-DTPA) marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação do radionucleotídeo ao anticorpo. Vide WO94/11026. O ligante pode ser um "ligante clivável", facilitando a liberação de um fármaco citotóxico na célula. Por exemplo, um ligante lábil a ácidos, ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetílico ou ligante contendo dissulfeto (Chari et al., Cancer Res., 52:127-131 (1992); Patente dos EUA de nº 5.208.020) podem ser usados.
[0347] Os imunuoconjugados ou ADCs no presente documento contemplam expressamente, mas não estão limitados a, tais conjugados preparados com reagentes de reticulação incluindo, mas não limitados a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, sulfo-SMPB e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona) benzoato) que estão comercialmente disponíveis (por exemplo, da Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., EUA).
III.MÉTODOS RECOMBINANTES E COMPOSIÇÕES
[0348] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser produzidas usando métodos e composições recombinantes, por exemplo, como descrito na Patente dos EUA de nº
4.816.567 e na Publicação dos EUA de nº 2013/0078249, que são incorporadsa no presente documento por referência em suas totalidades. Em uma modalidade, é fornecido o ácido nucleico isolado (por exemplo, um polinucleotídeo) que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica descrita neste documento. Tal ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos compreendendo uma VL e/ou uma sequência de aminoácidos compreendendo uma VH da molécula de ligação ao antígeno biespecífica (por exemplo, as cadeias leves e/ou pesadas de ambos os braços da molécula de ligação ao antígeno biespecífica). Em uma modalidade adicional, um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) compreendendo tal ácido nucleico são fornecidos.
[0349] Os polinucleotídeos que codificam moléculas de ligação ao antígeno biespecíficos da invenção podem ser expressos como uma única molécula de polinucleotídeo ou como múltiplos (por exemplo, dois ou mais) polinucleotídeos que são coexpressos. Os polipeptídeos codificados por polinucleotídeos que são coexpressos podem associar-se através, por exemplo, de ligações de dissulfeto ou outros meios para formar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica funcional. Por exemplo, uma fração de cadeia leve de uma fração de ligação ao antígeno pode ser codificada por um polinucleotídeo separado da fração da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende a fração de cadeia pesada da fração de ligação ao antígeno, uma subunidade do domínio Fc e, opcionalmente, outra fração de ligação ao antígeno. Quando coexpressos, os polipeptídeos de cadeia pesada se associam aos polipeptídeos de cadeia leve para formar a fração de ligação ao antígeno. Em outro exemplo, a fração da molécula de ligação ao antígeno biespecífica que compreende uma das duas subunidades do domínio Fc e opcionalmente uma ou mais frações de ligação ao antígeno pode ser codificada por um polinucleotídeo separado da fração da molécula de ligação ao antígeno que ativa células T compreendendo a outra das duas subunidades do domínio Fc e opcionalmente uma fração de ligação ao antígeno. Quando coexpressas, as subunidades do domínio Fc se associam para formar o domínio Fc.
[0350] Em certas modalidades, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica um fragmento de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreendendo uma primeira e uma segunda fração de ligação ao antígeno e um domínio Fc consistindo em duas subunidades. Em uma modalidade, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica a primeira fração de ligação ao antígeno e uma subunidade do domínio Fc. Em outra modalidade, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica a cadeia pesada da segunda fração de ligação ao antígeno e uma subunidade do domínio Fc.
Em uma modalidade mais específica, o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo, em que uma cadeia pesada Fab compartilha uma ligação peptídica do terminal C com uma subunidade do domínio Fc. Em ainda outra modalidade, um polinucleotídeo isolado da invenção codifica a cadeia pesada da terceira fração de ligação ao antígeno, a cadeia pesada da segunda fração de ligação ao antígeno e uma subunidade do domínio Fc. Em algumas modalidades, as cadeias leves da segunda e terceira frações de ligação ao antígeno são coexpressas e associadas às regiões de cadeia pesada para formar domínios Fab.
[0351] Em outra modalidade, uma célula hospedeira compreendendo tal ácido nucleico é fornecida. Em uma tal modalidade, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo ou (2) um primeiro vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VL do anticorpo e um segundo vetor compreendendo um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos compreendendo a VH do anticorpo. Em uma modalidade, a célula hospedeira é eucariótica, por exemplo, uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfóide. Em uma modalidade, é fornecido um método para produzir uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, como fornecido acima, em condições adequadas para expressão do anticorpo, e opcionalmente recuperar o anticorpo da célula hospedeira (ou meio de cultura da célula hospedeira).
[0352] Para a produção recombinante de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, um polinucleotídeo que codifica uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, por exemplo, conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão posteriores em uma célula hospedeira. Tal ácido nucleico pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas oligonucleotídicas que são capazes de especificamente se ligarem a genes que codificam as cadeias pesada e leve da molécula de ligação ao antígeno biespecífica).
[0353] Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam moléculas de ligação ao antígeno biespecíficos incluem células procarióticas ou eucarióticas descritas neste documento. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando a glicosilação e a função efetora de Fc não são necessárias. Para a expressão de fragmentos de anticorpo e polipeptídeos em bactérias, vide, por exemplo, as Patentes dos EUA de nºs 5.648.237, 5.789.199 e 5.840.523. (Vide também Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, descrevendo a expressão de fragmentos de anticorpo em E. coli.) Após a expressão, o anticorpo pode ser isolado da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e pode ser ainda purificado.
IV.FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[0354] As formulações terapêuticas das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção são preparadas para armazenamento misturando a molécula de ligação ao antígeno biespecífica tendo o grau de pureza desejado com transportadores farmaceuticamente aceitáveis, excipientes ou estabilizadores opcionais na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Para informações gerais sobre formulações, vide, por exemplo, Gilman et al., (eds.), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8ª Ed., Pergamon Press, 1990; A.
Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª edição, Mack Publishing Co., Pensilvânia, 1990; Avis et al., (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications Dekker, Nova Iorque, 1993; Lieberman et al., (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets Dekker, Nova Iorque, 1990; Lieberman et al., (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems Dekker, Nova Iorque, 1990; e Walters (ed.), Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119, Marcel Dekker, 2002.
[0355] Transportadores, excipientes ou estabilizadores aceitáveis não são tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões, tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; parabenos de alquila, tais como parabeno de metila ou propila; catecol; resorcinol; ciclo-hexanol; 3- pentanol; e m-cresol); polipeptídeos com baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes, tais como EDTA;
açúcares, tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra -íons formadores de sal, tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteína Zn); e/ou tensoativos não iônicos, tais como TWEEN™, PLURONICS™ ou polietilenoglicol (PEG).
[0356] A formulação contida neste documento também pode conter mais de um composto ativo, preferencialmente aqueles com atividades complementares que não se afetam adversamente. O tipo e quantidades efetivas de tais medicamentos dependem, por exemplo, da quantidade e tipo de antagonista presente na formulação e dos parâmetros clínicos dos pacientes.
[0357] Os ingredientes ativos também podem ser presos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de liberação de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas na Remington's Pharmaceutical Sciences, 16ª edição, Osol, A.
Ed. (1980).
[0358] Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antagonista, cujas matrizes estão no formato de artigos moldados, por exemplo, películas ou microcápsulas. Exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2 - hidroxietilmetacrilato) ou poli(vinilálcool)), polilactídeos (Patente dos EUA de nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutâmico e γ etil-L-glutamato, etileno acetato de vinila não degradável, copolímeros de ácido lático-
glicólico degradáveis, tais como o LUPRON DEPOT™ (microesferas injetáveis compostas por copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolide) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
[0359] As formulações a serem usadas para administração in vivo devem ser estéreis. Isto é facilmente realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis.
V.MÉTODOS TERAPÊUTICOS
[0360] Qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção (por exemplo, moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas tendo um braço monovalente capaz de especificamente se ligar a um primeiro antígeno e um braço bivalente capaz de especificamente se ligar a dois segundos antígenos) ou composições das mesmas podem ser usadas em qualquer um dos métodos terapêuticos descritos no presente documento.
[0361] Em um aspecto, é fornecida uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica para uso como medicamento. Por exemplo, em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas descritas no presente documento são para uso no tratamento ou retardamento da progressão de um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer) ou um distúrbio autoimune em um paciente em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores é para uso no aperfeiçoamento da função imune em um paciente tendo um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer) ou um distúrbio autoimune. Em certas modalidades, a invenção fornece uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica para uso em um método para aperfeiçoar a função imune em um paciente tendo um distúrbio proliferativo celular ou um distúrbio autoimune compreendendo administrar ao paciente uma quantidade eficaz da molécula de ligação ao antígeno biespecífica para ativar células efetoras (por exemplo, células T, por exemplo,
células T CD8+ e/ou CD4+), expandir (aumentar) uma população de células efetoras, reduzir uma população de células alvo (por exemplo, uma população de células que expressam um segundo antígeno de célula alvo reconhecido por uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção) e/ou matar uma célula alvo (por exemplo, célula tumoral alvo).
[0362] A invenção apresenta o uso da molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção na fabricação de um medicamento para tratar ou retardar a progressão de um distúrbio, tal como um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, um câncer) ou um distúrbio autoimune. Em uma modalidade adicional, o medicamento é para uso em um método para tratar um distúrbio proliferativo celular ou um distúrbio autoimune compreendendo administrar a um paciente tendo um distúrbio proliferativo celular ou um distúrbio autoimune uma quantidade eficaz do medicamento. Em uma de tais modalidades, o método compreende ainda administrar ao paciente uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo. Em uma modalidade adicional, o medicamento é para ativar células efetoras (por exemplo, células T, por exemplo, células T CD8+ e/ou CD4+), expandir (aumentar) uma população de células efetoras, reduzir uma população de células alvo (por exemplo, uma população de células que expressam um segundo antígeno de célula alvo reconhecido por uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção) e/ou matar uma célula alvo (por exemplo, célula tumoral alvo).
[0363] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para tratar ou retardar a progressão de um distúrbio em um paciente em necessidade do mesmo, o método compreendendo administrar ao paciente a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores. Em uma modalidade, o método compreende administrar a um paciente tendo tal distúrbio proliferativo celular ou um distúrbio autoimune uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica (por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica tendo um braço monovalente anti-CD3 e um anti braço bivalente do antígeno de células tumorais). Em uma dessas modalidades, o método compreende ainda administrar ao paciente uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo.
[0364] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para aperfeiçoar a função imune em um paciente tendo um distúrbio, o método compreendendo administrar ao paciente a molécula de ligação ao antígeno biespecífica de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores (por exemplo, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica tendo um braço monovalente anti-CD3 e um braço bivalente do antígeno de célula antitumoral). Em algumas modalidades, o distúrbio é um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer) ou um distúrbio autoimune. Em certas modalidades, o método inclui administrar uma quantidade eficaz da molécula de ligação ao antígeno biespecífica para ativar células efetoras (por exemplo, células T, por exemplo, células T CD8+ e/ou CD4+), expandir (aumentar) uma população de células efetoras, reduzir uma população de células alvo (por exemplo, uma população de células que expressam um segundo antígeno de célula alvo reconhecido por uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção) e/ou matar uma célula alvo (por exemplo, célula tumoral alvo).
[0365] Em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidas neste documento, as composições e os métodos para uso das mesmas são usados para o tratamento de câncer, tal como câncer de mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de Hodgkin não linfoma (NHL), linfoma de células B, leucemia de células B, mieloma múltiplo, câncer renal, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma, glioblastoma, linfoma difuso de grandes células B do centro germinativo (GCB), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL),
DLBCL do tipo de célula B ativado (ABC), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), leucemia mielóide aguda (LMA), leucemia linfoide crônica (LLC), linfoma de zona marginal (MZL), leucemia linfocítica pequena
(SLL), linfoma linfoplasmocítico (LL), Macroglobulinemia de Waldenström
(WM), linfoma do sistema nervoso central (CNSL), linfoma de Burkitt (BL),
leucemia prolinocítica de células B, linfoma esplênico da zona marginal,
leucemia de células cabeludas, linfoma/leucemia esplênico(a), linfoma esplênico difuso da polpa vermelha de linfócitos B pequenos, variante de leucemia de células cabeludas, doença das cadeias pesadas α, doença das cadeias pesadas γ, doença das cadeias pesadas μ, mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma solitário do osso, plasmocitoma extraósseo,
linfoma do tecido linfoide associado à mucosa (linfoma MALT), linfoma nodal da zona marginal, linfoma pediátrico da zona marginal nodal, linfoma folicular pediátrico, linfoma cutâneo primário do centro folicular, linfoma difuso de grandes células b rico em células t/histiócitos, DLBCL primário do sistema nervoso central, DLBCL cutâneo primário (tipo perna), DLBCL positivo para o vírus Epstein-Barr (EBV) de idosos, DLBCL associado a inflamação crônica,
granulomatose linfomatóide, linfoma mediastinal primário de grandes células B,
linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de grandes células B positivo para quinase anaplásico (ALK), linfoma plasmático, linfoma de grandes células B surgido na doença de Castleman multicêntrica associada a infecção pelo HHV-8, linfoma primário de efusão, Linfoma de grandes células B, não classificável, com características intermediárias entre linfoma difuso de grandes células B e linfoma de Burkitt ou linfoma de grandes células B, não classificável, com características intermediárias entre linfoma difuso de grandes células B e linfoma de Hodgkin clássico.
Em algumas modalidades, as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas fornecidas no presente documento, composições e métodos de uso das mesmas, são usadas para o tratamento de um câncer positivo para HER2 (por exemplo, um câncer de mama positivo para HER2 ou um câncer gástrico positivo para HER2).
[0366] A invenção fornece ainda terapias combinadas, incluindo a administração de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica com um ou mais agentes terapêuticos adicionais (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco ou mais agentes terapêuticos adicionais) administrados em paralelo ou como parte de um regime complexo. Em uma modalidade, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica é coadministrada com um ou mais modificadores biológicos selecionados a partir de um inibidor de BCL-2 (por exemplo, GDC-0199/ABT-199), lenalidomida (REVLIMID®), um inibidor de PI3K-delta (tal como idelalisibe (ZYDELIG®)), um agonista, por exemplo, anticorpo agonista direcionado contra uma molécula coestimulatória de ativação, por exemplo, CD40, CD226, CD28, OX40 (por exemplo, AgonOX), GITR, CD137 (também conhecido como TNFRSF9, 4-1BB ou ILA), CD27 (por exemplo, CDX-1127), HVEM ou CD127, um antagonista, por exemplo, anticorpo antagonista, direcionado contra uma molécula coestimulatória inibidora, por exemplo, CTLA-4 (também conhecido como CD152), PD-1, TIM- 3, BTLA, VISTA, LAG-3, B7-H3, B7-H4, IDO (por exemplo, 1-metil-D-triptofano (também conhecido como 1-D-MT), TIGIT, MICA/B, GITR (por exemplo, TRX518) ou arginase, ipilimumab (também conhecido como MDX-010, MDX- 101 ou YERVOY®), tremelimumab (também conhecido como ticilimumab ou CP-675.206, urelumab (também conhecido como BMS-663513), MGA271, um antagonista direcionado contra um TGF-β, por exemplo, metelimumab (também conhecido como CAT-192), fresolimumab (também conhecido como GC1008), LY2157299k e uma transferência adotiva de uma célula T (por exemplo, uma célula T citotóxica) expressando um receptor de antígeno quimérico (CAR), por exemplo, transferência adotiva de uma célula T compreendendo um receptor TGF-β negativo dominante, por exemplo, um receptordo tipo II TGF-β negativo dominante.
[0367] Em uma modalidade particular, o modificador biológico é um antagonista de ligação ao eixo PD-1. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo PD-1 ou agente terapêutico adicional são administrados antes ou após a administração da molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo PD-1 ou agente terapêutico adicional são administrados simultaneamente com a molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Em algumas modalidades, o antagonista de ligação ao eixo PD-1 é selecionado a partir do grupo que consiste em um antagonista de ligação ao PD-L1 (por exemplo, atezolizumabe (MPDL3280A), YW243.55.S70, MDX-1105, MEDI4736 (durvalumabe) e MSB0010718C (avelumabe)), um antagonista de ligação ao PD-1 (por exemplo, MDX-1106 (nivolumabe), MK-3475 (pembrolizumabe), CT-011 (pidilizumabe), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 (espartalizumabe), REGN2810 (cemiplimabe) e BGB-108) e um antagonista de ligação ao PD-L2 (por exemplo, um anticorpo ou uma imunoadesina).
[0368] Adicionalmente ou alternativamente, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção pode ser coadministrada com um ou mais agentes quimioterapêuticos (por exemplo, como parte de um método para tratar um paciente tendo um distúrbio proliferativo celular, por exemplo, um câncer).
[0369] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para tratar um câncer positivo para HER2. Em uma modalidade, o método compreende administrar um paciente tendo câncer positivo para HER2 uma quantidade eficaz de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção, tal como uma molécula 1Fab-IgG TDB tendo um braço anti-HER2 bivalente e um braço anti-CD3 monovalente. Em uma modalidade específica, o braço anti-HER2 possui um perfil de toxicidade aceitável quando administrado em uma dose eficaz em um paciente. Em uma modalidade, o braço anti-CD3 da molécula 1Fab-IgG TDB com um perfil de toxicidade aceitável é uma fração de ligação ao antígeno anti-CD3 de baixa afinidade. Em uma modalidade, a fração de ligação ao antígeno anti-CD3 do 1Fab-IgG TDB com um perfil de toxicidade aceitável é 40G5c.
[0370] Em uma modalidade particular, o câncer positivo para HER2 é um câncer de mama positivo para HER2 ou câncer gástrico positivo para HER2. O câncer positivo para HER2 (por exemplo, câncer de mama positivo para HER2 ou câncer gástrico positivo para HER2) pode ser caracterizado por células tumorais que expressam HER2 em um número de cópias (por exemplo, um número médio de cópias) de pelo menos 200.000 por célula (por exemplo, pelo menos 250.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 300.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 400.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 500.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos
600.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 700.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 750.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 800.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 900.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 1.000.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 1.200.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 1.500.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 2.000.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 2.500.000 cópias de HER2 por célula, pelo menos 3.000.000 cópias de HER2 por célula ou mais, por exemplo, de 200.000 a 2.000.000 cópias de HER2 por célula, de
300.000 a 1.500.000 cópias de HER2 por célula, de 400.000 a 1.200.000 cópias de HER2 por célula ou de 500.000 a 1.000.000 cópias de HER2 por célula, por exemplo, de 200.000 a 1.000.000 cópias de HER2 por célula (por exemplo, de 200.000 a 250.000 cópias de HER2 por célula, de 250.000 a
300.000 cópias de HER2 por célula, de 300.000 a 400.000 cópias de HER2 por célula, de 400.000 a 500.000 cópias de HER2 por célula, de 500.000 a 750.000 cópias de HER2 por célula ou de 750.000 a 1.000.000 cópias de HER2 por célula) ou de 1.000.000 a 3.000.000 cópias de HER2 por célula (por exemplo, de 1.000.000 a 1.500.000 cópias de HER2 por célula, de 1.500.000 a
2.000.000 cópias de HER2 por célula, de 2.000.000 a 2.500.000 cópias de HER2 por célula ou de 2.500.000 a 3.000.000 cópias de HER2 por célula).
[0371] Em uma modalidade, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2 é coadministrada com um ou mais agentes terapêuticos adicionais que têm como direcionam a via HER. Em uma modalidade, o agente terapêutico que tem direciona a via HER é selecionado a partir de um inibidor de EGFR, um inibidor de HER2, um inibidor de HER3 e/ou um inibidor de HER4. Em uma modalidade, um HER2 TDB (por exemplo, um 1Fab-IgG TDB) é coadministrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais selecionados a partir de trastuzumabe (HERCEPTIN®), T-DM1 (KADCYLA®) e pertuzumabe (PERJETA®). Em uma modalidade, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2/CD3 é coadministrada com trastuzumabe. Em uma modalidade, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2/CD3 é coadministrada com T-DM1. Em uma modalidade, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2/CD3 é coadministrada com pertuzumabe. Em uma modalidade, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2/CD3 é coadministrada com trastuzumabe e pertuzumabe. Em uma modalidade, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica anti-HER2/CD3 é coadministrada com T-DM1 e pertuzumabe.
[0372] Tais terapias combinadas mencionados acima abrangem a administração combinada (na qual dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos nas mesmas ou formulações separadas), e administração separada,
na qual a administração da molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção pode ocorrer antes da administração, simultaneamente e/ou após, do agente ou agentes terapêuticos adicionais. Em uma modalidade, a administração do anticorpo anti-CD3 e a administração de um agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de um mês, ou dentro de uma, duas ou três semanas, ou dentro de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias, de cada uma.
[0373] Uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção (e/ou qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrada por qualquer meio adequado, incluindo via subcutânea, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, transdérmica, intraperitoneal, intraorbital, por implantação, por inalação, intratecal, intraventricular ou intranasal. Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada por via subcutânea. Em outras modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada por via intravenosa. Em algumas modalidades, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica administrada por injeção subcutânea exibe uma resposta menos tóxica em um paciente do que a mesma molécula de ligação ao antígeno biespecífica administrada por injeção intravenosa. A dosagem pode ser por qualquer via adequada, por exemplo, através de injeções, tais como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem incluindo, entre outros, administrações únicas ou múltiplas ao longo de vários períodos de tempo, administração em bolus e infusão de pulsos são contemplados neste documento.
[0374] As moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção podem ser formuladas, dosadas e administradas de uma maneira consistente com as boas práticas médicas. Os fatores a serem considerados neste contexto incluem o distúrbio específico que está sendo tratado, o mamífero específico que está sendo tratado, a condição clínica do paciente, a causa do distúrbio, o local de entrega do agente, o método de administração, o agendamento da administração e outros fatores conhecidos pelos médicos. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica não precisa ser, mas é opcionalmente formulada com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento e de outros fatores discutidos acima. Essas são geralmente usadas nas mesmas dosagens e com vias de administração descritas neste documento, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas aqui, ou em qualquer dosagem e por qualquer via que seja empiricamente/clinicamente determinada como apropriada.
[0375] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada de uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno da invenção (quando usada sozinha ou em combinação com um ou mais outros agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, da gravidade e curso da doença, se a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico do paciente, resposta à molécula de ligação ao antígeno biespecífica e critério do médico assistente. A molécula de ligação ao antígeno biespecífica adequadamente administrada ao paciente de uma vez ou durante uma série de tratamentos.
[0376] Como proposição geral, a quantidade terapeuticamente eficaz da molécula de ligação ao antígeno biespecífica administrada a um humano estará na faixa de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg/kg do peso corporal do paciente, seja por uma ou mais administrações. Em algumas modalidades, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica usada é de cerca de 0,01 a cerca de 45 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 40 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 35 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 30 mg/kg, cerca de 0,01 para cerca de 25 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 20 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 15 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 10 mg/kg, cerca de 0,01 a cerca de 5 mg/kg ou cerca de 0,01 a cerca de 1 mg/kg administrados diariamente, por exemplo. Em uma modalidade, uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica descrita no presente documento é administrada a um ser humano a uma dose de cerca de 100 mg, cerca de 200 mg, cerca de 300 mg, cerca de 400 mg, cerca de 500 mg, cerca de 600 mg, cerca de 700 mg, cerca de 800 mg, cerca de 900 mg, cerca de 1000 mg, cerca de 1100 mg, cerca de 1200 mg, cerca de 1300 mg ou cerca de 1400 mg no dia 1 dos ciclos de 21 dias. A dose pode ser administrada com uma dose única ou em doses múltiplas (por exemplo, 2 ou 3 doses), tais como infusões. Para administrações repetidas por vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento geralmente é mantido até que ocorra a supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo estaria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Assim, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao paciente. Tais doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de tal modo que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo anti-CD3). Pode ser administrada uma dose inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. Em algumas modalidades de acordo com qualquer um dos aspectos anteriores da invenção, o paciente é um humano. VI.KITS
[0377] São fornecidos no presente documento kits incluindo uma ou mais composições descritas aqui (por exemplo, uma composição incluindo qualquer uma ou mais das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas descritas neste documento e um transportador farmaceuticamente aceitável) e uma bula para administrar a composição a um paciente para tratar ou retardar a progressão de um distúrbio (por exemplo, um distúrbio proliferativo celular (por exemplo, câncer de mama,
câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de Hodgkin não linfoma (NHL), linfoma de células B,
leucemia de células B, mieloma múltiplo, câncer renal, câncer de próstata,
câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma, glioblastoma, linfoma difuso de grandes células B do centro germinativo (GCB), linfoma difuso de grandes células B (DLBCL),
DLBCL do tipo de célula B ativado (ABC), linfoma folicular (FL), linfoma de células do manto (MCL), leucemia mielóide aguda (LMA), leucemia linfoide crônica (LLC), linfoma de zona marginal (MZL), leucemia linfocítica pequena (SLL), linfoma linfoplasmocítico (LL), Macroglobulinemia de
Waldenström (WM), linfoma do sistema nervoso central (CNSL), linfoma de
Burkitt (BL), leucemia prolinocítica de células B, linfoma esplênico da zona marginal, leucemia de células cabeludas, linfoma/leucemia esplênico(a),
linfoma esplênico difuso da polpa vermelha de linfócitos B pequenos,
variante de leucemia de células cabeludas, doença das cadeias pesadas α,
doença das cadeias pesadas γ, doença das cadeias pesadas μ, mieloma de células plasmáticas, plasmacitoma solitário do osso, plasmocitoma extraósseo, linfoma do tecido linfoide associado à mucosa (linfoma MALT),
linfoma nodal da zona marginal, linfoma pediátrico da zona marginal nodal,
linfoma folicular pediátrico, linfoma cutâneo primário do centro folicular, linfoma difuso de grandes células b rico em células t/histiócitos, DLBCL primário do sistema nervoso central, DLBCL cutâneo primário (tipo perna),
DLBCL positivo para o vírus Epstein-Barr (EBV) de idosos, DLBCL associado a inflamação crônica, granulomatose linfomatóide, linfoma mediastinal primário de grandes células B, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma de grandes células B positivo para quinase anaplásico (ALK), linfoma plasmático, linfoma de grandes células B surgido na doença de Castleman multicêntrica associada a infecção pelo HHV-8, linfoma primário de efusão, Linfoma de grandes células B, não classificável, com características intermediárias entre linfoma difuso de grandes células B e linfoma de Burkitt ou linfoma de grandes células B, não classificável, com características intermediárias entre linfoma difuso de grandes células B e linfoma de Hodgkin clássico)). Em algumas modalidades, o câncer é um câncer positivo para HER2 (por exemplo, um câncer de mama positivo para HER2 ou um câncer gástrico positivo para HER2). Adicionalmente ou alternativamente, o kit pode incluir uma bula para administrar a composição a um paciente para tratar ou retardar a progressão de um distúrbio autoimune.
E XEMPLOS
[0378] A seguir estão exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras modalidades podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.
E XEMPLO 1
MATERIAIS E MÉTODOS S ÍNTESE DE GENES FAB
[0379] Genes que codificam variantes de anti-HER2 (4D5-8; Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992, 89:4285-4289). Os Fabs foram obtidos por síntese de genes dos domínios variáveis de cadeia leve e cadeia pesada. O anti-HER2.4D5 Fab e as variantes foram produzidos em escala de 30 mL em células Expi293TTM e purificados em lote usando resina de afinidade anti-Flag. Após uma etapa de lavagem de PBS 3x, os Fabs foram eluídos com ácido fosfórico de 50 mM (pH 3,0), neutralizados com PBS 20x (pH 11,0) e filtrados. Todos os Fabs eram ≥95% puros e verificados por espectrometria de massa.
IGG TDB & 1FAB-IGG TDB
[0380] Foram gerados semianticorpos "knob" (anti- HER2.N297G.knob (4D5-8 e variante s); Kelley e O'Connell, Biochemistry, 1993, 32:6828-6835) e hole (anti-CD3.N297G.hole (40G5c, a menos que especificado de outra forma)) como descrito anteriormente (Dillon et al., MAbs, 2017, 9:213- 230). Para construções 1Fab-IgG TDF, a região de codificação para anti-HER2 Fab (E1-T225) precedeu diretamente a região de codificação da sequência anti- HER2.knob e foi sintetizada com ou sem um ligante G4SGG entre elas.
FUSÕES DE LUCIFERASE DE 1FAB-IGG TDB
[0381] A sequência proteica madura para luciferase (AAG54095.1) K18-D185 foi fundida ao terminal C com a cadeia leve anti- HER2.hu4D5. O Anti-HER2.hu4D5 Fab com e sem a fusão de cadeia leve da luciferase produziu cinética de ligação semelhante à HER2 usando um BIACORE® T200 (GE Healthcare) e método descrito abaixo.
EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS
[0382] As fusões de IgG TDB, 1Fab-IgG TDB e Luciferase de 1Fab-IgG TDB foram produzidas como se segue. Meios-anticorpos anti- HER2.hu4D5.knob e variantes e anti-CD3.40G5c.hole foram produzidos em células CHO na escala ≥1L e purificados por MAbSelect SuRe (GE Healthcare).
A montagem biespecífica da fusão de IgG TDB, 1Fab-IgG TDB ou 1Fab-IgG Luciferase TDB a partir de meios-anticorpos foi realizada como descrito em Junttila Cancer Res., 2014, 74:5561-5571; Spiess et al., Nat. Biotechnol., 2013, 31:753-758.
ANÁLISE POR WESTERNBLOT DE HER2
[0383] Os lisados celulares foram gerados usando o tampão de lise da Cell Signaling Technology. A proteína foi quantificada usando reagentes de ensaio BCA (Pierce Cat., nºs 23228 e 23224). 40 µg de proteína foram carregados em géis de SDS-PAGE e um anticorpo HER2 (Dako Cat., nº A0485) foi usado para detecção.
IMUNO-HISTOQUÍMICA (IHC)
[0384] A imuno-histoquímica para HER2 foi realizada em amostras de tecido de 5 μm corrigidas em formalina e embebidas em parafina e amostras de microarranjo de tecidos (TMA) com anticorpo primário monoclonal de coelho anti-Her-2/neu (Ventana Medical Systems, clone 4B5, Tuscan, AZ) usando o sistema Ventana Ultraview-Benchmark com detecção Ventana DAB.
Os resultados da coloração foram pontuados como 0, 1+, 2+ ou 3+, usando as diretrizes clínicas de classificação de HER2 recomendadas pela ASCO-CAP.
HIBRIDIZAÇÃO FLUORESCENTE IN SITU (FISH) SONDAS
[0385] Uma sonda HER2 FISH aprovada comercialmente e aprovada pela FDA (PathVysion, Abbott Molecular) foi usada pela Core Diagnostics para a análise da linhagem celular TMA. O cocktail PathVysion HER- 2 DNA Probe consiste em duas sondas de DNA rotuladas. A sonda LSI HER2 que abrange todo o gene HER2 está marcada no SpectrumOrange. A sonda CEP17 é marcada no SpectrumGreen e hibrida com o DNA satélite alfa localizado no centrômero do cromossomo 17 (17p11.1-q11.1). A inclusão da sonda CEP17 permite determinar o número de cópias relativo do gene HER2.
ENSAIO
[0386] Seções de FFPE de cinco μm de espessura do bloco TMA foram submetidas à análise de FISH, como descrito anteriormente com modificações. Após a incubação durante a noite a 56ºC, as lâminas foram desparafinadas em três lavagens de CitroSolv por cinco minutos cada, desidratadas por duas lavagens com álcool e secas ao ar. Posteriormente, as seções de FFPE foram incubadas em um reagente de pré-tratamento (Abbott Molecular, IL) por 30 minutos a 80ºC e, em seguida, tratadas com Protease II (Abbott Molecular, IL) antes de lavagens adicionais em água e uma série de etanol. As lâminas secas foram então codesnaturadas a 76°C por seis minutos com as sondas e foram hibridizadas durante a noite a 37°C (ThermoBrite; Abbott Molecular). As lavagens pós-hibridação e a coloração de contraste foram realizadas de maneira semelhante às descritas anteriormente.
[0387] As seções foram visualizadas usando microscópios de fluorescência equipados com sistemas de imageamento controlados por computador (BioView Duet, BioView Ltd.). Um mínimo de 50 células tumorais não sobrepostas de cada amostra foi enumerado para sinais de hibridação de HER2 e CEP17. Os atuais critérios e diretrizes de classificação de HER2 foram usados para a análise das lâminas. Uma linhagem celular foi considerada positiva para FISH se tivesse uma razão de HER2 para CEP17 de dois ou mais ou um número médio de cópias de HER2 de mais de seis sinais por núcleo em células com uma razão de HER2 para CEP17 inferior a dois. Amostras com uma razão HER2 para CEP17 inferior a dois e um número médio de cópias HER2 inferior a quatro sinais por núcleo foram consideradas negativas e amostras com uma razão HER2 para CEP17 inferior a dois e um número médio de cópias HER2 entre quatro a seis sinais por núcleo foram consideradas ambíguas.
ENSAIOS DE LIGAÇÃO CELULAR À HER2 LIGAÇÃO CELULAR DE FUSÕES DE LUCIFERASE DE 1FAB-IGGS - ENSAIO DE LIGAÇÃO DIRETA:
[0388] As células (SKBR3: 40.000 por poço, MCF7: 200.000 por poço) foram plaqueadas em 96 placas brancas tratadas com cultura de tecidos estéreis com fundo plano (Thermo Scientific; Cat #136101) e deixadas aderir durante a noite. As células foram então lavadas com tampão de ligação (PBS + BSA a 3% + azida de sódio a 0,05%; pH 7,2) e concentrações variadas (0,002 nM - 100 nM) de proteínas de fusão de luciferase TDB em tampão de ligação foram adicionadas a cada poço. As placas foram então incubadas a 4°C por quatro horas e subsequentemente lavadas três vezes com tampão de ligação.
Após a lavagem final, foram adicionados 20 μl de tampão de ligação contendo 50 μl do substrato da luciferase (New England Biolab, Cat #E3300L) a cada poço. Os valores de luminescência foram lidos no leitor de placas Perkin Elmer Envision. Os dados de ligação foram ajustados usando o modelo GraphPad Prism, "One Site Specific Binding" para determinar a afinidade de ligação do anticorpo.
LIGAÇÃO CELULAR DE FUSÕES DE LUCIFERASE DE 1FAB-IGGS - ENSAIO DE LIGAÇÃO POR COMPETIÇÃO:
[0389] As células foram plaqueadas e lavadas como descrito acima. Para medir a ligação competitiva, uma concentração corrigidas de uma proteína de fusão de luciferase TDB (15 nM de 4D5-WT ou 50 nM de 4D5-H91A) foi misturada com concentrações crescentes de TDB (0,007 nM-400 nM) no tampão de ligação e adicionada às células. As placas foram incubadas por quatro horas a 4°C, lavadas e lidas como descrito acima. Os dados de ligação foram ajustados usando o modelo GraphPad Prism, "One Site-Fit Ki" para determinar a afinidade de ligação do anticorpo.
LIGAÇÃO CELULAR POR CITOMETRIA DE FLUXO
[0390] As células MCF7 e SKBR3 foram plaqueadas a
100.000 células por poço em placas de U de 96 poços em 50 µL de tampão FACS (1% de BSA, 2 mM de EDTA em PBS). Os artigos de teste foram diluídos em série de 1:5 em tampão FACS, começando em 50 µg/mL ou 10 µg/mL, e incubados com células em gelo por 30 minutos. As células foram lavadas duas vezes com tampão FACS e ressuspensas em 100 µL de fragmento Fcγ IgG anti-humano Alexa 647 de cabra (Jackson ImmunoResearchde nº 109-606-098), a uma diluição de 1:200, em tampão FACS, e incubadas em gelo por 30 minutos. As células foram ressuspensas em 100 µL de tampão FACS contendo iodeto de propídio (PI; eBioscience #00-6990-50) a uma diluição de 1:100 e analisadas no FACSCaliber BD.
F RACIONAMENTO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS
[0391] As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram separadas do sangue de voluntários saudáveis usando meio de separação de linfócitos (MP Biomedicals). As células CD8 + foram extraídas de PBMC usando o Kit de Isolação de CD8 + humana (Miltenyi Biotec, nº 130-094-156) por seleção negativa.
ATIVAÇÃO DE CÉLULA T
[0392] Todos os anticorpos para coloração de células por citometria de fluxo foram obtidos da BD Biosciences (San Jose, CA). As PBMC humanas e as células alvo (razão 10:1) foram incubadas na presença do artigo de teste por 24 horas em placa com fundo p lano de 96 poços (BD). Após a incubação, as células foram transferidas para uma nova placa com fundo em V de 96 poços. As células foram coradas com anti-CD8-FITC, anti-CD69-PE e anti-CD25-APC. A expressão da superfície CD69 e CD25 foi detectada nas células T CD8+ por citometria de fluxo. A porcentagem de CD8+CD69+CD25+ foi relatada como ativação de células T. Para determinar a ativação de células T independentes de HER2, as células repórter Jurkat-Dual NF-κΒ/IRF (Invivogen Cat #jktd-isnf) foram incubadas a 37° C com anticorpo TDB ou OKT CD3 por 24 horas. 10 μL de sobrenadante foram removidos de cada poço e adicionados a uma placa branca com fundo claro de 96 poços. Foram adicionados 100 μL de solução Quantiluc (Invivogen) aos sobrenadantes colhidos e as placas foram lidas no leitor de placas Perkin Elmer Envision.
APOPTOSE IN VITRO
[0393] As células alvo foram plaqueadas a 10.000 células por poço em meio de cultura em uma placa preta com fundo transparente de 96 poços (Corning nº 3904) e colocadas a 37°C, em incubador de CO 2 a 5% durante a noite. O artigo de teste, 50.000 células CD8 + purificadas e uma diluição 1:1000 do reagente Caspase 3/7 (Essen nº4440) foram adicionados às células pré-plaqueadas e colocadas na ampliação do Incucyte. As imagens foram coletadas a cada quatro horas durante 40 horas e analisadas quanto ao número de eventos apoptóticos por mm 2.
V IABILIDADE CELULAR
[0394] As células foram cultivadas até confluência em RPMI suplementado com 10% de FBS, penicilina (100 U/mL), estreptavidina (100 µg/mL) e L-glutamato (0,2 mM). As células foram dissociadas com meio de dissociação de células à base de PBS e plaqueadas em placas pretas com fundo claro de 96 poços a uma densidade de 10.000 células por poço. No quarto dia, o meio foi descartado e as placas foram lavadas duas vezes com PBS. Adicionaram-se 100 µL de reagente de viabilidade celular luminescente CELLTITER-GLO® (Promega Cat. nº G7570) e as placas foram lidas no luminômetro, conforme descrito nas instruções.
P ROLIFERAÇÃO CELULAR DE CÂNCER DE MAMA
[0395] As células CD8 + foram usadas como efetores na razão efetor:alvo de 3:1. A proliferação/viabilidade celular de câncer de mama foi detectada usando o ensaio de viabilidade celular luminescente CELLTITER-GLO® (Promega). Para o ensaio, 15 x 10 3 células por poço foram plaqueadas em placas de 96 poços e incubadas durante a noite para fixação das células antes dos tratamentos.
EFICÁCIA IN VIVO
[0396] Camundongos fêmeas NOD scid gama (NSG) foram obtidos da The Jackson Laboratory. PBMC humanas foram usadas como células efetoras nos camundongos. As PBMC foram purificadas a partir do sangue de doadores saudáveis usando o Meio de Separação de Linfócitos (MP Biomedical, LLC, Salon, Ohio) e criopreservadas a -80°C. Antes da transferência para camundongos, as PBMCs foram descongeladas e cultivadas durante a noite em 10% de FBS contendo meio RPMI a 37°C, CO2 a 5%. As PBMCs foram inoculadas em camundongos intraperitonealmente, um dia após a inoculação de células tumorais a uma concentração de 10 × 10 6 células por camundongo, em um volume de 100 µL de tampão de solução salina balanceada de Hank (HBSS). Para avaliar a eficácia no tratamento do câncer de mama amplificado com HER2, os animais foram inoculados com 3 × 10 6 células tumorais KPL-4 em HBSS/MATRIGEL® por administração subcutânea na almofada de gordura mamária torácica direita. Para avaliar a atividade no tratamento de tumores com baixa expressão de HER2, os animais foram inoculados subcutaneamente com 5 × 106 células tumorais HT55 em HBSS.
Tratamentos de dose única foram administrados por via intravenosa no dia 0, como indicado nas legendas da Figura.
ESTUDO DE SEGURANÇA E FARMACOCINÉTICA (PK) DE MACACOS CYNOMOLGUS
[0397] Onze macacos cynomolgus fêmeas (Macaca fascicularis; idades e pesos no início da dosagem variando de 24 a 60 meses e 2 a 5 kg) foram divididos aleatoriamente em três grupos. Os animais receberam controle de veículo (N = 3) ou anti-HER2-CD3 4D4-H91A 1Fab-IgG TDB a 3 mg/kg (N = 3) ou TDB a 20 mg/kg (N = 5) por infusão intravenosa de uma hora a um volume de dois mL/kg/hora. Os animais foram monitorados duas vezes ao dia em busca de anormalidades e sinais de dor ou angústia. Pontos finais adicionais incluíram consumo de alimentos, pesos corporais, exames físicos, temperatura corporal, frequência respiratória e frequência cardíaca.
ANÁLISE PK
[0398] O sangue do macaco cynomolgus foi coletado em vários momentos do estudo para avaliar a farmacocinética. Foi permitido que o sangue coagulasse à temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. As amostras foram centrifugadas a cerca de 1500-2000 x g a 2-8°C dentro de uma hora após a coleta. O soro foi coletado conforme armazenado de -60°C a -80°C até ser enviado para análise. As amostras de PK no soro foram analisadas por GRIP ELISA (Yang et al., Journal of Immunological Methods, 2008, 335:8-20).
Os perfis séricos de concentração-tempo foram usados para estimar os seguintes parâmetros de farmacocinética usando análise não compartimental (WinNonlin, versão 5.2.1; Pharsight Corporation, Mountain View, CA): exposição total ao fármaco definida como área sob a curva sérica concentração-tempo (AUC), depuração de anticorpos (CL) e concentração sérica máxima observada (Cmax). Cada animal foi analisado separadamente e os resultados para cada grupo de dose foram sumarizados como média ± desvio padrão (DP).
PATOLOGIA CLÍNICA
[0399] Pelo menos duas vezes durante a fase de pré-dose e nos dias 2 e 8 do estudo, o sangue foi coletado em tubos contendo o citrato de sódio anticoagulante para testes de coagulação ou EDTA de potássio para testes de hematologia.
BIACORE®
[0400] A cinética de ligação dos anticorpos anti-HER2 Fabs ou anti-HER2/CD3 dependentes de células T (TDB) foi medida usando ressonância plasmônica de superfície em um instrumento BIACORE® T200 ou 8K (GE Healthcare). Todas os experimentos de cinética foram realizados a uma taxa de fluxo de 30 µL/minutos a 37°C, e com um tampão de 10 mM de HEPES, pH 7,2, 150 mM de NaCl, 0,05% de Tween 20 e 1 mM de EDTA (tampão HBS-EP). O domínio extracelular de HER2 humana (ECD; Sino Biologicals 10004-H08H ou Novus Biologicals NBP1-94702) ou a HER2 de macaco cynomolgus ECD foram imobilizados em um chip sensor CM5 por meio de acoplamento à base de amina. Para a HER2 ECD humana, foi usada uma série de concentrações multiplicadas por 3 de anti-HER2 Fabs ou TDBs, variando de 0,27 a 200 nM, para analisar a ligação. Para a HER2 ECD de macaco cynomolgus, foi usada uma série de concentrações de 1,5 vezes de anti-HER2 Fabs, variando de 87,8 a 1000 nM para analisar a ligação.
Sensorgramas para ligação de HER2 foram registrados usando um tempo de injeção de 180 segundos, seguido por 300 segundos de tempo de dissociação e regeneração da superfície com HCl a 50 mM. Todos os sensorgramas observados para a ligação ao antígeno aos anticorpos foram analisados usando uma ligação Langmuir de 1:1, com exceção das variantes 4D5 Fab que se ligam à HER2 de macaco cynomolgus, que usaram um modelo de ligação em estado estacionário para calcular a cinética e constantes de ligação. Devido ao requisito de altas concentrações de Fab para medir afinidades fracas à HER2 de macaco cynomolgus, todas as variantes de Fab foram trocadas por tampão para tampão HBS-EP antes do experimento, a fim de evitar efeitos tamponizados e garantir medições precisas. A massa de todas as variantes 4D5 foi verificada por espectrometria de massa.
EXEMPLO 2 A AFINIDADE DE HER2 DO ANTI-HER2/CD3 IGG TDB TEM UM EFEITO DIRETO NA ATIVIDADE DE MATAR, MAS NÃO NA SELETIVIDADE PARA CÉLULAS QUE SUPEREXPRESSAM HER2.
[0401] Os anticorpos biespecíficos anti-HER2/CD3 que são monovalentes para cada braço de ligação demonstraram ter uma atividade robusta nos modelos de câncer de mama in vitro e in vivo amplificados por HER2. No entanto, este formato IgG TDB também retém atividade de baixo nível contra linhagens celulares que expressam baixos níveis de HER2, semelhante às células epiteliais humanas normais positivas para HER2. É desejável aumentar a seletividade de anti-HER2/CD3 TDB para células amplificadas por HER2, a fim de minimizar o risco de atividade fora do tumor, no alvo, e assim aumentar o índice terapêutico do TDB direcionado a HER2.
Inicialmente, o impacto da afinidade de HER2 na seletividade da IgG TDB para células amplificadas por HER2 foi investigado. Geraram-se múltiplas variantes de anti-HER2 4D5 com afinidades de ligação monovalentes como Fabs variando de 0,3 a 213 nM (Tabela 4). Para todas as variantes, o principal fator de afinidade reduzida foi o aumento (ou seja, mais rápido) da taxa de dissociação (kd), enquanto a taxa de associação (ka) permaneceu inalterada.
TABELA 4 AFINIDADES DE LIGAÇÃO MONOVALENTES DE VARIANTES 4D5. Razão de KD ka kd KD Anti-HER2 (4D5) Fab (Variante/WT (1/Ms, 1E+5) (1/s, 1E-3) (nM) ) WT (trastuzumabe) 8,74 ± 1,74 0,25 ± 0,03 0,30 ± 0,01 1,0 Y102V 9,28 ± 0,34 0,30 ± 0,02 0,32 ± 0,03 1,1 Y55E.Y102V 5,83 ± 1,04 1,43 ± 0,10 2,60 ± 0,34 8,7 Y55E.D98A.F100A.Y102V 11,5 ± 3,34 15,6 ± 2,58 14,0 ± 2,08 47 D98A.F100A.Y102V 10,1 ± 1,47 22,8 ± 2,12 22,7 ± 2,07 76 H91A 7,07 ± 2,43 33,6 ± 6,54 49,3 ± 8,57 164 Y55E.H91A 5,10 ± 0,20 87,5 ± 3,60 172 ± 13,2 573 Y100aA 4,61 ± 1,27 91,9 ± 11,2 213 ± 81,8 710 N30A.H91A 5,75 ± 0,56 201 ± 19,1 353 ± 62,7 1177
[0402] Para o teste de seletividade primária, SKBR3 e MCF7 foram usados como linhagens celulares modelos. SKBR3 é uma linhagem celular de câncer de mama amplificada por HER2, enquanto MCF7 é uma linhagem celular de câncer de mama que expressa baixos níveis de HER2 (Figura 1), semelhantes aos níveis detectados em células não cancerígenas, tais como cardiomiócitos cultivados (Junttila et al., Cancer Res, 74 (19):5561- 5571, 2014). O número de cópias da membrana celular de HER2 nas células SKBR3 e MCF7 foi relatado como 2 × 106 por célula e 1,5 × 104 por célula, respectivamente (Aguilar et al., Oncogene, 18(44):6050-6062, 1999). A diminuição da afinidade de ligação à HER2 reduziu gradualmente a atividade de morte do anti-HER2 IgG TDB nas linhagens celulares SKBR3 e MCF7 (Figuras 2A a 2F). A atividade de matar foi praticamente abolida com IgG TDBs tendo uma afinidade para HER2 de 49 nM ou superior. Níveis semelhantes de diminuição da atividade foram observados nas células SKBR3 e MCF7. Em suma, a afinidade monovalente de HER2 desempenha um papel fundamental na atividade do anti-HER2/CD3 IgG TDB, mas não afetou a seletividade para as células que superexpressam HER2.
EXEMPLO 3 DISTINGUINDO O EFEITO DA LIGAÇÃO BIVALENTE DE HER2 DE BAIXA AFINIDADE NA SELETIVIDADE PARA CÉLULAS QUE SUPEREXPRESSAM HER2
[0403] Anticorpos tendo ligação bivalente à HER2 e ligação monovalente à CD3 (formato 1Fab-IgG TDB) foram construídos com base em variantes de afinidade monovalente de 4D5 (Figura 3). Os 1Fab-IgG TDBs foram testados quanto à ligação celular às células SKBR3 (Figuras 4A e 7A) e às células MCF7 (Figuras 4B e 7B) e quanto à capacidade de mediar a apoptose (Figuras 5A e 5B) e matar (Figuras 6A a 6C e 8) as células SKBR3 e MCF7. Múltiplas variantes 4D5 1Fab-IgG TDB demonstraram ligação semelhante às células SKBR3 e MCF7 em comparação com um IgG TDB de controle com um braço monovalente HER2 de alta afinidade baseado em 4D5 do tipo selvagem (trastuzumabe; Figuras 4A e 4B). As substituições
Y55E.H91A, Y100aA ou N30A.H91A (KDs monovalentes de 172, 213 e 353 nM, respectivamente) resultaram em uma ligação celular substancialmente reduzida no formato 1Fab-IgG TDB em comparação com o formato IgG TDB de alta afinidade monovalente de HER2(Figuras 7A e 7B). A ligação mais baixa foi refletida na morte substancialmente reduzida de células SKBR3 (Figura 8). As substituições Y102V e Y55E.Y102V (KD monovalente de 0,3 e 2,6 nM, respectivamente) no formato 1Fab-IgG TDB resultaram em ligação semelhante às linhagens celulares SKBR3 e MCF7 em comparação com o IgG TDB de controle (Figuras 4A e 4B). Consistente com a ligação celular, as variantes 1Fab-IgG TDB Y102V e Y55E.Y102V demonstraram potência substancial na morte de células MCF7 com baixa expressão de HER2, sugerindo que essas modificações não aprimoraram a seletividade para as células que superexpressam HER2 (Figuras 5A, 5B, 6B e 6C).
[0404] Duas variantes 4D5, D98A.F100A.Y102V e H91A (KD monovalente de 23 e 49 nM, respectivamente) mantiveram alta ligação celular às células SKBR3, demonstrando somente uma ligação mínima às células MCF7 (Figuras 4A, 4B, 5A e 5B). Essa ligação celular foi refletida na atividade de matar. Em particular, as variantes 1Fab-IgG TDB D98A.F100A.Y102V e H91A induziram apoptose e morte potentes de células SKBR3, mas não conseguiram mediar a morte de células MCF7 que expressam HER2, apesar de concentrações muito altas (50 ng/mL a 50 µg/mL). Foi relatado que a atividade in vitro do HER2-IgG TDB de alta afinidade monovalente de HER2 saturou a uma concentração de ~10 ng/mL (Junttila et al., Cancer Res., 74(19):5561-5571, 2014). Esses resultados sugerem que a avidez aperfeiçoada do 1Fab-IgG TDB, em relação aos anticorpos convencionais, pode permitir maior seletividade às células que superexpressam HER2. A janela para afinidade monovalente (KD) resultando em maior seletividade estava na faixa de 20 a 50 nM, medida como Fabs. Uma redução menor na afinidade não aprimora a seletividade e uma redução maior na afinidade compromete significativamente a potência do TDB.
EXEMPLO 4 DISTINGUINDO A SELETIVIDADE APRIMORADA DO FORMATO 1FAB-IGG TDB PARA CÉLULAS QUE SUPEREXPRESSAM HER2
[0405] A variante H91A-1Fab-IgG TDB de 4D5 foi selecionada para analisar melhor a atividade in vitro. Um estudo de resposta à dose demonstrou que a atividade de 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB nas células SKBR3 era quase idêntica em comparação com IgG TDB de alta afinidade monovalente para HER2 (Figura 9; EC50 de 6,9 e 6,3 pM, respectivamente). Em contraste com o IgG TDB, não foi observada atividade em nenhum nível de dose de 1Fab-IgG TDB contra células MCF7 (Figura 9). 90 linhagens celulares de câncer de mama foram arbitrariamente divididas em altas (> 400 leituras normalizadas por kilobase de comprimento de transcrição por milhão de leituras mapeadas (nRPKM)), médias (50 a 400 nRPKM) e baixas (<50 nRPKM). Células que expressam HER2 com base na expressão de HER2-RNA relatadas em Klijn, 2015, (Figura 10; Klijn et al., Nat. Biotechnol., 33(3):306- 312, 2015). Os estudos de seletividade foram estendidos para 15 linhagens celulares com níveis variáveis de expressão de HER2. A um nível de dose alto (50 ng/mL), não foi observada correlação clara entre a ativação de células T e a expressão de HER2 para o IgG TDB de alta afinidade monovalente de HER2 (Figuras 11A a 11D). Em contraste marcante, a ativação de células T foi induzida apenas nas linhagens celulares com o nível de expressão mais alto de HER2 quando foi testada a variante de afinidade H91A 1Fab-IgG TDB (Figuras 12A a 12D). Da mesma forma, a morte de células alvo foi limitada a altas linhagens celulares que expressam HER2 com a molécula 1Fab-IgG TDB, enquanto o IgG TDB de alta afinidade de HER2 também foi amplamente ativo na indução da morte de células com baixa expressão de HER2 quando usadas em altos níveis de dose (Figuras 11A a 11D e 12A a 12D). Uma dose de 50 ng/mL de IgG TDB de controle induziu a ativação de células T e a morte de células com baixa expressão de HER2, enquanto um 1Fab-IgG TDB de 50 µg/ml não afetou a viabilidade de células com baixa expressão de HER2.
Portanto, o aprimoramento na seletividade das moléculas 1Fab-IgG TDB em relação ao IgG TDB de controle para HER2 foi calculado em ≥1000 vezes.
[0406] A atividade foi ainda testada em linhagens celulares humanas não cancerígenas derivadas de pulmão, pele e tecidos mamários. A expressão com baixo nível de HER2 foi confirmada em todas as células não cancerígenas testadas por citometria de fluxo. A Tabela 5 mostra uma distinção dessas células e a ligação de IgG TDBs e 1Fab-IgG TDB.
TABELA 5
LIGAÇÃO A CÉLULAS HUMANAS NÃO CANCERÍGENAS COM BAIXA EXPRESSÃO DE HER2. Linhagem HER2 IgG TDB IgG TDB 1Fab-IgG Origem do tecido Celular MFI* EC50 MED** TDB MED** Nenhuma Nenhuma Nenhuma MRC-5 Pulmão normal 74 atividade atividade atividade Nenhuma HBL-100 Epitelial 60 2 ng/mL 5 ng/mL atividade Nenhuma Nenhuma Nenhuma BEAS-2B Pulmão normal 33 atividade atividade atividade Nenhuma Hs 888.Sk Pele normal 35 7 ng/mL 50 ng/mL atividade hTERT- Mama normal + Nenhuma 9 32 ng/mL 50 ng/mL HME1 hTERT atividade Lábio de Nenhuma Nenhuma Nenhuma Kd 46 fibroblasto normal atividade atividade atividade Prepúcio endotelial Nenhuma Nenhuma HMEC-1 15 50 ng/mL microvascular atividade atividade *MFI = intensidade média de fluorescência **MED = Nível mínimo de dose eficaz
[0407] A variante de afinidade H91A 1Fab-IgG TDB não demonstrou atividade apoptótica contra qualquer uma das 8 células testadas em concentrações ≤ 5 µg/mL. Uma comparação representativa das curvas de resposta à dose entre 1Fab-IgG TDB e IgG TDB cultivadas com células HBL-100 mostra que o H91A-IgG TDB mata potencialmente células HBL-100 com baixa expressão de HER2, em contraste com o H91A-1Fab-IgG TDB (Figura 13). Os ensaios cinéticos confirmam a dependência da dose de H91A-IgG TDB na morte de HBL-100 ao longo do tempo e demonstram ainda que a morte induzida por H91A-1Fab-IgG TDB é mínima ao longo de 70 horas (Figuras 14A e 14B). Estes resultados demonstram que a potência in vitro do 1Fab-IgG TDB é semelhante ao TDB IgG de alta afinidade monovalente para HER2 na morte de linhagens celulares que expressam HER2. No entanto, 1Fab-IgG TDB não teve atividade detectável em nenhuma linhagem celular com baixa expressão de HER2 testada, sugerindo que é seletiva para células que superexpressam HER2.
[0408] O limiar do nível de expressão de HER2 necessário para a atividade da variante de afinidade de H91A 1Fab-IgG TDB foi então investigado.
Após incubação de 1Fab-IgG TDB com 13 linhagens celulares alvo tendo vários perfis de expressão de HER2, foi observada a morte em células alvo que expressam HER2 a um número de cópias superior a 200.000 moléculas de HER2 por célula (Figura 15A). Em particular, foi detectada uma atividade de morte robusta em todas as linhagens celulares que expressam RNA HER2 ≥ 489 nRPKM (isto é, linhagens celulares que expressam HER2 com um número de cópia ≥ 290.579). A atividade mínima foi detectada em todas as linhagens celulares que expressavam RNA HER2 ≤ 260 nRPKM (isto é, linhagens celulares que expressam HER2 com um número de cópia ≤ 146.208). O número de cópias de HER2 para cada linhagem celular foi quantificado por FACS usando esferas Quantum-Alexa647 MESF, e os resultados estão sumarizados na Tabela 6, abaixo.
TABELA 6 NÚMERO DE CÓPIAS DE HER2 DE VÁRIAS LINHAGENS CELULARES TESTADAS PARA A MORTE DE 1FAB-IGG TDB Número médio de Desvio % do Desvio Linhagem Celular cópias HER2 Padrão Padrão
Número médio de Desvio % do Desvio Linhagem Celular cópias HER2 Padrão Padrão HCC1187 38.436 3.238 8% NCI-H522 26.954 198 1% VP267 70.761 7.515 11% EFM-19 38.479 51 0% ZFR-75-1 58.337 18.222 31% NUGC-4 59.298 3.020 5% YMB-1 69.655 964 1% SNU-216 175.357 1.819 1% OE-33 146.208 68.969 47% EFM-192C 290.579 34.503 12% HCC202 368.513 82.560 22% SKBR3 774.501 109.335 14% Calu-3 525.657 42.062 8% HT55 26.337 1.157 4% KPL4 636.978 31.743 5% CHO-K1 0 0 0%
[0409] A atividade foi ainda comparada aos testes de diagnóstico de HER2 que são validados clinicamente e usados para a seleção de pacientes. Das 20 linhagens celulares testadas em células, observou-se atividade substancial de morte apenas nas linhagens celulares IHC 3+, FISH+, usando a variante de afinidade H91A 1Fab-IgG TDB (Figuras 15B e 15C).
EXEMPLO 5 AVALIAÇÃO DA SELETIVIDADE IN VIVO DE 1FAB-IGG TDB PARA TUMORES QUE SUPEREXPRESSAM HER2
[0410] A atividade in vivo da variante de afinidade H91A 1Fab- IgG TDB foi avaliada. Os camundongos NSG suplementados com PBMC humano foram enxertados com tumores KPL4 amplificados com HER2 ou tumores HT55, que expressaram um nível semelhante de HER2 conforme as células MCF7 (Figura 16). O H91A-1Fab-IgG induziu regressões de dose em resposta a uma dose única de 0,5 a 5 mg/kg (Figura 17), enquanto o IgG TDB de alta afinidade monovalente para HER2 induziu regressões na dose de 0,05 mg/kg, indicando que o 1Fab- O IgG TDB é cerca de 10 vezes menos ativo in vivo. Como esperado, com base nos resultados in vitro, menos atividade foi detectada no tratamento de tumores HT55 (Figura 18). O IgG TDB de alta afinidade monovalente de HER2, induziu regressões no tumor HT55 na dose única de 0,1 mg/kg. O H91A-1Fab-IgG TDB não apresentou atividade antitumoral no tratamento de tumores HT55 em doses ≤ 50 mg/kg. Estes resultados demonstraram que ambas as moléculas eram altamente potentes no tratamento de tumores amplificados com HER2 e fornecem suporte para um índice terapêutico positivo com base no nível de expressão de HER2 no câncer amplificado com HER2. O H91A-1Fab-IgG TDB HER2 TDB demonstrou seletividade ≥ 100 vezes in vivo para tumores amplificados com HER2 em comparação com tumores que expressam níveis normais e baixos de HER2 (por exemplo, semelhantes aos tecidos humanos normais).
EXEMPLO 6 AJUSTANDO A AFINIDADE DE HER2 PARA APERFEIÇOAR A SELETIVIDADE
[0411] Duas variantes de 4D5, D98A.F100A.Y102V e H91A (KD monovalentes de 23 e 49 nM, respectivamente), que demonstraram seletividade aprimorada no formato 1Fab-IgG TDB, foram selecionados para distinção estendida, a fim de identificar a afinidade ideal e obter seletividade máxima para células que superexpressam HER2. Em um ensaio de resposta à dose in vitro contra células SKBR3, as variantes D98A.F100A.Y102V e H91A demonstraram atividade quase idêntica (Figura 20). Ambas as moléculas demonstraram atividade antitumoral robusta em doses de 0,5 mg/kg no tratamento de xenoenxertos do tumor KPL4 amplificado com HER2 (Figuras 17 e 19). Os ensaios de atividade in vitro foram estendidos por tratamento de várias linhagens celulares que expressam níveis altos, médios ou baixos de HER2 com uma alta concentração (50 ng/mL) de variantes 1Fab-IgG TDB, H91A-1FabIg (Figuras 21A, 23A e 25A) e D98A.F100A.Y102V (Figuras 21B, 23B e 25B). As respostas das linhagens celulares foram geralmente semelhantes às duas moléculas. No entanto, foi observada uma tendência clara em que a potência da variante D98A.F100A.Y102V era maior em comparação com a variante H91A (Figuras 22, 24 e 26). Como esta tendência foi detectável em células com baixa expressão de HER2, foi determinado que a substituição de H91A na 4D5 HVR que liga HER2 a KD monovalente de 49 nM resultou em seletividade máxima às células que superexpressam HER2.
EXEMPLO 7
DISTINGUINDO O EFEITO DO COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA DE LIGANTE
[0412] Para quantificar o efeito do comprimento da sequência de ligantes que funde os anti-HER2 Fabs na ligação e atividade bivalentes à HER2 de cadeia pesada, testaram-se duas sequências de ligantes (Figura 27A). Todas as moléculas 1Fab-IgG TDB em experimentos anteriores incluíram a sequência de ligantes estendida (DKTHTGGGGSGG, SEQ ID NO: 52), incluindo a sequência natural de DKTHT (SEQ ID NO: 50) derivada da dobradiça superior de IgG1 do Fab distal, seguida por uma extensão GGGGSGG (SEQ ID NO: 51). A sequência de ligantes estendida foi comparada a uma molécula 1Fab-IgG TDB tendo um ligante da sequência natural de DKTHT (SEQ ID NO: 50). O impacto dos ligantes foi testado usando H91A-1Fab-IgG TDB. Não foi observada diferença na ligação às células SKBR3 ou MCF7 (Figuras 27B e 27C). A resposta à dose in vitro na morte de SKBR3, bem como a tela de atividade da linhagem celular mais ampla, demonstraram atividade quase idêntica entre as variantes. A variante de ligante natural teve desempenho semelhante no tratamento de xenoenxertos dos tumores KPL4 e HT55, em relação ao ligante estendido. Estes dados sugerem que o anti-HER2 1Fab- IgG TDB tendo afinidades monovalentes para HER2 que variam de KD de 23 nM a 49 nM exibem perfis de atividade favoráveis. Nestes estudos, a máxima seletividade para células que superexpressam HER2 foi alcançada usando a variante H91A 4D5 (K D de 49 nM).
EXEMPLO 8
O EFEITO DE ANTISSINALIZAÇÃO DE CÉLULAS T INDEPENDENTES DO TRASTUZUMABE É ATENUADO NA MOLÉCULA 1FAB-IGG TDB COM LIGAÇÃO BIVALENTE DE BAIXA AFINIDADE À HER2
[0413] A ligação do trastuzumabe à HER2 superexpressada nas células cancerígenas amplificadas por HER2 resulta na interferência robusta da sinalização PI3K independente do ligante constitutivo iniciada pelo complexo desregulado HER2-HER3 (Junttila et al., Cancer Res., 74 (19):5561-5571, 2014). A molécula de 1Fab-IgG TDB se liga à HER2 na forma bivalente. O tratamento in vitro de células SKBR3 com incubação com 1Fab-IgG TDB resultou na redução transitória não durável de pAKT, sem efeito detectável na fosforilação de HER3 (Figura 28A). Além disso, nem o IgG TDB de alta afinidade monovalente de HER2, nem o 1Fab-IgG TDB de baixa afinidade bivalente para HER2 afetaram substancialmente a proliferação/viabilidade das células SKBR3 (Figura 28B). Em suma, a ligação bivalente de baixa afinidade ao HER2 não inibe a proliferação de células amplificadas por HER2.
EXEMPLO 9 COMBINANDO VARIANTES DE ANTICORPO 4D5 COM VARIANTES CORRIGIDAS DE
DEFICIÊNCIA
[0414] Para aperfeiçoar a estabilidade das variantes de afinidade de anticorpos 4D5, foram introduzidas correções de deficiência. Para reduzir a desaminação, o resíduo de cadeia leve 4D5 N30 foi substituído por um resíduo de serina (N30S) e o resíduo de cadeia pesada 4D5 N54 foi substituído por um resíduo de ácido glutâmico (N54E). Para reduzir a isomerização, o resíduo de cadeia pesada 4D5 D98 foi substituído por um resíduo de alanina (D98A) e/ou um resíduo de treonina (D98T). Afinidades de ligação do Fab do tipo selvagem 4D5 e variantes de afinidade das mesmas (4D5 Y55E.Y102V-Fab, 4D5 D98A.F100A.Y102V-Fab e 4D5 H91A-Fab; Figuras 29A a 29D); variantes de correções de deficiência (4D5 N30S-Fab, 4D5 N54E.D98T-Fab e N30S.N54E.D98T-Fab; Figuras 30A a 30C); e variantes de afinidade com correções de deficiência (4D5 N30S.Y55E.N54E.D98T.Y102V-Fab, 4D5 N30S.N54E.D98A.F100A.Y102V-Fab e 4D5 H91A.N30S.N54E.D98T-Fab; Figuras 31A a 31C) foram quantificadas por BIACORE®.
[0415] As variantes de afinidade 4D5 com correções de deficiência foram geradas e distinguidas. Os pesos moleculares (MW; Daltons) de cada variante 4D5 Fab foram medidos por espectrometria de massa e o grau de agregação foi quantificado por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC). Os resultados são mostrados na Tabela 7, abaixo. A diferença observada em MW entre os valores observados e esperados estava ligada ao recorte de lisina do terminal C.
TABELA 7 RESULTADOS DA ESPECTROMETRIA DE MASSA E EXPERIMENTOS COM SEC. MW % de 4D5 Fab MW esperado MW delta observado monômero WT 48.605 48.773 -128 99,11 H91A 48.539 48.667 -128 97,89 Y55E.Y102V 48.507 48.635 -128 96,28 D98A.F100A.Y102V 48.421 48.549 -128 99,28 D98T.F100A.Y102V 48.451 48.579 -128 98,71 N30S.N54E.D98T 48.579 48.707 -128 98,69 N30S.H91A.N54E.D98T 48.513 48.641 -128 98,86 H91A.N54E.D98T 48.540 48.668 -128 99,03 N30S.Y55E.N54E.D98T.Y102V 48.442 48.570 -128 99,65 N30S 48.578 48.706 -128 95,13 N54E.D98T 48.606 48.734 -128 97,16 N30S.N54E.D98A.F100A.Y102V 48.409 48.537 -128 97,24 N30S.N54E.D98T.F100A.Y102V 48.439 48.567 -128 98,67
[0416] As variantes das variantes de afinidade 4D5 foram formatadas em anticorpos IgG TDB associando um braço 4D5 monovalente a um braço anti-CD3 (40G5c N297G) (vide, por exemplo, Publicação dos EUA de nº 2015/095392, que é incorporada no presente documento por referência em sua totalidade). Os anticorpos foram testados quanto à ligação à HER2 humana por BIACORE®. Os resultados são mostrados nas Figuras 32A a 32K e sumarizados na Tabela 8, abaixo.
TABELA 8 CARACTERÍSTICAS DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS 4D5 IGG TDB À HER2 HUMANA. Razão de Variante Anti-HER2 KD (nM) KD Rmax Chi² ka (1/Ms) kd (1/s) (IgG TDB) HER2 Hu (Variante/ (RU) (RU²) WT) H91A.D98A.F100A.Y1 - - - - - - 02V Y55E.H91A.D98A.F10 - - - - - - 0A.Y102V Y55E.H91A.Y102V - - - - - - WT 3,20E+05 2,75E-04 0,86 1 42,4 6,02 Y102V 2,59E+05 3,27E-04 1,26 1,5 41,2 4,58 Y55E.Y102V 1,82E+05 1,30E-03 7,15 8,3 36,7 2,93 Y55E.D98A.F100A.Y1 2,65E+05 1,12E-02 42,1 48,8 33,1 4,11 02V D98A.F100A.Y102V 3,12E+05 1,51E-02 48,5 56,3 32,8 6,24 H91A 2,37E+05 2,17E-02 91,6 106,3 28,6 2,28 H91A.Y102V 2,61E+05 3,17E-02 121 140,4 25,4 2,07 Y55E.H91A 1,55E+05 4,67E-02 301 349,2 12,2 2,26
[0417] Não foi detectada ligação nas variantes H91A.D98T.F100A.Y102V-IgG TDB, Y55E.H91A.D98A.F100A.Y102V-IgG TDB ou variantes Y55E.H91A.Y102V-IgG TDB. Em geral, valores mais baixos de KD (afinidades de ligação mais fortes) foram amplamente associados dissociações mais baixas. No formato IgG TDB, foi observada uma afinidade duas vezes mais fraca em comparação com o formato Fab (Tabelas 9 e 10). No entanto, quando uma razão de KD é usada, em que a KD de uma variante 4D5 é dividida pelo KD de um 4D5 do tipo selvagem, o resultado é um valor relativamente consistente de 100 a 200 para a variante H91A em tanto o IgG TDB quanto o formato Fab.
TABELA 9 CARACTERÍSTICAS DE LIGAÇÃO DE MOLÉCULAS FAB 4D5 CORRIGIDAS DE DEFICIÊNCIA À HER2 HUMANA. ka kd KD Razão de KD Rmax χ2 4D5 Fab (1/Ms) (1/s) (nM) (Variante/WT) (RU) (RU2) N30S.N54E.D98T 1,07E+6 6,18E-5 0,06 0,23 42,1 0,681 N54E.D98T 9,62E+5 6,89E-5 0,07 0,29 40,9 0,722 ka kd KD Razão de KD Rmax χ2 4D5 Fab (1/Ms) (1/s) (nM) (Variante/WT) (RU) (RU2) WT 1,02E+6 2,54E-4 0,25 1 43 0,544 N30S 1,05E+6 2,82E-4 0,27 1,07 41,2 0,656 Y55E.Y102V 6,60E+5 1,46E-3 2,21 8,84 42,3 0,555 H91A.N54E.D98T 7,82E+5 5,02E-3 6,42 25,7 39,6 0,185 N30S.H91A.N54E.D98T 8,22E+5 6,55E-3 7,97 31,9 39,7 0,15 N30S.N54E.D98T.F100A 7,39E+5 6,76E-3 9,15 36,6 38,3 0,185 .Y102V N30S.N54E.D98A.F100 7,58E+5 9,58E-3 12,6 50,4 37,2 0,235 A.Y102V D98T.F100A.Y102V 1,14E+6 1,47E-2 12,9 51,6 38,9 0,212 D98A.F100A.Y102V 1,14E+6 2,37E-2 20,7 82,8 37,7 0,319 H91A 6,63E+5 2,82E-2 42,6 170 36 0,281 Y55E.H91A.N54E.D98T. 6,42E+5 3,18E-2 49,5 198 35,8 0,113 Y102V
[0418] Um painel de variantes 4D5 no formato Fab foi gerado para obter uma faixa de afinidades para o rastreamento no formato IgG TDB (Tabela 9) ou 1Fab-IgG TDB (Tabela 10). Como a afinidade e a cinética eram mais desejáveis na variante H91A, foi realizada a eliminação de possíveis deficiências moleculares nessa variante. As deficiências incluíam a posição de cadeia leve N(30) T na HVR-L1 e as posições de cadeia pesada N(54)G na HVR-H2 e D(98)G na HVR-H3. O objetivo era evitar a possível isomerização de D(98)G e a possível desaminação de N(30)T e N(54)G. Inicialmente, o design racional foi usado para rastrear as variantes. No entanto, combinar variantes de baixa afinidade com variantes de alta afinidade não produziu afinidade preditiva, e mesmo combinações de duas ou três variantes produziram resultados imprevisíveis, como ilustrado na Figura 38. Por exemplo, Y55E normalmente enfraqueceu a afinidade de 3,5 para 20 vezes, mas em um caso produziu um pequeno aumento na afinidade. H91A enfraqueceu a afinidade de 91 para 163 vezes e Y102V aumentou a afinidade ou não mudou a afinidade. Portanto, uma pequena matriz foi testada usando N30S.N54E.D98A/T para corrigir as deficiências moleculares. N30S foi usado para evitar uma possível desaminação na HVR-L1 e teve pouco ou nenhum efeito na afinidade. N54E.D98T aumentou a afinidade para 0,07 nM, sendo necessárias mutações que enfraquecem a afinidade para atingir uma K D de cerca de 50 nM. Através do uso das mutações de afinidade Y55E, H91A e/ou Y102V, além das correções de deficiência, foram identificadas duas variantes tendo cinética semelhante a H91A (Tabela 10). 4D5 N30S.Y55E.H91A.HC- N54E.D98T-Fab apresenta correções em todos as três deficiências, enquanto 4D5 Y55E.H91A.HC-N54E.D98T.Y102V-Fab apresenta dois resíduos corrigidos de deficiência e ambos têm KDs de cerca de 50 nM. Uma outra variante, 4D5 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-Fab exibiu uma dissociação ligeiramente mais rápida de forma consistente e tinha uma K D de 70 nM.
TABELA 10 CARACTERÍSTICAS DE LIGAÇÃO DE MOLÉCULAS FAB 4D5 CORRIGIDAS DE DEFICIÊNCIA À HER2 HUMANA. Razão de ka kd KD 4D5 Fab KD (nM) (1/Ms, E+5) (1/s, E-3) (Variante/ WT) WT 8,74 ± 1,74 0,25 ± 0,03 0,30 ± 0,01 1,0 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T 6,76 ± 1,41 32,8 ± 4,07 49,2 ± 5,06 164 H91A 7,07 ± 2,43 33,6 ± 6,54 49,3 ± 8,57 164 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V 5,98 ± 0,18 32,2 ± 1,45 54,0 ± 2,51 180 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y10 6,34 ± 0,33 44,0 ± 1,97 69,8 ± 6,95 233 2V Y55E.H91A.N54E.D98T 1,85 ± 0,49 22,7 ± 3,25 126 ± 18,0 420
[0419] Como mostrado na Tabela 11, a afinidade monovalente do 4D5 Fab do tipo selvagem para a HER2 de macaco cynomolgus (3,3 nM) foi aproximadamente 10 vezes mais fraca do que para a HER2 humana (0,3 nM).
A variante de afinidade 4D5 H91A-Fab e as variantes corrigidas de deficiência exibem afinidades monovalentes superiores a 300 nM à HER2 de macaco cynomolgus (Tabela 12). No entanto, a razãode KD para a proteína HER2 de cynomolgus da variante 4D5 H91A-Fab e do tipo selvagem 4D5 do macaco cynomolgus foi de aproximadamente 100 a 200, dentro de uma faixa semelhante à observada no formato humano.
TABELA 11 CARACTERÍSTICAS DE LIGAÇÃO DE MOLÉCULAS FAB 4D5 CORRIGIDAS DE DEFICIÊNCIA À HER2 DE MACACO CYNOMOLGUS. Razão de KD Cyno/ KD Cyno KD 4D5 Fab KD (nM) Humana KD (Variante/ (nM) (nM) Humana WT) WT 3,35 1 3,35 0,30 11,2 H91A 334 100 325 49,3 6,77 Y55E.H91A.N54E.D98T ≥ 770 230 ≥728 126 ≥6,11 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102 ≥ 710 212 ≥692 54,0 ≥13,1
V N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T 420 125 400 49,2 8,54 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T 452 134 429 69,8 6,48 .Y102V EXEMPLO 10 DISTINGUINDO VARIANTES DE AFINIDADE CORRIGIDA DE DEFICIÊNCIA 4D5
[0420] Várias variantes de afinidade corrigida de deficiência 4D5 foram selecionadas para posterior distinção. As variantes Y55E.H91A.N54E.D98T e Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V foram formatadas em um anticorpo 1Fab-IgG TDB tendo um ligante natural (curto) (dobradiça; DKTHT) e comparadas a H91A-1Fab-IgG TDB em um ensaio de resposta à dose para quantificar a morte de células alvo SKBR3 (Figura 33A) ou MCF7 (Figura 33B). Cada poço foi semeado com 1,5 × 10 4 células alvo SKBR3 ou MCF7 e cocultivado com céluas efetoras CD8+ derivadas de PMBC na razão efetor:alvo de 1:3. Os resultados estão sumarizados na Tabela 12, abaixo.
TABELA 12 MORTE DE CÉLULAS ALVO SKBR3 POR VARIANTES 4D5 1FAB-IGG TDB
SELECIONADAS SKBR3 MCF7 4D5 1Fab-IgG TDB IC50 (ng/mL) IC50 (ng/mL) Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V 2,61 >1.000 Y55E.H91A.N54E.D98T 1,63 >1.000 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V 1,83 >1.000 H91A 2,01 >1.000
[0421] A ligação de anticorpos 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T-
1Fab-IgG TDB e 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V a células SKBR3 (Figura 34A) e células MCF7 (Figura 34B) também foi distinguida por citometria de fluxo. Em geral, 4D5 Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V-1Fab-IgG TDB foi semelhante a 4D5 H91A-1Fab-IgG TDB em termos de citotoxicidade e ligação a células SKBR3 e células MCF7.
EXEMPLO 11
AFINIDADE DE LIGAÇÃO CELULAR
[0422] Para entender a contribuição do envolvimento bivalente de HER2 ou avidez, na afinidade baseada em células com mais detalhes, as aparentes afinidades das moléculas 4D5-WT 1Fab-IgG TDB e 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB para SKBR3, MCF7 e células transfectadas para expressar a HER2 de macaco cynomolgus em níveis comparáveis a MCF7 foram determinadas (Tabela 13). Apesar da diferença de 164 vezes entre 4D5 e a afinidade atenuada da variante 4D5-H91A como Fab monovalente, as afinidades de ligação baseadas em células das moléculas 1Fab-IgG às células SKBR3 foram comparáveis, conforme determinado por ensaios diretos de ligação celular ou de ligação por competição. A afinidade aparente de 4D5- H91A 1Fab-IgG TDB para HER2 expressa em células SKBR3 estava na faixa de 1,5-5 nM, que é ~10 vezes maior em comparação com sua afinidade monovalente de Fab medida por BIACORE®. Este resultado sugere que a baixa afinidade monovalente de Fab pode ser compensada pela avidez que é mediada pela ligação bivalente à HER2 em um contexto celular. Em contraste, 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB não demonstrou ligação substancial a células que expressam HER2 de cyno ou MCF7 (KD de >100 nM para ligação celular direta e ausência de ligação detectada na ligação por competição), sugerindo que o número mais baixo de cópias de HER2 nessas células não é suficiente para o envolvimento bivalente de HER2. Os resultados estão sumarizados na Tabela 13.
TABELA 13 AFINIDADE DE LIGAÇÃO DOS 1FAB-IGG TDBS PARA HER2 DE MACACO CYNOMOLGUS.
1Fab IgG KD (nM) SKBR3 MCF7 CHO-cynoHER2 Alta WT 3,26±1,22 11,57±5,91 1,51±0,15 H91A 5,02±1,96 >100 >100 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T 5,08±1,22 >100 >100
[0423] O efeito da afinidade de ligação a CD3 na morte de células alvo mediada por TDB também foi avaliado. 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB tendo o braço anti-CD3 de baixa afinidade 40G5c (“40G5c 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB”; CD3 KD de ~50 nM) foi comparado a um 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB análogo tendo braço anti-CD3 de alta afinidade 38E4v1 (“38E4v1 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB”; CD3 KD de ~1 nM). Em um ensaio de morte de células in vitro usando a linhagem celular alvo com alta expressão de HER2 SKBR3, 40G5c 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB exibiu potência semelhante na morte de células alvo conforme 38E4v1 4D5- H91A 1Fab-IgG TDB (Figura 37). Por outro lado, em um ensaio análogo usando a linhagem celular alvo com baixa expressão de HER2 MCF7, 38E4v1 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB foi substancialmente mais potente na morte de células alvo do que 40G5c 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB, que exibia pouca capacidade de matar células.
Esses resultados, sumarizados na Tabela 14 abaixo, mostram que a baixa ligação ao anti-CD3 aumenta drasticamente a capacidade do 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB de seletivamente matar células que expressam altos níveis de HER2.
TABELA 14 EFEITO DA AFINIDADE DE LIGAÇÃO A CD3 NA MORTE DE CÉLULAS ALVO MEDIADA POR 4D5-H91A 1FAB-IGG TDB Clone de anti-CD3 Linhagem Celular IC50 (ng/mL) IC50 (pM)
Clone de anti-CD3 Linhagem Celular IC50 (ng/mL) IC50 (pM) 40G5c (baixa afinidade) MCF7 >1.000 >1.000 40G5c (baixa afinidade) SKBR3 4,2 28 38E4v1 (alta afinidade) MCF7 150 970 38E4v1 (alta afinidade) SKBR3 11 1,8 EXEMPLO 12 DOSE ALTA DE 4D5-H91A 1FAB-IGG TDB NÃO RESULTA NA ATIVAÇÃO DE CÉLULAS T INDEPENDENTES DE HER2
[0424] A ligação de FcγR foi atenuada nos TDBs pela substituição de N297G na região Fc. Para confirmar que os TDBs não induzem a ativação de células T independentes de alvo em alta concentração, uma linhagem celular repórter Jurkat foi usada (Figura 38A). Um sinal robusto foi detectado quando as células repórter foram estimuladas com TDB na presença de células que expressam HER2. Nem 4D5-WT IgG TDB nem 4D5 H91A 1Fab-IgG TDB ativaram células T na ausência de HER2. Altos níveis de TDB foram adicionados em PBMC humano (Figura 38B). Anti-CD3 bivalente (OKT-3) induziu a ativação de células T na concentração de ≥ 10 ng/ml, enquanto nenhuma ativação de células T foi detectada na concentração de 100 µg/ml, indicando que nenhum formato TDB induz a ativação de células T independentes de HER2 em altas concentrações.
EXEMPLO 13 4D5-H91A 1FAB-IGG TDB TEM ATIVIDADE FARMACOLÓGICA LIMITADA E É BEM
TOLERADO EM MACACOS CYNOMOLGUS
[0425] Os tecidos do macaco cynomolgus(cyno) expressam baixos níveis de HER2, semelhantes aos tecidos normais humanos. 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB não substancialmente liga ou induz a apoptose de células que expressam níveis baixos a moderados de HER2 de cyno (Tabela 13). Para testar a tolerabilidade de 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB, um estudo de tolerabilidade de dose única foi projetado para estudar a atividade farmacodinâmica (DP) e farmacocinética (PK) em macacos cynomolgus.
Macacos fêmeas foram dosados com infusão intravenosa lenta em nível de dose de 3 mg/kg (N=3) e 20 mg/kg (N=5). As leituras de tolerabilidade/PK/PD incluíram observações clínicas, química clínica, hematologia, citocinas e PK. A histopatologia não foi incluída na análise. Nenhuma ou mínimas alterações relacionadas ao artigo de teste foram detectadas nas observações clínicas (peso corporal, frequência cardíaca, temperatura, frequência respiratória). As respostas farmacológicas e patológicas clínicas associadas ao TDB típicas (Bargou et al., Science, 2008, 321:974-977; Lutterbuese et al., Proc. Nat. Acad.
Sci., 2010, 107(28):12605-12610) foram surpreendentemente ausentes (Figura 38C). Os níveis de proteína C reativa (PCR; um reagente de fase aguda e um marcador para inflamação) permaneceram no nível de referência. Não foram detectadas margens de linfócitos, elevação de enzimas hepáticas (aminotransferases de alanina e aspartato; ALT e AST) ou elevação de citocinas do sangue periférico (não mostradas), apesar da alta dose de TDB.
Tomado em conjunto, o 4D5-H91A 1Fab-IgG TDB foi bem tolerado com um nível de dose alto e demonstrou atividade farmacológica limitada no cyno.
[0426] A exposição ao TDB foi confirmada para os níveis de dose testados e para as características de PK normais (Figura 38D). As exposições foram quase proporcionais à dose e mantidas até o último momento avaliado (14 dias). Para confirmar que o TDB não é inativado no cyno, foram recuperadas alíquotas séricas das amostras colhidas 7 dias e 14 dias após a dose com 20 mg/kg de TDB, e diluições séricas foram usadas para mediar a morte de células SKBR3 in vitro usando células T saudáveis de doador humano (Figura 38E). As concentrações séricas de TDB medidas em amostras não diluídas foram de 193 e 65 µg/mL para as amostras do dia 7 e do dia 14, respectivamente. A diluição de 100 vezes do soro 14 dias após a dosagem induziu um nível semelhante de morte de SKBR3, em comparação com a atividade máxima alcançada no ensaio de morte paralelo usando TDB fresco em alta concentração (1 µg/ml), o que normalmente é suficiente para saturar a atividade.
Juntos, esses dados sugerem que a baixa expressão de
HER2 em tecidos de cyno normais não é suficiente para desencadear a ativação de células T ou a atividade de células T fora do tumor em tecidos normais que expressam baixos níveis de HER2.

Claims (55)

REIVINDICAÇÕES
1. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente, caracterizada por: (a) o braço monovalente compreender uma primeira fração de ligação ao antígeno, em que o terminal C da primeira fração de ligação ao antígeno é fundido ao terminal N de uma primeira subunidade Fc; (b) o braço bivalente compreender uma segunda fração de ligação ao antígeno e uma terceira fração de ligação ao antígeno, em que o terminal C da terceira fração de ligação ao antígeno é fundido ao terminal N da segunda fração de ligação ao antígeno e o terminal C da segunda fração de ligação ao antígeno é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc; e (c) a primeira subunidade Fc estar associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc, em que a primeira fração de ligação ao antígeno é capaz de especificamente se ligar a CD3, e a segunda fração de ligação ao antígeno e a terceira fração de ligação ao antígeno são capazes de especificamente se ligarem à HER2.
2. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela segunda e a terceira frações de ligação ao antígeno se ligarem ao domínio IV de HER2.
3. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizada pela afinidade de ligação (KD) monovalente de cada uma da segunda fração de ligação ao antígeno e da terceira fração de ligação ao antígeno ser de 10 nM a 100 nM.
4. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pela KD monovalente de cada uma da segunda fração de ligação ao antígeno e da terceira fração de ligação ao antígeno ser de 20 nM a 50 nM.
5. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pela taxa de dissociação monovalente da segunda fração de ligação ao antígeno e/ou da terceira fração de ligação ao antígeno ser de 10- 3/segundo a 10-1/segundo.
6. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pela taxa de dissociação monovalente de cada uma da segunda fração de ligação ao antígeno e da terceira fração de ligação ao antígeno ser de 10-2/segundo a 30- 2/segundo.
7. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pela KD monovalente da primeira fração de ligação ao antígeno ser de 10 nM a 100 nM.
8. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pela K D monovalente da primeira fração de ligação ao antígeno ser de 20 nM a 80 nM.
9. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pela K D monovalente da primeira fração de ligação ao antígeno ser de 40 nM a 60 nM.
10. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pela KD monovalente da segunda fração de ligação ao antígeno ser a KD da segunda fração de ligação ao antígeno no formato Fab, medida usando ressonância plasmônica de superfície, e em que a KD monovalente da terceira fração de ligação ao antígeno ser a KD da terceira fração de ligação ao antígeno no formato Fab, medida usando ressonância plasmônica de superfície.
11. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pela primeira fração de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab (FabA) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH A) e uma região variável de cadeia leve (VLA).
12. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pela segunda fração de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab (FabB1) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VH B1) e uma região variável de cadeia leve (VLB1) e/ou a terceira fração de ligação ao antígeno ser uma molécula Fab (FabB2) compreendendo uma região variável de cadeia pesada (VHB2) e uma região variável de cadeia leve (VLB2).
13. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pela primeira fração de ligação ao antígeno ser uma FabA compreendendo uma região VHA e uma região VLA, a segunda fração de ligação ao antígeno ser uma FabB1 compreendendo uma região VHB1 e uma região VLB1 e a terceira fração de ligação ao antígeno ser um FabB2 compreendendo uma região VHB2 e uma região VLB2.
14. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, caracterizada por (a) a VHB1 e a VHB2 compartilharem pelo menos 95% de identidade de sequência; (b) a VLB1 e a VLB2 compartilharem pelo menos 95% de identidade de sequência; ou (c) a VHB1 e a VHB2 compartilharem pelo menos 95% de identidade de sequência e a VLB1 e a VLB2 compartilharem pelo menos
95% de identidade de sequência.
15. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizada pela região VHB1 e/ou a região VHB2 compreenderem uma substituição de aminoácidos em um, dois, três ou todos os quatro resíduos de N54, D98, F100, e/ou Y102, de acordo com o sistema de numeração Kabat.
16. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pela região VHB1 e/ou a região VHB2 compreenderem uma substituição de aminoácidos em um, dois, três, quatro ou todos os cinco dos seguintes resíduos: N54E, D98A, D98T, F100A e/ou Y102V, de acordo com o sistema de numeração Kabat.
17. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizada pela região VLB1 e/ou a região VLB2 compreenderem uma substituição de aminoácidos em um, dois ou todos os três resíduos de N30, Y55 e/ou H91, de acordo com o sistema de numeração Kabat.
18. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pela região VLB1 e/ou a região VLB2 compreenderem uma substituição de aminoácidos em um, dois ou todos os três dos seguintes resíduos: N30S, Y55E e/ou H91A.
19. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizada pela região VHB1 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, ou
(c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20.
20. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 19, caracterizada pela região VHB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24.
21. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pela região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24.
22. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 21, caracterizada pela região VLB1 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
23. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 22, caracterizada pela região VLB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27.
24. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pela região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.
25. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 24,
caracterizada pela VHB1 compreender as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; e pela VLB1 compreender as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
26. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 25, caracterizada pela região VHB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e pela região VLB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27.
27. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pela região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e pela região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.
28. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 27, caracterizada pela região VHB2 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs:
(a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20.
29. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 28, caracterizada pela região VHB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24.
30. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 29, caracterizada pela região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24.
31. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 30, caracterizada pela região VLB2 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
32. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 31, caracterizada pela região VLB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27.
33. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pela região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.
34. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 33, caracterizada pela VHB2 compreender as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20; e pela VLB2 compreender as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
35. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 34, caracterizada pela região VHB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e a região VLB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27.
36. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 35, caracterizada pela região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e pela região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.
37. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 36, caracterizada pela região VLB1 e/ou a região VLB2 compreenderem um ou mais resíduos corrigidos de deficiência.
38. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelos um ou mais resíduos corrigidos de deficiência compreenderem a substituição de aminoácidos de N30S.
39. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 38, caracterizada pela região VHB1 e/ou a região VHB2 compreenderem um ou mais resíduos corrigidos de deficiência.
40. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 39, caracterizada pelos um ou mais resíduos corrigidos de deficiência compreenderem uma ou mais substituições de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em N54E, D98A e D98T.
41. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizada pela região VHB1 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32.
42. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 41, caracterizada pela região VHB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33.
43. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 42, caracterizada pela região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33.
44. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 41 a 43, caracterizada pela região VLB1 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23.
45. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 41 a 44, caracterizada pela região VLB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25.
46. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pela região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.
47. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 41 a 46, caracterizada pela VHB1 compreender as seguintes HVRs:
(a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e pela VLB1 compreender as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23.
48. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 41 a 47, caracterizada pela região VHB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 e pela região VLB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25.
49. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 48, caracterizada pela região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 e pela região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.
50. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 41 a 49, caracterizada pela região VHB2 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32.
51. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 41 a 50, caracterizada pela região VHB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33.
52. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 51, caracterizada pela região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33.
53. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 41 a 52, caracterizada pela região VLB2 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23.
54. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 41 a 53, caracterizada pela região VLB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25.
55. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 54, caracterizada pela região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.
56. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 41 a 55, caracterizada pela VHB2 compreender as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32; e pela VLB2 compreender as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23.
57. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 41 a 56, caracterizada pela região VHB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 e pela região VLB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25.
58. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pela região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 e pela região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.
59. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizada pela região VHB1 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37.
60. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 59, caracterizada pela região VHB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41.
61. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 60, caracterizada pela região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41.
62. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 59 a 61, caracterizada pela região VLB1 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
63. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 59 a 62, caracterizada pela região VLB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48.
64. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 63, caracterizada pela região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
65. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 59 a 64, caracterizada pela VHB1 compreender as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e pela VLB1 compreender as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
66. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 59 a 65, caracterizada pela região VHB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e pela região VLB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48.
67. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 66, caracterizada pela região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e pela região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
68. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 59 a 67, caracterizada pela região VHB2 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37.
69. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 59 a 68, caracterizada pela região VHB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41.
70. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 69, caracterizada pela região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41.
71. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 59 a 70, caracterizada pela região VLB2 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
72. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 59 a 71, caracterizada pela região VLB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48.
73. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 72, caracterizada pela região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
74. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17 ou 59 a 73, caracterizada pela VHB2 compreender as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e pela VLB2 compreender as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
75. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 59 a 74, caracterizada pela região VHB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e pela região VLB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48.
76. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 75, caracterizada pela região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e pela região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
77. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizada pela região VHB1 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43.
78. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 77, caracterizada pela região VHB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44.
79. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 78, caracterizada pela região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44.
80. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 77 a 79, caracterizada pela região VLB1 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
81. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 77 a 80, caracterizada pela região VL da segunda fração de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48.
82. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 81, caracterizada pela região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
83. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 77 a 82, caracterizada pela VHB1 compreender as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, e
(c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; e pela VLB1 compreender as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
84. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 77 a 83, caracterizada pela região VHB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e pela região VLB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48.
85. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 84, caracterizada pela região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e pela região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
86. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 77 a 85, caracterizada pela região VHB2 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43.
87. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 77 a 86, caracterizada pela região VHB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44.
88. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 87, caracterizada pela região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44.
89. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 77 a 88, caracterizada pela região VLB2 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
90. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 77 a 89, caracterizada pela região VLB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48.
91. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 90, caracterizada pela região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
92. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 77 a 91, caracterizada pela VHB2 compreender as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; e pela VLB2 compreender as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
93. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 77 a 92, caracterizada pela região VHB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e pela região VLB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48.
94. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 93, caracterizada pela região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e pela região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
95. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizada pela região VHB1 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37.
96. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 95, caracterizada pela região VHB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41.
97. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 96, caracterizada pela região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41.
98. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 95 a 97, caracterizada pela região VLB1 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
99. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 95 a 98, caracterizada pela região VLB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49.
100. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 99, caracterizada pela região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
101. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 95 a 100, caracterizada pela VHB1 compreender as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e pela VLB1 compreender as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
102. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 95 a 101, caracterizada pela região VHB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e pela região VLB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49.
103. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 102, caracterizada pela região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e pela região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
104. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 95 a 103, caracterizada pela região VHB2 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37.
105. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 95 a 104, caracterizada pela região VHB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41.
106. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 105, caracterizada pela região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41.
107. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 95 a 106, caracterizada pela região VLB2 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
108. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 95 a 107, caracterizada pela região VLB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49.
109. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 108, caracterizada pela região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
110. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 95 a 109, caracterizada pela VHB2 compreender as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37; e pela VLB2 compreender as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
111. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 95 a 110, caracterizada pela região VHB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e pela região VLB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49.
112. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 111, caracterizada pela região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e pela região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
113. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18, caracterizada pela região VHB1 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43.
114. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 113, caracterizada pela região VHB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44.
115. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 114, caracterizada pela região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44.
116. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 113 a 115, caracterizada pela região VLB1 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
117. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 113 a 116, caracterizada pela região VLB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49.
118. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 117, caracterizada pela região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
119. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 113 a 118, caracterizada pela VHB1 compreender as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; e pela VLB1 compreender as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
120. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 113 a 119, caracterizada pela região VHB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e pela região VLB1 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49.
121. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 120, caracterizada pela região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e pela região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
122. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 113 a 121, caracterizada pela região VHB2 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43.
123. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 113 a 122, caracterizada pela região VHB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44.
124. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 123, caracterizada pela região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44.
125. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 113 a 124, caracterizada pela região VLB2 compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
126. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 113 a 125, caracterizada pela região VLB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49.
127. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 126, caracterizada pela região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
128. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 113 a 127, caracterizada pela VHB2 compreender as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11,
(b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43; e pela VLB2 compreender as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26.
129. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 ou 113 a 128, caracterizada pela região VHB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e pela região VLB2 compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49.
130. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 129, caracterizada pela região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e pela região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
131. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 130, caracterizada pela região VHA compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, ou (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.
132. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 131, caracterizada pela região VHA compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7.
133. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 132, caracterizada pela região VHA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7.
134. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 133, caracterizada pela região VLA compreender uma, duas ou todas as três das seguintes HVRs: (a) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (b) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, ou (c) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.
135. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 134, caracterizada pela região VLA compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8.
136. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 135, caracterizada pela região VLA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.
137. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO
BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 136, caracterizada pela VHA compreender as seguintes HVRs: (a) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (b) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, e (c) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; e pela VLA compreender as seguintes HVRs: (d) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (e) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, e (f) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6.
138. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 137, caracterizada pela região VHA compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e pela região VLA compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8.
139. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 138, caracterizada pela região VHA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e pela região VLA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.
140. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente caracterizada por:
(a) o braço monovalente compreender um FabA, em que o terminal C do FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc e em que o FabA compreende as seguintes HVRs:
(i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1,
(ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2,
(iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3,
(iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4,
(v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, e
(vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6;
(b) o braço bivalente compreender um FabB1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do
FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o
FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs:
(i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11,
(ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19,
(iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 20,
(iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22,
(v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, e (c) a primeira subunidade Fc estar associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc.
141. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 140, caracterizada por: (a) a FabA compreender uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreender uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27; e (c) a FabB2 compreender uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 24 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 27.
142. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 141, caracterizada por: (a) a região VHA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e a região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27; e (c) a região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 24 e a região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 27.
143. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente caracterizada por: (a) o braço monovalente compreender um FabA, em que o terminal C do FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc e em que o FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreender um FabB1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 32, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 22, e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 23; e (c) a primeira subunidade Fc estar associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc.
144. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 143, caracterizada por: (a) a FabA compreender uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreender uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25; e (c) a FabB2 compreender uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 33 e a região
VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 25.
145. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 144, caracterizada por: (a) a região VHA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 e a região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25; e (c) a região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 33 e a região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 25.
146. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente caracterizada por: (a) o braço monovalente compreender um FabA, em que o terminal C do FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc e em que o FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreender um FabB1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, e (c) a primeira subunidade Fc estar associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc.
147. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 146, caracterizada por: (a) a FabA compreender uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8;
(b) a FabB1 compreender uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48; e (c) a FabB2 compreender uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48.
148. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 147, caracterizada por: (a) a região VHA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48; e (c) a região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
149. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente caracterizada por: (a) o braço monovalente compreender um FabA, em que o terminal C do FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc e em que o FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1,
(ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2,
(iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3,
(iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4,
(v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, e
(vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6;
(b) o braço bivalente compreender um FabB1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do
FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o
FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs:
(i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11,
(ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36,
(iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43,
(iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 21,
(v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, e
(vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, e
(c) a primeira subunidade Fc estar associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc.
150. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 149, caracterizada por: (a) a FabA compreender uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreender uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48; e (c) a FabB2 compreender uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 48.
151. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 150, caracterizada por: (a) a região VHA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48; e (c) a região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 48.
152. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente caracterizada por: (a) o braço monovalente compreender um FabA, em que o terminal C do FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc e em que o FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreender um FabB1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 37, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, e (c) a primeira subunidade Fc estar associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc.
153. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 152, caracterizada por: (a) a FabA compreender uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreender uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49; e (c) a FabB2 compreender uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 41 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49.
154. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 153, caracterizada por:
(a) a região VHA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49; e (c) a região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
155. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA compreendendo um braço monovalente e um braço bivalente caracterizada por: (a) o braço monovalente compreender um FabA, em que o terminal C do FabA é fundido a um terminal N de uma primeira subunidade Fc e em que o FabA compreende as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 4, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5, e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6; (b) o braço bivalente compreender um FabB1 e um FabB2, em que o terminal C do FabB2 é fundido ao terminal N do FabB1 e o terminal C do FabB1 é fundido a um terminal N de uma segunda subunidade Fc, em que o FabB1 e o FabB2 compreendem as seguintes HVRs: (i) uma HVR-H1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11, (ii) uma HVR-H2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 36, (iii) uma HVR-H3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 43, (iv) uma HVR-L1 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 38, (v) uma HVR-L2 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 29, e (vi) uma HVR-L3 compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 26, e (c) a primeira subunidade Fc estar associada à segunda subunidade Fc para formar um domínio Fc.
156. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 155, caracterizada por: (a) a FabA compreender uma região VHA e uma região VLA, em que a região VHA compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 e a região VL A compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 8; (b) a FabB1 compreender uma região VHB1 e uma região VLB1, em que a região VHB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a região VLB1 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49; e (c) a FabB2 compreender uma região VHB2 e uma região VLB2, em que a região VHB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 44 e a região VLB2 compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 49.
157. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 156, caracterizada por: (a) a região VHA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 7 e a região VLA compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8; (b) a região VHB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região VLB1 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49; e (c) a região VHB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 44 e a região VLB2 compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 49.
158. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 157, caracterizada pelo domínio Fc ser um domínio Fc da IgG.
159. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 158, caracterizada pelo domínio Fc da IgG ser um domínio Fc da IgG1 ou IgG4.
160. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 159, caracterizada pelo domínio Fc ser um domínio Fc humano.
161. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 160,
caracterizada pelo domínio Fc compreender uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora.
162. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 161, caracterizada pelas uma ou mais substituições de aminoácidos que reduzem a ligação a um receptor Fc e/ou função efetora estarem em N297.
163. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 162, caracterizada pela primeira subunidade Fc e a segunda subunidade Fc compreenderem a substituição de aminoácidos de N297G.
164. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 161 a 163, caracterizada pelo receptor Fc ser um receptor Fcγ.
165. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 161 a 164, caracterizada pela função efetora ser citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos (ADCC).
166. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 165, caracterizada pelo domínio Fc compreender uma modificação configurada para promover a associação da primeira subunidade Fc com a segunda subunidade Fc.
167. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 166, caracterizada pelo resíduo de aminoácido no domínio CH3 da segunda subunidade Fc ser substituído por um resíduo de aminoácido tendo um volume maior de cadeia lateral, gerando assim uma protuberância dentro do domínio CH3 da segunda subunidade Fc, que é posicionada em uma cavidade dentro do domínio CH3 da primeira subunidade Fc, e por um resíduo de aminoácido no domínio CH3 da primeira subunidade Fc ser substituído por um resíduo de aminoácido tendo um volume menor de cadeia lateral, gerando assim uma cavidade dentro do domínio CH3 da primeira subunidade Fc, dentro da qual a protuberância dentro do domínio CH3 da segunda subunidade Fc é posicionável.
168. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 167, caracterizada pelo domínio CH3 da segunda subunidade Fc compreender a substituição de aminoácidos de T366 e pelo domínio CH3 da primeira subunidade Fc compreender substituições de aminoácidos em um, dois ou todos os três de T366, L368 e/ou Y407.
169. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 168, caracterizada pelo domínio CH3 da segunda subunidade Fc compreender a substituição de aminoácidos de T366W e pelo domínio CH3 da primeira subunidade Fc compreender uma, duas ou todas as três substituições de aminoácidos de T366S, L368A e/ou Y407V.
170. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 169, caracterizada pelo terminal C da terceira fração de ligação ao antígeno ser fundido ao terminal N da segunda fração de ligação ao antígeno por meio de um ligante peptídico.
171. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 170, caracterizada pelo ligante peptídico ter de 5 a 20 aminoácidos de comprimento.
172. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 171, caracterizada pelo ligante peptídico compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50.
173. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 172, caracterizada por compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 53.
174. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 173, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 57, 61, 81, 83, 85 e 87.
175. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 174, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 57, 61, 81, 83, 85 e 87.
176. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 175, caracterizada pelo ligante de peptídeo compreender a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51.
177. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 176, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 56.
178. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 177, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno compreender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOs: 58, 62, 82, 84, 86 e 88.
179. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 178, caracterizada pela molécula de ligação ao antígeno compreender a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 58, 62, 82, 84, 86 e 88.
180. ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, caracterizado por codificar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 179.
181. VETOR, caracterizado por compreender o ácido nucleico isolado conforme definido na reivindicação 180.
182. CÉLULA HOSPEDEIRA, caracterizada por compreender o ácido nucleico isolado conforme definido na reivindicação 180 ou o vetor conforme definido na reivindicação 181.
183. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 182, caracterizada pela célula hospedeira ser uma célula de mamífero.
184. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 183, caracterizada pela célula de mamífero ser uma célula de ovário de hamster chinês (CHO).
185. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 184, caracterizada pela célula hospedeira ser uma célula procariótica.
186. CÉLULA HOSPEDEIRA, de acordo com a reivindicação 185, caracterizada pela célula procariótica ser uma célula de E. coli.
187. MÉTODO PARA PRODUZIR A MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ao antígeno biespecífica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 179, caracterizado por compreender cultivar a célula hospedeira conforme definida em qualquer uma das reivindicações 182 a 186 em um meio de cultura.
188. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 187, caracterizado pelo método compreender ainda recuperar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica a partir da célula hospedeira ou do meio de cultura.
189. CONJUNTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS ISOLADOS, caracterizado por codificar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 179.
190. CONJUNTO DE VETORES, caracterizado por cada vetor do conjunto compreender um ácido nucleico isolado do conjunto de ácidos nucleicos isolados conforme definido na reivindicação 189.
191. CONJUNTO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS, caracterizado por cada célula hospedeira do conjunto compreender um ácido nucleico isolado do conjunto de ácidos nucleicos isolados conforme definido na reivindicação 189 ou um vetor do conjunto de vetores conforme definido na reivindicação 190.
192. CONJUNTO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS, de acordo com a reivindicação 191, caracterizado pelas células hospedeiras compreenderem células de mamíferos.
193. CONJUNTO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS, de acordo com a reivindicação 192, caracterizado pelas células de mamíferos serem células de CHO.
194. CONJUNTO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS, de acordo com a reivindicação 191, caracterizado pelas células hospedeiras compreenderem células procarióticas.
195. CONJUNTO DE CÉLULAS HOSPEDEIRAS, de acordo com a reivindicação 194, caracterizado pelas células procarióticas serem células de E. coli.
196. MÉTODO PARA PRODUZIR A MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ao antígeno biespecífica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 179, caracterizado por compreender cultivar o conjunto de células hospedeiras conforme definido em qualquer uma das reivindicações 191 a 195 em um meio de cultura.
197. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 196, caracterizado pelo método compreender ainda recuperar a molécula de ligação ao antígeno biespecífica a partir do conjunto de células hospedeiras ou do meio de cultura.
198. IMUNOCONJUGADO, caracterizado por compreender a molécula de ligação ao antígeno biespecífica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 179 e um agente citotóxico.
199. COMPOSIÇÃO, caracterizada por compreender a molécula de ligação ao antígeno biespecífica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 179.
200. COMPOSIÇÃO, de acordo com a reivindicação 199, caracterizada por compreender ainda um transportador farmaceuticamente aceitável, excipiente ou diluente.
201. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 199 a 200, caracterizada pela composição ser uma composição farmacêutica.
202. COMPOSIÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 199 a 201, caracterizada pela composição compreender ainda um antagonista de ligação ao eixo PD-1 ou um agente terapêutico adicional.
203. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 179, caracterizada por ser para uso como um medicamento.
204. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 179, caracterizada por ser para uso no tratamento ou retardamento da progressão de um câncer positivo para HER2 em um paciente em necessidade do mesmo.
205. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 179, caracterizada por ser para uso no aperfeiçoamento da função imune em um paciente tendo câncer positivo para HER2.
206. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com a reivindicação 205, caracterizado pelo câncer positivo para HER2 ser selecionado a partir do grupo que consiste em câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma, glioblastoma, câncer de endométrio e osteossarcoma.
207. MOLÉCULA DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO BIESPECÍFICA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 204 a 206, caracterizada pelo câncer positivo para HER2 ser distinguido por células tumorais que expressam HER2 em um número médio de cópias de 200.000 cópias por célula ou mais.
208. USO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ao antígeno biespecífica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 179, caracterizado por ser para fabricação de um medicamento para tratar ou retardar a progressão de um câncer positivo para HER2.
209. USO DA MOLÉCULA DE LIGAÇÃO ao antígeno biespecífica, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 179, caracterizado por ser para fabricação de um medicamento para aperfeiçoar a função imune em um paciente tendo um câncer positivo para HER2.
210. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 208 a 209, caracterizado pelo câncer positivo para HER2 ser selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma, glioblastoma, câncer de endométrio e osteossarcoma.
211. USO, de acordo com qualquer uma das reivindicações
208 a 210, caracterizado pelo câncer positivo para HER2 ser distinguido por células tumorais que expressam HER2 em um número médio de cópias de
200.000 cópias por célula ou mais.
212. MÉTODO PARA TRATAR OU RETARDAR A PROGRESSÃO DE UM CÂNCER positivo para HER2 em um paciente em necessidade do mesmo, caracterizado por compreender administrar ao paciente a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 179.
213. MÉTODO PARA APERFEIÇOAR A FUNÇÃO IMUNE em um paciente tendo um câncer positivo para HER2, caracterizado por compreender administrar ao paciente a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 179.
214. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 212 ou 213, caracterizado pelo o câncer positivo para HER2 ser selecionado a partir do grupo que consiste em câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma, glioblastoma, câncer de endométrio e osteossarcoma.
215. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 212 a 214, caracterizado pelo câncer positivo para HER2 ser distinguido por células tumorais que expressam HER2 em um número médio de cópias de 200.000 cópias por célula ou mais.
216. MÉTODO PARA TRATAR OU RETARDAR A PROGRESSÃO DE UM CÂNCER positivo para HER2 em um paciente em necessidade do mesmo, caracterizado por compreender: (a) determinar uma expressão de HER2 em uma célula tumoral, em que a célula tumoral expressa HER2 em um número médio de cópias de 200.000 cópias por célula ou mais; e (b) administrar ao paciente a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 179.
217. MÉTODO PARA APERFEIÇOAR A FUNÇÃO IMUNE em um paciente tendo um câncer positivo para HER2, caracterizado por compreender: (a) determinar uma expressão de HER2 em uma célula tumoral, em que a célula tumoral expressa HER2 em um número médio de cópias de 200.000 cópias por célula ou mais; e (b) administrar ao paciente a molécula de ligação ao antígeno biespecífica, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 179.
218. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 216 ou 217, caracterizado pelo câncer positivo para HER2 ser selecionado a partir do grupo que consiste em câncer da mama, câncer gástrico, câncer colorretal, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer renal, câncer de bexiga, câncer de pâncreas, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de cabeça e pescoço, melanoma, câncer de ovário, mesotelioma, glioblastoma, câncer de endométrio e osteossarcoma.
219. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 212 a 218, caracterizado pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica ser administrada ao paciente em uma dosagem de cerca de 0,01 mg/kg a cerca de 10 mg/kg.
220. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 219, caracterizado pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica ser administrada ao paciente em uma dosagem de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg.
221. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 220, caracterizado pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica ser administrada ao paciente em uma dosagem de cerca de 1 mg/kg.
222. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 212 a 221, caracterizado por compreender ainda administrar ao paciente um antagonista de ligação ao eixo PD-1 e/ou um agente terapêutico adicional.
223. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 222, caracterizado pelo antagonista de ligação ao eixo PD-1 ou agente terapêutico adicional ser administrado antes ou após a administração da molécula de ligação ao antígeno biespecífica.
224. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 222, caracterizado pelo agente terapêutico adicional do antagonista de ligação ao eixo PD-1 ser administrado simultaneamente com a molécula de ligação ao antígeno biespecífica.
225. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 212 a 224, caracterizado pelo antagonista de ligação ao eixo PD-1 ser selecionado a partir do grupo que consiste em um antagonista de ligação a PD-L1, um antagonista de ligação ao PD-1 e um antagonista de ligação ao PD-L2.
226. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 225, caracterizado pelo antagonista de ligação ao eixo PD-1 ser um antagonista de ligação ao PD-L1.
227. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 226, caracterizado pelo antagonista de ligação ao PD-L1 ser selecionado a partir do grupo que consiste em MPDL3280A (atezolizumabe), YW243.55.S70, MDX- 1105, MEDI4736 (durvalumabe) e MSB0010718C (avelumabe).
228. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 225, caracterizado pelo antagonista de ligação ao eixo PD-1 ser um antagonista de ligação ao PD-1.
229. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 228, caracterizado pelo antagonista de ligação ao PD-1 ser selecionado a partir do grupo que consiste em MDX-1106 (nivolumabe), MK-3475 (pembrolizumabe), MEDI-0680 (AMP-514), PDR001 (espartalizumabe), REGN2810 (cemiplimabe) e BGB-108.
230. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 225, caracterizado pelo antagonista de ligação ao eixo PD-1 ser um antagonista de ligação ao PD-L2.
231. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 230, caracterizado pelo antagonista de ligação ao PD-L2 ser um anticorpo ou uma imunoadesina.
232. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 212 a 231, caracterizado pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica ser administrada por via subcutânea, intravenosa, intramuscular, tópica, oral, transdermal, intraperitoneal, intraorbital, por implantação, por inalação, intratecal, intraventricular ou intranasal.
233. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 232, caracterizado pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica ser administrada por via subcutânea.
234. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 232, caracterizado pela molécula de ligação ao antígeno biespecífica ser administrada por via intravenosa.
235. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 212 a 234, caracterizado pelo paciente ser um humano.
236. KIT, caracterizado por compreender: (a) a composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 199 a 202; e (b) uma bula que compreende instruções para administrar a composição a um paciente para tratar ou retardar a progressão de um câncer positivo para HER2.
237. KIT, de acordo com a reivindicação 236, caracterizado pelo câncer positivo para HER2 ser distinguido por células tumorais que expressam HER2 em um número médio de cópias de 200.000 cópias por célula ou mais.
SKBR3 MCF7
FIGURA 1
Variantes 1FablgG
HER2
CD3
HER2
4D5-WT (Monovalente) 4D5-LC_ H91A 4D5-HC_ D98A.F100A.Y102V 4D5-HC_ Y102V 4D5-LC_ Y55E Y102V
FIGURA 3
100 WT 4D5 100 LC_Y55E 100 LC_Y55E (Trastuzumab) HC_Y102V HC_D98A.F100A.Y102V 80 80 80 SKBR3 SKBR3 SKBR3 60 MCF7 MCF7 MCF7 60 60 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 505/547 40 40 40 (% Não Tratada) (% Não Tratada) 20 (% Não Tratada) 20 20 Morte de Células Alvo Morte de Células Alvo Morte de Células Alvo 0 0 0
0.00001 0,001 0,1 10 1000 100000 0,0001 0,01 1 100 10000 0,0001 0,01 1 100 10000 ng/mL ng/mL ng/mL FIGURA 2A FIGURA 2B FIGURA 2C
100 HC_D98A.F100A.Y102V 100 LC_H91A 100 HC_Y100aA 80 SKBR3 80 SKBR3 80 SKBR3 MCF7 MCF7 MCF7 60 60 60 40 40 40 (% Não Tratada) (% Não Tratada) (% Não Tratada) 20 20 20 Morte de Células Alvo Morte de Células Alvo Morte de Células Alvo 0 0 0 0,0001 0,01 1 100 10000 0,0001 0,01 1 100 10000 0,0001 0,01 1 100 10000 ng/mL ng/mL ng/mL FIGURA 2D FIGURA 2E FIGURA 2F
MFU FL4
4000
2000
0 0,001 0,01 0,1 1 10 FIGURA 4A µg/mL
250
200
150 MFU FL4
100
50
0 0,001 0,01 0,1 1 10 FIGURA 4B µg/mL
Atividade da Caspase 3/7 400 (Eventos/mm3)
300
200
100
0 0 10 20 30 40 50 FIGURA 5A Horas
600 CAtividade da Caspase 3/7 (Eventos/mm3)
400
200
0 0 10 20 30 40 50 FIGURA 5B Horas
Morte de Células Alvo (% Não Tratada) 80
60
40
20
0 FIGURA 6A 50 ng/mL 48H
100 Morte de Células Alvo (% Não Tratada)
80
60
40
20
0 FIGURA 6B 50 ng/mL 48H
100 Morte de Células Alvo (% Não Tratada)
80
60
40
20
0 FIGURA 6C 50 µg/mL 48H
4D5 lgG TDB do tipo selvagem MFU FL4
Y55E.H91A-1Fab-lgG TDB Y100Aa-1Fab-lgG TDB 500 H91A.N30A-1Fab-lgG TDB
0 0,01 0,1 1 10 100 FIGURA 7A µg/mL
40
30 MFU FL4
4D5 lgG TDB do tipo selvagem 20 H91A.N30A-1Fab-lgG Y100Aa-1Fab-lgG Y55E.H91A-1Fab-lgG 10
0 0,01 0,1 1 10 100 FIGURA 7B µg/mL
100 Morte de Células Alvo (% Não Tratada)
80
60 H91A-1Fab-lgG TDB H91A.N30A-1Fab-lgG TDB 40 Y100Aa-1Fab-lgG TDB
20
0 0,01 1 100 10000 FIGURA 8 ng/mL
Morte de Células Alvo 100 (% Não Tratada) 80 60 40 20 0 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 ng/mL SKBR3 SKBR3 MCF7 MCF7 FIGURA 9 10000 1000 HER2 alta (nRPKM >400) ERBB2 nRPKM 100 HER2 média (nRPKM 50-400) 10 HER2 baixa (nRPKM <50) 1
0.1 0 50 100 Linhagem Celular # FIGURA 10
Morte (%) Morte (%) 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 511/547 MDA-MB-436 MDA-MB-436 PC3 PC3 MCF7/neo-cl3 MCF7/neo-cl3 50 ng/mL 50 ng/mL MDA-MB-231 MDA-MB-231 LS1034 LS1034 HT55 HT55
MDA-MB-453 MDA-MB-453 MDA-MB-175-VII MDA-MB-175-VII FIGURA 11B FIGURA 11A JIMT-1 JIMT-1 MKN7 MKN7 MDA-MB-361 MDA-MB-361 SKBR3 SKBR3 BT474-M1 BT474-M1 SK-OV-3 SK-OV-3 KPL4 KPL4
CD69+CD5+ (% CD) 0 20 40 60 80 100 Amplif. HER2 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 512/547 MDA-MB-436 MDA-MB-436 PC3 PC3 MCF7/neo-cl3 50 ng/mL MCF7/neo-cl3 MDA-MB-231 MDA-MB-231 LS1034 LS1034 HT55 HT55
MDA-MB-453 + MDA-MB-453 MDA-MB-175-VII MDA-MB-175-VII FIGURA 11D FIGURA 11C JIMT-1 JIMT-1 MKN7 MKN7 MDA-MB-361 MDA-MB-361 SKBR3 SKBR3 BT474-M1 BT474-M1 SK-OV-3 SK-OV-3 KPL4 + + + + + + KPL4
Morte (%) Morte (%) 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 513/547 MDA-MB-436 MDA-MB-436 PC3 PC3 MCF7/neo-cl3 MCF7/neo-cl3 50 ng/mL 50 —g/mL MDA-MB-231 MDA-MB-231 LS1034 LS1034 HT55 HT55 MDA-MB-453 MDA-MB-453
MDA-MB-175-VII MDA-MB-175-VII FIGURA 12B FIGURA 12A JIMT-1 JIMT-1 MKN7 MKN7 MDA-MB-361 MDA-MB-361 SKBR3 SKBR3 BT474-M1 BT474-M1 SK-OV-3 SK-OV-3 KPL4 KPL4
CD69+CD5+ (% CD) 0 20 40 60 80 100 Amplif. HER2 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 514/547 MDA-MB-436 MDA-MB-436 PC3 PC3 MCF7/neo-cl3 50 ng/mL MCF7/neo-cl3 MDA-MB-231 MDA-MB-231 LS1034 LS1034 HT55 HT55 MDA-MB-453
+ MDA-MB-453 MDA-MB-175-VII MDA-MB-175-VII FIGURA 12D FIGURA 12C JIMT-1 JIMT-1 MKN7 MKN7 MDA-MB-361 MDA-MB-361 SKBR3 SKBR3 BT474-M1 BT474-M1 SK-OV-3 SK-OV-3 KPL4 + + + + + + KPL4 lgG TDB Morte (%)
50
0 1Fab-lgG TDB
0,0001 0,01 1 100 10000 ng/mL HER2 TDB
FIGURA 13
Eventos da Caspase 3/7
5 0,5 100 0
50
0 0 20 40 60 FIGURA 14A Horas
150 5000 500 50 Eventos da Caspase 3/7
5 0,5 100 0
50
0 0 20 40 60 FIGURA 14B Horas
Número de Cópias de Receptor Morte (%) Morte (%) Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 517/547 0 60 20 40 80 0
200.000
400.000
600.000
800.000 1 x 106 0 100 20 40 60 80 100 nRPKM HCC1187 58,7 NCI-H522 61,7 VP267 64,5 EFM-19 83,2 ZFR-75-1 105 NUGC-4 122 YMB-1 148
FIGURA 15A SNU-216 186 OE-33 260 EFM-192C 489 HCC202 533 SKBR3 735 Calu-3 1150 HT55 KPL4 CHO-K1 >400 50-400 HER2 nRPKM 1 µg/mL 48H 1 µg/mL 48H
IHC 0 FISH-
IHC 1+ FISH-
IHC 2+ FISH-
IHC 2+ FISH+
IHC 3+ FISH+
FIGURA 15B
Morte de Células Alvo (% Não Tratada) 80
60
40
20
0 IHC 0 FISH-
IHC1+ FISH-
IHC2+ FISH-
IHC2+ FISH+
IHC3+ FISH+
FIGURA 15C
MCF7 HT55 KPL4
HER2
Amplif. +
FIGURA 16
Veículo + PBMC 5 mg/kg Sem células T 0,05 mg/kg + PBMC 2048 1024 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 520/547 512 256 128 64 32
FIGURA 17 4 5 6 4096 0,5 mg/kg + PBMC 5 mg/kg + PBMC 0,05 mg/kg + PBMC 2048 Volume Tumoral (mm3) 1024 512 256 128 64 32 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 Dia
Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 521/547 256 128 64 Veículo + PBMC 50 mg/kg Sem células T 10 mg/kg + PBMC 32 4 5 6 2048 1024 512 FIGURA 18
256 128 64 50 mg/kg + PBMC 0,5 mg/kg + PBMC 0,1 mg/kg + PBMC Volume Tumoral (mm3) 32 7 2048 0,5 mg/kg + PBMC 1024 512 256 128 64 32 0 5 10 15 20 25 Dia
2048 Veículo + PBMC 5 mg/kg Sem células T 0,5 mg/kg + PBMC 1024 512 256 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 522/547 128 64 32 16 8 4 4 5 6 4096 0,5 mg/kg + PBMC 5 mg/kg + PBMC 0,05 mg/kg Sem células T 2048 1024 512 FIGURA 19 256
128 64 32 16 8 Volume Tumoral (mm3) 4 7 4096 2048 0,05 mg/kg + PBMC 1024 512 256 128 64 32 16 8 4 0 5 10 15 20 25 30 Dia
Morte de SKBR3 (% Não tratada) 80
60
40
20 LC_H91A LC_D98A.F100A.Y102V 0 0,0001 0,01 1 100 10000 ng/mL FIGURA 20
Morte de Células Alvo Morte de Células Alvo (% Não Tratada) (% Não Tratada) 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 524/547 MDA-MB-361 MDA-MB-361 EFM-192C EFM-192C HCC202 HCC202 EFM-192B EFM-192B SKBR3 SKBR3 MDA-MB-330 MDA-MB-330 BT-474 BT-474 HCC1569 HCC1569
SKOV3 SKOV3 KYSE-410 KYSE-410 KPL4 KPL4 UACC-812 UACC-812 Calu3 Calu3 FIGURA 21B FIGURA 21A HCC1954 HCC1954 EFM-192A EFM-192A ZR-75-1 ZR-75-1 NCIH 2170 NCIH 2170 HCC1419 HCC1419 OE19 OE19 UACC-893 UACC-893 NCI-N87 NCI-N87
FIGURA 26 FIGURA 24 FIGURA 22 % de Diferença em Morte % de Diferença em Potência % de Diferença em Potência Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 525/547 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 CAPAN1 HCC 1187 MDA-MB-361 EFM-192C SNU-484 NCI H522 HCC202 CFPAC1 VP 267 EFM-192B SKBR3 RT4 EFM-19 MDA-MB-330 HCC2935 ZR-75-1 BT-474
HCC1569 HCC1187 NUGC-4 SKOV3 H1666 YMB-1 KYSE-410 KPL4 RERF-GC-1B NCIH 441 UACC-893 SK-CO-1 SNU-216 Calu3 LC_H91A Mais Potente LC_H91A Mais Potente LC_H91A Mais Potente HC_D98A.F100A.Y102V Mais Potente HCC1954 NCIH522 OE33 EFM-192A ZR-75-1 HC_D98A.F100A.Y102V Mais Potente HC_D98A.F100A.Y102V Mais Potente HUP-T4 EFM-192C NCIH 2170 HCC1354 HCC202 HCC1419 SKBR3 SKBR3 OE19 UACC-893
Morte de Células Alvo Morte de Células Alvo (% Não Tratada) (% Não Tratada) 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 526/547 HCC1187 HCC1187 NCIH522 NCIH522 VP267 VP267 EFM-19 EFM-19 ZR-75-1 ZR-75-1 NUGC-4 NUGC-4
YMB-1 YMB-1 NCIH 441 NCIH 441 FIGURA 23B FIGURA 23A SNU-216 SNU-216 OE33 OE33 EFM-192C EFM-192C HCC202 HCC202 SKBR3 SKBR3
Morte de Células Alvo Morte de Células Alvo (% Não Tratada) (% Não Tratada) 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 527/547 CAPAN1 CAPAN1 SNU-484 SNU-484 CFPAC1 CFPAC1 RT4 RT4 HCC2935 HCC2935 HCC1187 HCC1187
H1666 H1666 RERF-GC-1B RERF-GC-1B FIGURA 25B FIGURA 25A SK-CO-1 SK-CO-1 NCIH522 NCIH522 HUP-T4 HUP-T4 HCC1354 HCC1354 SKBR3 SKBR3
DKTHTGGGGSGG
DKTHT FIGURA 27A 3000 2000 MFU FL4 1000 0 0,001 0,01 0,1 1 10 100 FIGURA 27B µg/mL 200 150 MFU FL4 100 50 0 0,001 0,01 0,1 1 10 100 FIGURA 27C µg/mL
Efeito na sinalização de PI3K 1FablgG T-Mab 0 5 Pin 30 Pin 2 Kr 0 5 Pin 30 Pin 2 Kr HRG pHER3 HER3 pAKTS473
AKT pPRAS40 PRAS40 FIGURA 28A 100 Viabilidade de SKBR3 75 (% Não tratada) 50 Anti-HER2/CD3 1FablgG 25 Anti-HER2/CD3 lgG TDB Trastuzumabe 0 0,01 1 100 10000 ng/mL FIGURA 28B
WT Y55E.Y102V Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 530/547 FIGURA 29A FIGURA 29B
D98A.F100A.Y102V H91A FIGURA 29C FIGURA 29D
N30S N54E.D98T Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 531/547 FIGURA 30A FIGURA 30B
N30S.N54E.D98T FIGURA 30C
N30S.Y55E.N54E.D98T.Y102V N30S.Y54E.D98T.F100A.Y102V Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 532/547 FIGURA 31A FIGURA 31B
N30S.H91A.N54E.D98T FIGURA 31C
WT H91A 50 50 40 40 30 30 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 533/547 20 20 10 10 0 0 -100 0 100 200 300 400 500 -100 0 100 200 300 400 500 FIGURA 32A FIGURA 32B
Y55E.H91A Y55E.D98A.F100A.Y102V 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 0 -100 0 100 200 300 400 500 -100 0 100 200 300 400 500 FIGURA 32C FIGURA 32D
D98A.F100A.Y102V H91A.D98A.F100A.Y102V 50 50 40 40 30 30 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 534/547 20 20 10 10 0 0 -100 0 100 200 300 400 500 -100 0 100 200 300 400 500 FIGURA 32E FIGURA 32F
Y55E.H91A.D98A.F100A.Y102V Y55E.Y102V 50 50 40 40 30 30 20 20 10 10 0 0 -100 0 100 200 300 400 500 -100 0 100 200 300 400 500 FIGURA 32G FIGURA 32H
Y102V H91A.Y102V 50 50 40 40 30 30 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 535/547 20 20 10 10 0 0 -100 0 100 200 300 400 500 -100 0 100 200 300 400 500 FIGURA 32I FIGURA 32J
Y55E.H91A.Y102V 50 40 30 20 10 0 -100 0 100 200 300 400 500 FIGURA 32K
SKBR3 100
80 Morte de Células Alvo (% Não Tratada)
60
40
20
0
0,000001 0,0001 0,01 1 100 10000 1000000 ng/mL FIGURA 33A
MCF7 100
80 Morte de Células Alvo (% Não Tratada)
60
40
20
0
0,000001 0,0001 0,01 1 100 10000 1000000 ng/mL FIGURA 33B
SKBR3 1500
1000 MFU FL4
500
0 0,001 0,01 0,1 1 10 100 µg/mL FIGURA 34A
MCF7 25
20
15 MFU FL4
10
5
0 0,001 0,01 0,1 1 10 100 µg/mL FIGURA 34B
Alta Afinidade Monovalente HER2 CD3 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 538/547 Superexpressão Baixa Expressão (Tumor HER2+) (Tecidos Normais)
Alta Afinidade - Alta Atividade Alta Afinidade - Atividade Moderada FIGURA 35A
Baixa Afinidade Monovalente HER2 CD3 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 539/547
Baixa Afinidade - Baixa/Nenhuma Atividade Baixa Afinidade - Baixa/Nenhuma Atividade FIGURA 35B
Baixa Afinidade Bivalente HER2 CD3 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 540/547 HER2
Efeito de Avidez - Alta Atividade Baixa Afinidade - Baixa/Nenhuma Atividade FIGURA 35C
7C2 Domínio I Domínio II 2C4 Pertuzumabe Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 541/547 100Å 50Å Domínio III
Domínio IV 4D5 Trastuzumabe FIGURA 36
100 SKBR3 (HER2 alta) Morte de Células Alvo (% Não Tratada) 80 60 40 MCF7 (HER2 baixa) 20 0 FIGURA 37 0,0001 0,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000 TDB ng/mL 20000 15000 4D5-WT lgG TDB
RLU 10000 + SKBR3 4D5-WT lgG TDB 4D5-H91A 5000 1Fab-lgG TDB 0 FIGURA 38A 10 100 1000 10000 100000 ng/mL 30 CD25+ CD69+ (% of CD8+) 20 OKT3 4D5-WT lgG TDB 4D5-H91A 1Fab-lgG TDB 10 0 FIGURA 38B 10 100 1000 10000 100000 ng/mL
CRP Linfócitos 8 10 7 8 6 5 6 Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 543/547 4 4 mg/dL 3 2 Contagens 103/µL 2 1 0 0 D-14 D-7 D2 D8 D-14 D-7 D2 D8 Dias no Estudo Dias no Estudo Veículo
3 mg/kg FIGURA 38C 20 mg/kg
ALT AST 500 1250 400 1000 300 750 U/L U/L 200 500 100 250 0 0 D-14 D-7 D2 D8 D-14 D-7 D2 D8 Dias no Estudo Dias no Estudo
20 mg/kg 3 mg/kg 1 0 5 10 15 Dia
Nível de dose Cmax (µg/mL) AUC (µg/mL-dia) CL (mL/dia/kg) 3 mg/kg 74,8 ± 1,0 379 ± 65 8,1 ± 1,3 20 mg/kg 716 ± 38 3351 ± 538 6,1 ± 1,0
FIGURA 38D
100 100 Diluição 80 80 50 x Morte de SKBR3
100 x (% Não tratada)
1000 x 60 60 10000 x 100000 x 40 40 1000 ng/mL 10 ng/mL 20 20
0 0 D7 D14 Controle
FIGURA 38E
4D5 WT: 0,3 nM D98A.F100A.Y102V: 21 nM N30S D98A.F100A (Nenhuma H91A Y102V (Diminuição de alteração) (Diminuição (Nenhuma 70 vezes) Y55E de 163 vezes) alteração) (Pequeno aum.) Y55E.D98A.F100A.Y102V: 14 nM N30S.N54E Petição 870200099301, de 07/08/2020, pág. 545/547 N30S: 0,3 nM H91A: 49 nM Y102V: 0,3 nM N54E.D98T (Aumento de 4,3 vezes) (Nenhuma alteração) N30A Y55E Y55E (Diminuição de 7,2 vezes) (Diminuição de 3,5 vezes) (Diminuição de 7,3 vezes) N30S.N54E.D98A.F100A.Y102V: 13 nM N30A.H91A: 353 nM Y55E.H91A: 172 nM Y55E.Y102V: 2,2 nM N54E.D98T: 0,07 nM D98T.F100A.Y102V: 13 nM H91A N30S (Diminuição de 91 vezes) (Nenhuma alteração)
Y55E H91A.N54E.D98T: 6,4 nM N30S.N54E.D98T: 0,06 nM N30S.N54E (Diminuição de (Nenhuma alteração) 20 vezes) N30S H91A F100A.Y102V Y55E.H91A.N54E.D98T: 126 nM (Nenhuma alteração) (Diminuição (Diminição de de 133 vezes) 150 vezes) Y102V (Diminuição de 2,6 vezes) N30S.H91A.N54E.D98T: 8 nM N30S.N54E.D98T.F100A.Y102V: 9 nM Y55E Y55E.H91A.N54E.D98A.Y102V: 49 nM (Diminuição de 6,1 vezes) N30S N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T: 49 nM (Pequena dim.) FIGURA 39 N30S.Y55E.H91A.N54E.D98T.Y102V: 70 nM
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