KR20180073561A - 이중특이적 항-ceaxcd3 t 세포 활성화 항원 결합 분자 - Google Patents

이중특이적 항-ceaxcd3 t 세포 활성화 항원 결합 분자 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로 T 세포 활성화 및 특이적 표적 세포로의 방향 전환을 위한 신규한 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법, 및 질병의 치료에 이들 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

이중특이적 항-CEAXCD3 T 세포 활성화 항원 결합 분자
본 발명은 일반적으로 T 세포를 활성화시키는 이중특이적 항원 결합 분자에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법, 및 질병의 치료에서 이들 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하는 방법에 관한 것이다.
개별 세포 또는 특이적 세포 유형의 선택적 파괴는 종종 다양한 임상적 환경에서 바람직하다. 예를 들면, 건강한 세포 및 조직을 온전하고 손상되지 않은 상태로 남기면서 종양 세포를 특이적으로 파괴하는 것이 암 치료의 일차 목적이다.
이것을 달성하는 흥미로운 방법은 종양에 대한 면역 반응을 유도함으로써 면역 효과기 세포, 예컨대, 자연 살해(NK) 세포 또는 세포독성 T 림프구(CTL) 공격을 유발하고 종양 세포를 파괴하는 것이다. CTL은 면역계의 가장 강력한 효과기 세포를 구성하지만, 이들은 종래 치료 항체의 Fc 도메인에 의해 매개되는 효과기 기작에 의해 활성화될 수 없다.
이와 관련하여, 하나의 "아암(arm)"으로 표적 세포 상의 표면 항원에 결합하고 제2 "아암"으로 T 세포 수용체(TCR) 복합체의 활성화 불변 성분에 결합하도록 설계된 이중특이적 항체가 최근에 관심을 끌고 있다. 이러한 항체와 이의 표적 둘 다의 동시적인 결합은 표적 세포와 T 세포 사이의 일시적인 상호작용을 발생시켜 임의의 세포독성 T 세포의 활성화 및 표적 세포의 후속 용해를 야기한다. 따라서, 면역 반응은 표적 세포로 방향 전환되고, CTL의 일반적인 MHC-제한된 활성화와 관련될 수 있는 표적 세포에 의한 펩티드 항원 제시 또는 T 세포의 특이성과 무관하다. 이와 관련하여, 표적 세포가 이중특이적 항체를 CTL에 제시할 때, 즉 면역학적 시냅시스가 모방될 때에만 CTL이 활성화된다는 것은 중요하다. 표적 세포의 효율적인 용해를 이끌어내기 위해 림프구 예비컨디셔닝(preconditioning) 또는 보조자극을 요구하지 않는 이중특이적 항체가 특히 바람직하다.
여러 이중특이적 항체 포맷이 개발되었고, T 세포-매개된 면역치료에 대한 이들의 적합성이 연구되었다. 이들 중에서 소위 BiTE(이중특이적 T 세포 개입유발자(engager)) 분자는 매우 잘 특징규명되어 있고 이미 임상에서 일부 가능성을 보여주었다(문헌[Nagorsen and Bauerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260(2011)]에서 검토됨). BiTE는 2개의 scFv 분자가 유연한 연결기에 의해 융합되어 있는 탠덤(tandem) scFv 분자이다. T 세포 개입에 대해 평가되는 추가의 이중특이적 포맷은 다이아바디(문헌[Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305(1996)]) 및 이의 유도체, 예컨대, 탠덤 다이아바디(문헌[Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-66(1999)])를 포함한다. 보다 최근의 개발은 다이아바디 포맷에 근거하지만 추가의 안정화를 위한 C-말단 다이설파이드 가교를 특징으로 하는 소위 DART(이중 친화성 재표적화) 분자이다(문헌[Moore et al., Blood 117, 4542-51(2011)]). 전체 하이브리드 마우스/래트 IgG 분자이고 또한 현재 임상 시험에서 평가되고 있는 소위 트라이오맙(triomab)은 보다 큰 크기의 포맷을 대표한다(문헌[Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467(2010)]에서 검토됨).
개발되고 있는 다양한 포맷은 면역치료에서 T 세포 방향 전환 및 활성화에 기인하는 큰 잠재력을 보여준다. 그러나, 그에 적합한 이중특이적 항체를 발생시키는 작업은 결코 쉽지 않고 항체의 효능, 독성, 적용가능성 및 제조가능성과 관련되어 충족되어야 하는 다수의 과제를 수반한다.
작은 구축물, 예컨대, BiTE 분자는 효과기와 표적 세포를 효율적으로 교차결합시킬 수 있지만 매우 짧은 혈청 반감기를 가지므로, 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 필요가 있다. 다른 한편으로, IgG-유사 포맷은 긴 반감기라는 큰 이점을 갖지만 IgG 분자에 내재하는 천연 효과기 기능과 관련된 독성을 갖는다. 이들의 면역원성 잠재력은 성공적인 치료제 개발에 있어서 IgG-유사 이중특이적 항체, 특히 비인간 포맷의 또 다른 불리한 특징을 구성한다. 마지막으로, 이중특이적 항체의 일반적인 개발에 있어서 주요 과제는 이중특이적 항체 구축물을 임상적으로 충분한 양 및 순도로 제조하는 것인데, 공동-발현시 상이한 특이성의 항체 중쇄와 경쇄의 짝풀림으로 인해, 이는 정확히 조립된 구축물의 수율을 감소시키고 원하는 이중특이적 항체를 분리하는 것이 어려울 수 있는 다수의 비기능적 부산물을 초래한다.
이중특이적 항체에서 쇄 회합 문제를 극복하기 위해 다른 접근법을 실행하였다(예를 들면, 문헌[Klein et al., mAbs 6, 653-663 (2012)] 참조). 예를 들면, "놉-인투-홀(knob-into-hole)" 전략은 돌연변이를 CH3 도메인에 도입하여 접촉 계면을 변형시켜 2개의 상이한 항체 중쇄의 쌍을 가용하는 것이 목표이다. 하나의 쇄에서 벌키 아미노산은 짧은 측쇄를 갖는 아미노산으로 대체되어 "홀"을 생성한다. 반대로, 긴 측쇄를 갖는 아미노산은 다른 CH3 도메인에 도입되어 "놉"을 생성한다. 이러한 2개 중쇄(및 2개의 동일한 경쇄, 이는 중쇄 모두에 대해 적합해야 함)를 공동-발현시킴으로써, 고수율의 이종이량체(놉-홀) 대 동종이량체(홀-홀 또는 놉-놉)가 관찰된다(문헌[Ridgway, J.B., et al., 단백질 Eng. 9(1996) 617-621]; 및 WO 96/027011). 이종이량체의 백분율은, 파지 디스플레이 접근법 및 이종이량체를 안정화시키기 위한 다이설파이드 가교의 도입을 사용하여 2개의 CH3 도메인의 상호작용 표면을 개조하여 추가로 증가될 수 있다(문헌[Merchant, A.M., et al., Nature Biotech. 16(1998) 677-681]; [Atwell, S., et al., J. Mol. Biol. 270(1997) 26-35]). 놉-인투-홀 기법에 대한 신규한 접근법은 예를 들면 EP 1870459 A1에 기재되어 있다.
그러나, 놉-인투-홀 전략은 상이한 표적 항원에 결합하는 상이한 경쇄를 포함하는 이중특이적 항체에서 발생하는 중쇄-경쇄 짝풀림 문제를 해결하지 못한다.
중쇄-경쇄 짝풀림을 방지하기 위한 전략은 이중특이적 항체의 결합 아암 중 하나의 중쇄와 경쇄 사이에 도메인을 교환하는 것이다(WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254 및 문헌[Schaefer, W. et al, PNAS, 108(2011) 11187-11191](이는 도메인 교차형을 갖는 이중특이적 IgG 항체에 관함) 참조).
이중특이적 항체의 결합 아암 중 하나에서 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 VH 및 VL의 교환(WO 2009/080252, 또한 문헌[Schaefer, W. et al, PNAS, 108(2011) 11187-11191] 참조)은 (상기 도메인을 교환하지 않는 접근법에 비해) 제1 항원에 대한 경쇄와 제2 항원에 대한 잘못된 중쇄의 짝풀림에 의해 야기된 부산물을 분명히 감소시킨다. 그럼에도 불구하고, 이러한 항체 제조가 완전히 부산물을 함유하지 않는 것은 아니다. 주요 부산물은 벤스 존스 유형(Bence Jones-type) 상호작용에 기초한다(문헌[Schaefer, W. et al, PNAS, 108(2011) 11187-11191]; 보충자료의 도면 S1I). 따라서, 상기 부산물의 추가 감소는 예를 들면 상기 이중특이적 항체의 수율을 개선시키는 데 바람직하다.
T 세포 항원 및 표적 세포 항원 둘 다에 대한 표적 항원 및 적절한 결합제의 선택은 치료적 적용을 위한 T 세포 이중특이적(TCB) 항체의 생성에서 보다 중요한 측면이다. 암배 항원(CEA)은 CEA 발현의 출현율이 일반적으로 종양에서 높으나 정상 조직에서는 낮기 때문에 매력적인 표적 항원이다. 따라서, 많은 항체가 이러한 표적에 대해 제기되었고, 이들 중 하나는 뮤린 항체 T84.66이며(문헌[Wagener et al., J Immunol 130, 2308 (1983)], [Neumaier et al., J Immunol 135, 3604 (1985)]), 이는 또한 키메라화되고(WO 1991/01990) 인간화되었다(WO 2005/086875). WO 2007/071426 또는 WO 2014/131712는 T 세포 상의 CD3 및 표적 세포 상의 암배 항원(CEA)을 표적화하는 이중특이적 항체를 기재한다.
본 발명은 낮은 독성 및 유리한 약동학적 특성과 함께 우수한 효능 및 제조가능성을 겸비하는, CD3 및 CEA를 표적화하는 T 세포 활성화 및 방향 전환을 위해 설계된 신규하고 개선된 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다.
본 발명자는 신규한 인간화된 항-CEA 항체를 사용하여 예상 밖의 개선된 특성을 갖는 신규한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 개발하였다.
따라서, 제1 양상에서, 본 발명은
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 모이어티; 및
(b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 모이어티
를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되,
제1 항원이 활성화 T 세포 항원이고 제2 항원이 CEA이거나, 제1 항원이 CEA이고 제2 항원이 활성화 T 세포 항원이고;
CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티가 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 15의 HCDR 2 및 서열번호 16의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 특히 인간화된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 18의 LCDR 2 및 서열번호 19의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 특히 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 제1 및/또는 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이다. 특정 실시양태에서, 제2 항원 결합 모이어티는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자이되, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체된다(즉, 이러한 실시양태에 따라, 제2 Fab 분자는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 또는 불변 도메인이 교환되는 교차 Fab 분자이다).
특정 실시양태에서, 제1 (및 존재하는 경우 제3) Fab 분자는 통상적 Fab 분자이다. 추가로 특정한 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 Fab 분자가 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 존재한다(즉, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 1가 결합을 제공한다).
하나의 실시양태에서, 제1 항원은 CEA이고, 제2 항원은 활성화 T 세포 항원이다. 보다 구체적인 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 CD3 엡실론이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자; 및
(b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체되는, 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자
를 포함하되;
제1 항원은 CEA이고 제2 항원은 활성화 T 세포 항원이고;
(a)의 제1 Fab 분자는 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 15의 HCDR 2 및 서열번호 16의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 특히 인간화된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 18의 LCDR 2 및 서열번호 19의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 특히 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 추가적 양상에 따라, 바람직하지 않은 부산물, 특히 이중특이적 항체의 결합 아암 중 하나에서 VH/VL 도메인 교환을 갖는 이중특이적 항체에서 발생하는 벤스 존스 유형 부산물과 비교한 바람직한 이중특이적 항체의 비는 CH1 및 CL 도메인에서 구체적 아미노산 위치에서 반대 전하로 대전된 아미노산의 도입에 의해 개선될 수 있다(이는 때때로 "전하 변형"으로 지칭됨).
따라서, 일부 실시양태에서, (a)의 제1 항원 결합 모이어티는 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자이고, (b)의 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자이고;
i) (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트(Kabat)에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되거나(카바트 EU 지수에 따라 넘버링);
ii) (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
하나의 이러한 실시양태에서, (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로) 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
추가적 실시양태에서, (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
또 다른 실시양태에서, (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로) 치환되고(카바트에 따라 넘버링), 위치 123의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로) 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
특정 실시양태에서, (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
또 다른 특정한 실시양태에서, (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 아르기닌(R)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
대안적 실시양태에서, (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로) 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
추가적 실시양태에서, (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
또 다른 실시양태에서, (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로) 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로) 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
하나의 실시양태에서, (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
또 다른 실시양태에서, (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 아르기닌(R)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자; 및
(b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자를 포함하되;
제1 항원은 CEA이고, 제2 항원은 활성화 T 세포 항원이고;
(a)의 제1 Fab 분자는 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 15의 HCDR 2 및 서열번호 16의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 특히 인간화된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 18의 LCDR 2 및 서열번호 19의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 특히 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함하고;
(a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로) 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로) 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제3 항원 결합 모이어티를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 제3 항원 결합 모이어티는 제1 항원 결합 모이어티와 동일하다. 하나의 실시양태에서, 제3 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이다.
특정 실시양태에서, 제3 및 제1 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이고, 제3 Fab 분자는 제1 Fab 분자와 동일하다. 이러한 실시양태에서, 제3 Fab 분자는 존재하는 경우 제1 Fab 분자와 동일한 아미노산 치환을 포함한다. 제1 Fab 분자와 마찬가지로, 제3 Fab 분자는 특히 통상적 Fab 분자이다.
제3 항원 결합 모이어티가 존재하는 경우, 특정 실시양태에서, 제1 및 제3 항원 모이어티는 CEA에 특이적으로 결합하고, 제2 항원 결합 모이어티는 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합한다.
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부 실시양태에서, (a)의 제1 항원 결합 모이어티 및 (b)의 제2 항원 결합 모이어티는 임의적으로 펩티드 연결기를 통해 서로 융합된다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이다. 구체적인 이러한 실시양태에서, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 대안적인 이러한 실시양태에서, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. (i) 제2 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되거나 (ii) 제1 Fab 분자가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되는 실시양태에서, 추가적으로 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 임의적으로 펩티드 연결기를 통해 서로 융합될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 추가적으로 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 상이한 배열을 가질 수 있다, 즉, 제1, 제2 (및 임의적으로 제3) 항원 결합 모이어티는 여러 방법으로 서로 융합될 수 있고 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 성분은 서로 직접 융합되거나 바람직하게는 하나 이상의 적합한 펩티드 연결기를 통해 융합될 수 있다. Fab 분자가 Fc 도메인의 서브유닛의 N-말단에 융합되는 경우, 이는 전형적으로 면역글로불린 힌지 영역을 통한다.
하나의 실시양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이고, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 이러한 실시양태에서, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 또는 Fc 도메인의 서브유닛 중 나머지 하나의 N-말단에 융합될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 분자이고, 제1 및 제2 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다. 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 면역글로불린 분자를 근본적으로 포함하되, Fab 아암 중 하나에서 중쇄 및 경쇄 가변 영역 VH 및 VL(또는 본원에 기재된 전하 변형이 CH1 및 CL 도메인에 도입되지 않는 실시양태에서 불변 영역 CH1 및 CL)은 서로 교환/대체된다(도 1A 및 1D 참조).
대안적 실시양태에서, 제3 항원 결합 모이어티, 특히 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 특정한 이러한 실시양태에서, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제1 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 근본적으로 면역글로불린 분자를 포함하되, Fab 아암 중 하나에서 중쇄 및 경쇄 가변 영역 VH 및 VL(또는 본원에 기재된 전하 변형이 CH1 및 CL 도메인에 도입되지 않은 실시양태에서 불변 영역 CH1 및 CL)은 서로 교환/대체되고, 추가적 (통상적) Fab 분자는 상기 Fab 아암에 N-말단 융합된다(도 1B 및 1E 참조). 또 다른 이러한 실시양태에서, 제1 및 제3 항원 결합 모이어티는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제2 항원 결합 모이어티는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 근본적으로 면역글로불린 Fab 아암 중 하나에 N-말단 융합된 추가적 Fab 분자를 갖는 면역글로불린 분자를 포함하되, 상기 추가적 Fab 분자에서 중쇄 및 경쇄 가변 영역 VH 및 VL(또는 본원에 기재된 전하 변형이 CH1 및 CL 도메인에 도입되지 않은 실시양태에서 불변 영역 CH1 및 CL)은 서로 교환/대체된다(도 1C 및 1F 참조).
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함되는 면역글로불린 분자는 IgG 부류 면역글로불린이다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG1 하위부류 면역글로불린이다. 또 다른 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG4 하위부류 면역글로불린이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자;
(b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자;
(c) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자; 및
(d) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되;
제1 항원은 CEA이고, 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론이고;
(c)의 제3 Fab 분자는 (a)의 제1 Fab 분자와 동일하고;
(i) (a)의 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (b)의 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, (b)의 제2 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 (d)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
(ii) (b)의 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (a)의 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, (a)의 제1 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 (d)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고;
(a)의 제1 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자는 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 15의 HCDR 2 및 서열번호 16의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 특히 인간화된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 18의 LCDR 2 및 서열번호 19의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 특히 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자;
(b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자; 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되;
제1 항원은 CEA이고, 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론이고;
(i) (a)의 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (b)의 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, (b)의 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (c)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
(ii) (b)의 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (a)의 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, (a)의 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (c)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고;
(a)의 제1 Fab 분자는 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 15의 HCDR 2 및 서열번호 16의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 특히 인간화된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 18의 LCDR 2 및 서열번호 19의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 특히 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
추가적 실시양태에서, 본 발명은
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자;
(b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자; 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되;
(i) 제1 항원은 CEA이고, 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론이거나;
(ii) 제2 항원은 CEA이고, 제1 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론이고;
(a)의 제1 Fab 분자 및 (b)의 제2 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 (c)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고;
CEA에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 15의 HCDR 2 및 서열번호 16의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 특히 인간화된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 18의 LCDR 2 및 서열번호 19의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 특히 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 모든 상이한 배열에서, 본원에 기재된 아미노산 치환은, 존재하는 경우, 제1 및 (존재하는 경우) 제3 Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인에 또는 제2 Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 이들은 제1 및 (존재하는 경우) 제3 Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인에 존재한다. 본 발명의 개념에 따라, 본원에 기재된 아미노산 치환이 제1 (및, 존재하는 경우, 제3) Fab 분자에 존재하는 경우, 이러한 아미노산 치환은 제2 Fab 분자에는 존재하지 않는다. 역으로, 본원에 기재된 아미노산 치환이 제2 Fab 분자에 존재하는 경우, 이러한 아미노산 치환은 제1 (및, 존재하는 경우, 제3) Fab 분자에 존재하지 않는다. 아미노산 치환은 Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 도메인 CL 및 CH1이 각각 대체된 Fab 분자를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 존재하지 않는다.
특히 본원에 기재된 아미노산 치환이 제1 (및, 존재하는 경우, 제3) Fab 분자에 존재하는 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정 실시양태에서, 제1 (및, 존재하는 경우, 제3) Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 동종형의 것이다. 특히 본원에 기재된 아미노산 치환이 제2 Fab 분자에 존재하는 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 다른 실시양태에서, 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 동종형의 것이다. 일부 실시양태에서, 제1 (및, 존재하는 경우, 제3) Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 동종형의 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자;
(b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자;
(c) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자; 및
(d) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되;
제1 항원은 CEA이고, 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론이고;
(c)의 제3 Fab 분자는 (a)의 제1 Fab 분자와 동일하고;
(a)의 제1 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링);
(i) (a)의 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (b)의 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, (b)의 제2 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 (d)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
(ii) (b)의 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (a)의 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, (a)의 제1 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 (d)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고;
(a)의 제1 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자는 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 15의 HCDR 2 및 서열번호 16의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 특히 인간화된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 18의 LCDR 2 및 서열번호 19의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 특히 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
보다 더 특정한 실시양태에서, 본 발명은
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자;
(b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자;
(c) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자; 및
(d) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되;
제1 항원은 CEA이고, 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론이고;
(c)의 제3 Fab 분자는 (a)의 제1 Fab 분자와 동일하고;
(a)의 제1 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 아르기닌(R)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링);
(a)의 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (b)의 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, (b)의 제2 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 (d)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고;
(a)의 제1 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자는 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 15의 HCDR 2 및 서열번호 16의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 특히 인간화된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 18의 LCDR 2 및 서열번호 19의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 특히 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자;
(b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자; 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되;
제1 항원은 CEA이고, 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론이고;
(a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링);
(i) (a)의 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (b)의 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, (b)의 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (c)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되거나,
(ii) (b)의 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (a)의 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, (a)의 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (c)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고;
(a)의 제1 Fab 분자는 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 15의 HCDR 2 및 서열번호 16의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 특히 인간화된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 18의 LCDR 2 및 서열번호 19의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 특히 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
추가적 실시양태에서, 본 발명은
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자;
(b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자; 및
(c) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되;
(i) 제1 항원은 CEA이고, 제2 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론이거나;
(ii) 제2 항원은 CEA이고, 제1 항원은 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론이고;
(a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링);
(a)의 제1 Fab 분자 및 (b)의 제2 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 (c)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고;
CEA에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 15의 HCDR 2 및 서열번호 16의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 특히 인간화된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 18의 LCDR 2 및 서열번호 19의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 특히 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함한다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 구체적 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또 다른 구체적 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 더 구체적인 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 S228P(카바트 넘버링)를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인은 제1 및 제2 Fc 도메인 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형을 포함한다. 구체적인 이러한 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 캐비티에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내에 돌출부를 생성하고, Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기는 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내에 캐비티를 생성한다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함한다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인에서 하나 이상의 아미노산 치환은 L234, L235 및 P329(카바트 EU 지수 넘버링)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 존재한다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 아미노산 치환은 L234A, L235A 및 P329G이다(카바트 EU 지수 넘버링). 하나의 이러한 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 다른 실시양태에서, Fc 도메인의 각각의 서브유닛은 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 2개의 아미노산 치환을 포함하되, 상기 아미노산 치환은 L235E 및 P329G이다(카바트 EU 지수 넘버링). 하나의 이러한 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이고 아미노산 치환 L235E 및 S228P(SPLE)(카바트 EU 지수 넘버링)를 포함한다.
하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 FcγRIIa, FcγRI 및/또는 FcγRIIIa이다. 하나의 실시양태에서, 효과기 기능은 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)이다.
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 구체적 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 서열번호 4의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 5의 HCDR 2 및 서열번호 6의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 9의 LCDR 2 및 서열번호 10의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 보다 더 구체적인 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이다. 하나의 구체적 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함되는 제2 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고 서열번호 4의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 5의 중쇄 CDR 2, 서열번호 6의 중쇄 CDR 3, 서열번호 8의 경쇄 CDR 1, 서열번호 9의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR 3을 포함한다. 보다 더 구체적인 실시양태에서, 상기 제2 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 추가적 구체적인 실시양태에서, CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 15의 중쇄 CDR 2, 서열번호 16의 중쇄 CDR 3, 서열번호 17의 경쇄 CDR 1, 서열번호 18의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 19의 경쇄 CDR 3을 포함한다. 보다 더 구체적인 실시양태에서, CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 하나의 구체적 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함되는 제1 (및, 존재하는 경우, 제3) 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 CEA에 특이적으로 결합하고 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 15의 중쇄 CDR 2, 서열번호 16의 중쇄 CDR 3, 서열번호 17의 경쇄 CDR 1, 서열번호 18의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 19의 경쇄 CDR 3을 포함한다. 보다 더 구체적인 실시양태에서, 상기 제1 (및, 존재하는 경우, 상기 제3) 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
특정 양상에서, 본 발명은
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자;
(b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자;
(c) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자; 및
(d) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하되;
(i) 제1 항원은 CEA이고, 제2 항원은 CD3, 특히 CD3 엡실론이고;
(ii) (a)의 제1 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자는 각각 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 15의 중쇄 CDR 2, 서열번호 16의 중쇄 CDR 3, 서열번호 17의 경쇄 CDR 1, 서열번호 18의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 19의 경쇄 CDR 3을 포함하고, (b)의 제2 Fab 분자는 서열번호 4의 중쇄 CDR 1, 서열번호 5의 중쇄 CDR 2, 서열번호 6의 중쇄 CDR 3, 서열번호 8의 경쇄 CDR 1, 서열번호 9의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR 3을 포함하고;
(iii) (a)의 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 (b)의 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, (b)의 제2 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 (d)의 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다.
하나의 실시양태에서, (b)의 제2 Fab 분자에서 가변 도메인 VL 및 VH는 서로 대체되고 추가로 (iv) (a)의 제1 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R), 특히 아르기닌(R)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자 및 (c)의 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
본 발명의 또 다른 양상에 따라, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 본 발명은 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 발현 벡터, 및 본 발명의 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 특히 포유동물 세포이다.
또 다른 양상에서, a) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 b) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제조 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 제조된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학 조성물의 사용 방법이 본 발명에 포함된다. 하나의 양상에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 양상에서, 질병의 치료가 필요한 개체에서 질병의 치료를 위한 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물이 제공된다 구체적 실시양태에서 질병은 암이다.
또한, 질병의 치료가 필요한 개체에서 질병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도; 뿐만 아니라 개체에게 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 치료적 효과량의 조성물을 약학적으로 허용되는 형태로 투여하는 단계를 포함하는 개체에서 질병의 치료 방법을 제공한다. 구체적 실시양태에서 질병은 암이다. 임의의 상기 실시양태에서, 개체는 바람직하게는 포유동물, 특히 인간이다.
또한, 본 발명은 표적 세포를 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재 하에 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(TCB)의 예시적인 배열을 도시한다. (A 및 D) "1+1 교차Mab" 분자의 예시. (B 및 E) 교차fab 및 Fab 성분(도립된)의 대체 순서를 갖는 "2+1 IgG 교차fab" 분자의 예시. (C 및 F) "2+1 IgG 교차fab" 분자의 예시. (G 및 K) 교차fab 및 Fab 성분(도립된)의 대체 순서를 갖는 "1+1 IgG 교차fab" 분자의 예시. (H 및 L) "1+1 IgG 교차fab" 분자의 예시. (I 및 M) 2개의 교차Fab를 갖는 "2+1 IgG 교차fab" 분자의 예시. (J 및 N) 2개의 교차Fab 및 교차fab 및 Fab 성분(도립된)의 대체 순서를 갖는 "2+1 IgG 교차fab" 분자. (O 및 S) "Fab-교차fab" 분자의 예시. (P 및 T) "교차fab-Fab" 분자의 예시. (Q 및 U) "(Fab)2-교차fab" 분자의 예시. (R 및 V) "교차fab-(Fab)2" 분자의 예시. (W 및 Y) "Fab-(교차fab)2" 분자의 예시. (X 및 Z) "(교차fab)2-Fab" 분자의 예시. 흑색점: 이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인의 임의적인 변형. ++, --: CH 및 CL 도메인에 임의적으로 도입된 반대 전하의 아미노산. 교차fab 분자는 VH 및 VL 영역의 교환을 포함하는 것으로 도시되나, 전하 변형이 CH1 및 CL 도메인에 도입되지 않은 실시양태에서는 대안적으로 CH1 및 CL 도메인의 교환을 포함할 수 있다.
도 2는 세포에 대한 T84.66 IgG의 상이한 인간화된 변이체의 결합을 나타낸다. 결합 곡선을 기반으로 EC50 값을 그래프패드프리즘(Graph Pad Prism)에 의해 계산하였고 표 1에 제시한다.
도 3은 실시예에서 제조된 TCB의 예시이다. (A 및 B) 전하 변형을 갖는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab" 항-CEA/항-CD3 TCB 분자의 예시(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 분자 A 및 B). (C) 전하 변형을 갖는 "도립된 1+1 IgG 교차Fab" 항-CEA/항-CD3 TCB 분자의 예시(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 분자 C). (D) 전하 변형을 갖는 "1+1 IgG 교차Mab" 항-CEA/항-CD3 TCB 분자의 예시(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 분자 D). (E) 전하 변형 및 보다 긴 연결기를 갖는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab" 항-CEA/항-CD3 TCB 분자(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 분자 E). (F) 전하 변형이 없는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab" 항-CEA/항-CD3 TCB 분자의 예시(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, 분자 F). EE = 147E, 213E; RK = 123R, 124K.
도 4는 실시예에서 제조된 TCB 분자(최종 정제된 제제)의 CE-SDS 분석이다. (A) 전하 변형을 갖는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"의 전기영동도(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 모 뮤린 CEA 결합제(T84.66); 분자 A). (B) 전하 변형을 갖는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 인간화된 CEA 결합제; 분자 B)의 전기영동도. (C) 전하 변형을 갖는 "도립된 1+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 인간화된 CEA 결합제; 분자 C)의 전기영동도. (D) 전하 변형을 갖는 "1+1 IgG 교차Mab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 인간화된 CEA 결합제; 분자 D)의 전기영동도. (E) 전하 변형 및 보다 긴 연결기를 갖는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 인간화된 CEA 결합제; 분자 E)의 전기영동도. (F) 전하 변형이 없는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, 인간화된 CEA 결합제; 분자 F)의 전기영동도. A 레인 = 환원되지 않음, B 레인 = 환원됨.
도 5는 높은 수준의 CEA(MKN45; A), 중간 수준의 CEA(LS174T; B) 또는 낮은 수준의 CEA(HT29; C), 또는 인간 CD3(주르카트(Jurkat) 세포; D)을 발현하는 세포에 대한 상이한 CEA TCB 포맷의 결합을 나타낸다. 중간 형광 강도(MFI)를 도시하였다. 오차 막대는 3회 결과의 SD를 나타낸다.
도 6은 24시간(A 내지 C) 또는 48시간(D 내지 F) 후에 LDH 방출에 의해 측정된 상이한 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 종양 세포의 T 세포-매개된 용해를 나타낸다. 인간 PBMC가 효과기 세포로서 사용되었고, MKN45(A 및 D), BxPC-3(B 및 E) 또는 HT29(C 및 F) 세포가 표적 세포로서 사용되었고, 최종 효과기 세포 대 표적 세포 비는 10:1이었다. 3회 결과를 SD와 함께 도시하였다. EC50 값을 그래프패드프리즘 5에 의해 계산하고 표 4 및 5에 제시한다.
도 7은 상이한 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 CEA-발현 종양 세포의 T 세포-매개된 용해 후에 인간 CD4+(A 내지 D) 및 CD8+(E 내지 H) T 세포 상의 CD25의 상향 조절을 나타낸다. 인간 PBMC가 효과기 세포로서 사용되었고 MKN45(A 및 E), BxPC-3(B 및 F) 또는 HT29(C 및 G) 세포가 표적 세포로서 사용되었고, 최종 효과기 세포 대 표적 세포 비는 10:1이었다. 표적 세포를 사용하지 않은 결과를 (D) 및 (H)에 나타냈다. CD25-양성 T 세포의 백분율을 48시간 후에 FACS에 의해 결정하였다. 3회 결과를 SD와 함께 도시하였다.
도 8은 CEA-발현 종양 또는 일차 상피 세포 및 상이한 CEA CD3 TCB 분자와 함께 공동-배양시 인간 CD4+(A 내지 E) 및 CD8+(F 내지 J) T 세포 상의 CD69의 상향 조절을 나타낸다. 인간 PBMC가 효과기 세포로서 사용되었고, MKN45(A 및 F), LS174T(B 및 G), HT29(C 및 H) 및 CCD841 (D 및 I) 세포가 표적 세포로서 사용되었고, 최종 효과기 세포 대 표적 세포 비는 10:1이었다. 표적 세포를 사용하지 않은 결과를 (E) 및 (J)에 나타냈다. CD69-양성 T 세포의 백분율을 48시간 후에 FACS에 의해 결정하였다. 3회 결과를 SD와 함께 도시하였다.
도 9는 FACS(CD69-양성 CD8+ T 세포의 백분율(A 및 B)), 또는 48시간 후에 LDH(C 및 D)에 의해 측정된 상이한 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 T 세포 활성화 및 종양 세포 용해를 나타낸다. 인간 PBMC가 효과기 세포로서 사용되었고, 최종 효과기 세포 대 표적 세포 비는 10:1이었다. 표적 세포는 높은 CEA 발현 MKN45 또는 낮은 CEA-발현 일차 상피 세포 CCD841 CoN이었다. 또한, T 세포 활성화를 표적의 부재 하에("표적 없음") 평가하였다. 3회 결과를 SD와 함께 도시하였다. A 및 C: CEA CD3 TCB와 모 키메릭 T84.66 CEA 결합제(분자 A), B 및 D: CEA CD3 TCB와 인간화된 CEA 결합제(인간화된 변이체 1; 분자 B).
도 10은 상이한 CEA CD3 TCB 분자의 표적 및 주르카트 효과기 세포에 대한 동시 결합시 주르카트의 이른 CD3-매개된 활성화를 결정하는 주르카트-NFAT 리포터 세포 분석을 나타낸다. CD3-매개된 활성화 및 신호전달의 강도는 상대적 발광 신호(RLUs)를 측정함으로써 검출되었다. 3회 결과를 SD와 함께 도시하였다. (A) CEA CD3 TCB와 모 키메릭 T84.66 CEA 결합제(분자 A), (B) CEA CD3 TCB와 인간화된 CEA 결합제(인간화된 변이체 1; 분자 B).
도 11은 FACS(A 내지 D, CD69-양성 CD8+ T 세포의 백분율), 또는 48시간 후에 LDH(E 내지 H)에 의해 측정된 상이한 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 T 세포 활성화(A 내지 D) 및 종양 세포 용해(E 내지 H)를 나타낸다. 인간 PBMC가 효과기 세포로서 사용되었고, 최종 효과기 세포 대 표적 세포 비는 10:1이었다. 표적 세포는 중간 CEA 발현 BxPC-3(A 및 E), 낮은 CEA-발현 NCI-H2122(B 및 F) 세포 또는 매우 낮은 CEA 발현 COR-L105(C 및 G) 또는 일차 상피 세포 HBEpiC(D 및 H)이었다. 3회 결과를 SD와 함께 도시하였다.
도 12는 5일 후 FACS에 의해 측정된 상이한 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 CD8+(A 내지 D) 및 CD4+(E 내지 H) T 세포의 증식을 나타낸다. 인간 PBMC가 효과기 세포로서 사용되었고, 최종 효과기 세포 대 표적 세포 비는 10:1이었다. 표적 세포는 높은 CEA 발현 MKN45(A 및 E), 중간 CEA 발현 LS174T(B 및 F), 낮은 CEA-발현 HT29(C 및 G) 세포 또는 매우 낮은 CEA 발현 일차 상피 세포 CCD841 CoN(D 및 H)이었다. 3회 결과를 SD와 함께 도시하였다.
도 13은 FACS에 의해 측정된 상이한 CEA CD3 TCB 분자(분자 B 및 분자 E)의 MKN45(A), LS174T(B), HT29(C) 및 주르카트(D) 세포에 대한 결합을 나타낸다.
도 14는 24시간(A 내지 D) 또는 48시간(E 내지 H) 후 LDH 방출에 의해 측정된 상이한 CEA CD3 TCB 분자(분자 B 및 분자 E)에 의해 유도된 종양 세포의 T 세포-매개된 용해를 나타낸다. 인간 PBMC가 효과기 세포로서 사용되었고, MKN45(A 및 E), LS174T(B 및 F), HT29(C 및 G), HBEpiC(D 및 H) 세포가 표적 세포로서 사용되었고, 최종 효과기 세포 대 표적 세포 비는 10:1이었다. 3회 결과를 SD와 함께 도시하였다. EC50 값을 그래프패드프리즘 5에 의해 계산하고 표 6에 제시하였다.
도 15는 NOG 마우스에게 정맥내 볼루스 단일 투여 후에 CEA CD3 TCB 분자 B 및 CEA CD3 TCB 분자 X의 약동학적 비교를 나타낸다.
도 16은 MKN45(A), LS174T(B) 및 HT29(C) 세포 상에 발현된 인간 CEA 또는 주르카트 세포(D) 상에 발현된 인간 CD3에 대한 상이한 CEA CD3 TCB 분자의 결합을 나타낸다. 3회 결과 및 SD를 도시하였다. 결합 곡선을 기반으로 한 EC50 값을 그래프패드프리즘에 의해 계산하고 표 6에 제시하였다.
도 17은 다양한 CEA-양성 종양 세포[(A) HCC1954, (B) NCI-H596, (C) NCI-H2122, (D) Kato III, (E) CX-1]의 존재 하에 상이한 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 항원-의존성 종양 세포 용해의 결정을 나타낸다. 종양 세포 용해는 세포자멸성/괴사성 종양 세포로부터 방출된 LDH의 정량화에 의해 결정된다. 3회 결과를 SD와 함께 도시하였다. 종양 세포 용해의 EC50 값을 그래프패드프리즘에 의해 계산하고 표 7에 제시하였다.
도 18은 낮은 CEA-발현 일차 상피 세포의 존재가 아닌 CEA-양성 종양 세포의 존재 하에 CEA CD3 TCB 분자 B에 의해 유도된 항원-의존성 T 세포 활성화 및 종양 용해를 나타낸다. 종양 세포 용해를 세포자멸성/괴사성 종양 세포로부터 방출된 LDH의 정량화에 의해 결정하였다(A). T 세포 활성화를 CD4+ 효과기 세포 상의 이른 활성화 마커 CD69의 상향 조절의 FACS 측정에 의해 결정하였다(B). 3회 결과를 SD와 함께 도시하였다. 종양 세포 용해 및 T-세포 활성화의 EC50 값을 그래프패드프리즘에 의해 계산하고 표 9 및 표 11에 제시하였다.
도 19는 낮은 CEA-발현 일차 상피 세포의 존재가 아닌 CEA-양성 종양 세포의 존재 하에 CEA CD3 TCB 분자 B에 의해 유도된 항원-의존성 T 세포 활성화 및 종양 용해를 나타낸다. 종양 세포 용해를 세포자멸성/괴사성 종양 세포로부터 방출된 LDH의 정량화에 의해 결정하였다(A). T 세포 활성화를 CD4+ 효과기 세포 상의 늦은 활성화 마커 CD25의 상향 조절의 FACS 측정에 의해 결정하였다(B). 3회 결과를 SD와 함께 도시하였다. 종양 세포 용해의 EC50 값을 그래프패드프리즘에 의해 계산하고 표 10에 제시하였다.
도 20의 (A)는 인간 CEACAM5, CEACAM1 또는 CEACAM6을 발현하는 일시적 HEK293T 감염체에 대한 CEA CD3 TCB 분자 B의 결합을 나타낸다. 3회 결과를 SD와 함께 도시하였다. (B)는 일시적 HEK293T 감염체에 대한 항-CD66 항체의 결합이 형질감염 효능, 각각 CEACAM 패밀리 멤버의 발현 수준을 나타냄을 나타낸다. 3회 결과 및 SD를 기반으로 MFI(중간 형광 신호)를 도시하였다.
도 21은 완전히 인간화된 NOG 마우스의 MKN45 모델에서 CEA CD3 TCB 분자 B 대 CEA CD3 TCB 분자 X의 항-종양 활성을 나타낸다. 상이한 투여량 및 투여 일정이 시험되었다: (A) 2.5 mg/kg 2회/주, (B) 2.5 mg/kg 1회/주, (C) 0.5 mg/kg 1회/주. 흑색 화살표는 치료의 개시를 나타낸다. 치료는 9주 동안 투여되었다. *p<0.05 **p<0.01; ***p<0.001 연구 종결(제70일)에서 언페어드(unpaired) 양측 t-검정(8<n<9).
도 22는 투여량-범위 효능 연구(실시예 12)에 사용된 상이한 투여량 수준 및 일정의 모의의 PK를 나타낸다. 2-구획 모델을 사용하였고, 모의 실험은 SDPK 데이터를 기반으로 한다.
도 23의 (A)는 완전히 인간화된 NSG 마우스의 MKN45 모델에서 CEA CD3 TCB 분자 B 대 CEA CD3 TCB 분자 X의 항-종양 활성을 나타낸다. 상이한 투여량 및 투여 일정이 시험되었다. 흑색 화살표는 치료의 개시를 나타낸다. 치료는 4주 동안 투여되었다. (B) 연구 종결(제38일)에서 2-웨이 ANOVA 다중 비교 분석을 나타낸다. *p<0.05 **p<0.01; ***p<0.001; ****p<0.0001 (9<n<14).
도 24는 huPBMC 이동을 갖는 NOG 마우스의 HPAF-II 모델에서 CEA CD3 TCB 분자 B 대 CEA CD3 TCB 분자 X(2.5 mg/kg, 1회/주)의 항-종양 활성을 나타낸다. 회색 화살표는 인간 PBMC(huPBMC) 주입을 나타내고, 흑색 화살표는 치료의 개시를 나타낸다. 치료는 3주 동안 투여되었다. *p<0.05; **p<0.01; ****p<0.0001 연구 종결(제32일)에서 언페어드 양측 t-검정(n=10).
도 25는 시노몰구스 원숭이에게 정맥내 볼루스 투여 후에 CEA CD3 TCB 분자 B 및 CEA CD3 TCB 분자 X의 약동학적 비교를 나타낸다. 개별적 대표적인 동물의 약동학을 도시하였다.
정의
하기에서 달리 정의되어 있지 않는 한, 용어는 당해 분야에서 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 분자"는 그의 가장 넓은 의미에서 항원성 결정인자에 특이적으로 결합하는 분자를 지칭한다. 항원 결합 분자의 예는 면역글로불린 및 이의 유도체, 예를 들면, 단편이다.
용어 "이중특이적"은 항원 결합 분자가 2개 이상의 상이한 항원성 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하고, 상기 부위 각각은 상이한 항원성 결정인자에 대해 특이적이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원성 결정인자, 특히 2개의 상이한 세포 상에서 발현된 2개의 항원성 결정인자에 동시적으로 결합할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "원자가(valent)"는 항원 결합 분자에 특정된 수의 항원 결합 부위가 존재한다는 것을 표시한다. 따라서, 용어 "항원에 대한 1가 결합"은 항원에 대해 특이적인 하나의(및 하나 이하의) 항원 결합 부위가 항원 결합 분자에 존재한다는 것을 표시한다.
"항원 결합 부위"는 항원과의 상호작용을 제공하는 항원 결합 분자의 부위, 즉 하나 이상의 아미노산 잔기를 지칭한다. 예를 들면, 항체의 항원 결합 부위는 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 포함한다. 천연 면역글로불린 분자는 전형적으로 2개의 항원 결합 부위를 갖고, Fab 분자는 전형적으로 단일 항원 결합 부위를 갖는다.
본원에서 사용된 용어 "항원 결합 모이어티"는 항원성 결정인자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 분자를 지칭한다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 그 자신에 부착된 물질(예를 들면, 제2 항원 결합 모이어티)이 표적 부위, 예를 들면, 항원성 결정인자를 보유하는 특정 유형의 종양 세포 또는 종양 간질(stroma)로 향하게 할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 그의 표적 항원, 예를 들면, T 세포 수용체 복합체 항원을 통해 신호전달을 활성화시킬 수 있다. 항원 결합 모이어티는 본원에 추가로 정의된 바와 같은 항체 및 이의 단편을 포함한다. 특정 항원 결합 모이어티는 항체 중쇄 가변 영역 및 항체 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 모이어티는 본원에 더 정의되어 있고 당해 분야에서 공지되어 있는 바와 같은 항체 불변 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변 영역은 하기 5종의 동종형 중 임의의 동종형을 포함한다: α, δ, ε, γ 및 μ. 유용한 경쇄 불변 영역은 하기 2종의 동종형 중 임의의 동종형을 포함한다: κ 및 λ.
본원에서 사용된 용어 "항원성 결정인자"는 "항원" 및 "에피토프"와 동의어이고, 항원 결합 모이어티가 결합하여 항원 결합 모이어티-항원 복합체를 형성하는 폴리펩티드 거대분자 상의 부위(예를 들면, 아미노산의 연속 스트레치 또는 비연속 아미노산의 상이한 영역으로 구성된 입체구조적 배열)를 지칭한다. 유용한 항원성 결정인자는 예를 들면, 종양 세포의 표면 상에, 바이러스-감염된 세포의 표면 상에, 다른 병든 세포의 표면 상에, 면역 세포의 표면 상에, 혈액 혈청 내에 자유롭게 및/또는 세포외 매트릭스(ECM) 내에서 발견될 수 있다. 달리 표시되어 있지 않는 한, 본원에서 항원으로서 지칭된 단백질(예를 들면, CD3)은 포유동물, 예컨대, 영장류(예를 들면, 인간) 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터 유래된 임의의 천연 형태 단백질일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항원은 인간 단백질이다. 본원에서 특정 단백질이 언급되는 경우, 상기 용어는 "전장" 처리되지 않은 단백질뿐만 아니라 세포에서의 처리로부터 발생되는 임의의 형태의 단백질도 포괄한다. 상기 용어는 단백질의 천연 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체도 포괄한다. 항원으로서 유용한 예시적 인간 단백질은 CD3, 특히 CD3의 엡실론 서브유닛(유니프롯(UniProt) 번호 P07766(버전 130), NCBI RefSeq 번호 NP_000724.1, 인간 서열의 경우 서열번호 1; 또는 유니프롯 번호 Q95LI5(버전 49), NCBI 유전자은행 번호 BAB71849.1, 시노몰구스[필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) 서열]의 경우 서열번호 2 참조) 또는 암배 항원(CEA; 암배 항원-관련된 세포 부착 분자 5로도 공지됨)(CEACAM5, 유니프롯 번호 P06731(버전 119), NCBI RefSeq 번호 NP_004354.2)이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 상이한 종의 CD3 또는 CEA 항원 사이에 보존되어 있는 CD3 또는 CEA의 에피토프에 결합한다.
"특이적 결합"은 결합이 항원에 대해 선택적이고 원치않거나 비특이적인 상호작용으로부터 구별될 수 있다는 것을 의미한다. 특이적 항원성 결정인자에 결합하는 항원 결합 모이어티의 능력은 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA) 또는 당업자에게 알려진 다른 기법, 예를 들면, (비아코어 기기 상에서 분석되는) 표면 플라스몬 공명(SPR) 기법(문헌[Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329(2000)]) 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229(2002)])을 통해 측정될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 항원 결합 모이어티와 관련없는 단백질의 결합 정도는 예를 들면, SPR에 의해 측정되었을 때 항원 결합 모이어티와 항원의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 항원에 결합하는 항원 결합 모이어티, 또는 상기 항원 결합 모이어티를 포함하는 항원 결합 분자는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM(예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다.
"친화성"은 분자의 단일 결합 부위(예를 들면, 수용체)와 그의 결합 파트너(예를 들면, 리간드) 사이의 비공유 상호작용의 총 합계의 강도를 지칭한다. 달리 표시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원(예를 들면, 항원 결합 모이어티와 항원, 또는 수용체와 그의 리간드) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로 해리 속도 상수 및 결합 속도 상수(각각 koff 및 kon)의 비인 해리 상수(KD)로 표시될 수 있다. 따라서, 상기 속도 상수의 비가 동일하게 유지되는 한, 동등한 친화성은 상이한 속도 상수를 포함할 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 방법을 포함하는, 당해 분야에서 공지된 잘 확립된 방법에 의해 측정될 수 있다. 친화성을 측정하는 특정 방법은 표면 플라스몬 공명(SPR)이다.
"감소된 결합", 예를 들면, Fc 수용체에 대한 감소된 결합은 예를 들면, SPR에 의해 측정시 각각의 상호작용에 대한 친화성의 감소를 지칭한다. 명료함을 위해, 상기 용어는 0(또는 분석 방법의 검출 한계 미만), 즉 상호작용의 완전한 제거까지의 친화성의 감소도 포함한다. 대조적으로, "증가된 결합"은 각각의 상호작용에 대한 결합 친화성의 증가를 지칭한다.
본원에서 사용된 "활성화 T 세포 항원"은 항원 결합 분자와의 상호작용시 T 세포 활성화를 유도할 수 있는, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 표면 상에서 발현된 항원성 결정인자를 지칭한다. 구체적으로, 항원 결합 분자와 활성화 T 세포 항원의 상호작용은 T 세포 수용체 복합체의 신호전달 캐스케이드를 유발함으로써 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. 특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 CD3의 엡실론 하위단위이다(유니프롯(UniProt) 번호 P07766(버전 130), NCBI 참조 번호 NP_000724.1, 인간 서열에 대하여 서열번호 1; 또는 유니프롯 번호 Q95LI5(버전 49), NCBI 유전자은행 번호 BAB71849.1, 시노몰구스[필리핀 원숭이(Macaca fascicularis)] 서열에 대하여 서열번호 2 참조).
본원에서 사용된 "T 세포 활성화"는 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성, 및 활성화 마커의 발현으로부터 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 하나 이상의 세포 반응을 지칭한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포 활성화를 유도할 수 있다. T 세포 활성화를 측정하기에 적합한 분석은 본원에 기재된 바와 같이 당해 분야에서 공지되어 있다.
본원에서 사용된 "표적 세포 항원"은 표적 세포, 예를 들면, 종양 내의 세포, 예컨대, 암세포 또는 종양 간질의 세포의 표면 상에서 제시된 항원성 결정인자를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 표적 세포 항원은 CEA, 특히 인간 CEA이다.
본원에서 Fab 분자 등과 관련하여 사용된 용어 "제1", "제2" 또는 "제3"은 하나 초과의 각각의 유형의 모이어티가 존재할 때 구별의 편리함을 위해 사용된다. 달리 명시되어 있지 않은 한, 이들 용어의 사용은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 특정 순서 또는 배향을 부여하기 위한 것이 아니다.
"Fab 분자"는 면역글로불린의 중쇄("Fab 중쇄")의 VH 및 CH1 도메인 및 경쇄("Fab 경쇄")의 VL 및 CL 도메인으로 구성된 단백질을 지칭한다.
"융합된"은 구성성분(예를 들면, Fab 분자 및 Fc 도메인 서브유닛)이 직접 또는 하나 이상의 펩티드 연결기를 통해 펩티드 결합에 의해 연결되어 있다는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "단일 쇄"는 펩티드 결합에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 항원 결합 모이어티 중 하나는 단일 쇄 Fab 분자, 즉 Fab 경쇄와 Fab 중쇄가 펩티드 연결기에 의해 연결되어 단일 펩티드 쇄를 형성하는 Fab 분자이다. 이러한 특정 실시양태에서, Fab 경쇄의 C-말단은 단일 쇄 Fab 분자에서 Fab 중쇄의 N-말단에 연결되어 있다.
"교차" Fab 분자("교차fab"로도 지칭됨)는 Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 또는 불변 도메인이 교환되어 있는(즉, 서로 대체된) Fab 분자를 의미한다(즉, 교차 Fab 분자는 경쇄 가변 도메인 VL 및 중쇄 불변 도메인 1 CH1(VL-CH1, N-말단에서 C-말단 방향으로)로 구성된 펩티드 쇄, 및 중쇄 가변 도메인 VH 및 경쇄 불변 도메인 CL(VH-CL, N-말단에서 C-말단 방향으로)로 구성된 펩티드 쇄를 포함한다). 명료함을 위해, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인이 교환되어 있는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 불변 도메인 1 CH1을 포함하는 펩티드 쇄는 (교차) Fab 분자의 "중쇄"로서 본원에서 지칭된다. 역으로, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 불변 도메인이 교환되어 있는 교차 Fab 분자에서, 중쇄 가변 도메인 VH을 포함하는 펩티드 쇄는 (교차) Fab 분자의 "중쇄"로서 본원에서 지칭된다.
그와 반대로, "통상적" Fab 분자는 이의 천연 포맷으로 존재하는, 즉, 중쇄 가변 및 불변 도메인(VH-CH1, N-말단에서 C-말단 방향으로)으로 구성된 중쇄, 및 경쇄 가변 및 불변 도메인(VL-CL, N-말단에서 C-말단 방향으로)으로 구성? 경쇄를 포함하는 Fab 분자를 의미한다.
용어 "면역글로불린 분자"는 천연 항체의 구조를 갖는 단백질을 지칭한다. 예를 들면, IgG 부류의 면역글로불린은 다이설파이드 결합된 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변 중쇄 또는 중쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 도메인(VH)에 이어서 중쇄 불변 영역으로도 지칭되는 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 지칭되는 가변 도메인(VL)에 이어서 경쇄 불변 영역으로도 지칭되는 불변 경쇄(CL) 도메인을 갖는다. 면역글로불린의 중쇄는 α(IgA), δ(IgD), ε(IgE), γ(IgG) 또는 μ(IgM)로 지칭되는 5종의 유형 중 하나로 배정될 수 있고, 이들 유형 중 일부는 하위유형, 예를 들면, γ1(IgG1), γ2(IgG2), γ3(IgG3), γ4(IgG4), α1(IgA1) 및 α2(IgA2)로 세분될 수 있다. 면역글로불린의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2종의 유형 중 하나로 배정될 수 있다. 면역글로불린은 본질적으로 면역글로불린 힌지(hinge) 영역을 통해 연결된 2개의 Fab 분자 및 1개의 Fc 도메인으로 구성된다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 항체 구조물을 포괄한다.
"항체 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는, 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예에는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 다이아바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자(예를 들면, scFv) 및 단일 도메인 항체가 포함되나 이들로 한정되지 않는다. 일부 항체 단편의 검토를 위해서는 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌[Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibody, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조하고, WO 93/16185 및 US 5,571,894 및 US 5,587,458도 참조한다. 살비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의를 위해서는 US 5,869,046을 참조한다. 다이아바디는 2가일 수 있거나 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 문헌[Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 또한, 트라이아바디 및 테트라바디가 문헌[Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003)]에 기재되어 있다. 단일 도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부, 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체(도맨티스 인코포페이티드(Domantis, Inc.), 미국 매사추세츠주 왈탐 소재); 예를 들면, US 6,248,516 B1 참조)이다. 항체 단편은 본원에 기재된 바와 같이 온전한 항체의 단백질용해성 분해 및 재조합 숙주 세포(예를 들면, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 파지)에 의한 제조를 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 항원의 일부 또는 전부에 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부를 지칭한다. 항원 결합 도메인은 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변 도메인(항체 가변 도메인으로도 지칭됨)에 의해 제공될 수 있다. 특히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 도메인(VL) 및 항체 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체와 항원의 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 이때 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격 영역(FR) 및 3개의 초가변 도메인(HVR)을 포함한다. 예를 들면, 문헌[Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열 면에서 초가변성을 갖고/갖거나 구조적으로 한정된 루프("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역 각각을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 6개의 HVR(VH 내의 3개 HVR(H1, H2 및 H3) 및 VL 내의 3개 HVR(L1, L2 및 L3))을 포함한다. HVR은 일반적으로 초가변 루프 및/또는 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산 잔기를 포함하고, 이때 후자는 가장 높은 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인식에 관여한다. VH 내의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 초가변 도메인(HVR)은 "상보성 결정 영역"(CDR)으로도 지칭되고, 이들 용어는 항원 결합 영역을 형성하는 가변 도메인의 일부를 언급하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 특정 영역은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)] 및 [Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)]에 기재되어 있고, 이때 정의는 서로에 대해 비교되었을 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 서브세트를 포함한다. 그럼에도, 항체 또는 이의 변이체의 CDR을 지칭하기 위한 어느 한 정의의 적용은 본원에서 정의되고 사용된 용어의 범위 내에 있기 위한 것이다. 상기 인용된 참조문헌 각각에 의해 정의된 CDR을 구성하는 적절한 아미노산 잔기는 비교로서 하기 표 A에 기재되어 있다. 특정 CDR을 구성하는 정확한 잔기 수는 상기 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당업자는 항체의 가변 도메인 아미노산 서열이 주어졌을 때 어떤 잔기가 특정 CDR을 구성하는 지를 상용적으로 결정할 수 있다. 본원에 주어진 CDR 서열은 일반적으로 카바트 정의에 따른다.
[표 A]
CDR 정의1
Figure pct00001
또한, 카바트 등의 문헌은 임의의 항체에 적용될 수 있는 가변 도메인 서열에 대한 넘버링 시스템을 정의하였다. 당업자는 서열 자체 이외의 임의의 실험 데이터에 의존하지 않으면서 이 "카바트 넘버링" 시스템을 임의의 가변 도메인 서열에 명확히 배정할 수 있다. 가변 영역 서열과 관련하여 본원에서 사용된 "카바트 넘버링"은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기재된 넘버링 시스템을 지칭한다. 달리 특정되어 있지 않은 한, 항체 가변 도메인 내의 특정 아미노산 잔기 위치의 넘버링에 대한 언급은 카바트 넘버링 시스템에 따른다.
본원에 사용된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 보든 불변 영역 및 도메인의 아미노산 위치는 문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]에 기재된 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링되고, 본원에서 "카바트에 따라 넘버링" 또는 "카바트 넘버링"으로 지칭된다. 구체적으로, 카바트 넘버링 시스템(문헌[Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)]의 647 내지 660쪽 참조)은 카파 및 람다 동종형의 경쇄 불변 도메인 CL에 대하여 사용되고, 카바트 EU 지수 넘버링 시스템(661 내지 723쪽 참조)은 중쇄 불변 도메인(CH1, 힌지, CH2 및 CH3)에 대하여 사용되고, 이러한 경우 본원에서 "카바트 EU 지수에 따라 넘버링"을 언급함으로써 본원에서 또한 명백해진다.
서열목록의 폴리펩티드 서열은 카바트 넘버링 시스템에 따라 넘버링되어 있지 않다. 그러나, 서열목록의 서열의 넘버링을 카바트 넘버링으로 전환시키는 것은 당해 분야에서 통상의 기술 범위 내에 있다.
"골격" 또는 "FR"은 초가변 도메인(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 하기 4개의 FR 도메인으로 구성된다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"인간화된" 항체는 비-인간 HVR의 아미노산 잔기 및 인간 FR의 아미노산 잔기를 포함하는 키메릭 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 HVR(예를 들어 CDR)이 비-인간 항체의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 항체의 것에 상응하는 실질적으로 모든 하나 이상, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 포함할 것이다. 이러한 가변 도메인은 "인간화된 가변 영역"으로 지칭된다. 인간화된 항체는 임의적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화된 형태"는 인간화를 수행한 항체를 지칭한다. 본 발명에 포함되는 "인간화된 항체"의 다른 형태는 불변 영역이 원래 항체의 것으로부터 추가적으로 변형되거나 변화되어 특히 C1q 결합 및/또는 Fc 수용체(FcR) 결합에 관련된 본 발명에 따른 특성을 생성한 것이다.
항체 또는 면역글로불린의 "부류"는 그의 중쇄에 의해 보유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 하기 5종의 주요 부류, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 일부는 하위부류(동종형), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나누어질 수 있다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 지칭된다.
본원에서 용어 "Fc 도메인" 또는 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 Cys226 또는 Pro230부터 중쇄의 카복시-말단까지 걸쳐 있는 것으로 정의된다. 그러나, 숙주 세포에 의해 생성된 항체는 중쇄의 C-말단으로부터 하나 이상, 특히 1 또는 2개의 아미노산의 전사 후 절단을 겪을 수 있다. 따라서, 전장 중쇄를 암호화하는 특이적 핵산 분자의 발현에 의한 숙주 세포에 의해 생성된 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있고, 상기 항체는 전장 중쇄의 절두된 가변(본원에서 "절두된 가변 중쇄"로도 지칭됨)을 포함할 수 있다. 중쇄의 최종 2개의 C-말단 아미노산이 글리신(G446) 및 리신(K447, 카바트 EU 지수에 따라 넘버링)인 경우 사실일 수 있다. 따라서, Fc 영역의 C-말단 리신(Lys447), 또는 C-말단 글리신(Gly446) 및 리신(K447)은 존재할 수 있거나 존재할 수 없다. Fc 도메인(또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 도메인의 서브유닛)을 비롯한 중쇄의 아미노산 서열은 달리 나타내지 않는 경우 C-말단 글리신-리신 다이펩티드를 포함하지 않고 본원에 나타낸다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된, 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄는 추가의 C-말단 글리신-리신 다이펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링)를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된, 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄는 추가의 C-말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링)를 포함한다. 본 발명의 조성물, 예컨대 본원에 기재된 약학 조성물은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 개체군(population)을 포함한다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 개체군은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절두된 가변 중쇄를 갖는 분자를 포함할 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 개체군은 전장 중쇄를 갖는 분자 및 절두된 가변 중쇄를 갖는 분자의 혼합물로 이루어질 수 있고, 이때 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상은 절두된 가변 중쇄를 갖는다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 개체군을 포함하는 조성물은 추가의 C-말단 글리신-리신 다이펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링)를 갖는 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 개체군을 포함하는 조성물은 추가의 C-말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링)를 갖는 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 본 발명의 하나의 실시양태에서, 상기 조성물은 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄를 포함하는 분자; 추가의 C-말단 글리신 잔기(G446, 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링)를 갖는 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄를 포함하는 분자; 및 추가의 C-말단 글리신-리신 다이펩티드(G446 및 K447, 카바트의 EU 지수에 따라 넘버링)를 갖는 본원에 명시된 Fc 도메인의 서브유닛을 비롯한 중쇄를 포함하는 분자로 구성된다. 본원에서 달리 특정되어 있지 않은 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, (1991)](또한 상기 참조)에 기재된 바와 같이 EU 지수로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다. 본원에서 사용된 Fc 도메인의 "서브유닛"은 안정한 자가 결합을 형성할 수 있는, 이량체 Fc 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩티드 중 하나, 즉 면역글로불린 중쇄의 C-말단 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들면, IgG Fc 도메인의 서브유닛은 IgG CH2 및 IgG CH3 불변 도메인을 포함한다.
"Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형"은 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드와 동일한 폴리펩티드가 결합하여 동종이량체를 형성하는 것을 감소시키거나 방해하는, Fc 도메인 서브유닛의 펩티드 골격 조작 또는 번역 후 변형이다. 본원에서 사용된 결합을 촉진하는 변형은 특히 원하는 2개의 Fc 도메인 서브유닛(즉, Fc 도메인의 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛) 각각이 결합하도록 만들어진 별도의 변형을 포함하고, 이때 상기 변형은 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 결합을 촉진하도록 서로 상보적이다. 예를 들면, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인 서브유닛의 결합을 각각 입체적으로 또는 정전기적으로 유리하게 만들도록 상기 Fc 도메인 서브유닛 중 하나 또는 둘 다의 구조 또는 전하를 변형시킬 수 있다. 따라서, (이종)이량체화는 서브유닛(예를 들면, 항원 결합 모이어티) 각각에 융합된 추가의 구성성분이 동일하지 않다는 의미에서 동일하지 않을, 제1 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드와 제2 Fc 도메인 서브유닛을 포함하는 폴리펩티드 사이에 일어난다. 일부 실시양태에서, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인에서 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 포함한다. 특정 실시양태에서, 결합을 촉진하는 변형은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 각각에서 별도의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 포함한다.
용어 "효과기 기능"은 항체 동종형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 효과기 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC), 항체 의존적 세포 식균작용(ADCP), 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 면역 복합체-매개된 항원 섭취, 세포 표면 수용체(예를 들면, B 세포 수용체)의 하향 조절 및 B 세포 활성화를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "조작하다", "조작된" 및 "조작하는"은 천연 또는 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편의 임의의 펩티드 골격 조작 또는 번역 후 변형을 포함하는 것으로 간주된다. 조작은 아미노산 서열, 글리코실화 패턴 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 변형뿐만 아니라 이들 방법의 조합도 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "아미노산 돌연변이"는 아미노산 치환, 결실, 삽입 및 변형을 포괄하기 위한 것이다. 최종 구축물이 목적하는 특성, 예를 들면, Fc 수용체에 대한 감소된 결합 또는 또 다른 펩티드에 대한 증가된 결합을 보유하는 경우, 치환, 결실, 삽입 및 변형의 임의의 조합이 이뤄져 최종 구축물에 도달할 수 있다. 아미노산 서열의 결실 및 삽입은 아미노산의 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 결실 및 삽입을 포함한다. 특정 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들면, Fc 영역의 결합 특성을 변형시키기 위한 목적으로, 비보존적 아미노산 치환, 즉 하나의 아미노산을 상이한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것이 특히 바람직하다. 아미노산 치환은 비천연 아미노산에 의한 치환 또는 20종의 표준 아미노산의 천연 아미노산 유도체(예를 들면, 4-하이드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-하이드록시리신)에 의한 치환을 포함한다. 당해 분야에서 주지된 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 아미노산 돌연변이를 발생시킬 수 있다. 유전적 방법은 부위-지정된 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 아미노산의 측쇄 기를 유전적 조작 이외의 방법, 예컨대, 화학적 변형으로 변형시키는 방법도 유용할 수 있다고 생각된다. 동일한 아미노산 돌연변이를 표시하기 위해 다양한 표기가 본원에서 사용될 수 있다. 예를 들면, Fc 도메인의 위치 329에서 프롤린을 글리신으로 치환시키는 것은 329G, G329, G329, P329G 또는 Pro329Gly로서 표시될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합(펩티드 결합으로도 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체(아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산으로 구성된 임의의 쇄를 지칭하고, 구체적 길이의 생성물을 지칭하지 않는다. 따라서, 2개 이상의 아미노산으로 구성된 쇄를 지칭하기 위해 사용되는 펩티드, 다이펩티드, 트라이펩티드, 올리고펩티드, "단백질", "아미노산 쇄" 또는 임의의 다른 용어가 "폴리펩티드"의 정의 내에 포함되고, 용어 "폴리펩티드"는 이들 용어 중 임의의 용어 대신에 또는 이러한 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한, 용어 "폴리펩티드"는 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 용해성 절단, 또는 비천연 아미노산에 의한 변형을 포함하나 이들로 한정되지 않는 폴리펩티드의 발현 후 변형의 생성물을 지칭하기 위한 것이다. 폴리펩티드는 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 재조합 기술에 의해 제조될 수 있지만, 반드시 표기된 핵산 서열로부터 번역되지는 않는다. 폴리펩티드는 화학적 합성을 포함하는 임의의 방식으로 발생할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 크기는 약 3개 이상, 5개 이상, 10개 이상, 20개 이상, 25개 이상, 50개 이상, 75개 이상, 100개 이상, 200개 이상, 500개 이상, 1,000개 이상 또는 2,000개 이상의 아미노산일 수 있다. 폴리펩티드는 정의된 3차원적 구조를 가질 수 있지만 반드시 이러한 구조를 갖지는 않는다. 정의된 3차원적 구조를 갖는 폴리펩티드는 접혀진(folded) 폴리펩티드로서 지칭되고, 정의된 3차원적 구조를 보유하지 않는 폴리펩티드는 오히려 다수의 상이한 입체구조를 채택할 수 있고 접혀지지 않은(unfolded) 폴리펩티드로서 지칭된다.
"단리된" 폴리펩티드 또는 변이체, 또는 이의 유도체는 그의 천연 환경에서 존재하지 않는 폴리펩티드를 의미하기 위한 것이다. 특정한 수준의 정제가 요구되지는 않는다. 예를 들면, 단리된 폴리펩티드는 그의 천연 상태 또는 천연 환경으로부터 분리될 수 있다. 재조합적으로 제조된 폴리펩티드 및 숙주 세포에서 발현된 단백질은 임의의 적합한 기법에 의해 분리되거나, 분획되거나, 부분적으로 또는 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드처럼 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다.
기준 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 필요하다면 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭을 도입하고 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후 기준 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 당해 분야의 기술 내에 있는 다양한 방식, 예를 들면, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign)(디엔에이스타(DNASTAR)) 소프트웨어를 사용함으로써 결정될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전체 길이에 걸쳐 최대 정렬을 결정하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하는, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상% 아미노산 서열 동일성 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2의 사용을 통해 발생한다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 만들어졌고, 소스 코드는 미국 저작권 협회(U.S. Copyright Office, 미국 워싱톤 디씨 20559 소재)에 사용자 문서로 출원되었고, 상기 미국 저작권 협회에서 상기 코드는 미국 저작권 등록 번호 TXU510087하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 인코포레이티드(미국 캘리포니아주 사우쓰 샌프란시스코 소재)로부터 공개적으로 입수될 수 있거나 상기 소스 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 작동 시스템 상에서 사용을 위해 편집되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고 변형되지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의% 아미노산 서열 동일성(또는, 주어진 아미노산 서열 B에 대한 특정% 아미노산 서열 동일성을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로서 표현될 수 있음)은 다음과 같이 계산된다:
100 x 분율(X/Y)
여기서, X는 A 및 B의 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2 정렬에서 상기 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일한 일치(match)로서 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에 존재하는 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동등하지 않은 경우, B에 대한 A의% 아미노산 서열 동일성은 A에 대한 B의% 아미노산 서열 동일성과 동등하지 않을 것임이 인식될 것이다. 달리 구체적으로 명시되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든% 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램의 사용을 통해 바로 이전 단락에 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "폴리펩티드"는 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA), 바이러스로부터 유래된 RNA 또는 플라스미드 DNA(pDNA)를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포다이에스터 결합 또는 비통상적인 결합(예를 들면, 아미드 결합, 예컨대, 펩티드 핵산(PNA)에서 발견되는 결합)을 포함할 수 있다. 용어 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 하나 이상의 핵산 분절, 예를 들면, DNA 또는 RNA 단편을 지칭한다.
"단리된" 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오티드는 그의 천연 환경으로부터 분리되어 있는 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 의미하기 위한 것이다. 예를 들면, 벡터에 함유된 폴리펩티드를 암호화하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 목적을 위해 단리된 것으로 간주된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가의 예에는 이종 숙주 세포 내에서 유지된 재조합 폴리뉴클레오티드 또는 용액 중의(부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 단리된 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드 분자를 통상적으로 함유하지 않는 세포 내에 함유된 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하지만, 폴리뉴클레오티드 분자는 염색체 외부에 존재하거나 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다. 단리된 RNA 분자는 본 발명의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체뿐만 아니라, 양성 및 음성 가닥 형태 및 이중 가닥 형태도 포함한다. 본 발명에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 합성 제조된 이러한 분자를 추가로 포함한다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대, 프로모터, 리보좀 결합 부위 또는 전사 종결요소일 수 있거나 이러한 조절 요소를 포함할 수 있다.
본 발명의 기준 뉴클레오티드 서열과 예를 들면 95% 이상 "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 뉴클레오티드 서열의 각각 100개 뉴클레오티드당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 점을 제외하고 상기 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 기준 서열과 동일하다는 것을 의미한다. 다시 말해, 기준 뉴클레오티드 서열과 95% 이상 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 수득하기 위해, 기준 서열에서 5% 이하의 뉴클레오티드가 결실될 수 있거나 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 기준 서열 내의 총 뉴클레오티드의 5% 이하를 차지하는 다수의 뉴클레오티드가 기준 서열 내로 삽입될 수 있다. 기준 서열의 이들 변형은 기준 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어날 수 있거나, 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있거나, 기준 서열 내의 잔기 사이에 개별적으로 산재되어 있을 수 있거나, 기준 서열 내에서 하나 이상의 인접한 군으로 산재되어 있을 수 있다. 실질적인 문제로서, 임의의 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한지를, 공지된 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 폴리펩티드에 대해 상기 논의된 프로그램(예를 들면, ALIGN-2)을 사용하여 통상적으로 결정할 수 있다.
용어 "발현 카세트"는 표적 세포에서 특정 핵산의 전사를 허용하는 일련의 특정된 핵산 요소와 함께 재조합적으로 또는 합성적으로 발생된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 재조합 발현 카세트는 플라스미드, 염색체, 미토콘드리아 DNA, 플라스티드 DNA, 바이러스 또는 핵산 단편 내로 삽입될 수 있다. 전형적으로, 발현 벡터의 재조합 발현 카세트 부분은 다른 서열 중에서 전사될 핵산 서열 및 프로모터를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 발현 카세트는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
용어 "벡터" 또는 "발현 벡터"는 "발현 구축물"과 동의어이고, 표적 세포 내로 도입되어 표적 세포에서 그 자신과 작동가능하게 연결된 특정 유전자의 발현을 지시하는 데에 사용되는 DNA 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자가 복제 핵산 구조물로서의 벡터뿐만 아니라 그 자신이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 삽입된 벡터도 포함한다. 본 발명의 발현 벡터는 발현 카세트를 포함한다. 발현 벡터는 다량의 안정한 mRNA의 전사를 가능하게 한다. 발현 벡터가 표적 세포 내부에 존재하면, 유전자에 의해 암호화된 리보핵산 분자 또는 단백질이 세포 전사 및/또는 번역 기구에 의해 제조된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 외래 핵산이 도입되어 있는 세포(이러한 세포의 자손을 포함함)를 지칭한다. 숙주 세포는 일차 형질전환된 세포 및 계대배양의 수와 관계없이 이로부터 유래된 자손을 포함하는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함한다. 자손은 핵산 함량 면에서 모 세포와 완전히 동일하지 않을 수 있으나 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 기능 또는 생물학적 활성과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 여기에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명의 이중특이적 항원 결합 분자를 발생시키는 데에 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들면, 배양된 포유동물 세포, 예컨대, CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 효모 세포, 곤충 세포 및 식물 세포를 포함할 뿐만 아니라, 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포도 포함한다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 도메인의 개입 후 효과기 기능을 수행하도록 수용체 보유 세포를 자극하는 신호전달 사건을 이끌어내는 Fc 수용체이다. 인간 활성화 Fc 수용체는 FcγRIIIa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRIIa(CD32) 및 FcαRI(CD89)를 포함한다.
항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC)은 면역 효과기 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해를 유발하는 면역 기작이다. 표적 세포는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 유도체가 일반적으로 Fc 영역의 N-말단에 위치하는 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에서 사용된 용어 "감소된 ADCC"는 상기 정의된 ADCC의 기작에 의해 표적 세포를 둘러싸는 매질 중의 항체의 주어진 농도에서 주어진 시간 이내에 용해되는 표적 세포 수의 감소, 및/또는 ADCC의 기작에 의해 주어진 시간 이내에 주어진 수의 표적 세포의 용해를 달성하는 데에 요구되는, 표적 세포를 둘러싸는 매질 중의 항체의 농도의 증가로서 정의된다. ADCC의 감소는 동일한 표준 제조, 정제, 제형화 및 저장 방법(당업자에게 공지되어 있음)을 사용하였을 때 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 제조되되, 조작되지 않은 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 비해 상대적인 감소이다. 예를 들면, ADCC를 감소시키는 아미노산 치환을 그의 Fc 도메인 내에 포함하는 항체에 의해 매개된 ADCC의 감소는 Fc 도메인 내에 이 아미노산 치환을 갖지 않는 동일한 항체에 의해 매개된 ADCC에 비해 상대적인 감소이다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 당해 분야에서 공지되어 있다(예를 들면, WO 2006/082515 또는 WO 2012/130831 참조).
제제의 "효과량"은 이 제제가 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 발생시키기 위해 필요한 양을 지칭한다.
제제, 예를 들면, 약학 조성물의 "치료 효과량"은 필요한 시간 동안 필요한 용량에서 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기에 효과적인 양을 지칭한다. 치료 효과량의 제제는 예를 들면, 질환의 불리한 효과를 제거하거나, 감소시키거나, 지연시키거나, 최소화하거나 방지한다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축(예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들면, 인간 및 비인간 영장류, 예컨대, 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들면, 마우스 및 래트)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 구체적으로, 개체 또는 대상체는 인간이다.
용어 "약학 조성물"은 내부에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 형태로 존재하고 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성을 나타내는 추가의 구성성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
용어 "약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분 이외에 대상체에게 독성을 나타내지 않는 약학 조성물 중의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제를 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 "치료"(및 이의 문법적 어미변화, 예컨대, "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서의 질환의 자연 경과를 변형시키기 위한 시도에서의 임상 시술을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리의 과정 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 경감, 및 관해 또는 개선된 예후를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
용어 "패키지 삽입물"은 적응증, 사용법, 투여량, 투여, 병용 요법, 사용 금지 사유 및/또는 이러한 치료 제품의 사용에 관한 경고에 관한 정보를 포함하는 치료 제품의 상업적 패키지에 통상적으로 포함되는 지침서를 지칭한다.
실시양태의 상세한 설명
본 발명은 치료 적용을 위한 유리한 특성, 특히 개선된 효능 및 안정성(예를 들어 T 세포의 비특이적 활성화 또는 정상 세포보다 종양 세포에 대한의 선택성에 관련됨) 및 개선된 제조용이성(예를 들어 순도 및 수율에 관련됨)을 갖는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자을 제공한다.
본 발명자는 항-CEA 항체 T84.66의 결합 특이성을 갖는 항원 결합 모이어티를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가(문헌[Wagener et al., J Immunol 130, 2308- (1983)],[ Neumaier et al., J Immunol 135, 3604 (1985)]) T 세포에 의한 CEA-발현 종양 세포의 사멸을 매개함에 있어서 예상 밖으로 높은 효력을 제공한다는 것을 발견하였다. 또한, 항체 T84.66의 신규한 인간화된 버전을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 모 T84.66 결합제를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 비교하여 정상 세포보다 종양 세포에 대한 개선된 선택성을 나타내는 것이 놀랍게도 밝혀졌다.
전하 변형
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 특히 경쇄와 비일치하는 중쇄의 짝풀림(벤스-존스-유형 부산물)을 감소시키는 데 효율적인 그에 포함된 Fab 분자의 아미노산 치환을 포함할 수 있고, 이는 (2개 이상의 항원 결합 Fab 분자를 포함하는 분자의 경우) 이의 결합 아암 중 하나(또는 그 이상)에서 VH/VL 교환으로 Fab-기초된 이중특이적/다중특이적 항원 결합 분자의 제조시 발생할 수 있다(또한 전체가 본원에 참조로서 혼입된 WO 2015/150447, 특히 실시예 부분 참조).
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는
(a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자, 및
(b) Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자
를 포함하되,
제1 항원은 활성화 T 세포 항원이고 제2 항원은 CEA이거나, 제1 항원은 CEA이고 제2 항원은 활성화 T 세포 항원이고;
i) (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산으로 치환되거나(카바트 EU 지수에 따라 넘버링);
ii) (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 양으로 하전된 아미노산으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 음으로 하전된 아미노산으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 상기 i) 및 ii)에 언급된 변형을 둘 다 포함하지 않는다. 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 CH1은 서로 대체되지 않는다(즉, 교환되지 않는다).
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나의 실시양태에서, (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로) 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
추가적 실시양태에서, (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
특정 실시양태에서, (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로) 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로(하나의 바람직한 실시양태에서 독립적으로 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로) 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
보다 특정한 실시양태에서, (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 리신(K) 또는 아르기닌(R)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
보다 더 특정한 실시양태에서, (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산은 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산은 아르기닌(R)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산은 글루탐산(E)으로 치환된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
특정 실시양태에서, (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 동종형의 것이다.
대안적으로, 상기 실시양태에 따른 아미노산 치환은 (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1 대신에 (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에 존재할 수 있다. 특정한 이러한 실시양태에서, (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL은 카파 동종형의 것이다.
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 제3 Fab 분자는 (a)의 제1 Fab 분자와 동일하다. 이러한 실시양태에서, 상기 실시양태에 따른 아미노산 치환은 제1 Fab 분자 및 제3 Fab 분자 각각의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에 존재할 수 있다. 대안적으로, 상기 실시양태에 따른 아미노산 치환은 제1 Fab 분자 및 제3 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1이 아닌 (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL 및 불변 도메인 CH1에 존재할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 추가로 포함한다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 포맷
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분은 서로 다양한 배열로 융합될 수 있다. 예시적 배열이 도 1에 도시되어 있다.
특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 항원 결합 모이어티는 Fab 분자이다. 이러한 실시양태에서, 제1, 제2, 제3 등의 항원 결합 모이어티는 각각 제1, 제2, 제3 등의 Fab 분자로 지칭될 수 있다. 또한, 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다.
하나의 이러한 실시양태에서, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 구체적인 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 근본적으로 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지되, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 이러한 배열을 도 1G 및 1K에 개략적으로 도시하였다. 임의적으로, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 서로 추가로 융합될 수 있다.
또 다른 이러한 실시양태에서, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 구체적인 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 근본적으로 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지되, 제1 및 제2 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합된다. 이러한 배열을 도 1A 및 1D에 개략적으로 도시하였다. 제1 및 제2 Fab 분자는 직접 또는 펩티드 연결기를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제2 Fab 분자는 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 구체적 실시양태에서, 면역글로불린 힌지 영역은 특히 Fc 도메인이 IgG1 Fc 도메인인 경우 인간 IgG1 힌지 영역이다.
다른 실시양태에서, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다.
하나의 이러한 실시양태에서, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 구체적인 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 근본적으로 제1 및 제2 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지되, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 이러한 배열을 도 1H 및 1L에 개략적으로 도시하였다. 임의적으로, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 서로 추가로 융합될 수 있다.
Fab 분자는 Fc 도메인에 융합될 수 있거나, 직접 또는 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩티드 연결기를 통해 서로 융합될 수 있다. 펩티드 연결기는 당해 분야에서 공지되어 있고 본원에 기재된 바와 같다. 적합한 비면역원성 펩티드 연결기는 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 연결기를 포함한다. "n"은 일반적으로 1 내지 10, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다. 하나의 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기의 길이는 5개 이상의 아미노산, 하나의 실시양태에서, 5 내지 100개, 또 다른 실시양태에서, 10 내지 50개의 아미노산을 갖는다. 하나의 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 (GxS)n 또는 (GxS)nGm 이고, 이때 G는 글리신, S는 세린이고, x는 3이고, n은 3, 4, 5 또는 6이고, m은 0, 1, 2 또는 3이거나, x는 4이고, n은 2, 3, 4 또는 5이고, m은 0, 1, 2 또는 3이고, 하나의 실시양태에서, x는 4이고, n은 2 또는 3이고, 또 다른 실시양태에서, x는 4이고, n은 2이다. 하나의 실시양태에서, 상기 펩티드 연결기는 (G4S)2이다. 제1 Fab 분자 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄를 서로 융합하는 데 특히 적합한 펩티드 연결기는 (G4S)2이다. 제1 Fab 분자 및 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄를 연결하는 데 적합한 예시적 펩티드 연결기는 서열(D)-(G4S)2(서열번호 11 및 12)를 포함한다. 또 다른 적합한 이러한 연결기는 서열 (G4S)4를 포함한다. 추가로, 연결기는 면역글로불린 힌지 영역(의 일부)을 포함할 수 있다. 특히, Fab 분자가 Fc 도메인 서브유닛의 N-말단에 융합되는 경우, 추가의 펩티드 연결기를 사용하거나 사용하지 않고 면역글로불린 힌지 영역 또는 이의 일부를 통해 상기 Fab 분자를 융합시킬 수 있다.
특히, 고친화성 Fab 분자의 결합 후 표적 세포 항원의 내재화가 예상되는 경우, (예를 들면, 도 1A, 1D, 1G, 1H, 1K, 1L에 나타낸 바와 같이) 표적 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 단일 항원 결합 모이어티(예컨대, Fab 분자)를 갖는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 유용하다. 이러한 경우, 표적 세포 항원에 대해 특이적인 하나 초과의 Fab 분자의 존재는 표적 세포 항원의 내재화를 향상시킴으로써 그의 사용가능성을 감소시킬 수 있다.
그러나, 많은 또 다른 경우에서, 예를 들면, 표적 부위로의 표적화를 최적화하거나 표적 세포 항원의 가교결합을 가능하게 하기 위해 표적 세포 항원에 대해 특이적인 2개 이상의 항원 결합 모이어티(예컨대, Fab 분자)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 갖는 것이 유리할 것이다(도 1B, 1C, 1E, 1F, 1I, 1J, 1M 또는 1N에 나타낸 예 참조).
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자를 추가로 포함한다. 제1 항원은 바람직하게는 표적 세포 항원, 즉, CEA이다. 하나의 실시양태에서, 제3 Fab 분자는 통상적 Fab 분자이다. 하나의 실시양태에서, 제3 Fab 분자는 제1 Fab 분자와 동일하다(즉, 제1 및 제3 Fab 분자는 동일한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하고 동일한 도메인 배열(즉, 통상적이거나 교차)을 갖는다). 특정 실시양태에서, 제2 Fab 분자는 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3에 특이적으로 결합하고, 제1 및 제3 Fab 분자는 CEA에 특이적으로 결합한다.
대안적 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제3 Fab 분자를 추가로 포함한다. 이러한 실시양태에서, 제2 항원은 바람직하게는 표적 세포 항원, 즉, CEA이다. 하나의 이러한 실시양태에서, 제3 Fab 분자는 교차 Fab 분자(Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교환/교체된 Fab 분자)이다. 하나의 이러한 실시양태에서, 제3 Fab 분자는 제2 Fab 분자와 동일하다(즉, 제2 및 제3 Fab 분자는 동일한 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 포함하고 동일한 도메인 배열(즉, 통상적이거나 교차)을 갖는다). 하나의 이러한 실시양태에서, 제1 Fab 분자는 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3에 특이적으로 결합하고, 제2 및 제3 Fab 분자는 CEA에 특이적으로 결합한다.
하나의 실시양태에서, 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다.
특정 실시양태에서, 제2 및 제3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 구체적인 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 근본적으로 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지되, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되고, 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 이러한 배열을 도 1B 및 1E(제3 Fab 분자가 통상적인 Fab 분자이고 바람직하게는 제1 Fab 분자와 동일한 특정한 실시양태), 및 도 1I 및 1M(제3 Fab 분자가 교차 Fab 분자이고 바람직하게는 제2 Fab 분자와 동일한 대안적 실시양태)에 개략적으로 도시하였다. 제2 및 제3 Fab 분자는 직접 또는 펩티드 연결기를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제2 및 제3 Fab 분자는 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 구체적 실시양태에서, 면역글로불린 힌지 영역은 특히 Fc 도메인이 IgG1 Fc 도메인인 경우 인간 IgG1 힌지 영역이다. 임의적으로, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 서로 추가로 융합될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제1 및 제3 Fab 분자는 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 구체적인 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 근본적으로 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지되, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 N-말단에 융합되고, 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 N-말단에 융합된다. 이러한 배열을 도 1C 및 1F(제3 Fab 분자가 통상적 Fab 분자이고 바람직하게는 제1 Fab 분자와 동일한 특정 실시양태) 및 도 1J 및 1N(제3 Fab 분자가 교차 Fab 분자이고 바람직하게는 제2 Fab 분자와 동일한 대안적 실시양태)에 개략적으로 도시하였다. 제1 및 제3 Fab 분자는 직접 또는 펩티드 연결기를 통해 Fc 도메인에 융합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 및 제3 Fab 분자는 각각 면역글로불린 힌지 영역을 통해 Fc 도메인에 융합된다. 구체적 실시양태에서, 면역글로불린 힌지 영역은 특히 Fc 도메인이 IgG1 Fc 도메인인 경우 인간 IgG1 힌지 영역이다. 임의적으로, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 서로 추가적으로 융합될 수 있다.
Fab 분자가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 각각의 서브유닛의 N-말단에 면역글로불린 힌지 영역을 통해 융합된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 배열에서, 2개의 Fab 분자, 힌지 영역 및 Fc 도메인이 근본적으로 면역글로불린 분자를 형성한다. 특정 실시양태에서, 면역글로불린 분자는 IgG 부류 면역글로불린이다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG1 하위부류 면역글로불린이다. 또 다른 실시양태에서, 면역글로불린은 IgG4 하위부류 면역글로불린이다. 추가로 특정한 실시양태에서, 면역글로불린은 인간 면역글로불린이다. 다른 실시양태에서, 면역글로불린은 키메릭 면역글로불린 또는 인간화된 면역글로불린이다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 일부에서, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 임의적으로 펩티드 연결기를 통해 서로 융합된다. 제1 및 제2 Fab 분자의 배열에 따라, 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄는 이의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있거나, 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄는 이의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄의 N-말단에 융합될 수 있다. 제1 및 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄의 융합은 비일치하는 Fab 중쇄 및 경쇄의 짝풀림을 감소시키고, 또한 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 일부의 발현을 위해 필요한 플라스미드의 수를 감소시킨다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)) 폴리펩티드, 및 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해 공유결합된다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4)) 폴리펩티드, 및 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해 공유결합된다.
일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합를 공유하는(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)) 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합를 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-CH2-CH3(-CH4)) 폴리펩티드를 포함한다.
이들 실시양태 중 일부에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 제2 Fab 분자의 교차 Fab 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 다른 이들 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 경쇄 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VH(2)-CL(2)-VL(1)-CL(1)) 폴리펩티드, 또는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2)) 폴리펩티드를 적절하게 추가로 포함한다.
이들 실시양태에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩티드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) 및 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해 공유결합된다.
일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-CH2-CH3(-CH4)) 폴리펩티드를 포함한다. 다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 Fc 도메인 서브유닛과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-CH2-CH3(-CH4)) 폴리펩티드를 포함한다.
이들 실시양태 중 일부에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 제2 Fab 분자의 교차 Fab 경쇄 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 다른 이들 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VL(2)-CH1(2)-VL(1)-CL(1)) 폴리펩티드, 또는 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VL(1)-CL(1)-VH(2)-CL(2)) 폴리펩티드를 적절하게 추가로 포함한다.
이들 실시양태에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 (i) Fc 도메인 서브유닛 폴리펩티드(CH2-CH3(-CH4)), 또는 (ii) 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 Fc 도메인 서브유닛(VH(3)-CH1(3)-CH2-CH3(-CH4)) 및 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 예를 들어 다이설파이드 결합에 의해 공유결합된다.
일부 실시양태에서, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정한 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 근본적으로 제1 및 제2 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지되, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 이러한 배열을 도 1O 및 1S에 개략적으로 도시하였다.
다른 실시양태에서, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정한 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인을 포함하지 않는다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 근본적으로 제1 및 제2 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지되, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 이러한 배열을 도 1P 및 1T에 개략적으로 도시하였다.
일부 실시양태에서, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자를 추가로 포함하되, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정한 이러한 실시양태에서, 상기 제3 Fab 분자는 통상적 Fab 분자이다. 다른 이러한 실시양태에서, 상기 제3 Fab 분자는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 교환/대체된 Fab 분자이다. 특정한 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 근본적으로 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지되, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 이러한 배열을 도 1Q 및 1U에 개략적으로 도시하였다(제3 Fab 분자가 통상적 Fab 분자이고 바람직하게는 제1 Fab 분자와 동일한 특정 실시양태).
일부 실시양태에서, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자를 추가로 포함하되, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 N-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C-말단에 융합된다. 특정한 이러한 실시양태에서, 상기 제3 Fab 분자는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로 교환/대체된 Fab 분자이다. 다른 이러한 실시양태에서, 상기 제3 Fab 분자는 통상적 Fab 분자이다. 특정한 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 근본적으로 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지되, 제1 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 N-말단에서 2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C-말단에 융합된다. 이러한 배열을 도 1W 및 1Y에 개략적으로 도시하였다(제3 Fab 분자가 교차 Fab 분자이고 바람직하게는 제2 Fab 분자와 동일한 특정 실시양태).
일부 실시양태에서, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자를 추가로 포함하되, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 N-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C-말단에 융합된다. 특정한 이러한 실시양태에서, 상기 제3 Fab 분자는 통상적 Fab 분자이다. 다른 이러한 실시양태에서, 상기 제3 Fab 분자는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로 교환/대체된 Fab 분자이다. 특정한 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 근본적으로 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지되, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 N-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 C-말단에 융합된다. 이러한 배열을 도 1R 및 1V에 개략적으로 도시하였다(제3 Fab 분자가 통상적 Fab 분자이고 바람직하게는 제1 Fab 분자와 동일한 특정 실시양태).
일부 실시양태에서, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자를 추가로 포함하되, 상기 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 특정한 이러한 실시양태에서, 상기 제3 Fab 분자는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로 교환/대체된 Fab 분자이다. 다른 이러한 실시양태에서, 상기 제3 Fab 분자는 통상적 Fab 분자이다. 특정한 이러한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 근본적으로 제1, 제2 및 제3 Fab 분자, 및 임의적으로 하나 이상의 펩티드 연결기로 이루어지되, 제2 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되고, 제3 Fab 분자는 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합된다. 이러한 배열을 도 1X 및 1Z에 개략적으로 도시하였다(제3 Fab 분자가 교차 Fab 분자이고 바람직하게는 제1 Fab 분자와 동일한 특정 실시양태).
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합를 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다)(VH(3)-CH1(3)-VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3)) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)-VH(3)-CH1(3)) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역 (VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(3)-CL(3))를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(즉, 제3 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다)(VH(1)-CH1(1)-VL(2)-CH1(2)-VL(3)-CH1(3)) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VH(3)-CL(3)) 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄가 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(즉, 제3 Fab 분자는 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다)(VH(1)-CH1(1)-VH(2)-CL(2)-VH(3)-CL(3)) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(3)-CH1(3))과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제3 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 가변 영역이 경쇄 가변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VL(3)-CH1(3)-VL(2)-CH1(2)-VH(1)-CH1(1)) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역(VH(2)-CL(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합를 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VH(3)-CL(3)) 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제3 Fab 분자는 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 가변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고, 차례로 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하고(즉, 제2 Fab 분자가 중쇄 불변 영역이 경쇄 불변 영역으로 대체된 교차 Fab 중쇄를 포함한다), 차례로 제1 Fab 분자의 Fab 중쇄와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VH(3)-CL(3)-VH(2)-CL(2)-VH(1)-CH1(1)) 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제2 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제2 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역(VL(2)-CH1(2)) 및 제1 Fab 분자의 Fab 경쇄 폴리펩티드(VL(1)-CL(1))와 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 제3 Fab 분자의 Fab 경쇄 가변 영역이 제3 Fab 분자의 Fab 중쇄 불변 영역과 카복시-말단 펩티드 결합을 공유하는(VL(3)-CH1(3)) 폴리펩티드를 포함한다.
임의의 상기 실시양태에 따라, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 성분(예를 들어 Fab 분자, Fc 도메인)은 직접 또는 본원에 기재되거나 당분야에 공지된 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개의 아미노산을 포함하는 다양한 연결기, 특히 펩티드 연결기를 통해 융합될 수 있다. 적합한 비-면역원성 펩티드 연결기는 예를 들어 (G4S)n, (SG4)n, (G4S)n 또는 G4(SG4)n 펩티드 연결기(이때, n은 일반적으로 1 내지 10의 정수, 전형적으로 2 내지 4의 정수이다)를 포함한다.
Fc 도메인
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 면역글로불린 분자의 중쇄 도메인을 포함하는 한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성된다. 예를 들면, 면역글로불린 G(IgG) 분자의 Fc 도메인은 이량체이고, 이들의 각각의 서브유닛은 CH2 IgG 중쇄 불변 도메인 및 CH3 IgG 중쇄 불변 도메인을 포함한다. Fc 도메인의 2개 서브유닛은 서로 안정한 결합을 형성할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하나 이하의 Fc 도메인을 포함한다.
본 발명에 따른 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG Fc 도메인이다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인이다. 또 다른 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인이다. 보다 구체적인 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 S228(카바트 넘버링)에서 아미노산 치환, 특히 아미노산 치환 S228P를 포함하는 IgG4 Fc 도메인이다. 이 아미노산 치환은 IgG4 항체의 생체내 Fab 아암 교환을 감소시킨다(문헌[Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)] 참조). 추가로 특정한 실시양태에서, Fc 도메인은 인간 Fc 도메인이다. 인간 IgG1 Fc 영역의 예시적인 서열은 서열번호 13으로 주어진다.
이종이량체화를 촉진하는 Fc 도메인 변형
본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나 또는 다른 하나에 융합된 상이한 Fab 분자를 포함하므로, 상기 Fc 도메인의 2개 서브유닛은 전형적으로 2개의 동일하지 않은 폴리펩티드 쇄에 포함되어 있다. 이들 폴리펩티드의 재조합 공동-발현 및 후속 이량체화는 상기 2개의 폴리펩티드의 여러 가능한 조합을 유발한다. 따라서, 재조합 제조에 있어서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선하기 위해, 원하는 폴리펩티드의 결합을 촉진하는 변형을 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인 내에 도입하는 것이 유리할 것이다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형을 포함한다. 인간 IgG Fc 도메인의 2개 서브유닛 사이의 가장 광범위한 단백질-단백질 상호작용의 부위는 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 상기 변형은 Fc 도메인의 CH3 도메인에 존재한다.
이종이량체화를 시행하기 위해 Fc 도메인의 CH3 도메인에서 변형시키기 위한 여러 접근법이 존재하고, 예를 들면 WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291에 잘 기재되어 있다. 전형적으로, 모든 상기 접근법에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인 및 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인 둘 다는, 각각의 CH3 도메인(또는 이를 포함하는 중쇄)이 더 이상 스스로 동종이량체화 될 수 없지만 (제1 CH3 도메인 및 제2 CH3 도메인이 이종이량체화되고 2개의 제1 CH3 도메인 또는 2개의 제2 CH3 도메인 사이에 동종이량체가 형성되지 않도록) 상보적으로 조작된 다른 CH3 도메인과 이종이량체화 하도록 상보적인 방식으로 조작된다. 향상된 중쇄 이종이량체화를 위한 이러한 상이한 접근법은 경쇄 짝풀림 및 벤스 존스 유형 부산물을 감소시키는 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에서 중쇄-경쇄 변형(하나의 결합 아암에서 VH 및 VL 교환/대체 및 CH1/CL 계면에서 반대 전하로 하전된 아미노산 치환의 도입)과 함께 상이한 대안으로서 고려된다.
구체적 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 상기 변형은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 하나에서 "놉" 변형을 포함하고 Fc 도메인의 2개 서브유닛 중 나머지 하나에서 "홀" 변형을 포함하는 소위 "놉-인투-홀" 변형이다.
놉-인투-홀 기술은 예를 들면, US 5,731,168, US 7,695,936, 문헌[Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)] 및 [Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 돌출부를 캐비티에 위치시켜 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해할 수 있도록 돌출부("놉")를 제1 폴리펩티드의 계면에서 도입하고 상응하는 캐비티("홀")를 제2 폴리펩티드의 계면에서 도입하는 단계를 포함한다. 돌출부는 제1 폴리펩티드의 계면의 작은 아미노산 측쇄가 보다 큰 측쇄(예를 들면, 티로신 또는 트립토판)로 치환됨으로써 구축된다. 상기 돌출부와 동일하거나 유사한 크기의 상쇄 캐비티는 큰 아미노산 측쇄가 보다 작은 아미노산 측쇄(예를 들면, 알라닌 또는 쓰레오닌)로 치환됨으로써 제2 폴리펩티드의 계면에서 생성된다.
따라서, 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 돌출부가 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 캐비티에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생되고, Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 치환됨으로써, 캐비티가 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내에서 발생한다.
바람직하게는 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직하게는 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기는 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
돌출부 및 캐비티는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 변형시킴으로써, 예를 들면, 부위 특이적 돌연변이유발 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다.
구체적 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛("놉" 서브유닛)의 CH3 도메인에서 위치 366의 쓰레오닌 잔기는 트립토판 잔기로 치환되고(T366W), Fc 도메인의 제2 서브유닛("홀" 서브유닛)의 CH3 도메인에서 위치 407의 티로신 잔기는 발린 잔기로 치환된다(Y407V). 하나의 실시양태에서, Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 위치 366의 쓰레오닌 잔기는 세린 잔기로 치환되고(T366S) 위치 368의 류신 잔기는 알라닌 잔기로 치환된다(L368A)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
추가의 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 추가로 위치 354의 세린 잔기는 시스테인 잔기로 치환되거나(S354C) 위치 356의 글루탐산 잔기는 시스테인 잔기로 치환되고(E356C), Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가로 위치 349의 티로신 잔기는 시스테인 잔기로 치환된다(Y349C)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 이들 2개의 시스테인 잔기의 도입은 Fc 도메인의 2개 서브유닛 사이에서 이량체를 더 안정화시키는 다이설파이드 가교의 형성을 야기한다(문헌[Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)] 참조).
특정 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자는 Fc 도메인의 제1 서브유닛("놉" 변형을 포함함)에 (임의적으로 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자를 통해) 융합된다. 이론에 구애됨이 없이, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자와 Fc 도메인의 놉-함유 서브유닛의 융합은 활성화 T 세포 항원에 결합하는 2개의 Fab 분자를 포함하는 분자에 결합하는 항원의 생성(2개의 놉-함유 폴리펩티드의 입체 충돌)을 (추가로) 최소화한다.
이종이량체화를 실시하기 위한 CH3-변형의 다른 기술은 본 발명에 따른 대안으로 고려되고 예를 들면, WO 96/27011, WO 98/050431, EP 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291에 기재되어 있다.
하나의 실시양태에서, 다르게는 EP 1870459 A1에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 이러한 접근법은 Fc 도메인의 2개의 서브유닛 사이의 CH3/CH3 도메인 계면 중에 특정한 아미노산 위치에서 전하된 아미노산을 반대 전하로 도입하는 것에 기초한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 대한 바람직한 하나의 실시양태는 (Fc 도메인의) 2개의 CH3 도메인 중 하나에서 아미노산 돌연변이 R409D; K370E 및 Fc 도메인의 CH3 도메인의 다른 하나에서 아미노산 돌연변이 D399K; E357K이다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366W 및 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 T366S, L368A, Y407V, 및 추가적으로 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 R409D; K370E 및 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 D399K; E357K를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366W, 및 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V를 포함하거나, 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 Y349C, T366W, 및 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 S354C, T366S, L368A, Y407V, 및 추가로 Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 R409D; K370E 및 Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 돌연변이 D399K; E357를 포함한다(모두 카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
하나의 실시양태에서, 다르게는 WO 2013/157953에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 하나의 실시양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366K를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351D를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 추가적 실시양태에서, 제1 CH3 도메인은 추가 아미노산 돌연변이 L351K를 포함한다. 추가적 실시양태에서, 제2 CH3 도메인은 Y349E, Y349D 및 L368E(바람직하게는 L368E)로부터 선택된 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
하나의 실시양태에서, 다르게는 WO 2012/058768에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 하나의 실시양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가적 실시양태에서, 제2 CH3 도메인은 위치 T411, D399, S400, F405, N390 또는 K392에서, 예를 들면, (a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, T411E 및 T411W, (b) D399R, D399W, D399Y 및 D399K, (c) S400E, S400D, S400R 및 S400K, (d) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V 및 F405W, (e) N390R, N390K 및 N390D, (f) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F 및 K392E로부터 선택된 추가 아미노산 돌연변이를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 추가적 실시양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 L351Y, Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366V, K409F를 포함한다 추가적 실시양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366A, K409F를 포함한다. 추가적 실시양태에서, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K392E, T411E, D399R 및 S400R을 추가로 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
하나의 실시양태에서, 다르게는 WO 2011/143545에 기재된 이종이량체화 접근법, 예를 들면, 368 및 409로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 변형이 사용된다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
하나의 실시양태에서, 다르게는 상기 기재된 놉-인투-홀 기법을 또한 사용하는 WO 2011/090762에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 하나의 실시양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366W를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407A를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 T366Y를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 Y407T를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 Fc 도메인은 IgG2 서브클래스의 분자 또는 도메인이고, 다르게는 WO 2010/129304에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용된다.
대안적인 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛과 제2 서브유닛의 결합을 촉진하는 변형은 예를 들면, WO 2009/089004에 기재된 바와 같이 정전기 조종(steering) 효과를 매개하는 변형을 포함한다. 일반적으로, 이 방법은 동종이량체 형성이 정전기적으로 불리하게 되지만 이종이량체화가 정전기적으로 유리하게 되도록 2개의 Fc 도메인 서브유닛의 계면에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 하전된 아미노산 잔기로 치환시키는 단계를 포함한다. 이러한 하나의 실시양태에서, 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산으로 K392 또는 N392의 아미노산 치환(예를 들면, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D), 바람직하게는 K392D 또는 N392D)을 포함하고 제2 CH3 도메인은 양으로 하전된 아미노산으로 D399, E356, D356 또는 E357의 아미노산 치환(예를 들면, 리신(K) 또는 아르기닌(R), 바람직하게는 D399K, E356K, D356K 또는 E357K, 더욱 바람직하게는 D399K 또는 E356K)을 포함한다. 추가적 실시양태에서, 제1 CH3 도메인은 음으로 하전된 아미노산으로 K409 또는 R409의 아미노산 치환(예를 들면, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D), 바람직하게는 K409D 또는 R409D)을 추가로 포함한다 추가적 실시양태에서, 제1 CH3 도메인은 추가로 또는 다르게는 음으로 하전된 아미노산으로 K439 및/또는 K370의 아미노산 치환(예를 들면, 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D))을 포함한다(모두 카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
또 다른 실시양태에서, 다르게는 WO 2007/147901에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용된다. 하나의 실시양태에서, 제1 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 K253E, D282K 및 K322D를 포함하고, 제2 CH3 도메인은 아미노산 돌연변이 D239K, E240K 및 K292D를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
또 다른 실시양태에서, 다르게는 WO 2007/110205에 기재된 이종이량체화 접근법이 사용될 수 있다.
하나의 실시양태에서, Fc 도메인의 제1 서브유닛은 아미노산 치환 K392D 및 K409D를 포함하고, Fc 도메인의 제2 서브유닛은 아미노산 치환 D356K 및 D399K를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 Fc 도메인 변형
Fc 도메인은 표적 조직에서의 우수한 축적 및 유리한 조직-혈액 분포 비에 기여하는 긴 혈청 반감기를 포함하는 유리한 약동학적 성질을 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 부여한다. 그러나, 동시에 상기 Fc 도메인은 바람직한 항원 보유 세포로의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 표적화보다는 오히려 Fc 수용체를 발현하는 세포로의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 원치 않는 표적화를 유발할 수 있다. 더욱이, Fc 수용체 신호전달 경로의 공활성화(co-activation)는 항원 결합 분자의 T 세포 활성화 성질 및 긴 반감기와 함께 사이토카인 수용체의 과도한 활성화 및 전신 투여 시 심각한 부작용을 초래하는 사이토카인 방출을 유발할 수 있다. T 세포 이외의 (Fc 수용체 보유) 면역 세포의 활성화는 예를 들면, NK 세포에 의한 T 세포의 잠재적 파괴로 인해 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 효능조차도 더 감소시킬 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 이러한 하나의 실시양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)은 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)에 비해 Fc 수용체에 대한 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 결합 친화성, 및/또는 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)에 비해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 가장 바람직하게는 5% 미만의 효과기 기능을 나타낸다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)은 실질적으로 Fc 수용체에 결합하지 않고/않거나 효과기 기능을 유도하지 않는다. 특정 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 하나의 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 하나의 실시양태에서, 효과기 기능은 CDC, ADCC, ADCP 및 사이토카인 분비로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효과기 기능이다. 특정 실시양태에서, 효과기 기능은 ADCC이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 실질적으로 유사한 결합 친화성을 나타낸다. Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 천연 IgG1 Fc 도메인(또는 천연 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화성의 약 70% 초과, 구체적으로 약 80% 초과, 보다 구체적으로 약 90% 초과의 결합 친화성을 나타내는 경우 FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합이 달성된다.
특정 실시양태에서, Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 구체적인 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 전형적으로, 동일한 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 Fc 도메인의 2개 서브유닛 각각에 존재한다. 하나의 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시킨다. 하나의 실시양태에서, 아미노산 돌연변이는 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 2배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상만큼 감소시킨다. Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 감소시키는 하나 초과의 아미노산 돌연변이가 존재하는 실시양태에서, 이들 아미노산 돌연변이의 조합은 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 10배 이상, 20배 이상 또는 심지어 50배 이상만큼 감소시킬 수 있다. 하나의 실시양태에서, 조작된 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 비해 Fc 수용체에 대한 20% 미만, 특히 10% 미만, 보다 특히 5% 미만의 결합 친화성을 나타낸다. 특정 실시양태에서, Fc 수용체는 Fcγ 수용체이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 인간 Fc 수용체이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 Fc 수용체이다. 구체적인 실시양태에서, Fc 수용체는 활성화 인간 Fcγ 수용체, 보다 구체적으로 인간 FcγRIIIa, FcγRI 또는 FcγRIIa, 가장 구체적으로 인간 FcγRIIIa이다. 바람직하게는, 이들 수용체 각각에 대한 결합이 감소된다. 일부 실시양태에서, 보체 구성성분에 대한 결합 친화성, 구체적으로 C1q에 대한 결합 친화성도 감소된다. 하나의 실시양태에서, 신생아 Fc 수용체(FcRn)에 대한 결합 친화성은 감소되지 않는다. Fc 도메인(또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)이 FcRn에 대한 조작되지 않은 형태의 Fc 도메인(또는 상기 조작되지 않은 형태의 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)의 결합 친화성의 약 70% 초과의 결합 친화성을 나타내는 경우 FcRn에 대한 실질적으로 유사한 결합, 즉 상기 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성의 보존이 달성된다. Fc 도메인, 또는 상기 Fc 도메인을 포함하는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 이러한 친화성의 약 80% 초과, 심지어 약 90% 초과의 결합 친화성을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 조작되지 않은 Fc 도메인에 비해 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작된다. 감소된 효과기 기능은 하기 효과기 기능 중 하나 이상의 효과기 기능을 포함할 수 있으나 이들로 한정되지 않는다: 감소된 보체 의존적 세포독성(CDC), 감소된 항체 의존적 세포-매개된 세포독성(ADCC), 감소된 항체 의존적 세포 식균작용(ADCP), 감소된 사이토카인 분비, 항원 제시 세포에 의한 감소된 면역 복합체-매개된 항원 흡수, NK 세포에 대한 감소된 결합, 대식세포에 대한 감소된 결합, 단핵세포에 대한 감소된 결합, 다형핵세포에 대한 감소된 결합, 세포자멸을 유도하는 감소된 직접적인 신호전달, 표적-결합된 항체의 감소된 가교결합, 감소된 수지상 세포 성숙, 및 감소된 T 세포 프라이밍(priming). 하나의 실시양태에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC, 감소된 ADCC, 감소된 ADCP 및 감소된 사이토카인 분비로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효과기 기능이다. 특정 실시양태에서, 감소된 효과기 기능은 감소된 ADCC이다. 하나의 실시양태에서, 감소된 ADCC는 조작되지 않은 Fc 도메인(또는 조작되지 않은 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자)에 의해 유도된 ADCC의 20% 미만이다.
하나의 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 E233, L234, L235, N297, P331 및 P329로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 보다 구체적인 실시양태에서, Fc 도메인은 L234, L235 및 P329로 이루어진 군으로부터 선택된 위치에서 아미노산 치환을 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 일부 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A 및 L235A를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 이러한 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함한다. 보다 구체적인 실시양태에서, 아미노산 치환은 P329A 또는 P329G, 특히 P329G이다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환을 포함하고 E233, L234, L235, N297 및 P331로부터 선택된 위치에서 추가의 아미노산 치환을 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 보다 구체적인 실시양태에서, 추가의 아미노산 치환은 E233P, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D 또는 P331S이다. 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 P329, L234 및 L235에서 아미노산 치환을 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 보다 특정 실시양태에서, Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 P329G("P329G LALA")를 포함한다. 이러한 하나의 실시양태에서, Fc 도메인은 IgG1 Fc 도메인, 특히 인간 IgG1 Fc 도메인이다. 아미노산 치환의 "P329G LALA" 조합은 전체적으로 본원에 참조로 도입되는 WO 2012/13083에 기재된 바와 같이 인간 IgG1 Fc 도메인의 Fcγ 수용체(및 상보적) 결합을 거의 완전히 제거한다. 또한, WO 2012/130831은 이러한 돌연변이체 Fc 도메인을 제조하는 방법 및 그의 성질, 예컨대, Fc 수용체 결합 또는 효과기 기능을 결정하는 방법을 기재한다.
IgG4 항체는 IgG1 항체에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및 감소된 효과기 기능을 나타낸다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 Fc 도메인은 IgG4 Fc 도메인, 특히 인간 IgG4 Fc 도메인이다. 하나의 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). Fc 수용체에 대한 그의 결합 친화성 및/또는 그의 효과기 기능을 더 감소시키기 위해, 하나의 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 L235에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 L235E를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 또 다른 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 P329G를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 특정 실시양태에서, IgG4 Fc 도메인은 위치 S228, L235 및 P329에서 아미노산 치환, 구체적으로 아미노산 치환 S228P, L235E 및 P329G를 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 이러한 IgG4 Fc 도메인 돌연변이체 및 이들의 Fcγ 수용체 결합 성질은 전체적으로 본원에 참조로 도입되는 WO 2012/130831에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 천연 IgG1 Fc 도메인에 비해 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는 Fc 도메인은 아미노산 치환 L234A, L235A 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG1 Fc 도메인, 또는 아미노산 치환 S228P, L235E 및 임의적으로 P329G를 포함하는 인간 IgG4 Fc 도메인이다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
특정 실시양태에서, Fc 도메인의 N-글리코실화는 제거되어 있다. 하나의 이러한 실시양태에서, Fc 도메인은 위치 N297에서 아미노산 돌연변이, 특히 아스파라긴을 알라닌(N297A) 또는 아스파르트산(N297D)으로 치환시키는 아미노산 치환을 포함한다(카바트 EU 지수에 따라 넘버링).
전술되어 있고 WO 2012/130831에도 기재된 Fc 도메인 이외에, 감소된 Fc 수용체 결합 및/또는 효과기 기능을 갖는 Fc 도메인은 Fc 도메인 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 도메인도 포함한다(US 6,737,056)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링). 이러한 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하는, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상의 아미노산 위치에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(US 7,332,581).
돌연변이체 Fc 도메인은 당해 분야에서 주지되어 있는 유전적 또는 화학적 방법을 사용한 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 변형에 의해 제조될 수 있다. 유전적 방법은 암호화 DNA 서열의 부위 특이적 돌연변이유발, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들면, 서열분석에 의해 검증될 수 있다.
Fc 수용체에 대한 결합은 예를 들면, ELISA에 의해, 또는 표준 기기, 예컨대, 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)를 사용한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 용이하게 결정될 수 있고, Fc 수용체는 예컨대, 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 적합한 이러한 결합 분석은 본원에 기재되어 있다. 대안적으로, 특정 Fc 수용체를 발현하는 것으로 공지된 세포주, 예컨대, FcγIIIa 수용체를 발현하는 인간 NK 세포를 사용하여 Fc 수용체에 대한 Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 결합 친화성을 평가할 수 있다.
Fc 도메인, 또는 Fc 도메인을 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 효과기 기능은 당해 분야에서 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC를 측정하기에 적합한 분석은 본원에 기재되어 있다. 관심 있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 다른 예는 US 5,500,362, 문헌[Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)], [Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985), US 5,821,337 및 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기재되어 있다. 대안적으로, 비방사성 분석 방법이 사용될 수 있다(예를 들면, 유세포계수를 위한 ACTI(상표) 비방사성 세포독성 분석(셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc., 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)), 및 사이토톡스(CytoTox) 96(등록상표) 비방사성 세포독성 분석(프로메가(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)) 참조). 이러한 분석을 위한 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵세포(PBMC) 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 있는 분자의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들면, 동물 모델, 예컨대, 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시된 동물 모델에서 평가될 수 있다.
일부 실시양태에서, Fc 도메인과 보체 구성성분, 특히 C1q의 결합이 감소된다. 따라서, Fc 도메인이 감소된 효과기 기능을 갖도록 조작되어 있는 일부 실시양태에서, 상기 감소된 효과기 기능은 감소된 CDC를 포함한다. C1q 결합 분석은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 C1q에 결합할 수 있음으로써 CDC 활성을 갖는 지를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에 기재된 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 분석을 수행할 수 있다(예를 들면, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996)], [Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)] 및 [Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)] 참조).
항원 결합 모이어티
본 발명의 항원 결합 분자는 이중특이적이다(즉, 상기 분자는 2개의 상이한 항원성 결정인자에 특이적으로 결합할 수 있는 2개 이상의 Fab 분자를 포함한다). 본 발명의 특정 실시양태에 따라, Fab 분자는 Fab 분자(즉, 가변 도메인 및 불변 도메인을 각각 포함하는 중쇄 및 경쇄로 구성된 항원 결합 도메인)이다. 하나의 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간 Fab 분자이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간화된 Fab 분자이다. 또 다른 실시양태에서, 상기 Fab 분자는 인간 중쇄 불변 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다.
바람직하게는, Fab 분자 중 하나 이상은 교차 Fab 분자이다. 이러한 변형은 상이한 Fab 분자의 중쇄와 경쇄의 짝풀림을 감소시킴으로써 재조합 제조에 있어서 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 수율 및 순도를 개선한다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 유용한 특정 교차 Fab 분자에서, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인(각각 VL 및 VH)은 교환된다. 그러나, 이러한 도메인 교환에도 불구하고, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제조는 짝풀림된 중쇄 및 경쇄 사이의 소위 벤스 존스 유형 상호작용으로 인해 특정한 부산물을 포함할 수 있다(문헌[Schaefer et al, PNAS, 108 11187-11191 (2011)] 참조). 상이한 Fab 분자로부터 중쇄 및 경쇄의 짝풀림을 추가로 감소시키고 따라서 목적한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 순도 및 수율을 증가시키기 위해, 본 발명에 따라 하전된 반대 전하를 갖는 아미노산은 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자, 또는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자의 CH1 및 CL 도메인에서 특정한 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 전하 변형은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 통상적인 Fab 분자(예컨대, 도 1A 내지 C, G 내지 J에 나타냄), 또는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 VH/VL 교차 Fab 분자(예컨대, 도 1D 내지 F, K 내지 N에 나타냄)에서 수행된다(그러나 둘 다에서는 아님). 특정 실시양태에서, 전하 변형은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 통상적인 Fab 분자에서 수행된다(특정 실시양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합한다).
본 발명에 따른 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원, 특히 종양 세포 항원, 및 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3에 동시적으로 결합할 수 있다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 표적 세포 항원 및 활성화 T 세포 항원에 동시적으로 결합함으로써 T 세포와 표적 세포를 가교결합시킬 수 있다. 보다 구체적인 실시양태에서, 이러한 동시적인 결합은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 야기한다. 하나의 실시양태에서, 이러한 동시적인 결합은 T 세포의 활성화를 야기한다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 동시적인 결합은 증식, 분화, 사이토카인 분비, 세포독성 효과기 분자 방출, 세포독성 활성 및 활성화 마커의 발현으로 이루어진 군으로부터 선택된, T 림프구, 특히 세포독성 T 림프구의 세포 반응을 야기한다. 하나의 실시양태에서, 표적 세포 항원에 대한 동시적인 결합의 부재 하에 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3의 결합은 T 세포 활성화를 야기하지 않는다.
하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 T 세포의 세포독성 활성을 표적 세포로 방향 전환시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 상기 방향 전환은 표적 세포에 의한 MHC-매개된 펩티드 항원 제시 및/또는 T 세포의 특이성과 무관하다.
특히, 본 발명의 임의의 실시양태에 따른 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 특히 CD8+ T 세포이다.
활성화 T 세포 항원 결합 모이어티
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자("활성화 T 세포 항원 결합 모이어티, 또는 활성화 T 세포 항원 결합 Fab 분자"로도 본원에서 지칭됨)를 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 하나 이하의 항원 결합 모이어티를 포함한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 활성화 T 세포 항원에 1가 결합을 제공한다.
특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로 교환/대체된 Fab 분자이다. 이러한 실시양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 바람직하게는 통상적 Fab 분자이다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함되는 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 하나 초과의 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자가 존재하는 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티눈 바람직하게는 교차 Fab 분자이고, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 통상적 Fab 분자이다.
대안적 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 통상적 Fab 분자이다. 이러한 실시양태에서, 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로 교환/대체된 Fab 분자이다.
특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3, 특히 인간 CD3(서열번호 1) 또는 시노몰구스 CD3(서열번호 2), 가장 특히 인간 CD3이다. 특정 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 인간 및 시노몰구스 CD3에 교차-반응성이다(즉, 특이적으로 결합한다). 일부 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원은 CD3의 엡실론 서브유닛(CD3 엡실론)이다.
일부 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원 결합 모이어티는 CD3, 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하고, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 및 서열번호 8, 서열번호 9 및 서열번호 10으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 경쇄 CDR을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 결합 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 5의 중쇄 CDR2 및 서열번호 6의 중쇄 CDR3를 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 8의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, CD3 결합 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 4의 중쇄 CDR1, 서열번호 46의 중쇄 CDR2 및 서열번호 6의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 47의 경쇄 CDR1, 서열번호 9의 경쇄 CDR2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR3를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 결합 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 3과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 결합 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 결합 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 3의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 7의 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 결합 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 48과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 49와 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 결합 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 48의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 49의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
하나의 실시양태에서, CD3 결합 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 48의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 49의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
표적 세포 항원 결합 모이어티
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CEA(표적 세포 항원)에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자를 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CEA에 특이적으로 결합하는 2개의 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자를 포함한다. 특정한 이러한 실시양태에서, 이들 항원 결합 모이어티 각각은 동일한 항원성 결정인자에 특이적으로 결합한다. 보다 더 특정한 실시양태에서, 이들 항원 결합 모이어티 모두는 동일하다, 즉, 이들은 본원에 기재된 바와 같이 (필요에 따라) CH1 및 CL 도메인에서 동일한 아미노산 치환을 포함하는 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CEA에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 포함한다. 하나의 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 CEA에 특이적으로 결합하는 2개 이하의 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자를 포함한다.
특정 실시양태에서, CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 통상적 Fab 분자이다. 이러한 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로 교환/대체된 Fab 분자이다.
대안적 실시양태에서, CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 본원에 기재된 교차 Fab 분자, 즉, Fab 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 VH 및 VL 또는 불변 도메인 CH1 및 CL이 서로 교환/대체된 Fab 분자이다. 이러한 실시양태에서, 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티는 통상적 Fab 분자이다.
CEA 결합 잔기는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 표적 부위로, 예를 들어 CEA를 발현하는 특정 유형의 종양 세포로 유도할 수 있다.
하나의 실시양태에서, CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 15의 중쇄 CDR 2 및 서열번호 16의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 경쇄 CDR 1, 서열번호 18의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 19의 경쇄 CDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가적 실시양태에서, CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 22의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 22의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 23의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 34의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 36의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 37의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 및 서열번호 38의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 추가로 특정한 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 34의 폴리펩티드 서열, 서열번호 36의 폴리펩티드 서열, 서열번호 37의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 38의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 34의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 37의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 38의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 및 서열번호 39의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 추가적 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 34의 폴리펩티드 서열, 서열번호 37의 폴리펩티드 서열, 서열번호 38의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 39의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 34의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 36의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 38의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 및 서열번호 40의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 추가적 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 34의 폴리펩티드 서열, 서열번호 36의 폴리펩티드 서열, 서열번호 38의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 40의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 추가적 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 34의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 36의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 38의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 및 서열번호 41의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 추가적 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 34의 폴리펩티드 서열, 서열번호 36의 폴리펩티드 서열, 서열번호 38의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 41의 폴리펩티드 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 34의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 50의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 서열번호 51의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드, 및 서열번호 52의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 추가적 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 서열번호 34의 폴리펩티드 서열, 서열번호 50의 폴리펩티드 서열, 서열번호 51의 폴리펩티드 서열 및 서열번호 52의 폴리펩티드 서열을 포함한다.
CEA 항체
하나의 양상에서, 본 발명은 CEA에 특이적으로 결합하는 항체, 특히 인간화된 항체를 제공하되, 상기 항체는 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 15의 중쇄 CDR 2 및 서열번호 16의 중쇄 CDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 경쇄 CDR 1, 서열번호 18의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 19의 경쇄 CDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항체는 서열번호 22의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 서열과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 경쇄 가변 영역을 포함한다. 추가적 실시양태에서, CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티, 특히 Fab 분자는 서열번호 22의 중쇄 가변 영역 서열 및 서열번호 23의 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에서, 항체는 Fab 분자이다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 단편은 항원 결합 단편이다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 전체 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 단일 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있거나 공동-발현되는 다수(예를 들면, 2개 이상)의 폴리뉴클레오티드로서 발현될 수 있다. 공동-발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드는 예를 들면, 다이설파이드 결합 또는 다른 수단을 통해 결합하여 기능성 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 형성할 수 있다. 예를 들면, Fab 분자의 경쇄 부분은 Fab 분자의 중쇄 부분, Fc 도메인 서브유닛 및 임의적으로 또 다른 Fab 분자(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부로부터 분리된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공동-발현되는 경우, 중쇄 폴리펩티드는 경쇄 폴리펩티드와 결합하여 Fab 분자를 형성할 것이다. 또 다른 예에서, 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 하나 및 임의적으로 하나 이상의 Fab 분자(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부는 상기 2개의 Fc 도메인 서브유닛 중 나머지 하나 및 임의적으로 Fab 분자(의 일부)를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 일부로부터 분리된 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화될 수 있다. 공동-발현되는 경우, Fc 도메인 서브유닛은 결합하여 Fc 도메인을 형성할 것이다.
일부 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 전체 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화한다. 또 다른 실시양태에서, 단리된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 포함된 폴리펩티드를 암호화한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 DNA이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를 들면, 메신저 RNA(mRNA) 형태의 RNA이다. 본 발명의 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
재조합 방법
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 예를 들면, 고체 상태 펩티드 합성(예를 들면, 메리필드(Merrifield) 고체상 합성) 또는 재조합 제조에 의해 수득될 수 있다. 재조합 제조를 위해, 예를 들면, 전술된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 단리하고 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입한다. 통상적인 절차를 사용하여 이러한 폴리뉴클레오티드를 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터가 제공된다. 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 적절한 전사/번역 조절 신호와 함께 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)의 암호화 서열을 함유하는 발현 벡터를 구축할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전적 재조합을 포함한다. 예를 들면, 문헌[Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)] 및 [Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)]에 기재된 기법을 참조한다. 발현 벡터는 플라스미드 또는 바이러스의 일부일 수 있거나 핵산 단편일 수 있다. 발현 벡터는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드(즉, 암호화 영역)가 프로모터 및/또는 다른 전사 또는 번역 조절 요소와 작동가능하게 연결된 상태로 클로닝되어 있는 발현 카세트를 포함한다. 본원에서 사용된 "암호화 영역"은 아미노산으로 번역되는 코돈들로 구성된 핵산의 일부이다. "정지 코돈"(TAG, TGA 또는 TAA)은 아미노산으로 번역되지 않지만, 암호화 영역의 일부인 것으로 간주될 수 있지만, 존재하는 경우 임의의 플랭킹 서열, 예를 들면, 프로모터, 리보좀 결합 부위, 전사 종결요소, 인트론, 5' 및 3' 비번역 영역 등은 암호화 영역의 일부가 아니다. 2개 이상의 암호화 영역은 단일 폴리뉴클레오티드 구축물 내에, 예를 들면, 단일 벡터 상에 존재할 수 있거나 별도의 폴리뉴클레오티드 구축물 내에, 예를 들면, 별도의 (상이한) 벡터 상에 존재할 수 있다. 더욱이, 임의의 벡터는 단일 암호화 영역을 함유할 수 있거나 2개 이상의 암호화 영역을 포함할 수 있다(예를 들면, 본 발명의 벡터는 단백질용해성 절단을 통해 번역 후에 또는 번역과 동시에 최종 단백질로 분리되는 하나 이상의 폴리펩티드를 암호화할 수 있다). 또한, 본 발명의 벡터, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편), 또는 이의 변이체 또는 유도체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 융합되거나 융합되지 않은 이종 암호화 영역을 암호화할 수 있다. 이종 암호화 영역은 전문화된 요소 또는 모티프, 예컨대, 분비 신호 펩티드 또는 이종 기능성 도메인을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 작동가능한 연결은 유전자 생성물, 예를 들면, 폴리펩티드에 대한 암호화 영역이 조절 서열의 영향 또는 조절하에 유전자 생성물이 발현되게 하는 방식으로 하나 이상의 조절 서열과 연결되어 있는 경우이다. 2개의 DNA 단편(예컨대, 폴리펩티드 암호화 영역 및 이와 연결된 프로모터)은 프로모터 기능의 유도가 원하는 유전자 생성물을 암호화하는 mRNA의 전사를 야기하는 경우 및 상기 2개의 DNA 단편 사이의 연결의 성질이 유전자 생성물의 발현을 지시하는 발현 조절 서열의 능력을 방해하지 않거나 전사되는 DNA 주형의 능력을 방해하지 않는 경우 "작동가능하게 연결"되어 있다. 따라서, 프로모터 영역은 이 프로모터가 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 전사에 영향을 미칠 수 있는 경우 상기 핵산과 작동가능하게 연결되어 있을 것이다. 프로모터는 예정된 세포에서만 DNA의 실질적인 전사를 지시하는 세포 특이적 프로모터일 수 있다. 프로모터 이외의 다른 전사 조절 요소, 예를 들면, 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호는 세포 특이적 전사를 지시하도록 폴리뉴클레오티드와 작동가능하게 연결될 수 있다. 적합한 프로모터 및 다른 전사 조절 영역은 본원에 개시되어 있다. 다양한 전사 조절 영역이 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 척추동물 세포에서 기능하는 전사 조절 영역, 예컨대, 사이토메갈로바이러스(예를 들면, 인트론-A와 함께 즉시 초기 프로모터), 원숭이 바이러스 40(예를 들면, 초기 프로모터) 및 레트로바이러스(예를 들면, 라우스 육종 바이러스)의 프로모터 및 인핸서 분절(그러나, 이들로 한정되지 않음)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 다른 전사 조절 영역은 척추동물 유전자, 예컨대, 액틴, 열 충격 단백질, 소 성장 호르몬 및 토끼 α-글로빈으로부터 유래된 전사 조절 영역뿐만 아니라, 진핵 세포에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 다른 서열도 포함한다. 추가의 적합한 전사 조절 영역은 조직 특이적 프로모터 및 인핸서뿐만 아니라 유도성 프로모터(예를 들면, 테트라사이클린 유도성 프로모터)도 포함한다. 유사하게, 다양한 번역 조절 요소들이 당업자에게 공지되어 있다. 이들은 리보좀 결합 부위, 번역 개시 및 종결 코돈, 및 바이러스 시스템으로부터 유래된 요소(특히, CITE 서열로도 지칭되는 내부 리보좀 도입 부위 또는 IRES)를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 발현 카세트는 다른 특징, 예컨대, 복제기점 및/또는 염색체 삽입 요소, 예컨대, 레트로바이러스 긴 말단 반복부(LTR), 또는 아데노 관련 바이러스(AAV) 도립 말단 반복부(ITR)도 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 핵산 암호화 영역은 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 분비 또는 신호 펩티드를 암호화하는 추가의 암호화 서열과 연결될 수 있다. 예를 들면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 분비를 원하는 경우, 신호 서열을 암호화하는 DNA를 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 암호화하는 핵산의 상류에 배치할 수 있다. 신호 가설에 따르면, 포유동물 세포에 의해 분비된 단백질은 일단 성장하는 단백질 쇄가 조면 소포체(rough endoplasmic reticulum)를 횡단하여 이출되기 시작하면 성숙 단백질로부터 절단되는 신호 펩티드 또는 분비 리더 서열을 갖는다. 당업자는 척추동물 세포에 의해 분비된 폴리펩티드가 일반적으로 이 폴리펩티드의 N-말단에 융합된 신호 펩티드를 갖고, 상기 신호 펩티드는 상기 폴리펩티드의 분비된 또는 "성숙" 형태를 생성하기 위해 번역된 폴리펩티드로부터 절단된다는 것을 인식하고 있다. 일부 실시양태에서, 천연 신호 펩티드, 예를 들면, 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 신호 펩티드, 또는 그 자신과 작동가능하게 연결된 폴리펩티드의 분비를 지시하는 능력을 보유하는 상기 서열의 기능성 유도체가 사용된다. 대안적으로, 이종 포유동물 신호 펩티드 또는 이의 기능성 유도체가 사용될 수 있다. 예를 들면, 야생형 리더 서열은 인간 조직 플라스미노겐 활성화제(TPA) 또는 마우스 β-글루쿠로니다제의 리더 서열로 치환될 수 있다.
추가의 정제를 용이하게 하기 위해 또는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 표지하는 것을 보조하기 위해 사용될 수 있는 짧은 단백질 서열(예를 들면, 히스티딘 태그)을 암호화하는 DNA가 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(단편) 암호화 폴리뉴클레오티드의 내부 또는 말단에 포함될 수 있다.
추가의 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 하나 이상의 벡터를 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 폴리뉴클레오티드 및 벡터 각각과 관련하여 본원에 기재된 특징 중 임의의 특징을 단독으로 또는 조합으로 포함할 수 있다. 이러한 하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(의 일부)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다(예를 들면, 이러한 벡터로 형질전환되어 있거나 형질감염되어 있다). 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 단편을 발생시키기 위해 조작될 수 있는 임의의 종류의 세포 시스템을 지칭한다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현을 복제하고 뒷받침하기에 적합한 숙주 세포는 당해 분야에서 공지되어 있다. 이러한 세포를 적절한 경우 특정 발현 벡터로 형질감염시킬 수 있거나 형질도입할 수 있고, 임상 적용에 충분한 양의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하기 위해 다량의 벡터 함유 세포를 대규모 발효기 시딩용으로 성장시킬 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵 미생물, 예컨대, 에스케리키아 콜라이 또는 다양한 진핵 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소 세포(CHO), 곤충 세포 등을 포함한다. 예를 들면, 특히 글리코실화가 필요하지 않은 경우 폴리펩티드를 세균에서 제조할 수 있다. 발현 후, 상기 폴리펩티드를 가용성 분획으로 세균 세포 페이스트로부터 단리할 수 있고 더 정제할 수 있다. 원핵생물 이외에, 진핵 미생물, 예컨대, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 있어 부분적으로 또는 전체적으로 인간 글리코실화 패턴을 갖는 폴리펩티드의 생성을 야기하는 진균 및 효모 균주를 포함하는 사상 진균 또는 효모가 폴리펩티드 암호화 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌[Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)] 및 [Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)]을 참조한다. (글리코실화된) 폴리펩티드의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터도 유래된다. 무척추동물 세포의 예에는 식물 세포 및 곤충 세포가 포함된다. 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 곤충 세포와 함께 사용될 수 있는 다수의 바큘로바이러스 균주가 동정되어 있다. 식물 세포 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, (형질전환 식물에서 항체를 제조하기 위한 플랜티바디스(PL항체: 상표) 기술을 기술하는) US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429를 참조한다. 척추동물 세포도 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액 중에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주(COS-7), 인간 배아 신장 세포주(예를 들면, 문헌[Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기재된 293 또는 293T 세포), 새끼 햄스터 신장 세포(BHK), 마우스 세르톨리 세포(예를 들면, 문헌[Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기재된 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 자궁경부암종 세포(HELA), 개 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유선 종양 세포(MMT 060562), TRI 세포(예를 들면, 문헌[Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기재됨), MRC 5 세포 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 dhfr- CHO 세포(문헌[Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)])를 포함하는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포; 및 골수종 세포주, 예컨대, YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0를 포함한다. 단백질 제조에 적합한 일부 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해서는 예를 들면, 문헌[Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다. 숙주 세포는 배양된 세포, 예를 들면, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 세균 세포 및 식물 세포뿐만 아니라, 형질전환 동물, 형질전환 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직 내에 포함된 세포도 포함한다. 하나의 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 세포 또는 림프계 세포(예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
이들 시스템에서 외래 유전자를 발현하기 위한 표준 기술은 당해 분야에서 공지되어 있다. 항원 결합 도메인, 예컨대, 항체의 중쇄 또는 경쇄를 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 세포는 나머지 항체 쇄도 발현하여 발현된 생성물이 중쇄 및 경쇄 둘 다를 갖는 항체이도록 조작될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본원에서 제공된 바와 같은 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계, 및 상기 숙주 세포(또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법이 제공된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 구성성분은 서로 유전적으로 융합되어 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 그의 구성성분이 직접적으로 또는 연결기 서열을 통해 간접적으로 서로 융합되도록 설계될 수 있다. 상기 연결기의 조성 및 길이는 당해 분야에서 주지된 방법에 따라 결정될 수 있고 효능에 대해 시험될 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 상이한 성분 사이의 연결기 서열의 예는 본원에 제공된 서열에서 발견된다. 필요에 따라, 융합체의 개별 구성성분을 분리하기 위한 절단 부위, 예를 들면, 엔도펩티다제 인식 서열을 도입하도록 추가의 서열도 포함될 수 있다.
특정 실시양태에서, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 하나 이상의 Fab 분자는 항원성 결정인자에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 가변 도메인을 포함한다. 가변 도메인은 천연 또는 비천연 항체 또는 이의 단편의 일부를 형성할 수 있고 이러한 천연 또는 비천연 항체 또는 이의 단편으로부터 유래될 수 있다. 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에서 공지되어 있다(예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, "Antibody, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988] 참조). 비천연 항체는 고체상 펩티드 합성의 사용을 통해 구축될 수 있거나, (예를 들면, US 4,186,567에 기재된 바와 같이) 재조합적으로 제조될 수 있거나, 예를 들면, 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 포함하는 조합 라이브러리의 스크리닝에 의해 수득될 수 있다(예를 들면, US 5,969,108 (McCafferty) 참조).
임의의 동물 종의 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인이 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 사용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 비한정적 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인은 뮤린, 영장류 또는 인간으로부터 유래될 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 인간에 사용되기 위한 것인 경우, 키메라 형태의 항체가 사용될 수 있고, 이때 항체의 불변 도메인은 인간으로부터 유래된다. 인간화된 또는 전체 인간 형태의 항체도 당해 분야에서 주지된 방법에 따라 제조될 수 있다(예를 들면, US 5,565,332 (Winter) 참조). 인간화는 (a) 중요한 골격 잔기(예를 들면, 우수한 항원 결합 친화성 또는 항체 기능을 보유하는 데에 있어서 중요한 골격 잔기)를 보유하거나 보유하지 않으면서 비인간(예를 들면, 공여자 항체) CDR을 인간(예를 들면, 수용자 항체) 골격 및 불변 도메인에 그래프팅하는 방법, (b) 비인간 특이적 결정 영역(SDR 또는 a-CDR: 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)을 인간 골격 및 불변 도메인에 그래프팅하는 방법, 또는 (c) 전체 비인간 가변 도메인을 이식하되, 표면 잔기의 치환을 통해 이들을 인간 유사 구획으로 "은폐"시키는 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 인간화된 항체 및 이를 제조하는 방법은 예를 들면, 문헌[Almagro and Fransson, Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)]에서 검토되어 있고, 예를 들면, 하기 문헌에 더 기재되어 있다: 문헌[Riechmann et al., Nature 332, 323-329 (1988)]; [Queen et al., Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; US 5,821,337, US 7,527,791, US 6,982,321 및 US 7,087,409; 문헌[Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986)]; 문헌[Morrison et al., Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)]; [Morrison and Oi, Adv Immunol 44, 65-92 (1988)]; [Verhoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)]; [Padlan, Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)]; [Kashmiri et al., Methods 36, 25-34 (2005)](SDR(a-CDR) 그래프팅이 기재됨); [Padlan, Mol Immunol 28, 489-498 (1991)]("재표면화"가 기재됨); [Dall'Acqua et al., Methods 36, 43-60 (2005)]("FR 셔플링"이 기재됨); 및 [Osbourn et al., Methods 36, 61-68(2005) and Klimka et al., Br J Cancer 83, 252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "유도 선택" 방법이 기재됨). 당해 분야에서 공지된 다양한 기법을 사용하여 인간 항체 및 인간 가변 도메인을 제조할 수 있다. 인간 항체는 문헌[van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)] 및 [Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)]에 일반적으로 기재되어 있다. 인간 가변 도메인은 하이브리도마 방법에 의해 제조된 인간 단일클론 항체의 일부를 형성할 수 있고 이러한 인간 단일클론 항체로부터 유래될 수 있다(예를 들면, 문헌[Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 참조). 또한, 인간 항체 및 인간 가변 도메인은 항원 챌린지에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 도메인을 갖는 온전한 항체를 생성하도록 변형된 형질전환 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌[Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)] 참조). 또한, 인간 항체 및 인간 가변 도메인은 인간으로부터 유래된 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로써 발생할 수 있다(예를 들면, 문헌[Hoogenboom et al., in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)], [McCafferty et al., Nature 348, 552-554] 및 [Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)] 참조). 파지는 전형적으로 단일 쇄 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다.
특정 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 Fab 분자는 예를 들면, 전체 내용이 본원에 참조로 도입되는 US 2004/0132066에 개시된 방법에 따라 향상된 결합 친화성을 갖도록 조작된다. 특정 항원성 결정인자에 결합하는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 능력은 효소-연결된 면역흡착 분석(ELISA) 또는 당업자에게 공지된 다른 기법, 예를 들면, (비아코어 T100 시스템 상에서 분석되는) 표면 플라스몬 공명 기법(문헌[Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)]) 및 전통적인 결합 분석(문헌[Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)])를 통해 측정될 수 있다. 경쟁 분석을 사용하여 특정 항원에 대한 결합에 대해 기준 항체와 경쟁하는 항체, 항체 단편, 항원 결합 도메인 또는 가변 도메인, 예를 들면, CD3에 대한 결합에 대해 V9 항체와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 기준 항체에 의해 결합되는 에피토프와 동일한 에피토프(예를 들면, 선형 또는 입체구조형 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑하는 상세한 예시적 방법은 문헌[Morris., "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (1996) (Humana Press, Totowa, NJ)]에 제공되어 있다. 예시적 경쟁 분석에서, 고정된 항원(예를 들면, CD3)은 이 항원에 결합하는 표지된 제1 항체(예를 들면, US 6,054,297에 기재된 V9 항체) 및 상기 항원에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력을 시험받는 비표지된 제2 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 항원은 표지된 제1 항체를 포함하되 비표지된 제2 항체를 포함하지 않는 용액에서 항온처리된다. 제1 항체와 항원의 결합을 허용하는 조건하에 항온처리된 후, 과량의 비결합된 항체가 제거되고, 고정된 항원과 연결된 표지의 양이 측정된다. 고정된 항원과 연결된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 상대적으로 시험 샘플에서 실질적으로 감소되는 경우, 이것은 제2 항체가 상기 항원에 대한 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 표시한다. 문헌[Harlow and Lane (1988) Antibody: A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 당해 분야에서 공지된 기법, 예컨대, 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질의 정제에 사용되는 실제 조건은 부분적으로 순 전하, 소수성, 친수성 등과 같은 인자에 의해 좌우될 것이고 당업자에게 자명할 것이다. 친화성 크로마토그래피 정제의 경우, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 결합하는 항체, 리간드, 수용체 또는 항원이 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 친화성 크로마토그래피 정제를 위해, 단백질 A 또는 단백질 G를 갖는 매트릭스가 사용될 수 있다. 실시예에 기재된 바와 같이 근본적으로 순차적 단백질 A 또는 G 친화성 크로마토그래피 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 단리할 수 있다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 순도는 겔 전기영동, 고압 액체 크로마토그래피 등을 포함하는 주지된 다양한 분석 방법 중 임의의 분석 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같이 발현된 중쇄 융합 단백질은 환원 SDS-PAGE에 의해 입증된 바와 같이 온전하고 적절하게 조립되어 있는 것으로 밝혀졌다(예를 들면, 도 4 참조). 3개의 밴드가 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 경쇄, 중쇄 및 중쇄/경쇄 융합 단백질의 예측된 분자량에 상응하는 약 Mr 25,000, Mr 50,000 및 Mr 75,000에서 분석되었다.
분석
본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 당해 분야에서 공지된 다양한 분석에 의해 그들의 물리적/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인될 수 있거나, 스크리닝될 수 있거나 특징규명될 수 있다.
친화성 분석
Fc 수용체 또는 표적 항원에 대한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 친화성은 표준 기기, 예컨대, 비아코어 기기(지이 헬쓰케어)를 사용한 표면 플라스몬 공명(SPR)에 의해 실시예에 기재된 방법에 따라 결정될 수 있고, 수용체 또는 표적 단백질은 예컨대, 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 대안적으로, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 상이한 수용체 또는 표적 항원의 결합은 특정 수용체 또는 표적 항원을 발현하는 세포주를 사용함으로써 예를 들면, 유세포계수(FACS)에 의해 평가될 수 있다. 결합 친화성을 측정하는 구체적인 예증적 및 예시적 실시양태는 하기 설명 및 하기 실시예에 기재되어 있다.
하나의 실시양태에 따라, 25℃에서 비아코어(등록상표) T100 기기(지이 헬쓰케어)를 사용하여 표면 플라스몬 공명으로 KD를 측정한다.
Fc 부분과 Fc 수용체 사이의 상호작용을 분석하기 위해, His 태그가 부착된 재조합 Fc 수용체를 CM5 칩 상에 고정된 항-펜타 His 항체(퀴아젠(Qiagen))로 포획하고, 이중특이적 구축물을 분석물로서 사용한다. 요약하건대, 카복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩(CM5, 지이 헬쓰케어)을 공급자의 설명서에 따라 N-에틸-N'-(3-다이메틸아미노프로필)-카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 및 N-하이드록시석신이미드(NHS)로 활성화시킨다. 약 6,500 반응 유닛(RU)의 커플링된 단백질을 달성하기 위해 5 ㎕/분의 유속으로 주입하기 전에 항-펜타 His 항체를 10 mM 나트륨 아세테이트(pH 5.0)로 40 ㎍/㎖까지 희석한다. 리간드의 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응된 기를 차단한다. 그 후, Fc 수용체를 4 또는 10 nM에서 60초 동안 포획한다. 동역학적 측정을 위해, HBS-EP(지이 헬쓰케어, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 계면활성제 P20, pH 7.4) 중의 이중특이적 구축물의 4배 연속 희석물(500 내지 4000 nM의 범위)을 25℃에서 30 ㎕/분의 유속으로 120초 동안 주입한다.
표적 항원에 대한 친화성을 결정하기 위해, 이중특이적 구축물을 항-펜타 His 항체에 대해 기재된 바와 같이 활성화된 CM5-센서 칩 표면 상에 고정된 항-인간 Fab 특이적 항체(지이 헬쓰케어)로 포획한다. 커플링된 단백질의 최종 양은 약 12000 RU이다. 이중특이적 구축물을 300 nM에서 90초 동안 포획한다. 표적 항원을 250 내지 1000 nM의 농도 범위에서 30 ㎕/의 유속으로 180초 동안 유동 셀에 통과시킨다. 해리를 180초 동안 모니터링한다.
기준 유동 셀에 대해 수득된 반응을 차감함으로써 벌크 굴절률 차이를 보정한다. 정상 상태 반응을 사용하여 랭뮤어(Langmuir) 결합 등온선의 비선형 곡선 피팅으로 해리 상수 KD를 유도하였다. 결합 센서그램 및 해리 센서그램을 동시에 피팅함으로써 단순 1-대-1 랭뮤어 결합 모델(비아코어(등록상표) T100 평가 소프트웨어 버전 1.1.1)을 사용하여 결합 속도(kon) 및 해리 속도(koff)를 계산한다. 평형 해리 상수(KD)를 비 koff/kon로서 계산한다. 예를 들면, 문헌[Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881(1999)]을 참조한다.
활성 분석
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 생물학적 활성은 실시예에 기재된 바와 같이 다양한 분석에 의해 측정될 수 있다. 생물학적 활성은 예를 들면, T 세포의 증식의 유도, T 세포에서의 신호전달의 유도, T 세포에서의 활성화 마커 발현의 유도, T 세포에 의한 사이토카인 분비의 유도, 표적 세포, 예컨대, 종양 세포의 용해의 유도, 및 종양 퇴행의 유도 및/또는 생존의 개선을 포함할 수 있다.
조성물, 제형 및 투여 경로
추가의 양상에서, 본 발명은 예를 들면, 하기 치료 방법 중 임의의 치료 방법에서 사용되는, 본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 약학 조성물은 예를 들면, 후술된 바와 같이 본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
또한, 생체내 투여에 적합한 형태로 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제조하는 방법으로서, (a) 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 수득하는 단계, 및 (b) 상기 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체로 제형화함으로써 생체내 투여를 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제제를 제형화하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체에 용해되거나 분산된 치료 효과량의 하나 이상의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. 어구 "약학적 또는 약학적으로 허용되는"은 사용된 용량 및 농도에서 수용체에게 일반적으로 독성을 나타내지 않는, 즉 적절한 경우 동물, 예컨대, 인간에게 투여되었을 때 불리한, 알레르기 또는 다른 원치 않는 반응을 발생시키지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다. 하나 이상의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 임의적으로 추가의 활성 성분을 함유하는 약학 조성물의 제조는 본원에 참조로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990]에 의해 예시된 바와 같이 본 개시내용에 비추어 볼 때 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 더욱이, 동물(예를 들면, 인간) 투여의 경우, 제제는 FDA 생물학적 표준 관청 또는 다른 국가의 상응하는 정부기관에 의해 요구되는 멸균성, 발열원성, 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다는 것을 이해할 것이다. 바람직한 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액이다. 본원에서 사용된 "약학적으로 허용되는 담체"는 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이(예를 들면, 본원에 참조로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329] 참조) 임의의 모든 용매, 완충제, 분산 매질, 코팅제, 계면활성제, 항산화제, 방부제(예를 들면, 항균제, 항진균제), 등장제, 흡수 지연제, 염, 단백질, 약물, 약물 안정화제, 중합체, 겔, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 풍미제, 안료, 이와 유사한 물질 및 이들의 조합물을 포함한다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 상용불가능한 경우를 제외하고, 치료 또는 약학 조성물에서의 상기 담체의 사용이 고려된다.
조성물은 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여될지, 및 주사로서 이러한 투여 경로를 위해 멸균될 필요가 있는 지에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자(및 임의의 추가의 치료제)는 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이(예를 들면, 본원에 참조로 도입되는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990] 참조) 흡입(예를 들면, 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입, 직접적으로, 카테터를 통해 또는 세척을 통해 표적 세포를 세척하는 국소화된 관류, 크림, 지질 조성물(예를 들면, 리포좀) 또는 다른 방법, 또는 상기 방법의 임의의 조합에 의해 정맥내, 피내, 동맥내, 복강내, 병변내, 두개내, 관절내, 전립선내, 비장내, 신장내, 흉막내, 경막내, 비내, 유리체내, 질내, 직장내, 종양내, 근육내, 피하, 결막하, 소포내, 점막, 심장주위내, 배꼽내, 안구내, 경구, 국부 또는 국소 투여될 수 있다. 비경구 투여, 특히 정맥내 주사가 폴리펩티드 분자, 예컨대, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 투여하기 위해 가장 통상적으로 사용된다.
비경구 조성물은 주사, 예를 들면, 피하, 피내, 병변내, 정맥내, 동맥내, 근육내, 경막내 또는 복강내 주사에 의한 투여용으로 설계된 비경구 조성물을 포함한다. 주사의 경우, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 수용액, 바람직하게는 생리학적으로 상용가능한 완충제, 예컨대, 행크(Hank) 용액, 링거(Ringer) 용액 또는 생리학적 식염수 완충제에서 제형화될 수 있다. 용액은 제형화제, 예컨대, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들면, 발열원 무함유 멸균수로 재구성될 분말 형태로 존재할 수 있다. 멸균 주사 용액은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 요구된 양으로 필요에 따라 하기 나열된 다양한 다른 성분들과 함께 적절한 용매 내로 도입함으로써 제조된다. 멸균성은 예를 들면, 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균된 활성 성분들을 염기성 분산 매질 및/또는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 도입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액, 현탁액 또는 유화액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 및 임의의 추가의 원하는 성분으로 구성된 분말을 이의 미리 멸균-여과된 액체 매질로부터 생성하는 진공 건조 또는 동결 건조 기법이다. 상기 액체 매질은 필요한 경우 적절하게 완충되어야 하고, 액체 희석제는 먼저 주사 전에 충분한 식염수 또는 당에 의해 등장성을 갖게 되어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하고 미생물, 예컨대, 세균 및 진균의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 내독소 오염은 안전한 수준, 예를 들면, 단백질 1 mg 당 0.5 ng 미만에서 최소한으로 유지되어야 한다는 것을 인식할 것이다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체는 하기 담체를 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예컨대, 옥타데실다이메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대, 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량(약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 모노사카라이드, 다이사카라이드 및 다른 탄수화물; 킬레이팅제, 예컨대, EDTA; 당, 예컨대, 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 금속 착물(예를 들면, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜(PEG). 수성 주사 현탁액은 이 현탁액의 점도를 증가시키는 화합물, 예컨대, 나트륨 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 덱스트란 등을 함유할 수 있다. 임의적으로, 상기 현탁액은 적합한 안정화제, 또는 화합물의 가용성을 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 물질도 함유할 수 있다. 추가로, 활성 화합물의 현탁액은 적절한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 지방유, 예컨대, 참깨유, 또는 합성 지방산 에스터, 예컨대, 에틸 클레에이트 또는 트라이글리세라이드, 또는 리포좀을 포함한다.
활성 성분은 예를 들면, 코아세르베이션 기법 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 중의 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 기법은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed. Mack Printing Company, 1990)]에 개시되어 있다. 지속 방출 제제가 제조될 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예에는 폴리펩티드를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 상기 매트릭스는 성형된 제품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태로 존재한다. 특정 실시양태에서, 흡수를 지연하는 물질, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트, 젤라틴 또는 이들의 조합물을 조성물에서 사용함으로써 주사가능한 조성물의 연장된 흡수를 달성할 수 있다.
전술된 조성물 이외에, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 데포 제제로서 제형화될 수도 있다. 이러한 장기 작용 제형은(예를 들면, 피하 또는 근육내) 이식 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들면, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 적합한 중합체성 또는 소수성 물질(예를 들면, 허용되는 오일 중의 에멀젼으로서) 또는 이온 교환 수지로 제형화될 수 있거나, 약한 가용성을 나타내는 유도체, 예를 들면, 약한 가용성을 나타내는 염으로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학 조성물을 통상적인 혼합, 용해, 유화, 캡슐화, 포획 또는 동결건조 과정으로 제조할 수 있다. 단백질을 약학적으로 사용될 수 있는 제제로 프로세싱하는 것을 용이하게 하는 하나 이상의 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 보조제를 사용하여 통상적인 방식으로 약학 조성물을 제형화할 수 있다. 적절한 제형화는 선택된 투여 경로에 의해 좌우된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 자유 산 또는 염기, 중성 또는 염 형태로 조성물로 제형화할 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 자유 산 또는 염기의 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 염이다. 이들은 산 부가 염, 예를 들면, 단백질성 조성물의 자유 아미노 기에 의해 형성된 염, 또는 무기 산, 예컨대, 염산 또는 인산, 또는 유기산, 예컨대, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산에 의해 형성된 염을 포함한다. 자유 카복시 기에 의해 형성된 염도 무기 염기, 예컨대, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철; 또는 유기 염기, 예컨대, 이소프로필아민, 트라이메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인으로부터 유도될 수 있다. 약학적 염은 수성 및 다른 양성자성 용매에서 상응하는 자유 염기 형태보다 더 높은 가용성을 나타내는 경향을 갖는다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 중 임의의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 치료 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 예를 들면, 암의 치료에서 면역치료제로서 사용될 수 있다.
치료 방법에서 사용하기 위해, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 우수한 의학적 관행과 일치하는 방식으로 제형화되고 복용되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료될 구체적인 장애, 치료될 구체적인 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 상기 장애의 원인, 약제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의사에게 공지된 다른 인자를 포함한다.
하나의 양상에서, 약제로서 사용되는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 추가의 양상에서, 질환의 치료에 사용되는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에서 사용되는 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 하나의 실시양태에서, 본 발명은 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료에 사용되는 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 치료 효과량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에서 사용되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 치료되는 질환이 암인 경우 치료 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 항암제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 데에 사용되는, 본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 효과량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 개체에게 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 상기 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.
추가의 양상에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도를 제공한다. 하나의 실시양태에서, 약제는 질환의 치료를 필요로 하는 개체에서 질환의 치료를 위한 약제이다. 추가의 실시양태에서, 약제는 치료 효과량의 약제를 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법에서 사용되는 약제이다. 특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 치료되는 질환이 암인 경우 치료 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 항암제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 실시양태에서, 약제는 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하기 위한 약제이다. 추가의 실시양태에서, 약제는 효과량의 약제를 개체에게 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함하는, 상기 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법에서 사용되는 약제이다. 상기 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 치료 효과량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 이러한 질환을 갖는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 약학적으로 허용되는 형태로 포함하는 조성물을 상기 개체에게 투여한다. 특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애이다. 특정 실시양태에서, 상기 질환은 암이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 치료되는 질환이 암인 경우 치료 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들면, 항암제를 상기 개체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 실시양태 중 임의의 실시양태에 따른 "개체"는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본 발명은 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 T 세포, 특히 세포독성 T 세포의 존재 하에 표적 세포를 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다. 추가의 양상에서, 개체에서 표적 세포, 특히 종양 세포의 용해를 유도하는 방법이 제공된다. 이러한 하나의 실시양태에서, 상기 방법은 효과량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 개체에게 투여하여 표적 세포의 용해를 유도하는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, "개체"는 인간이다.
특정 실시양태에서, 치료되는 질환은 증식 장애, 특히 암이다. 암의 비한정적 예에는 방광암, 뇌암, 두경부암, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 식도암, 결장암, 결장직장암, 직장암, 위암, 전립선암, 혈액암, 피부암, 편평세포암종, 골암 및 신장암이 포함된다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 사용하여 치료할 수 있는 다른 세포 증식 장애는 복부, 골, 유방, 소화 시스템, 간, 췌장, 복막, 내분비선(부신, 부갑상선, 뇌하수체, 정소, 난소, 흉선, 갑상선), 눈, 두경부, 신경계(중추 및 말초), 림프계, 골반, 피부, 연조직, 비장, 흉부 영역 및 비뇨생식계에 위치하는 신생물을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 전구암성 병태 또는 병변, 및 암 전이도 포함된다. 특정 실시양태에서, 암은 신장세포암, 피부암, 폐암, 결장직장암, 유방암, 뇌암 및 두경부암, 위암, 췌장암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에서, 암은 고형 종양이다. 당업자는 많은 경우에서 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 치유를 제공할 수 없지만 부분적인 이익만을 제공할 수 있다는 것을 용이하게 인식한다. 일부 실시양태에서, 일부 이익을 갖는 생리학적 변화도 치료적으로 유리한 것으로 간주된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 생리학적 변화를 제공하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 양은 "효과량" 또는 "치료 효과량"으로서 간주된다. 치료를 필요로 하는 대상체, 환자 또는 개체는 전형적으로 포유동물, 보다 구체적으로 인간이다.
일부 실시양태에서, 효과량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 세포에게 투여된다. 또 다른 실시양태에서, 치료 효과량의 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 질환의 치료를 위해 개체에게 투여된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, (단독으로 사용되거나 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 함께 사용될 때) 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 적절한 용량은 치료되는 질환의 유형, 투여 경로, 환자의 체중, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 유형, 질환의 중증도 및 경과, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 예방 목적으로 투여되는 지 아니면 치료 목적으로 투여되는 지, 선행 또는 병행 치료 시술, 환자의 임상 병력 및 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의해 좌우될 것이다. 투여를 담당하는 의사는 어떠한 경우에서든 개별 대상체를 위한 조성물 중의 활성 성분의 농도 및 적절한 용량을 결정할 것이다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다회 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 고려된다.
T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적절하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg(예를 들면, 0.1 내지 10 mg/kg)의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 예를 들면, 1회 이상의 분리 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해 환자에게 투여될 초기 후보 용량일 수 있다. 한 전형적인 1일 용량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 이상일 것이다. 수일 또는 이보다 오랜 시간에 걸친 반복된 투여의 경우, 병태에 따라 치료는 일반적으로 질환 증상의 원하는 억제가 일어날 때까지 지속될 것이다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 한 예시적 용량은 약 0.005 내지 약 10 mg/kg의 범위 내에 있을 것이다. 다른 비한정적 예에서, 용량은 투여 당 약 1 ㎍/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중, 약 10 ㎍/kg 체중, 약 50 ㎍/kg 체중, 약 100 ㎍/kg 체중, 약 200 ㎍/kg 체중, 약 350 ㎍/kg 체중, 약 500 ㎍/kg 체중, 약 1 mg/kg 체중, 약 5 mg/kg 체중, 약 10 mg/kg 체중, 약 50 mg/kg 체중, 약 100 mg/kg 체중, 약 200 mg/kg 체중, 약 350 mg/kg 체중 또는 약 500 내지 약 1000 mg/kg 체중 또는 그 이상, 및 상기 범위 내에서 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에서 나열된 수치로부터 유도될 수 있는 범위의 비한정적 예에서, 상기 기재된 수치에 근거하여 약 5 내지 약 100 mg/kg 체중, 약 5 ㎍/kg 체중 내지 약 500 mg/kg 체중의 범위 등이 투여될 수 있다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 5.0 mg/kg 또는 10 mg/kg(또는 이들의 임의의 조합)의 1회 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은(예를 들면, 환자가 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공받도록) 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다. 초기 보다 높은 적재 용량에 이어서 1회 이상의 보다 낮은 용량이 투여될 수 있다. 그러나, 다른 투약 요법이 유용할 수 있다. 이 치료의 진행은 통상적인 기법 및 분석에 의해 용이하게 모니터링된다.
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 사용될 것이다. 질환 상태를 치료하거나 예방하기 위해 사용되는 경우, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 약학 조성물은 치료 효과량으로 투여되거나 적용된다. 치료 효과량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 개시내용에 비추어 볼 때 당업자의 능력 내에 있다.
전신 투여의 경우, 치료 효과 용량을 먼저 시험관내 분석, 예컨대, 세포 배양 분석로부터 추정할 수 있다. 그 다음, 용량을 동물 모델에서 공식화하여 세포 배양에서 결정된 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
당해 분야에서 주지된 기법을 사용하여 생체내 데이터, 예를 들면, 동물 모델로부터 초기 용량을 추정할 수도 있다. 당업자는 동물 데이터에 근거하여 인간에게의 투여를 용이하게 최적화할 수 있다.
치료 효과를 유지하기에 충분한 혈장 수준의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 제공하기 위해 투약 용량 및 간격을 개별적으로 조절할 수 있다. 주사에 의한 투여를 위한 일반적인 환자 용량은 약 0.1 내지 50 mg/kg/일, 전형적으로 약 0.5 내지 1 mg/kg/일이다. 매일 다회 용량을 투여함으로써 치료 유효 혈장 수준을 달성할 수 있다. 혈장 중의 수준은 예를 들면, HPLC에 의해 측정될 수 있다.
국소 투여 또는 선택 흡수의 경우, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있다. 당업자는 과도한 실험없이 치료 유효 국소 용량을 최적화할 수 있을 것이다.
본원에 기재된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 치료 효과 용량은 일반적으로 실질적인 독성을 야기하지 않으면서 치료 이익을 제공할 것이다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 독성 및 치료 효과는 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약학 절차에 의해 결정될 수 있다. 세포 배양 분석 및 동물 연구를 사용하여 LD50(집단의 50%에게 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 효과적인 용량)을 결정할 수 있다. 독성과 치료 효과 사이의 용량 비는 비 LD50/ED50로서 표현될 수 있는 치료 지수이다. 큰 치료 지수를 나타내는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자가 바람직하다. 하나의 실시양태에서, 본 발명에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 높은 치료 지수를 나타낸다. 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에서 사용되기에 적합한 용량 범위를 공식화하는 데에 사용될 수 있다. 상기 용량은 바람직하게는 거의 또는 전혀 독성을 나타내지 않으면서 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 상기 용량은 다양한 인자, 예를 들면, 사용되는 투약 제형, 사용되는 투여 경로, 대상체의 상태 등에 따라 이 범위 내에서 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 용량은 환자의 상태를 고려하여 개별 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들면, 전체적으로 본원에 참조로 도입되는 문헌[Fingl et al., 1975, The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1] 참조).
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로 치료된 환자의 주치의는 독성, 장기 기능장애 등으로 인해 투여를 종결하거나, 중단하거나 조절하는 방법 및 시기를 알 것이다. 대조적으로, 주치의는 임상 반응이 적절하지 않은 경우(방해 독성) 치료를 보다 높은 수준까지 조절하는 것도 알 것이다. 관심 있는 장애의 관리에 있어서 투여되는 용량의 크기는 치료되는 병태의 중증도, 투여 경로 등에 따라 달라질 것이다. 상기 병태의 중증도는 예를 들면, 부분적으로 표준 예후 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 추가로, 용량 및 아마도 용량 빈도도 개별 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다.
다른 제제 및 치료
본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 치료에서 하나 이상의 다른 제제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 하나 이상의 추가의 치료제와 공투여될 수 있다. 용어 "치료제"는 이러한 치료를 필요로 하는 개체에서 증상 또는 질환을 치료하기 위해 투여되는 임의의 제제를 포괄한다. 이러한 추가의 치료제는 치료되는 구체적인 증상에 적합한 임의의 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적인 활성을 갖는 임의의 활성 성분을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 면역조절제, 세포증식정지제, 세포 부착의 억제제, 세포독성제, 세포 세포자멸의 활성화제, 또는 세포자멸 유도제에 대한 세포의 민감성을 증가시키는 제제이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 항암제, 예를 들면, 마이크로튜불 파괴제, 항대사물질, 토포이소머라제(topoisomerase) 억제제, DNA 인터칼레이터, 알킬화제, 호르몬 치료, 키나제(kinase) 억제제, 수용체 길항제, 종양 세포 세포자멸의 활성화제 또는 항혈관신생제이다.
이러한 다른 제제는 적절하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 함께 존재한다. 이러한 다른 약제의 효과량은 사용되는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 의해 좌우된다. T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 일반적으로 본원에 기재된 용량 및 투여 경로와 동일한 용량 및 투여 경로로 사용되거나, 본원에 기재된 용량의 1 내지 99%의 용량으로 사용되거나, 적절한 용량 및 경로로서 실험적으로/임상적으로 결정된 임의의 용량 및 임의의 경로로 사용된다.
상기 언급된 이러한 병용 치료는 병용 투여(2종 이상의 치료제가 동일한 또는 분리된 조성물에 포함되는 경우), 및 분리 투여를 포괄하고, 어느 경우에서든 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 투여는 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 전에, 동시에 및/또는 후에 일어날 수 있다. 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자는 방사선치료와 함께 사용될 수도 있다.
제품의 제조
본 발명의 또 다른 양태에서, 전술된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 상기 제품은 용기; 및 용기 상에 존재하거나 용기와 연결되어 있는 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기는 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 상기 용기는 다양한 물질, 예컨대, 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 그 자체로 존재하거나 병태의 치료, 예방 및/또는 진단에 효과적인 또 다른 조성물과 조합되어 있는 조성물을 보유하고, 멸균 출입구를 가질 수 있다(예를 들면, 상기 용기는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물 중의 하나 이상의 활성 물질은 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자이다. 상기 표지 또는 포장 삽입물은 상기 조성물이 선택된 병태의 치료에 사용된다는 것을 표시한다. 나아가, 제품은 (a) 본 발명의 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 그 내부에 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 실시양태에서, 제품은 상기 조성물이 특정 병태의 치료에 사용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제품은 약학적으로 허용되는 완충제, 예컨대, 정균성 주사용수(BWFI), 포스페이트 완충 식염수, 링거 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2(또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제품은 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하는, 상업적 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적인 설명을 고려할 때, 다양한 또 다른 실시양태가 실시될 수 있음이 이해된다.
일반적인 방법
재조합 DNA 기법
문헌[Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 기재된 바와 같이 표준 방법을 사용하여 DNA를 조작하였다. 분자 생물학적 시약을 제조자의 설명서에 따라 사용하였다. 인간 면역글로불린 경쇄 및 중쇄의 뉴클레오티드 서열에 대한 일반적인 정보는 문헌[Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242]에 제공되어 있다.
DNA 서열분석
DNA 서열을 이중 가닥 서열분석으로 측정하였다.
유전자 합성
필요에 따라, 원하는 유전자 절편을 적절한 주형을 사용하여 PCR로 생성하거나 진아트 아게(Geneart AG, 독일 레겐스부르그 소재)에 의해 합성 올리고뉴클레오티드로부터 및 자동화된 유전자 합성에 의해 PCR 생성물로부터 합성하였다. 정확한 유전자 서열을 이용할 수 없는 경우, 올리고뉴클레오티드 프라이머를 가장 유사한 상동체의 서열에 기초하여 설계하고, 유전자를 적절한 조직으로부터 유래된 RNA로부터 RT-PCR로 단리하였다. 단일 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 절단 부위에 의해 플랭킹된 유전자 절편을 표준 클로닝/서열분석 벡터 내로 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 형질전환된 박테리아로부터 정제하고, UV 분광법으로 농도를 측정하였다. 서브클로닝된 유전자 단편의 DNA 서열을 DNA 서열분석으로 확인하였다. 각각의 발현 벡터 내로 서브클로닝을 허용하기 위해 적합한 제한 부위를 갖는 유전자 절편을 설계하였다. 모든 구축물이 진핵 세포에서 분비하는 단백질을 표적하는 리더 펩티드를 암호화하는 5'-말단 DNA 서열을 갖도록 설계하였다.
실시예 1: 세포에 대한 T84.66 IgG의 상이한 인간화된 변이체의 결합
뮤린 항체 T84.66의 신규한 인간화된 변이체(문헌[Wagener et al., J Immunol 130, 2308 (1983)], [Neumaier et al., J Immunol 135, 3604 (1985)])를, CDR을 인간 생식 세포 골격 수용체 서열 상에 그래프팅하여 발생시켰다.
본 실시예에서, T84.66 IgG의 상이한 인간화된 변이체의 결합을 CEA-발현 인간 위 선암 세포(MKN45, DSMZ ACC 409)에 대해 시험하였다.
간략히, 세포를 채취하고 계수하고 생존력에 대해 확인하고 2x106 세포/ml로 FACS 완충액(100 μl PBS 0.1% BSA)에 재현탁시켰다. 세포 현탁액(100 μl, 0.2x106 세포를 함유함)을 환저 96-웰 플레이트에서 30분 동안 4℃에서 CEA IgG의 농도를 증가시키면서(4 ng/ml - 60 μg/ml) 항온처리하고 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고 추가적 30분 동안 4℃에서 PE-접합된 어피니퓨어(AffiniPure) F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적 이차 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩(Jackson Immuno Research Lab) PE #109-116-170)와 함께 재항온처리하고, 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고 FACS CantoII(소프트웨어 FACS Diva)를 사용하여 FACS에 의해 즉시 분석하였다. 결합 곡선 및 EC50 값을 수득하고 그래프패드프리즘5를 사용하여 계산하였다(도 2, MKN45 세포에 대한 결합).
도 2는 MKN45 세포 상에 발현된 인간 CEA에 대한 T84.66 IgG의 선택된 인간화된 변이체의 상이한 결합 패턴을 나타낸다. 결합 패턴 및 계산된 EC50 결합 값(표 1)을 기반으로, 인간화된 변이체 1(서열번호 22 및 23)을 추가적 평가를 위해 선택하였다.
세포에 대한 T84.66 IgG의 상이한 인간화된 변이체의 결합(도 2에 나타낸 결합 곡선을 기반으로 그래프패드프리즘에 의해 계산된 EC50 값).
EC50 (㎍/ml)
모 키메릭 T84.66 0.99
인간화된 변이체 1 1.5
인간화된 변이체 2 8.6
인간화된 변이체 3 1.4
인간화된 변이체 4 3.1
인간화된 변이체 5 -
인간화된 변이체 6 -
실시예 2: 항- CEA /항-CD3 T 세포 이중특이적 ( TCB ) 분자의 제조
하기 분자를 본 실시예에서 제조하였다; 이의 개략도를 도 3에 나타냈다:
A. 전하 변형을 갖는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 모 뮤린 CEA 결합제 (T84.66))(도 3A, 서열번호 32-35)
B. 전하 변형을 갖는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 인간화된 CEA 결합제)(도 3B, 서열번호 34, 36-38)
C. 전하 변형을 갖는 "도립된 1+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 인간화된 CEA 결합제)(도 3C, 서열번호 34, 37-39)
D. 전하 변형을 갖는 "1+1 IgG 교차Mab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 인간화된 CEA 결합제)(도 3D, 서열번호 34, 36, 38, 40)
E. 전하 변형을 갖는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, CEA 결합제에서 전하 변형, 인간화된 CEA 결합제, 보다 긴 연결기)(도 3E, 서열번호 34, 36, 38, 41).
F. 전하 변형이 없는 "도립된 2+1 IgG 교차Fab"(CD3 결합제에서 VH/VL 교환, 인간화된 CEA 결합제)(도 3F, 서열번호 34, 50 내지 52).
CD3 및 CEA 결합제의 가변 중쇄 및 경쇄 영역을 암호화하는 DNA 서열을 각각의 수용자 포유동물 발현 벡터 내에 예비-삽입된 각각의 불변 영역을 갖는 프레임에 서브클로닝하였다. 단백질 발현을 MPSV 또는 CMV 프로모터에 의해 구동하였다. 폴리아덴일화를 CDS의 3' 말단에 위치된 합성 폴리A 신호 서열에 의해 구동하였다. 또한, 각각의 벡터는 상염색체 복제를 위한 EBV OriP 서열을 함유하였다.
분자의 생산을 위해, 현탁액에서 성장하는 HEK293-EBNA 세포를 형질감염 시약으로서 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 각각의 발현 벡터로 공동-형질감염시켰다. 세포를 상응하는 발현 벡터로 1:2:1:1 비로(A, B, E 및 F : "벡터 중쇄(VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3)" : "벡터 경쇄(VL-CL)" : "벡터 중쇄(VH-CH1-CH2-CH3)" : "벡터 경쇄(VH-CL)") 또는 1:1:1:1 비로(C : "벡터 중쇄(VH-CH1-VL-CH1-CH2-CH3)" : "벡터 경쇄(VL-CL)" : "벡터 중쇄(CH2-CH3)" : "벡터 경쇄(VH-CL)", D : "벡터 중쇄(VL-CH1-CH2-CH3)" : "벡터 경쇄(VL-CL)" : "벡터 중쇄(VH-CH1-CH2-CH3)" : "벡터 경쇄(VH-CL)") 형질감염시켰다.
형질감염을 위해, HEK293 EBNA 세포를, 6 mM L-글루타민 및 250 mg/l G418을 함유하는 엑셀(Excell) 배양 배지에서 무혈청 현탁액에서 배양하였다. 600 ml 튜브스핀 플라스크(최대 작업 부피 400 ml)에서의 생산을 위해, 6억 개의 HEK293 EBNA 세포를 형질감염 24시간 전에 시딩하였다. 형질감염을 위해, 세포를 5분 동안 210 x g에서 원심분리하고, 상청액을 20 ml의 예비-가온된 CD CHO 배지로 대체하였다. 발현 벡터를 20 ml CD CHO 배지에서 400 μg DNA의 최종 양으로 혼합하였다. 1080 μl PEI 용액(2.7 μg/ml)을 첨가한 후에, 혼합물을 15초 동안 와류시킨 후에, 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이후, 세포를 DNA/PEI 용액과 혼합하고 600 ml 튜브스핀 플라스크에 옮기고 3시간 동안 37℃에서 가습된 5% CO2 대기를 갖는 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리 후에, 6 mM L-글루타민, 5 g/L 펩소이(Pepsoy) 및 1.0 mM VPA를 함유하는 360 ml 엑셀 배지를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 배양하였다. 형질감염 1일 후에, 7% 공급물(Feed) 1을 첨가하였다. 7일 후에, 배양 상청액을 정제를 위해 20 내지 30분 동안 3600 x g에서 원심분리에 의해(시그마(Sigma) 8K 원심분리기) 수집하고, 용액을 멸균 여과하고(0.22 μm 필터), 나트륨 아지드를 0.01% w/v의 최종 농도로 첨가하였다. 용액을 4℃에서 유지하였다.
배양 배지에서 분자의 역가를 단백질 A-HPLC에 의해 결정하였다(표 2). 역가의 계산은 2-단계 프로세스를 기반으로 하고 pH 8.0에서 단백질 A에 대한 Fc-함유 분자의 결합 및 pH 2.5에서 계단 용리의 방출을 포함한다. 분석에 사용된 둘 다의 완충액은 Tris(10 mM), 글리신(50 mM) 및 NaCl(100 mM)을 함유하였고 각각의 pH(8 및 2.5)로 조정되었다. 컬럼 바디는 POROS 20A로 패킹된 약 63 μl의 내부 부피를 갖는 업처치(Upchurch) 2x20 mm 프리-컬럼이었다. 초기 교정 후에, 100 μl의 각각의 샘플을 0.5 ml/분의 유속으로 주입하였다. 0.67분 후에, 샘플을 pH 2.5까지 pH 계단으로 용리하였다. 280 nm 흡광도의 결정 및 16 내지 166 mg/l의 인간 IgG1의 농도 범위에서의 표준 곡선을 사용한 계산에 의해 정량화를 수행하였다.
분비된 단백질을 세포 배양 상청액으로부터 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용한 친화성 크로마토그래피 후에 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 정제하였다.
친화성 크로마토그래피를 위해, 상청액을 25 ml 20 mM 인산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)을 갖춘 하이트랩(HiTrap) 단백질A HP(분자 A, B 및 F) 또는 맵셀렉트슈어(MabSelectSure)(분자 C, D 및 E) 컬럼(CV=5 mL, 지이 헬쓰케어(GE Healthcare)) 상에 적재하였다. 미결합 단백질을 10 컬럼 부피 이상의 20 mM 인산 나트륨, 20 mM 시트르산 나트륨(pH 7.5)으로 세척하고, 표적 단백질을 6 컬럼 부피의 20 mM 시트르산 나트륨, 100 mM 염화 나트륨, 100 mM 글리신(pH 3.0)에 용리하였다. 단백질 용액을 1/10의 0.5 M 인산 나트륨(pH 8.0)을 첨가하여 중화시켰다. 단백질 A 크로마토그래피 후에 제조 과정에 있는 분석을 위해, 단일 분획의 분자의 순도 및 분자량을 환원제 및 쿠마시 염색(인스턴트블루(InstantBlue, 상표), 엑스페돈(Expedeon))의 부재 하에 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. NuPAGE(등록상표) 프리-캐스트 젤 시스템(Pre-Cast gel system)(4 내지 12% Bis-Tris, 인비트로겐(Invitrogen))을 제조업자의 지침에 따라 사용하였다. 20 mM 히스티딘, 140 mM 염화 나트륨, 0.01% 트윈(Tween)-20(pH 6.0)을 갖춘 하이로드 슈퍼덱스(HiLoad Superdex) 200 컬럼(지이 헬쓰케어) 상에 적재하기 전에 표적 단백질의 선택된 분획을 농축하고 여과하였다.
정제된 단백질 샘플의 단백질 농도를 아미노산 서열을 기반으로 계산된 몰 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서의 광학 밀도(OD)를 측정함으로써 결정하였다.
분자의 응집물 함량을 25 mM K2HPO4, 125 mM NaCl, 200 mM L-아르기닌 모노하이드로클로라이드, 0.02 %(w/v) NaN3, pH 6.7 러닝 완충액에서 25℃에서 TSKgel G3000 SW XL 분석적 크기 배재 컬럼(토소(Tosoh))을 사용하여 분석하였다.
최종 정제 단계 후에 분자의 순도 및 분자량을 환원제의 존재 또는 부재 하에 CE-SDS 분석에 의해 분석하였다. 캘리퍼 랩칩(Caliper LabChip) GXII 시스템(캘리퍼 라이프사이언스(Caliper lifescience))을 제조업자의 지침에 따라 사용하였다(도 5 및 표 3).
분자의 질량 분광 분석을 애질런트(Agilent) LC-MS 시스템(애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재)) 상에서 수행하였다. 크로마토그래피 시스템(애질런트 1260 인피니티)을 애질런트 6224 TOF LC/MS ESI 장치 상에서 커플링하였다. 약 5 μg의 샘플을 NUCLEOGEL RP1000-8, 250 mm x 4.6 mm 컬럼(마쉐리-나젤 게엠베하 & 콤파니 카게(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, 독일 뒤렌 소재)) 상에 1 ml/분의 유속으로 40℃에서 주입하였다. 이동상은 하기와 같았다: A: 5% 아세토니트릴, 0.05% 폼산, 및 B: 95% 아세토니트릴, 0.05% 폼산. 용리 구배를 적용하기 위해, 15% B를 10분 내에 60% B로 상승시킨 후에, 2.5분 내에 100% B로 상승시켰다.
질량 분석계를 고해상도 모드 4 GHz 포지티브에서 측정하고 500 내지 3200 m/z 범위에서 기록하였다. m/z 스펙트럼을 로슈(호프만-라 로슈 리미티드(Hoffman-La Roche, Ltd))의 매쓰어낼라이저(MassAnalyzer) 2.4.1로 수동으로 디콘볼루션(deconvolution)하였다.
모든 분자를 근본적으로 동일한 방법에 따라 생산하고 정제하였다. 최종 품질은, 거의 100% 단량체 함량 및 100% 순도(CE-SDS)와 함께 분자 A및 B 둘 다의 경우 매우 양호하였다(표 2 및 3, 도 4). LC-MS 분석을 분자 B에 대해 수행하였고, 경쇄의 짝풀림 없음이 밝혀졌다. 대조적으로, 분자 F(전하 변형 없음)는, 부산물이 제거되어야 했고 LC-MS 측정이 여전히 약 10% 짝풀림을 나타냈기 때문에 매우 낮은 회수율을 가졌다. 분자 C는 분자 D보다 약간 양호한 수율 및 품질을 갖도록 정제될 수 있었다. 또한, 최종 품질은, 거의 100% 단량체 함량 및 96% 초과의 순도(CE-SDS)와 함께 분자 C 및 D 둘 다의 경우 양호하였다(표 2 및 3, 도 4).
전하 변형이 있거나 없는 항-CEA/항-CD3 TCB 분자의 생산 및 정제의 요약
분자 역가 [mg/l] 회수율 [%] 수율 [mg/l] 분석적 SEC(HMW/단량체/LMW)
[%]
A 10 40 4 0/100/0
B 1.5 61 0.9 0.8/99.2/0
C 20 36 7.3 0/100/0
D 10 17 1.7 0/99/1
E 16 27 4.3 3/97/0
F 15 3 0.46 0/100/0
전하 변형이 있거나 없는 항-CEA/항-CD3 TCB 분자의 (비-환원된) CE-SDS 분석
분자 피크 # 크기 [kDa] 순도 [%]
A 1 218.6 100
B 1 199.6 100
C 1 169 100
D 1 98 4
2 166 96
E 1 190 2
2 200 94
3 210 4
F 1 172 2
2 197 2
3 220 2
4 230 94
실시예 3: 상이한 항- CEA /항-CD3 T 세포 이중특이적 분자 포맷의 비교
실시예 3A: 세포에 대한 상이한 항 - CEA /항-CD3 T 세포 이중특이적 ( CEA CD3 TCB) 분자의 결합
항-CEA/항-CD3 T 세포 이중특이적(CEA CD3 TCB) 분자의 상이한 포맷의 결합을 인간 위 선암 세포(MKN45, DSMZ ACC 409, 약 513,000 CEA 결합 부위), 결장 선암 세포(LS174T, ATCC(등록상표) CL-188, 약 40,700 CEA 결합 부위) 및 결장 선암 세포 HT29(DSMZ ACC 299, 약 10,000 CEA 결합 부위)에 대해, 뿐만 아니라 CD3-발현 불멸성 T 림프구 세포(주르카트, DSMZ ACC 282)에 대해 시험하였다.
간략히, 세포를 채취하고 계수하고 생존력에 대해 확인하고 2x106 세포/ml로 FACS 완충액(100 μl PBS 0.1% BSA)에 재현탁시켰다. 100 μl의 세포 현탁액(0.2x106 세포를 함유함)을 환저 96-웰 플레이트에서 30분 동안 4℃에서 CEA CD3 TCB 분자의 농도를 증가시키면서(310 pM - 500 nM) 항온처리하고 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고 추가적 30분 동안 4℃에서 플루오레세인(Fluorescein)(FITC)-어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩 #109-096-008)와 함께 재항온처리하고 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하였다.
세포를 2% PFA를 함유하는 FACS 완충액과 함께 30분 동안 4℃에서 어둠에서 항온처리함으로써 염색을 고정하였다. 측정을 위해, 세포를 150 μl FACS 완충액에 재현탁시키고, 형광을 밀테나이(Miltenyi) MACSQuant를 사용하여 측정하였다.
결과를 도 5에 나타냈다. 그래프패드프리즘5를 사용하여 결합 곡선을 수득하였다(윗열 왼편에서 오른편으로, MKN45 세포에 대한 결합, LS174T 세포에 대한 결합, HT29 세포에 대한 결합; 아랫열, 주르카트 세포에 대한 결합).
도 5는, 중간(LS174T) 또는 낮은 CEA 발현 수준(HT29)을 갖는 세포주에 대하여 높은 농도의 분자 D 및 분자 C의 경우 보다 높은 형광 강도를 나타낸다. 이는 인간 CEA에 2가로 결합하는 분자 B에 비교하여 오히려 일가 결합 구출물이 이들 조건 하에 결합 할 수 있다는 사실을 암시한다. 주르카트 세포 상에 인간 CD3에 대한 결합은 분자 C 및 분자 B의 경우 비슷한 반면에, 분자 D는 보다 양호한 결합을 나타냈다. 이는 분자 D에서 CD3-표적화 모이어티의 보다 양호한 접근성에 기인한 것으로 생각된다.
실시예 3B: 상이한 항- CEA /항-CD3 T 세포 이중특이적 ( CEA CD3 TCB ) 분자에 의해 유도된 종양 세포 사멸
CEA CD3 TCB 분자에 의한 상이한 종양 세포의 T-세포 매개된 사멸을, MKN45, BxPC-3(ECACC 93120816, 인간 일차 췌장 선암 세포주) 또는 HT-29 인간 종양 세포를 표적으로 사용하고 인간 PBMC를 효과기 세포로 사용하여 평가하였다. 종양 세포의 용해를 지시된 CEA CD3 TCB 분자를 사용한 항온처리의 24시간 및 48시간에 검출하였다.
간략히, 표적 세포를 트립신/EDTA로 채취하고 세척하고 25,000 세포/웰의 밀도로 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 플레이팅하였다. 세포를 밤새 방치하여 부착시켰다. 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 건강한 인간 공여자의 농축된 림프구 제제(버피 코트)의 히스토패크(Histopaque) 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 신선한 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토패크 그래디언트(시그마, #H8889) 위에 적층하였다. 원심분리(450 x g, 30분, 실온) 후에, PBMC-함유 인터페이즈 위의 혈장을 폐기하고, PBMC를 새로운 팔콘(falcon) 튜브에 옮긴 후에, 50 ml의 PBS로 충전하였다. 혼합물을 원심분리하고(400 x g, 10분, 실온), 상청액을 폐기하고, PBMC 펠릿을 2회 멸균 PBS로 세척하였다(원심분리 단계 350 x g, 10분). 생성된 PBMC 모집단을 기계로(바이셀(ViCell)) 계수하고 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민을 함유하는 RPMI1640 배지(바이오크롬(Biochrom), K0302)에서 37℃, 5% CO2에서 세포 항온처리기에서 추가 사용 전까지 저장하였다(24시간 이하). 종양 세포 용해 분석을 위해, CEA CD3 TCB 분자를 지시된 농도(1 pM 내지 20 nM 범위, 3회)로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 표적 세포 사멸을 37℃, 5% CO2에서 항온처리 후 24시간 및 48시간에 세포자멸성/괴사성 세포에 의해 세포 상청액 내로 방출된 LDH의 정량화에 의해(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), #11 644 793 001) 평가하였다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)를 표적 세포와 1% 트리톤(Triton) X-100을 함께 항온처리하여 달성하였다. 최소 용해(= 0%)는 이중특이적 구축물의 부재 하에 효과기 세포와 공동-항온처리된 표적 세포를 나타낸다.
도 6은 분자 D가 표적 세포주의 가장 강한 사멸을 유도하고, 이어서 분자 C, 마지막으로 분자 B가 뒤따름을 보여준다. 3개의 상이한 포맷 사이의 최고의 차이는 낮은 CEA 발현 수준을 갖는 종양 세포주에 대해 나타났다(도 6C 및 6F). 종양 세포 용해의 EC50 값을 그래프패드프리즘5를 사용하여 계산하고 표 4(24시간) 및 표 5(48시간)에 제시하였다.
24시간 후에 상이한 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 CEA-발현 종양 세포의 T-세포 매개된 사멸에 대한 EC50 값(pM)
세포주 CEA 결합 부위 분자 B 분자 C 분자 D
MKN45 513,000 78.46 72.96 13.58
BxPC-3 44,400 113.5 91.33 22.19
HT-29 10,000 214.5 142.0
48시간 후에 상이한 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 CEA-발현 종양 세포의 T-세포 매개된 사멸에 EC50 값(pM)
세포주 CEA 결합 부위 분자 B 분자 C 분자 D
MKN45 513,000 41.24 47.64 11.60
BxPC-3 44,400 46.98 32.42 13.67
HT-29 10,000 31.72 63.80 62.44
실시예 3C: 상이한 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 CEA -발현 종양 세포의 사멸 후에 CD4+ 및 CD8+ 효과기 세포에 대한 CD25 상향 조절
상이한 CEA CD3 TCB 분자에 의해 매개된 CEA-발현 MKN45, BxPC3 또는 HT29 종양 세포의 사멸 후 CD4+(도 7 A-D) 및 CD8+ T 세포(도 7 E-H)의 활성화를 T 세포 활성화 마커 CD25(늦은 활성화 마커)를 인식하는 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 평가하였다. 또한, CD25를, 표적 세포의 부재 하에 효과기 세포와 상이한 CEA CD3 TCB 분자의 항온처리시 CD4 및 CD8 T 효과기 세포 상에서 분석하여 항원-비특이적 T 세포 활성화를 확인하였다.
항체 및 사멸 분석 조건은 동일한 항체 농도 범위(1 pM 내지 20 nM, 3회), 10:1의 E:T 비 및 48시간의 항온처리 시간을 사용하여 근본적으로 상기에 기재된 바와 같았다(실시예 3B).
항온처리 후에, PBMC를 환저 96-웰 플레이트에 옮기고 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고 2회 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 세척하였다. CD8(FITC 항-인간 CD8, 바이오레전드(BioLegend) #344704), CD4(PECy7 항-인간 CD4, 바이오레전드 #344612) 및 CD25(APC 항-인간 CD25 바이오레전드 #302610)에 대한 표면 염색을 공급자의 지침에 따라 수행하였다. 세포를 2회 0.1% BSA를 함유하는 150 μl/웰 PBS로 세척하고 30분 동안 4℃에서 2% PFA를 함유하는 150 μl/웰의 FACS 완충액을 사용하여 고정하였다. 원심분리 후에, 샘플을 200 μl/웰 PBS 0.1% BSA에 재현탁시키고 BD FACS 포르테사(Fortessa)를 사용하여 분석하였다.
도 7은 분자 D가 CD25-양성 T 세포의 백분율에 의해 측정시 가장 강한 T 세포 활성화를 유도하였음을 나타낸다. 그러나, 이 분자는 가장 높은 2 내지 3개의 농도에서도 표적 세포의 부재 하에 T 세포의 활성화를 유도하여 바람직한 포맷으로서 선택되지 않았다.
분자 C는 CEA-발현 표적 세포의 존재 하에 T 세포 활성화를 유도하는 두번째로 강력한 분자이고, 이는 특히 꽤 낮은 수준의 CEA를 발현하는 표적 세포를 갖는 설정에서 분명하였다(도 7C). 또한, 분자 B는 CEA-발현 표적 세포의 존재 하에 강하고 농도-의존성인 T 세포 활성화를 유도할 수 있었다. 본 실시예에서, 분자 B 및 C 둘 다는 표적 세포의 부재 하에 유의미한 T 세포 활성화를 유도하지 않았다.
이러한 중요한 안전성 포인트를 추가로 설명하기 위해, 추가적 분석을 수행하였다.
실시예 3D: 상이한 CEA CD3 TCB 분자와 CEA -발현 종양 또는 일차 상피 세포의 공동-항온처리시 CD4+ 및 CD8+ 효과기 세포에 대한 CD69 상향 조절
CD4+(도 8 A-E) 및 CD8+ T 세포(도 8 F-J)의 활성화를 48시간 동안의 CEA-발현 MKN45, LS174T(ECACC 87060401, 약 40,700 CEA 결합 부위를 갖는 인간 결장 선암 세포주), HT29 또는 CCD 841 CoN(ATCC(등록상표) CRL-1790(상표), 인간 결장의 일차 상피 세포주, < 2000 CEA 결합 부위를 발현함)과 인간 PBMC 및 상이한 CEA CD3 TCB 분자의 공동-항온처리 후에 평가하였다. 또한, 항원-비특이적 T 세포 활성화를 확인하기 위해, CD69를 표적 세포의 부재 하에 효과기 세포와 상이한 CEA CD3 TCB 분자의 공동-항온처리시 CD4 및 CD8 T 효과기 세포에 대해 분석하였다.
항체 및 분석 조건은 동일한 항체 농도 범위(1 pM 내지 20 nM, 3회) 및 10:1의 E:T, 뿐만 아니라 상기에 기재된 FACS 염색 프로토콜(PE 항-인간 CD69, 바이오레전드 #310906)을 사용하여 근본적으로 상기에 기재된 바와 같았다(실시예 3B 및 3C).
도 8은 다시 분자 D가 상이한 CEA-발현 종양 세포의 존재 하에 CD69-양성 T 세포의 백분율에 의해 측정시 가장 강한 T 세포 활성화를 유도함을 나타낸다. 그러나, 이 분자는 일차 상피 세포의 존재 하에(CCD841, 도 8D 및 8I 참조), 뿐만 아니라 표적 세포의 부재 하에도(도 8E 및 8J) T 세포의 활성화를 유도한다. 이러한 결과는 T 세포의 항원-독립적 활성화를 확정하고, 또한 매우 낮은 CEA 발현 수준을 갖는 일차 상피 세포의 존재 하에 잠재적인 안전성 문제를 암시한다.
그러나, 이들 반응성 PBMC 효과기 세포를 사용하여, 항원-독립적 T 세포 활성화가 두번째로 강한 분자인 분자 C에서도 관찰되었다. 결과적으로, 다양한 CEA-발현 종양 세포의 강하고 농도-의존성인 사멸을 나타내나, 일차 상피 세포의 유의미한 사멸, 일차 상피 세포의 존재 하에 또는 표적 세포의 부재 하에 항원-독립적 T 세포 활성화를 나타내지 않는 유일한 포맷은 분자 B였다. 따라서, "도립된 2+1 IgG 교차Fab" 포맷이 바람직한 포맷으로 선택되었다.
실시예 4: 모 또는 인간화된 CEA 결합제를 포함하는 항- CEA /항-CD3 T 세포 이중특이적 분자의 비교
실시예 4A: 상이한 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 T 세포 활성화 및 종양 세포 사멸( 키메릭 T84.66 대 인간화된 변이체 1)
T 세포 활성화 또는 종양 세포 용해를 유도하는 CEA CD3 TCB의 최종 효능에 대한 CEA 결합제(모 키메릭 T84.66 대 인간화된 변이체 1)의 영향을 상기에 기재된 바와 같은 T 세포 활성화 마커의 후속 염색(실시예 3B 및 실시예 3C)을 사용한 통상적인 종양 세포 용해 분석을 사용하여 평가하였다. 안전 윈도우를 추가로 평가하기 위해, 둘 다의 분자를 단지 효과기 세포와 공동-항온처리하였다.
간략히, 본 분석에 포함된 표적 세포는 MKN45 및 CCD841 CoN 세포였다. CEA CD3 TCB 분자 A 및 B를 1 pM 내지 20 nM(3회)의 지시된 농도 범위로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 종양 또는 일차 상피 세포의 용해를 지시된 CEA CD3 TCB 분자와의 항온처리의 48시간에 검출하였다. 본 분석의 PBMC를 채취하고 상기에 기재된 바와 같이(실시예 3C) CD8+ 및 이른 활성화 마커 CD69에 대해 염색시켰다.
도 9는 모 키메릭 T84.66 CEA 결합제를 함유하는 CEA CD3 TCB 분자(분자 A)가 CEA 높은 발현 종양 세포(MKN45)의 존재 하에 뿐만 아니라 매우 낮은 CEA 발현 수준을 갖는 일차 상피 세포 CCD841 존재 하에 또는 표적 세포의 부재 하에도 T 세포 활성화(도 9 A, B) 및 세포 용해(도 9 C, D) 둘 다를 유도하였음을 나타낸다.
대조적으로, 인간화된 결합제를 함유하는 CEA CD3 TCB 분자(분자 B)는 종양 세포주 MKN45의 존재 하에서만 T 세포 활성화를 유도하였고, 일차 상피 세포주의 존재 하에서는 T 세포 활성화를 유도하지 않았다. 세포 용해에 대해서도 마찬가지였다. 또한, 표적 세포의 부재 하에 유의미한 T 세포 활성화의 신호가 존재하지 않았다.
실시예 4B
모, 키메릭 T84.66 CEA 결합제(분자 A) 또는 인간화된 변이체 1(분자 B)을 함유하는 CEA CD3 TCB 분자의 안전 윈도우를 추가로 평가하기 위해, 민감성 주르카트-NFAT 리포터 분석을 수행하였다. 이론상, 항원-발현 세포 상의 인간 CEA 및 주르카트-NFAT 리포터 세포 상의 인간 CD3(NFAT 프로모터-조절된 루시퍼라제 발현되는 인간 급성 림프성 백혈병 리포터 세포주, 글로리스판스(GloResponse) 주르카트 NFAT-RE-luc2P, 프로메가(Promega) #CS176501)에 대한 TCB 분자의 동시 결합시, NFAT 프로모터는 활성화되고 활성 반딧불이 루시퍼라제의 발현을 야기한다. 발광 신호의 강도(루시퍼라제 기질의 첨가시 수득됨)는 CD3 활성화 및 신호전달의 강도에 비례한다.
분석을 위해, 표적 세포를 트립신/EDTA로 채취하고, 생존력을 바이셀을 사용하여 결정하였다. 20,000 세포/웰로 평저 백색-벽 96-웰 플레이트(#655098, 그라이너 바이오-원(greiner bio-one))에 플레이팅하고, 희석된 항체 또는 배지(대조군용)를 지시된 농도 범위(0.4 pM 내지 100 nM)로 첨가하였다. 이어서, 주르카트-NFAT 리포터 세포를 채취하고, 생존력을 바이셀을 사용하여 평가하였다. 세포를 세포 배양 배지에 재현탁시키고 종양 세포에 첨가하여 2.5:1의 최종 E:T 비 및 하나의 웰 당 100 μl의 최종 부피를 수득하였다. 세포를 4시간 동안 37℃에서 가습된 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리 기간의 말에, 100 μl/웰의 ONE-Glo 용액(하나의 웰 당 1:1 ONE-Glo 및 분석 매질 부피)을 웰에 첨가하고 10분 동안 실온에서 어둠에서 항온처리하였다. 발광을 월락 빅터3(WALLAC Victor3) ELISA 판독기(퍼킨엘머(PerkinElmer)2030)를 사용하고 검출 시간으로서 1초/웰을 사용하여 검출하였다.
도 10은 모 키메릭 T84.66 CEA 결합제를 함유하는 CEA CD3 TCB 분자(분자 A)가 CEA 높은 및 중간 발현 종양 세포(각각 MKN45 및 LS174T)의 존재 하에서 뿐만 아니라 매우 낮은 CEA 발현 수준을 갖는 일차 상피 세포 CCD841의 존재 하에 또는 표적 세포의 부재 하에서도 주르카트 T 세포 활성화를 유도하였음을 나타낸다(도 10A).
대조적으로, 인간화된 결합제를 함유하는 CEA CD3 TCB 분자(분자 B)는 종양 세포주 MKN45 및 LS174T의 존재 하에서만 주르카트 T 세포 활성화를 유도하였고, 일차 상피 세포주 존재 하에 또는 표적의 부재 하에는 주르카트 T 세포 활성화를 유도하지 않았다(도 10B). 이들 결과는 놀랍게도 인간화된 CEA 결합제를 포함하는 분자가 안전성의 면에서 보다 양호함을 나타낸다.
실시예 5: 항이한 인간화된 CEA 결합제를 포함하는 항- CEA /항-CD3 T 세포 이중특이적 분자의 비교
실시예 5A: 상이한 인간화된 CEA 결합제를 포함하는 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 T 세포 활성화 및 종양 세포 사멸
종양 세포 용해를 유도하는 CEA TCB의 최종 효능에 대한 CEA 결합제(인간화된 변이체 1(서열번호 22 및 23) 대 상이한 인간화된 CEA 결합제(서열번호 30 및 31, T84.66을 기반으로 하지 않음))의 영향을 상기에 기재된 바와 같은(실시예 3B) 통상적인 종양 세포 용해 분석으로 평가하였다.
간략히, 본 분석에 포함된 표적 세포는 BxPC-3, NCI-H2122(ATCC(등록상표) CRL-5985, 인간 비-소세포 폐암 세포주, 약 13,300 CEA 결합 부위), COR-L105(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) #92031918, 인간 폐 선암 세포주, 약 1200 CEA 결합 부위) 및 HBEpiC(케미 브룬슈빅 아게(Chemie Brunschwig AG) #3210, 인간 기관지 상피 세포, <500 CEA 결합 부위)였다. 인간화된 변이체 1 CEA 결합제를 포함하는 CEA CD3 TCB 분자(분자 B)를 1 pM 내지 20 nM(3회)의 지시된 농도 범위로 첨가하고, 상이한 인간화된 CEA 결합제를 포함하는 CEA CD3 TCB 분자(즉, 분자 B와 유사한 구조를 가지나 상이한 CEA 결합제를 포함하는 CEA CD3 TCB 분자, 서열번호 42 내지 45 참조)를 6 pM 내지 100 nM의 지시된 농도 범위로 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 종양 또는 일차 상피 세포의 용해를 지시된 CEA CD3 TCB 분자와의 항온처리의 47시간에 검출하였다.
이어서, 본 분석의 PBMC를 채취하고 상기에 기재된 바와 같이 인간 CD8+ T 세포 상의 이른 활성화 마커 CD69를 염색시켰다.
도 11 A 내지 D는 상이한 인간화된 CEA 결합제를 기반으로 한 TCB 분자(하기에 "분자 X"로 지칭됨, 서열번호 42 내지 45)와 비교시 인간화된 변이체 1을 기반으로 한 CEA CD3 TCB(실시예 2의 분자 B)가 T 효과기 및 CEA-양성 표적 세포에 대한 동시 결합시 보다 강한 T 세포 활성화를 유도하였음을 나타낸다.
이는 CEA-발현 종양 세포의 보다 강한 사멸이 인간화된 변이체 1을 기반으로 한 분자를 사용하여 관찰된 도 11 E 내지 H에 도시된 종양 세포 용해 데이터와 일직선을 이루었다. 뚜렷하게, CEA CD3 TCB 분자 중 CEA-낮은 일차 상피 HBEpiC 세포의 용해를 유도하는 것은 없었다.
종합하여, 상이한 인간화된 CEA 결합제를 기반으로 한 CEA CD3 TCB(분자 X)와 비교시, 인간화된 변이체 1을 기반으로 하는 CEA CD3 TCB 분자(분자 B)는 안전 윈도우를 유지하면서 훨씬 낮은 CEA 수준을 갖는 종양 세포를 사멸할 수 있었다.
실시예 5B: 상이한 인간화된 CEA 결합제를 포함하는 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 T 세포 증식
대안적 판독으로서, 실시예 5A에 사용된 TCB 분자를, 각각의 종양 표적 세포(MKN45, LS174T, HT29)의 존재 하에 교차결합시 T 세포 증식을 유도하는 능력에 대해 분석하였다. 대조군으로서, 매우 낮은 CEA 발현 수준을 갖는 일차 상피 세포 CCD841 CoN을 대안적 표적 세포로서 포함시켰다.
간략히, 갓 단리된 인간 PBMC를 따뜻한 PBS에서 1 ml 당 백만개의 세포로 조정하고 가습된 항온처리기에서 37℃에서 15분 동안 0.1 μM CFSE로 염색시켰다. 염색을 1/10 부피의 FCS를 첨가하여 중단하고, 이를 1분 동안 실온에서 항온처리하였다. 이어서, 세포를 원심분리하고 예비-가온된 배지에서 재현탁시키고 추가적 30분 동안 가습된 항온처리기에서 37℃에서 항온처리하여 잔여 CFSE를 제거하였다. 항온처리 후에, 세포를 1회 따뜻한 배지로 세척하고 계수하고 배지에 1 ml 당 2백만개의 세포로 재현탁시켰다.
2만개의 표적 세포를 평저 96-웰 플레이트의 하나의 웰 마다 플레이팅하고, 상이한 TCB 분자를 지시된 농도로 첨가하였다. CFSE-표지된 PBMC를 첨가하여 10:1의 최종 E:T 비를 수득하고, 분석 플레이트를 5일 동안 가습된 항온처리기에서 37℃에서 항온처리하였다.
제5일에, 효과기 세포를 채취하고 2회 FACS 완충액(PBS, 0.1% BSA)으로 세척하고 CD4 및 CD8의 표면 발현에 대해 염색시켰다. 상이한 T 세포 부분모집단의 증식을 PD FACS Diva 소프트웨어를 갖춘 BD FACS 포르테사를 사용하여 분석하였다. 증식 곡선을 그래프패드프리즘5에 의해 분석하였다.
도 12는 인간화된 변이체 1을 기반으로 하는 CEA CD3 TCB(분자 B)가 상이한 인간화된 CEA 결합제를 기반으로 하는 CEA CD3 TCB(분자 X)와 비교하여 CEA-양성 종양 표적 세포의 존재 하에 보다 강한 T 세포 활성화 및 후속 T 세포 증식을 유도하였음을 나타낸다. CD8+ T 세포의 증식을 도 12 A 내지 D에 나타냈고, CD4+ T 세포의 증식을 도 12 E 내지 H에 나타냈다.
특히, 5일의 항온처리 후에도 일차 상피 세포의 존재 하에 분자 중 하나를 사용하였을 때 유의미한 T 세포 활성화 및 후속 T 세포 증식이 관찰되지 않았다(도 12, CCD841 CoN 세포).
이는, 상이한 인간화된 CEA 결합제를 기반으로 한 CEA CD3 TCB(분자 X)와 비교시, 인간화된 변이체 1을 기반으로 한 CEA CD3 TCB(분자 B)의 유리한 효능 및 안전 윈도우를 추가로 확인하였다.
실시예 5C: 세포에 대한 상이한 항 - CEA /항-CD3 T 세포 이중특이적 ( CEA CD3 TCB) 분자의 결합
실시예 5A 및 B에 사용된 TCB 분자의 결합을 상이한 CEA-발현 종양 및 CD3-발현 주르카트(DSMZ ACC 282) 세포에 대해 시험하였다.
간략히, 세포를 채취하고 계수하고 생존력에 대해 확인하고 2x106 세포/ml로 FACS 완충액(100 μl PBS 0.1% BSA)에 재현탁시켰다. 100 μl의 세포 현탁액(0.2x106 세포를 함유함)을 CEA IgG의 농도를 증가시키면서(31 pM 내지 500 nM) 환저 96-웰 플레이트에서 30분 동안 4℃에서 항온처리하고 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고, 추가적 30분 동안 4℃에서 FITC-접합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적 이차 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩 FITC #109-096-008, PBS 0.1 % BSA에 1:40 예비-희석됨)와 재항온처리하고 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고 2% PFA를 함유하는 150 μl PBS 0.1 % BSA를 사용하여 고정하고 4℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 이후, 세포를 1회 8분 동안 400 xg에서 4℃에서 세척하고 FACS 측정을 위해 마지막으로 150 μl FACS 완충액에 재현탁시켰다. 형광을 밀테나이 MACSQuant를 사용하여 측정하였다.
결합 곡선 및 EC50 값을 수득하고 그래프패드프리즘6을 사용하여 계산하였다(도 16 A, MKN45 세포에 대한 결합, 도 16 B, LS-174T 세포에 대한 결합, 도 16 C, HT-29 세포에 대한 결합, 도 16 D, 표 6).
도 16은 인간화된 변이체 1을 기반으로 한 CEA CD3 분자(분자 B)가 상이한 인간화된 CEA 결합제를 기반으로 한 CEA CD3 TCB(분자 X)보다 CEA-발현 종양 세포에 대해 보다 양호한 결합을 나타냄을 보여준다(보다 양호한 EC50 값 및 최대 결합, 특히 중간 및 낮은 CEA-발현 표적 세포에 대해). 둘 다의 TCB 분자는 주르카트 세포 상에 인간 CD3에 대해 농도-의존성 결합을 나타낸다.
세포에 대한 CEA CD3 TCB 분자 B 및 CEA CD3 TCB 분자 X의 결합(도 16에 나타낸 결합 곡선을 기반으로 하고 그래프패드프리즘에 의해 계산된 EC50 값).
세포주 판매 회사 CEA 결합 부위 분자 B
EC50 결합 (nM)		 분자 X
EC50 결합 (nM)
MKN45 DSMZ #ACC409 약 513,300 26.61 27.85
LS-174T ATCC(등록상표) #CL-188 약 40,700 4.256 11.69
HT-29 DSMZ #ACC299 약 10,000 18.66 n.c.
CEA 결합 부위를 10 μg/ml 항-인간 CEA 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology), sc-23928)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 FACS-기반 Qifikit 분석에 의해 결정하였다.
실시예 5D: 상이한 인간화된 CEA 결합제를 포함하는 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 종양 세포 용해
실시예 5A 내지 C에 사용된 CEA CD3 TCB 분자에 의한 종양 세포의 T-세포 매개된 용해를, 인간 종양 세포를 표적 세포로서 사용하고 인간 PBMC를 효과기 세포로서 사용하여 평가하였다. 종양 세포의 용해를 지시된 CEA CD3 TCB 분자와의 항온처리의 48시간에 검출하였다.
간략히, 표적 세포를 트립신/EDTA로 채취하고 세척하고 25,000 내지 30,000 세포/웰의 밀도로 평저 96-웰 플레이트를 사용하여 플레이팅하였다. 세포를 밤새 방치하여 부착시켰다. 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 건강한 인간 공여자로부터 수득된 농축된 림프구 제제(버피 코트)의 히스토패크 밀도 원심분리에 의해 제조하였다. 신선한 혈액을 멸균 PBS로 희석하고 히스토패크 그래디언트(시그마, #H8889) 위에 적층하였다. 원심분리(450 x g, 30분, 실온) 후에, PBMC-함유 인터페이즈 위의 혈장을 폐기하고, PBMC를 새로운 팔콘 튜브에 옮긴 후에, 50 ml의 PBS로 충전하였다. 혼합물을 원심분리하고(400 x g, 10분, 실온), 상청액을 폐기하고, PBMC 펠릿을 2회 멸균 PBS(원심분리 단계 350 x g, 10분)로 세척하였다. 생성된 PBMC 모집단을 기계로(바이셀) 계수하고 추가로 사용하기 전까지(24시간 이하) 37℃, 5% CO2에서 세포 항온처리기에서 10% FCS 및 1% L-알라닐-L-글루타민(바이오크롬, K0302)을 함유하는 RPMI1640 배지에 저장하였다. 종양 세포 용해 분석을 위해, CEA CD3 TCB 분자를 지시된 농도로(인간화된 변이체 1을 기반으로 한 CEA CD3 TCB(분자 B)의 경우 0.26 pM 내지 20 nM 범위, 상이한 인간화된 CEA 결합제를 기반으로 하는 CEA CD3 TCB(분자 X)의 경우 각각 1.28 pM 내지 100 nM 범위, 3회) 첨가하였다. PBMC를 10:1의 최종 E:T 비로 표적 세포에 첨가하였다. 표적 세포 사멸을 37℃, 5% CO2에서 항온처리의 48시간 후에 세포자멸성/괴사성 세포에 의한 세포 상청액 내로 방출된 LDH의 정량화에 의해(LDH 검출 키트, 로슈 어플라이드 사이언스, #11 644 793 001) 평가하였다. 표적 세포의 최대 용해(= 100%)를 표적 세포와 1% 트리톤 X-100의 항온처리에 의해 달성하였다. 최소 용해(= 0%)는 이중특이적 구축물의 부재 하에 표적 세포와 효과기 세포의 공동-항온처리를 나타낸다.
도 17은 인간화된 변이체 1을 기반으로 한 CEA CD3 TCB 분자(분자 B)가 나타낸 모든 종양 세포주의 유의미하고 농도-의존성인 용해를 유도한 반면에, 상이한 인간화된 CEA 결합제를 기반으로 한 CEA CD3 TCB(분자 X)는 단지 KatoIII의 종양 용해 및 보다 적은 정도로 NCI-H2122의 종양 용해를 유도하였음을 나타낸다. 이는 분자 X와 비교시, 분자 B의 보다 큰 효능(특히 꽤 낮은 CEA 발현 수준을 갖는 종양 세포주의 경우)을 분명하게 입증하였다.
종양 세포 용해의 EC50 값을 그래프패드프리즘6을 사용하여 계산하고 표 7에 제시하였다(48시간).
48시간 후에 상이한 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 낮은 CEA-발현 종양 세포의 T-세포 매개된 용해에 대한 EC50 값(pM)
세포주 종양 적응증 참조 CEA 결합 부위 분자 B
EC50 용해		 분자 X
EC50 용해
Kato III 위암 ECACC #86093004 약 22,700 55.4 8233
HCC1954 유방암 ATCC #CRL-2338 약 15,750 421.7 -
NCI-H2122 폐암 ATCC #CRL-598 약 13,300 27.9 -
CX-1 결장암 DSMZ #ACC 129 약 4,750 430.4 -
NCI-H596 폐암 ATCC #HTB-178 약 1,900 18.5 -
CEA 결합 부위를 10 μg/ml 항-인간 CEA 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지, sc-23928)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 FACS-기반 Qifikit 분석에 의해 결정하였다.
실시예 6: CEA와 CD3 결합제 사이에 상이한 연결기를 포함하는 항- CEA /항-CD3 T 세포 이중특이적 분자의 비교
실시예 6A: 세포에 대한 CEA와 CD3 결합제 사이에 상이한 연결기를 포함하는 CEA CD3 TCB 분자의 결합
CD3 Fab와 CEA Fab 사이에 보다 긴 연결기를 갖는 분자 B의 변이체(분자 E)의 결합을 세포에 대한 분자 B의 결합에 대해 비교하였다.
인간 CEA에 대한 결합을 MKN45, LS174T 또는 HT29에 대해 시험하고, 인간 CD3에 대한 결합을 주르카트 세포에 대해 시험하였다. 분석 설정 및 조건은 하기에 기재된 바와 같았다(실시예 3A).
결과를 도 13에 나타냈다. 결합 곡선을 그래프패드프리즘5를 사용하여 수득하였다(A, MKN45 세포에 대한 결합; B, LS174T 세포에 대한 결합; C, HT29 세포에 대한 결합; D, 주르카트 세포에 대한 결합).
도 13은 세포 상에 인간 CEA 및 인간 CD3에 대한 둘 다의 분자의 비슷한 결합을 나타낸다.
실시예 6B: CEA와 CD3 결합제 사이에 상이한 연결기를 포함하는 CEA CD3 TCB 분자에 의한 다양한 종양 세포의 용해
CEA-발현 종양 세포의 T 세포-매개된 용해를 유도하는 분자의 효능에 대한 연결기 길이의 영향을 추가로 평가하기 위해, 통상적인 종양 세포 용해 분석을 상기에 기재된 바와 같이(예를 들어 실시예 3B) 수행하였다. 실시예 6A의 CEA CD3 TCB 분자(분자 B, 및 CEA와 CD3 결합제 사이에 보다 긴 연결기를 갖는 상응하는 분자인 분자 E)를 지시된 농도로(1 pM 내지 20 nM 범위, 3회) 첨가하고, 종양 세포 용해를 24시간(도 14 A 내지 D) 및 48시간(도 14 E 내지 H) 후에 평가하였다. EC50 값을 그래프패드프리즘5에 의해 계산하고 표 8에 제시하였다.
도 14는 CEA의 높은(MKN45) 또는 중간 수준(LS174T)의 CEA를 발현하는 종양 세포의 비슷한 용해 및 일차 상피 세포 CCD841의 사멸 없음을 나타낸다.
그러나, 낮은 CEA 발현 수준을 갖는 표적 세포(HT29)는 보다 긴 연결기를 포함하는 분자를 사용시 보다 높은 전체 사멸을 나타냈다.
24시간 및 48시간 후에 상이한 CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 낮은 CEA-발현 HT29 종양 세포의 T-세포 매개된 사멸에 대한 EC50 값(pM)
EC50 (pM) 분자 B 분자 E
24시간 512 679
48시간 338 342
실시예 7: CEA CD3 TCB 분자에 의해 유도된 종양 세포 용해 및 T 세포 활성화
실시예 7A: CEA CD3 TCB 분자 B에 의한 상이한 CEA 발현 수준을 갖는 세포주의 용해
또 다른 실험에서(도 18A), CEA CD3 TCB 분자 B를 낮은 CEA-발현 일차 상피 세포주 HBEpiC 대 상이한 종양 세포주의 존재 하에 이의 안전성에 대해 평가하였다. 분석 설정 및 항체 범위는 실시예 5D의 분자 B에 대해 기재된 바와 같았다. 종양 세포 용해의 EC50 값을 그래프패드프리즘6을 사용하여 계산하고 표 9에 제시하였다(48시간).
도 18A 및 표 9에 나타낸 바와 같이, 일차 상피 세포는 CEA CD3 TCB 분자에 의해 사멸되지 않은 반면에, 다양한 CEA 발현 수준을 갖는 종양 세포주는 농도-의존성 방식으로 CEA CD3 TCB 분자에 의해 용해될 수 있었다.
48시간 후에 CEA CD3 TCB 분자 B에 의해 유도된 CEA-발현 종양 세포의 T-세포 매개된 용해에 대한 EC50 값(pM)
세포주 참조 CEA 결합 부위 분자 B
BxPC-3 ECACC
#93120816		 약 44,000 49.63
NCI-H2122 ATCC
#CRL-598		 약 13,300 237.5
COR-L105 시그마-알드리치 #92031918 약 1,200 n.c.*
HBEpiC 사이언셀(ScienCell) #3210 < 600 -
* COR-L105에 대한 EC50은 곡선이 높은 농도에서 포화에 도달하지 않았기 때문에 적절하게 계산될 수 없었다.
CEA 결합 부위를 10 μg/ml 항-인간 CEA 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지, sc-23928)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 FACS-기반 Qifikit 분석에 의해 결정하였다.
또 다른 실험에서(도 19A), CEA CD3 TCB 분자 B를 또 다른 낮은 CEA-발현 일차 상피 세포주(CCD841CoN) 대 상이한 종양 세포주의 존재 하에 또 다른 PBMC 공여자를 사용하여 이의 안전성에 대해 평가하였다. 분석 설정 및 항체 범위는 실시예 5D에서 CEA CD3 TCB 분자 B에 대해 기재된 바와 같았다. 종양 세포 용해의 EC50 값을 그래프패드프리즘6을 사용하여 계산하고 표 10에 제시하였다(48시간).
48시간 후에 CEA CD3 TCB 분자 B에 의해 유도된 CEA-발현 종양 세포의 T-세포 매개된 용해에 대한 EC50 값(pM)
세포주 참조 CEA 결합 부위 분자 B
MKN45 DSMZ #ACC409 약 513,300 41.24
BxPC-3 ECACC #93120816 약 44,000 46.98
HT-29 DSMZ #ACC299 약 10,000 562.7
CCD-841CoN ATCC #CRL-1790 < 600 -
CEA 결합 부위를 10 μg/ml 항-인간 CEA 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지, sc-23928)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 FACS-기반 Qifikit 분석에 의해 결정하였다.
도 19A 및 표 10에 나타낸 바와 같이, 일차 상피 세포는 CEA CD3 TCB 분자 B에 의해 사멸되지 않은 반면에, 다양한 CEA 발현 수준을 갖는 종양 세포주는 농도-의존성 방식으로 CEA CD3 TCB 분자에 의해 용해될 수 있었다.
실시예 7B: CEA CD3 TCB 분자 B에 의해 유도된 CEA -발현 종양 세포의 사멸 후 CD4+ 효과기 세포에 대한 CD69 상향 조절
CEA CD3 TCB 분자 B에 의해 매개된 CEA-발현 종양 세포의 용해 후 CD4+ 및 CD8+ 효과기 세포의 활성화를 T 세포 활성화 마커 CD69(이른 활성화 마커)를 인식하는 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 평가하였다.
항체 및 사멸 분석 조건은 동일한 항체 농도 범위(0.26 pM 내지 20 nM, 3회), 10:1의 E:T 및 48시간의 항온처리 시간을 사용하여 근본적으로 상기에 기재된 바와 같았다(실시예 5D).
항온처리 후에, PBMC를 환저 96-웰 플레이트에 옮기고 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고 2회 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 세척하였다. CD8(FITC 항-인간 CD8, 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences) #555634), CD4(PECy7 항-인간 CD4, 비디 바이오사이언시즈 #557852) 및 CD69(PE 항-인간 CD69 바이오레전드 #310906)에 대한 표면 염색을 공급자의 지침에 따라 수행하였다. 세포를 2회 0.1% BSA를 함유하는 150 μl/웰 PBS로 세척하고 30분 동안 4℃에서 2% PFA를 함유하는 150 μl/웰의 FACS 완충액을 사용하여 고정하였다. 원심분리 후에, 샘플을 200 μl/웰 PBS 0.1% BSA에 재현탁시키고 BD FACS 포르테사를 사용하여 분석하였다.
도 18B는 CD69-양성 CD4+ T 세포의 백분율에 의해 측정시, CEA CD3 TCB 분자 B가 상이한 CEA-발현 종양 세포주의 존재 하에 농도-의존성 T 세포 활성화를 유도하였음을 나타낸다. 대조적으로, T 세포 활성화가 낮은 CEA-발현 일차 상피 세포의 존재 하에 발생하지 않았다. 유사한 결과를 CD8+ 세포의 경우 수득하였다(데이터를 나타내지 않음). 데이터는 CEA CD3 TCB 분자 B의 치료적 투여가 낮은 CEA 발현 수준을 갖는 일차 상피 세포에 대해 역효과를 야기하지 않아야 함을 시사한다.
T-세포 활성화의 EC50 값을 그래프패드프리즘6을 사용하여 계산하고 표 11에 제시하였다.
48시간 후에 CEA-발현 세포 및 CD3-발현 T 세포에 대한 CEA CD3 TCB 분자 B의 동시 결합시 T-세포 활성화에 대한 EC50 값(pM)
세포주 참조 CEA 결합 부위 분자 B
BxPC-3 ECACC
#93120816		 약 44,000 84.74
NCI-H2122 ATCC
#CRL-598		 약 13,300 149.1
COR-L105 시그마-알드리치
#92031918		 약 1,200 n.c.*
HBEpiC 사이언셀
#3210		 < 600 -
* COR-L105에 대한 EC50은 곡선이 높은 농도에서 포화에 도달하지 않았기 때문에 적절하게 계산될 수 없었다.
CEA 결합 부위는 10 μg/ml 항-인간 CEA 항체(산타 크루즈 바이오테크놀로지, sc-23928)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 FACS-기반 Qifikit 분석에 의해 결정하였다.
실시예 7C: CEA CD3 TCB 분자 B에 의해 유도된 CEA -발현 종양 세포의 사멸 후에 CD4+ 효과기 세포에 대한 CD25 상향 조절
CEA CD3 TCB 분자 B에 의해 매개된 CEA-발현 종양 세포의 용해 후 CD4+ 및 CD8+의 활성화를 T 세포 활성화 마커 CD25(늦은 활성화 마커)를 인식하는 항체를 사용하여 FACS 분석에 의해 평가하였다.
항체 및 사멸 분석 조건은 동일한 항체 농도 범위(0.26 pM 내지 20 nM, 3회), 10:1의 E:T 비 및 48시간의 항온처리 시간을 사용하여 근본적으로 상기에 기재된 바와 같았다(실시예 5D).
항온처리 후에, PBMC를 환저 96-웰 플레이트에 옮기고 350 x g에서 5분 동안 원심분리하고 2회 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 세척하였다. CD8(FITC 항-인간 CD8, 바이오레전드 #344704), CD4(PECy7 항-인간 CD4, 바이오레전드 #344612) 및 CD25(APC 항-인간 CD25 바이오레전드 #302610)에 대한 표면 염색을 공급자의 지침에 따라 수행하였다. 세포를 2회 0.1% BSA를 함유하는 150 μl/웰 PBS로 세척하고 30분 동안 4℃에서 2% PFA를 함유하는 150 μl/웰의 FACS 완충액을 사용하여 고정하였다. 원심분리 후에, 샘플을 200 μl/웰 PBS 0.1% BSA에 재현탁시키고 BD FACS 포르테사를 사용하여 분석하였다.
도 19B는 CD25-양성 T 세포의 백분율에 의해 측정시 CEA CD3 TCB 분자 B가 CEA-발현 종양 세포의 존재 하에 농도-의존성 T 세포 활성화를 유도하였음을 나타낸다. 대조적으로, T 세포 활성화는 낮은 CEA-발현 일차 상피 세포의 존재 하에 발생하지 않았다. 유사한 결과가 CD8+ 세포의 경우 수득되었다(데이터를 나타내지 않음). 데이터는 CEA CD3 TCB 분자 B의 치료적 투여가 낮은 CEA 발현 수준을 갖는 일차 상피 세포에 대해 역효과를 야기하지 않아야 함을 시사한다.
실시예 8: 인간 CEACAM5에 대한 CEA CD3 분자 B의 특이적 결합
다른 가장 유사한 패밀리 멤버 CEACAM1 및 CEACAM6이 아닌 인간 CEACAM5에 대한 CEA CD3 TCB 분자 B의 특이적 결합을 나타내기 위해, 인간 CEACAM5, CEACAM1 또는 CEACAM6을 발현하는 일시적 HEK293T 감염된 세포에 대한 CEA CD3 TCB 분자 B의 결합을 평가하였다.
간략히, 세포를 채취하고 계수하고 생존력에 대해 확인하고 1x106 세포/ml로 FACS 완충액(100 μl PBS 0.1% BSA)에 재현탁시켰다. 100 μl의 세포 현탁액(0.1x106 세포를 함유함)을 환저 96-웰 플레이트에 플레이팅하고 2회 150 μl의 찬 PBS로 세척하였다. 세포를 30분 동안 4℃에서 PBS 중의 고정시킬 수 있는 생존력 염료 Fluor660(이바이오사이언스(eBioscience), #65-0864-14)의 1:5000 예비-희석된 현탁액을 사용하여 염색시켰다. 이후, 세포를 2회 PBS로 세척하고 1회 FACS 완충액으로 세척하고 CEA CD3 TCB 분자 B의 농도를 증가시키면서 30분 동안 4℃에서 염색시켰다. 항체 농도 범위는 30.5 pM 내지 500 nM이었다. 세포를 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고 추가적 30분 동안 4℃에서 FITC-접합된 어피니퓨어 F(ab')2 단편 염소 항-인간 IgG Fcg 단편 특이적 이차 항체(잭슨 이뮤노 리서치 랩 FITC # 109-096-098, PBS 0.1% BSA에 1:50 예비-희석됨)와 재항온처리하고 찬 PBS 0.1% BSA로 2회 세척하고 2% PFA를 함유하는 150 μl PBS 0.1% BSA를 사용하여 고정하고 4℃에서 20분 동안 항온처리하였다. 이후, 세포를 1회 8분 동안 400 x g에서 4℃에서 세척하고 FACS 측정을 위해 150 μl FACS 완충액에 재현탁시켰다. 형광을 BD FACS CantoII를 사용하여 측정하였다. 결합 곡선을 그래프패드프리즘6을 사용하여 수득하였다(도 20A).
형질감염 효능을 결정하기 위해, 모든 감염체를 30분 동안 4℃에서 상업적으로 입수가능한 항-인간 CD66 항체(FITC 마우스 항-인간 CD66, 비디 바이오사이언시즈 #551479, 샘플 당 20 μl)를 사용하여 염색시켰다(도 20B). 도 20B에 나타낸 바와 같이, 가장 높은 발현 수준이 인간 CEACAM1에 대해 검출되었고, CEACAM5 및 CEACAM6이 뒤이었다.
도 20A는 CEA CD3 TCB 분자 B가 인간 CEACAM1 또는 CEACAM6을 발현하는 임의의 다른 감염체가 아닌 인간 CEACAM5를 발현하는 일시적 감염체에 대한 농도-의존성 결합을 나타냄을 분명히 보여주고, 이는 CEA에 대한 결합의 특이성을 입증한다.
실시예 9: 건강한 NOG 마우스에서 상이한 인간화된 CEA 결합제를 포함하는 CEA CD3 TCB 분자의 단일 투여량 PK
단일 투여량 약동학적 연구(SDPK)를 건강한 NOG 마우스에서 수행하여 CEA CD3 TCB 분자 B 및 CEA CD3 TCB 분자 X의 노출을 평가하였다(도 15). 0.5 mg/kg의 정맥내 볼루스 주입을 NOG 마우스에 투여하고, 혈액 샘플을 약동학적 평가를 위해 선택된 시점에서 채취하였다. 포괄적 면역 분석을 CEA CD3 TCB 분자의 총 농도를 측정하기 위해 사용하였다. 둘 다의 TCB 분자에 대한 표준 곡선의 교정 범위는 0.078 내지 5 ng/ml였고, 이때 1.5 ng/ml가 정량 한계(LLOQ)이다.
2상의 쇠퇴가 CEA CD3 TCB 분자 B의 경우 10일의 반감기(구획이 없음) 및 CEA CD3 TCB 분자 X의 경우 6.5일의 반감기와 함께 관찰되었다. 각각, CEA CD3 TCB 분자 B의 경우 8.1 ml/일/kg의 클리어런스(clearance)(CL)가 검출되었고, CEA CD3 TCB 분자 X의 경우 19 ml/일/kg의 클리어런스가 검출되었다(표 12). 전반적으로, CEA CD3 TCB 분자 B는 CEA CD3 TCB 분자 X와 비교하여 NOG 마우스에서 보다 긴 반감기 및 보다 낮은 CL을 나타냈다.
파사이트 리미티드(Pharsight Ltd)의 포에닉스(Phoenix) v6.4를 PK 분석, 모델링 및 시뮬레이션을 위해 사용하였다.
NOG 마우스에서 CEA CD3 TCB 분자의 0.5 mg/kg iv 볼루스 투여의 약동학적 파라미터
구축물 반감기 (일) CL (mL/일/kg)
분자 B 10 8.1
분자 X 6.5 19
실시예 10: MKN45 모델에서 상이한 인간화된 CEA 결합제를 포함하는 CEA CD3 TCB 분자의 항-종양 활성
CEA CD3 TCB 분자 B 및 CEA CD3 TCB 분자 X의 항-종양 활성을 위암 세포주 MKN45를 갖는 완전하게 인간화된 NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull(NOG) 마우스에서 시험하였다.
생리학적 수준의 순환하는 인간 B- 및 T- 세포를 갖는 14주령의 완전하게 인간화된 NOG 마우스를(문헌[Hayakawa et al., Stem Cells 27 (2009) 175-182]) 1 x106 MKN45 세포로(본래 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)로부터 입수함) 피하(s.c.) 주입시켰다. 평균 종양 부피가 100 mm3에 도달하였을 때, 마우스에 CEA CD3 TCB 분자 X 또는 CEA CD3 TCB 분자 B를 2.5 mg/kg의 투여량으로 2회 또는 1회/주 및 0.5 mg/kg의 투여량으로 1회/주 정맥내 투여하였다(도 21). CEA CD3 TCB 분자 B는 모든 시험된 투여량 및 일정에서 상당히 보다 강한 항-종양 활성을 나타냈다. 중요하게, CEA CD3 TCB 분자 B만이 2.5 mg/kg 및 0.5 mg/kg 처리된 군에서 검출된 무종양 마우스의 종양 퇴행을 매개할 수 있었다(도 21, 표 13).
시험 종결시(제70일) 군 당 무종양 마우스의 수
처리 종결시 무종양 마우스
(연구 제70일)
비히클 0/9
분자 X 2.5 mg/kg 2회/주 0/9
분자 B 2.5 mg/kg 2회/주 3/9
분자 X 2.5 mg/kg 1회/주 0/9
분자 B 2.5 mg/kg 1회/주 1/9
분자 X 0.5 mg/kg 1회/주 0/9
분자 B 0.5 mg/kg 1회/주 1/8
실시예 11
실시예 9에 나타낸 SDPK 데이터를 기반으로, 2-구획 모델을 NOG 마우스에서 CEA CD3 TCB 분자 B 및 CEA CD3 TCB 분자 X의 PK를 설명하기 위해 따랐다(도 22). 다음 실시예에 기재된 투여량-범위 효능 연구를 위해 선택된 상이한 투여량 수준 및 일정을 모의하였다. 도 22에 나타낸 바와 같이, CEA5 CD3 TCB 분자 B의 보다 낮은 클리어런스를 보상하기 위해, 연구의 설계를 조정하였다. CEA CD3 TCB 분자 X에 대한 투여의 빈도를 매주 2회 일정으로 증가시키고, 또한 12.5 mg/kg까지의 보다 높은 투여량 수준을 사용하였다. 모의의 프로파일은 CEA CD3 TCB 분자 X의 12.5 mg의 격주 투여량에서 노출이 0.5 mg/kg CEA CD3 TCB 분자 B와 비교하여 실질적으로 보다 높았음을 나타낸다.
실시예 12: MKN45 모델에서 상이한 인간화된 CEA 결합제를 포함하는 CEA CD3 TCB 분자를 사용한 투여량-범위 효능 연구
생체내 2개의 분자 사이의 차이의 배수를 보다 구체적으로 평가하기 위해, CEA CD3 TCB 분자 B 및 CEA CD3 TCB 분자 X를 위암 세포주 MKN45를 갖는 완전하게 인간화된 NSG 마우스에서 보다 넓은 범위의 투여량에서 시험하였다(도 23).
완전하게 인간화된 NSG 마우스에 1 x106 MKN45 세포를 피하 주입하였다. 평균 종양 부피가 180 mm3에 도달하였을 때, 마우스에게 도 23에 도시된 상이한 투여량 및 일정으로 CEA CD3 TCB 분자 B 또는 CEA CD3 TCB 분자 X를 정맥내 제공하였다. 투여량 및 일정을 실시예 11에 기재된 분석을 기반으로 선택하였다. 수득된 효능 데이터는 CEA CD3 TCB 분자 X와 비교시 CEA CD3 TCB 분자 B가 25배 이상의 유의미한 배수 차이와 더불어 보다 강한 항-종양 활성을 매개할 수 있음을 분명하게 보여준다(도 23의 그래프에서 별표로 강조됨).
실시예 13: HPAF -II 모델에서 상이한 인간화된 CEA 결합제를 포함하는 CEA CD3 TCB 분자의 항-종양 활성
CEA CD3 TCB 분자 B 및 CEA CD3 TCB 분자 X의 항-종양 활성을 인간 췌장암 세포주 HPAF-II 및 인간 말초혈 단핵 세포(PBMC)를 갖는 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스에서 시험하였다. 간략히, 암컷 NOG 마우스에게 1 x106 HPAF-II 세포로(아메리칸 타입 컬처 콜렉션(American Type Culture Collection; ATCC)으로부터 본래 입수됨) 피하(s.c.) 주입하였다. 평균 종양 부피가 150 mm3에 도달하였을 때, 마우스에게 인간 T-세포의 공급원으로서 인간 PBMC(마우스 당 10x106 세포)를 정맥내 주입으로 제공하였다. 3일 후에, 마우스에게 CEA CD3 TCB 분자 B 또는 CEA CD3 TCB 분자 X를 정맥내 2.5 mg/kg의 투여량으로 1회/주 정맥내 투여하였다. 도 24에 도시된 바와 같이, 3주의 처리 후에, 둘 다의 TCB 분자는 강한 항-종양 활성을 나타냈고, 분자 B만이 종양 퇴행을 매개할 수 있었다(연구 종결 제32일)(도 24).
실시예 14: 시노몰구스 원숭이에서 상이한 인간화된 CEA 결합제를 포함하는 CEA CD3 TCB 분자의 단일 투여량 PK
단일 투여량 약동학적 연구(SDPK)를 각각 CEA CD3 TCB 분자 B 및 CEA CD3 TCB 분자 X의 노출을 평가하기 위해 시노몰구스 원숭이에서 수행하였다(도 25). 0.01 mg/kg의 IV 볼루스 투여를 수행하고, 혈액 샘플을 약동학적 평가를 위해 선택된 시점에서 채취하였다. 특이적 면역 분석을 사용하여 CEA CD3 TCB 분자 B 및 CEA CD3 TCB 분자 X의 결합 컴피턴트(competent) 농도를 측정하였다. CEA CD3 TCB 분자 X의 경우 정량 한계(LLOQ)는 0.1 ng/ml이었고, CEA CD3 TCB 분자 B의 경우 0.44 ng/ml이었다.
2상의 쇠퇴가가 CEA CD3 TCB 분자 B의 경우 184 ± 40시간의 반감기(비구획 분석) 및 CEA CD3 TCB 분자 X의 경우 32 ± 11시간의 반감기와 함께 관찰되었다. CEA CD3 TCB 분자 B의 경우 7 ± 0.9 ml/일/kg의 클리어런스(CL) 및 CEA CD3 TCB 분자 X의 경우 25 ± 6 ml/일/kg의 클리어런스(CL)가 검출되었다. 전반적으로, CEA CD3 TCB 분자 B는 CEA CD3 TCB 분자 X와 비교하여 시노몰구스 원숭에서 IgG-유사 특성을 나타냈고 보다 긴 반감기 및 보다 느린 클리어런스를 나타냈다.
시노몰구스 원숭이(N=3)에게 0.01 mg/kg의 단일 정맥내 (볼루스) 투여 후 혈청에서 CEA CD3 TCB 분자 B의 약동학적 파라미터의 요약
ID 반감기
(시간)		 CL
(ml/일/kg)		 Cmax
(ng/ml)		 AUCINF (h*ng/ml) Vc
(ml/kg)
평균 184 7 257 33351 39
SD 40 0.9 18 4259 2
CV% 22 13 7 13 6
시노몰구스 원숭이(N=5)에게 0.01 mg/kg의 단일 정맥내 (볼루스) 투여 후 혈청에서 CEA CD3 TCB 분자 X의 약동학적 파라미터의 요약
ID 반감기
(시간)		 CL
(ml/일/kg)		 Cmax
(ng/ml)		 AUCINF (h*ng/ml) Vc
(ml/kg)
평균 32 25 321 9991 31
SD 11 6 24 2133 2
CV% 34 23 7 21 7
파사이트 리미티드의 포에닉스 v6.4를 PK 평가를 위해 사용하였다.
상기 발명이 명확한 이해를 목적으로 설명 및 실시예에 의해 다소 상세히 기재되어 있지만, 상기 설명 및 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 본원에서 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 전체가 참조로서 분명히 도입된다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Bispecific anti-CEAXCD3 T cell activating antigen binding molecules <130> P33120 <140> PCT/EP2016/073171 <141> 2016-09-29 <150> EP 15188035.8 <151> 2015-10-02 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys 50 55 60 Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp 65 70 75 80 His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr 85 90 95 Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu 100 105 110 Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met 115 120 125 Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu 130 135 140 Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys 145 150 155 160 Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn 165 170 175 Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg 180 185 190 Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 200 205 <210> 2 <211> 198 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 2 Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser 1 5 10 15 Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr 20 25 30 Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr 35 40 45 Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys 50 55 60 Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu 65 70 75 80 Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro 85 90 95 Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn 100 105 110 Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp 115 120 125 Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys 130 135 140 Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly 145 150 155 160 Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn 165 170 175 Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly 180 185 190 Leu Asn Gln Arg Arg Ile 195 <210> 3 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 VH <400> 3 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 HCDR1 <400> 4 Thr Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 HCDR2 <400> 5 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 6 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 HCDR3 <400> 6 His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 VL <400> 7 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 8 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 LCDR1 <400> 8 Gly Ser 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Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 160 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 165 170 175 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 180 185 190 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 195 200 205 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 210 215 220 Pro 225 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Asp Thr Tyr Met His 1 5 <210> 15 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 17 Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His 1 5 10 15 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 19 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 20 <211> 121 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 111 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Met Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe 20 25 30 Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Val 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Thr Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 22 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized CEA binder VH <400> 22 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized CEA binder VL <400> 23 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe 20 25 30 Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA HCDR1 <400> 24 Glu Phe Gly Met Asn 1 5 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA HCDR2 <400> 25 Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 26 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA HCDR3 <400> 26 Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 27 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA LCDR1 <400> 27 Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala 1 5 10 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA LCDR2 <400> 28 Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg 1 5 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA LCDR3 <400> 29 His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr 1 5 10 <210> 30 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA VH <400> 30 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 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420 425 430 Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 435 440 445 Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 450 455 460 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe 465 470 475 480 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 485 490 495 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 500 505 510 Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 515 520 525 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 530 535 540 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 545 550 555 560 Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 565 570 575 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 580 585 590 Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val 595 600 605 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 610 615 620 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 625 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135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu 225 230 235 240 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 245 250 255 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val 260 265 270 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Arg Ile Arg Ser 275 280 285 Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 290 295 300 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 305 310 315 320 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His 325 330 335 Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln 340 345 350 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val 355 360 365 Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser 370 375 380 Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln 385 390 395 400 Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val 405 410 415 Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu 420 425 430 Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu 435 440 445 Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 450 455 460 Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 465 470 475 480 Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 485 490 495 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 500 505 510 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 515 520 525 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 530 535 540 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 545 550 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Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 44 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 VL-CH1 <400> 44 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala 100 105 110 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 115 120 125 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 130 135 140 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 145 150 155 160 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 180 185 190 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys 195 200 205 Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 <210> 45 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CEA VL-CL <400> 45 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 46 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 HCDR2 <400> 46 Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 1 5 10 15 Val Lys Asp <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 LCDR1 <400> 47 Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn 1 5 10 <210> 48 <211> 125 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 VH <400> 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 100 105 110 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 49 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3 VL <400> 49 Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 20 25 30 Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly 35 40 45 Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala 65 70 75 80 Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 85 90 95 Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 <210> 50 <211> 674 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized CEA VH-CH1-CD3 VL-CH1-Fc (knob, P329G LALA) <400> 50 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr 225 230 235 240 Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr 245 250 255 Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp 260 265 270 Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr 275 280 285 Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu 290 295 300 Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu 305 310 315 320 Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly 325 330 335 Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 340 345 350 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 355 360 365 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 370 375 380 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 385 390 395 400 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 405 410 415 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 420 425 430 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 435 440 445 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 450 455 460 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 465 470 475 480 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 485 490 495 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 500 505 510 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 515 520 525 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 530 535 540 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro 545 550 555 560 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 565 570 575 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 580 585 590 Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 595 600 605 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 610 615 620 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 625 630 635 640 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 645 650 655 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 660 665 670 Ser Pro <210> 51 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized CEA VH-CH1-Fc (hole, P329G LALA) <400> 51 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro <210> 52 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized CEA VL-CL <400> 52 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe 20 25 30 Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 80 Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Claims (63)

  1. (a) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 모이어티; 및
    (b) 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 모이어티
    를 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자로서,
    제1 항원이 활성화 T 세포 항원이고 제2 항원이 암배 항원(CEA)이거나, 제1 항원이 CEA이고 제2 항원이 활성화 T 세포 항원이고,
    CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티가 서열번호 14의 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR) 1, 서열번호 15의 HCDR 2 및 서열번호 16의 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 특히 인간화된 중쇄 가변 영역, 및 서열번호 17의 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR) 1, 서열번호 18의 LCDR 2 및 서열번호 19의 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변 영역, 특히 인간화된 경쇄 가변 영역을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    CEA에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티가 서열번호 22의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    제1 및/또는 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 분자인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 항원 결합 모이어티가 제2 항원에 특이적으로 결합하는 Fab 분자이고, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH 또는 불변 도메인 CL 및 CH1이 서로 대체되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 항원이 CEA이고, 제2 항원이 활성화 T 세포 항원인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원이 CD3, 특히 CD3 엡실론인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티가 서열번호 4의 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 1, 서열번호 5의 중쇄 CDR 2, 서열번호 6의 중쇄 CDR 3, 서열번호 8의 경쇄 CDR 1, 서열번호 9의 경쇄 CDR 2 및 서열번호 10의 경쇄 CDR 3을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 모이어티가 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a)의 제1 항원 결합 모이어티가 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제1 Fab 분자이고, (b)의 제2 항원 결합 모이어티가, Fab 경쇄 및 Fab 중쇄의 가변 도메인 VL 및 VH가 서로 대체되는, 제2 항원에 특이적으로 결합하는 제2 Fab 분자이고;
    i) (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되거나(카바트 EU 지수에 따라 넘버링);
    ii) (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되는(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  10. 제9항에 있어서,
    (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되는(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되는(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산이 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되는(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산이 아르기닌(R)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환되는(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  14. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (a)의 제1 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환되는(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  15. 제9항에 있어서,
    (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산 또는 위치 213의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되는(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  16. 제9항 또는 제15항에 있어서,
    (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되는(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  17. 제9항, 제15항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산이 독립적으로 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산이 독립적으로 글루탐산(E) 또는 아스파르트산(D)으로 치환되는(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  18. 제9항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산이 아르기닌(R)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환되는(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  19. 제9항 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CL에서 위치 124의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링) 위치 123의 아미노산이 리신(K)으로 치환되고(카바트에 따라 넘버링), (b)의 제2 Fab 분자의 불변 도메인 CH1에서 위치 147의 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환되고(카바트 EU 지수에 따라 넘버링) 위치 213의 아미노산이 글루탐산(E)으로 치환되는(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    (c) 제1 항원에 특이적으로 결합하는 제3 항원 결합 모이어티
    를 추가로 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  21. 제20항에 있어서,
    제3 항원 결합 모이어티가 Fab 분자인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서,
    제3 항원 결합 모이어티가 제1 항원 결합 모이어티와 동일한, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및 제3 항원 결합 모이어티가 표적 세포 항원에 특이적으로 결합하고, 제2 항원 결합 모이어티가 활성화 T 세포 항원, 특히 CD3, 보다 특히 CD3 엡실론에 특이적으로 결합하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    d) 안정하게 회합할 수 있는 제1 및 제2 서브유닛으로 구성된 Fc 도메인
    을 추가로 포함하는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및 제2 항원 결합 모이어티가 임의적으로 펩티드 연결기를 통해 서로 융합되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 분자이고, 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 및 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 분자이고, 제1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  28. 제26항 또는 제27항에서,
    제1 및 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 분자이고, 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄 및 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 경쇄가 임의적으로 펩티드 연결기를 통해 서로 융합되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  29. 제24항에 있어서,
    제1 및 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 분자이고, 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  30. 제24항에 있어서,
    제1 및 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 분자이고, 제1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  31. 제24항에 있어서,
    제1 및 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 분자이고, 제1 및 제2 항원 결합 모이어티가 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  32. 제24항, 제29항 및 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    제3 항원 결합 모이어티가 Fab 분자이고 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 제1 또는 제2 서브유닛의 N-말단에 융합되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  33. 제24항에 있어서,
    제1, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티가 Fab 분자이고, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티가 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제1 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제2 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  34. 제24항에 있어서,
    제1, 제2 및 제3 항원 결합 모이어티가 Fab 분자이고, 제1 및 제3 항원 결합 모이어티가 각각 Fab 중쇄의 C-말단에서 Fc 도메인의 서브유닛 중 하나의 N-말단에 융합되고, 제2 항원 결합 모이어티가 Fab 중쇄의 C-말단에서 제1 항원 결합 모이어티의 Fab 중쇄의 N-말단에 융합되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  35. 제34항에 있어서,
    제1 및 제3 항원 결합 모이어티 및 Fc 도메인이 면역글로불린 분자의 부분, 특히 IgG 부류 면역글로불린인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  36. 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 IgG, 구체적으로 IgG1 또는 IgG4 Fc 도메인인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  37. 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 인간 Fc 도메인인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  38. 제24항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 도메인의 제1 및 제2 서브유닛의 회합을 촉진하는 변형을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  39. 제38항에 있어서,
    Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내의 캐비티에 위치할 수 있는 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내에 돌출부를 생성하고, Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 아미노산 잔기가 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기로 대체되어 제1 서브유닛의 CH3 도메인 내의 돌출부가 위치할 수 있는 제2 서브유닛의 CH3 도메인 내에 캐비티를 생성하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  40. 제39항에 있어서,
    보다 큰 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기가 아르기닌(R), 페닐알라닌(F), 티로신(Y) 및 트립토판(W)으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 보다 작은 측쇄 부피를 갖는 아미노산 잔기가 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서,
    Fc 도메인의 제1 서브유닛의 CH3 도메인에서 위치 366의 트레오닌 잔기가 트립토판 잔기로 대체되고(T366W), Fc 도메인의 제2 서브유닛의 CH3 도메인에서 위치 407의 티로신 잔기가 발린 잔기로 대체되고(Y407V), 임의적으로 Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가적으로 위치 366의 트레오닌 잔기가 세린 잔기로 대체되고(T366S), 위치 368의 류신 잔기가 알라닌 잔기로 대체되는(L368A)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인의 제1 서브유닛에서 추가적으로 위치 354의 세린 잔기가 시스테인 잔기로 대체되거나(S354C) 위치 356의 글루탐산 잔기가 시스테인 잔기로 대체되고(E356C), Fc 도메인의 제2 서브유닛에서 추가적으로 위치 349의 티로신 잔기가 시스테인 잔기로 대체되는(Y349C)(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인의 제1 서브유닛이 아미노산 치환 S354C 및 T366W를 포함하고, Fc 도메인의 제2 서브유닛이 아미노산 치환 Y349C, T366S, L368A 및 Y407V를 포함하는(카바트 EU 지수에 따라 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  44. 제24항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 천연 IgG1 Fc 도메인과 비교하여 Fc 수용체에 대한 감소된 결합 친화성 및/또는 감소된 효과기 기능을 나타내는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  45. 제24항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인이 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  46. 제45항에 있어서,
    하나 이상의 아미노산 치환이 L234, L235 및 P329로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 존재하는(카바트 EU 지수 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  47. 제24항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 도메인의 각각의 서브유닛이 활성화 Fc 수용체에 대한 결합 및/또는 효과기 기능을 감소시키는 3개의 아미노산 치환을 포함하되, 아미노산 치환이 L234A, L235A 및 P329G인(카바트 EU 지수 넘버링), T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  48. 제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc 수용체가 Fcγ 수용체인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  49. 제44항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    효과기 기능이 항체-의존성 세포-매개된 세포독성(ADCC)인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 암호화하는 하나 이상의 단리된 폴리뉴클레오티드.
  51. 제50항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 벡터, 특히 발현 벡터.
  52. 제50항에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 제51항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  53. a) T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 발현에 적합한 조건 하에 제52항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 b) 임의적으로 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 회수하는 단계를 포함하는 CEA 및 활성화 T 세포 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 제조 방법.
  54. 제53항에 따른 방법에 의해 제조된 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자.
  55. 제1항 내지 제49항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  56. 제1항 내지 제49항, 제54항 및 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    약제로서 사용하기 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물.
  57. 제1항 내지 제49항, 제54항 및 제55항 중 어느 한 항에 있어서,
    질병의 치료가 필요한 개체에서 질병의 치료에 사용하기 위한 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물.
  58. 제57항에 있어서,
    질병이 암인, T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자 또는 약학 조성물.
  59. 질병의 치료가 필요한 개체에서 질병의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 제1항 내지 제49항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자의 용도.
  60. 제1항 내지 제49항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 치료적 효과량의 조성물을 약학적으로 허용되는 형태로 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 질병의 치료 방법.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서,
    질병이 암인, 용도 또는 방법.
  62. T 세포의 존재 하에 표적 세포를 제1항 내지 제49항 및 제54항 중 어느 한 항에 따른 T 세포 활성화 이중특이적 항원 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포의 용해의 유도 방법.
  63. 상기에 기재된 바와 같은 발명.
KR1020187008947A 2015-10-02 2016-09-29 이중특이적 항-ceaxcd3 t 세포 활성화 항원 결합 분자 KR20180073561A (ko)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
CN103403025B (zh) 2011-02-28 2016-10-12 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 单价抗原结合蛋白
KR101870555B1 (ko) 2011-08-23 2018-06-22 로슈 글리카트 아게 T 세포 활성화 항원 및 종양 항원에 대해 특이적인 이중특이적 항체 및 이의 사용 방법
WO2014056783A1 (en) 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
RU2015140915A (ru) 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
MY192312A (en) 2013-02-26 2022-08-17 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
MX2016003593A (es) 2013-10-11 2016-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos de cadena ligera variable comun intercambiada de dominio multiespecifico.
PE20170263A1 (es) 2014-08-04 2017-03-30 Hoffmann La Roche Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
BR112017010324A2 (pt) 2014-11-20 2018-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag método para tratar ou retardar a progressão de um câncer em um indivíduo, moléculas, métodos para aumentar a função imune em um indivíduo e para selecionar um paciente para tratamento, kits, composição farmacêutica e usos de uma combinação de uma molécula
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
CN107849137B (zh) 2015-10-02 2021-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗ceaxcd3 t细胞活化性抗原结合分子
JP7325186B2 (ja) 2015-12-09 2023-08-14 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗薬物抗体の形成を減少させるためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体
MX2018008347A (es) 2016-01-08 2018-12-06 Hoffmann La Roche Metodos de tratamiento de canceres positivos para ace utilizando antagonistas de union a eje pd-1 y anticuerpos biespecificos anti-ace/anti-cd3.
FI3433280T3 (fi) 2016-03-22 2023-06-06 Hoffmann La Roche Proteaasin aktivoimia t-solubispesifisiä molekyylejä
EP3519437B1 (en) 2016-09-30 2021-09-08 F. Hoffmann-La Roche AG Bispecific antibodies against p95her2
EP3409322A1 (en) 2017-06-01 2018-12-05 F. Hoffmann-La Roche AG Treatment method
TWI789399B (zh) * 2017-06-22 2023-01-11 財團法人生物技術開發中心 不對稱異二聚fc-scfv融合抗globo h及抗cd3雙特異性抗體及其於癌症治療上之用途
CA3079036A1 (en) * 2017-11-01 2019-05-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with targeted ox40 agonists
AU2019218959A1 (en) 2018-02-08 2020-09-03 Genentech, Inc. Bispecific antigen-binding molecules and methods of use
US20210221908A1 (en) 2018-06-03 2021-07-22 Lamkap Bio Beta Ltd. Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
TWI829831B (zh) * 2018-12-21 2024-01-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 結合cd3之抗體
WO2020169698A1 (en) 2019-02-21 2020-08-27 F. Hoffmann-La Roche Ag Sensitization of cancer cells to tnf by bet inhibition
WO2020208124A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Treatment of cancer using a cea cd3 bispecific antibody and a wnt signaling inhibitor
EP3986924A1 (en) 2019-06-19 2022-04-27 F. Hoffmann-La Roche AG Method for the generation of a multivalent, multispecific antibody expressing cell by targeted integration of multiple expression cassettes in a defined organization
MX2021015540A (es) * 2019-06-19 2022-02-10 Hoffmann La Roche Metodo para la generacion de una celula que expresa un anticuerpo trivalente mediante la integracion dirigida de multiples casetes de expresion en una organizacion definida.
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
CN114786776A (zh) 2019-09-18 2022-07-22 拉姆卡普生物阿尔法股份公司 针对ceacam5和cd3的双特异性抗体
WO2021098822A1 (zh) * 2019-11-21 2021-05-27 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种双特异性抗体
EP3831849A1 (en) 2019-12-02 2021-06-09 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
US11179473B2 (en) 2020-02-21 2021-11-23 Silverback Therapeutics, Inc. Nectin-4 antibody conjugates and uses thereof
AU2021291011A1 (en) 2020-06-19 2023-01-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to CD3 and CD19
WO2021255146A1 (en) 2020-06-19 2021-12-23 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies binding to cd3 and cea
AU2021300362A1 (en) 2020-07-01 2023-02-23 ARS Pharmaceuticals, Inc. Anti-ASGR1 antibody conjugates and uses thereof
CR20230076A (es) 2020-07-10 2023-03-13 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a células cancerosas y dirigen radionucleótidos a dichas células
EP4055055B1 (en) 2020-12-18 2023-11-22 LamKap Bio beta AG Bispecific antibodies against ceacam5 and cd47
AU2022207615A1 (en) 2021-01-12 2023-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Split antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
EP4277668A1 (en) 2021-01-13 2023-11-22 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy
IL310578A (en) 2021-08-09 2024-03-01 Harbour Biomed Shanghai Co Ltd CLDN18.2-targeting antibody, a bispecific antibody and its use
WO2023242351A1 (en) 2022-06-16 2023-12-21 Lamkap Bio Beta Ag Combination therapy of bispecific antibodies against ceacam5 and cd47 and bispecific antibodies against ceacam5 and cd3

Family Cites Families (147)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2388385B1 (fr) 1977-04-18 1982-01-08 Hitachi Metals Ltd Piece d'ornement fixee par des aimants permanents
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
KR0184860B1 (ko) 1988-11-11 1999-04-01 메디칼 리써어치 카운실 단일영역 리간드와 이를 포함하는 수용체 및 이들의 제조방법과 이용(법)
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5081235A (en) 1989-07-26 1992-01-14 City Of Hope Chimeric anti-cea antibody
AU6290090A (en) 1989-08-29 1991-04-08 University Of Southampton Bi-or trispecific (fab)3 or (fab)4 conjugates
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
US5798100A (en) 1994-07-06 1998-08-25 Immunomedics, Inc. Multi-stage cascade boosting vaccine
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2222231A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Imclone Systems Incorporated Antibody and antibody fragments for inhibiting the growth of tumors
US7727761B2 (en) 1995-08-01 2010-06-01 Vegenics Limited Vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) protein and gene, mutants thereof, and uses thereof
FR2757863B1 (fr) 1996-12-27 1999-03-26 Inovat Sarl Nouvelles substances a activite biologique, leur procede d'obtention et les compositions en renfermant
DE69830901T2 (de) 1997-05-02 2006-05-24 Genentech Inc., San Francisco ein verfahren zur herstellung multispezifischer antikörper die heteromultimere und gemeinsame komponenten besitzen
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
ATE531812T1 (de) 1997-12-05 2011-11-15 Scripps Research Inst Humanisierung von nager-antikörpern
EP1049787B1 (en) 1998-01-23 2004-11-24 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie Multipurpose antibody derivatives
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
AU782626B2 (en) 1999-10-04 2005-08-18 Medicago Inc. Method for regulating transcription of foreign genes
ES2528794T3 (es) 2000-04-11 2015-02-12 Genentech, Inc. Anticuerpos multivalentes y usos de los mismos
US6773883B2 (en) 2000-07-31 2004-08-10 The Brigham & Women's Hospital, Inc. Prognostic classification of endometrial cancer
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
EA036531B1 (ru) 2003-11-05 2020-11-19 Роше Гликарт Аг Гуманизированное антитело типа ii к cd20 (варианты), фармацевтическая композиция, содержащая эти варианты антитела, и их применение
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
WO2005086875A2 (en) * 2004-03-11 2005-09-22 City Of Hope A humanized anti-cea t84.66 antibody and uses thereof
MXPA06011199A (es) 2004-03-31 2007-04-16 Genentech Inc Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados.
CA2885854C (en) 2004-04-13 2017-02-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-p-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
AR051836A1 (es) 2004-11-30 2007-02-14 Centocor Inc Antagonistas de receptor 3 simil toll metodos y usos
NZ556286A (en) 2005-02-07 2010-11-26 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules that bind EGFR, vectors encoding same, and uses thereof
US10011858B2 (en) 2005-03-31 2018-07-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
WO2006114115A1 (de) 2005-04-26 2006-11-02 Trion Pharma Gmbh Kombination von antikörpern mit glukokortikoiden zur behandlung von krebs
EP1888649A2 (en) 2005-05-09 2008-02-20 GlycArt Biotechnology AG Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
RU2515108C2 (ru) 2005-08-19 2014-05-10 Эббви Инк Иммуноглобулин с двойными вариабельными доменами и его применения
AU2006301492B2 (en) 2005-10-11 2011-06-09 Amgen Research (Munich) Gmbh Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
SG153825A1 (en) 2005-12-16 2009-07-29 Ibc Pharmaceuticals Inc Multivalent immunoglobulin-based bioactive assemblies
DK1976880T3 (en) 2005-12-21 2016-09-26 Amgen Res (Munich) Gmbh Pharmaceutical compositions with resistance to soluble cea
JP5463036B2 (ja) 2005-12-21 2014-04-09 アムゲン リサーチ （ミュンヘン） ゲーエムベーハー 可溶性ｃｅａに対する抵抗性を有する医薬抗体組成物
AU2007229698B9 (en) 2006-03-24 2012-11-08 Merck Patent Gmbh Engineered heterodimeric protein domains
JP2009539413A (ja) 2006-06-12 2009-11-19 トゥルビオン・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド エフェクター機能を有する単鎖多価結合タンパク質
JP2009541275A (ja) 2006-06-22 2009-11-26 ノボ・ノルデイスク・エー／エス 二重特異性抗体の生産
SI2502938T1 (sl) * 2006-10-27 2015-05-29 Genentech, Inc. Protitelesa in imunokonjugati in njihove uporabe
LT2520590T (lt) 2007-04-03 2018-09-10 Amgen Research (Munich) Gmbh Susijusioms rūšims specifinis rišantis domenas
CN109456410B (zh) 2007-04-03 2022-01-28 安进研发（慕尼黑）股份有限公司 跨物种特异性CD3-ε结合结构域
MX2009010611A (es) 2007-04-03 2010-03-26 Micromet Ag Enlazadores biespecificos, especificos para especies.
JP5490714B2 (ja) 2007-11-28 2014-05-14 メディミューン，エルエルシー タンパク質製剤
US8227577B2 (en) 2007-12-21 2012-07-24 Hoffman-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
PT2235064E (pt) 2008-01-07 2016-03-01 Amgen Inc Método de preparação de moléculas heterodiméricas de fc de anticorpos utilizando efeitos de indução eletrostática
CA2756244A1 (en) 2009-04-02 2010-10-07 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain fab fragments
MX2011010169A (es) * 2009-04-07 2011-10-11 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos anti-erbb-1/anti-c-met.
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
WO2010136172A1 (en) 2009-05-27 2010-12-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
MA33381B1 (fr) * 2009-05-28 2012-06-01 Glaxo Group Ltd Proteine de liaison a il-13
EP2261258A1 (de) 2009-06-08 2010-12-15 Schuler, Gerold MCSP-gerichtete scFv-Antikörperfragmente und deren Verwendung
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
US8703132B2 (en) 2009-06-18 2014-04-22 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific, tetravalent antigen binding proteins
BR112012003983A2 (pt) 2009-08-31 2021-09-14 Roche Glycart Ag Molecula de ligação abm moleculas de ligação de antigenos abm variante polipeptideo isolado molecula de ligação de antigeneos humanizada anticorpo polinucleotideo isolado composição vetor celula hospedeira metodo de produção de abm metodo de indução da lise celular de tumor, metodo de diagnostico de doença em pacientes que possuem um cancer metodo de aumento de tempo de sobrevivencia em pacientes que possuem um cancer metodo de indução em pacientes de regressão de um motor uso abm e invenção
US9493578B2 (en) 2009-09-02 2016-11-15 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
SI2519543T1 (sl) 2009-12-29 2016-08-31 Emergent Product Development Seattle, Llc Beljakovine, ki se vežejo s heterodimeri in njihova uporaba
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
US9527926B2 (en) 2010-05-14 2016-12-27 Rinat Neuroscience Corp. Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
AR084053A1 (es) 2010-11-30 2013-04-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapeutico que induce citotoxicidad
PE20140303A1 (es) 2011-02-10 2014-03-22 Roche Glycart Ag Polipeptidos interleuquina-2 mutantes
NZ614125A (en) 2011-03-02 2015-07-31 Roche Glycart Ag Cea antibodies
PT2691417T (pt) 2011-03-29 2018-10-31 Roche Glycart Ag Variantes de fc de anticorpos
EA201892619A1 (ru) 2011-04-29 2019-04-30 Роше Гликарт Аг Иммуноконъюгаты, содержащие мутантные полипептиды интерлейкина-2
PE20141454A1 (es) * 2011-05-06 2014-10-23 Us Gov Health & Human Serv Inmunotoxina recombinante dirigida a la mesotelina
CN103842383B (zh) 2011-05-16 2017-11-03 健能隆医药技术（上海）有限公司 多特异性fab融合蛋白及其使用方法
SG195072A1 (en) 2011-05-21 2013-12-30 Macrogenics Inc Cd3-binding molecules capable of binding to human and non-human cd3
WO2013012414A1 (en) 2011-07-18 2013-01-24 Medimmune, Llc Dosing regimens for treatment of cea-expressing cancers
US9309306B2 (en) 2011-08-23 2016-04-12 Roche Glycart Ag Anti-MCSP antibodies
US20130078250A1 (en) 2011-08-23 2013-03-28 Oliver Ast Bispecific t cell activating antigen binding molecules
KR101870555B1 (ko) 2011-08-23 2018-06-22 로슈 글리카트 아게 T 세포 활성화 항원 및 종양 항원에 대해 특이적인 이중특이적 항체 및 이의 사용 방법
RU2617970C2 (ru) 2011-08-23 2017-04-28 Рош Гликарт Аг Антитела, не содержащие fc-фрагмента, включающие два fab-фрагмента, и способы их применения
SI2748202T1 (sl) 2011-08-23 2018-10-30 Roche Glycart Ag Bispecifične molekule, ki se vežejo na antigen
CN103748114B (zh) 2011-08-23 2017-07-21 罗切格利卡特公司 T细胞活化性双特异性抗原结合分子
TW201326212A (zh) 2011-08-23 2013-07-01 Roche Glycart Ag 抗－ｍｃｓｐ抗體
EP2578230A1 (en) 2011-10-04 2013-04-10 Trion Pharma Gmbh Removal of Tumor Cells from Intraoperative Autologous Blood Salvage
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
CA2859667C (en) 2011-12-20 2022-05-24 Medimmune, Llc Modified polypeptides for bispecific antibody scaffolds
MX360109B (es) 2012-04-20 2018-10-23 Merus Nv Metodos y medios para la produccion de moleculas de tipo ig.
US20150203591A1 (en) 2012-08-02 2015-07-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mutivalent antigen-binding proteins
SG10201800535XA (en) 2012-08-07 2018-02-27 Roche Glycart Ag Composition comprising two antibodies engineered to have reduced and increased effector function
US9315567B2 (en) 2012-08-14 2016-04-19 Ibc Pharmaceuticals, Inc. T-cell redirecting bispecific antibodies for treatment of disease
JOP20200236A1 (ar) 2012-09-21 2017-06-16 Regeneron Pharma الأجسام المضادة لمضاد cd3 وجزيئات ربط الأنتيجين ثنائية التحديد التي تربط cd3 وcd20 واستخداماتها
WO2014056783A1 (en) * 2012-10-08 2014-04-17 Roche Glycart Ag Fc-free antibodies comprising two fab-fragments and methods of use
WO2014079886A1 (en) 2012-11-20 2014-05-30 Sanofi Anti-ceacam5 antibodies and uses thereof
UY35148A (es) 2012-11-21 2014-05-30 Amgen Inc Immunoglobulinas heterodiméricas
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AU2014205086B2 (en) 2013-01-14 2019-04-18 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
JP6636803B2 (ja) 2013-02-05 2020-01-29 エンクマフ エスアーエールエル Ｂｃｍａに対する抗体の選択のための方法
JO3529B1 (ar) 2013-02-08 2020-07-05 Amgen Res Munich Gmbh مضاد التصاق خلايا الدم البيض من أجل التخفيف من الاثار السلبية الممكنة الناتجة عن مجالات ارتباط cd3- المحدد
EP2961770A1 (en) * 2013-02-26 2016-01-06 Roche Glycart AG Bispecific t cell activating antigen binding molecules
MY192312A (en) 2013-02-26 2022-08-17 Roche Glycart Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
RU2015140915A (ru) * 2013-02-26 2017-04-03 Роше Гликарт Аг Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, активирующие т-клетки
WO2014153164A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 The California Institute For Biomedical Research Targeting agent antibody conjugates and uses thereof
SG11201506499YA (en) 2013-03-15 2015-09-29 Glaxosmithkline Ip No 2 Ltd Low concentration antibody formulations
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US20140302037A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
EP2789630A1 (en) 2013-04-09 2014-10-15 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3e and ROR1
SG11201509361TA (en) 2013-05-28 2015-12-30 Numab Ag Novel antibodies
EP3083692B1 (en) 2013-12-17 2020-02-19 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating her2-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-her2 antibodies
DK3083689T3 (da) 2013-12-17 2020-08-03 Genentech Inc Anti-CD3-antistoffer og fremgangsmåder til anvendelse
EP3092251B1 (en) * 2014-01-06 2021-01-20 F. Hoffmann-La Roche AG Monovalent blood brain barrier shuttle modules
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
PE20170263A1 (es) * 2014-08-04 2017-03-30 Hoffmann La Roche Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
WO2016019969A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Ludwig-Maximilians-Universität München Subcutaneously administered bispecific antibodies for use in the treatment of cancer
WO2016030350A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy of tumor-targeted il-2 variant immunocytokines and antibodies against human pd-l1
WO2016036678A1 (en) 2014-09-02 2016-03-10 Medimmune, Llc Formulations of bispecific antibodies
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
AU2015329966A1 (en) 2014-10-09 2017-04-27 Engmab Sàrl Bispecific antibodies against CD3epsilon and ROR1 for use in the treatment of ovarian cancer
ES2850325T3 (es) 2014-10-09 2021-08-27 Engmab Sarl Anticuerpos biespecíficos contra CD3epsilon y ROR1
EP3224275B1 (en) * 2014-11-14 2020-03-04 F.Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding molecules comprising a tnf family ligand trimer
PL3221357T3 (pl) 2014-11-20 2020-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Wspólne łańcuchy lekkie i sposoby zastosowania
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
MX2017006571A (es) 2014-11-20 2017-09-29 Hoffmann La Roche Moleculas de union a antigeno biespecificas activadoras de celulas t.
EP3029068A1 (en) 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
JP2018520642A (ja) 2015-05-01 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド マスク抗ｃｄ３抗体及びその使用方法
TWI731861B (zh) 2015-06-16 2021-07-01 美商建南德克公司 FcRH5之人源化及親和力成熟抗體及使用方法
SI3331910T1 (sl) 2015-08-03 2020-07-31 Engmab Sarl Monoklonska protitelesa proti humani antigen dozorevanja limfocitov B (BCMA)
US20170096485A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific t cell activating antigen binding molecules
CN107849137B (zh) 2015-10-02 2021-11-26 豪夫迈·罗氏有限公司 双特异性抗ceaxcd3 t细胞活化性抗原结合分子
WO2017055318A1 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Cd33xcd3 bispecific t cell activating antigen binding molecules
WO2017055388A2 (en) 2015-10-02 2017-04-06 F. Hoffmann-La Roche Ag Bispecific t cell activating antigen binding molecules
JP6937746B2 (ja) 2015-10-02 2021-09-22 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 二重特異性抗ｃｄ１９×ｃｄ３ｔ細胞活性化抗原結合分子
JP7325186B2 (ja) * 2015-12-09 2023-08-14 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗薬物抗体の形成を減少させるためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体

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