JP5463036B2 - 可溶性ceaに対する抵抗性を有する医薬抗体組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、可溶性CEAに対する抵抗性を有する医薬抗体組成物に関する。
ゴールドおよびフリードマンが最初にヒト結腸癌組織抽出物における腫瘍関連癌胎児性抗原(CEA)を記載してから30年以上が経過した(Gold and Freedman; J. Exp. Med. 122 (1965); 467-481)。
その間、CEA遺伝子ファミリーに関連する28のその他の遺伝子/偽遺伝子が見出された。CEA遺伝子ファミリーのメンバーに用いる命名を簡略化するために、該ファミリーは最近「CEA関連細胞接着分子」(CEACAM)と改名され、そのメンバーの命名が統一された(Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249)。例えば、この命名に従って、ヒトCEA(CD66e)はCEACAM5と名付けられる。
ヒトCEA遺伝子ファミリーは、染色体19q13.2の上に集まる(Olsen et al., Genomics 23 (1994); 659-668)。その29遺伝子および偽遺伝子は3つのサブグループ、すなわち、7つの発現遺伝子を含有するCEAサブグループ、11の発現遺伝子を含有する妊娠特異的糖タンパク質(PSG)サブグループおよび偽遺伝子のみを含有する第3のサブグループに分割することができる(Hammarstroem, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Beauchemin, Exp. Cell Res. 252 (1999), 243-249)。CEAのアミノ酸配列および他のファミリーメンバーの解析により、それらが免疫グロブリン(Ig)スーパーファミリーに属することが明らかとなった(Williams and Barclay, Annul. Rev. Immunol. 6 (1988), 381-405)。CEAサブグループの全てのメンバーは細胞表面膜に付着している。胆汁糖タンパク質(CEACAM1;BGP1;TM−CEA;CD66a)、CEA遺伝子ファミリーメンバー1(CEACAM3;CGM1;CD66d)およびCEA遺伝子ファミリーメンバー7(CEACAM4;CGM7)は疎水性の膜貫通ドメインを有するのに対し、癌胎児性抗原(癌胎児性抗原関連細胞接着分子5;CEACAM5;CEA;CD66e)、非特異的交差反応性抗原(CEACAM6;NCA;NCA−50/90;CD66c)、CEA遺伝子ファミリーメンバー2(CEACAM7;CGM2)およびCEA遺伝子ファミリーメンバー6(CEACAM8;CGM6;CD66b)はグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)脂質部分によって血漿膜と繋がれている。CEAタンパク質は、Igドメインの数に応じて約300kDaまでの分子量で高度にグリコシル化されている。
CEAタンパク質の生物活性に関して、腫瘍細胞株を用いるインビトロ研究から、胆汁糖タンパク質、CEAおよび非特異的交差反応性抗原を含むいくつかのCEAサブファミリーは、腫瘍細胞表面に発現すると、同種親和性の異型細胞接着分子として作用することができることが示唆された(Oikawa et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 186 (1992), 881-887;Zhou et al., Cancer Res. 53 (1993), 3817-3822)。より最近には、微生物による攻撃から結腸を守る自然免疫応答におけるCEAおよび非特異的交差反応抗原の可能性のある役割が考察されている(Hammarstroem and Baranov, Trends Microbiol. 9 (2001), p. 119-125)。特に、これらのタンパク質は微生物と結合および捕獲することにより、それらが微絨毛の上皮細胞に到達し、侵入することを防ぐことが提唱されている。
CEAは、胎児期の間に発現し、健常成人には存在せず、再び癌に発現する癌胎児性抗原であると仮定された。しかし、CEAは、正常成人組織にも発現する。例えば、胆汁糖タンパク質、CEA、非特異的交差反応性抗原およびCEA遺伝子ファミリーメンバー2は、正常ヒト結腸に、特に腸管内腔に面している成熟した円柱上皮細胞におよび陰窩口(crypt mouth)で高度に分化した細胞に発現する(Fraengsmyr et al., Cancer Res. 55 (1995), 2963-2967;Fraengsmyr et al., Tumor Biol. 20 (1999), 277-292)。より具体的には、これらのタンパク質は、フリーな管腔表面の内側を覆う成熟した結腸細胞の刷子縁多糖外被に局在する。胆汁糖タンパク質、CEAおよび非特異的交差反応性抗原はまた、多数の上皮性起源の腫瘍にも発現する(Hammarstriem, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Shively and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355-399)。
既に1970年代後半および1980年代前半に、CEAは結腸直腸およびその他の上皮腫瘍の放射免疫学的局在に好まれる標的抗原となった。これは、CEAが胃腸癌および膵臓癌の95%に、ならびに大部分の小細胞および非小細胞肺癌腫に過剰発現するという事実に起因する。また、それは乳癌ならびに頭部および頚部の扁平上皮癌にも発現する(Primus et al., Cancer 42 (1978), 1540-1545)。実際に、CEAは最も広く用いられている臨床腫瘍マーカーの1つである。それは、その安定性、正常成人組織での相当に制限された発現、ならびに上皮性起源の腫瘍での高度な発現のために、結腸直腸癌およびその他のいくつかの癌の血清腫瘍マーカーとして用いられている。健康な個体においてCEAの大半は結腸で産生される。そこでそれは成熟した円柱細胞の頂端膜側から腸管内腔に放出され、糞便の中で消失する。従って、健康な個体からは、血液中に極めて低いレベルしか通常見出されない。例えば、健康な個体の血液中のCEAレベルは2μg/l未満である。それに対して、結腸直腸癌およびその他の癌腫の患者からの血清中のCEAレベルは2000μg/lを超える範囲まで増加している(Thomson et al., PNAS 64 (1969), 161-167)。特に、進行性、悪性、または後期の上皮腫瘍は、しばしば高い血清濃度の可溶性CEAを伴う(Fletcher; Ann. Intern. Med. 104 (1986), 66-73)。CEAを含む血漿膜からの成分は、血漿膜由来小胞のように表面から継続的に剥脱することが知られ(Taylor and Black, J. Natl. Cancer Inst. 74 (1985), 859-866;Sack et al., J Clin Invest. 82 (1988), 586-93)、それはリンパ管および血管を流れて最後に血液に行き着き得る。腫瘍サイズが増大するにつれて、より多くのCEAが血液に蓄積する。腫瘍マーカーとしての血清CEA決定の主な用途は、結腸癌の手術後のサーベイランスにある。増加したCEAレベルは、患者のそれぞれ81%(Minton et al., Cancer 55 (1985), 1284-1290)および89%(Wanebo et al., Surg. Gynecol. Obstet. 169 (1989), 479-487)において、再発性疾患の最初の指標であった。血清CEAレベルはまた、予後指標としても用いることができる(Mulcahy and Benson, Curr. Oncol. Rep. 1 (1999), 168-172)。
多くの上皮癌でのその過剰発現に起因して、CEAは腫瘍マーカーとして用いられるだけでなく、抗腫瘍療法の標的としても用いられる。例えば、胃腸癌は高い割合のヒト上皮腫瘍の原因であり、米国において2001年の胃癌の新規症例は21,700、結腸直腸癌の新規症例は135,400と推定される(Greenlee; CA Cancer J Clin 51 (2001), 15-36)。結腸直腸癌は3番目に頻度の高い悪性腫瘍であり、男性および女性の両方において癌死の3番目の主な原因である(Ries; Cancer 88 (2000), 2398-2424)。これらの腫瘍に対する新規な治療法を見出すために、抗CEAモノクローナル抗体がCEA陽性癌の可能性のある治療法として調査されてきた(Murakami et al., Immunol. Invest. 25 (1996), 23-35)。
腫瘍量の少ない患者(低い血清CEAレベルに相当する)が首尾よく治療を受けるアプローチの一例は、ベアらによって行われた研究である。このアプローチでは、ラベツズマブ(labetuzumab)(ラベツズマブは、ヒト化形態の抗CEAモノクローナル抗体MN−14である;Behr et al., Cancer, 94: 1373-1381, (2002), 1559-64)の131I標識変異体が、5−フルオロウラシルおよびフォリン酸に、または肝転移後のアジュバント・セッティングに対して化学療法抵抗性の、少量の転移性疾患を有する30名のCRC患者が登録された第II相試験において分析された。131I標識ラベツズマブの単回注射が行われた。評価可能な19名の患者のうち、3名が部分的緩解を有し、8名がわずかな応答を15ヶ月まで持続して示した。アジュバント・セッティングにおいて、9名のうち7名の患者が3年間まで疾患に罹らなかったのに対して、対照群の再発率は同じ期間で67%であった。患者の血清CEAレベルは3.9〜45ng/mlの範囲であった(Behr et al., Cancer, 94: 1373-1381, 2002)。CEA血清レベルの低い(<5ng/ml)患者を特徴とする別の研究では、131I−ラベツズマブ(上記引用文中)を用いるCEAの放射免疫療法は、肝臓における結腸直腸癌転移の救済切除(salvage resection)後の生存を向上したことが示された。23名の患者に40〜60mCi/m2 131I−ラベツズマブの用量が投与された。5年生存率は、それぞれ処置群について51.3%、対照群について7.4%であった(Liersch et al., JCO, 2005, ASCO Proc, Vol 23, No 16S: 3627)。
けれども、高い血清CEA濃度に対応する治療的アプローチは、しばしば低いかまたは全くない抗腫瘍応答という結果をもたらした。例えば、ウォン(Clin. Cancer Res. 6 (2000): 3855-3863)は、転移性CEAを産生する悪性腫瘍を有する患者において前記抗体を評価するために、第I相放射免疫治療試験において、CEAに対して高い親和特異性を有する、遺伝子操作された90Y標識ヒト/マウスキメラIgG T84.66抗体を用いた。22名の患者が、111In標識抗体に続いて90Y標識キメラ抗体の診断投与からなる1回の治療サイクルを受けた(3名の患者だけが2〜3サイクルを受けた)。主な抗腫瘍応答は見出されなかった。16名の患者はヒト抗キメラ抗体(HACA)を生じた。この研究に登録した患者における可溶性CEAレベルの範囲は14.8〜1027ng/ml(中央値97ng/ml)であった。追跡調査では、同じ抗体を5−フルオロ−ウラシル(5−FU)との併用療法に用いた。この第I相併用試験では、21名の化学療法抵抗性の転移性結腸直腸癌患者に5−FUおよび90Y−cT84.66が投与された。客観的反応は観察されなかった。平均血清CEAレベルは227.4ng/mlであり、<2.5〜1305ng/mlの範囲であった(Wong, Clin Cancer Res, 9 (2003): 5842-5852)。ハヤールらによる別の研究では、ヨウ素−131−標識ヒト化MN−14抗CEAモノクローナル抗体が転移性胃腸および結腸直腸癌患者において評価された。この第I相試験では、21名の患者が、事前の外部照射後または標準的な化学療法後のいずれかに抗体で処置された。21名のうち7名の患者がヒト抗ヒト抗体(HAHA)を有したが、有害作用はなかった。抗腫瘍応答は観察されなかった。この場合もやはり、上昇した血漿CEAレベルが抗CEA抗体アプローチの治療効果を妨げることが見出された(Hajjar et al., Clin Colorectal Cancer, 2 (2002), 31-42)。
上に述べた課題を考慮すると、進行性、悪性、または後期上皮腫瘍のための効果的な治療法のための手段および方法の提供が大いに望まれる。
従って、本発明の一態様は、ヒトにおける上皮腫瘍の治療のための医薬組成物に関し、前記医薬組成物はヒトCEAと特異的に結合するIgG1抗体を含み、前記IgG1抗体の可変領域は少なくとも、
(a)アミノ酸配列「SYWMH」(配列番号29)を有するCDR−H1と、アミノ酸配列「FIRNKANGGTTEYAASVKG」(配列番号28)を有するCDR−H2と、アミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を有するCDR−H3、および
(b)アミノ酸配列「TYAMH」(配列番号31)を有するCDR−H1と、アミノ酸配列「LISNDGSNKYYADSVKG」(配列番号30)を有するCDR−H2と、アミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を有するCDR−H3
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
アミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)は、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当する(Chester, Int. J. Cancer 57 (1994), 67-72; Harwood, Br J Cancer. 54 (1986), 75-82)。
本発明の医薬組成物の好ましい実施形態では、本明細書に定義されるIgG1抗体の前記可変領域は、アミノ酸配列「TLRRGINVGAYSIY」(配列番号34)を有するCDR−L1および/またはアミノ酸配列「YKSDSDKQQGS」(配列番号33)を有するCDR−L2および/またはアミノ酸配列「MIWHSGASAV」(配列番号32)を有するCDR−L3を含む。
CDRの決定は当業者に公知である;例えば、http://www.bioinf.org.uk/abs/#cdrid参照。抗体中のアミノ酸配列の番号付けは、例えば、当分野に記載されるKabatの番号付けスキームに従って行ってよい;例えば、Kabat, E.A., T.T.Wu, H.M.Perry, K. S. Gottesman, and C. Foeller.1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine参照。
本発明は、その血清/血漿中の可溶性CEA濃度の高い患者における上皮腫瘍の治療に特に適した手段および方法を提供する。このような高い可溶性CEA濃度は、進行性腫瘍、再発性、転移性、後期腫瘍を有する上皮腫瘍患者および腫瘍量の多い患者の血清/血漿に見出される。上記に定義される可変領域を含むヒトCEAと特異的に結合するIgG1抗体は、CEA陽性の標的細胞と結合するだけでなく、可溶性CEAとも結合することが見出されている;本発明の実施例5参照。驚くことに、可溶性CEAと結合するにもかかわらず、本発明のIgG1抗体は、高い濃度の可溶性CEAの存在下でさえもCEAを有する腫瘍細胞を死滅させる。言い換えれば、前記IgG1抗体構築物は、可溶性CEAによって、CEA陽性の腫瘍細胞に対するそれらの細胞障害活性(抗体依存性細胞障害活性;ADCC)を阻害されない。例えば、実施例5は、漸増量の可溶性CEA抗原の存在下での、上記に定義されるCEA反応性のIgG1抗体構築物のKato III細胞(CEA陽性のヒト胃癌腫細胞株)に対する細胞障害活性を示す。従って、本明細書に定義されるIgG1抗体に媒介される細胞障害活性は可溶性CEAに抵抗性である。本明細書に定義される本発明のIgG1抗体は、マウスモノクローナル抗体A5B7のKabatの位置95〜102に相当するCDR−H3「DRGLRFYFDY」(配列番号27)アミノ酸配列を含む上記のCDR−H領域を有する可変領域を含む(Chester;Harwood;上記引用文中)。このモノクローナル抗体はまた、膜結合と可溶性CEAの両方と結合する(自己データ)。アミノ酸配列「DRGLRFYFDY」は、本明細書に定義されるヒト化抗CEA IgG1抗体の可変領域で用いられる場合、可溶性CEAに対する抵抗性を媒介することが見出された;実施例5参照。
その一方、実施例2に示されるように、huIgG1 CEA IIに媒介される細胞障害活性は、漸増量の可溶性CEAにより阻害される。huIgG1 CEA IIの可変領域は、mAb T84.66に由来する(Neumaier, Cancer Res. 50 (1990), 2128-2134)。huIgG1 CEA IIは可溶性CEAと結合することが見出されているので、可溶性CEA抗原は、抗体がその抗体に媒介される細胞障害活性を発揮することを阻止するということが結論付けられた。T84.66由来のIgG1構築物について得られた結果を鑑みると、可溶性CEAがA5B7由来の抗体構築物において細胞障害活性を阻害しないことは予測されなかった。より具体的に言えば、可溶性CEA抗原に対する抵抗性は、その可変領域がマウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」を含むIgG1抗体についてのみ、見出すことができた(Chester、上記引用文中;Harwood, Br J Cancer. 54 (1986), 75-82)。
上記に示したように、ヒトにおけるCEAを有する上皮腫瘍に対して向けられる多くの治療的アプローチは、癌患者の血漿中の高いレベルの可溶性CEA抗原の存在により著しく妨害される。可溶性CEA抗原は、しばしば進行性腫瘍、再発性癌、転移性腫瘍、大きい腫瘍量、または後期腫瘍の癌患者の血清中に高い濃度で存在し、CEA陽性の腫瘍細胞に対して向けられる治療薬を阻害し、従って腫瘍細胞認識および破壊を妨げる。従って、腫瘍に到達する治療薬の実際量は減少し、その結果低下した低い抗腫瘍活性をもたらすか、または実に抗腫瘍活性を全くもたらさない。この制限は、今までのところ、例えば、治療的な腫瘍細胞の相互作用を妨げるとは思われない可溶性CEA抗原を非常に低い血清レベルで有する患者に対する抗体に基づくアプローチを制限する。現在のCEA特異的Ig分子を用いる治療的アプローチは、高い血清レベルの可溶性CEAを有する患者において抗腫瘍活性を示さない。
本発明において、腫瘍細胞に対して向けられる細胞障害(ADCC)活性が、さらに高い濃度の可溶性CEA抗原に抵抗性である、ヒトCEAに対する特異性を有する抗体治療薬を生成することが可能であることが見出された。この知見は、本発明のIgG1抗体が可溶性CEA抗原と結合するという事実(実施例5参照)を考えると全く予想外である。それにもかかわらず、本明細書に定義されるIgG1抗体は、腫瘍細胞に対するそれらの細胞障害活性においてさらに高いレベルの可溶性CEAの存在に抵抗性である。従って、本発明は、(例えば腫瘍進行中に)観察される血漿中の可溶性CEA濃度の高い腫瘍患者の治療に、再発性癌に、転移に、腫瘍量が多い患者に、または後期腫瘍に特に適した手段および方法を提供する。
この知見を鑑みると、以下の本発明の医薬組成物中のIgG1抗体は、可溶性CEA抗原に対して抵抗性であるとみなされる。用語「可溶性CEA抗原に対する抵抗性」、「可溶性CEAに対して抵抗性である」(または関連語)は、本明細書において、前記IgG1抗体により媒介されるCEA陽性の腫瘍細胞に対する細胞障害活性が、漸増濃度の可溶性CEAにより影響されないという事実を指す。特に、細胞障害活性は、さらに高い濃度の可溶性CEAにより阻害されない。上記に示したように、健康な個体の血液中のCEAレベルは2ng/ml未満である。腫瘍患者の血清/血漿中の可溶性CEA濃度が高いことは、進行性腫瘍、再発性腫瘍、転移性腫瘍、または後期腫瘍、さらに腫瘍量の多い患者の特徴である。従って、本発明は、その血漿中にこのような高い可溶性CEA濃度を有する上皮腫瘍患者の治療に特に適した手段および方法を提供する。用語「高い可溶性CEA濃度」は、本明細書において、10、20、50、70、80、90または100ng/mlよりも高い可溶性の血清/血漿CEA濃度を示す。血清/血漿CEA濃度は、特に、ELISA法により測定されてよい。好ましくは、 前記可溶性血清/血漿CEA濃度は、例えばELISAで測定して100ng/mlよりも高い。CEA血清中濃度は、例えばCEA ELISAアッセイにより測定することができる(例えば、IBL CEA EIA、IBL Hamburg,Germany参照)。
本発明によれば、用語「医薬組成物」は、ヒト患者への投与のための組成物に関する。好ましくは、医薬組成物は、担体、安定剤および/または賦形剤からなる適した製剤を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、非経口、経皮、管腔内、動脈内、くも膜下腔内および/または鼻腔内投与のための、または組織への直接注射による組成物を含む。前記組成物は、注入または注射によって患者へ投与されることが特に想定される。適した組成物の投与は、様々な方法によって、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与によって達成されてよい。本発明の組成物は、製薬上許容される担体をさらに含んでよい。適した医薬担体の例は当分野で周知であり、それにはリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液、リポソームなどが含まれる。このような担体を含む組成物は、周知の従来法によって処方されてよい。これらの組成物は、被験体に適した用量で投与することができ、それは、本明細書に記載される可溶性血清CEA抗原に対して抵抗性を示すIgG1抗体の漸増用量の投与による用量漸増試験により決定することができる。上記に示したように、本明細書に記載される、可溶性血清CEA抗原に対する抵抗性を有するIgG1抗体は、高いCEA血清中濃度を有する癌患者、例えば、進行性腫瘍、再発性癌、転移性腫瘍、腫瘍量の大きな腫瘍、または後期腫瘍の治療に有利に用いることができる。これらの組成物はまた、その他のタンパク質性および非タンパク質性薬剤と組み合わせて、例えば併用療法(co-therapy)の形で投与することができる。これらの薬剤は、本明細書に定義されるIgG1抗体を含む組成物と同時に投与してもよいし、前記IgG1抗体の投与の前後に適時に定められた間隔および用量で別々に投与してもよい。投与計画は主治医および臨床学的要因により決定される。医学分野で周知のように、任意の患者一人への投薬量は多くの要因によって決まり、それには患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、全体的な健康状態、および同時に投与されるその他の薬剤が含まれる。非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液または非水溶液、および懸濁液が挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用の有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、水、水溶液、または生理食塩水および緩衝媒体を含む懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、または乳酸化リンゲル液が挙げられる。静脈内媒体としては、液体および栄養素補充液、電解質補充液(リンゲルデキストロースに基づくものなど)などが挙げられる。防腐剤およびその他の添加剤も存在してよく、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが挙げられる。さらに、本発明の組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体を含んでもよい。併用療法は、本明細書に定義されるIgG1抗体に加えて、組成物の意図される使用によって、さらなる生物活性物質を含むことが想定される。このような物質は、胃腸管系に作用する薬剤、抗悪性腫瘍薬として作用する薬剤、化学療法薬、細胞増殖抑制剤(cytostatica)、高尿酸血症を予防する薬剤、免疫反応を阻害する薬剤(例えばコルチコステロイド)、炎症応答を調節する薬剤、循環系に作用する薬剤および/またはサイトカインなどの当分野で公知の薬剤であってよい。
好ましくは、本明細書に定義されるIgG1抗体は、緩衝液、安定剤および界面活性剤中に処方される。緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液または酢酸緩衝液であってよい。安定剤は、アミノ酸および/または糖であってよい。界面活性剤は、合成洗剤、PEGなどであってよい。より好ましくは、本明細書に定義されるIgG1抗体は、クエン酸塩、リシン、トレハロースおよびTween80中に処方される。本発明の医薬組成物の希釈液として、等張生理食塩水およびTween80が好ましい。
本明細書において、「抗体」は、免疫グロブリン分子、すなわち抗原、好ましくはヒトCEAと免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を示す。全ての抗体は同じ方法で構築される。それらは対になった重および軽ポリペプチド鎖を形成し、免疫グロブリンという総称はこのようなタンパク質全てに用いられる。しかし、この一般的なカテゴリーの中で、5つの異なるクラスの免疫グロブリン(IgM、IgD、IgG、IgA、およびIgE)を、それらのC領域により識別することができる。IgG抗体は大きな分子で、分子量は約150kDaであり、2つの異なる種類のポリペプチド鎖からなる。その約50kDaの一方は、重鎖またはH鎖と称され、25kDaのもう一方は、軽鎖またはL鎖と称される。各IgG分子は2本の重鎖と2本の軽鎖からなる。2本の重鎖は互いにジスルフィド結合によって連結され、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖と連結されている。どのような任意の免疫グロブリン分子においても、2本の重鎖と2本の軽鎖は同一であり、抗体分子に2つの同一の抗原結合部位をもたらし、従って同時に2つの同一構造と結合する能力をもたらす。λおよびκと称される2種類の軽鎖が抗体中に見出される。λ鎖またはκ鎖のいずれかを有する所与の免疫グロブリンは、2本とも同じものである。λまたはκ軽鎖を有する抗体間で機能的な差は見出されず、いずれの種類の軽鎖も5つの主なクラスのいずれかの抗体に見出すことができる。2種類の軽鎖の比は種ごとに異なる。マウスでは、平均のκ:λ比は20:1であり、それに対してヒトでは2:1、さらにウシでは1:20である。この変異の理由は不明である。一方、クラス、および従って抗体のエフェクター機能は、その重鎖の構造により定義される。5つの主な重鎖クラスまたはアイソタイプがあり、その一部はいくつかのサブタイプを有し、これらが抗体分子の機能活性を決定する。免疫グロブリンの5つの主なクラスは、免疫グロブリンM(IgM)、免疫グロブリンD(IgD)、免疫グロブリンG(IgG)、免疫グロブリンA(IgA)、および免疫グロブリンE(IgE)である。それらの重鎖は対応する小文字のギリシャ文字(それぞれμ、δ、γ、α、およびε)で示される。IgGは群を抜いて最も豊富な免疫グロブリンであり、いくつかのサブクラス(ヒトにおいてIgG1、2、3、および4)を有する。それらの独特の機能特性は、軽鎖と関連しない、重鎖のカルボキシ末端部分により与えられる。全てのアイソタイプの一般的な構造上の特徴は類似している。血漿中で最も豊富なアイソタイプであるIgG抗体の構造を、典型的な抗体分子として図1に例示する。
好ましくは、本明細書に定義される抗体はIgG抗体である。当分野で周知のように、IgGは、高度に差別的な抗原認識および結合を担う抗体可変領域だけでなく、通常内因的に産生された抗体中に存在する抗体ポリペプチドの重鎖および軽鎖の定常領域を含み、一部の例では、炭水化物を含む1またはそれ以上の部位での修飾までも含む。このようなグリコシル化は一般にIgG型の顕著な特徴であり、これらの定常領域の部分は、インビボで様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性(ADCC)などを引き出すことが知られている完全抗体(full antibody)のいわゆるFc領域を構成する。さらに、Fc領域はIgGとFc受容体の結合を媒介し、従ってインビボでの半減期を長くすると同時にFc受容体の存在の増加した位置へのIgGのホーミングを促進する。有利には、IgG抗体は、ヒトCEA抗原と特異的に結合するIgG1抗体(それらのインビボでの作用機序は特に十分理解され、特徴づけられているために好まれる型である)である。これは特にIgG1抗体の場合である。
本明細書において称されるIgG1抗体は、上記に定義される可変領域を、ヒンジ領域、CH1、CH2、およびCH3ドメインおよびCLドメインの全部または一部と併せて含む;例えば図1参照。一般に、可変領域において、VHドメインはVLドメインと対になって抗体の抗原結合部位を提供する。好ましくは、(i)アミノ酸配列「SYWMH」(配列番号29)を有するCDR−H1と、アミノ酸配列「FIRNKANGGTTEYAASVKG」(配列番号28)を有するCDR−H2と、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を有するCDR−H3、または(ii)アミノ酸配列「TYAMH」(配列番号31)を有するCDR−H1と、アミノ酸配列「LISNDGSNKYYADSVKG」(配列番号30)を有するCDR−H2と、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を有するCDR−H3を含むVHドメインは、アミノ酸配列「TLRRGINVGAYSIY」(配列番号34)を有するCDR−L1と、アミノ酸配列「YKSDSDKQQGS」(配列番号33)を有するCDR−L2と、アミノ酸配列「MIWHSGASAV」(配列番号32)を有するCDR−L3を含むVLドメインと、言及されるVHドメインのうちの1つと前記VLドメインを含む抗体の抗原結合部位が形成されるように対となる。本明細書に定義される抗CEA IgG1抗体は、げっ歯類抗体(すなわち、マウスまたはラット起源)である。好ましくは、前記IgG1抗体は、下記により詳細に示されるように、ヒト化抗体である。
本発明によれば、Ig由来抗原の相互作用と関連して用いられる、用語「結合ドメイン」または「可変領域」は、抗体、抗体断片またはその誘導体に由来する1つのCDRを少なくとも含むポリペプチドの断片および誘導体を含む。本発明により、本明細書に定義されるIgG1抗体のヒトCEAと特異的に結合する結合ドメインは、少なくとも1つのCDR、好ましくはCDR−H3、より好ましくはA5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を含むマウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3を含むことが想定される。以下の実施例に示されるように、前記mAb A5B7由来CDR−H3「DRGLRFYFDY」(配列番号27)アミノ酸配列を含む、本明細書に定義されるIgG1抗体の腫瘍細胞に対する細胞障害活性は、可溶性CEA抗原に対して抵抗性があり、それにより、その血漿中の血清CEA濃度の高い腫瘍患者の治療を可能にする。
本明細書において、「ヒト」とは、種Homo sapiensを指す。「ヒト」分子、例えばヒトCEAは、従って、Homo sapiensにおいて天然に発現するその分子の変異体である。
用語「上皮腫瘍」とは、本明細書において、CEA陽性である上皮性起源の腫瘍を意味する(Cancer Medicine;6th ed.; Kufe, Donald W.; Pollock, Raphael E.; Weichselbaum, Ralph R.; Bast, Robert C., Jr.; Gansler, Ted S.; Holland, James F.; Frei III, Emil., editors. Hamilton (Canada): BC Decker Inc. 2003;http://www.dkfz.de: HYPERLINK "http://www.krebsinformationsdienst.de/Krebsarten/index.html" http://www.krebsinformationsdienst.de/Krebsarten/index.html)。治療し得る上皮腫瘍は、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である。前記胃腸腺癌は、好ましくは結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である。本明細書に示されるように、本発明の医薬組成物は、腫瘍患者の血清/血漿中の高レベルの可溶性CEA抗原を特徴とする、進行性腫瘍、転移、再発性癌、後期上皮腫瘍、上皮腫瘍量の多い患者、またはCEA血清中濃度が100ng/mlより高い腫瘍患者(例えばELISAにより測定)の治療に特に有利である。前記医薬組成物が原発腫瘍の外科切除の後に投与されることも本発明の範囲内である。例えば、CEA産生上皮腫瘍に由来する散在性の(disseminated)残存腫瘍細胞も、CEAをそれらの微小環境に流し、その周囲では可溶性CEAのレベルが高い。従って、本明細書に定義されるIgG1抗体の細胞障害活性の可溶性CEAに対する抵抗性は、最小残存病変の治療にも有利である。従って、本明細書に定義されるIgG1抗体は、残りの腫瘍細胞を死滅させるために、(CEA源、すなわち原発腫瘍の除去によって)血清CEAレベルの低下する期間に投与し得ることが想定される。または、本明細書に定義されるIgG1抗体は、二次性腫瘍または転移の形成によって血清CEAレベルが増大する場合に、原発腫瘍の除去後に有用であり得る。CEA血清中濃度は、例えばCEA ELISAアッセイ(例えばIBL CEA EIA、IBL Hamburg,Germany参照)により決定することができる。上記に示したように、多くの抗体に基づく治療的アプローチにおいて、前記血清CEAは、抗体と腫瘍細胞上の膜結合CEAの結合を阻害し、抗体の活性を遮断し、それにより抗腫瘍療法の成功を悪化させる。
本明細書において、用語「特異的に結合する」または「特異的結合」または「〜との/〜に対する特異的反応性」などの関連表現は、本明細書に定義されるIgG1抗体の結合ドメインの、可能な結合パートナーとしての複数の異なる分子のプールから、前記それぞれの第1および/または第2の分子にのみ結合する、あるいは有意に結合する程度まで第1および/または第2の分子を識別する能力を指す。このような結合測定は、例えばBiacore装置で、ELISA、FACS分析などにより日常的に行うことができる。より具体的には、本明細書に定義されるIgG1抗体の結合ドメインは、下記に示すように、上皮腫瘍抗原、すなわち、ヒトCEA(癌胎児性抗原、癌胎児性抗原関連細胞接着分子5;CEACAM5;CD66e)と結合する。用語「特異的結合」は、本発明によれば、IgG1抗体分子が本明細書に定義されるヒトCEAの少なくとも2、3、4、5、6、7、8、またはさらにそれより多くのアミノ酸と特異的に相互作用かつ/または結合できることを意味する。前記用語は、抗体分子の特異性、すなわち、本明細書に定義されるヒトCEA抗原の特定の領域を識別するその能力に関する。抗原相互作用部位とその特異的抗原との特異的相互作用は、例えば抗原の立体構造の変化の誘導、抗原のオリゴマー化などに起因する、シグナルの開始をもたらし得る。さらに、前記結合は、「キーロックの原則(key-lock-principle)」という特異性に例証され得る。従って、抗原相互作用部位および抗原のアミノ酸配列中の特異的モチーフは、それらの一次、二次または三次構造の結果ならびに前記構造の二次修飾の結果として相互に結合する。抗原相互作用部位のその特異的抗原との特異的相互作用は、さらに前記部位と抗原との結合をもたらし得る。
抗体の「特異的結合」は、主に2つのパラメータ:定性的パラメータ(結合エピトープ、すなわち抗体が結合する場所)および定量的パラメータ(結合親和性、すなわちそれが結合する場所でどの程度強く結合するか)に特徴付けられる。どのエピトープが抗体によって結合されるかは、例えば公知のFACS方法論、ペプチドスポットエピトープマッピング、質量分析またはペプチドELISAにより有利に決定することができる。特定のエピトープと結合している抗体の強度は、例えば公知のBiacoreおよび/またはELISA法により有利に決定することができる。このような技法を組み合わせることにより、結合特異性の代表的な尺度としてのシグナル対ノイズ比の算出が可能となる。そのようなシグナル対ノイズ比では、シグナルは注目されるエピトープと結合する抗体の強度を表すのに対して、ノイズは注目されるエピトープとは異なる他の非関連エピトープと結合する抗体の強度を表す。好ましくは、注目されるエピトープに対するシグナル:ノイズ比(注目されるエピトープと異なるその他のエピトープに対するものより約50倍高い)は、評価される抗体が注目されるエピトープと特異的な方法で結合する指標として考えることができる、言い換えれば「特異的結合剤」である。
本発明に従って用いられる用語「特異的結合」または「特異的相互作用」は、IgG1抗体構築物が類似構造のポリペプチドと交差反応しないか、または本質的に交差反応しないことを意味する。研究中の抗体構築物のパネルの交差反応は、例えば、注目されるポリペプチドならびに程度の差はあるが(構造的かつ/または機能的に)密接に関連した多数のポリペプチドとの、従来条件下で抗体構築物の前記パネルの結合(例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 ならびに Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999参照)を評価することにより試験することができる。例えば、本明細書に定義されるIgG1抗体の結合ドメインが、ヒトCEA(癌胎児性抗原;CEACAM5;CEA;CD66e)、すなわち可溶性CEAと膜結合CEAの双方と結合することは本発明の範囲内であるが、それに対して、その他のCEAファミリーメンバー、例えば胆汁糖タンパク質(CEACAM1;BGP1;TM−CEA;CD66a)と結合しているIgG1抗体は、前記範囲から除外される。
抗原相互作用部位と特異的抗原との特異的相互作用の例は、その受容体のリガンドの特異性を含む。前記定義は、特にその特異的な受容体との結合の際にシグナルを誘導するリガンドの相互作用を含む。対応するリガンドの例は、その特異的なサイトカイン受容体と相互作用/結合するサイトカインを含む。また、前記定義により特に含まれるものは、抗原相互作用部位と、セレクチンファミリー、インテグリンおよびEGFなどの成長因子のファミリーの抗原などの抗原との結合である。前記相互作用の別の例(それも前記定義により特に含まれる)は、抗原決定基(エピトープ)と抗体の抗原結合部位の相互作用である。
用語「〜と結合/相互作用する」もまた、立体構造エピトープ、構造エピトープまたはヒト標的分子、すなわちヒトCEAの2つの領域からなる不連続エピトープまたはその部分に関連する。本発明の文脈において、立体構造エピトープは、ポリペプチドが折りたたまれて未変性タンパク質となる際に分子の表面上に集まる一次配列において分離した2またはそれ以上の別個のアミノ酸配列により定義される(Sela、(1969) Science 166, 1365 およびLaver, (1990) Cell 61, 553-6)。
用語「不連続エピトープ」とは、本発明の文脈において、ポリペプチド鎖の離れた部分の残基から構築される非直線状エピトープを意味する。これらの残基は、ポリペプチド鎖が三次元構造に折りたたまれて立体構造/構造エピトープを構成する際に分子の表面上に集まる。
「CEA」とは、上皮性起源の多数の腫瘍に発現した抗原である、癌胎児性抗原(癌胎児性抗原関連細胞接着分子5;CEACAM5;CEA;CD66e)を意味する(Hammarstroem, Sem. Cancer Biol. 9 (1999), 67-81; Shively and Beatty CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2 (1985), 355-399)。ヒトCEAのアミノ酸配列は、GenBank受託番号NM_004363に表され、配列番号37を含む。
本発明において、驚くことに、ヒトCEAに対して特異性を有する抗体に基づく治療薬を生成することが可能であり、腫瘍細胞に対して向けられる細胞障害活性(ADCC)がさらに高い濃度の可溶性CEA抗原に対して抵抗性であることが見出された。この知見は、本明細書に定義されるIgG1抗体が可溶性CEA抗原と結合するという事実を考えると全く予期されないものである。例えば、モノクローナル抗体T84.66に由来するIgG1抗体構築物が作製される場合、これらの抗体は可溶性CEA抗原に感受性が高かった、すなわちそれらの細胞障害活性(ADCC)は可溶性CEA抗原の存在下で遮断されていた。これらの構築物はまた、可溶性CEAとの結合が可能であることが見出されている。このことを考えて、可溶性CEA抗原は、抗体がその細胞障害活性を発揮することを妨げると結論付けられた。その一方、本明細書に定義されるIgG1抗体は、腫瘍細胞に対するそれらの細胞障害活性においてさらに高いレベルの可溶性CEAの存在に対して抵抗性である。さらにより驚くことには、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)は、ヒトIgG1抗体のヒトCEA結合ドメイン(すなわち、ヒトCEAと特異的に結合するヒト結合ドメイン)に用いられる場合、可溶性CEA抗原に対する抵抗性を媒介するのに十分であることが見出された。それらがヒト起源であることに起因して(「DRGLRFYFDY」アミノ酸配列は除く)、前記構築物はヒト腫瘍患者に投与すると免疫原性が低いかまたはない。要約すれば、本明細書に定義されるIgG1抗体を含む医薬組成物は、例えば腫瘍の進行中、再発性癌、転移、腫瘍量の多い患者、または後期腫瘍に観察される、血漿中の可溶性CEA濃度の高い上皮腫瘍患者の治療に特に有用である。本明細書に定義されるこのようなIgG1抗体は、当分野に記載される方法により、例えばファージディスプレイに基づく技法により作製することができる;以下の実施例も参照されたい。
本明細書に定義されるIgG1抗体のヒトCEAと特異的に結合する結合ドメインは、少なくとも1つのCDR、好ましくはCDR−H3、より好ましくは、Kabatの位置95(「D」、アスパラギン酸)、96(「R」;アルギニン)、97(「G」;グリシン)、98(「L」;ロイシン)、99(「R」;アルギニン)、100(「F」;フェニルアラニン)、100a(「Y」;チロシン)、100b(「F」;フェニルアラニン)、101(「D」;アスパラギン酸)、および102(「Y」;チロシン)にそれぞれ相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を含むマウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3の一部分または完全なCDR−H3を含むことが好ましい。Kabatシステムに従う番号付けは、例えばKabat, E.A., T.T.Wu, H.M.Perry, K.S.Gottesman, and C. Foeller. 1991. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed. Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicineに記載されている。
以下の実施例に示されるように、CEAと相互作用する結合ドメインの前記mAb A5B7由来のCDR−H3「DRGLRFYFDY」(配列番号27)アミノ酸配列を含む、本明細書に定義されるIgG1抗体の腫瘍細胞に対する細胞障害活性(ADCC)は、可溶性CEA抗原に対して抵抗性であり、それにより血漿中の血清CEA濃度の高い腫瘍患者の治療が可能となる。
このA5B7由来「DRGLRFYFDY」CDR−H3アミノ酸配列は、例えば、(上皮腫瘍細胞上の)CEA標的抗原に対する親和性を改良するため、かつ/または本明細書に定義されるIgG1抗体の「微細な(fine)特異性」を最適化するためにさらに修飾することが望ましい。この目的のため、例えば、アミノ酸配列「DX1234FYFDY」において、改良された親和性および/または微細な特異性を有する、修飾されたCDR−H3を同定するために、様々なアミノ酸残基を位置「X1」、「X2」、「X3」および/または「X4」(それぞれ、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置96(「X1」)、97(「X2」)、98(「X3」)および99(「X4」)に対応)で試験してよい。例えば、「X1」、「X2」、「X3」または「X4」は、アミノ酸残基「R」(アルギニン)、「G」(グリシン)、「L」(ロイシン)、「Y」(チロシン)、「A」(アラニン)、「D」(アスパラギン酸)、「S」(セリン)、「W」(トリプトファン)、「F」(フェニルアラニン)または「T」(トレオニン)で表され得る。ここで、表示される「X」の位置の1、2、3または4つ全ては、CDR−H3「DRGLRFYFDY」(配列番号27)アミノ酸配列中のKabatの位置96〜99にて本来の「RGLR」アミノ酸配列と比較して交換されてよい。しかし、「X1」、「X2」、「X3」および「X4」が同じアミノ酸を表す場合、例えば「X1」、「X2」、「X3」および「X4」が全て「F」(フェニルアラニン)である場合は本発明の特許請求の範囲から除外される。上記のA5B7由来の「DRGLRFYFDY」CDR−H3アミノ酸配列の修飾は当分野で公知の方法、例えば、CEA結合ドメイン中に、このような修飾されたCDR−H3領域を含むIgG1抗体の作製を可能にするランダム化されたプライマーを用いるPCRにより達成することができる。これらの修飾されたIgG1抗体の親和性または微細な特異性は、当分野で記載される方法、例えばELISA、BiacoreまたはFACS分析により試験することができる。そのような修飾されたCDR−H3を含むIgG1抗体の可溶性CEA抗原に対する抵抗性は、以下の実施例に記載されるように、漸増量の可溶性CEAの存在下で、細胞障害活性(抗体依存性細胞障害活性、ADCC)アッセイで試験することができる。
好ましくは、本明細書に定義されるIgG1抗体の可変領域は、少なくとも、(a)アミノ酸配列「SYWMH」(配列番号29)を有するCDR−H1と、アミノ酸配列「FIRNKANGGTTEYAASVKG」(配列番号28)を有するCDR−H2と、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を有するCDR−H3;および
(b)アミノ酸配列「TYAMH」(配列番号31)を有するCDR−H1と、アミノ酸配列「LISNDGSNKYYADSVKG」(配列番号30)を有するCDR−H2と、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を有するCDR−H3
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
より好ましくは、前記可変領域は、アミノ酸配列「TLRRGINVGAYSIY」(配列番号34)を有するCDR−L1および/またはアミノ酸配列「YKSDSDKQQGS」(配列番号33)を有するCDR−L2および/またはアミノ酸配列「MIWHSGASAV」(配列番号32)を有するCDR−L3を含む。
本明細書に定義されるIgG1抗体のヒトCEAに特異的な結合ドメインのVH領域のアミノ酸配列は、配列番号20、22または24であることが好ましい。
本明細書に定義されるIgG1抗体のヒトCEAに特異的な結合ドメインのVL領域のアミノ酸配列は、配列番号26であることが好ましい。
さらにより好ましくは、本明細書に定義されるIgG1抗体のヒトCEAに特異的な結合ドメインの可変(V)領域は、
(a)VH領域が配列番号22に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、VL領域が配列番号26に示されるアミノ酸配列からなる;
(b)VH領域が配列番号20に示されるアミノ酸配列からなり、かつ、VL領域が配列番号26に示されるアミノ酸配列からなる;および
(c)VH領域が配列番号24に示されるアミノ酸配列からなり、VL領域が配列番号26に示されるアミノ酸配列からなる、
からなる群より選択される。
最も好ましくは、本明細書に定義される前記IgG1抗体は、
(a)配列番号77に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号80に示される軽鎖のアミノ酸配列;
(b)配列番号78に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号80に示される軽鎖のアミノ酸配列;
(c)配列番号79に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号80に示される軽鎖のアミノ酸配列;および
(d)(a)、(b)または(c)のアミノ酸配列と少なくとも85%同一の、より好ましくは少なくとも90%同一の、最も好ましくは少なくとも95%同一のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
最も好ましくは、さらに添付の実施例に実証されるように、本発明の医薬組成物に用いられる「IgG1抗体」は、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102(配列番号27)に対応するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」を含む、ヒト定常領域およびヒト化可変領域を含むヒト化IgG1抗体である。
好ましくは、前記IgG1抗体の軽鎖定常領域はλ軽鎖定常領域、好ましくは、ヒトλ軽鎖定常領域である。
本明細書に定義されるIgG1抗体は、例えば有機ポリマー(例えばポリエチレングリコール(「PEG」)および/またはポリビニルピロリドン(「PVP」)の1またはそれ以上の分子)を用いて誘導体化してよい。当分野で公知のように、このような誘導体化は、抗体またはそのフラグメントの薬理学的特性を調節するのに有利であり得る。特に好ましいものは、システインアミノ酸のスルフヒドリル基を介する部位特異的な方法で抗体またはそのフラグメントとの共役を可能にする、PEG−マレイミドとして誘導体化されたPEG分子である。これらの中で、特に好ましいものは20kDおよび/または40kDのPEG−マレイミドの分枝かまたは直鎖の形のものである。
さらに、本明細書に定義されるIgG1抗体を放射性核種(例えば131I)、細胞毒類(例えばシュードモナス毒素A)またはサイトカイン類、例えばIL−2と融合させてもよい。得られる融合タンパク質は、上皮腫瘍の治療において治療目的で用いられることが好ましい。放射性核種と融合した本発明の抗体もまた、例えば診断目的に有用であり得る。
本発明の医薬組成物のもう1つの好ましい実施形態では、治療されるべき前記上皮腫瘍は、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である。前記胃腸腺癌は、好ましくは結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である。
より好ましくは、本発明の前記医薬組成物は、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはCEA血清中濃度が100ng/mlより高い腫瘍患者の治療のためのものである。前記CEA血清中濃度は、例えばELISAにより測定され得る。
本発明の医薬組成物のさらなる好ましい実施形態では、本明細書に定義されるIgG1抗体はヒト化および/または脱免疫化されている。
本明細書において、用語「CDR移植」、「ヒト化された」または「ヒト化」は、その結合ドメイン中に非ヒト抗体またはそのフラグメント由来の少なくとも1つの相補性決定領域(「CDR」)を含むヒトIgG1抗体を指すために同義的に用いられる。ヒト化アプローチは、例えばWO 91/09968および米国特許第6,407,213号に記載されている。限定されない例として、この用語は、結合ドメインの可変領域が単一のCDR領域、例えば別の非ヒト動物、例えばげっ歯類由来のVHの第3のCDR領域(CDR−H3)を含む場合、ならびに一方または両方の可変領域がそのそれぞれの第1、第2および第3のCDRに前記非ヒト動物由来のCDRを含む場合を包含する。抗体の結合ドメインの全てのCDRが、例えばげっ歯類由来のそれらの対応する同等物で置換されている場合、通常「CDR移植(CDR-grafting)」といい、この用語は本明細書において「ヒト化」という用語も包含していると理解される。用語「ヒト化」はまた、結合ドメインのVHおよび/またはVL内での1またはそれ以上のCDR領域の置換に加えて、CDR間のフレームワーク(「FR」)領域内の少なくとも単一のアミノ酸残基のさらなる変異(例えば置換)が、その位置のアミノ酸を、置換に用いたCDR領域の由来する動物におけるその位置のアミノ酸に合致させている場合も包含する。当分野で公知のように、このような個々の変異は、その標的分子のCDR供与体として用いられる非ヒト抗体の本来の結合親和性を回復させるために、CDR移植の後にフレームワーク領域に作製される場合が多い。用語「ヒト化」は、上記のフレームワーク領域中のアミノ酸置換に加えて、非ヒト動物由来のCDR領域における、ヒト抗体由来の相当するCDR領域のアミノ酸へのアミノ酸置換(1または複数箇所)をさらに包含する。
より具体的には、本明細書において、「ヒト化抗体」または関連語は、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を有するCDR−H3を除いて、ヒトCDR配列およびフレームワーク領域配列を含む可変領域を含むヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有するIgG1抗体を包含する。このような抗体は、以下の実施例に示されるように作製することができる。本明細書に記載されるIgG1抗体はヒト化抗体であることが特に有利である。ヒトへの治療的投与を意図する抗体剤を検討する際、この抗体の大部分がヒト起源であることが非常に有利である。ヒト患者への投与の後に、そのヒト化抗体(または断片)は、患者の免疫系により強い免疫原性応答を誘発しない可能性が最も高い、すなわち、「外来」、つまり非ヒトタンパク質であると認識されない。これは、どの宿主の抗体、すなわち患者の抗体も、治療的抗体に対して生成されないか、さもなければ治療的抗体の活性を阻害し、かつ/または患者の身体からの治療的抗体の排除を加速し、従ってその所望の治療効果を発揮することを妨げることを意味する。用語「ヒト化」抗体は、本明細書において、本明細書に定義されるIgG1抗体がヒト抗体レパートリーに含有されるアミノ酸配列、およびマウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を有するCDR−H3を含むという意味として理解される。本明細書における定義の目的において、抗体、またはその断片は、従って、それがこのようなヒトアミノ酸配列からなる場合、すなわち、問題の抗体またはその断片のアミノ酸配列が、上記に示したマウスCDR−H3を除いて、発現したヒト生殖系列アミノ酸配列と同一である場合、ヒト化であると考えられる。本明細書に定義されるIgG1抗体も、それが体細胞超変異の跡(imprint)によるものであると予期されない、その近縁のヒト生殖系列配列に由来する配列からなる場合、ヒト化とみなされ得る。好ましくは、本明細書に定義される(ヒト化)IgG1抗体は、ヒト定常領域と、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を有するCDR−H3を含むヒト可変領域を有する。上記に示したように、前記CDR−H3は可溶性CEAに対する抵抗性を媒介する。
本明細書において、用語「脱免疫化された」または「脱免疫化」は、元の野生型構築物と向かい合う結合ドメインを、ヒトにおいて前記野生型構築物を非免疫原性または低免疫原性にすることにより修飾することを意味する。脱免疫化アプローチは、例えばWO 00/34317号、WO 98/52976号、WO 02/079415号またはWO 92/10755号に示されている。用語「脱免疫化された」はまた、T細胞エピトープを形成する傾向の低下を示す構築物に関する。本発明に従って、用語「T細胞エピトープを形成する傾向の低下」とは、特異的なT細胞活性化をもたらすT細胞エピトープの除去に関する。さらに、「T細胞エピトープを形成する傾向の低下」とは、T細胞エピトープの形成に寄与するアミノ酸の置換、すなわち、T細胞エピトープの形成に必須のアミノ酸の置換を意味する。言い換えれば、「T細胞エピトープを形成する傾向の低下」は、免疫原性の低下または抗原非依存性のT細胞増殖を誘導する能力の低下に関する。用語「T細胞エピトープ」は、細胞内でペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の分解中に放出され、その後に、T細胞の活性化を引き起こすために主要組織適合抗原複合体(MHC)の分子より提示される短いペプチド配列に関する;特に、WO 02/066514号参照。MHCクラスIIで表されるペプチドに関して、このようなT細胞の活性化は、次に、T細胞の直接刺激による抗体応答を引き起こし、前記抗体を産生することができる。「T細胞エピトープを形成する傾向の低下」および/または「脱免疫化」は、当分野で公知の技法により測定することができる。T細胞増殖アッセイによりインビトロでタンパク質の脱免疫化を試験することが好ましい。このアッセイでは、世界で80%を超えるHLA−DR対立遺伝子を提示するドナー由来のPBMCを、野生型かまたは脱免疫化されたペプチドのいずれかに応答する増殖についてスクリーニングする。理想的には、細胞増殖は野生型ペプチドに抗原提示細胞を負荷する(loading)際にのみ検出される。あるいは、全てのハプロタイプを提示するHLA−DR四量体を発現させることにより、脱免疫化を試験することができる。これらの四量体は、ペプチド結合について試験するか、または増殖アッセイにおいて抗原提示細胞の代わりをするペプチドを負荷してよい。脱免疫化されたペプチドがHLA−DRハプロタイプに提示されるかどうかを試験するため、例えばPBMC上の蛍光標識ペプチドの結合を測定することができる。さらに、脱免疫化は、患者への投与後に脱免疫化分子に対する抗体が形成されたかどうかを判定することにより証明することができる。好ましくは、CDR領域の結合親和性が影響を受けないように、T細胞エピトープを誘導する傾向の低下をもたらすために、抗体由来分子をフレームワーク領域で脱免疫化し、大部分のCDR領域は修飾されない。たとえ1つのT細胞エピトープの除去であっても、結果として免疫原性が低下する。要約すれば、上記のアプローチは、上皮腫瘍患者に投与される場合、本明細書に定義される治療的IgG1抗体の免疫原性を低下させるために役立つ。
別の態様では、本発明は、
(a)配列番号77に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号80に示される軽鎖のアミノ酸配列;
(b)配列番号78に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号80に示される軽鎖のアミノ酸配列;
(c)配列番号79に示される重鎖のアミノ酸配列と配列番号80に示される軽鎖のアミノ酸配列;および
(d)(a)、(b)または(c)のアミノ酸配列と少なくとも85%同一の、より好ましくは少なくとも90%同一の、最も好ましくは少なくとも95%同一のアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むIgG1抗体に関する。
本発明はまた、上記に定義されるIgG1抗体をコードする核酸に関する。有利には、本明細書に定義される前記IgG1抗体またはそれをコードする核酸は、ヒトにおいて上皮腫瘍の治療のための医薬組成物として使用される。前記上皮腫瘍はCEA陽性である。CEA陽性の上皮腫瘍細胞に対するこれらの本発明の医薬組成物中のIgG1抗体の細胞障害活性は、腫瘍患者の血漿中のさらに高い濃度の可溶性CEA抗原に対してでさえ抵抗性である。
特定のポリペプチドが本明細書に定義されるヌクレオチドまたはアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるかどうかは、公知のコンピュータープログラムを用いて従来法で決定してよい。クエリー配列(本明細書に定義される配列)と対象配列(subject sequence)との間で最も全体的に適合するものを決定するための好ましい方法(グローバル配列アラインメントとも称される)は、Bultragらのアルゴリズム(Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990))に基づくFASTDBコンピュータープログラムを用いて決定してよい。配列アラインメントにおいてクエリー配列と対象配列は、双方ともDNA配列である。RNA配列はUをTに変換することにより比較され得る。
本発明はまた、本明細書に定義されるIgG1抗体をコードする核酸配列を含む医薬組成物を提供する。前記核酸は、以下により詳細に示されるように、ヒトにおいて上皮腫瘍を治療するために、例えば遺伝子治療アプローチに利用することができる。
本発明はさらに上記に定義される核酸配列を含むベクターを含む医薬組成物に関する。好ましくは、前記ベクターは、上記に定義される前記核酸配列と作動可能なように連結されている調節配列をさらに含む。より好ましくは、前記ベクターは発現ベクターである。例えば1つの発現ベクターが前記抗体の重鎖をコードし、それに対してもう1つの発現ベクターが軽鎖をコードすることも想定される。
さらに、本発明のベクターはまた、遺伝子導入または標的遺伝子組換えベクターであってよい。エキソビボ(ex-vivo)またはインビボ技術により治療遺伝子または核酸を細胞に導入することに基づく遺伝子治療は、遺伝子導入の最も重要な適用の一つである。インビトロまたはインビボでの遺伝子治療に適したベクター、方法または遺伝子送達系は、文献に記載され、当業者に公知である;例えば、Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539; Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919; Anderson, Science 256 (1992), 808-813, Isner, Lancet 348 (1996), 370-374; Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086;Onodua, Blood 91 (1998), 30-36; Verzeletti, Hum. Gene Ther. 9 (1998), 2243-2251; Verma, Nature 389 (1997), 239-242; Anderson, Nature 392 (Supp. 1998), 25-30; Wang, Gene Therapy 4 (1997), 393-400;Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716;WO 94/29469;WO 97/00957;US5,580,859;US5,589,466;US4,394,448またはSchaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640、ならびにそれに引用される参照文献を参照。本明細書に定義される核酸分子およびベクターは、細胞への直接導入用に、またはリポソーム、ウイルス(例えばアデノウイルス、レトロウイルス)ベクター、エレクトロポレーション、またはその他の送達系を介する細胞への導入用に設計することができる。さらに、バキュロウイルス系を本明細書に定義される核酸分子のための真核生物発現系として用いてもよい。導入および遺伝子治療アプローチは、好ましくは、本明細書に定義される機能的IgG1抗体構築物の発現をもたらすべきであり、それによって、前記IgG1抗体構築物はヒトにおける上皮腫瘍の治療、寛解および/または予防に特に有用である。
さらなる態様では、本発明は、上記に定義されるベクターまたは核酸で形質転換またはトランスフェクトされた宿主を含む医薬組成物に関する。
好ましくは、医薬組成物は、担体、安定剤および/または賦形剤からなる適した製剤をさらに含む。
別の態様では、本発明は、上記に定義される医薬組成物の製造のためのプロセスに関し、前記プロセスは上記に定義される宿主を上記に定義されるIgG1抗体の発現を可能にする条件下で培養することと、産生されたIgG1抗体を培養物から回収することを含む。本発明のさらなる態様は、ヒトにおける上皮腫瘍の予防、治療または寛解のための医薬組成物の調製のための、上記に定義されるIgG1抗体または上記に定義されるプロセスにより産生されたIgG1抗体、上記に定義される核酸分子、上記に定義されるベクターまたは上記に定義される宿主の使用に関する。本発明の別の態様は、ヒトにおける上皮腫瘍の予防、治療または寛解のための方法に関し、前記方法は本発明の、または上に示されるプロセスによって製造された医薬組成物の有効量を投与する段階を含む。当業者、特に主治医であれば、本発明の二重特異的分子/二重特異的一本鎖抗体の投与を必要とする患者の治療の成功を評価することができる。従って、投与計画ならびに投薬量および投与回数は前記当業者により判断され得る。つまり、判断される、対応する「寛解」および/または「治療」は下に定義される。
最も好ましい投与方法は、所与の時間/期間の静脈内投与である。本明細書に定義されるIgG1抗体は1回につき単独で投与されてよいが、好ましいものは、製薬上許容される担体中の投与である。適した医薬担体の例は当分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、リポソーム、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが含まれる。このような担体を含む組成物は、周知の従来法により処方されてよい。これらの医薬組成物は被験体に適した用量で投与することができる。投与計画は主治医および臨床学的因子により決定される。医学分野で周知のように、任意の患者一人への投薬量は多くの要因によって決まり、それには患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、全体的な健康状態、および同時に投与されるその他の薬剤が含まれる。非経口投与のための製剤としては、滅菌水溶液または非水溶液、および懸濁液が挙げられる。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射用の有機エステル類、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、水、水溶液、または生理食塩水および緩衝媒体を含む懸濁液が挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、または硬化油が挙げられる。静脈内媒体としては、液体および栄養素補充液、電解質補充液(リンゲルデキストロースに基づくものなど)などが挙げられる。防腐剤およびその他の添加剤も存在してよく、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどが挙げられる。さらに、組成物は、例えば、好ましくはヒト起源の血清アルブミンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質性担体を含んでもよい。併用療法は、タンパク質性IgG1抗体に加えて、医薬組成物の意図される使用に応じて、さらなる生物活性物質を含むことが想定される。このような物質は、胃腸管系に作用する物質、細胞増殖抑制剤として作用する物質、高尿酸血症を予防する物質、免疫反応を阻害する物質(例えばコルチコステロイド、FK506)、循環系に作用する薬剤および/またはT細胞共刺激分子またはサイトカインなどの当分野で公知の薬剤であってよい。好ましくは、本明細書に定義されるIgG1抗体は、緩衝液、安定剤および界面活性剤中に処方される。緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液または酢酸緩衝液であってよい。安定剤は、(1または複数の)アミノ酸および/または糖であってよい。界面活性剤は、合成洗剤、PEGなどであってよい。より好ましくは、本明細書に定義されるIgG1抗体は、クエン酸塩、リシン、トレハロースおよびTween80中に処方される。前記医薬組成物の希釈液として、等張生理食塩水およびTween80が好ましい。
本明細書において用語「寛解」とは、疾患、すなわち上皮腫瘍の重篤度の改善または緩和を指す。例えば、そのような寛解は、本発明の医薬組成物の投与に起因する、安定な疾患の達成、またさらにより好ましくは、上皮腫瘍の縮小、すなわち、微小、部分的応答または完全寛解であり得る。「安定な疾患」とは、臨床および/または組織学的診断方法により腫瘍進行/増殖が全くまたはほとんど観察されないまたは検出されない疾患状態を指す。例えば、指標病変の断面積の合計の50%より多くの縮小である、腫瘍の縮小は、「部分応答」と考えられる。「完全寛解」は、治療後に病変がこれ以上全く検出されない状態を意味する。安定疾患と部分応答との間の腫瘍縮小を伴う応答は、微小応答と考えられ得る。例えば、指標病変の断面積の合計の20%、25%または30%縮小は、微小応答と称され得る。
用語「寛解」は、本明細書において、上皮腫瘍の数の減少も包含する。それは、さらに腫瘍進行の阻止/減速を意味する。さらに、治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の全体的な生存の改善は、本明細書において「寛解」と考えられる。これは、必要な変更を加えて、治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の進行のない生存または再発のない生存の改善にも当てはまる。さらに、用語「寛解」はまた、上皮腫瘍の症状の強度の減少も指し、その結果得られる、例えば治療した腫瘍患者の生活の質の改善も指す。
用語「上皮腫瘍の予防」は、本明細書において、次のように理解される。原発上皮腫瘍のヒト患者からの外科切除後、および/または原発上皮腫瘍の化学療法または放射線治療後に、腫瘍細胞が全て身体から排除されない場合もあり得る。しかし、これらの残存腫瘍細胞は患者において再発性癌、すなわち、局所再発および/または転移を引き起こす可能性がある。転移はよく見られる癌の合併症であるが、癌細胞が原発腫瘍から播種されて遠位のコロニーを形成する過程はあまり分かっていない。転移性癌は、ほぼ例外なく難治性で新しい治療方法の必要性が生じる。本発明の医薬組成物を用いると、これらの播種された腫瘍細胞を死滅させて二次性腫瘍(一次治療後に身体に残存する腫瘍細胞から生じる)の形成を予防することができる。このように、本医薬組成物は、腫瘍患者において局所再発および/または転移の形成を予防するために役立つ。
抗腫瘍治療の成功は、それぞれの疾病について、例えばコンピュータ断層撮影、X線、核磁気共鳴断層撮影(例えば、米国国立癌研究所の判定基準に基づく応答評価(Cheson (1999), J. Clin. Oncol.; 17 (4):1244))、陽電子放射断層撮影走査、内視鏡検査、蛍光活性化セルソーター、骨髄の吸引、胸水または腹水、組織/組織学、および様々な上皮腫瘍特異的臨床化学パラメータ(例えば血清中の可溶性CEA濃度)により確立された標準的な方法でモニターすることができ、さらに、その他の確立された標準的な方法を用いてよい。さらに、T細胞の活性化を測定するアッセイを用いてよい;例えば、WO 99/054440号を参照。
治療しなかった腫瘍患者と比較して、治療した腫瘍患者の全体的な生存、進行のない生存または再発のない生存の決定のために統計学を用いてもよい。
好ましくは、前記上皮腫瘍は、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である。前記胃腸腺癌は、より好ましくは、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である。
さらにより好ましくは、前記本発明の医薬組成物は、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはCEA血清中濃度が100ng/mlより高い腫瘍患者の治療のためのものである。前記CEA血清中濃度は、例えばELISAにより測定され得る。
本発明の使用または方法のもう1つの好ましい実施形態では、上記に定義される前記医薬組成物は、さらなる薬剤と組み合わせて、すなわち、併用療法の一部として投与されるのに適している。前記併用療法では、活性薬剤を場合により、同医薬組成物中にIgG1抗体として含むか、別個の医薬組成物に含んでよい。後者の場合、前記別個の医薬組成物は、IgG1抗体を含む前記医薬組成物の投与の前に、同時に、またはその投与の後に投与するのに適している。さらなる薬剤または医薬組成物は非タンパク質性化合物であってもタンパク質性化合物であってもよい。
好ましくは、前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物は、上記に定義されるIgG1抗体、上記に定義される核酸分子、上記に定義されるベクター、または上記に定義される宿主と同時または非同時に投与してよい。好ましくは、治療される前記被験体はヒトである。
さらなる態様において、本発明は、上記に定義されるIgG1抗体、上記に定義される核酸分子、上記に定義されるベクター、または上記に定義される宿主を含むキットに関する。
これらおよびその他の実施形態は、本発明の説明および実施例に開示され、包含される。免疫学分野の組換え技術および方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd edition 2001; Lefkovits; Immunology Methods Manual;The Comprehensive Sourcebook of Techniques;Academic Press, 1997; Golemis; Protein-Protein Interactions: A Molecular Cloning Manual;Cold Spring Laboratory Press, 2002に記載されている。本発明に従って用いられ得る抗体、方法、用途および化合物のいずれかに関するさらなる参照文献は、例えば電子装置を用いて公開されているライブラリーおよびデータベースから得ることができる。例えば、インターネットで利用可能な公開データベース「Medline」を、例えばhttp://www.ncbi.nlm.nih.qov/PubMed/medline.htmlで利用してよい。さらなるデータベースおよびアドレス、例えばhttp://www.ncbi.nim.nih.qov/、http://www.infobioaen.fr/、http://www.fmi.ch/bioloqv/research tools.html、http://www.tiqr.orQ/が当業者に公知であり、例えば、http://www.lvcos.comを用いて得ることもできる。腫瘍関連の話題は、例えば、http://www.nih.govまたはhttp://www.dkfz.deを参照のこと。
以下の実施例は本発明を説明する。
実施例1:ヒトCEA(癌胎児性抗原関連細胞接着分子5;CEACAM5)がトランスフェクトされたCHO細胞の作製
CEA陽性の、Kato III細胞(ヒト胃癌腫細胞株;ATCC HTB−103)を用いて全RNAを得、それをキットマニュアルの説明書(Qiagen、RNeasy Mini Kit)に従って単離した。得られたRNAを、ランダムに開始される逆転写によるcDNA合成に用いた。CEA抗原の全長配列のクローニングのため、以下のオリゴヌクレオチドを用いた。5’CEACAM5 EcoRI GAATTCGCCACCATGGAGTCTCCCTCGGCCCC(配列番号35)および3’CEACAM5 Sal I GTCGACCTATATCAGAGCAACCCC(配列番号36)。PCR(第1サイクルに関して、93℃にて5分間の変性、58℃にて1分間のアニーリング、72℃にて1分間の伸張;93℃にて1分間の変性、58℃にて1分間のアニーリング、72℃にて1分間の伸張を30サイクル;72℃にて5分間の末端伸張)を用いてコード配列を増幅した。その後、PCR産物をEcoRIおよびSalIで消化し、適切に消化した発現ベクターpEF−DHFRに連結し、大腸菌に形質転換した。単離したプラスミドDNAを配列決定し、確立されたCEACAM5の核酸配列(米国国立バイオテクノロジー情報センター(National Center for biotechnology information)のNM_004363、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/;配列番号37)と比較した。標準的なプロトコールに従って、上述の手順を実行した(Sambrook, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York (1989;2001)。確認された核酸配列を含むクローンを、構築物の真核生物における発現のためにDHFR欠損CHO細胞にトランスフェクトした。DHFR欠損CHO細胞における真核生物タンパク質発現を、Kaufmannに記載のとおり行った(Kaufmann R.J., Methods Enzymol. 185 (1990), 537-566)。構築物の遺伝子増幅を、最大20nM MTXの終濃度までの、漸増濃度のMTXにより誘導した。次に、トランスフェクトした細胞を、FACSアッセイを用いてCEA抗原の発現について試験した。その目的のため、2.5×105の数のトランスフェクト細胞を、濃度5μg/mlのマウスモノクローナル抗体COL−1(Neomakers;Fremont,CA,USA)とともにインキュベートした。50μl PBS中2% FCS(Dianova,Hamburg,Germanyより入手)を用いて1:100で希釈した、R−フィコエリトリン結合アフィニティー精製F(ab’)2断片、ヤギ抗マウスIgG、Fc−γ断片特異的抗体を用いて、抗体の結合を検出した。細胞を、FACS−Calibur(Becton Dickinson,Heidelberg)でフローサイトメトリーにより分析した。FACS染色および蛍光強度の測定を、Current Protocols in Immunology (Coligan, Kruisbeek, Margulies, Shevach and Strober, Wiley-Interscience, 2002)に記載のとおり行った。結果として、形質転換体は、ヒトCEA抗原について明らかな陽性染色を実証した。
実施例2:マウスモノクローナル抗体(mAb)A5B7およびT84.66由来のIgG1抗体の作製および特性決定
完全なIgG抗体分子を発現するため、2つのベクターを作製した。これらのベクターのうちの一方は重鎖をコードし、それに対してもう一方は軽鎖をコードした。完全なIgG分子は、マウスモノクローナル抗体A5B7(Chester, Int. J. Cancer 57 (1994), 67-72; Harwood、上記引用文中)およびT84.66(Neumaier, Cancer Res. 50 (1990), 2128-34)に由来している。それぞれの配列は文献から抽出され、対応するV領域はEntelechon,Germanyにて遺伝子合成された。これらの合成されたDNA断片を以下のPCR段階の鋳型として用いた。
1.抗体CEA I(A5B7)およびCEA II(T84.66)に基づくマウス軽鎖のクローニング
適した末端制限部位を作製するため、抗体CEA I(A5B7)のVL領域をコードするDNA断片をPCRにより再び増幅し、結果として5’末端にBsu36I部位および3’末端にXho I部位を含むVκ断片を得た。プライマー5’−VL CEA I Bsu36I(5’−TTCTCTCCTTAGGTGTCCACTCCGACATTGAGCTCACCCAGTCTCC−3’)(配列番号81)および3’−VL CEA I Xho I(5’−CATGCACTCGAGCTTGGTCCCTCCACCGAACGTC−3’)(配列番号82)をこの目的に用いた。次に、この断片を、Bsu36IおよびXho Iによりヒトリーダー配列およびマウスCκ(Hieter et al., 1980 Cell 22: 197-207)領域を含有するpBS由来のプラスミドにサブクローニングし、それにより哺乳類リーダー配列とマウスCκ定常領域を加えた。EcoRIおよびSalIを利用して、CEA I VL−Cκ DNAを前記ベクターから切り出し、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)をコードするcDNAをマウスアデノシンデアミナーゼ(ADA)をコードするそれと置換することにより発現ベクターpEF−DHFRに由来する真核生物発現ベクターpEF−ADAにサブクローニングした(Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 7021-5)。同じ手順を、適宜に、しかし異なる特異的プライマー:CEA II(T84.66)に対して、5’−VL CEA II Bsu36I(5’−TTCTCTCCTTAGGTGTCCACTCCGACATTGTGCTGACCCAATCTCC−3’)(配列番号83)および3’−VL CEA II Xho I(5’−CATGCACTCGAGCTTGGTCCCCCCACCGAACGTG−3’)(配列番号84)を用いて抗体CEA−II(T84.66)のVLで行った。
この実験の結果として、抗体CEA I(A5B7)、およびCEA II(T84.66)に基づくマウス軽鎖が作製された。mAb A5B7のVH領域のアミノ酸配列は配列番号8で示され、一方、CEA I(mAb A5B7)のVL領域は配列番号10で示される。CEA II(mAb T84.66)のVH領域のアミノ酸配列は配列番号12で示され、一方、mAb T84.66のVL領域は配列番号14で示される。
2.マウス重鎖可変ドメインのクローニング
CEA I(A5B7)およびCEA II(T84.66)のマウスVH領域から、重鎖の可変領域をPCRにより再び増幅させ、両方の末端にBsu36I制限部位を作製した。CEA I(A5B7)には、次の2つのプライマーの組み合わせ:5’−プライマー 5'CEA I VH−Bsu36I(5’−TTCTCTCCTTAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAACTGCAGGAGTCAGG−3’)(配列番号87)および3’−プライマー 3’−CVH−Bsu36I(5’−GACTCACCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGG−3’)(配列番号88)を用い、CEA II(T84.66)には、次の2つのプライマーの組み合わせ:5’−プライマー 5’CEA II VH−Bsu36I(5’−TTCTCTCCTTAGGTGTCCACTCCGAGGTTCAGCTGCAGCAGTCTGG−3’)(配列番号89)および3’−プライマー 3’CEA II VH−Bsu36I(5’−GACTCACCTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGACC−3’)(配列番号90)を用いた。
得られるDNA断片を、次に、これらの制限部位を用いて、既に真核生物のリーダー配列とヒトIgG1重鎖定常領域をコードするDNA断片を含有する真核生物発現ベクターpEF−DHFRにサブクローニングした(Raum, Cancer Immunol Immunother. 50 (2001): 141-50参照)。従って重鎖可変領域はリーダー配列と重鎖定常領域との間に挿入した。
この実験の結果として、前記ヒトIgG1定常領域と連結されたマウス重鎖可変ドメインをコードするベクターが作製された。mAb A5B7のVH領域のアミノ酸配列は配列番号8に示され、一方、CEA I(mAb A5B7)のVL領域は配列番号10に示される。CEA II(mAb T84.66)のVH領域のアミノ酸配列は配列番号12に示され、一方、mAb T84.66のVL領域は配列番号14に示される。
3.完全なIgGタンパク質の発現
完全なIgG1抗体を発現させるため、上記のように作製した1本の(マウス)軽鎖をコードするプラスミドおよび1本の重鎖(マウスVH/ヒトIgG1定常領域)をコードするプラスミドを、一過性のタンパク質発現のための標準的なプロトコールに従ってHEK細胞に同時導入し、細胞を培養して免疫グロブリンの培地中への発現および産生を可能とした。このように、抗体CEA I(A5B7)由来のhuIgG1 CEA Iおよび抗体CEA II(T84.66)由来のhuIgG1 CEA IIが産生された。前記huIgG1抗体構築物は、CEA I(A5B7)またはCEA II(T84.66)に由来するマウス可変(V)領域、マウス定常(C)軽鎖(Cκ)領域ならびにヒト定常重鎖CH1、CH2、CH3およびヒンジ領域(ヒトIgG1重鎖定常領域は、Raum, Cancer Immunol Immunother. 50 (2001): 141-50に記載されている)からなる。それぞれの製造期間の後、上清を回収し、免疫グロブリンの精製のための標準的なプロトコールに従ってプロテインAクロマトグラフィーによってヒト免疫グロブリンを単離した。次に、培養上清、ならびに精製された免疫グロブリンをさらなる特性決定実験に用いた。
4.上記で作製されたIgG1抗体の特性決定
4.1 固定化された可溶性CEA(sCEA)抗原との結合
重鎖+軽鎖の二重形質転換体の培養上清ならびに対応する精製抗体の調製物を、固定化された可溶性CEA(sCEA;Abcam,Ltd,Cambridge UK)抗原上での結合についてELISAにより標準的な手順に従って試験した。上記に示す通りに作製された抗体CEA I(A5B7)に由来するhuIgG1 CEA Iと、抗体CEA II(T84.66)に由来するhuIgG1 CEA IIの抗体は、陰性対照と比較して固定化されたsCEA抗原との明確な結合を示し、sCEA抗原がコートされない点で異なる同等の設定では結合を示さなかった(図4に示される通り)。
4.2 膜結合CEAとの結合
抗体CEA I(A5B7)由来のhuIgG1 CEA Iと抗体CEA II(T84.66)由来のhuIgG1 CEA IIの精製抗体調製物をFACS分析によりCEA陽性の胃癌細胞株Kato III、CEAトランスフェクトCHO細胞および非トランスフェクトCHO細胞上で試験した。
2×105細胞を、精製抗体調製物(通常10〜20μg/ml)とともにインキュベートした。細胞結合抗体の検出は、FITC標識抗マウスIgG抗体または抗ヒトIgG抗体(通常10〜20μg/ml)を用いて行った。インキュベーションは20〜40分間氷上で行った。
抗体CEA I(A5B7)由来のhuIgG1 CEA Iおよび抗体CEA II(T84.66)由来のhuIgG1 CEA IIは、CEA陽性細胞に対して明確な結合を示した。非トランスフェクトCHO細胞との結合を示したIgG1抗体はなかった。IgG−対照は、Kato III細胞、CHO/CEA−細胞および非トランスフェクトCHO細胞では陰性であった(図5A、BおよびCに示される通り)。
4.3 抗体依存性細胞障害活性(ADCC)アッセイ(51Cr放出アッセイ)
51Cr放出アッセイのため、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)をエフェクター細胞として健康なドナーから単離した。フィコール密度勾配遠心分離とその後の100×g遠心分離段階よりPBMCを分離した。刺激されていないPBMC(5×105細胞)を、平底マイクロタイタープレートの各ウェルに100μlの容積の10% FCSを含むRPMI 1640培地に添加し、37℃にて一晩インキュベートした。標的細胞として、CEAトランスフェクトCHO細胞を用いた。標的細胞を2時間51Crで標識した。標識した標的細胞(50,000細胞)および様々な濃度の抗体(10pg/ml〜10μg/ml)をPBMCに添加し、37℃にて18時間インキュベートした。このアッセイは可溶性CEA(sCEA)抗原の不在下で行われた。対応する結合していないアイソタイプを陰性対照として用いた。特異的溶解を、((実験放出cpm)−(自然放出cpm))/((最大放出cpm)−(自然放出cpm))として計算した。抗体CEA I(A5B7)由来のhuIgG1 CEA Iおよび抗体CEA II(T84.66)由来のhuIgG1 CEA IIは、陰性対照と比較して、この51Cr放出アッセイにおいてCEA陽性CHO細胞に有意な細胞障害活性を媒介することを示した。
2番目の細胞障害活性実験では、抗体サンプルを可溶性CEA(sCEA)抗原で20分間攪拌しながらプレインキュベートし、次に、標識した標的細胞およびヒトPBMCと混合した。さもなければ、アッセイを上記のように行った。可溶性CEA(sCEA)抗原は様々な濃度、すなわち、1μg/mlおよび10μg/mlで用いた。
可溶性CEA、特に高い濃度の可溶性CEAの存在下で、抗体CEA II(T84.66)に由来するhuIgG1 CEA IIは、低下した細胞障害(ADCC)活性を示した。これに対し、抗体CEA I(A5B7)に由来するhuIgG1 CEA Iは可溶性CEAの不在下での活性と比較して細胞障害活性の有意な低下を示さなかった。従って、抗体CEA I(A5B7)に由来するhuIgG1 CEA Iに媒介されるCEA陽性腫瘍細胞に対する細胞障害活性は、可溶性CEAに対して抵抗性である。
要約すれば、抗体CEA I(A5B7)に由来するhuIgG1 CEA Iの腫瘍細胞に対して向けられる細胞障害活性(ADCC)は、さらに高い濃度の可溶性CEA抗原に対して抵抗性であることが見出された。この知見は、このIgG1抗体が可溶性CEA抗原と結合するという事実を考えると全く予期しないものである。例えば、モノクローナル抗体T84.66に由来するIgG1抗体構築物を試験した場合、この抗体は可溶性CEA抗原に対して非常に高い感受性がある、すなわち、細胞障害活性(ADCC)が可溶性CEA抗原によって遮断されている。この抗体はまた、可溶性CEAと結合できることが見出されている。このことを考えると、可溶性CEA抗原は抗体CEA II(T84.66)由来のhuIgG1 CEA IIがその抗体に媒介される細胞障害活性を発揮することを妨げると結論付けられる。その一方、本明細書に定義される抗体CEA I(A5B7)に由来するIgG1 CEA I抗体は、腫瘍細胞に対する細胞障害活性において、さらに高いレベルの可溶性CEAの存在に対して抵抗性である。
実施例3:ヒトVL領域の選択
癌患者に投与される際に免疫原性の低下したIgG1抗体を提供するため、可溶性CEA抗原に対する抵抗性を有するヒト化IgG1抗体を作製した。第1段階で、可溶性CEAに対する抵抗性を有するヒトVL領域が単離された。従って、この実験の目的は、モノクローナル抗体(mAb)A5B7の母親由来のマウスVHと対となり得るヒトVL領域の選択である。
1.可溶性ヒトCEA抗原のビオチン化
ファージライブラリー選択のため、可溶性CEA抗原をビオチン化した。ビオチン化は、5% DMSO(Sigma)を含有するPBS中で、サンプルミキサー(Dynal)中で室温にて1時間15倍モル過剰のEZ−Link Sulfo NHS−LC−LC−ビオチン(Pierce)を用いて達成した。遊離ビオチンとビオチン化CEA抗原の分離のため、標準的なプロトコールに従って、アッセイをPBSに対して過剰に透析した。ビオチン標識したCEAの保持された生物活性をELISA結合アッセイで確認した。
2.RNAのヒトB細胞からの単離
100mLの血液を5名の健康なヒトドナーから採取した。末梢血単核細胞(PBMC)を標準的な方法に従ってフィコール勾配により単離した。RNeasy(登録商標)Midi Kit(QIAGEN)を製造業者の説明書に従って用いて、全RNAを単離細胞から単離した。標準的な方法に従ってcDNAを合成した(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001)。
3.可変軽鎖領域(VL−領域)のPCR増幅
軽鎖V領域DNAの単離のため、RT−PCRを、V−κ−(5’−hu−VK1−SacI−2001(5’−GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CCAGATGACC CAGTCTCC−3’)(配列番号38)、5’−hu−VK2/4−SacI−2001(5’−GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGATGACY CAGTCTCC−3’)(配列番号39)、5’−hu−VK3−SacI−2001(5’−GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGWTGACR CAGTCTCC−3’)(配列番号40)、5’−hu−VK5−SacI−2001(5’−GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CACACTCACG CAGTCTCC−3’)(配列番号41)、5’−hu−VK6−SacI−2001(5’−GAGCCGCACG AGCCCGAGCT CGTGCTGACT CAGTCTCC−3’)(配列番号42)、3’−hu−Vk−J1−SpeI−BsiWI (5’−GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATTTCCACC TTGGTCC−3’)(配列番号43)、3’−hu−Vk−J2/4−SpeI−BsiWI (5’−GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATCTCCASC TTGGTCC−3’)(配列番号44)、3’−hu−Vk−J3−SpeI−BsiWI (5’−GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT GATATCCACT TTGGTCC−3’)(配列番号45)、3’−hu−Vk−J5−SpeI−BsiWI (5’−GACGACACTA GTTGCAGCCA CCGTACGTTT AATCTCCAGT CGTGTCC−3’)(配列番号46))およびVλ(5’−huVL1a−SacI−2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG TTG ACG CAG CCG CCC TC)(配列番号47)、5’−huVL1b−SacI−2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG CTG ACT CAG CCA CCC TC)(配列番号48)、5’−huVL2−SacI−2001 (GAG CCG CAG GAG CCC GAG CTC GCC CTG ACT CAG CCT SCC TCC GT)(配列番号49)、5’−huVL4−SacI−2001 (ACC TGC GAG CTC GTG CTG ACT CAR YCM YCC TCT GC)(配列番号50)、5’−huVL5−SacI−2001 (ACC TGC GAG CTC GTG CTG ACT CAG CCR SCT TCC)(配列番号51)、5’−huVL6−SacI−2001 (ACC TGC GAG CTC ATG CTG ACT CAG CCC CAC TC)(配列番号52)、5’−huVL3/9−SacI−2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GWG CTG ACT CAG CCA CCY TC)(配列番号53)、5’−huVL7/8−SacI−2001 (GAG CCG CAC GAG CCC GAG CTC GTG GTG ACY CAG GAG CCM TC)(配列番号54)、3’−hu−Vlam−BlnI−SpeI−2001 (CGT GGG ACT AGT CTT GGG CTG ACC TAG GAC GGT)(配列番号55)、3’−hu−Vlam2−BlnI−SpeI−2002:CGT GGG ACT AGT CTT GGG CTG ACC GAG GAC GGT)(配列番号56)プライマーセットを用いて行った。ヒトB細胞由来のRNAをcDNAに転写し(上記の通り)、PCR反応の鋳型DNAとして用いた。1回のPCR反応につき、1個の5’−プライマーを1個の3’−プライマーと組み合わせた。異なるPCR反応の数を、5’−および3’−プライマーの可能な組み合わせの数により決定した。増幅には次のPCRプログラムを用いた。すなわち、94℃にて15秒間の変性、52℃にて50秒間のプライマーアニーリングおよび72℃にて90秒間のプライマー伸張を40サイクル以上行い、それに続いて72℃にて10分間の最終伸張を行った。次に、軽鎖DNA V断片を標準的なプロトコールに従って単離した。
4.ライブラリー構築−ヒトVLプールのクローニング
ファージディスプレイライブラリーは、概して、例えば「Phage Display: A Laboratory Manual」; Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に開示されるような標準的な手順に基づいて構築された。PCR増幅に選択されるプライマーは、軽鎖V断片の5’−SacIおよび3’−SpeI認識部位を生じた。4回の連結反応をセットアップし、各々400ngの軽鎖断片(SacI−SpeI消化、2×κおよび2×λ)および1400ngのファージミドpComb3H5BHis(SacI−SpeI消化;大きな断片;このベクターは、Ralf Lutterbuese博士の論文に記載されている)で構成された。次に、得られる4つの抗体V軽鎖プールを、エレクトロポレーション(2.5kV、0.2cmギャップキュベット、25mF、200 Ohm、Biorad gene−pulser)により300μlのエレクトロコンピテント(electrocompetent)大腸菌(Escherichia coli)XL1 Blue株に各々形質転換して、
κ1:2×108
κ2:6×107
λ1:9×107
λ2:6×107
の独立したクローンからなるライブラリーサイズを得た。
様々なPCR増幅から得たκ(軽鎖)DNA断片を、各連結について次のように秤量した。それぞれの5’−プライマーは特定のグループを定義する。これらのグループの中で、3’−プライマーはサブグループを定義する。κサブグループを、1:2:1:1(プライマー3’−hu−Vk−J1−SpeI−BsiWI:3’−hu−Vk−J2/4−SpeI−BsiWI:3’−hu−Vk−J3−SpeI−BsiWI:3’−hu−Vk−J5−SpeI−BsiWIに対応)に秤量した。グループを、それらの生殖系列分布1:1:1:0.2:0.2(プライマー5’−huVK1−Sac−2001:5’−huVK3−Sac−2001:5’−huVK2/4−Sac−2001:5’−huVK5−Sac−2001:5’−huVK6−Sac−2001に対応)に従って秤量した。
異なるPCR増幅から得たλ(軽鎖)DNA断片を、各連結について次のように秤量した。それぞれの5’−プライマーは、特定のグループを定義する。これらのグループの中で、3’−プライマーはサブグループを定義する。λサブグループを、3:1(プライマー3’−hu−Vlam−BlnI−SpeI−2001:3’−hu−Vlam2−BlnI−SpeI−2002に対応)に秤量した。
グループを、それらの生殖系列分布1:1:2:2:2:3(プライマー5’−huVL1a−SacI−2001:5’−huVL1b−SacI−2001:5’−huVL2−SacI−2001:5’−huVL4−SacI−2001+5’−huVL5−SacI−2001:5’−huVL6−SacI−2001+5’−huVL7/8−SacI−2001:5’−huVL3/9−SacI−2001に対応)に従って秤量した。
エレクトロポレーション後、それぞれの形質転換された大腸菌培養を表現型発現のためにSOC培養液(Fluka)中でインキュベートした。2つのκ培養物を組み合わせ、同様に2つのλ培養物も組み合わせた。得られるκ培養物および得られるλ培養物を、次にそれぞれ500mLの、50μg/ml カルベニシリンおよび2% w/v グルコースを含有するSB選択培地中で一晩インキュベートした。翌日、細胞を遠心分離により回収し、市販のプラスミド調製キット(Qiagen)を用いてプラスミドの調製を行った。
5.抗体ライブラリーの構築−ヒトVL−母親由来VH
PCRを行ってmAb A5B7の母親由来のVHを前記母親由来のVHを含有するベクターから増幅した。増幅のために、5’−プライマー5’−AVH−Xho I(5’−GTC ACA CTC GAG TCA GGA GGA GGC TTG GTA C−3’)(配列番号57)および3’−プライマー3’−AVH−BstEII(5’−GTC ACA GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA G−3’(配列番号58)を用いて標準的手順に従うPCRプロトコールに従った。分析用アガロースゲルからの約350bp増幅産物の精製後、DNA断片を制限酵素BstEIIおよびXho Iで切り出した。ファージミドpComb3H5BHis(このベクターはRalf Lutterbuese博士の論文に記載されている。)をしかるべく消化させ、大きな断片を上述の断片と連結させた。大腸菌XL1 blueへの形質転換後、単一のクローンを100mL SB培地(50μg/ml カルベニシリン含有)で培養し、プラスミドを標準的なプロトコールに従って調製した。挿入物を配列決定することにより首尾よいクローニングを確認した(Sequiserve,Munich)。
このベクターpComb3H5BHis/mAb A5B7の母親由来VHを制限酵素SacIおよびSpeIで制限した。大きなベクター断片を単離した。プラスミド−DNAを含有するVκライブラリーおよびVλライブラリーを制限酵素SacIおよびSpeIで制限した。小さなVκ断片およびそれぞれのVλ断片(各およそ350bp)を標準的なプロトコールに従って単離した。1200ngのベクター断片を各200ngのVκおよびVλ断片両方の混合と連結した。連結反応物をエレクトロポレーション(2.5kV、0.2cmギャップキュベット、25mF、200 Ohm)により300μLのエレクトロコンピテント(electrocompetent)大腸菌XL1 Blue株に形質転換して、1.2×108の独立したクローンからなる全scFvライブラリーサイズを得た。
表現型発現およびカルベニシリンへの緩やかな適応の後、抗体ライブラリーをSB−カルベニシリン(50μg/ml)選択培地へ移した。次に、抗体ライブラリーを感染量の1×1012粒子のヘルパーファージVCSM13で感染させ、その結果、繊維状のM13ファージの産生および分泌が得られ、この各ファージ粒子は半ヒトscFv−断片をコードする一本鎖pComb3H5BHis−DNAを含み、ファージコートタンパク質IIIへの翻訳融合として対応するscFv−タンパク質を提示した。
6.ヒトVLのファージディスプレイ選択
scFv−レパートリーを有するファージ粒子をPEG8000/NaCl沈殿および遠心分離により培養上清から回収した。次に、約1×1011〜1×1012scFvファージ粒子を0.5mLのTBS/1% BSAに再懸濁し、ストレプトアビジンコートされたELISAプレート(Nunc)のウェル中で1時間固定されたビオチン化可溶性CEAとともにインキュベートした。抗原10μg/mlのPBS溶液(50μl)をストレプトアビジンコートされたウェル中で4℃にて一晩インキュベートし、水で1回洗浄し、それに続いてTBS中200μlの3% BSAで37℃にて1時間ブロッキングし、それをインキュベーション後に取り除いた。
標的抗原と特異的結合しなかったscFvファージをTBS/0.05% Tweenでの洗浄段階により除去した。この洗浄手順は、さらなるラウンドで10回まで繰り返された。
洗浄後、HCl−グリシン、pH 2.2を用いることにより結合体を溶出した。2M Tris、pH 12での中和後、溶出液を新鮮な非感染大腸菌XL1 Blue培養株の感染に用いた。
残っている高結合体を溶出するため、50μlの新鮮な大腸菌XL1 blue培養株(OD600≧0.5)をウェルに添加し、15分間インキュベートした。次に、両方の培養物を混合し、ヒトscFv−断片をコードするファージミドコピーで首尾よく形質導入した細胞を再びカルベニシリン抵抗性について選択し、その後にVCMS13ヘルパーファージで感染させて、抗体提示およびインビトロでの選択の第2のラウンドを開始した。
4ラウンドのパニングに対応するプラスミドDNAを大腸菌培養物から単離した。可溶性scFv−タンパク質の産生のため、VH−VL−DNA断片をプラスミドから切り出し(Xho I−SpeI)、プラスミドpComb3H5BFIag/His中の同じ制限部位を介してクローニングし、その発現構築物(例えばscFv)は、scFvとHis6タグとの間にFlagタグ(TGDYKDDDDK)(配列番号59)を含み、さらなるファージタンパク質が欠失している。
連結後、各プール(異なるラウンドのパニング)のプラスミドDNAを100μL熱ショックコンピテント大腸菌TG1に形質転換し、カルベニシリンLB寒天上にプレーティングした。単一のコロニーを選定し、96ウェルプレート(Greiner)中の120μLのLBカルベニシリン(50μg/ml)1% グルコースに播種した。ウェルを半透膜(Greiner)で密封し、振盪インキュベータでプレートを37℃にて一晩インキュベートした(マスタープレート)。次に、10μlのマスタープレート培養物を、ウェルあたり90μL LBカルベニシリン(50μg/ml)0.1% グルコースを含有する第2の96ウェルプレート(ワーキングプレート)に移した。37℃の振盪インキュベータ中で4時間のインキュベーションの後、20μL LBカルベニシリン、6mM IPTGを各ウェルに添加することによりscFv生成を誘導した。振盪しながら30℃にて一晩の別のインキュベーション段階の後、細胞を、40μL 溶解緩衝液(400mM ホウ酸、320mM NaCl、4mM EDTA pH8、2.5mg/ml リゾチーム)での室温にて1時間のインキュベーションで溶解した。残りの細胞および細胞片を1.900×gで12分間の遠心分離により分離した(Hettich)。
次に、scFv分子を含有する上清を、フローサイトメトリー結合アッセイで結合について試験した。ヒトCEAでトランスフェクトしたCHO細胞をCEA陽性細胞株として用いた。最初に100,000〜200,000個の細胞をヒトscFvまたは関連する対照を含有する周辺質(periplasmic)調製物とともにインキュベートすることにより細胞結合アッセイを行った。インキュベーション後、細胞をPBS/1% FCS(ウシ胎児血清)中で洗浄し、さらに5〜10μg/mlの抗FLAG M2抗体(Sigma)とともにインキュベートした。細胞を再び洗浄した後、それらをポリクローナル、PE標識抗マウス抗体(Dianova)とともにインキュベートし、その後フローサイトメトリーにより分析した。およそ600個のクローンをCEA陽性のCHO細胞で結合シグナルについて試験した。27個の陽性クローンが得られた。それぞれのscFv DNAを配列決定した後、合計9個の異なる配列が得られた。
図2は、フローサイトメトリー分析により測定される、9個の様々な半ヒトscFv(すなわち、マウスA5B7 VH−ヒトVL)構築物とCEA−形質転換CHO細胞株の結合を示す。前記図は複数の図表を含み、1つが試験された各構築物を表す。任意の所与図表中、黒色の分布は、いずれの構築物も不在下であるが、scFvの検出に用いられるあらゆる適切な検出剤を含むPBS単独でインキュベートした細胞の蛍光強度を示す。このようにして、観察されるいずれの蛍光シフトも間違いなく検出剤または緩衝液よりもscFv構築物に起因し得る。構築物とそれぞれの細胞株との結合の指標である蛍光のシフトは、各図表中灰色の線で示される。一般に、(黒色の)対照から離れてより高い強度のシフト、すなわち対照よりもはるかに遠いシフトはより強い結合を示し、一方、(黒色の)対照から離れてより低い強度のシフト、すなわち対照により近いシフトはより弱い結合を示す。
図2から、構築物A−121、A−183、A−240、A−313、A−290、A−315、A4−35、A4−52、MP2−A5は、それぞれの対照と比較して、蛍光強度において明らかに識別できるシフトを示し、scFvとCHO標的細胞上の膜結合CEAとの結合を示すことが分かる。以下で、scFv A−240のヒトVL領域を選択し、ヒトVH領域の単離に用いた。前記ヒトA−240 VL領域は、例えば配列番号2に包含される。
実施例4:可溶性CEA抗原に対して抵抗性のあるヒト化VH領域の抗体ライブラリーの構築およびファージディスプレイ選択
以下の実験の目的は、実施例3に記載されるように選択される、scFv A−240のヒトVL領域と対となる可溶性CEA抗原に対して抵抗性のある一連のヒト化VH領域の選択である。前記ヒトA−240 VL領域は、例えば配列番号2に包含される。
1.末梢血単核細胞(PBMC)からのRNAの単離
100mLの血液を5名の健康なヒトドナーから採取した。末梢血単核細胞(PBMC)を、標準的な方法に従ってフィコール勾配により単離した。全RNAを、RNeasy(登録商標)Midi Kit(QIAGEN)を製造業者の説明書に従って用いてPBMCから単離した。cDNAを標準的な方法に従って合成した(Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989, 2001)。
2.可変重鎖領域(VH領域)のPCR増幅
VHライブラリーを構築し、Lib 134−VHと名付けた。このVH−ライブラリーは、その後にヒトFR4生殖系列配列が続く母親由来の抗体のVHCDR3と作動可能なように連結された、PCR増幅された上記のPBMCプールのVH領域由来のFR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3のヒトレパートリーで構成される。
ヒト鋳型VH領域の単離のため、5’−VH特異的プライマーセット(5’−huVH1,3,5−Xho I−2001(5’−AGG TGC AGC TGC TCG AGT CTG G−3’)(配列番号60)、5’−huVH4−Xho I−2001(5’−CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG−3’)(配列番号61)、5’−huVH4B−Xho I−2001(5’−CAG GTG CAG CTA CTC GAG TGG GG−3’)(配列番号62))および2つの3’−VH特異的プライマーセット(3’−hu−VH−BstEII−2001(5’−CTG AGG AGA CGG TGA CC−3’)(配列番号63)、3’−hu−VH−J3−BstEII−2001(5’−CTG AAG AGA CGG TGA CC−3’)(配列番号64))を用いてRT−PCRを行った。1回のPCR反応につき、1個の5’−プライマーを1個の3’−プライマーと組み合わせた;異なるPCR反応の数は、5’−および3’−プライマーの可能な組み合わせの数により決定した。5つのドナーのPBMC cDNAを、VH遺伝子の供給源として用いた。次のPCRプログラム:94℃にて15秒間の変性、52℃にて50秒間のプライマーアニーリングおよび72℃にて60秒間のプライマー伸張を40サイクル以上行い、それに続いて72℃にて10分間の最終伸張、を増幅に用いた。約350bpのサイズの増幅産物を標準的な方法に従って単離した。
Lib 134−VH領域の単離のため、RT−PCRを二段階で行った。最初に、ヒト重鎖VH−セグメント(FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3)を、上記と同じ5’−VH特異的プライマーセット(5’−huVH1,3,5−Xho I−2001、5’−huVH4−Xho I−2001、5’−huVH4B−Xho I−2001;配列番号60〜62)および3’−特異的プライマーセット(3’−A134−VH1A(5’−GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT YGC ACA GTA ATA CAC GGC−3’)(配列番号65)、3’−A134−VH1B(5’−GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT YGC ACA GTA ATA CAY RGC−3’)(配列番号66)、3’−A134−VH3A(5’−GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT NGY ACA GTA ATA CAC RGC−3’)(配列番号67)、3’−A134−VH3B(5’−GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT NGC ACA GTA ATA CAA RGC−3’)(配列番号68)、3’−A134−VH4(5’−GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CCC CCT ATC TCT SGC ACA GTA ATA CAC RGC−3’)(配列番号69))を、FR3の非常に末端の領域で一致するヒトVHサブファミリー1、3および4に対して用いて、単離された鋳型VH断片からPCR増幅した。
次のプライマーの組み合わせを用いた。
a)5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH1A
b)5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH1B
c)5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH3A
d)5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH3B
e)5’−huVH4−Xho I−2001 × 3’−A134−VH4
f)5’−huVH4B−Xho I−2001 × 3’−A134−VH4
1回のPCR反応につき、1個の5’−プライマーを1個の3’−プライマーと組み合わせた;異なるPCR反応の数は、5’−および3’−プライマーの可能な組み合わせの数により決定した。次のPCRプログラム:94℃にて15秒間の変性、52℃にて50秒間のプライマーアニーリングおよび72℃にて90秒間のプライマー伸張を40サイクル以上行い、それに続いて72℃にて10分間の最終伸張、を増幅に用いた。このPCR段階およびそれぞれの3’−プライマー配列によって、ヒトVHセグメントが母親由来のVH CDR3の一部分について延長された。それは言い換えると次の2番目の段階のPCR3’−プライマーのプライミングサイトである。
これらのVH−(FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3)DNA断片を、次に、それぞれの5’VH特異的プライマーと、増幅されたDNA断片の普遍的な3’−末端に一致する普遍的な3’プライマー(3’A134−JH6−BstEII、5’−CGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG GCC CCA GTA GTC AAA GTA GAA CCG TAG CC−3’)(配列番号70)を再び用いる2番目のPCR反応の鋳型として用いた。
次のPCRプログラム:
94℃にて15秒間の変性、52℃にて50秒間のプライマーアニーリングおよび72℃にて60秒間のプライマー伸張を40サイクル以上行い、それに続いて72℃にて10分間の最終伸張、を増幅に用いた。DNA V断片を標準的なプロトコールに従って単離した。
3.ライブラリー構築−ヒトVHプールのクローニング
前述の方法の第2ラウンドでは、1回目の前の選択(実施例3参照)で同定されたscFv A−240のヒトVLを選択し、それに続いてヒトscFvを作製する目的でヒトVH断片のライブラリーと組み合わせた。ファージディスプレイライブラリーは、概して、例えば「Phage Display: A Laboratory Manual」;Ed. Barbas, Burton, Scott & Silverman; Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001に開示されるような標準的な手順に基づいて構築された。
異なるPCR増幅からの重鎖DNA断片を各連結について次のように秤量した。
a:b:c:d:e:f=3:1:3:1:1:1、ここでa〜fは次の意味:
a)初期プライマー組み合わせ 5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH1Aに由来
b)初期プライマー組み合わせ 5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH1Bに由来
c)初期プライマー組み合わせ 5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH3Aに由来
d)初期プライマー組み合わせ 5’−huVH1,3,5−Xho I−2001 × 3’−A134−VH3Bに由来
e)初期プライマー組み合わせ 5’−huVH4−Xho I−2001 × 3’−A134−VH4に由来
f)初期プライマー組み合わせ 5’−huVH4B−Xho I−2001 × 3’−A134−VH4に由来
を有する。
400ngのヒトLib 134−VH断片プール(Xho I-BstEII消化)および1200ngのプラスミドpComb3H5BHis/A−240 VL(scFv A−240のVL領域をコードするDNAを、制限部位SacIおよびSpeIを介して標準手順に従ってpComb3H5BHisにクローニングした)で構成される、1回の連結反応を設定した。得られる抗体ヒトVHプールを、次に、300μLのエレクトロコンピテント大腸菌XL1 Blue株にエレクトロポレーション(2.5kV、0.2cmギャップキュベット、25mF、200 Ohm、Biorad gene−pulser)により形質転換し、合計で0.8×108の独立したクローンからなるライブラリーサイズを得た。
エレクトロポレーション後、アッセイをSOC培養液(Fluka)中で表現型発現のためにインキュベートした。次に培養物を、50μg/ml カルベニシリンおよび2% v/v グルコースを含有する500mLのSB選択培地中で一晩それぞれインキュベートした。翌日、培養物の細胞を遠心分離により回収し、市販のプラスミド調製キット(QIAGEN)を用いてプラスミド調製を行ってDNAライブラリーを保存した。
それぞれのscFvプールをコードする、1.5μgのこのプラスミドプールを、次に、大腸菌XL1 blue(2.5kV、0.2cmギャップキュベット、25mF、200 Ohm、Biorad gene−pulser)に電気穿孔して合計で2.4×109の独立したクローンからなるライブラリーサイズを得た。表現型発現およびカルベニシリンへの緩やかな適応の後、抗体ライブラリーをSB−カルベニシリン(50μg/ml)選択培地へ移した。次に、抗体ライブラリーを感染量の1×1012粒子のヘルパーファージVCSM13で感染させ、その結果、繊維状のM13ファージの産生および分泌が得られ、この各ファージ粒子はヒトscFv−断片をコードする一本鎖pComb3H5BHis−DNAを含み、ファージコートタンパク質IIIへの翻訳融合として対応するscFv−タンパク質を提示した。
4.ヒトVHのファージディスプレイ選択
ヒトscFv−レパートリーを有するファージ粒子をPEG8000/NaCl沈殿および遠心分離により培養上清から回収した。次に、約1×1011〜1×1012scFvファージ粒子を0.5mLのTBS/1% BSAに再懸濁し、ストレプトアビジンコートされたELISAプレート(Nunc)のウェル中で1時間固定されたビオチン化可溶性CEAとともにインキュベートした。抗原10μg/mlのPBS溶液(50μl)をストレプトアビジンコートされたウェル中で4℃にて一晩インキュベートし、水で1回洗浄し、それに続いてTBS中200μlの3% BSAで37℃にて1時間ブロッキングし、それをインキュベーション後に取り除いた。
標的抗原と特異的結合しなかったscFvファージをTBS/0.05% Tweenでの洗浄段階により除去した。この洗浄手順は、さらなるラウンドで10回まで繰り返された。
洗浄後、HCl−グリシン、pH 2.2を用いることにより結合体を溶出した。2M Tris、pH 12での中和後、溶出液を新鮮な非感染大腸菌XL1 Blue培養株の感染に用いた。
残っている高結合体を溶出するため、50μlの新鮮な大腸菌XL1 blue培養株(OD600≧0.5)をウェルに添加し、15分間インキュベートした。次に、両方の培養物を混合し、ヒトscFv−断片をコードするファージミドコピーで首尾よく形質導入した細胞を再びカルベニシリン抵抗性について選択し、その後にVCMS13ヘルパーファージで感染させて、抗体提示およびインビトロでの選択の第2のラウンドを開始した。
4ラウンドのパニングに対応するプラスミドDNAを大腸菌培養物から単離した。可溶性scFv−タンパク質の産生のため、VH−VL−DNA断片をプラスミドから切り出し(Xho I−SpeI)、プラスミドpComb3H5BFlag/His中の同じ制限部位を介してクローニングし、その発現構築物(例えばscFv)は、scFvとHis6タグとの間にFlagタグ(TGDYKDDDDK)(配列番号59)を含み、さらなるファージタンパク質が欠失している。
連結後、各プール(異なるラウンドのパニング)のプラスミドDNAを100μL熱ショックコンピテント大腸菌TG1に形質転換し、カルベニシリンLB寒天上にプレーティングした。単一のコロニーを選定し、96ウェルプレート(Greiner)中の120μLのLBカルベニシリン(50μg/ml)1% グルコースに播種した。ウェルに半透膜(Greiner)で密封し、振盪インキュベータでプレートを37℃にて一晩インキュベートした(マスタープレート)。次に、10μlのマスタープレート培養物を、ウェルあたり90μL LBカルベニシリン(50μg/ml)0.1% グルコースを含有する第2の96ウェルプレート(ワーキングプレート)に移した。37℃の振盪インキュベータ中で4時間のインキュベーションの後、20μL LBカルベニシリン、6mM IPTGを各ウェルに添加することによりscFv生成を誘導した。振盪しながら30℃にて一晩の別のインキュベーション段階の後、細胞を、40μL 溶解緩衝液(400mM ホウ酸、320mM NaCl、4mM EDTA pH8、2.5mg/ml リゾチーム)での室温にて1時間のインキュベーションで溶解した。残りの細胞および細胞片は1,900×gで12分間の遠心分離により分離した(Hettich)。
次に、scFv分子を含有する上清を、フローサイトメトリー結合アッセイで結合について試験した。
ヒトCEAをトランスフェクトしたCHO細胞をCEA陽性細胞株として用いた。最初に100,000〜200,000個の細胞をヒトscFvまたは関連する対照を含有する周辺質調製物とともにインキュベートすることにより細胞結合アッセイを行った。インキュベーション後、細胞をPBS/1% FCS(ウシ胎児血清)中で洗浄し、さらに5〜10μg/mlの抗FLAG M2抗体とともにインキュベートした。細胞を再び洗浄した後、それらをポリクローナル、PE標識抗マウス抗体(Dianova)とともにインキュベートし、その後フローサイトメトリーにより分析した。46個のクローンをCEA陽性のCHO細胞で結合シグナルについて試験した。それらの全てが陽性のシグナルを示した。それぞれのscFv DNAを配列決定した後、合計9個の異なる配列が得られ、そのうちの8個が高度の相同性を示した。ヒト化構築物MP510_3A−5.3(MP510−A5;配列番号2)、MP510_3−B9.1(MP511−B9;配列番号4)、MP510_3−D8.1(MP511−D8;配列番号6)が、さらなる特性決定のために選択された。これらの構築物中のヒト化VH領域は、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を含有する。scFvの対応するアミノ酸配列を表1に示す。
前記ヒト化構築物MP510−A5、MP511−B9、MP511−D8ならびに半ヒト構築物A−240 Vλ.3(マウスVH A5B7/ヒトVLA240)の周辺質抽出物を、CEA陽性および陰性の細胞株でのフローサイトメトリー実験でさらに分析した。図3から、ヒト化構築物MP510−A5(配列番号2)、MP511−B9(配列番号4)、MP511−D8(配列番号6)は、それぞれの半ヒト対照A−240 Vλ.3(マウスVH A5B7/ヒトVLA240)と比較して、明らかに識別できるシフトを蛍光強度において示すことが分かる。従って、ヒトscFv構築物は、膜結合ヒトCEAに対して半ヒト構築物A−240 Vλ.3よりも強い結合活性を示す。さらに、全てのヒト構築物は、CEA陽性のヒトKATO III細胞(ヒト胃癌細胞株)との明確な結合を示したのに対し、それらのどれもがCEA陰性の非トランスフェクトCHO細胞ならびにCEA陰性のヒトNALM6細胞(ヒトB細胞株)との結合を示さなかった(データは示さず)。
実施例5:可溶性CEA抗原に対する抵抗性を有するヒト化IgG1抗体の作製および特性決定
細菌は機能的なFab断片を発現することが知られているが、それらは通常、完全な機能的免疫グロブリンを産生することはできない。完全な機能的IgG1抗体の産生のためには、哺乳類細胞を使用する必要があり、そのために実施例4で選択したscFv A−240のVL領域およびscFv分子の様々なVH領域(特にscFv A5、scFv D8およびscFv B9のVH領域)が哺乳類発現ベクターにサブクローニングされた。
1.scFv A−240に基づくヒト軽鎖のクローニング
クローンA−240のヒトVLは、Bsu36I制限部位をその核酸配列に含有した。従って、標準的なプロトコールを用いて、アミノ酸交換をもたらさないヌクレオチド交換を制限モチーフ中に有する変異体が生成された(A−240delBsu)。
VL A−240の適した哺乳類発現ベクターへのクローニングのため、適した末端制限部位を挿入する必要があった。従って、scFv A240のVL領域をコードするDNA断片を、プライマー、5’−A240−Bsu36I (TTCTCTCCTTAGGTGTCCACTCC CAG GCC GTG CTG ACT CAG CCG GC)(配列番号93)および3’−A240−オーバーラップ(GCCTTGGGCTGACCTAGGACGGTCAACTTGGTCC)(配列番号94)を用いるPCRにより再び増幅した。
2回目のPCRでは、ヒトλ定常領域を、標準的な方法に従って5’−プライマー5’−Clam−オーバーラップ(GTTGACCGTCCTAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCG)(配列番号95)および3’−プライマー3’−Clam−Notl(GACGTA GCGGCCGC GTCGAC CTATGAACATTCTGTAGGGGC)(配列番号96)を用いてヒトcDNAプールから増幅した。両方のPCRの約330bpのDNA産物は同一の3’(A−240)または5’(Cλ)オーバーラップを配列中に有した。
2つの断片を、5’−プライマー5’−A240−Bsu36Iおよび3’−プライマー3’−Clam−Notlと組み合わせて融合PCRに(標準的なプロトコールに従って)用いて、ヒトλ定常領域と融合したヒトVL A−240をコードする全長軽鎖産物を生成した(配列番号80に示されるアミノ酸配列に対応)。このDNA断片は、5’末端にBsu36I部位を含有し、かつ3’−末端にSalI制限部位とそれに続いてNotI制限部位を含有した。
次に、この断片を、Bsu36IおよびNot Iにより、従ってヒトリーダー配列を加えることによりpBS由来のプラスミド(上記)にサブクローニングした。この構築物を配列決定により検証した。EcoRIおよびSalIを利用して、A−240 VL−CλDNAを前記構築物から切り出し、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)をコードするcDNAをマウスアデノシンデアミナーゼ(ADA)をコードするcDNAと置換することにより発現ベクターpEF−DHFRに由来する真核生物発現ベクターpEF−ADAにサブクローニングした(Mack et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 7021-5)。pEF−ADAはRaum(上記引用文中)に記載されている。A−240 VL−Cλのアミノ酸配列(A240軽鎖に対応)は配列番号80に示される。
2.ヒト化重鎖可変ドメインのクローニング
実施例4で選択された様々なヒト化VH領域(特にscFv A5、scFv D8およびscFv B9のVH領域)から、可変領域をPCRにより再増幅し、両末端にBsu36I制限部位を生成した。全ての構築物について、2つのプライマーの組み合わせ:5’−プライマー5’−CVH−Bsu36I (5’−TTCTCTCCTTAGGTGTCCACTCC GAG GTG CAG CTG GTC GAG TC−3’)(配列番号97)および3’−プライマー3’−CVH−Bsu36I (5’−GACTCACCTGAGGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC TTG G−3’)(配列番号98)を用いた。次に、得られるDNA断片を、これらの制限部位を用いて、既に真核生物のリーダー配列とヒトIgG1重鎖定常領域をコードするDNA断片を含有する真核生物発現ベクターpEF−DHFRにサブクローニングした。従って重鎖可変領域はリーダーと重鎖定常領域の間に挿入した。可変領域の正しい配列は配列決定により確認した。A5重鎖のアミノ酸配列は配列番号77に示され、B9重鎖のアミノ酸配列は配列番号78に示され、D8重鎖のアミノ酸配列は配列番号79に示される。
3.ヒト化完全IgGタンパク質の発現
1本の軽鎖をコードするプラスミドおよび1本の重鎖をコードするプラスミド(VH/ヒトIgG1定常領域)を、一過性のタンパク質発現のための標準的なプロトコールに従ってHEK細胞に同時導入し、細胞を培養して免疫グロブリンの培地中への発現および産生を可能とした。このように、scFv A5に由来するIgG1 A5、scFv D8に由来するIgG1 D8およびscFv B9に由来するIgG1 B9を産生させた。それぞれの製造期間の後、上清を回収し、免疫グロブリンの精製のための標準的なプロトコールに従ってプロテインAクロマトグラフィーによってヒト免疫グロブリンを単離した。次に、培養上清、ならびに精製された免疫グロブリンをさらなる特性決定実験に用いた。
A5重鎖のアミノ酸配列は配列番号77に示され、B9重鎖のアミノ酸配列は配列番号78に示され、D8重鎖のアミノ酸配列は配列番号79に示される。A240軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号80に示される。
scFv A5に由来するIgG1 A5は、配列番号77に示されるA5重鎖と配列番号80に示されるA240軽鎖のアミノ酸配列を含む。scFv B9に由来するIgG1 B9は、配列番号78に示されるB9重鎖のアミノ酸配列と配列番号80に示されるA240軽鎖のアミノ酸配列を含む。scFv D8に由来するIgG1 D8は、配列番号79に示されるD8重鎖のアミノ酸配列と配列番号80に示されるA240軽鎖のアミノ酸配列を含む。これらのIgG1抗体構築物中の(ヒト化)VH領域は、マウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を含有する。上述の重鎖および軽鎖の対応するアミノ酸配列を表1に示す。
4.可溶性CEA抗原に対する抵抗性を有するヒト化IgG1抗体の特性決定
4.1 固定化された可溶性CEA(sCEA)抗原との結合
重鎖+軽鎖の二重形質転換体の培養上清ならびに対応する精製抗体の調製物を、固定化されたsCEA抗原上での結合についてELISAにより標準的な手順に従って試験した。無関係なヒトIgG1抗体を陰性対照として含んだ。
手短に言えば、抗体結合を固定化CEA抗原上で試験し、CEA特異性を実証するために、それぞれ10ug/mlおよび1ug/mlの培養上清および精製抗体溶液を用いて、コートされたCEA抗原の不在下でも試験した。これらの抗体溶液を、+/−抗原コートウェル(4℃、一晩)およびBSAブロックしたウェル(37℃、1時間)に添加した。検出は、ペルオキシダーゼ標識ポリクローナルヒトIgG抗体(Jackson ImmunoResearch)により行った。ABTS溶液での適切なインキュベーション後にシグナルを測定した。
図4に示されるように、ヒト化抗体IgG1 A5、IgG1 D8およびIgG1 B9ならびに実施例2のhuIgG1 CEA IおよびCEA II構築物は、陰性対照と比較して固定化された可溶性CEA(sCEA)抗原との明確な結合を示し、sCEA抗原がコートされない点で異なる同等の設定では結合を示さなかった。
4.2 天然CEA抗原との細胞上での結合
ヒト化IgG1 A5、IgG1 D8およびIgG1 B9構築物の精製抗体調製物ならびに実施例2のhuIgG1−CEA Iおよび−CEA II構築物を、CEAを発現しているKato III細胞、CEAトランスフェクトCHO細胞およびCEA非トランスフェクトCHO細胞でFACS分析により試験した。
2×105細胞を、精製抗体調製物とともにインキュベートした(通常10〜20μg/ml)。検出は、ビオチン化ポリクローナル抗ヒトIgG抗体(DAKO)、それに続いてPE標識ストレプトアビジン(Jackson ImmunoResearch)(通常10〜20μg/ml)により行った。インキュベーションは氷上で20〜40分間行った。
ヒト化IgG1 A5、IgG1 D8およびIgG1 B9構築物ならびに実施例2のhuIgG−CEA Iおよび−CEA II構築物はCEA陽性細胞に対して明確な結合を示した(図5A、BおよびC)。いずれの抗体も非トランスフェクトCHO細胞との結合を示さなかった。IgG−対照はKato細胞、CHO/CEA−細胞および非トランスフェクトCHO細胞上で陰性であった。
4.3 抗体依存性の細胞に媒介される細胞障害活性(ADCC;51Cr放出アッセイ)
51Cr放出アッセイのため、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)をエフェクター細胞として健康なドナーから単離した。フィコール密度勾配遠心分離とその後の100×g遠心分離段階よりPBMCを分離した。刺激されていないPBMC(5×105細胞)を、平底マイクロタイタープレートの各ウェルに100μlの容積の10% FCSを含むRPMI 1640培地に添加し、37℃にて一晩インキュベートした。標的細胞として、CEA陽性の胃癌細胞株KATO IIIを用いた。標的細胞(50,000細胞)を2時間51Crで標識した。標識した標的細胞(100μl)および様々な濃度の抗体(10pg/ml〜10μg/ml)をPBMCに添加し、37℃にて18時間インキュベートした。対応する結合していないアイソタイプを陰性対照として用いた。特異的溶解を、((実験放出cpm)−(自然放出cpm))/((最大放出cpm)−(自然放出cpm))として計算した。
sCEAの不在下で、ヒト化抗CEA抗体IgG1 A5、IgG1 D8およびIgG1 B9は、陰性対照と比較してCEA陽性胃癌細胞株KATO IIIに細胞障害活性を媒介することが分かった。実施例2に示されるように、抗体CEA IおよびCEA II(huIgG1−CEA IおよびCEA II構築物)のIgG版に関して同じ結果が観察されている。同時に、抗体サンプルを攪拌下で20分間可溶性CEA(sCEA)抗原でプレインキュベートし、次に標識した標的細胞とヒトPBMCを混合した。さもなければ、アッセイは上記のように行った。可溶性CEA(sCEA)抗原を、様々な濃度、すなわち、1μg/mlおよび10μg/mlで用いた。アッセイを測定し、それぞれの細胞障害値をプロットした。
2つの代表的な結果を、それぞれ抗体CEA IIおよび抗体IgG1 A5について図6AおよびBに示す。このアッセイにおいて、抗体CEA IIの細胞溶解能が可溶性CEA抗原の存在下で用量依存的に劇的に低減されたことが実証された。それぞれの曲線は、可溶性CEAを含まない曲線と比較して、1ug/ml sCEAの存在下で明らかに右にシフトする。10ug/ml sCEAの存在下では、検出レベルを下回る抗体CEA IIの細胞溶解活性の完全な低下を示す、細胞溶解曲線は観察されなかった。それぞれのEC50値(最大半量の細胞溶解抗体濃度)は、ベースレベルで最も低い(the last)細胞障害値よりも濃度が高いと推定された。このことは、抗体CEA IIに関するEC50レベルの過小評価と、おそらくさらにより高い、下に定められる「阻害因子」を導く。
これに対し、細胞溶解アッセイにおいて可溶性CEA抗原の有意な阻害効果は抗体IgG1 A5、IgG1 B9およびIgG1 D8に関して実証されなかった。全ての抗体が可溶性CEAの不在下で同程度のEC50値を示した。このことは可溶性CEAの不在下での同程度の細胞溶解活性を示す。
EC50値を解析ソフトウェアにより決定した。EC 50値を表2に表す。
可溶性CEA抗原の存在下での細胞溶解性の阻害を「阻害因子」に変換した。この因子は、ADCCアッセイにおける10および1ug/ml 可溶性CEAの存在下でのEC50を可溶性CEAの不在下でのEC50で割ったものと定義される。阻害因子を表3に表す。
阻害因子のグラフ表示が図7に示される。この図は明らかに、1ug/mlの可溶性CEA抗原の存在下で、可溶性CEA抗原の存在下で37倍以上の細胞溶解活性の低下を示し、CEA IIが劇的に細胞溶解活性を低減させたこと、一方、IgG1 A5およびIgG1 D8に媒介される、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性は可溶性CEAに対して完全に抵抗性であることを示す。IgG1 B9に媒介される、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性はsCEAによりごくわずかな影響しか受けない。前記抗体構築物は10を下回る阻害因子を示す。
この効果は、ADCCアッセイにおいて10ug/ml濃度の可溶性CEAでさらにより明白である。抗体CEA IIの細胞溶解曲線はベースラインまで低下している(最大濃度でさえも細胞溶解活性は検知することができなかった)。従って、抗体CEA IIの阻害因子は、おそらくはるかに低く見積もって最高で74であると推定された。
要約すれば、可溶性CEAの存在下で、huIgG−CEA II(mAb T84.66に由来)は、CEA陽性標的細胞に対して劇的に低下した細胞障害活性のを示した;実施例2および5参照。これに対し、ヒト化CEA抗体IgG1 A5、IgG1 D8およびIgG1 B9は、可溶性CEAの不在下での活性と比較して、細胞溶解活性の有意な低下を示さなかった。IgG1 A5、IgG1 B9およびIgG1 D8に媒介される、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性は可溶性CEAに対して抵抗性である。驚くことに、そのほかの点では完全なヒトIgG1抗体のIgG1 A5、IgG1 D8およびIgG1 B9のVH領域中のマウスモノクローナル抗体A5B7のCDR−H3のKabatの位置95〜102に相当するアミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)は、可溶性CEA抗原に対する抵抗性を媒介するのに十分である。
VH、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、VLおよびCL領域を含むIgG分子の模式図である。VHおよびVL領域のCDRは黒色の長方形で示される。 Flagがタグされた、選択されたクローン由来のCEA特異的scFvタンパク質断片を含有する周辺質調製物のフローサイトメトリー分析を示す。scFvの各々は、実施例3に記載されるように、マウスA5B7VH領域とヒトVL領域からなる。可溶性scFvタンパク質断片の周辺質調製物を100,000〜200,000個のCEAをトランスフェクトしたCHO細胞に添加した。検出のため、モノクローナル抗Flag抗体を用い、その後にPE標識ポリクローナル抗マウス抗体を用いた。細胞と結合しているScFvを、蛍光強度を増加させて、PBSのみでインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をX軸にブロットし、イベントの数をY軸にブロットした。陰性対照(PBSおよび検出試薬)は黒く塗られた曲線で示し、個別のscFvは灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。全てのscFv、すなわち、A−121、A−183、A−240、A−313、A−290、A−315、A4−35、A4−52およびMP2−A5は、CHO細胞上で膜と結合したCEAと結合する。 Flagがタグされた、選択されたクローン由来のCEA特異的scFvタンパク質断片を含有する周辺質調製物のフローサイトメトリー分析を示す。これらのscFvの各々は、実施例4に記載されるように、ヒト化VH領域とヒトVL領域A240からなる。可溶性scFvタンパク質断片の周辺質調製物を100,000〜200,000個のCEAをトランスフェクトしたCHO細胞に添加した。モノクローナル抗Flag抗体、続いてPE標識ポリクローナル抗マウス抗体で検出を行った。細胞と結合しているScFvを、蛍光強度を増加させて、PBSのみでインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をX軸にブロットし、イベントの数をY軸にブロットした。陰性対照(PBSおよび検出試薬)は黒く塗られた曲線で示し、個別のscFvは灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。ヒト化scFv構築物MP510_3A5.3、MP510_3−B9.1、およびMP510_3−D8.1はCHO細胞上で膜と結合したCEAと結合する。240Vλ.3は、マウスA5B7VH領域とヒトVLA−240領域からなるscFvである。この構築物はまた、CEA結合活性を示す。 ヒト化抗体A5、B9、D8の精製ヒトIgG1版および抗体CEA IおよびCEA IIのヒトIgG1版ならびに抗体含有培養上清のELISA分析を示す。無関係なヒトIgG1抗体を陰性対照として含んだ。抗体結合を、固定化されたCEA抗原で、さらにCEA特異性の実証のためにコートされたCEA抗原の不在下で試験した。培養上清、10ug/mlおよび1ug/ml 抗体溶液をBSAでブロックされた+/−抗原コートウェルに添加した。検出をペルオキシダーゼ標識ポリクローナルヒトIgG抗体(Jackson ImmunoResearch)により行った。ABTS溶液を用いる適当なインキュベーションの後にシグナルを測定した。シグナル強度をY軸にプロットする。抗体CEA IおよびCEA IIならびにヒト化抗体IgG1 A5、IgG1 B9およびIgG1 D8と、固定化されたヒトCEA抗原との特異的結合をこの実験で実証することができた。 10ug/mlの抗体濃度を用いる、精製したCEA抗体およびそれぞれの陰性対照のフローサイトメトリー分析(図4参照)を示す。抗体サンプルを、100,000〜200,000個のCEA陽性Kato III細胞(A)、CEAトランスフェクトCHO細胞(B)およびCEA陰性CHO細胞(C)に添加した。検出は、ビオチン化ポリクローナル抗ヒトIgG抗体(DAKO)、それに続いてPE標識ストレプトアビジン(Jackson ImmunoResearch)で行った。細胞と結合している抗体を、蛍光強度を増加させて、それぞれのアイソタイプ対照とともにインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をX軸にブロットし、イベントの数をY軸にブロットした。陰性対照(PBSおよび検出試薬)は黒く塗られた曲線で示し、それぞれの抗体は灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。抗体CEA IおよびCEA IIならびにヒト化抗体IgG1 A5、IgG1 B9およびIgG1 D8と、細胞上のヒトCEA抗原との特異的結合をこの実験で実証することができた。 10ug/mlの抗体濃度を用いる、精製したCEA抗体およびそれぞれの陰性対照のフローサイトメトリー分析(図4参照)を示す。抗体サンプルを、100,000〜200,000個のCEA陽性Kato III細胞(A)、CEAトランスフェクトCHO細胞(B)およびCEA陰性CHO細胞(C)に添加した。検出は、ビオチン化ポリクローナル抗ヒトIgG抗体(DAKO)、それに続いてPE標識ストレプトアビジン(Jackson ImmunoResearch)で行った。細胞と結合している抗体を、蛍光強度を増加させて、それぞれのアイソタイプ対照とともにインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をX軸にブロットし、イベントの数をY軸にブロットした。陰性対照(PBSおよび検出試薬)は黒く塗られた曲線で示し、それぞれの抗体は灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。抗体CEA IおよびCEA IIならびにヒト化抗体IgG1 A5、IgG1 B9およびIgG1 D8と、細胞上のヒトCEA抗原との特異的結合をこの実験で実証することができた。 10ug/mlの抗体濃度を用いる、精製したCEA抗体およびそれぞれの陰性対照のフローサイトメトリー分析(図4参照)を示す。抗体サンプルを、100,000〜200,000個のCEA陽性Kato III細胞(A)、CEAトランスフェクトCHO細胞(B)およびCEA陰性CHO細胞(C)に添加した。検出は、ビオチン化ポリクローナル抗ヒトIgG抗体(DAKO)、それに続いてPE標識ストレプトアビジン(Jackson ImmunoResearch)で行った。細胞と結合している抗体を、蛍光強度を増加させて、それぞれのアイソタイプ対照とともにインキュベートした細胞と比較して測定した。蛍光強度をX軸にブロットし、イベントの数をY軸にブロットした。陰性対照(PBSおよび検出試薬)は黒く塗られた曲線で示し、それぞれの抗体は灰色の線で示す。右への移動は細胞との正の結合を示す。抗体CEA IおよびCEA IIならびにヒト化抗体IgG1 A5、IgG1 B9およびIgG1 D8と、細胞上のヒトCEA抗原との特異的結合をこの実験で実証することができた。 ヒト化抗体A5、B9、D8の精製ヒトIgG1版および抗体CEA IIのヒトIgG1版の細胞障害活性分析(ADCCアッセイ)を示す。標的細胞(CEAトランスフェクトCHO細胞)をクロム51で標識し、ヒトPBMCの存在下で個々の抗体の量を低下させて18時間、そして2つの濃度の可溶性ヒトCEA抗原(それぞれ10および1ug/ml)の存在下でインキュベートした。2つの代表結果は、図6AのCEA II抗体および図6BのIgG1 A5抗体に示される。これらの2つの例は、ヒト化抗体IgG1 A5に対する可溶性CEAの細胞障害阻害効果がないこと(図6B)、それに対してCEA II抗体の細胞溶解活性は1ug/mlの可溶性CEAの存在下で劇的に低下し、10ug/mlの可溶性CEAの存在下でさらに検出レベルを下回って低下する(図6A)ことを明らかに示している。 ヒト化抗体A5、B9、D8の精製ヒトIgG1版および抗体CEA IIのヒトIgG1版の細胞障害活性分析(ADCCアッセイ)を示す。標的細胞(CEAトランスフェクトCHO細胞)をクロム51で標識し、ヒトPBMCの存在下で個々の抗体の量を低下させて18時間、そして2つの濃度の可溶性ヒトCEA抗原(それぞれ10および1ug/ml)の存在下でインキュベートした。2つの代表結果は、図6AのCEA II抗体および図6BのIgG1 A5抗体に示される。これらの2つの例は、ヒト化抗体IgG1 A5に対する可溶性CEAの細胞障害阻害効果がないこと(図6B)、それに対してCEA II抗体の細胞溶解活性は1ug/mlの可溶性CEAの存在下で劇的に低下し、10ug/mlの可溶性CEAの存在下でさらに検出レベルを下回って低下する(図6A)ことを明らかに示している。 可溶性CEA抗原の存在下での細胞溶解の阻害を「阻害因子」に変換した。この因子は、可溶性CEAの不在下でのEC50で割った、ADCCアッセイにおける10および1ug/mlの可溶性CEAの存在下でのEC50として定義される。CEA IIが、可溶性CEA抗原の存在下で劇的に低下した細胞溶解活性を有し、それに対してIgG1 A5、IgG1 B9およびIgG1 D8に媒介される、腫瘍細胞に対する細胞溶解活性は可溶性CEAに対して抵抗性であることが明らかに示され得る。

Claims (27)

  1. ヒトにおける上皮腫瘍の治療のための医薬組成物であって、前記医薬組成物がヒトCEAと特異的に結合するIgG1抗体を含み、前記IgG1抗体の可変領域が、少なくとも、
    (a)アミノ酸配列「SYWMH」(配列番号29)を有するCDR−H1と、アミノ酸配列「FIRNKANGGTTEYAASVKG」(配列番号28)を有するCDR−H2と、アミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を有するCDR−H3、
    および
    (b)アミノ酸配列「TYAMH」(配列番号31)を有するCDR−H1と、アミノ酸配列「LISNDGSNKYYADSVKG」(配列番号30)を有するCDR−H2と、アミノ酸配列「DRGLRFYFDY」(配列番号27)を有するCDR−H3
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、かつ
    前記可変領域が、アミノ酸配列「TLRRGINVGAYSIY」(配列番号34)を有するCDR−L1および/またはアミノ酸配列「YKSDSDKQQGS」(配列番号33)を有するCDR−L2および/またはアミノ酸配列「MIWHSGASAV」(配列番号32)を有するCDR−L3を含む、医薬組成物。
  2. 前記IgG1抗体の軽鎖定常領域がλ軽鎖定常領域である、請求項1に記載の医薬組成物。
  3. 前記IgG1抗体の可変領域のVH領域のアミノ酸配列が配列番号20、22または24である、請求項1に記載の医薬組成物。
  4. 前記IgG1抗体の可変領域のVL領域のアミノ酸配列が配列番号26である、請求項1に記載の医薬組成物。
  5. 前記IgG1抗体の可変領域が、
    (a)VH領域が、配列番号22に示されるアミノ酸配列からなり、VL領域が、配列番号26に示されるアミノ酸配列からなる;
    (b)VH領域が、配列番号20に示されるアミノ酸配列からなり、VL領域が、配列番号26に示されるアミノ酸配列からなる;および
    (c)VH領域が、配列番号24に示されるアミノ酸配列からなり、VL領域が、配列番号26に示されるアミノ酸配列からなる
    からなる群より選択される、請求項1から4のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  6. 前記IgG1抗体が、
    (a)配列番号77に示される重鎖のアミノ酸配列と、配列番号80に示される軽鎖のアミノ酸配列;
    (b)配列番号78に示される重鎖のアミノ酸配列と、配列番号80に示される軽鎖のアミノ酸配列;
    (c)配列番号79に示される重鎖のアミノ酸配列と、配列番号80に示される軽鎖のアミノ酸配列;および
    (d)(a)、(b)または(c)のアミノ酸配列と少なくとも85%同一の、より好ましくは少なくとも90%同一の、最も好ましくは少なくとも95%同一のアミノ酸配列
    からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  7. 前記上皮腫瘍が、胃腸腺癌(gastrointestinal adenocarcinoma)、乳腺腺癌または肺腺癌である、請求項1から6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  8. 前記胃腸腺癌が、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である、請求項7に記載の医薬組成物。
  9. 前記医薬組成物が進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはCEA血清中濃度が100ng/mlより高い腫瘍患者の治療のためのものである、請求項1から8のいずれかに記載の医薬組成物。
  10. IgG1抗体が、CDR移植、ヒト化および/または脱免疫化されている、請求項1から9のいずれかに記載の医薬組成物。
  11. 請求項1から10のいずれかに記載のIgG1抗体をコードする核酸。
  12. 請求項11に記載の核酸を含むベクター。
  13. 請求項11に記載の前記核酸と作動可能なように連結されている調節配列をさらに含む、請求項12に記載のベクター。
  14. 発現ベクターである、請求項12または13に記載のベクター。
  15. 請求項11に記載の核酸または請求項12から14のいずれかに記載のベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主(但し、ヒトを除く)
  16. 請求項1から10のいずれかに記載の医薬組成物の製造のためのプロセスであって、前記プロセスが、請求項15に記載の宿主を請求項1から10のいずれかに記載のIgG1抗体の発現を可能にする条件下で培養する段階と、産生されたIgG1抗体を培養物から回収する段階とを含む、プロセス。
  17. 担体、安定剤および/または賦形剤からなる、適した製剤をさらに含む、請求項1から10のいずれかに記載の医薬組成物。
  18. 請求項1から10のいずれかに記載のIgG1抗体、請求項11に記載の核酸、請求項12から14のいずれかに記載のベクター、または請求項15に記載の宿主の、ヒトにおける上皮腫瘍の予防、治療または寛解のための医薬組成物の調製のための使用。
  19. 前記上皮腫瘍が、胃腸腺癌、乳腺腺癌または肺腺癌である、請求項18に記載の使用。
  20. 前記胃腸腺癌が、結腸直腸腺癌、膵臓腺癌、食道腺癌または胃腺癌である、請求項19に記載の使用。
  21. 医薬組成物が、進行性腫瘍、後期腫瘍、腫瘍量の多い腫瘍患者、転移性腫瘍、またはCEA血清中濃度が100ng/mlより高い腫瘍患者の治療のためのものである、請求項18から20のいずれかに記載の使用。
  22. 前記医薬組成物が、さらなる薬剤と組み合わせて投与されることに適している、請求項18から21のいずれかに記載の使用。
  23. さらなる薬剤と組み合わせて投与される、請求項1から10のいずれかに記載の医薬組成物。
  24. 前記薬剤が、非タンパク質性化合物またはタンパク質性化合物である、請求項23に記載の医薬組成物または請求項22に記載の使用。
  25. 前記タンパク質性化合物または非タンパク質性化合物が、請求項1から10のいずれかに記載のIgG1抗体、請求項11に記載の核酸、請求項12から14のいずれかに記載のベクター、または請求項15に記載の宿主と同時または非同時に投与される、請求項23または24に記載の医薬組成物あるいは請求項24に記載の使用。
  26. 請求項1から10のいずれかに記載のIgG1抗体、請求項11に記載の核酸、請求項12から14のいずれかに記載のベクター、または請求項15に記載の宿主を含む、キット。
  27. 前記CEA血清中濃度がELISAにより測定される、請求項9に記載の医薬組成物、または請求項21に記載の使用。
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Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9453251B2 (en) 2002-10-08 2016-09-27 Pfenex Inc. Expression of mammalian proteins in Pseudomonas fluorescens
EP2412816B1 (en) 2004-07-26 2014-12-03 Pfenex Inc. Process for improved protein expression by strain engineering
CN101370827B (zh) 2005-12-21 2015-10-14 麦克罗梅特股份公司 具有cea抗性的药物组合物
US9580719B2 (en) 2007-04-27 2017-02-28 Pfenex, Inc. Method for rapidly screening microbial hosts to identify certain strains with improved yield and/or quality in the expression of heterologous proteins
MX2009011523A (es) 2007-04-27 2009-11-09 Dow Global Technologies Inc Metodo para clasificar rapidamente huespedes microbianos para identificar ciertas cepas con rendimiento y/o calidad mejorados en la expresion de proteinas heterologas.
WO2013054320A1 (en) 2011-10-11 2013-04-18 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Antibodies to carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule (ceacam)
US11427647B2 (en) 2014-04-27 2022-08-30 Famewave Ltd. Polynucleotides encoding humanized antibodies against CEACAM1
AP2016009564A0 (en) 2014-04-27 2016-11-30 Ccam Biotherapeutics Ltd Humanized antibodies against ceacam1
AR106188A1 (es) 2015-10-01 2017-12-20 Hoffmann La Roche Anticuerpos anti-cd19 humano humanizados y métodos de utilización
BR112018000835A2 (pt) 2015-10-02 2018-09-11 Hoffmann La Roche molécula, um ou mais polinucleotídeos, um ou mais vetores, célula, método de produção da molécula, composição, uso da molécula, método de tratamento de uma doença e método para induzir a lise de uma célula-alvo
MX2018005229A (es) 2015-12-09 2019-04-29 F Hoffmann­La Roche Ag Anticuerpo anti-cd20 de tipo ii y usos del mismo.
CA3006529A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2017184895A2 (en) * 2016-04-20 2017-10-26 Aelan Cell Technologies, Inc. Compositions and methods related to κ180 dimethylated h1.0 protein
CN107663240B (zh) * 2016-07-29 2021-01-12 中国人民解放军第四军医大学 高度糖基化cea特异性结合的单链抗体及其在检测和治疗上的应用
CN106749667B (zh) * 2016-12-04 2020-07-14 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 一种抗癌胚抗原的纳米抗体及其应用
JP7252953B2 (ja) 2017-10-25 2023-04-05 エアラン セル テクノロジーズ, インコーポレイテッド H1.0k180me2抗体、その作製および使用の方法
JP2021528988A (ja) 2018-07-04 2021-10-28 エフ・ホフマン−ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 新規の二重特異性アゴニスト4−1bb抗原結合分子
TW202030204A (zh) 2018-12-21 2020-08-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 靶向腫瘤之超促效cd28抗原結合分子
MA54513A (fr) 2018-12-21 2022-03-30 Hoffmann La Roche Molécules de liaison à l'antigène cd28 agonistes de ciblage de tumeurs
JP2022538075A (ja) 2019-06-26 2022-08-31 エフ・ホフマン-ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト 抗体結合cea及び4-1bblの融合
AR119382A1 (es) 2019-07-12 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso
AR119393A1 (es) 2019-07-15 2021-12-15 Hoffmann La Roche Anticuerpos que se unen a nkg2d
EP4178985A1 (en) 2020-07-10 2023-05-17 F. Hoffmann-La Roche AG Antibodies which bind to cancer cells and target radionuclides to said cells
JP2024504931A (ja) 2021-01-12 2024-02-02 エフ・ホフマン-ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト がん細胞に結合し、放射性核種を前記細胞に標的化するスプリット抗体
WO2022152701A1 (en) 2021-01-13 2022-07-21 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy
WO2023099683A1 (en) * 2021-12-02 2023-06-08 Sanofi Cea assay for patient selection in cancer therapy

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9014932D0 (en) 1990-07-05 1990-08-22 Celltech Ltd Recombinant dna product and method
GB9324807D0 (en) * 1993-12-03 1994-01-19 Cancer Res Campaign Tech Tumour antibody
GB9709421D0 (en) * 1997-05-10 1997-07-02 Zeneca Ltd Chemical compounds
TW200401638A (en) 2002-06-20 2004-02-01 Bristol Myers Squibb Co Heterocyclic inhibitors of kinases
CA2501616C (en) * 2002-10-08 2015-05-12 Immunomedics, Inc. Antibody therapy
CN101370827B (zh) * 2005-12-21 2015-10-14 麦克罗梅特股份公司 具有cea抗性的药物组合物

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