MXPA06011199A - Anticuerpos anti-tgf-beta humanizados. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan anticuerpos anti-TGF-beta, tambien como metodos para su preparacion y uso, en los que se incluyen metodos para el tratamiento de alteraciones TFG-beta, por ejemplo cancer. Tambien se proporcionan articulos de manufactura disenados para varios usos que contienen los anticuerpos humanizados.

Description

ANTICUERPOS ANTI-TGF-BETA HUMANIZADOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con anticuerpos anti-TGF-beta humanizados y métodos para la preparación de los mismos y el uso de los mismos en métodos para el tratamiento de alteración relacionadas con TGF-beta. Los anticuerpos son útiles, por ejemplo en purificaciones de inmunoafinidad, pruebas inmunológicas, formación de imagen in vivo, análisis de radioreceptor y tratamientos en donde se desea antagonizar la actividad TGF-beta, particularmente actividad TGF-betal .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El factor-beta de crecimiento transformante (TGF-beta) es una citocina multifuncional nombrada originalmente por su capacidad para transformar fibroblastos normales a células capaces de crecimiento independiente de afianzamiento. Los TGF-beta, producidos principalmente por células hematopoyéticas y células de tumor, pueden regular, esto es, estimular o inhibir el crecimiento y diferenciación de células de una variedad de orígenes de tejido normal y neoplásico (Sporn et al., Science, 233: 532 (1986)) y estimulan la formación y elaboración de varios elementos estromales. Para una revisión general de TGF-beta y sus acciones véase Sporn et al., J. Cell Biol., 105: 1039-1045 (1987) y Sporn and Roberts, Nature, 332: 217-219 (1988) .

Se sabe que están involucrados en muchos procesos celulares proliferativos y no proliferativos tales como proliferación celular y diferenciación celular, desarrollo embriónico, formación de matriz extracelular, desarrollo del hueso, cicatrización de heridas, hematopoyesis y respuestas inmunes e inflamatorias. Pircher et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 136: 30-37 (1986); Wakefield et al., Growth Factors, 1: 203-218 (1989); Roberts and Sporn, pp 419-472 en Handbook of Experimental Pharmacology eds M.B. Sporn & A.B. Roberts (Springer, Heidelberg, 1990); Massague et al., Annual Rev. Cell Biol., 6: 597-646 (1990); Singer and Clark, New Eng. J. Med., 341: 738-745 (1999). También, TGF-beta es usado en el tratamiento y prevención de alteración de mucosa intestinal. WO 2001/24813. De particular interés desde un punto de vista inmunológico son las actividades inmunosupresoras potentes de TGF-beta, que incluyen inhibición de exter inador linfocina-activado (LAK) y de linfocito citotóxico T (CTL) (Ranges et al., J. Exp. Med., 166: 991 (1987), Espevik et al., J. Immunol . , 140: 2312 (1988), Grimm et al., Cáncer Immunol . Im unother., 27: 53 (1988), Kasid et al., J. Im unol . , 141: 690 (1988), Mulé et al., Cáncer Immunol. Iiruriunother . , 26: 95 (1988)), linfopoyesis de célula B deprimida y expresión de cadena ligera kappa (Lee et al., J. Exp. Med., 166: 1290 (1987)), regulación negativa de hematopoyesis (Hiño et al . , Br.

J. Haematol., 70: 143 (1988), Sing et al., Blood, 72: 1504 (1988)), regulación descendente de expresión de HLA-DR en células de tumor (Czarniecki et al., J. Immunol, 140: 4217 (1988), Zuber et al., Eur. J. Immunol . , 18: 1623 (1988)), e inhibición de la proliferación de linfocitos B antigeno-activados en respuesta al factor de crecimiento de célula B (Petit- Koskas et al., Eur. J. Immunol . , 18: 111 (1988)). La observación de que muchos tumores humanos (deMartin et al., EMBO J., 6: 3673 (1987), Kuppner et al., Int. J. Cáncer, 42: 562 (1988)) y muchas lineas células de tumor (Derynck et a. Cáncer Res., 47: 707(1987), Roberts et al., Br. J. Cáncer, 52: 594 (1988)) produce TGF-beta sugiere un mecanismo posible para aquellos tumores para evadir la vigilancia inmunológica normal. Esta inmunomodulación negativa, acoplada con las observaciones de que ciertas lineas celulares transformadas han perdido la capacidad para responder a TGF-beta de manera autócrina (Wakefield et al., J. Cell Biol., 105: 965 (1987), McMahon et al., Cáncer Res., 46: 4665 (1986)), y que TGF-beta estimula la formación de estroma y disminuye la vigilancia inmune del tumor, sugiere modelos atractivos para la desregulación de neoplasma y proliferación (Roberts et al., Br . J. Cáncer, supra) . Además, las patentes estadounidenses Nos. 5,824,297 y 5,262,319 revelan un método para inhibir el envenenamiento citotóxico de células normales al administrar a las mismas un TGF-beta tal como TGF-beta3. Hay por lo menos cinco formas de TGF-beta identificadas actualmente, TGF-betal, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, y TGF-beta5. Métodos apropiados son conocidos para purificar esta familia de TGF-betas de varias especies tales como humano, ratón, chango verde, puerco, bovino, pollo y rana y de varias fuentes corporales tales como hueso, plaquetas o placenta, para producirlo en cultivo celular recombinante y para determinar su actividad. Véase, por ejemplo Derynck et al., Nature, 316: 701-705 (1985); European Pat. Pub. Nos. 200,341 publicado el 10 de diciembre de 1986, 169,016 publicado el 22 de enero de 1986, 268,561 publicado el 25 de mayo de 1988, y 267,463 publicado el 18 de mayo de 1988; Patente Estadounidenses No. 4,774,322; Cheifetz et al., Cell, 48: 409-415 (1987); Jakowlew et al., Molecular Endocrin., 2: 747-755 (1988); Dijke et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.), 85: 4715-4719 (1988); Derynck et al., J. Biol. Chem., 261: 4377-4379 (1986); Sharples et al., DNA, 6: 239-244 (1987); Derynck et al-, Nucí. Acids. Res., 15: 3188-3189 (1987); Derynck et al., Nucí. Acids. Res., 15: 3187 (1987); Derynck et al., EMBO J., 7: 3737-3743 (1988)); Seyedin et al., J. Biol. Chem.. 261: 5693-5695 (1986); Madisen et al., DNA, 7: 1-8 (1988); y Hanks et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (U.S.A.), 85: 79-82 (1988), el contenido completo de estas publicaciones es expresamente incorporado por referencia.

La forma activada de TGF-betal es un homodímero formado mediante dimerización de los 112 aminoácidos carboxi-terminales de un precursor de 390 aminoácidos (Derynck et al., Nature, supra) . TGF-beta2 tiene una forma de precursor de 414 aminoácidos y es también procesado a un homodimero de los 112 aminoácidos carboxi-terminales que comparte aproximadamente 70% de homología con la forma activa de TGF-betal (Marquardt et al., J. Biol. Chem., 262: 12127 (1987)). TGF-beta2 ha sido purificado de plaquetas porcinas (Seyedin et al., J. Biol. Chem., 262: 1946-1949 (1987)) y células de glioblastoma humanas (Wrann et al., EMBO J., 6: 1633 (1987)), y TGF- beta2 humano recombinante ha sido clonado (deMartin et al., supra). TGF-betal recombinante ha sido clonado (Derynck et al., Nature, supra) y expresado en célula de ovario de hámster Chino (Gentry et al., Mol. Cell. Biol., 7: 3418-3427 (1987)). Véanse patentes estadounidenses Nos. 4,774,322; 4,843,063; y 4,848,063 con respecto a CIF-A y CIF-B, ahora reconocidos como TGF-betal y 2, respectivamente. Ellingsworth et al., J. Biol. Chem., 261: 12362-12367 (1986) . Aunque hay 14 diferencias de aminoácidos en los primeros 36 residuos de aminoácidos de las dos formas (TGF-betal y TGF- beta2), sus actividades biológicas son similares. Cheifetz et al., Cell, 48: 409-415 (1987); Seyedin et al., J. Biol. Chem., 262: supra. TGF-beta3, TGF-beta4, y TGF-beta5, que son las formas descubiertas más recientemente de TGF-beta, fueron identificados mediante selección de bibliotecas de cDNA. Ninguna de estas tres proteínas supuestas ha sido aislada de fuentes naturales, aunque los análisis de Northern blot demuestran la expresión los mRNA correspondientes. TGF-beta3 humano y porcino han sido clonados y son descritos como homodimeros y expresados en células de ovario de hámster Chino (Dernyck et al., EMBO. J., 7: 3737-3743 (1988), ten Dijke et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 4715 (1988); Patente estadounidense No. 4,886,747). Véase también WO 1992/00318 con respecto a proteínas de TGF-beta3 y anticuerpos de las mismas. TGF-betal difiera de TGF-beta2 por 27 cambios principalmente conservadores y de TGF-beta3 por 22 cambios principalmente conservadores. Estas diferencias han sido relacionadas con la estructura 3-D. Schlunegger and Grutter, Nature, 358: 430-434 (1992) . TGF-beta4 y TGF-beta5 fueron clonados de una biblioteca de cDNA de condrocito de pollo (Jakowlew et al., Molec. Endocrinol., 2: 1186-1195 (1988)) y de una biblioteca de cDNA de oocito de rana. La biblioteca cDNA de oocito de rana puede ser seleccionada utilizando una sonda derivada de una o más secuencias de otro tipo de TGF-beta. El ARN de TGF-beta4 es detectable en condrocitos de embrión de pollo, pero es bastante menos abundante que el aARN de TGF-beta3 en embriones en desarrollo o en fibroblastos de embrión de pollo. El mARN de TGF-beta5 es expresado en embriones de rana más allá del estado de nerula y en células de renacuajo de Xenopus (XTC) . La producción recombinante de TGF-betal, TGF-beta2, y TGF-beta3 es descrita en las patentes estadounidenses Nos. 5,061,786; 5,268,455 y 5,801,231. véase también patente estadounidense No. 5,120,535 en cuanto a un TGF-beta2 usado para el tratamiento de carcinoma hormonalmente sensible para la producción de anticuerpos. El heterodímero de TGF-betal y TGF- beta2, llamado TGF-betal.2, ha sido identificado y sus usos demostraron, como se revela en las patentes estadounidenses Nos. 4,931,548 y 5,304,541, la última también revela un anticuerpo del mismo. WO 1990/00900, presentada el 20 de julio de 1989, revela el tratamiento de alteraciones inflamatorias con TGF-betal y -beta2, ho odiméricos y el heterodímero TGF-betal.2. La patente estadounidense No. 5,462,925 revela un heterodímero de TGF-beta2 y TGF-beta3. La patente estadounidense No. 5,780,436 revela imitaciones de péptido pequeño de TGF-beta. Niveles incrementados de actividad TGF-beta están involucrados en un gran número de condiciones patológicas, en las que se incluyen, pero no limitadas a la siguientes: (i) fibrosis, cicatrización y adhesión durante la cicatrización de heridas; (ii) enfermedades fibróticas de los pulmones, higado y riñones; (iii) aterosclerosis y arteriosclerosis; (?Y) ciertos tipos de cáncer en los que se incluyen cáncer de próstata, tumores neuroendócrinos de sistema digestivo, cáncer de la cérvix, glioblastomas, y cáncer gástrico; (v) angiopatía, vasculopatía, nefropatía; (vi) esclerosis sistémica; (vii) infección viral tal como hepatitis C y HIV; y (viii) alteraciones y deficiencias inmunológicas e inflamatorias, tales como artritis reumatoide. La modulación de respuestas inmunes e inflamatorias de TGF-betas incluye: (i) inhibición de proliferación de todos los subconjuntos de célula T; (ii) efectos inhibitorios en cuanto a la proliferación y función de linfocitos B; (iii) regulación descendente de actividad de célula exter inadora natural y la respuesta de célula T; (iv) regulación de producción de citocina por células inmunes; (v) regulación de función de macrófago y (vi) reclutamiento y activación de leucocitos . En cuanto al cáncer específicamente, los elementos de la familia TGF-beta son conocidos por tener un número de actividades biológicas relacionados con la tumorigénesis (en las que se incluyen angiogénesis) y metástasis. TGF-beta inhibe la proliferación de muchos tipos de células en los que se incluyen células endoteliales capilares y células de músculo liso. TGF-beta regula descendentemente la expresión de integrina (alphalbetal, alpha2betal, y alphavbeta3 involucrados en la migración celular endotelial) . La integrinas están involucradas en la migración de todas las células, en las que se incluyen las metastásicas . TGF-beta regula descendentemente la expresión de metaloproteinasas de matriz necesaria tanto para la angiogénesis como la metástasis. TGF-beta induce el inhibidor de activador de plasminógeno, que inhibe una cascada proteinácea necesaria para angiogénesis y metástasis. TGF-beta induce a células normales a inhibir células transformadas. Véase, por ejemplo, Yingling et al., Nature Reviews, 3 (12): 1011-1022 (2004), que revela que la desregulación de TGF-beta ha estado implicada en la patogénesis de una variedad de enfermedades, en las que se incluyen cáncer y fibrosis, y presenta el razonamiento para evaluar inhibidores de señalización TGF-beta como terapéuticos del cáncer, biomarcadores/diagnósticos, las estructuras de inhibidores de molécula pequeña, que están en desarrollo y el modelo de descubrimiento de fármaco apuntado que es aplicado a su desarrollo. La detección temprana del cáncer es muy importante (Ruth et al., Nature Reviews Cáncer, 3: 243-252 (2003)), la patogénesis de metástasis de cáncer es estudiada. Fidler, Nature Reviews Cáncer, 3: 453-458 (2003). TGF-beta ha emergido como un modulador principal de angiogénesis al regular la proliferación de célula endotelial, migración, metabolismo de matriz extracelular (ECM) y la expresión de moléculas de adhesión. Es un inhibidor de crecimiento potente de células epiteliales mamíferos normales y un número de líneas celulares de cáncer de pecho. TGF-beta parece ejercer efectos pleiotropicos en la oncogénesis de cáncer de pecho de manera contextual, esto es, suprime la tumorigénesis en una etapa prematura mediante inhibición directa de angiogénesis y crecimiento de célula de tumor. Sin embargo, la sobreproducción de TGF-beta por un tumor avanzado puede acelerar el avance de la enfermedad por medio de estimulación indirecta de angiogénesis y supresión inmune.' El antígeno de membrana celular CD105 (endoglina) enlaza TGF-betal TGF-beta3 y es expresado preferiblemente en células endoteliales vasculares angiogénicas. La reducción de niveles de CD105 en HUVEC conduce a una inhibición de angiogénesis in vitro y mortandad celular masiva en presencia de TGF-betal. Ratones nulificados con CD105 murieron in útero con vasculatura deteriorada, indicando- el papel pivotal de CD105 en el desarrollo vascular. Li et al., Microsc. Res. Tech., 52:437-449 (2001) . La angiogénesis anormal pero potencial hematopoyético intacto ha sido observado en ratones deficientes de receptor tipo I de TGF-beta. Larsson et al., EMBO J., 20 (7): 1663-1673 (2001) . Además, la deficiencia de receptor tipo II de TGF-beta dio como resultado en defectos de hematopoyesis de saco de yema y vasculogénesis . Oshima et al., Developmental Biology, 179 (1) : 297-302 (1996) . También, los defectos de corazón e hígado y sensibilidad reducida de factor de crecimiento transformante beta 2 fueron observados en embriones deficientes de receptor tipo III de TGF-beta. Stenvers et al., Mol. Cell. Biol, 23 (12) : 4371-4385 (2003) . Además, la disrupción apuntada del gen TGF-betal de ratón dio como resultado enfermedad inflamatoria multifocal. Shull et al., Nature, 359 (6397): 693-699 (1992). La inflamación multifocal de inicio prematuro en el ratón nulo con TGF-betal se encontró estar moderada por linfocito. Diebold et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 92 (26): 12215-12219 (1995) . La función no proliferativa más importante de los TGF-beta es en la mejora de la formación de matrices extracelulares. Aunque esto se obtiene principalmente por medio de la transcripción incrementada tanto de colágeno como de fibronectina, la inhibición de las proteasas de degradar la matriz también contribuye a su estabilidad. La degradación de la matriz extracelular es inhibida por la disminución en la secreción de las proteasas por sí mismas y el incremento simultáneo en los niveles de inhibidores de proteasa. WO 1984/001106 describe TGF-betal y su uso para la promoción de liberación celular y proliferación de tejido, cicatrización de herida y tratamiento de traumata. La patente estadounidense No. 4,806,523 revela que TGF-betal y TGF- beta2 poseen ambos actividad antiinflamatoria y son inhibidores de proliferación de célula T estimulada por mitógeno y activación de célula B. También reporta que TGF-beta está localizado en centros de hematopoyesis y linfopoyesis y que el TGF-beta puede por consiguiente, ser útil para el tratamiento de indicaciones asociadas con mal funcionamiento o disfunción de hematopoyesis o linfopoyesis.

También se ha demostrado que el TGF-beta2 es la isoforma predominante de TGF-beta en la retina neural, epitelio-coroide de pigmento retina ley vitreo del ojo humano (Pfeffer et al., Exp. Eye Res., 59: 323-333 (1994)) son encontrados en humor acuoso humano en especímenes de los ojos que sufren extracción de cataratas con implantación de cristalino infraocular. Jampel et al., Current Eye Research. 9: 963-969 (1990) . Las células epiteliales de pigmento retinal humanas no transformadas segregan principalmente TGF-beta2. Kvanta, Ophthalmic Res., 26: 361-367 (1994). Otras enfermedades que tienen potencial para tratamiento con anticuerpos contra TGF-beta incluyen síndrome de enfermedad respiratoria adulta, cirrosis del hígado, infarto post-miocardio, restenosis post-angioplastía, cicatrices queloides y escleroderma. El nivel incrementado de expresión de TGF-beta2 en osteoporosis (Erlenbacher et al., J. Cell Biol., 132: 195-210 (1996)) significa que esta es una enfermedad potencialmente tratable por anticuerpos dirigidos contra TGF-beta2. Debido al involucramiento de TGF-beta en un gran número de condiciones patológicas serias, hay interés considerable en desarrollar inhibidores de TGF-beta. Muchas de las propuestas para inhibidores de TGF-beta han involucrado anticuerpos . Es una tarea demandante aislar un fragmento de anticuerpo específico para TGF-beta de la misma especie. Los animales no producen normalmente anticuerpos a anti-antígenos, un fenómeno llamado tolerancia (Nossal, Science, 245: 147-153 (1989) . En general, la vacunación con un auto-antígeno no da como resultado la producción de anticuerpos circulantes. Por consiguiente, es difícil crear anticuerpos humanos a auto-antígenos humanos. También hay, además, problemas éticos en la vacunación de humanos. En relación con la cría de anticuerpos no humanos específicos por TGF-beta, hay un número de problemas. TGF-beta es una molécula inmunosupresora y además, hay una fuente conservación de secuencia entre moléculas de TGF-beta humanas y de ratón. El TGF-betal de ratón y humano solamente difieren por un residuo de aminoácido, un cambio de alanina (humano) a serina (ratón) en un residuo enterrado. Derynck et al., J. Biol. Chem., 261: 4377-4379 (1986). TGF-beta2 de ratón y humano solamente difieren en tres residuos; residuo 59 (T ratón, S humano) ; residuo 60 (K ratón, R humano) , y residuo 94 (N ratón; K humano) . Esto hace difícil crear anticuerpos en ratones contra TGF-beta humano. Además, cualesquier anticuerpos creados pueden solamente ser dirigidos contra un conjunto restringido de epítopos. Anticuerpos monoclonales contra TGF-beta han sido producidos al inmunizar pollo e inmortalizar células B, usadas para por ejemplo, diagnosis y tratamiento pasivo de enfermedad como se describe en la patente estadounidense No. 6,143,559.

Anticuerpos policlonales que se enlazan a TGF-betal humano y TGF-beta2 humano tanto contra epítopos neutralizantes como no neutralizantes han sido criados en conejos. (Danielpour et al., Growth Factors, 2: 61-71 (1989); Roberts et al., Growth Factors, 3: 277-286 (1990)), pollos (R&D Systems, Minneapolis) y pavos (Danielpour et al., J. Cell Physiol., 138: 79-86 (1989); Danielpour and Sporn, J. Cell Biochem., 13B: 84 (1989) ) . Péptidos que representan secuencias de TGF-beta parcial o completa han también sido usados como inmunógenos para criar antisuero policlonal neutralizante en conejos. Ellingsworth et al., J. Biol. Chem., 261: 12362 (1986); Ellingsworth et al., Cell. Immunol, 114: 41 (1988); Border et al., Nature, 346: 371-374 (1990); Flanders, Biochemistry 27: 739-746 (1988); Flanders et al., Growth Factors, 3: 45-52 (1990); Flanders et al., Development, 113: 183-191 (1991). Además, ha habido reportes limitados aislamiento de anticuerpos monoclonales de ratón contra TGF-beta. Enseguida de la inmunización con TGF-beta2 bovino (idéntico a TGF-beta2 humano) , tres anticuerpos monoclonales no neutralizantes fueron aislados que son específicos para TGF-beta2 y un anticuerpo neutralizante que es específico para TGF-betal y TGF-beta2. Dasch et al., J. Immunol, 142: 1536-1541 (1989). En otro reporte, enseguida de la inmunización con TGF-betal, anticuerpos neutralizantes fueron aislados que eran ya sea específicos para TGF-betal o se hicieron reaccionar de manera cruzada con TGF-betal, TGF-beta2 y TGF-beta3. Lucas et al., J Immunol., 145, 1415-1422 (1990)". Se ha demostrado que sueros policlonales a TGF-beta humano y porcino (Keski-Oja et al., Cáncer Res., 47: 6451-6458 (1987)) y a TGF-beta2 porcino (Rosa et al., Science, 239: 783-785 (1988)) neutralizan la actividad biológica de TGF-betal y TGF-beta2, respectivamente. Suero anti-TGF-beta de conejo es descrito en Roberts et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 83: 4167-4171 (1986). Además, RÍA contra TGF-betal utilizando antisuero de conejo ha sido establecido para cuantificar la proteína liberada durante la agregación de plaquetas. Assoian and Sporn, J. Cell Biol., 102: 12178-1223 (1986) . Un anticuerpo monoclonal de ratón nautralizante que se enlaza tanto a isoformas de TGF-beta2 y TGF-beta3 está disponible comercialmente de Genzyme Diagnostics. Un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido contra TGF-betal humano está disponible en R&D Systems. Este anticuerpo neutraliza solo débilmente TGF-betal en un análisis de neutralización. Anticuerpos monoclonales de ratón neutralizantes también han sido generados de ratones inmunizados con péptidos de TGF-betal humanos que comprenden posiciones de aminoácidos 48 a 60 (anticuerpo reactivo con TGF-betal, TGF-beta2 y TGF-beta3) y posiciones de aminoácido 86 a 101 (anticuerpo específico para TGF-betal). Hoefer and Anderer, Cáncer Immunol . Immunother., 41; 302-308 (1995) .

La tecnología de anticuerpo de fago (WO 1992/01047 ; WO 1993/19172; WO 1992/20791; WO 1993/06213; y WO 1993/11236) ofrece la capacidad de aislar anticuerpos humanos directamente contra TGF-beta humano. El aislamiento de anti-auto anticuerpos a partir de repertorios de segmentos de anticuerpos exhibidos sobre fago se ha descrito. Griffiths et al., EMBO J. , 12: 725-734 (1993); Nissim et al., EMBO J., 13: 692-698 (1994); Griffiths et al., 13: 3245-3260 (1994); Barbas et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 90: 10003-10007 (1993); y WO 1993/11236. Además, Tempest et al., Immunotechnology, 2: 306 (1996) describe anticuerpos humanos específicos para TGF-beta humano derivado de bibliotecas de exhibición de fago. WO 1997/13844 revela el aislamiento de anticuerpos humanos específicos para TGF-betal humano y anticuerpos humanos específicos para TGF-beta2 humanos. Describe anticuerpos con el dominio 31G9 VH y variantes de dominio, más específicamente, el anticuerpo CS37 que comprende el dominio 31G9 VH junto con el CS37 VL y variantes de este dominio, que incluyen anticuerpos que: (i) compiten en ELISA con CS37 para enlazar a TGF-betal, (ii) enlazar TGF-betal, preferiblemente con respecto a TGF-beta3, y (iii) neuralizar TGF-betal. La patente estadounidense No. 6,492,497 está basada en la identificación de anticuerpos que están relacionados con CS37, pero tienen propiedades inesperadamente ventajosas con respecto al enlace y neutralización de TGF-betal. No se enlazan a o neutralizan TGF-beta2 o TGF-beta3. El epítopo para estos anticuerpos cae en la región C-terminal de TGF-betal (residuos 83-112) e incluye el bucle que consiste de los residuos 92-98 de TGF-betal, también conocido como dedo 2, una región que ha sido identificada por interactuar con el receptor para TGF-beta . Un anticuerpo monoclonal contra TGF-beta-1 humano que es altamente específico y puede ser usado para diagnosis de tumor y para cromatografía de afinidad es revelado por JP 95068278 B2 publicada el 26 de julio de 1995. El uso de TGF-beta y sus antagonistas para modular la presión sanguínea y para tratar la hipertensión e hipotensión, respectivamente, es revelado en WO 1991/19513. WO 1991/15223 revela un factor de supresión de estallido respiratorio purificado que puede ser incubado con anticuerpo anti-TGF-beta de pavo que se enlaza específicamente a TGF-betal. El anticuerpo neutralizó completamente la actividad de TGF-betal sobre macrófagos activados, pero no tuvo ningún efecto sobre la actividad del factor de supresión de estallido respiratorio sobre los macrófagos. La supresión de la actividad TGF-beta y acumulación de matriz extracelular en diagnosis y tratamiento de enfermedades fibróticas tales como glomerulonefritis por contacto con un supresor de actividad que produce ECM, tal como anticuerpo anti-TGF-beta, es revelado en WO 1991/04748 y WO 1993/10808. Anticuerpos contra un péptido lineal de TGF-beta, y células que producen los anticuerpos son también revelados. La patente estadounidense No. 5,888,705 revela un método para inducir la proliferación de células pancreáticas adultas humanas o la diferenciación de las mismas al poner en contacto cultivos primarios de tales células con factor de crecimiento de hepatocitos solo o en combinación con anticuerpos anti-TGF-beta. WO 2001/66140 revela el uso de antagonistas TGF-beta tales como anticuerpos para tratar o impedir la pérdida de función renal . WO 2000/40227 revela métodos para tratar condiciones asociadas con la acumulación de matriz extracelular en exceso utilizando agentes que inhiben TGF-beta tales como anticuerpos. Anticuerpos a TGF-beta son revelados que mejoran la apóptosis tubular en obstrucción uretal unilateral en Miyajima et al., Kidney International, 58: 2301-2313 (2000). La prevención a largo plazo de insuficiencia renal, expresión de gen de matriz en exceso y expansión de matriz mesangial glomerular mediante tratamiento con anticuerpo anti-anti-TGF-beta monoclonal en ratones diabéticos db/db es revelado en Ziyadeh et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 97 (14) : S015-8020 (2000) . Un resultado de tratamiento favorable con anticuerpo anti-TGF-beta neutralizantes en enfermedad de riñon diabética experimental es revelado en Han and Ziyadeh, Peritoneal dialysis international, 19 Suppl 2: S234-237 (1999). Se encontró que el TGF-beta es un mediador clave en hiperglicemia y enfermedad de riñon diabética. Sharma and Ziyadeh, Diabetes, 44 (10) pll39-46 (1995) . El uso de TGF-beta en nefropatía diabética es revelado en Border et al., Diabetes Metab. Rev., 12/4: 309-339 (1996) . La patente estadounidense No. 5,662,904 describe una composición para uso en el tratamiento de heridas para inhibir la formación de tejido de cicatrización. Una composición ejemplar tiene anticuerpo neutralizante de factor de crecimiento, tales como anticuerpos a TGF- betal, TGF-beta2, y PDGF. La patente estadounidense No. 5,972,335 revela composiciones que comprende por lo menos dos anticuerpos para uso en promover la cicatrización de heridas de alteraciones fibróticas, en donde el primer anticuerpo es específico para un solo epítopo sobre TGF betal y el segundo anticuerpo es específico para un solo epítopo TGF beta2. La patente estadounidense No. 5,958,411 revela métodos para tratamiento de una patología de CNS mediante la administración de anticuerpos anti-TGF-beta neutralizantes. La patente estadounidense No. 5,616,561 revela un método para el tratamiento de daños del tejido provocados por radiación utilizando un antagonista TGF-beta tales como anticuerpos . La patente estadounidense No. 6,500,920 revela un péptido de 10-25 aminoácidos gue comprenden los aminoácidos 49- 58 de un TGF-beta2, en donde el péptido es capaz de inhibir el enlace específico de un TGF-beta a un receptor de TGF-beta, sobre una célula. La solicitud de patente estadounidense No. 2002/0176858 y las patentes estadounidenses Nos. 5,693,607; 6,419,928; 6,090,383; 5,783,185; 5,772,998; y 5,571,714, también como EP 489,062; 557,418; y 669,833, también como WO 1992/08480; 1994/09815; y 1994/18991 revelan anticuerpos monoclonales a TGF-beta, que incluyen uno que neutraliza la actividad de TGF-betal y TGF-beta2, y su uso en aplicaciones terapéuticas para el tratamiento de indicaciones en donde hay una sobreproducción de TGF-beta {por ejemplo, lesión de hígado aguda, fibrosis de pulmón intersticial, cirrosis de hígado, fibrosis hepática crónica y alteraciones de la piel fibróticas tales como escleroderma) y para el diagnosis o tratamiento de malignidades (por ejemplo sarcomas y melanomas) y cánceres metastáticos . Nuevos anticuerpos para tratamiento de alteraciones asociadas con TGF-beta3, por ejemplo, osteoporosis, SIDA, cáncer, etc., son revelados en WO 1992/00330 y patente estadounidense No. 5,262,319. Tales anticuerpos se enlazan a TGF-beta3 humano y no exhiben reactividad cruzada con TGF-betal y beta2.

La patente estadounidense No. 6,509,318 revela una familia de péptidos pequeños que se encuentran ser inhibidores a la actividad TGF-beta para usos tales como inhibición de tejido de cicatriz durante la cicatrización de heridas. El uso de un compuesto (por ejemplo un anticuerpo) que puede inhibir la actividad biológica de TGF-beta sobre neuronas pre-dañadas para tratamiento de alteración cerebrales, por ejemplo isquemia cerebral, es revelado en WO 2000/13705. Un anticuerpo monoclonal que reconoce todas las tres isoformas de TGF-beta que puede inhibir la actividad biológica de TGF-beta sobre neuronas pre-dañadas, útil para el tratamiento de alteraciones cerebrales, es revelado en WO 2000/54804. Tal anticuerpo fue usado para neutralizar TGF-beta endógeno durante el período principal de muerte celular ontogenética de ganglios ciliares (CG) y ganglios de raiz dorsal (DRG) también como motoneuronas espinales en embriones de pollo. La diagnosis y predicción de probabilidad de desarrollo de cáncer de pecho sensible a tomoxifen o resistente a tamoxifen utilizando un anticuerpo específico a factores o receptores angiogénicos, tal como un anticuerpo específico a TGF-beta3, es revelado en WO 2000/34788. EP 945464 Bl revela elementos de enlace específicos para TGF-beta humano, esto es, elementos de enlace específicos que comprenden dominios de enlace anti-antígeno humano específicos para TGF-beta humano que enlazan específicamente isoformas de TGF-beta2 y TGF-betal y o ambos, preferiblemente, en comparación con TGF-beta3. elementos de enlace específicos pueden ser aislados y utilizados en el tratamiento de enfermedad, particularmente en enfermedad fibrótica y también en enfermedades inmunes/inflamatorias . Anticuerpos contra TGF-beta han mostrado ser efectivos en el tratamiento de glomerulonefritis (Border et al., Diabetes Metab. Rev., supra); cicatrización neural (Logan et al., Eur. J. Neurosci., 6: 355-363 (1994); WO 1993/19783); cicatrización dérmica (Shah et al., Lancet, 339: 213-214 (1992); Shah et al., J. Cell Science, 107: 1137-1157 (1994); Shah et al., J. Cell Science, 985-1002 (1995); WO 1992/17206); fibrosis de pulmón (Giri et al., Thorax. 48: 959-966 (1993)); lesión arterial (Wolf et al., J. Clin. Invest., 93: 1172-1178 (1994)); y artritis reumatoide (Wahl et al., J. Exp. Medicine, 177: 225-230 (1993)). Se ha sugerido que TGF-beta3 actúa antagonísticamente a TGF-betal y TGF-beta2 en la cicatrización dérmica (Shah et al., 1995 supra). Arteaga et al., J. Clin. Invest., 92: 2569-2576 (1993) revela que los anticuerpos anti-TGF-beta inhiben la tumorigenicidad de células de cáncer de pecho e incrementan la actividad de célula exter inadora natural de bazo de ratón. Agentes anti-fibróticos para la cicatrización de heridas y tratamiento de alteraciones fibróticas, que incluyen anti-TGF-beta son descritos en WO 1993/19769. Secuencias específicas de anti-TGF-beta2 son descritas en EP 853,661 Bl . Otras aplicación en donde anticuerpos contra .TGF-beta han mostrado promesa de eficacia terapéutica, incluyen el uso de anticuerpos contra TGF-beta para el tratamiento de enfermedades de los ojos que involucran fibrosis ocular, en los que se incluyen retinopatía proliferativa (Pena et al., Invest. Ophthalmology. Vis. Sci., 35: 2804-2808 (1994)), prevención de cataratas (WO 1995/13827) , desprendimiento retinal y cirugía de drenaje de post-glaucoraa (Khaw et al., Eye, 8: 188-195 (1994)). Connor et al., J. Clin. Invest., 83: 1661-1666 (1989) mostraron que niveles mucho más altos de TGF-beta2 estaban presentes en aspirados vitreos de pacientes con fibrosis intraocular asociada con la retinopatía proliferativa en comparación con pacientes con desprendimiento retinal no complicado sin fibrosis ocular y que la actividad biológica de este TGF-beta2 podría neutralizar con anticuerpos dirigidos contra TGF-beta2. El uso de anticuerpos contra TGF-beta para el tratamiento de enfermedades ha sido la materia de solicitudes de patente por enfermedad fibrótica (WO 1991/04748) ; enfermedades de deficiencia de macrófago (WO 1993/14782) ; infecciones de patógeno de macrófago (WO 1993/17708; patente estadounidense No. 5,730,976); alteraciones vasculares (WO 1993/21945) . Una composición de célula de tallo tratada con anticuerpo TGF-beta capa de sobrevivencia durante 14 días in vitro o ex vivo y repoblación del sistema hematopoyético in vivo rápida son descritos en WO 2000/43499. Scrip 2580 pl4, 4 de octubre de 2000 reportaron que Cambridge Antibody Technology (CAT) y Genzyme estuvieron trabajando conjuntamente para desarrollar anticuerpos monoclonales humanos contra TGF-beta. CAT tiene dos anticuerpos TGF-beta plenamente humanos, CAT-152 y CAT-192, y Genzyme tiene IDll, un anticuerpo monoclonal pan-específico murino que neutraliza TGF-betal, TGF-beta2 y TGF-beta3 y es evaluado como un terapéutico potencial para escleroderma difuso. CAT iba a desarrollar un análogo humano de ID11 utilizando su tecnología de exhibición de fago. Varias otras indicaciones clínicas para tratamiento anti-TGF-beta, en las que se incluyen indicaciones oftálmicas, cicatrización post-quirúrgica, fibrosis de órganos mayores, tales como pulmones, ríñones e hígado y ciertos cánceres, también serán considerados como tratamiento de tumores de cerebro malignos al inhibir el crecimiento de TGF-beta2. CAT-152 (anti-TGF-beta2) está en estudios de Fase II para prevenir la cicatrización post-operativa en pacientes que sufren cirugía por glaucoma y CAT-192 (anti-TGF-betal) ha completado los estudios de Fase I. Véase también "Trends in Antibody Research: The Monoclonal Élite" por Tim Searle, Bioventure-View 1510 ?l4, 1 de octubre de 2000. Un método para cuantificar TGF-beta utilizando anti anti-TGF-beta es revelado en WO 1995/19987. Un nuevo análisis para determinar TGF-beta activo en una muestra utilizando células eucariónticas que contienen un vector de expresión TGF-beta sensible es descrito en WO 2000/00641. Este análisis incluye uno para determinar los niveles de isoformas de TGF-beta en una muestra, en donde crio-secciones son pre-incubadas con anticuerpos neutralizantes de isoformas anti-TGF-beta. Pruebas inmunológicas de TGF-beta que utilizan anticuerpos TGF-beta son descritos, por ejemplo en JP 2126157 y JP 92041307 B publicados el 7 de julio de 1992. Darland y D'Amore, J. Clin. Invest., 103: 157-158 (1999) revelan que el desarrollo del bazo procede de una etapa de dependencia al factor de crecimiento en donde la pérdida de un factor de sobrevivencia conduce a la apóptosis. La estabilización del bazo está marcada por inversión con células murales, activación de TGF-beta y producción de membrana basal. Plantea varias cuestiones con respecto a cual es la función de los factores de crecimiento en el vascular adulto, en los que se incluyen VGF y TGF-beta. Benjamín et al., J. Clin. Invest., 103: 159-165 (1999) revela la ablación selectiva de vasos sanguíneos inmaduros en tumores humanos establecidos sigue a la extracción de VEGF. Métodos de fabricación de anticuerpos quiméricos y humanizados son descritos en y otras referencias en esta área incluyen, por ejemplo, patente estadounidense No. 6,235,883 en cuanto a anticuerpos monoclonales plenamente humanos contra el receptor de factor de crecimiento epidérmico humano; EP 184187 sobre un anticuerpo quimérico de ratón-humano; EP 844,306 en cuanto a un método de fabricación de anticuerpos recombinantemente utilizando tecnología de fago; patente estadounidense No. 5,859,205 en la preparación de anticuerpos CDR-injertados, preferiblemente anticuerpos humanizados, que tienen una aceptación o estructuras de donador no humano y humano, EP 120,694; EP 125,023; EP 171,496; EP 173,494; EP 239,400; WO 1989/07452; WO 1990/07861; y WO 1986/01533 en cuanto a técnicas de humanización; la solicitud de patente estadounidense 2003/0039649 en cuanto a anticuerpos superhumanizados; la solicitud de patente estadounidense No. 2003/0039645 en cuanto a anticuerpos humanizados con especificidad para TNF-alfa humano; EP 239,400 en cuanto a anticuerpos recombinantes y su producción; WO 1991/09967 en cuanto a anticuerpos humanizados; WO 1992/01047 en cuanto a la producción de anticuerpos; WO 1992/22653 en cuanto a métodos para fabricar anticuerpos humanizados; WO 1993/11161 en cuanto a proteínas de antígeno-enlace multivalente; WO 1994/13804 en cuanto a proteínas antígeno-enlace multivalentes; WO 2000/66631 en cuanto a elementos de enlace específicos para TGF-beta; y Henry "Special Delivery: Alternative methods for delivering drugs improve performance, convenience, and patient compliance . "C&EN, p. 49-65 (2000). véase también patentes estadounidenses.

Nos. 6,140,471 y 5,969,108 y 5,872,215 y 5,871,907 y 5,858,657 y 5,837,242 y 5,733,743; EP 1,024,191; EP 774,511; WO 1997/13844; EP 656,941 y 605,522 y WO 1994/13804; EP 589,877; EP 585,287; WO 1993/19172; EP 540,586; WO 1993/06213; WO 1992/20791; WO 1992/01787; y WO 1992/01047. además, WO 2004/065417 revela varias alteraciones a anticuerpos y fragmentos de enlace de antígeno para mejorar el rendimiento. Véase también patente estadounidense 20050049403. Hay la necesidad de controlar moléculas de TGF-beta para impedir sus efectos perjudiciales en enfermedades tales como las resumidas anteriormente. También hay necesidad de proporcionar anticuerpos monoclonales de alta afinidad que se enlazan a TGF-beta específicamente y que neutralizan la actividad TGF-beta para actuar como un antagonista TGF-beta. La pérdida aparente de regulación TGF-beta por las células neoplásicas acopladas con la supresión de fracción inmune y la formación de estroma inducida por TGF-beta hace la intervención potencial con antagonistas de TGF-beta una opción atractiva para terapia de cáncer. Además, los anticuerpos TGF-beta son útiles en análisis de diagnóstico y purificación de inmunoafinidad .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo humanizado que enlaza un TGF-beta que comprende dominio pesadc variable (VH) que comprende resid os de región rJ ervar?abie no humanos incorporados a un dominio de V? humano, ei dominio variable comprende una sustitución ce región de estructura (FR) en S?Q ID NO: 6 en una posición seleccionada del grupo que consiste de 48, 49, 67, 69, 71, 73, y 78, utilizando el sistema de numeración resumido en Kabat et al., Sequences of Proteins of Ir.jtiunoiogical Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . El anticuerpo incluye n anticuerpo IsGl intacto o fragmento de anticuerpo tal coto un Fab. Preferiblerr.er.te, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR en posiciones 49, 67 y 71, en donde más preferiblemente en la posición 49 la alanina está cambiada a una glicina, en la posición 67 la fenilalanina está cambiada a una aia ina y en la posición 71 la arginina esté cambiada a una alapir.a. En otra modalidad preferida, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones FR en posiciones 48, 69 y 71, en donde más preferiblemente en la posición 48 la valipa está cambiada a una isoleucina, en posición 49 ia alanina está cambiada a una glicina y en posición 71 la arginina está cambiada a una alapina. También, preferiblemente, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones FR en posiciones 49, 69 y 71, en donde más oreferibiemente en posición 49 la alar.ina está cambiada a una glicina, en posición 69, le iscleucina está cambiada a una leucina y en posición 71 ia arginina está cambiada a una alanina. En otro aspecto, una sustitución FR adicional está en posición 73, más preferiblemente en posición 73 la asparagina está cambiada a una usina. En todavía otra modalidad preferida, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones FR en posiciones 49, 71 y 73, en donde más preferiblemente en ocsicicn 49 la alanina está cambiada a una glicina, en posición 71 la arginína está cambiada a una alanina y en posición 73, la asparagina está cambiada a una lisina. En todavía otra modalidad preferida, el anticuerpo humanizado comprende sustituidos FR en posiciones 49, 71 y 78, en donde más preferiblemente en posición 49 la aianina esta cambiada a una glicina, en posición 71 ía arsinína está cambiada a una alanina y en posición 78 la leucina está cambiada a una alanina. En otra modalidad preferida, cualquiera de ios anticuerpos anteriores comprende residuos de región que determinan la complementareidad (CDR) de dominio ligero variable (V-) RASQSVLYSSNQKKYLA (SEO TD NO: 36); ASTRES (SEQ ID NO: 38); y HQYLSSDJ (SEQ ID NO: 40), o comprende residuos de CDR de dominio VL en ?on?e el primer CDR (CDR 11) está invertido a la secuencia del sitio kappa de línea de germinación humano L8/ 9: RASQGISSYLA (SEQ ID KO: 37) y/o el se CDR (CDR L2) está invertido a la secuencia dei sitio kappa de línea de germinación humana L8/ 9/I14/115: YASSLQS (SEQ ID NO: 39). En otra modalidad preferida, cualquiera de los anticuerpos anteriores comprende residuos V¡ de región que determina la complenentareidad (CDR) de dominio GYAFTKYLI? (S?Q ID NO: 41), VNNPGSGGSKYK?KFKG {SEQ ID NO: 42), o VINPG3GGSNYN?KFKG (SEQ ID NO: 43); y SGGFYFDY (SEQ ID KO: 44). También, la invención proporciona cualquiera de los anticuerpos anteriores, conjugados con un agente citotóxico o no conjugado así. Además, la invención proporciona una composición que comprende tales anticuerpos y un portador. En una modalidad adicional, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo humanizado, un vector que comprende tal ácido nucleico y una célula huésped que comprende tal ácido nucleico. Adicionalmente, la invención proporciona un proceso para producir un anticuerpo humanizado que comprende cultivar la célula huésped que comprende ei ácido nucleico que codifica ei anticuerpo, de tal manera que el ácido nucleico es expresado y el anticuerpo producido y preferiblemente recuperado del cultivo de célula huésped, más preferiblemente del medio de cultivo de célula huésped. También, la célula huésped puede ser co-transfectada con un vector oee conprende ácido nucleico que codifica el dominio pesado variable y con un vector que ccmorer.de ácido nucleico que codifica ei dominio ligero variable. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método de tratamiento de una alteración de TGF-beta en un mamífero, preferiblemente un primate y más preferiblemente un humano, que comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva del anticuerpo humanizado. Este puede comprender administrar ai mamífero una cantidad efectiva de un agente terapéutico diferente al anticuerpo humanizado, tal como un agente suimioterapéutico, anti-angiogénico o agente citotóxico o una citocina. En todavía otra modalidad, la invención proporciona un método para detectar un TGF-beta en una muestra corporal que comprende poner en contacto el anticuerpo humanizado con ia muestra corporal y determinar si ha ocurrido el enlace de anticuerpo al TGF-beta. La invención también proporciona un articulo de manufactura que comprende un recipiente s\ e contiene el anticuerpo humanizado e instrucciones que instruyen a un usuario para tratar una alteración de TGF-beta en un mamífero, preferiblemente un humano, con un anticuerpo. Este artículo puede también comprender un recipiente que contiene un agente terapéutico diferente al anticuerpo humanizado, en donde las instrucciones instruyen al usuario al trecar alteración con el anticuerpo en combinación con el agente. En otra modalidad, la presente invención proporción un método para el tratamiento de cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva ce un anticuerpo TGF-beta y un anticuerpo que se enlaza al factor de crecimiento endotelial vascular. Preferiblemente, el mamífero es humano. En otra modalidad, ei anticuerpo de TGF-beta se enlaza a cualquiera de uno o más de los siguientes: TGF-betal, TGF~beta2, y TGF-beta3. En una modalidad adicional, ei anticuerpo se enlaza a TGF-betal, o tanto a TGF-betal como TGF-beta2.

BBEVS DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las figuras 1A y IB ilustran alineaciones de las secuencias de aminoácidos de ios dominios de ligera variable (VL) (Figura 1A) y pesada variable (VH) (Figura IB) de anticuerpo monoclonal murino 2G7 (SEQ ID NOS: 1 y 2, respectivamente) ; dominios VJ y VH de versión huxTGFB humanizado (V5H.V5L) (SEQ ID NOS: 3 y 4, respectivamente), y estructuras de consenso VA y V-¿ humanas hum ?l, subgrupo I kappa ligero; subgrupo III pesado huir.HI) , (S?Q ID KOS: 5 y 6, respectivamente) . Los asteriscos identificar, diferencias entre huxTGFB humanizado y anticuerpo moncclonal murinc 2G7 o entre huxTGFB humanizado y las regiones de estructura de consenso humanas. Las regiones que determinan la complementareidad (CDR) están subrayadas y la CDR de la secuencia de línea de germinación humana real están debajo de las regiones estructurales de consenso por comparación (SEQ ID KOS : 7-11). La figura ? muestra las secuencias de ADK (SEQ ID NOS: 12-17) que codifican las varias regiones de CDR (SEO ID KO°! • IS-?^! La figura 3 muestra las secuencias de aminoácidos de 7C9.landH.IgGl {S?Q ID NO: 24); de H2 I.V5L {SEQ ID NO: 25), de V11E.V11L (S?Q ID NO: 26), de V5E.V5L (SEQ ID KO: 27), de chimL.chi H :S?Q ID NO: 28), y de V6H.glL2 (SEO ID NO: 29). La figura 4 muestra las secuencias de ácido nucleico sin y con secuencias de señal que codifican las secuencias de la figura 3. (SEQ ID KOS:30-35.c La figura 5 muestra las curvas de enlace de anticuerpos humanizados 2G7 IgG variantes a TGF-beta. La figura 6 muestra la secuencia del plásmico pDRl (S?Q ID NO: 45; 5391 bp; para ia expresión ele cadenas ligeras de inmunoglobulina como se describen en el ejemplo 2. pDRl contiene secuencias que codifican un anticuerpo irrelevante, esto es, la cadena ligera de un anticuerpo an i-CDR humanización (Shalaby et al., J. Exp. Xed., 175: 217-225 (1992)), los codones de partida y retención para los cuales son indicados en negritas y subrayados. La figura 7 muestra la secuencia dei plásmido pDR2 (S?Q ID NO: 46; 6135 bp) para la expresión de cadenas pesadas de inmunoglobulina como se describe en ei ejemplo 2. pDR2 contiene secuencias que codifican un anticuerpo irrelevante, esto es, ia cadena pesada de un anticuerpo anti-CDR humanizado (Shaiaby et al., supra), los cocones ds inicio y retención para los cuales son indicados en negritas y subrayados. La figura 8 muestra las curvas de enlace de anticuerpos humanizados revertientes de líneas de germinación /bí a : oí D? -; . La figura 9 muestra los resultados de bloqueo de un análisis de proliferación celular mesa gial de ratón de anticuerpo TGF-betaí 2X1 y varios anticuerpos variantes TGF-beta humanizados. Las figuras 10A-10C muestran la neutralización de TGF-beta3 en tres consideraciones diferentes, respectivamente, en un análisis ce proliferación de fibroblasto 3T3 mediante tres anticuerpos humanizados contra TGF-beta (H2KLV5L, H2NI.gíL2, y V5E.gLL2) y anticuerpo murino 2G . Las figuras 1IA-11C muestran la neutralización de TGF-beta2 en tres concentraciones diferentes, respectivamente en un análisis de proliferación de fibroblasto 3T3 mediante los cuatro anticuerpos mostrados en ía figura 10. Las figuras 12A-12C muestran la neutralización de TGF-betal en tres concentraciones diferentes, respectivamente en un análisis de proliferación de fibroblastos 3T3 mediante les cuatro anticuerpos mostrades en la figura 10. Las figuras 13A-13C muestran la neutralización de 2 ng/ml TGF-betal, beta2, y beta3, respectivamente, en un análisis de proliferación de fibroblastos 3T3 mediante los cuatro anticuerpos mostrados en la figura 10. Las figuras 14A-I4D muestran la neutralización de las tres isoformas de TGF-beta en un análisis de proliferación de fibroblasto 3T3 mediante el anticuerpo humanizado E2NLV5L (figura 14A) , anticuerpo humanizado H2KI.glL2 (figura 143), anticuerpo murino 2G7 (Figura 14C; , y anticuerpo humanización V5E.glL2 (figure 14D; . Las figuras 15A y 153 muestran los resultados de ELISA de producción e inhibición de TGF-beta mediante células epiteliales normales y de tumor. La figura 15A. muestra la orcduccion in vitro de TGF-betal mediante células epiteliales normales (?pC) (C57) y mediante tumor ?pC (modelo 4T1) . La figura 15E muestra el efecto del anticuerpo anti-TGF-beta 2G7 in vivo sobre los niveles de TGF-betal en el suero en el tumor EpC contra el anticuerpo de control IgG (IgG isotipo-coincidente, que es un anticuerpo anti-a brosía en EpC normal y de tumor. Este mismo control de IgG es usado para las figuras restantes y en la figura 28 un control de IgG es usado que puede o no ser el mismo. Las figuras 16 y 16B muestran el efecto del anticuerpo anti-TGF-beta 2G7 sobre tumores de pul ón secundarios contra el control de IgG. La Figura 16A muestra puntuaciones de histología con grado y número de lóbulos afectados por anticuerpo de control IgG y anticuerpo TGF-beta 2G7, y la figura 153 muestra los pesos de tejido en gramos y "ocrcenta e ce peso corporal para eí mismo control y el anticuerpo TGF-beta 2G7. La figura 17 muestra el efecto del anticuerpo anti-TGF-beta 2G7 sobre la cuantificación de tumores de pulmón mediante uCt contra control ele IgG, tanto mediante volumen de tumor como número de tumor. Las figuras 18A y 183 muestran el efecto del anticuerpo anti-TGF-beta 2G"? y quimioterapia en el modelo de cáncer de pecho 4T1 contra el control de IgG. La figura 18A muestra el volumen de tumor como función del tiempo después de inyección de célula para IgG con control salino, IgG y control de docetaxel (TAXOT?REQ) , y anti-TGF-beta 2G7 y docetaxel ÍTAXOTER?®; . La figura 18B muestra el peso del tejido para cerebro, pulmón, bazo y tumor para los dos controles (IgG con y sin docetaxei TAXOTERE©) y el anti-TGF-beta con docetaxel (TAXOIEREd . La figura 19 muestra los niveles de VEGF en ei plasma (pg/ml) en ratones sin tumores (Normales), o en ratones con tumores mamarios 4T1 tratados ya sea con IgG de control (control) o anti-TGF-beta (2G7) . Las figuras 20A y 20B muestran el efecto del anticuerpo TGF-beta 2G7 en un modelo de cáncer de pecho diferente Py T. La figura 20A muestra eí volumen del tumor como función de días de crecimiento de tumor para el anticuerpo TGF- beta y control de IgG y ía figura 2CB muestra el peso dei tumor para el anticuerpo rGF-3eta y control de IgG. Las figuras 21A y 213 muestran un modele de eianoma de ratón Bl c y el efecto del anticuerpo TGF-beta 2G7 contra el control de IgG. La figura 21A muestra el porcentaje de ratones con tumores de pulmón en cuanto y superficie y patología para el contrcl y anticuerpo de TGF-beta y la figura 213 muestra eí número de tumor de pulmón para la superficie, despejado y CT para el anticuerpo y anticuerpo de TGF-beta. La figura 22 muestra el efecto del anticuerpo TGF-beta 2G7 sobre el crecimiento del tumor Bld (volumen) durante 14 días después de inoculación contra el IgG de control. La figura 23 muestra el efecto del anticuerpo TGF-beta 2G~ sobre ei conteo de metástasis de tumor visible B16 (Eß) contra eí control de IgG. La Figura 24 muestra el efecto del anticuerpo TGF-beta 2G7 sobre eí crecimiento del tumor Blß (volumen) durante 17 días después de inoculación contra el control de IgG. La figura 25 muestra el efecto del anticuerpo TGF-beta 2G7 sobre el peso de tumor primario 316 contra el control de IgG. La figura 26 muestra el efecto del anticuerpo TGF-beta 2G7 sobre el conteo de metástasis de tumor visible Blß (E7) contra el control de IgG.

La figura 27 muestra el efecto del anticuerpo TGF-beta 2G7, el anticuerpo anti-VEGF nopoc." or.al murino A. 61, y una combinación de los dos anticuerpos sobre el volumen de tumor en un xenoinjerto de ratón Caíu-ß de célula de pulmón humano centra el control de IgG durante un período de tiempo hasta el día 42. El tratamiento con los varios agentes es iniciado en el día 2. La figura 28 muestra les pesos de tumor final para ei exoerimento Caiu-6 en la figura 27 para los tres tipos de tratamientos de anticuerpo y un control de IgG.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS . Definiciones Los té transformante" son usados intercambiablemente en la presente y se refieren la familia de moléculas descritas anteriormente en la presente que tienen ya sea ía secuencia de aminoácidos de plena longitud, natural ae cualquiera de los TGF-beta de humanos, er. las que se incluyen las formas latentes y complejo asociado o sin asociar de TGF-beta precursor y maduro iJYGF-latente") . La referencia a tal TGF-beta en la presente se comprenderá una referencia a cualquiera de las formas identificadas actualmente, en las que se incluyen TGF-betal, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta , y TGF-beta5 y versiones latentes de las mismas, también como a especies TGF-beta humanas identificadas en el futuro, en las gue se incluyen polipéptidos derivados ae la secuencia de cualquier TGF-beta conocido y que es por io menos aproximadamente 75%, preferiblemente por lo menos 80%, mas preferiblemente por lo menos 85%, todavía más preferiblemente 90%, y aún más preferiblemente por lo menos 95% homólogo con la secuencia. Los términos específicos "TGF-becaYJ "TGF-beta2", y "TGF-beta3" , también como "TGF-beta4" y "TGF-beta5'Y se refieren a ios TGF-beta definidos en la literatura, por ejemplo, Derynck et al., Nature, supra, Seyedin et al., J. Biol. Chem., 262, supra, y deMartin et al., supra. El término "TGF-beta" se refiere al gen que codifica el TGF-beta humano. ?l TGF-beta preferido es el TGF-humano de secuencia natural. Los miembros de ia familia TGF-beta como se definen como aquellos que tienen nueve residuos de cisteír.a en la porción madura de la molécula, comparten por lo menos 65% de homología con otras secuencias de TGF-beta conocidas en la región madura y pueden competir por el mismo receptor. Además, se aprecia que serán modificadas como un precursor más grande que comparte una región de alta homología cerca del término N y muestra conservación de los tres residuos de cisteína en la porción del precursor que más tarde será retirado para procesamiento. Además, los TGF-beta parecen tener sitio de orocesamiento con cuatro o cinco aminoácidos.

Un polipéptido de "secuencia natural" es uno que tiene la misma secuencia de aminoácido como un pclipéptidc (por ejemplo, TGF-betal) derivado de la naturaleza. Tales polipéptidos de secuencia natural pueden ser aislados de la naturaleza o pueden ser producido mediante medios recombinantes o sintéticos. Así, un polipéptido de secuencia natural puede tener ia secuencia de aminoácido del polipéptido humano que se presenta de manera estable en la naturaleza, polipéptido murino o ooiipépticio de cualquier otra especie amíf ra. ?l término "variante de secuencia de aminoácido" se refiere a polipéptidos que tienen secuencias de aminoácidos que difieren a alguna extensión de un polipéptido de secuencia natural. Ordinariamente, las variantes de secuencia de aminoácidos poseerán por lo menos aproximadamente 70% de homología con el polipéptido de secuencia natural o porción del mismo que es comparado con la variante, y preferiblemente, será por lo menos aproximadamente 80%, más preferiblemente por lo menos 90% y todavía más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% homólogo con tal polipéptido de secuencia natural o porción. Las variantes de secuencias de aminoácidos poseen sustituciones, cancelaciones y/o inserciones en ciertas porción dentro de ia secuencia de aminoácidos natural. "Homología" es definida co o el porcentaje de residuos en la variante de secuencia de aminoácidos que son idénticos después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para obtener el por ciento máximo de homología. Métodos y programas ce computadora para la alineación son bien conocidos en el arte. Uno de tales programas de computadora es "Align 2", de Genentech, Inc., que fue presentado con ia documentación del usuario en la Oficina de Derechos Reservados de los Estados Unidos, Washington, DC 20559 el 10 de diciembre de 1991. El término "anticuerpo" se usa en la presente en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonaies, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) formados a partir de por lo menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad biológica deseada. El término "anticuerpo monoclonal" como se usa en ia presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos suscancialmente homogéneos, esto es, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las mutaciones que se presentan de manera estable en la naturaleza posiblemente que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, son dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpos pcíiclonales que incluyen anticuerpos diferentes dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal es dirigido con ra un solo determinante sobre el a tígeno. Además ?e su especificidad, los anticuerpos menoelenaies son ventajosos en que pueden ser sintetizados sin indica el carácter del anticuerpo que es obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos y no seré interpretado que requiere la producción del anticuerpo por algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monocicnaies a ser usados de acuerdo con la presente invención pueden ser elaborados mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohier et al, Kature, 256:495 (1975), o pueden ser elaborados mediante métodos de ADN recombinantes (véase, patente estadounidense Mo. 4,816,567). Los "anticuerpos mcnocicnales" pueden también ser aislados de bibliotecas de anti ce fago utilizando las técnicas descritas en Clac son et al, Nature, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J, Mol. Biol., 222: 581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos mono-clónales en ia presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una ciase o subclase de anticuerpo particular, en tanto que el resto de la(s) cadena (s) es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o subclase de anticuerpo, también como fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban ia actividad biológica deseada (patente estadounidense No. 4,816,567; y Morrisen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. "JSA, 81:6851-6855 (1934)). Anticuerpos quiméricos de interés en ia oresente incluyen ant: cuerpos "primatizados" qµe comprenden secuencias de enlace de antígeno de dominio variable derivadas de una secuencia de región constante primate no humana (por ejemplo, Oíd crla Xor.key, Ape etc.; y secuencias de región constante humanas. "Fragmentos ce anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, que comprende preferiblemente la región de enlace de anticuerpo o región variable dei mismo. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab F(abY2, y fragmentos de Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de una sola cadena y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmento (s) de anticuerpos. Un anticuerpo "intacto" es uno que comprende una región variable de enlace de antígeno también como un dominio constante de cadena íigera (CL) y dominios constantes de cadena pesada C31, ZA2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia natural (por ejemplo dominios constantes de secuencia natural humane) o variantes de secuencia de aminoácidos de ios mismos. Preferiblemente, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras.

"Funciones efec oras" de anticuerpos se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fc (una reción de Fc de secuencia natural o región de Fc variante de secuencia de aminoácido) de un anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras de anticuerpo incluyen enlace de Clq; citotoxicidad dependiente de complemento; enlace de receptor Fc; citotoxicidad ocerada oor la célula dependiente de anticuerpo (ADCC) ; fagocitosis; regulación descendente de receptores de superficie-; celular (por ejemplo receptor de célula B; BCR) ; etc. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden ser asignados a "clases" diferentes. Hay cinco clases mayores de anticuerpos intacto: IgA, TgD, IgE, IgG, e IgM, y varios de estos pueden ser divididos adicionalmente en "subclases" (isotipos), por ejemplo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, e IgAL2. Los dominios constantes de cadenas pesadas que corresponden a las clases diferentes de anticuerpos son llamados a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidad y las configuraciones tridimensionales de diferentes clases de inmunoglobu inas son bien conocidas. "Citotoxicídad moderada por célula dependiente de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción moderada por la célula en la cual células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcRs) (por ejemplo células exterminadoras naturales (MK) , neutrófilos y nacrófagos) reconocen el anticuerpo enlazado sobre una célula objetivo y subsecuentemente causan iisis de la célula objetivo. Las células primarias ara moderar ADCC, células NK, expresan FcyRIII solamente, mientras que ios monocitcs expresan FcyRI, FcyRII y FcyRTII. La expresión de FcR sobre células hematopoyéticas es resumida en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9: 457-92 (1921) . Para determinar ía actividad de A.DCC de una molécula de interés, un análisis de ADCC in vitro, tai como aquel descrito en la patente estadounidense No. 5,503,362 o 5,821,337, se puede efectuar. Células efectora útiles para tales análisis incluyen células mcuonucleares de sangre periférica (PBMC) y células exterminadoras naturales (NK) . Alternativa c adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser determinada in vivo, por ejemplo en un modelo de animal tai co o aquel revelado en Clyn.es et al, Proc. Nati. Acad. Sci. (USA), 95:652-656 H998). "Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y llevan a cabo funciones efectoras. Preferiblemente, las células expresan por lo menos Fc?RIII y llevan a cabo la función efectora de ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que moderan ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células exterminadoras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos, las células P3XC y KK son preferidas. Las células efectoras pueden ser aisladas de una fuente natural de las mismas, por ejemplo de sangre o PBMC como se describe en la presente . Los términos "receptor de Fc" o "FcR" eon usados para recibir un receptor que se enlaza a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia natural. Además, un Fcr preferido es uno que se enlaza a un anticuerpo e IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRT, FcyRTI, y Fc?RIII, en las q-ae se incluyen variantes alélicas y formas alternativamente divididas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activante") y Fc?RIT3 (un "receptor inhibidor") , que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente eu ios dominios citoplásmicos de ios mismos. El receptor activamente FcyRIIA contiene una porción de activación a base de tirosina inmunoreceptora (ITAM) en su dominio citoplásmico. Ei receptor inhibidor FcyRIIB contiene una porción de inhibición a base de tirosina inmunoreceptora (ITIM) en sn dominio citcplásmico (véase revisión en Daéron, Annu. R.ev. Im unol . 15: 203-234 (1997)). os FcRs son revisados en Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol . , 9: 457-492 (1991); Capel et al, I munomethods, 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126: 330-41 (1995). Otros FcRs, en los que se incluyen aquellos a ser identificados en eí futuro, son abarcados por el término "FcR", en la presente. El término también incluye ei receptor neonatal, FcRn, que es responsable cor la transferencia de IgG maternales ai feto. Guyer et al., C . Immunol, 117: 53"? (1976) y Kim et al., Z. Im unoí., 24: 249 "Citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para someter a lisis un objetivo en presencia del complemento. La ruta de activación de complemento es iniciada per el enlace del primer componente al sistema de complemento dlg) a una molécula (por ejemplo un anticuerpo) acomplejada con - r. antígeno cognato. Para determinar ia activación de complemento, se puede efectuar un análisis de CDC, por ejemplo co o se describe en Gazzano-Santorc et al-, C . Im unol . Methods, 2C2: 163 (1996). "Anticuerpos naturales" son usualmente glicoproteínas heterotetra éricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas e dos cadenas ligeras idénticas (L) y dos cadenas pesadas (E) idéntica. Cada cadena ligera es enlazada a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covalente, en tanto que el número de enlaces de disuifuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunogobnlina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disuifuro de intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena licera tiene un dominio variable en un extremo (vA.) y un dominio constante en su otro extremo. Ei dominio constante de la cadena ligera esté alineade con el primer dominio constante ce ia cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera es alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Residuos de aminoácidos particulares se cree que forman una interface entre los dominios variables de cada ligera y cadena pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y son usados en ei enlace y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida igualmente en todos los dominios variables de anticuerpos. Está concentrada en tres segmentos llamadas regiones hipervariebles tanto en los dominios variables de cadena ligera y de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables son llamadas las regiones de estructura (FR) . Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras naturales comprenden cada una cuatro FR, que adoptan extensamente una configuración de ß-hoja, conectada mediante tres regiones hipervariables, que forman bucles que las unen y en algunos casos forman parte ce la estructura de ß-hoja. Las regiones hipervariables en cada cadena son mantenidas conjuntamente en proximidad estrecha mediante las FR y con las regiones hipervariabies de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitie ae enlace de antígeno de anticuerpos (véase Kabat et al., suprdj. Los dominios constantes no están involucrados directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en ía citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . El término "región hipervariable" cuando se usa en la oresente se refiere a ios residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables per el enlace ce antígeno. La región hipervariabíe comprende en general residuos de aminoácido de una "región determinante de complementareidad" o "CDR" (por ejemplo, residuos 24-34 {Ll}, 50-56 (L2; y 89-97 (L3) ei dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl), 50-65 ÍB2) y 95-102 (E3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al, supra.i y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariabie" (por ejemplo residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (13) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia and Les , J. Mol. Biol., 196: 901-917 (1987)). Residuos de "región de estructura" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable como se definen en la presente. La digestión de papaína produce dos fragmentos de enlace de anticuerpo idénticos, llamados fragmentos "Fab" cada un con un solo sitio de enlace de antígeno y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(abY¡2 que tiene dos sitios de enlace de antígeno y es todavía capaz de reticular el antígeno. "Fv" es el frag e contiene un sitio ce reconocimiento de antígeno y de enlace de antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dcminic variable de cadena pesada y cadena ligera en asociación fuerte, no covaiente. Ss en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan oara definir un sitio de enlace de antígeno sobre la superficie del dímero Yr-Vd Colectivamente, las seis regiones hipervariabíes confieren especificidad de enlace de antígeno ai anticuerpo. Sin embargo, aún un solo dominio variable (o la mitad de un Fv comprende solamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno) tienen la capacidad para reconocer y enlazar el antígeno, aunque a una afinidad más baja que todo el sitio de enlace. El fragmento Fab también contiene eí dominio constante de ia cadena ligera y el primer dcminic constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el término carboxi del dominio de CK1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteinas de la región de engozne de anticuerpo. Fab' -SH es la designación en la presente para Fab' en ei cual el (los) residuo (s) de cisteína ae los dominios constantes llevan por io menos un grupo tiol libre. Fragmentos de anticuerpo ?(ab' }2 originalmente eran producidos como pares de fragmentos de Fab' tienen cisteínas de engozne entre las mismas. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos son también conocidos. Las "cadenas ligeras" de anticuerpos de cualquier especie ae vertebrados pueden ser asignadas a uno de dos tipos claramente distintos, llamados kappa (K) y lambda ;?; , en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. "Fv de una sola cadena" o fragmentos de anticuerpo de "scFv" comprenden ios dominios de V,_ y V- del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena de polipéptido. Preferiblemente, el polipéptido de Fv comprende además un enlaza?or de polipeptido entre ios dominios de VH y V- que permite que el scFv forme la estructura deseada para eí enlace de antígeno. Para una revisión de scFv, véase Pl?ckthun en The Pharmacoiogy of Monoclcnal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer- Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . Fragmentos de scFv ae anticuerpo anti-TGF-beta son descritos en WO 1993/16185; Patente estadounidense No. 5,571,894; y Patente estadounidense No. 5,587,458. El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de enlace de antígeno, tales fragmentos comprenden un dominio de cadena variable (VH) conectado a un dominio ligero variable ¡JA ) en la misma cadena de polipéptido (Vt-VL) • Al utilizar un eniazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en ia misma cadena, los dominios son forzados a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de enlace de antígeno. Diacuerpos son descritos más plenamente en, por ejemplo SP 404,097; WO 1993/11161; y Hollinger et al., Proc. Katl . Acad. Sci. USA. 90: 6444-6448 (1993) . Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo de roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen la secuencia mínima derivada de inmunoglcbulina no humana. Por la mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las cuales residuos de una región hipervariable del receptor son reemplazados por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tai como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene ia especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunas instancias, residuos de región de estructura (FR) de ia inmunoglobulina humanos son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no son encontrados en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones sen efectuadas para refinar adicionalmente el desempeño de anticuerpo. En general, ai anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmer.ee todos de por le menos uno y comúnmente dos domíneos variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles variables corresponden a aquel_.es de una in nnoglobulina no humana y todos o sustanciai ente todos los FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá cpcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunogíobuiina (Fc) comúnmente aquella de una inmunoglobulina humana. Para detalles adicionales, véase Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riech ann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2: 593-596 (1992) . ün anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más del 95% en peso de anticuerpo, tal como se determina por el método de Lowry y más preferiblemente más del 25% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuencia de aminoácido K-terminai o interna mediante el uso de un secuenciador de copa de centrifugación o (3) a homogeneidad mediante SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reduc oras utilizando azul de Coomassie o preferiblemente teñido de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes puesto que por io menos un componente del ambiente natural de anticuerpo no estará presente. Sin embargo, ordinariamente, el anticuerpo aislado será preparado mediante por lo menos una etapa de purificación. Un anticuerpo "que enlaza" un antigeno de interés, por ejemplo antígeno TGF-beta, es uno capaz de enlazar aquel antígeno con suficiente afinidad, de tal manera que el anticuerpo es útil como agente terapéutico en eí apuntamiento de una célula que expresa el antígeno. En donde el anticuerpo es une que enlaza TGF-beta, usualmeute enlazará TGF-beta preferiblemente en contraposición a otros miembros de las superfa iiia TGF-beta puede ser "uno que no reacciona de manera cruzada significa ivamente con otras proteínas de tai familia tal come 3M?, activina, etc. en tales modalidades, ia extensión-de enlace del anticuerpo a aquellas proteínas no TGF-beta será menos de 10%, tal como se determina mediante análisis de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) o radioinmunoprecipitación (RÍA) . Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" -de un anticuerpo designado, tal como el anticuerpo menoelonai designado 2G7, es uno que posee una o más de las características biológicas de aquel anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos que se enlazan al mismo antígeno (por ejemplo TGF-beta) . "Jor ejemplo, un anticuerpo con una característica biológica de 2G7 puede bloquear ia activación de un TGF-beta, y/o enlazarse al mismo epítcpo en el dominio extraceinlar de TGF-beta como aquel enlazado por 2G7. A no ser que se indique de otra manera, ia expresión "anticuerpo mcnoclonal 2G7" se refiere a un anticuerpo que tiene residuos de enlace de antígeno de o derivados del anticuerpo 2G7 murino de los ejemplos a continuación. Por ejemplo, ei anticuerpo moncclonal 2G"7 puede ser anticuerpo monocionai murino 2G"7 o una variante del mismo, tal como eí anticuerpo humanizado 2G7, que posee residuos de aminoácido de enlace de antígeno dei anticuerpo oncclonal murino 2G7. Ejemplos de anticuerpos 2G7 humanizados son proporcionados en el Ejemplo 2 a continuación. A no ser que se indique de otra manera, la expresión "rhuMAb 2G7" se refiere a un anticuerpo que comprende las secuencias ligera variable VY y pesada variable (VH) de SEQ ID NOs: 1 y 2, respectivamente, fusionados a secuencias de región constante ligeras y pesadas IgGl humano (no alotipo A) expresadas cpcionalmente por una célula de ovario de hámster Chino (CHO) . ün "agente inhibidor del crecimiento" cuando se usa en _a presente se refiere a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula, especialmente una célula de cáncer que expresa TGF-beta ya sea in vitro o m vivo. Así, el agente inhibidor de creci íentc puede ser uno que reduce significativamente el porcentaje de células que expresan TGF-beta en fase S. Ejemplos de agentes inhibidores de crecimiento incluyen agentes que bloquean el avance dei ciclo celular (en un lugar diferente a fase S) , tales como agentes que inducen ia detención ce Gl y detención de fase K . Los bloqueadores de fase M clásicos incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , taxanos e inhibidores topo TI tales co o doxorubicina, epirubicina, caunorubicina, etopósido y bleomicina. Aquellos agentes que detienen Gl también se esparce sobre la detención de fase S, por ejempío agentes alquilantes -de ADK, tales como tamoxifen, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatina, metotrexate, 5-fiuorouracilo y ara-C. Información adicional se puede encontrar en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel, ees., Capítulo 1 , titulado. "Cell cycle regulation, oncogenes, and antíneoplastic drugs" by Murakami et ai. (W3 Saunders: Filadelfia, 1995), especialmente página 13. Ejemplos de anticuerpos de anticuerpos "inhibidores de crecimiento" son aquellos que se enlazan a TGF-beta e inhiben el crecimiento de células de cáncer que sobreexpresan TGF-beta. Los anticuerpos inhibidores de crecimiento y anti-TGF-beta preferidos inhiben el crecimiento de células de tumor de pecho SK-BR-3 en cultivo celular por más de 20% y preferiblemente más del 50% (por ejemplo de aproximadamente 50% a aproximadamente 100%) a una concentración de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 30 ug/ml, en donde la inhibición de crecimiento es determinada seis después ce ia exposición de las células SK-3R-3 al anticuerpo (véase patente estadounidense No. 5,677,171 expedida el 14 de octubre de 1997) . El análisis de inhibición de crecimiento de célula SK-3R-3 es descrito en más detalle en aquella patente, ün ant provoca que una célula viable se convierta en no viable. La célula es en general una que expresa el receptor TGF-beta, especialmente en donde ia célula sobreexpresa el receptor TGF-beta. Preferiblemente, las célula es una célula de cáncer, por ejemplo cáncer de pecho, ovario, estómago, endcmetrial, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroide, pancreática o de vejiga. Ir. vitro, í célula puede ser una célula SK-BR-3, BT474, Calu 3, MDA-MB-453, MDA-X3-361 o SKOV3. La muerte celular in vitro puede ser determinada en ausencia de complemento y células efectoras inmunes para distinguir ía muerte celular inducida por citotoxicidad moderada por la célula dependiente de anticuerpo (ADCC) o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) . Así, el análisis de la muerte celular se puede efectuar utilizando suero inactivado térmicamente (esto es, en ausencia de complemento) y en ausencia de células efectoras inmunes. Para determinar si el anticuerpo es apto de inducir ia muerte celular, la perdida de integridad de membrana tal como es evaluada mediante la absorción de yoduro de propidiníc (?I) , azul de triptan (véase Mcore et ai., Cytotechnoiogy, "7:1-11 (1995)) o ^A D puede ser determinada en relación con células sin tratar. Los anticuerpos que inducen muerte celular preferidos son aquellos que inducen absorción de ?I en el análisis de absorción de Pl en células 3T (véase posteriormente en la presente) . ün anticuerpo que "induce apóptosis" es uno que induce la muerte celular programada tal como se determina mediante enlace de anexina V, fragmentación de ADN, encogimiento ceiular, dilatación de retícuio epdoplásmico, fragmentación de célula y/o formación de vesícnlo de membrana (llamados cuerpos apoptóticos) . La célula es usualmente una que sobreexpresa el receptor TGF-beta. Preferiblemente, la célula es una célula de tumor, por ejemplo célula de pecho, ovario, estómago, encometrial, glándula salival, pulmón, riñon, colon, tiroide, pancreática o vejiga. In vitro, la célula puede ser una célula SK-3R-3, 3T474, Caiu 3, MDA-MB-453, MDA-MB-361 o SKCV3. Varios métodos están disponibles para evaluar los eventos celulares asociados con la apóptosis. Por ejemplo, la translocación de fosfatidilserina (PS) puede ser medida mediante enlace de anexina; la fragmentación de ADN puede ser evaluada por medio de escalonamiento de ADN y condensación nuclear/cromati a junto con fragmentación de ADN puede ser evaluada por un incremento en células hípodipioides . Preferiblemente, el anticuerpo que induce apóptosis es uno que da come resultado aproximadamente 2- a 50 veces, ©referiblemente alrededor de 5- a 50 veces y más preferiblemente alreaedor de 10- a 50 veces, inducción de enlace de anexina en relación a las células sin tratar en un análisis de enlace de anexina utilizando células 3T474 (véase posteriormente en ía presente) . Algunas veces, el anticuerpo ro-apoptóticc será uno que bloquea adicionalmente el enlace de TGF-beta (por ejemplo anticuerpo 2G7 ; esto es, el anticuerpo comparte una característica biológica con un anticuerpo a TGF-beta. En otras situaciones, ei anticuerpo es uno que bloquea significativamente TGF-beta. Además, el anticuerpo puede ser uno que, en tanto que induce la aoóptosís, no induce una gran reducción en el per ciento de células en fase S (per ejemplo, una que solamente induce aproximadamente C-10% de reducción en por ciento ce estas células en relación con un control) . El "epítepo 2G7" es la región en el dominio extracelular de TGF-beta a la cual el anticuerpo 2G7 (ATCC H310240) se enlaza. Para seleccionar anticuerpos que se enlazan ai epítopo 2G7, se puede efectuar un análisis de bloqueo cruzado de rutina, tal como se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, ?d Harlow and David La e (1988) . ün "anticuerpo TGF-beta" se refiere a un anticuerpo que se enlaza a cualquiera de las isoformas de TGF-beta, preferiblemente que se enlaza asea a TGF-betal, TGF-beta2, o TGF-beta3, o cualquier combinación de los mismos, más preferiblemente por io menos TGF-betal, o por lo menos TGF-beta2, y más preferiblemente TGF-betal, o TGF-betal junto con TGF-beta2. Opcionalmente, el anticuerpo se puede enlazar a por lo menos TGF-beta3. "Tratamiento" se refiere tanto a un tratamiento terapéutico como medidas profilácticas o preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con ia enfermedad también como aquellos en los cuales se impedirá la alteración. De aquí, el mamífero a ser tratado en la presente puede haber sido diagnosticado como al tener ia alteración o puede estar predispuesto o susceptible a la alteración. "Mamífero" para prepósitos de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, en los que se incluyen humanos, animales domésticos y de granja y zoológico, deportivos o animales de mascota, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc. Preferiblemente, ei mamífero es un primate, tal como un chango, simio o humano, por ejemplo y más preferiblemente un humano. "Alteraciones TGF-beta" o "alteraciones relacionadas con TGF-beta" se refiere a cualquier alteración, enfermedad o condición que se beneficiaría de tratamiento con el anticuerpo anti-TGF-beta. Estas incluyen alteraciones crónicas y agudas o enfermedades que incluyen aquellas condiciones patológicas que predisponen ai mamífero a la alteración en cuestión. Las alteraciones a ser tratadas en la presente incluyen enfermedades caracterizadas por ía acumulación de matriz extracelular, enfermedades provocadas por TGF-beta circulante o TGF-beta activado en ur sitio local, condiciones provocadas por supresión deí sistema inmune a la producción de TGF-beta endógeno, deficiencias inmunes agudas resultantes de lesiones severas, quemaduras y enfermedades tales como infecciones virales o bacterianas, enfermedades sistémicas multiórganos debido a ia producción c sobreproducción de TGF-beta y tumores que producen 'TGF-beta. Ejemplos específicos no limitantes incluyen neuronal, giial, astrocital, hipotalamico y otras alteraciones glandulares, macrofagales, epiteliales, estromales y biastocoeiicas, fibrosis, cicatrización, daños al tejido tales como provocados por radiación y adhesión durante cicatrización de heridas, alteraciones de piel fibróticas tales como escleroderma, tejido de cicatrización de patología de CNS, cicatrización dérmica, cicatrización queloide y cicatrización neural, enfermedades floxóticas de la cavidad peritoneal, pulmones, hígado y riñones tales como fibrosis hepática crónica, lesión de hígado aguda, fibrosis de pulmón y renal intersticial y cirrosis de hígado, fibrosis cística, alteraciones 'vasculares, por ejemplo fibroeis cardiaca, iesión arterial tai como aterosclerosis y arteriosclerosis, tumores benignos y malignos, ciertas íeucemias no inhibidas por TGF-beta y alígrridades (por ejemplo sarcomas, carcinomas y melano as) , en los que se incluyen cáncer de próstata, cáncer fibrótícc, cáncer de ovario, melanoma maligno, pecho, pulmón, colon, rectal, colorrectal o cáncer cervical y cáncer metastásico, también como tumores neuroendrocrinos del sistema digestivo y glicblastomas, angiopatía, vasculopatía, nefropatía, esclerosis sístémica, infecciones taies como infecciones de patógeno macrófago e infecciones virales tales como hepatitis C y ?IV, alteraciones inmunológicas, angiegénicas e inflamatorias y deficiencias tales como artritis reumatoide, una alteración ocular, especialmente aquellas que involucran fibresis ocular, en las que se incluyen retipopatía proliferativa, desprendimiento retina! y cirugía de drenaje de post-glaucoma, tal como retina nenra, epitelio-corcide, de pigmento retinal y vitro del ojo humano y cataratas, osteoporosis, síndrome de molestia respiratoria adulta, infarto pest-miocardie, restenosis post-angiospiastia, glomerulonefritis, una condición relacionada con diabetes tal como hipergüeemia, diabetes, enfermedad de riñon diabético, nefropatía diabética, neuropatía diabética o retinopatia y enfermedades de deficiencia de macrófago. Preferiblemente, la alteración es fibrosis, una lesión arterial, una infección, artritis reumatoide, diabetes o una condición diabética o una malignidad, tal como cáncer que expresa TGF-beta, más preferiblemente en donde el cáncer está caracterizado por activación excesiva de TGF-beta. Tal cáncer puede sobreexpresar TGF-beta o alternativamente no ser caracterizado por ia sobreexprssión de TGF-beta. El término "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de un fármaco efectiva para tratar una enfermedad o alteración en un mamífero. EÍI el caso de cáncer, la cantidad terapéuticamente efectiva del fármaco puede reducir ei número de células de cáncer, reducir ei tamaño del tumor; inhibir (esto es, frenar alguna extensión y preferiblemente detener) infiltración de células de cáncer a órganos periféricos; inhibir (esto es, frenar alguna extensión y preferibíemente detener) metástasis ce tumor; inhibir a aluna extensión, crecimiento de tumor y/o aliviar a alguna extensión uno c más de ios síntomas asociados con el cáncer. A la extensión que ei fármaco puede impedir el crecimiento y/o exterminar células de cáncer existentes, puede ser citostático y/o citotóxico. La terapia de cáncer, eficacia puede, por ejemplo ser medida al determinar el tiempo al avance de la enfermedad (TT?) y/o determinar la velocidad de respuesta (RR) . Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que está caracterizada comúnmente por el crecimiento celular sin regular. Ejemplos de cáncer incluyen, pero no están limitados a, carcinoma, íinfcrna, blastoma, sarcoma y leucemia o malignidades linfoides. Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa (por ejemplo, cáncer de célula escamosa epitelial) , cáncer de pulmón en los que se incluyen cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adeuocarcino a dei pulmón y carcinoma escamoso deí pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o del estómago en los que se incluyen cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastcma, cáncer cervical, cáncer ce ovarios, cáncer de hígado, cáncer de ve iga, hepatoma, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vuivar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma per.il, también como cáncer de cabeza y cuello. ün "cáncer que expresa TGF-beta" es uno que produce niveles suficientes de TGF-beta eu la superficie de las células del mismo, de tal manera que un anticuerpo anti-TGF-beta se puede enlazar al mismo y tener un efecto terapéutico con respecto al cáncer. Un cáncer "caracterizado por activación excesiva" de un receptor TGF-beta es uno en ei cual ía extensión de activación de receptor de TGF-beta en células de cáncer excede significativamente el nivel de activación de aquel receptor en células no cancerosas en el mismo tipo de tejido. Tal activación excesiva puede resultar de ía sobreexpresión deí receptor TGF-beta y/o mayor que los niveles normales de un ligando TGF-beta disponible para activar el receptor TGF-beta en las células de cáncer. Tai activación excesiva puede provocar y/o ser provocada por el estado maligno de una célula de cáncer. En algunas modalidades, el cáncer será sometido a un análisis de diagnóstico o prognostico para determinar si la amplificación y/o sobreexpresicn de un receptor de TGF-beta eetá ocurriendo que de cómo resultado tal activación excesiva del receptor TGF-beta. Alternativa o adicionalmente, el canee r-puede ser sometido a un análisis de diagnóstico o prognestico para determinar si la amplificación y/o sobreexpresión de un ligando TGF-beta está ocurriendo en el cáncer que atribuye la activación excesiva del receptor. En un subconjunto de tales cánceres, la activación excesiva dei receptor puede resultar de una ruta autocrina-estimuí toria. En una ruta "autocrina"-estimulatoria, ocurre la autoestímuiación en virtud de la célula de cáncer que produce tanto un ligando TGF-beta y su receptor TGF-beta cognato. Por ejemplo, el cáncer puede expresar o sobreexpresar el receptor TGF-beta y también expresa o sobreexpresa un ligando TGF-beta (por ejemplo TGF-betal) . ün cáncer que "sobreexpresa" un receptor TGF-beta es uno que tiene niveles significativamente más altos de un receptor TGF-beta, en la superficie celular del mismo, en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. Tal sobreexpresión puede ser provocada por amplificación genética o mediante transcripción o traducción incrementada. Aa sobreexpresión dsl receptor TGF-oeta puede ser determinada en un anáiíeis de Diagnóstico o prognostico ai evaluar los niveles incrementados de la proteína TGF-beta presentes sobre la superficie de una célula (por ejemplo, vía un análisis de inmunohistoquímica; IHC) . Alternativa o adicionalmente, se pueden medir niveles de ácido nucleico que codifica TGF-beta en la célula, por ejemplo vía hibridización in situ fluorescente ÍFISE; véase WO 1998/45479 publicado en octubre de 1928), absorción de southern c técnicas de reaccionen cadena de polimerasa 'PCR) , tales como PCR cuantitativa en tiempo real (RT-PCR) . También se puede estudiar la sobreexpresión de receptor TGF-beta ai medir el antígeno de muda (por ejemplo, dominio extracelular TGF-beta) en un fluido biológico tal como suero (véase, por ejemplo, Patente estadounidense Ko. 4,933,294 expedida el 12 de junio de 1990; WO 1991/05264 publicado el 18 de abrií ce 1991; patente estadounidense 5,401,638 expedida el 28 de marzo de 1995; y Sias et ai., J. Immunol . Methods, 132: 73-80 (1990)). Además de los análisis anteriores, varíes anáiisis in vivo están disponibles para ei práctico experimentado. Por ejemplo, se puede exponer a las células dentro del cuerpo del paciente a un anticuerpo que es marcado opcionalmente con una etiqueta detectable, per ejemplo un isótopo radioactivo y eníace dei anticuerpo a células en el paciente se puede evaluar, por ejemplo mediante exploración externa en cnanto a radioactividad o al analizar una biopsia tomada de un paciente previamente expuesto al anticuerpo. Inversamente, un cáncer que está "no caracterizado por la scbreexpresión de TGF-beta" es uno que, en un análisis de diagnóstico, no expresa niveles más altos que les normales del receptor de TGF-beta en comparación con una célula no cancerosa del mismo tipo de tejido. ün cáncer que "sobreexpresa" un ligando de TGF-beta es uno que produce niveles significativamente más altos de aquel ligando en comparación con una célula no cancerosa deí mismo tipo de tejido. Tal sobreexpresión puede ser provocada por amplificación genética o por transcripción o traducción incrementada. La sobreexpresión del ligando TGF-beta puede ser determinada diagnósticamente al evaluar los niveles del ligando (o ácido nucleico que c codifica) en el paciente, por ejemplo en una biopsia de tumor o mediante varios análisis de diagnóstico tales co o IEC, FISH, absorción de southern, PCR, o en análisis in vivo descritos anteriormente. Un cáncer "hormona-independiente" es uno en el cual la proliferación del mismo no es dependiente de la presencia de una hormona que se enlaza a un receptor expresado por células en el cáncer. Tales cánceres no sufren regresión clínica después de la administración de estrategias farmacoiógicas o quirúrgicas sue reducen la concentración de hormona en o cerca del tumor. Ejemplos de cáncer independientes de hormona incluyen cáncer de próstata independiente de andrógeno, cáncer de peche independiente de estrógeno, cáncer endometrial y cáncer de ovarios. Tales cánceres pueden comenzar como tumores dependientes cié hormcna y avanzar d.e una etapa sensible a la hormona a un tumor refractario a hormona enseguida de ia terapia anti-hor onal . El término presente se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de células y/o provoca destrucción de células. El término está diseñado para incluir isótopos radioactivos (por ejemplo Ad11, I131, IU5, AA Relse, Re?efc, Sm153, 3d:2, ?3= e isótopos radioactivos de Lu; , y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, plantas o animales, en los que se incluyen fragmentos y/c variantes de los mismos. Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útii en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y ciclofosfamiaa ÍCYTOXANrE) ; aiquilsulfonatos tales como busulfan, i prosuifan y piposulfan; aziridinas tales como benzodcpa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metiiameiaminas en los que se incluyen altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetiloimelamina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucilo, clornafazina, coiofosfamida, estramstina, ifcsíemi?a, mecloretamina, óxido de clorhidrato de mecloretamina, elfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trcfosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorototocina, fotemustina, lomustina, nimustína, ranimustina, antibióticos tales como aclacino isinas, actinomicin, autramiciu, azaserna, bleomicinas, cactínomicina, calicheamícina, carabícina, carmtincmicina, carzincfilina, cro orr?.ciñas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicína, 6-diazc-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina, epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogala icina, oiivc icinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quela icina, rodorubicina, streptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales come metotrexate y 5-fluorouracilo (5-PU) ; análogos de ácido fóíico taies come denopterina, metotrexate, pteropterir.a, trimetexate; análogos de purina tales como fiudarebina, 6-mercaptopurina, tia iprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacítidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, oropionato de dromostanciona, epitiostanol, epitiostano, testolactona; anti-adrenaies tales como aminogiutetimida, mtitotane, trilostane; reabasteceaor de ácido fólico tai como ácido frolínico; aceslatona; aidofosfamida glicósido; ácido a inolevulínico; amsacrina; bestraoucilo; bisantreno; edatraxate; defofamina; aemecolcina; dieziqucna; eifornitina; acetato de eliptinio; etoglucido; nitrato de galio; hidrcxiurea; lentinan; lonidamina; mitoguazona; mitoxar.trona; mopidamoi; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubidína; ácido podofiiínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; krestina PSK€', razoxano; sizofirano; espirogermanio; ácido tenuazonicc; tria?iquona; 2, 2', 2"-triclorotrietilamina; uretano, vindesina; dacarbazina; manomustina; mitcoronitol; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosuro ("Ara-C") ; ciclofosfamida; tiotepa; taxanos (o taxoides) ; por el paciitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Cncoiogy, Princeton, NJ) y docetaxei {TAXOTERE®, Rhone- Poulenc Rcrer, Antony, Francia) ; clorambucilo; gemcitabina; 6-cioganina; mercaptopurina; metotrexate; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etopósido (VP-16; ; ifofasfamida; mitcmicina C; mitoxantrona; vincristina; vinoreibina; navelbina; novantrona; teníposide; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11, inhibir de topoisomerasa RFS 2000; difiuoromeilritina (DMFO); ácido retinoico; esperamicinas; capecitabina y sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores . También incluidos en esta definición están los asentes anti-hormonales aue actúan para regular o inhibir la acción de hormonas sobre tumores tales como anti-estrógenos y moduladores de receptor de estrógeno selectivos (SERM) , en los que se incluyen, por ejemplo, tamoxifeuo (en los que se incluyen tainoxifeno NOLVADEX®) , raicxifeno, aroloxifeno, 4-hidroxitamoxífeno, trioxifeno, keoxifeno, LYI17018, onapristona y toremifeno FARESTON ®; inr.ibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como por ejemplo 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, acétate ele megestrol MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestatina, fadrozcl, verozol RIVISOR®, letrozel FEMARA®, y anastrozol ARIM1DEXF; y anti-andrógenos tales cerno flutamida, nilutamida, bicalutamia, íeuprolide y goserelina; también cerno troxacitabina (un análogo de 1,3-dioxolan nucleósido citocina) ; oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben ia expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación de célula abherenfe, tal como por ejemplo PKC-aifa, Ralf y K-Ras; vacunas ties como vacunas de terapia genética, por ejemplo vacuna ALLCVECTIK®, vacuna LEUVSCTIN®, y vacuna VAXTD®; PRO EUKIN® rIL-2; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAK®, ABARELIXT rm.RH; y sales, ácidos o derivados aceptables farmacéuticamente de cualquiera de los anteriores. Como se usa en la presente, ei término "fármaco EGFR-apuntado" se refiere a un a terapéutico que se eriaza a EGFR y opcienalmente inhibe la activa de EGFP. Eje olos de tales agentes incluyen anticuerpos y moléculas pequeñas que se enlazan a EGFR. Ejemplos de anticuerpos que se enlazan a EGFR incluyen mAb 579 (ATCC CRL H3 8506), mAb 455 (ATCC CRL HB85C7), MAb 225 (ATCC CRL 3508), MAb 528 (ATCC CRL 3509) (véase patente estadounidense No. 4,943,533, Mendelsohn et al . i y variantes de los mismos, tales como 225 quimerizado (C225) y 225 humano reformado (H225) (véase WO 1996/40210, Imclene Systems Inc.); anticuerpos que se enlazan a EGFR mutante tipo II (patente estadounidense No. 5,212,290); anticuerpos humanizados y quimerices que se enlazan a EGFR como se describe en la patente estadounidense No. 5,891,996; y anticuerpos humanos crae se enlazan a EGFR (véase WO 1998 /50J 33, Abgenix) . El anticuerpo anti-EGFR puede ser conjugado con un agente citotóxico, generando así un inmunoconjugado i éase, por ejemplo, E? 659,439, Merck Patent GmbH). Ejemplos de moléculas pequeñas que se enlazan a ?GFR incluyen ZD1839 (Astra Z-eneca) , CP-358774 (OSI/Pfizer) , y G1478. Un "agente terapéutico diferente al anticuerpo humanizado" se refiere a cualquier agente que es efectivo en el tratamiento de una alteración TGF-beta que los anticuerpos en la presente e incluyen aquellos tipos enlistados posteriormente en la presente. Un "agente anti-angicgénico" se refiere a un compuesto que bioquea o interviene con, a algún grado, el desarrollo de vasos sanguíneos. Ei factor anti-angiogénico puede ser, por ejemplo una molécula pequeña o anticuerpo que se enlaza a un factor de crecimiento o receptor ce factor de crecimiento involucrado pera promover la angiogénesis. Ejemplos incluyen antagonistas al factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , tales come anticuerpos que se enlazan específicamente a VEGF, por ejemplo AVASTIN®. "Anticuerpos que se enlazan a V?GF" incluyen anticuerpos quiméricos, humanos y humanizados también como fragmentos y también incluyen anticuerpos que bloquean o neutralizan VEGF o bloquean el enlace de VEGF a uno o más receptores VEGF, preferiblemente ambos receptores . La expresión "reguladores de función inmune en un mamífero" se refiere a citocinas y factores de crecimiento que regulan una función inmune del mamífero, en los que se incluyen interleucinas, factor de necrosis de tumor, linfotoxina, factor de crecimiento epiaérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, 'TGF-a, factor inhibidor de migración de macró age, factor de activación de macrófago, factor de crecimiento de fibroblasto, factores activadores de macrófago, interferonas y factores que estimulan colonias. Estos reguladores pueden ser derivados de fuentes naturales, formados mediante leucocitos, sintetizados mediante métodos si es apropiado o preparados recombinantemente. Los preferidos son EL-I, IL-2, IL-6, y IFN- R rprrrmir.o citocma es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otra célula come mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citocinas son línfeeinas, onecinas y normonas de polipépticlo tradicionales. Incluidas entre las citocinas están la hormona del crecimiento tal como hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento humano de N-metionilo y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroides; tiroxina; insulina; proinsuíina; relaxina; prorelaxina; hormonas de glicoproteína tales cerno hormona que estimula el folículo (FSH) , hormona estimuladora de tiroides (TSH) , y hormona luteinizante (LH) ; factor de crecimiento hepático, factor de crecimiento de fibroblasto; prolactina; iactógeno placental; factor-a y -ß de necrosis de tumor; sustancia inhibidora uleriana; péptido asociado a gonadotropina de ratón; inhibina; activina; factor de crecimiento endo elial vascular; integrina; trombopoyetina (TPO) ; factores de crecimiento ae nervios tales como NFG~ß; factor de crecimiento de plaquetas; factor de crecimiento semejante a insulina I y II; eritropeyetina (EPO) ; factores osteoinductives; interferonas tales como interferón-a, -ß y -?; factores estimuladores de colonias (CSF) tales como macrófago-CSF (M-CSF) ; granulccíto-macrófago-CSF (GM-CSF) ; y granulocito-CSF (G-CSF); interleucinas (Ti) tales como IL-I, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, 11-6, IL-7, TL-8, 11-9, IL-1C, 11-11, 11-12; un factor de necrosis de tumor tal come TNF-a. o TNF-ß; y otros factores de pelipéptidos en les que se incluyen LIF y ligando de kit (KL) . Cerno se USE eu la presente, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultive celular recombinante y equivalentes biccógicamente activos de las citocinas de secuencia natural. El término "profármaco" como se usa en esta solicitud se refiere a un precursor o derivado de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos cítotóxica a células de tumor en comparación con el fármaco original y es capaz de ser activado enzimátíca ente o convertido a la forma original más activa. Véase, por ejemplo, Wilraan, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Appreach to Targeted Drug Delivery, " Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985) . Los profármacos de esta invención incluyen, pero no están limitados a, profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, prcfármacos que contienen péptido, profármacos D-aminoácido-modificado, profármacos glicoxilados, profármacos que contienen ß-íactama, profármacos que contienen fenoxiacetarr.ida opcionalmente sustituidos o profármaccs que contienen fenilacetamida opcionaimente sustituidos, 5-fluorocitosina y otros profarmacos de 5-fiuorouridina que pueden ser convertidos al fármaco libre más citotóxico activo.

Ejemplos de fármacos ci etóxicos que pueden ser derivados a un profármaco para use en esta invención incluyen, pero no están limitados a, aquellos agentes quimioterapéuticcs descritos anteriormente . Una "lipesorna" es una vesícula pequeña compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípides y/o surfactantes que es útil para la administración de un fármaco (tal como los anticuerpos anti-TGF-beta revelados en la presente y opcicual ente un agente quimioterapeutico; a un mamífero. Los componentes e liposoma sen dispuestos comúnmente en una formación bicapa, similar a la disposición de lípidos de membranas biológicas. El término "inserto de paquete" es usado para referirse a instrucciones acostumbradamente incluidas en paquetes comerciales de productos terapéuticos, que contienen información acerca de las indicaciones, use, dosificación, administración, contraindicaciones y/o advertencias concernientes con el uso de tales productos terapéuticos. ün "carcioprotector" es un compuesto o composición que impide o reduce ia disfunción miocardial (esto es, cardiomiepatía y/o insuficiencia cardiaca congestiva) asociada con la administración de un fármaco, tal como un antibiótico de antraciclina y/o un anticuerpo anti-TGF-beta a un paciente. El cardioprotecter puede por ejemplo bloquear o reducir un efecto cardiotóxico moderado por radicales libres y/c prevenir o reducir la lesión per tensión oxidante. Ejemplos de cardioprotectcres abarcados por la presente definición incluyen el agente quelante de hierro dexrazcxaiio (ICRF-187) (Seifert et ai., The Annals of Pharmacotherapy, 28: 1063-1072 (1994)); un agente de disminución de lípidos y/c oxidante tal como probucoi (Singal et al, J. Mol. Cell Cardiol., 27: 1055-1063 (1995)5; amifostina (a inotioi 2- i (3-aminopropii) aminc] etantiol-dihidrégeno fosfato éster, también llamado WR-2721, y ia forma de absorción cloruro desfosforilada dei mismo llamada WR- 1065) y ácido S-3- (3-metilaminocropiiamino)prcpilfosforotioico (WR- 151327;, véase Green et ai.. Cáncer Research, 54: 738-741 (1994); digoxina (Bristow, K.R. ?n: Brístow MR, ed. Drug- Induced Eeart Disease (New York: Elsevier 191-215 (1980)); bloqueadcres beta tales como metoprclol (Hjalmarson et al., Drugs, 4 : Snppl 4:31-9 (1994); y Shaday et al., Am. Eeart J. , 129: 197-199 (1995)); vitamina ?; ácido ascórbico (vitamina C) ; depuradores de radicales libres tales como ácido oleanólico, ácido nrsólicc y N-acetiicisteína (NAC) ; compuestos atrapadores de espín tales co o alfa fenil-terc-butil nitrona (P3N) (Paracchini et al., Anticancer Res., 13: 1607-1612 (1993)); compuestos selenoorgánicos tales como P251 (Elbesen) ; y los semejantes . Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucieico que está identificada y separada de al menos una molécula de ácido nucleico contaminante con ia cual está ordinariamente asociada en la fuente natural del ácido nucleico que codifica eí anticuerpo. Una molécula de ácido nucleico aislada es diferente de ia forma c ajuste en la cual se encuentra en la naturaleza. Por consiguiente, las moléculas de acido nucleico aisladas son distinguidas de la molécula de ácido nucleico como existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que expresan normalmente el anticuerpo en donde, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en un sitio cromosomal diferente de aquel de células naturales. La expresión "secuencias de control" se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación enlazada operativamente en un organismo huésped particular. Las secuencias de control que son apropiadas para procariontes, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionaimente una secuencia de operador y sitio de enlace de ribosoma. Se sabe que las células eucarionticas utilizan promotores, señales de poliadenilación y mejoradores. El ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando está colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, ADN para una ore-secuencia o líder secretorio está enlazado operativamente a ADN per un polipéptido si es expresado como una pre-proteína que participa en la secreción del polipéptido, un promotor o mejorador está enlazado operativamente a una secuencia de codificación que afecta la transcripción de la secuencia c un sitio de enlace de ribcsoma está enlazado operativamente a una secuencia de codificación si está colocado para facilitar la traducción. ?n general "enlazaao operativamente" significa que las secuencias de ADN que son enlazadas con contiguas y en el caso de un líder secretorio, continuas y en fase de lectura. Sin embargo, los mejoradores no tienen que ser contiguos. El enlace se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, los adaptadores de oiigcnncleótidos sintéticos o enlazadores son usados de acuerde con la práctica convencional. Como se usa en la presente, las expresiones "célula", "línea celular" y "cultive celular" son usados intercambiablemente y todas de tales designaciones incluyen progenie. Asi, las palabras "transformantes" y "células transformadas" incluyen la célula sujeto primaria y cultivos derivados de ia misma sin consideración del número de transferencias. También se comprenderá que toda ia progenie puede no ser precisamente idéntica en contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o inadvertidas. La progenie mutante aue tiene la misma función o actividad biológica tai cerno la seleccionada en la célula transformada originalmente son incluidas. En donde designaciones distintas eon propuestas, será claro del contexto.

Co o se usa er. la presente, "muestra corporal" se refiere a cualquier muestra líquida o biológica que contiene o puede contener ei TGF-beta a ser detectado. La muestra incluye fluidos tales come fluidos corporales humanos c animales, por ejemplo sangre, suero, orina, fluido amniótico, extractos de tejido, fluido cerebroespinal y los semejantes. Las muestras pueden requerir tratamiento especial tal como extracción antes de ser analizadas, dependiendo de la tendencia de los componentes contenidos en los mismos hacia la habilidad, agregación o absorción por ei recipiente de almacenamiento.

II . Producción de Anticuerpos anti-TGF-beta Humanizados Métodos para humanizar anticuerpos no humanos han sido descritos en el arte. Preferieie ente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de amineácidos introducidos al mismo ce una fuente que es no humana. Estos residuos de aminoácido no humanos sen frecuentemente denominados como residuos de "importación", los cuales son to ados comúnmente de un dominio rariable de "importación". La humanización se puede efectuar esencialmente siguiendo el método de Winter and co- orkers (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riech ann et al., Nature, 332: 323-327 í 988) ; Verhceyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), al sustituir secuencias de región hipervariables por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Así, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente estadounidense No. 4,816,567) en donae sustancialmente menos ce un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En ía práctica, los anticuerpos humanizados son comúnmente anticuerpos humanes en les cuales algunos residuos e región nipervariable y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos per residuos de sitios análogos en anticuerpos roedores. Otro método para fabricar anticuerpos humanizados es descrito en la publicación de patente estadounidense 2003/0017534 publicada el 23 de enero de 2003, en donde anticuerpos humanizados y preparaciones de anticuerpos son producidos de animales no humanes transgénicos . Los animales no humanos son diseñados genéticamente para contener uno o más sitios de inmunoglobnlina humanizados que sen aptos de sufrir reacomede genético y conversión genética en ios animales no humanos transgénicos para producir inmunoglobulinas humanizadas diversificadas . La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros componente pesados, a ser usados en la fabricación de anticuerpos humanizados es muy importante para reducir ia antigenicidad. De acuerdo con el método de "mejor ajuste", ia secuencia del deminio variable de un anticuerpo de roedor es seleccionado contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que es más cercana a aquella del roedor es luego acepada como la región de estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado. (Sims et al., J. Immunol . , 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol . Biol., 196: 901 (1987)). Otro método utiliza una región de estructura particular derivada de le secuencia de consenso de todos ios anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura puede ser usada para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993)). Es además importante que les anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para obtener este objetivo, de acuerdo con un método preferido, anticuerpos humanizados son preparados mediante un proceso de análisis de las secuencias originales y varios productos humanizados conceptuales utilizando los modelos tridimensionales de las secuencias originales y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales están disponibles comúnmente y son familiares para aquellos experimentados en el arte . Programas de computadora están disponibles que iíustran y exhiben-estructuras confor acioneles tridimensionales probables de secuencias de inmunogíobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones permite eí análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de ia secuencia de inmunoglobuiina candidata, este es, el análisis de residuos que influencia ia capacidad de la inmunoglobuliua caudidata para enlazarse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR pueden ser seleccionados y combinados ce las secuencias del receptor e importación de tal manera que ia característica de anticuerpo deseada, tal cerno afinidad incrementada por el (los) antígeno (s) objetivo es obtenida. En general, los residuos de región hipervariable están directa y más sustancialmente involucrados en ia influencia del enlace de antígeno. El ejemplo 2 a continuación describe la producción de anticuerpos anti-TGF-beta humanizados ejemplares que se enlazan a TGF-beta. El anticuerpo humanizado en la presente comprende residuos de región hipervariabie no humanos incorporados a un dominio pesado variable humanos y comprende además una sustitución de región estructural (FR) en una posición seleccionada dentro del grupo que consiste de 48, 49, 67, 69, 71, 73, y 78, utilizando el sistema de numérico de dominio variable resumido en Kabath et al., supra. En una modalidad, el anticuerpo humanizado comprende sustituciones de FR en dos o más posiciones 48, 49, 67, 69, 71, 73, y 78; y en otras modalidades, en tres o cuatro o más ce tales posiciones. En modalidades preferidas, ei anticuerpo comprende sustituciones FR en posiciones 49, 67 y 71, o posiciones 48, 49 y 71, o posiciones 49, 69, y 71, o posiciones 49, 69, 71, y 73, o posiciones 49, 71, y 73, o posiciones 49, 71, y 78. Es preferido que haya más bien menos en lugar de más sustituciones estructurales para minimizar ie inmunegenici?ad, pero la eficacia es también una consideración muy importante. Los aminoácidos realmente sustituidos son aquellos que son preferiblemente conservados para no cambiar la inmunogenicidad o eficacia. En a posición 48, el cambio es preferiblemente de valina a isoleucina, en posición 49, el cambio es preferialemente de alanina a glicina, en posición 67, el cambio es preferiblemente fenilalanina a alanina, en posición 69, eí cambio es preferiblemente fenilaíañina a alanina, en posición 71, ei cambio es preferiblemente de arginina a alanina, en posición 73, el cambio es preferiblemente asparagina a lisina y en posición 78, el cambio es preferiblemente leucina a aianina. ün anticuerpo humanizado ejemplar de interés en la presente comprende residuos que determinan ia complementareidad de dominio pesado variable GYAFTNYLIS (SEQ ID NO: 41); VNXPGSGGSKYNEKFKG (SEQ LA NO: 42; o V NPGSGGSNYNEKFKG (SEQ ID NO: 43); y/o SGGFYFDY (SEQ ID NO: 44), que comprende opcionalmente modificaciones de aminoácidos ?e aquellos residuos de CDR, por ejemplo, en donde las modificaciones mantienen esencialmente o mejora la afinidad del anticuerpo. Por ejemplo, la variante de anticuerpo de interés puede tener aproximadamente 1 a aproximadamente 7 u aproximadamente 5 sustituciones de aminoácidos en las secuencias de CDR pesadas variables anteriores. Taíes variantes de anticuerpo pueden ser preparadas mediante maduración de afinidad, por ejemplo co o se describe posteriormente en ia presente. Preferiblemente, ios residuos son dos c ás de GYAFTNY1I? (SEO ID NO: 41) ; VNNPGSGGSKYKEKFKG (S?Q ID NO: 42) c VINPGSGGSNYNEKFKG (SEQ ID NO: 43) , más preferiblemente todos ios tres y/o SGGFYFDY (SEQ ID KO: 44) . El anticuerpo humanizado más preferido comprende la secuencia de aminoácidos de dominio pesado variabie en 3SQ ID KO: 4 o una con GYAFTKYLIE (SEO TD NO: 41); VTNPGSGGSNYNEKFKG (SEQ ID NO: 43); y SGGFYFDY (SEQ ID NO: 44). El anticuerpo humanizado puede comprender residuos que determinan la ccmpiementareidaa de dominio íigero variabie RASQSVLYSSNOKNYLA (SEQ ID NO: 36) o RASQGISSY1A (SEQ ID KO: 37); ASTRES (S?Q ID KO: 38) o YASSLQS (SEO ID NO: 39); y/o HQYLSSDT (S?Q ID NO: 40;, por ejemplo además de aquellos residuos de CDR de dominio pesado variable en. el párrafo precedente. Tales anticuerpos humanizados comprenden opcionalmente modificaciones de aminoácidos de los residuos de CDR anteriores, por ejemplo en donde las modificaciones mantienen esencialmente o mejoran ía afinidad dei anticuerpo. Por ejemplo, la variante de anticuerpo de interés puede tener de aproximadamente 1 e aproximadamente 7 o aproximadamente 5 sustituciones de aminoácidos en la secuencia de CDR ligeras variables anteriores. Tales variantes de anticuerpo pueden ser preparadas mediante maduración de afinidad (por ejemplo como se describe posteriormente en la presente. Preferiblemente, ios i ~-spb??i? nur.roesí son dos o más de RASQSVLYSSKQKNYLA (SEQ ID KO: 36) ; WASTRES (SEQ ID NO: 38); y/o HQYLSSDT (SEQ ID KO: 40), más preferiblemente todos ios tres. El anticuerpo humanizado mas preferido comprende la secuencia de aminoácidos de dominio ligero -variable en SEQ ID NO: 3. La presente solicitud también contempla anticuerpos madurados de afinidad que se enlazan a TGF-beta. Ei anticuerpo original puede ser an anticuerpo humane o un anticuerpo humanizado, por ejemplo une que comprende las secuencias ligeras y/o pesadas variables de S?Q ID NOS: 3 and 4, respectivamente (esto es, Versión 5) - El anticuerpo de afinidad-madurada se enlaza preferiblemente a TGF-beta con una afinidad superior a aquella del 2G7 murino o variante 5 (por ejemplo de aproximao.ar.ecte des a aproximadamente cuatro veces a aproximadamente 100 veces o aproximadamente 10CC veces afinidad mejorada, por ejemplo como se determina utilizando una ELISA de dominio TGF-beta-extracelular (?CD) ) . Varias formas deí anticuerpo humanizado o anticuerpo de afinidad-madurada son contempladas. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado o anticuerpo de afinidad-madurada puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como Fab, que es opcionalmente conjugado con uno o más agente (s) citotóxico (s) con ei fin de generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado o anticuerpo de afinidad-madurada puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo IgGl intacto.

Varias técnicas han sido desarrolladas para la producción de fragmentos de anticuerpo de anticuerpos humanizados. Tradicionalmente, estos fragmentos fueron derivados vía digestión proteolítica cié anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Xorime e et al., Journal of Biaehemical and Biophysical ííethods, 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science. 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ser ahora ser producidos directamente mediante células huésped recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser aislados de las bibliotecas de fago de anticuerpo discutidas anteriormente. Alternativamente, fragmentos de Fab' -SF. pueden ser recuperados directamente de E. coli y acoplados químicamente para formar fragmentos de F(ab?2 (Cárter et al., 3io/Technolcgy, 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro procedimiento, los fragmentos de F(ab' ~ pueden ser aislados directamente del cultivo de célula huésped recombinante. Otras técnicas para ia producción de fragmentos de anticuerpo serán evidentes para ei práctico experimentado. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento de Fv de una sola cadena (scFv) . Véase WO 1993/16185; patente estadounidense No. 5,571,894; y patente estadounidense No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo puede también ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo como se describe en la patente estadounidense No. 5,641,870, por ejemplo. Tales fragmentos de anticuerpo lineales oueden ser monoesoecíficos o biespecíficos.

Les anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para por lo menos dos epítopos diferentes. Anticuerpos biespecíficos ejemplares se pueden enlazar a dos epí opos diferentes de la proteína TGF-beta. Otros de tales anticuerpos se pueden combinar ccn un sitio de enlace de TGF-beta con sitio (s) de enlace para HER-2, EGFR, ErbB, ErbB3, y/o ErbBd Alternativamente, un brazo de anti-TGF-beta puede ser combinado con un brazo que se enlaza a una molécula de disparo sobre un leucocito tal como una molécula receptora de célula T (por ejemplo CD2 o CDS), c receptores Fc para IgG (FcyR; , tai como FcyBI (CD64), Fc?RII (CD32) y FcyRIII (CD16) para enfocar mecanismos de defensa celular a la célula que expresa TGF-beta. Anticuerpos biespecíficos pueden también ser usados para localizar agentes citotóxicos a células que expresan TGF-beta. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace de TGF-beta y un brazo que se enlaza al agente citotóxico (por ejemplo saporina, anti-interferón- , vinca alcaloide, cadena de ricino A, metotrexate o hapteno de isótopo radioactivo) . Anticuerpos biespecífices pueden ser preparados cono anticuerpos de plena longitud o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpo biespecíficos F(ab'Y. WO 1996/16673 describe un anticuerpo anti-TGF-beta/anti-FcyRTII biespecífico y la patente estadounidense No. 5,837,234 revela un anticuerpo anti-TGF-beta/anti-Fc?RI biespecífico. ün anticuerpo anti-TGF-beta/Fc biespecífico es mostrado en WO 1998/02463. La patente estadounidense No. 5,821,337 enseña un anticuerpo anti-TGF-beta/anti-CD3 biespecífico . Xétodos para la fabricación. de anticuerpos biespecíficos son conocidos eu el arte. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de plena longitud está basada en ia co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes Millstein et al., Neture, 305: 537-539 (1983) ) . Debido a la clasificación aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estes hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de ía molécula correcta, que se hace usualmente mediante etapas de cromatografía de afinidad, es más bien molesta y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares son revelados en WO 1993/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991) . De acuerdo con un procedimiento diferente, los dominios de anticuerpo-variable con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) son fusionados a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobuiina, que comprende por lo menos parte dei engozne, CH2, y regiones CHS. Es preferido tener la primera región constante ce cadena pesada El) que contiene ei sitio necesario para ace C? rradena ligera, presente en por lo menos una de las fusiones. ADN que codifican las funciones de cadena pesada de inmunoglobulina y si se desea, la cadena ligera de inmunogiobuíina son insertados a vectores de expresión separados y sor. co-transfectadas a un organismo huésped apropiado. Esto proporciona mayor flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de les tres fragmentes de polipéptido en modalidades cuando proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidc usadas en la construcción proporcionan les rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o tedas ías tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos des cadenas de polipéptido en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no son de significado particular. En una modalidad preferida de este procedimiento, los anticuerpos biespecíficos son compuestos de una cadena pesada de inmunogiobuiina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobuliua híbrida (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita ia separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena de inmunoglcbulina indeseable, ye que _a presencia de una caaena ligera de inmunoglobulina en solamente una mitad de la molécula biespecífica proporciona una manera de separación fácil. Este procedimiento es revelado en r?'0 1994/04690. Para detalles adicionales de la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh et al., Kethods in Enzymcícgy, 121:210 (1986) . De acuerde con otro procedimiento descrito en ia patente estadounidense No. 5,731,168, la ir.terface entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser diseñada para maximizar ei porcentaje de hetercdímeros que son recuperados del cultivo celular recombinante . La interface preferida comprende por lo menos una parte deí dominio CES de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interface de la primera molécula de anticuerpo son reemplazadas con cadenas laterales más grandes (por ejemplo tirosina o triptófano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) cadena (s) lateral (es) grande (s) son creadas sobre la interface la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales de aminoácido grandes con pequeñas (por ejemplo elanina o treonína) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento deí heterodimero con respecto a otros productos finales indeseables tales como homodímeros.

Anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulades o "heteroccujugadosd Por ece plo, uno ?e los anticuerpos en el heterocen ugado puede ser acoplado a avidina, el otro a biotina. Tales anticuerpos han sido propuestos por ejemplo para apuntar células de sistema inmune a células indeseables (patente estadounidense No. 4,676,980), y para el tratamiento de infección de ETV (WO 1991/00360, WC 1992/200373, y EP 03089; . Anticuerpos heteroccn ugados pueden ser elaborados utilizando cualesquier métodos de reticulación convenientes. Agentes de reticulación apropiados son bien conocidos en el arte y son revelados por ejemplo en la patente estadounidense No. 4,676,980, junto con un número de técnicas de reticulación. Técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados utilizando enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) desdicen un procedimiento en donde anticuerpos intactos son escindidos proteoiíticamente para generar fragmentos ce F(ab')2> Estes fragmentes sen reducidos en presencia del agente acornólejante de ditiol arsenieto de sodio para estabilizar los ditioies vecinales e impedir la formación -de disuíf ro intermelecuia . Los fragmentos de Fab' generados son luego convertidos a derivados de ticnitrobenzoato (TNB). Luego uno de ios derivados de Fab ! -TNB es recuperado al Fab-tiol mediante reducción con mercaptcetilamina y es mezclado con una cantidad equimoler del otro derivado Fab ! -TNB para formar el anticuerpo biespecífi ce. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden ser usados como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. El avance reciente he facilitado ia recuperación directa de fragmentos de Fab'-SK de E. coli, les cuales pueden ser acoplados químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífica plenamente humanizada F(ab') 2. Cada fragmento de Fab' fue segregado separadamente de E. coli y sometido a acoplamiento químico directo in vitrc para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue apto d.e eniazarse a células que sobreexoresan el receptor TGF-beta y células T humanas normales, también como disparar la actividad lítica de iinfocitos citotóxicc-s humanos contra objetivos de tumor de peche humanos . Varias técnicas para fabricación y aislamiento de fragmentos de anticuerpo biespecíficos directamente de cultivo celular recombinante han también sido descritas. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos han sido producidos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny et al., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fes y Jun fueron enlazados las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión aenética. Los homodímeros de anticuerpo fueron reducidos en la región de engozne para formar monómeros y luego re~cxiaados para formar los heterodímeros de anticuerpo. Este método puede también ser usado para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por fícilinger et eí . , Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para la fabricación de anticuerpo biespecíficos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VJ conectado a un dominio variable de cadena ligera (V-) mediante un eníazador que es demasiado corto para permitir ei apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Así, ios dominios de J y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios VL y V? complementarios de otro fragmento, formando mediante esto dos sitios de enlace de anticuerpos. Otra estrategia para la elaboración de fragmentos de anticuerpo biespecíficos mediante ei uso de dímeros de Fv de una soia cadena (sFv) también se han reportado. Véase Gruber et ai., J. Immunol., 152-5368 (1994). Anticuerpos con más de dos valencias son contemplados. Por ejemplo, anticuerpos triespecíficos pueden ser preparados. Tutt et al., J. Im unol., 174:60 (1991). Se pueden determinar los efectos inhibidores del crecimiento de anticuerpo al determinar, por ejemplo su capacidad para neutralizar, antagonizar c inhibir una actividad TGF-beta, por ejemplo impedir sustencialmente por ic menos uno del inhibidor de crecimiento indeseable, inmunosupresor, formación de estroma (los e_er.er.tos estromales en los que se incluyen células inflamatorias, células endoteliales y fibroblastos) o actividades que promueven el crecimiento independiente deí afianzamiento de un TGF-beta maduro, como es definido en la literatura. El anticuerpo es así apto de bloquear la actividad de todo el TGF-beta endógeno producido por tumores y células linfoides de suprescr (células T) . Una manera para medir tal neutralización es mediante inhibición de absorción de 3H-timidina de una línea celular de fibroblasto de pulmón de mink, por ejemplo Kv-33) , en donde a medida que ía concentración del anticuerpo es incrementada, le actividad del TGF-beta es disminuida establemente, ya sea linealmente o no linealmente. La línea celular de pulmón d.e mink. es muy sensible a les efectos inhibidores de crecimiento de TGF-beta y es un análisis relativamente fácil para efectuar. ?n general, el análisis es efectuado al incubar las células ccn una mezcla de un TGF-beta y el anticuerpo en un medio esencialmente mínimo que contiene glutamina 2 m>I y 5% de suero bovino fetal durante 18-24 horas a 37 °C en 5% de CO^, y luego pulsar ccn uCi de J -timidi a en 20 µi y cosecha después de cuatro horas a 37 °C. Preferiblemente, el anticuerpo será apto ae inhibir ia proliferación celular mediante TGF-beta a una extensión mayor que el anticuerpo monoclonal 2G7. Otra manera de determinar los efectos inhibidores de crecimiento dei anticuerpo es orobar si inhibe TGF-beta en un análisis de proliferación celular mesangial de ratón co o se resume en los ejemplos a continuación. Los anticuerpos en ia presente sen también útiles en un análisis de enlace de receptor o análisis de ra?ioreceptor de manera convencional, tal como ai incubar una mezcla de TGF-beta radio arcado (por ejemplo, rhTGF-betal radioycdado) y el anticuerpo con células que contienen el receptor TGF-beta (por ejemplo, células de fibroblasto de pulmón de mink como la línea celular Mvllu, que está disponible de ATCC o ATCC No. CCL-64) , y determinar sí el anticuerpo bloquea el enlace del TGF- arcado al receptor. Para seleccionar anticuerpos que inducen muerte celular, pérdida de integridad de membrana como se indica por, por ejemplo, PJ , azul de triptan o una absorción de 7AAD puede ser determinada en relación con el control. ?l análisis preferido es el análisis de absorción d.e ?I utilizando células BT474. De acuerdo con este análisis, células BT474 (las cuales pueden ser obtenidas de la American Type Culture Collection (Xanassas, VA) ) son cultivadas en medio de ?agle modificado por Dulbecco (D-MEM; :Eam' s F-12 (50:50) complementado con 10% de FBS inactivado térmicamente FBS (Hyclone) y 2 mM L-glutamina.

(A_sí, el análisis es efectuado en ausencia de complemento y células efectoras inmunes) . Las células BT474 son sembradas a una densidad de 3 :•; 10" hojas en cajas de 100 x 20 mm y se les permite anexarse durante toda la noche. Luego el medio es retirado y reemplazado ccn medio nuevo solo o medio que contiene 10 µg/mi de anticuerpo mcnccional apropiado. Las ceiulas son incubadas por un período de tiempo de tres días. Enseguida de cada tratamiento, las monocapas son lavadas con solución salina de ??' regulado de fosfato (PBS) y desprendidas mediante tripsinización. Luego las células son centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos a 40°C, y la pelotilla es resuspendida en 3 ml de solución reguladora del pH de Ca helada (10 M Hepes, pH 7.4, 140 mM NaCi, 2.5 M CaC12) y agregado en alícuotas en 12 x 75 tubos tapados con coladera de 35 mm (un mí/tubo, 3 tubos per grupo de tratamiento) para ia remoción de fragmentos o terrones de células. Luego los tubos reciben Pl (10 ug/ml) . Las mezclas pueden ser analizadas utilizando un citómetro de flujo FAC3CAK-y y FACSCOKVER™ CellQuest software (Becton Dickinson) . Aquellos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de muerte ceiular tal como se determina mediante absorción de Pl pueden ser seleccionados como anticuerpos que inducen muerte celular. Con el fin de seleccionar anticuerpos que inducen apóptosís, un análisis de enlace de anexina utilizando células 3T474 está disponible. Las células 3T474 son cultivadas y sembradas en cajas como se discute en ei párrafo precedente. Luego eí medio es retirado y reemplazado con medio nuevo solo o medio que contiene 10 ug/ml del anticuerpo monoclonal. Enseguida de un período de incubación de tres días, las monocapas son lavadas con PBS y desprendidas mediante tripsinizecióu. Luego les células son centrifugadas, resuspendidas en solución reguladora ael pK de enlace de Ca y agregadas en alícuotas a tubos como se discute anteriormente para ei análisis de muerte celular. Luego les tubos reciben anexina marcada {por ejemplo v-FTIC anexina) (lug/ml) . Las muestran pueden ser analizadas utilizando un citómetro de flujo FACSCAN"-5 y elementos de programación FACSCQNV?RT-' CellQuest (Becton Dickiuson) . Aquellos anticuerpos que inducen niveles estadísticamente significativos de enlace de anexina en relación con el control sen seleccionados como anticuerpos que inducen apóptcsis. Además del análisis de enlace de anexina, un análisis de teñido de A.DK utiíizando células 3T474 está disponible. Con el fin de efectuar este análisis, células 3T474 que han sido tratadas con el anticuerpo de interés co o se describe en los dos párrafos precedentes son incubadas con 9 µg/ml de sonda HOECHST 33342^** de fluorescencia durante 2 horas a 37 °C, luego analizadas en un citómetro de flujo EPICS ÉLITE™ (Couíter Corporation) utilizando los elementos de programación MODF1T LT3-1 [Ver Ley Software House; . Los anticuerpos que inducen un cambio en eí porcentaje de células apoptétícas que es dos veces o mayor (y preferiblemente tres veces o mayor) que las células sin tratar (hasta 100% de células aoootóticas) pueden ser seleccionadas como anticuerpos pro-apoptóticos utilizando este análisis . Para seleccionar anticuerpos que se enlazan a un epítcpo sobre un TGF-beta enlazado por un anticuerpo de interés, un análisis de bloqueo cruzado de rutina, tal como aquel descrito en Antibodies, A Laboratory Xanual, Ccld Spring Harbor Laboratory, Ed Harlc and David Lañe (1988), se puede efectuar. Alternativa o adicionaimente, el mapeo de epítopo puede ser efectuado mediante métodos conocidos en ei arte. La invención también es concerniente con inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citofóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina de molécula pequeña o una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fangal, planta o animal, en los que se incluyen fragmentos y/o variantes de los mismos) o un isótopo radioactivo (esto es, un radioconjugado) . A.gentes quimioterapéuticos útiles en generación de tales inmunoconjugados han sido descritos anteriormente. Conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como una caiicheamicina, una maitansina (patente estadounidense No. 5, 208, 020 i, un tricoteno y agente anticáncer CC1065 son también contemplados en la presente. En una modalidad preferida de la invención, el anticuerpo es conjugado a una o más moléculas de maitansina (por ejemplo aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula de anticuerpo) . La maitansina puede per ejemplo ser convertida a Xay-SS-Xe, la cual puede ser reducida a May-SH3 y hacerse reaccionar con anticuerpo modificado (Chari et al., Cáncer Research, 52: 127-131 (1992)) para generar un inmunoco ugado de maitansinoide-anticuerpo. Otro ir-munoconj ugado de interés comprende un anticuerpo anti-TGF-beta conjugado a una o más moléculas de calicheamicina. La familia de antibióticos -de calicheamicina es apta de producir rupturas de ADN de doble hebra a concentraciones sub-picomoíares . Análogos estructurales de calicheam.icina que pueden ser usados incluyen, pero no están limitados ?l1, a2~, ac, N-acetil-?;-, PSAG y T (Einman et al., Cáncer Research, 53: 3336-3342 (1993) y Lode et al., Cáncer Research, 58: 2925-2928 (1998)). Véase, también patentes estadounidenses Nos. 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586; y 5, "73, 001, incorporadas expresamente en la presente por referencia . Toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas que pueden ser usados incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin enlazar de toxina de difteria, cadena de exotcxina A, (de Pseudomonas aexuginosa) , cadena de ricino A, cadena de abrina A, cadena de odecina A, alfa-sarcina, proteínas Aleurí tes for?lí, proteínas de diantina, proteínas Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcína, cretina, inhibidor de sapacnaria officir.alis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecencs . Véase, por ejemplo VIO 1993/21232 publicado el 28 de octubre de 1993. Aa presente invención contempla además un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolitica (per ejemplo, :na ribonncleasa o una endonuclease de ADN, tal como una desoxiribor.ucleasa; ADMasa) . Una variedad ce isótopos radioactivos están disponibles para la producción de anticuerpos anti-TGF-beta radiocenjugadcs . Ejemplos incluyen d3", I"Y IÍ¿D, Ys0, Re1"6, Re"Ba, Sm1"3, 3í"2, P3¿ e isótopos radioactivos de Lu. Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden ser elaborados utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionaies tales cerno propionato de N-succínimidil-3- (2-piridiíditiol) (SPD?; , ciclohexan-1-carboxilato de succinidimil-4- (N-maleimidcmetiic) , iminotiolanc (1T; , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como adipimidato de dimetilo HCl) , esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilc) , aldehidos (tales como giutareldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobezoil) hexandiamina) , derivados de bis-tíiazonio (tales como bis- (p-diazonioumbezoii) -etilendiamina) , iisocianetos (tales como 2, 6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bís-activo (tales come 1, 5-difiuoro-2, 4-d.initrobenceno) . Por j, una ricin in unotoxina puede ser preparada como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobecii-3-metildietilen triaminpentaecetico (MX-DTPAJ marcado con carbono 14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionucieó ido al anticuerpo. Véase, O 1994/11026. El enlazadcr puede ser un "enlazacor escindióle" que facilita la liberación dei fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, un eniazador ácido-lábil, enlazador peotidasa-sensible, enlazador de dimetilc o enlazador que contiene disuifuro (Chari et al., Cáncer Research, 52: 127-131 (1992)) pueden ser usados. Alternativamente, una proteina de fusión que ccmprende el anticuerpo anti-TGF-beta y agente cite-tóxico puede ser elaborado, por ejemplo mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidcs. En todavía otra modalidad, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavídina) para utilización en ei pre-apuntamiento de tumor en donde ei conjugado de anticuerpo-receptor es administrado al paciente, seguido por la remoción dei conjugado sin enlazar de la circulación utilizando un agente de limpieza y luego administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que es conjugado a un a citotóxíco (por ejemplo un radionucleótido) . Los anticuerpos de la presente invención pueden también ser usados en AD?PT al conjugar el anticuerpo a una enzima que activa ei proférmaco que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase SO 1981/01145) a un fármaco anti-cáncer activo. Véase, por ejemplo WO 1983/07378 y patente estadounidense No. 4,975,278. El componente de enzima del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco, de tal manera para convertirlo a su forma citotóxica más activa. Enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no están limitadas a, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato a fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfato a fármacos libres; citocina desa inasa útil para convertir 5- iuorocitocina no tóxica al fármaco anticáncer, 5-fluorouracilo; prcteasas, tales como serratia protease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y 1) , que son útiles para convertir los profármacos que contienen péptido a los fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes D-aminoácido; enzimas que escinden carbohidratos tales co o ß-galactosidasa y neura inid.asa útiles para convertir les pro-fármacos glicosilados a fármacos libres; ß-lactamasa útil para convertir fármacos derivados con ß-lactamas a fármacos libres y penicilin amidasas, tales como penicilin V amidasa o peniciin G amidas útiles para convertir fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilaeetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en ei arte come "abzimas", pueden ser usados para convertir los profármacos de le invención a fármacos activos libres (véase, por ejemplo Kassey, Nature, 328:457-458 (1987)). Conjugados de anticuerpo-abzi a pueden ser preparados como se describe en ia presente para administración de la abzi e a na población de células de tumor. Las enzimas útiles para la invención pueden ser enlazada covalentemente a los anticuerpos a ti-TGF-beta mediante técnicas bien conocidas en el arte, tal como el uso de reactivos de reticuiación heterobifunciopaies discutidos anteriormente. Alternativamente, proteínas de fusión que comprenden por ic menos una región de antígeno-enlace de un anticuerpo de la invención enlazada a por lo menos una pcrción funcionalmente activa de una enzima apropiada pueden ser construidas utilizando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en ei arte (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984)). Otras modificaciones del anticuerpo son contemplacos en la presente. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser enlazado a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo polietilenglicol, polipropiíenglicol, pclioxialquilenos, o copolímeros de polietiienglicol y polipropiienglicoi . Ei anticuerpo puede también ser atrapado en microcápsulas preparadas por ejemplo mediante técnicos de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, cápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli (metil metacrilato) , respectivamente) , en sistemas de administración de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsicnes, nauopartícuíes y nenocápsulas) o en macroexulsior.es. Tales técnicas son reveladas en Remington's Pharmaceutical Sciences, ídth edición, Oslo, A., Ed., (1980). Los anticuerpos anti-TGF-beta revelados en la presente pueden también ser formulados como inmu cliposomas . Liposomas que contienen ei anticuerpo son preparados mediante métodos conocidos en el arte, tel como se describe en Epstein et al., Prcc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Aca?. Sci. USA, 77:4030 (1980); patentes estadounidenses Nos. 4,485,045 y 4,544,545; y WO 1997/38731 publicado eí 23 de octubre de 1997. Les íiposo as con tiempos de circulación mejorado son revelados en la patente estadounidense Mo. 5,013,556. Liposomas particularmente útiles pueden ser generados mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípido que comprende fesfatidilcolina, colesterol y fosfatidiíetanolamina PEG-tíerivada (P?G-PE) . Los liposomas son extruidos a través ce fiítros de tamaño ce poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Fragmentes de Feb' del anticuerpo de la presente invención pueden ser coducados a los lioesomas cerno se describe en Martin et al., Z . Biol. Cnem. , 257: 286-288 (1982; vía una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente quimioterapéutico está opcionalmente contenido dentro del liposoma. Véase Gabizon et al., Z . National Cáncer lus . , 81(19) : 1484 (1989) .

III . Vectores , Células Huésped y Métodos Recombinan es La invención también proporciona el ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo anti-TGF-beta humanizado, vectores y células huésped que comprenden el ácido nucleico y técnicas recombinantes pare la producción dei anticuerpo. Pare la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica es aislado e insertado a un vector replicable para la clonación adicional (amplificación del ADK) o para expresión. Ei ADN que codifica el anticuerpo monoclonal es fácilmente aislado secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleótido que son aptas de enlazarse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras dei anticuerpo). Xuc os vectores están disponibles. Los componentes d.e vector incluyen en general, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de repiicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor y una secuencia de terminación de transcripción. (i) Componente de secuencia de señal El anticuerpo anti-TGF-beta ce esta invención puede ser producido recombinantemente no sclo de manera directa, sino también como un poiipéptído de fusión con un polipéptido heterólogo, el cual es preferiblemente una secuencia de señal u otro polipéptidc que tiene un sitio de escisión específico en el término N de la proteína madura o pclipéptido. Las secuencias de señal heteróloga seleccionada es preferiblemente una que es reconocida y procesada (esto es, escindida mediante una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para células huésped procarióticas que no reconocen y procesan la secuencia de señal de anticuerpo anti-TGF-beta natural, la secuencia de señales sustituida por una secuencia de señal prccariontica seleccionada, por ejemplo del grupo que la fosfatasa alcalina, penicilinasa, l??, o líderes de enterotoxina II estables térmicamente. Para ia secreción de levadura, la secuencia de señal natural puede ser sustituida por ejemplo por el líder de invertasa de levadura, un líder a-factor, (en los que se incluyen líderes de Saccharomyces y Kuyveroi yces de factor a) , líder de ácido-fosfatasa, el líder de C. aXoícans glucoamiíasa o la señal descrita en WO 1990/13646. En la expresión de célula mamífera, las secuencias de señal mamíferas también como líderes secretorios virales, por ejemplo, la señal de gD de herpes simolex están disponibles. til ADN para tal región de precursor es ligado en cuadro de lectura a ADN que codifica el anticuerpo anti-TGF-oeta. (ii) Origen de componente de replicación Tanto les vectores de expresión como de clonación que contienen una secuencia de áciao nucleico que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En general, en los vectores de clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosomal huésped e incluye orígenes de repiicación o secuencias autónomamente replicantes. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levadura y virus. El origen de reputación del plásmido pBR322 es apropiado para ia mayoría de las bacterias gram-negativas, eí origen de piásmido 2µ es apropiado para orígenes de levadura y varios orígenes virales (SV40, poíicma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células mamíferas. En general, el origen dei componente de replicacion no es necesario para vectores de expresión mamíferos (ei origen SV4C puede ser usado comúnmente solo debido a que contiene el prometer anterior) . (iii.) Componente de gen de selección Les vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado un marcador seleccionable. Genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo ampicílina, neomicina, metotrexate o tetraciclina, (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c) proporcionan nutrientes críticos no disponibles de medios complejos, per ejemplo el gen que codifica D-alanina racemesa para Bacilli . Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son transformadas exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia ai fármaco y así sobreviven al régimen de selección. Ejemplos de tal selección dominante utilizan los fármacos neomiciua, ácido micofenólico e higromicina. Otro ejemplo de marcadores seleccionables apropiados para células mamíferas son aquellos que permiten la identificación de céluias competentes para tomar ei ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-TGF-beta, tal como DHFR, timidina cinasa, metalotioneina-I y -II, preferiblemente genes de metalotioneina ce primate, adenosin deaminasa, ornitin decarbcxilasa, etc. Per ejemplo, células transformadas con el gen de selección DHFR, son primero identificadas al cultivar todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexate (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se usa DHFR tipo silvestre es de ovario de hámster chine (CHO) deficiente en actividad DHFR. Alternativamente, células huésped. (particularmente huésped tipo silvestre que contiene DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican anticuerpo anti-TGF-beta, proteína de DHFR tipo silvestre y otro marcador seleccionable tal como a inoglicoside 3' -fosfotransferasa (APH) pueden ser seleccionados mediante cultivo celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico de aminoglicosídico, por ejemplo canamicina, neomicina o G418. Véase patente estadounidense No. 4,965,199. Un gen de selección apropiado para uso en levadura es el gen trpl presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchco b et ai., Nature, 282:39 (1979)). El gen trpl proporcicna un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece ?e la capacidad para crecer en triptófano, por ejemplo ATCC No. 44Q76 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85: 12 (1977). La presencia de la lesión de trpi en el genoma de célula huésped de levadura proporciona luego un ambiente efectivo para detectar la transformación mediante cultivo en ausencia de triptófano. Similarmente, cepas de levadura Leu2-deficientes (ATCC 20,622 o 38,626) son complementadas mediante plásmidos conocidos que llevar, el gen Leu2.

Además, vectores derivados del plásmido circular de 1.6 µm pKDl pueden ser usados pera transformación de levaduras Kluyvero ryces . Alternativame te, un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimocina de becerro recombinante fue reportado por K. íactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). Vectores de expresión de multicopía estables para la secreción de albúmina de suero humano recombinante madure mediante cepas industriales de Kluyveroiayces también se han revelado. Fleer et al., Bio/Technology, 9: 968-975 (1991;. (iv) Componente de promotor Los vectores de expresión y clonación contienen usualmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y es enlazado operativamente al ácido nucleico que codifica el anticuerpo anti-TGF-beta. Promotores apropiados para uso con huésped procapóticos incluyen el promotor phoA, ß-lactamasa y sistemas de promotor de lactosa, fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales come el promotor tac. Sin embargo, otros promotores bacterianos conocidos sen apropiados. Promotores para uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Daígarpo (S.D.) er.íazada operativamente al ADN aue codifica el anticuerpo anti-TGF-beta.

Las secuencias de prcmotor son conocidas para ios eucaricntes. Virtualmente todos los genes eucarionticos tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sitio en donde la transcripción es iniciada. Otra secuencia en controí C a 80 bases corriente arriba del inicio de transcripción de muchos genes es una región CNCAAT (SSQ ID NO: 7) en tanto que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de ios genes eucarionticos se encuentra una secuencia AATAA.A (SEQ ID NO: 48) que puede ser la señal para adición de la cola poli A ai extremo 3' de ía secuencia de codificación. Todas estas secuencias son insertadas apropiadamente a vectores de expresión eucarionticos. Ejemplos de secuencias de promoción apropiadas para uso con huéspeaes de levadura incluyen promotores para 3' fcsfogiicerato cinasa u otras enzimas giicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexocinasa, piruvato decarboxiiasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfato irterasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, osfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones de promoter para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocrorco C, fosfatasa acida, enzimas degradantes asociadas con metabolismo de nitrógeno, metalotieneipa, gliceraldehído-3-fosfato deshidroger.asa y enzimas responsables por la utilización de maltosa y galactosa. Vectores y promotores aprepiadcs para uso en expresión de levadura son descritos adicionalmente en EP 73,65™. Mejoradores de levadura también son usados venta osamente come promotores de levadura. La transcripción de anticuerpo anti-TGF-beta de vectores en células huésped mamíferas es controlada por ejemplo mediante promotores obtenidos de los genomas de virus tales como polioma virus, virus de pustulación avícola, adenovirus (tal cerno adepovirus 2) , virus de papiloma bovino, virus de sarcoma aviar, citomegeicvirus, un retrovirus, virus de hepatitis 3 y más preferiblemente virus simio 40 (SV40) , promotores mamíferos heteróiogos, por ejemplo ei promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina y promotores de choque térmico, a condición que taies promotores sean compatibles con los sistemas de célula huésped. Los promotores prematuros y tardíos del virus SV40 son obtenidos convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene ei origen de replicación virai SV40. El promotor prematuro inmediato del citomegalovirus humano es obtenido convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para ia expresión de ADN en huéspedes mamíferos utilizando eí virus de papiloma bovino como un vector es revelado en ia patente estadounidense No. 4,419,446. Una modificación de este sistema es descrita en la patente estadounidense Ko. 4,601,978. Véase también Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982) con respecto a la expresión de cADN de ß-interferón humano en células de ratón baje el control de un promotor de timidína cinasa de virus de herpes simplex. Alternativamente, a repetición terminal larga del virus de sarcoma de Rous puede ser usado como el promotor. (v) Componente de elemento mejorador La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo anti-TGF-beta de esta invención mediante eucariontes superiores es frecuentemente incrementada al insertar una secuencia mej oradora ai vector. Xuchas secuencias de mejorador son ahora conocidas de genes mamíferos (globina, elastasa, albúmina, a-fetoprcteína e insulina) . Comúnmente, sin embargo, se usará un mejorador de un virus de célula eucariontica . Ejemplos incluyen el mejorador SV40 en el lado posterior del origen de replicaciór. (bp 100-270), el mejorador de promotor prematuro de citom.egaiovirus, ei mejorador de polioma en el lado tardío del gen de replicación y mejoradores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982) en cuanto a elementos mejoradores para la actividad de promotores eucarionticos. El mejorador puede ser cortado al vector en una posición 5' o 3' a la secuencia de codificación del anticuerpo anti-TGF-beta, pero está preferiblemente localizado en ?n sitio 5' del promotor. (vi) Componente de terminación de transcripción Los vec cores de expresión usados en céiuias huésped encarícnticas (per ejemplo, levadura, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrá secuencias necesarias pare la terminación de transcripción y para estabilizar el mARN. Tales secuencias están disponibles comúnmente dei extremo 5' , ocasionalmente extremo 3 Y de regiones sin traducir de ADN o cADN eucarienticas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadeuilados en la porción sin traducir de mARN que codifica el anticuerpo anti-TGF-beta. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadeniiacicn de hormona de crecimiento bovino. Véase WO 1994/11026 y el vector de expresión revelado en la misma. (vii) Selección y transformación de células huésped Células huésped apropiadas para clonar o expresar ei ADN en los vectores en ia presente son las células de procariontes, levadura o células eucarionticas superiores descritas anteriormente. Procariontes apropiados para esta propósito incluyen eubacterias, tales como organismo gram-negativos o gram-positivos, por ejemplo Escherichia, por ejemplo, ?. coli, ?ntercbacter, ?r inia, Klebsiella, Prcteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serretia, por ejemplo, Serratia marcescens, y Shigeila, también como Bacilli tales como B. subtilis y B. íicheniformis {por ejemplo, B. licheniformis 41? revelado en DD 266,710 publicado el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales cerno ?. aeruginosa, y Streptcmyces . Ün huésped ?e clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque otras cepas tales como E. coli 3, E. coii X1776 (ATCC 31,537), y 3. coli W3110 (ATCC 27,325) son apropiadas. Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitantes . Además de prccariontes, microbios eucarionticos tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión apropiados para vectores que codifican anticuerpo anti-TGF-beta. Saccharomyces cerevisiae, c levadura de panadero común, es la más comúnmente usada entre los microorganismos huésped eucarionticos inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies y cepas están disponibles comúnmente y útiles en ia presente, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes tales como Kluyveromyces, por ejemplo, K. lactis, K. fragiiis (ATCC 12,424), X. buígaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24, 178 Y K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), . thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (E? 402,226); Pichia pastoris (E? 183,070); Candida; Trichoderma reesia (E? 244,234); Neurcspora crassa; Schwanniomyces tales co o Schwapniomyces cccidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y huéspedes Aspergiilus tales como A. niduians y A. niger. Células huésped apropiadas para ia expresión de anticuerpo anti-TGF-beta glicesilaao son derivadas de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Numerosas cepas y variantes bacuíovirales y células huésped de insectos permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Acedes aibopictus (mosquito) , Drosophiia melanogaster (mosca mediterránea) , y Bombyx morí han sido identificados. Una variedad de cepas virales para transíección están disponibles públicamente, por ejemplo la variante L-l de Autographa caiifornica N?V y la cepa Bm-5 de Bombyx morí NPV, y tales virus pueden ser usados como el virus en ía presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para transfección de células Spodoptera frugiperda. Cultivos de células de planta de algodón, maix, patata, soya, petunia, tomate y tabaco pueden también ser utilizados como huéspedes. Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrados y la propagación de células vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas de células huésped mamíferas útiles ccn línea CV1 ce riñen ce chango transformada por SVO (COS-7, ATCC CFL 1651) ; línea de riñon embriónico humano (células 293 c 293 subclcnadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graha et ai., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñon de hámster bebé {3HK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino / DHFR (CEO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980), en los que se incluyen DG44 (Uriaub et al., So . Celí and Xol. Gen., 12: 555-566 (1986)) y líneas de células DP12); células de Sertcli de ratón (TX4, Mather, Bioi. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñon de chano (CVl ATCC CCL 7C) ; células de riñon de chango verde africano JV?RO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon canino ÍMDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata de búfalo Í'BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065) ; tumor mamario de ratón ( MT 060562, ATCC CCL51 ); células TRl (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humana (Hep GT) . Las células huésped son transformadas con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de anticuerpo anti-TGF-beta y cultivadas en medios nutrientes convencionales modificaciones co o sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. (vxii) Cultivo de las células huésped Las células huésped usadas para producir ei anticuerpo anti-TGF-beta de esta invención pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Medios disponibles comerciaímence teles como Ha s FIO (Sigma), medio esencial mínimo ( (MEMORIA) , Sigma, RPMI-1640 (Sigma) , y medio de Eagie modificado por Dulbecco ( (DMEM; , Sigma) son apropiados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de las medios descritos por ejemplo en Ha et al., Xeth. ?nz . 58:44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem., 102:255 (1980); Patentes estadounidenses Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; o 5,122,469; WO 1990/03430; WO 1.987/00195; o patente estadounidense Re. 30,985 pueden ser usados como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios pueden ser complementados como sea necesario hormonas y/u otros factores e crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico) , sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato) , soluciones reguiadoras dei olí (tales como HEPES) , nucleótidos (taies como adenosina y timidina) , antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCINra) , elementos traza (definidos cerno componentes inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en ei intervalo micro clar) v glucosa o una fuente de enersía equivalente.

Cualquiera de otros complementos necesarios pueden también ser incluidos a concentraciones apropiadas que serían conocidas para aquellos experimentados en el arte. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y los semejantes, son aquellos previamente usados con la célula huésped, seleccionada para expresión y serán evidentes para ei experimentado en la técnica. (ix) Purificación de un anticuerpo anti-TGF-beta Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede ser producido intraceluíarmente o en el espacio peripíésmico o secretado directamente al medio. Si el anticuerpo es producido intracelular epte, como una primera etapa, el desecho ce partículas, ya sea células huésped o fragmentos lisados, es retirado, por ejemplo mediante centrifugación c ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology. 10: 163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que son secretados ai espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular es decelada en presencia de acetato de sodio (pH 3.5), EDTA y fenilmetiisulfopilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. Los desechos celulares pueden ser separados mediante centrifugación. En donde ei cuerpo es secretado al medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión son en general concentrados primeros utilizando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo una unidad de ultrafiltración AMICO.V- o XliLIPGRE PF11JC0N™. Un inhibidor de proteasa tal como fluoruro de feuilmetiisulfonilo (PMSF) puede ser incluido en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir ía proteólisis y antibióticos pueden ser incluidos para impedir ei crecimiento de contaminantes adventicios. La composición ae anticuerpo preparada ce las células puede ser purificada usando por ejemplo cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis y cromatografía de afinidad, cromatografía de afinidad es la técnica de purificación preferida. La conveniencia de proteína A como ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquier dominio Fc de inmunogiobuiina que está presente en el anticuerpo. Proteína A puede ser usada para purificar anticuerpos que están basados er. cadenas pesadas ?l, ?2, o ?4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62: 1-13 (1983)). La proteína G es recomendada para todos los isotipos de ratón y para ?3 humano (G?ss et al., ?MBO J., 5:1567-1575 (1986)). La matriz a la cual el ligando de afinidad es anexado es más frecuentemente agarosa, pero ctras matrices son disponíbies. Matrices estables mecánicamente tales como vidrio de poro controlado o poli (esti rendí inil) enceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden obtener con agaresa. En donde el anticuerpo comprende un dominio CH3, la Baker, Phíllipsburg, NJ) es útil para ia purificación. Otras técnicas para purificación de proteína taies como fraccionamiento er. una columna de intercambie iónico, precipitación de etanol, HPLC ce fase inversa, cromatografía sobre sílice, cromatografía sobre SEPHAROSEt**- heparina, cromatografía sobre una resina de intercambio aniónico o intercambio catiónico (tal como una columna de ácido peliaspártico) , cro atcenfoque, SDS-PAGE y precipitación de sulfato de amonio también están disponibles dependiendo del anticuerpo a ser recuperado, Enseguida de cualesquier etapa (s) de purificación prelimina (es) la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y contaminantes puede ser sometida a cromatografía ?e interacción hitírefóbica de bajo pE utilizando una solución reguladora del pH de elución a un pH de entre aproximadamente 2.5-4.5, efectuada preferiblemente a bajas concentraciones de sal (per ejemplo, de aproximadamente 0-0.25 M de sal).

V. Formulaciones Farmacéuticas Formulaciones terapéuticas de los anticuerpos usados de acuerdo con ía presente invención son preparadas para almacenamiento al mezclar un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores aceptables farmacéuticamente opcionales (Remington' s Pharmaceuticai Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos a les receptores a las aosificacicnes y concentradas usadas e incluyen soluciones reguladoras del pH tales como fosfate, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidentes en los que se incluyen ácido ascórbico y etionir.e; conservadores (tales come cloruro de octadecilbenciidimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonic, fenol, alcohol bntílico o bencílico; alquilparabenes tales como metil e propil paraben; catecoi, resorcincl; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrelidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidína, arginina c lísina; monosacáridos, disacárides y otros carbohidratos en los que se incluyen glucosa, ma osa o dextrinas, agentes queiantes tales como ?DTA; azúcares tales como sacarosa, mar-icol, trihalosa o sorbitol; contraiones formadores de sal tales sodio; complejos de metal (por ejemplo complejos de Zn-proteí a) ; y/o surfactanfes RC iónicos tales como T ?EN™, PLURONICS""- o polietilenglicoi (P?G) . Formulaciones de anti-TGF-beta licfilizaeas preferidas son descritas en WO 1997/04801, incorporado expresamente en la presente por referencia.

La formulación en la presente puede también contener más de un compuesto activo come sea necesario ara ia indicación particular que es tratada, preferiblemente aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar adicionalmente anticuerpos que se enlazan a HER-2, EGFR, TGF-beta (por ejemplo, un anticuerpo que se enlaza a un epítopo diferente obre TGF-beta), ErbB3, ErbB4, o antígenos de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en la formulación. Alternativa o adicionalmente, la composición puede comprender además un agente quimiocerapéctico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor de crecimiento, agente an i-hcrmonal, fármaco apuntado a TGF-beta, agente anti-angiogénico y/o cardioprotector. Tales moléculas están presentes apropiadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito propuesto. Los ingredientes activos pueden también estar atrapados en microcápsulas preparadas por ejemplo mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo cápsulas de hidroximetilceluiosa o gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacriiato) , respectivamente, en sistemas de administración ce fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nauocápsuias) o en microemulsiones. Tales técnicas son reveladas en Remington's Pharmaceuticai Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980). Preparaciones de liberación sostenida pueden ser preparadas. Ejemplos apropiados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofcbicos sólidos que contienen el anticuerpo, tales matrices están en forma de artículos formados, por ejemplo películas o microcápsuies . Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrcgeles (por ejemplo, poli (2-hidrcxietil-metacrilato; o poli (alcohol viníiico) ) , poliíacturos (patente estadounidense No. 3,773,919), ccpolimeros de ácido L-glutámico y ? etií-L-glutemato, etileno-acetato de vinilo no degradadle, copolímeros de ácido láctico-ácido glicélíco degradables tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido giicólico y acetato de leuproluro) y ácido poli-D- (-) -3-nidroxibutírico. Las formulacicr.es a ser usadas para administración in vivo deben ser estériles. Esto se lleva a cabo fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estériles.

V. Tratamiento con los anticuerpos antx-TGF-beta Se contempla que, de acuerdo con la presente invención, los anticuerpos anti-TGF-beta pueden ser usados para tratar varias enfermedades o alteraciones. Condiciones o alteraciones ejemplares incluyen tumores benignos o malignos; leucemias y malignidades linfoides y otros desordenes o alteraciones tales cerno alteraciones neuronaies, guales, astrociteles, hipotaíárnicas, glandulares, macrefagales, epiteliales, estrcmales, blastocoelícas, inflamatorias, angiogénicas e inmunológicas. En general, la alteración a ser tratada es una alteración TGF-beta, más preferiblemente cáncer. Ejemplos de cáncer a ser tratado en le presente incluyen pero no están limitados a carcinoma, blastoma y sarcoma y ciertas leucemias y malignidades li foides . Ejemplos más particulares de tales cánceres incluyen cáncer de célula escamosa (por ejemplo, cáncer de célula escamosa epitelial) , cáncer de pulmón en los que se incluyen cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcir.oma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o del estómago en los que se incluyen cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, gliobiastc a, cáncer cervical, cáncer ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer tiroide, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma per.il, también como cáncer de cabeza v cuello.

En una modalidad, el cáncer será uno que exprese (o puede sobreexpresar) un receptor TGF-beta. Ejemplos -de cánceres que pueden expresar/sobreexpresar receptor (es) TGF-beta incluyen cáncer de célula escamosa (por ejemplo, cáncer de célula escamosa epitelial), cáncer de pulmón en los que se incluyen cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula r.o pequeña, adenocarcinoma del pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico c del estómago eu los que se incluyen cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer ce pecho, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñon o renal, cáncer cíe próstata, cáncer vulva!, cáncer tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma penil, también como cáncer de cabeza y cuello. Sin embargo, el cáncer a ser tratado por el anticuerpo en la presente puede ser cualquier cáncer, no simplemente aquellos que expresan o sobreexpresan un receptor TGF-beta. Si el cáncer a ser tratado en la presente puede ser uno caracterizado por ia activación excesiva de un receptor 'TGF-beta, tai activación excesiva puede ser atribuible a la sobreexpresión o producción incrementada del receptor TGF-beta. En una modalidad de ia invención, un análisis de diagnóstico o prognostico será efectuado para determinar si el cáncer del paciente está caracterj zade por le activación excesiva de un receptor TGF-beta. Por ejemplo, la amplificación del gen TGF-beta y/o sobreexpresiór. ce un receptor TGF-beta en el cáncer pueden ser determinados. Varios análisis pera determinar tal a plificació /sobreexpresión están disponibles en el arte, por ejemplo iumunohistoquím?ca (TEC) ; absorción de southern o técnicas de PCR. Ademas, la sobreexpresión o amplificación del receptor TGF-beta puede ser evaluada utilizando un análisis de diagnóstico in vivo, por ejemplo mediante administración de una molécula (tal como un anticuerpo) que se enlaza a la molécula a ser detectada y es marcada con una etiqueta detectable (por ejemplo un isótopo radioectivo) y exploración externamente del paciente para la localización de la etiqueta. Análisis útiles para determinar si el anticuerpo humanizado se encuentra que mejora ia actividad de reducción de tumor de TNF-alfa tanto en pruebas in vivo como in vitro son descritos posteriormente en la presente: A. Procedimiento de Análisis Citotóxico Eí sistema de análisis 1-929 es un análisis in vitro conveniente que permite a medición rápida de la actividad del anticuerpo en la presente opcionalmente en conjunción con un regulador apropiado de función inmune. Su grade de correlación con el análisis de necrosis de tumor in vivo de Carswell et al., Proc. Nati. Acad.. Sci. USA, 72:3666 (1975) está eu la presente desconocido. Sin embargo, ya que utiliza células de tumor murino específicamente, se espera que ía correlación sea alta. Los factores de necrosis de tumor de proteínas (TNF-a) y línfotexina (TNF-beta) dan actividad en este anáíisis. El análisis es similar eri concepto a aquel revelado en la patente estadounidense No. 4,457,916, que utilizó células L-M murinas y teñido de azul ?e metiieno. Sin embargo, se ha demostrado que eí análisis 1-929 se correlaciona (para TNF-a derivado de células HL-60) ccn ia citotoxicidad de línea de célula de tumor huma o . En el sistema de análisis L-929 en la presente, células L-929 so preparadas durante toda la noche como cnocapas en placas de icrotítulc. Las mejores muestras son diluidas dos veces otra vez de la placa, irradiadas con UV y luego agregadas sobre las monocapas de célula preparadas. Los medios de cultivo en las cavidades son luego traídos a 1 µg/mi de actinomicina D. Se permite que las placas se incuben 18 horas a 37 °C y las placas son puntuadas visualmente bajo el micrcscopio. Se da a cada cavidad una marca de 25, 50, 75, o 100% que significa la extensión de muerte de célula en la cavidad. Una unidad de actividad de T?F es definida como el recíproco de la dilución a ia cual se presenta el 50% de exterminio.

B. Análisis in vivo Las preparaciones pueden también ser probadas en cuanto a actividad utilizando la capacidad del anticuerpo anti-TGF-beta para exterminar o reprimir el crecimiento de tumores para proteger el animal que lleva el tumor de mortandad. Ratones 3alb/c son inyectados subcutáneamente ccn varios tipos ?e células de tumor para crear un. tumor localizado. Las líneas de células de tumor incluyen fibrosarcoma de ratón MetnA obtenido como una suspensión celular de fluido de ascites y MCF-7, un carcinoma de pecho humano que es administrado como un trozo de 1 mm3 de células. Para el análisis, ratones Balb/c hembras (19-22 g) son inyectados subcutáneamente por una aguja de calibre 26 ya sea con suspensión que contiene 5 x 10a células de fibrosarcoma en 0.1 ml de medio o con los trozos de ".4CF-7. (La suspensión de fibrosarcoma es preparada de fluido de ascites de 8 días mediante ccnteo de células y dilución con medie libre de suero. Después de 9-10 días, el tumor se vuelve palpable, 1 µg/ratón de TNF-a es inyectado intravenosamente y la administración de TNF-a es repetida, si se desea, en les díes subsecuentes. Los resultados sen determinados al medir ei volumen del tumor y por la proporción de sobrevivencia. La prueba es repetida utilizando inyecciones secuenciales separadas de un 1 ug/ratón de TNF-a y 10 mg/kg por ratón de anticuerpo 4A11. El anticuerpo de prueba es comparado contra estos agentes en cuanto a actividad. En donde ei cáncer a ser tratado es cáncer independiente de hormona, la expresión de le hormona (por ejemplo a drcgeno) y/o su receptor cognato en el tumor puede ser determinada utilizando cualquiera de los varios análisis disponibles, por ejemplo como se describe anteriormente. Alternativamente o adicionalmente, el paciente puede ser diagnosticado al tener cáncer independiente de hormona en que el paciente ya no responde a la terapie de antiandrógeno. En ciertas modalidades, un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo anti-TGF-beta conjugado con un agente citotóxicc es administrado al paciente. Preferiblemente, eí inmunoconjugado y/o prcteína TGF-beta al cual es enlazado es/son internalizados por la célula, dando como resultado una eficacia terapéutica incrementada dei inmuncconjugado en el exterminio de ia célula de cáncer a la cual se enlaza. En una modalidad preferida, el agente citotóxico apunta o interfiere con el ácido nucleico en la célula de cáncer. Ejemplos de tales agentes citotóxicos incluyen maitansinoides, calicheamicinas, ribonucleasas y endo ucleesas de ADN. Los anticuerpos anti-TGF-beta o inmunoconjugados son administrados a un paciente humano de acuerdo con métodos conocidos, taies como administración intravenosa, por ejemplo como un bolo o por infusión continua por un período de tiempo, mediante rutas intramuscular, intraperiteneai, intracerebroespina_ , subcutánea, intra-articuíar, intrasincviel, intratecal, eral, tópica o inhalación. La administración intravenosa, intraperitoneal o subcutánea del anticuerpo es preferida, les rutas subcutáneas o intraperitoneal son particularmente preferidas. Un programa de administración preferido es aproximadamente 2-3 -veces por semana, dependiendo del mamífero particular que es tratado, el tipo de anticuerpo y otros factores bien conocidos para ei practicante. Sin embargo, otros programas de administración son operables en la presente. Otros regímenes terapéuticos pue?en ser combinados con la administración del anticuerpo anti-TGF-beta. La administración combinada incluye co-administración, utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica y la administración consecutiva ya sea en un crden u otro, en donde preferiblemente hay un períc?o de tiempo en tanto que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. En una modalidad preferida, el paciente es tratado con dos anticuerpos anti-TGF-beta diferentes. Puede también ser deseable combinar ie administración del anticuerpo c anticuerpos anti-TGF-beta con ia administración de un anticuerpo dirigido contra otro antígeno asociado al tumor. El otro anticuerpo en este caso se puede enlazar por ejemplo a vn antigene tal como EER-2, EGFR, ?rbB3, ErbB4, factor de crecimiento eu?otelial vascular (VEGF) o un marcador de superficie de célula 3 o antígeno (un antígeno expresado sobre la superficie de una célula 3 que puede ser apuntada con un antagonista que se enlaza ai mismo) , tai como, por ejemplo, los marcadores de superficie de leucocito CD10, CD19, CD2C, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDv76, CD77, CDY78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD 84, CD85 y CD86 ¡para descripciones, véase The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition. 1997, ed. Barclay et al. Acedemic Press, Harcourt Brace & Co . , New York). Otros marcadores de superficie de célula 3 incluyen RP105, FcRE2, célula 3-cell CR2, CCR6, P2X5, ELA-D03, CXCR5, FCEP.2, BR3, Btig, NAG14, SLGC1627C, FcRHl, IRTA2, ATWD576, FcRH3, IRTA1, FcRH6, BCJA, y 239287. El marcador de superficie de célula 3 de interés particular es expresado preferencialmente sobre célula B er. comparación con otros tejidos que no son de célula 3 de un mamífero y pueden ser expresados tanto sobre células 3 precursoras y células B maduras. Los marcadores de superficie de célula 3 preferidos en la presente son CD20 y CD22. En otro aspecto, el anticuerpo TGF-beta puede ser combinado con un agente anti-angiogénico, que actúa para inhibir la angiogénesis . ün ejemplo es un antagonista a V?GF, tal como un anticuerpo, por ejemplo AVASTIN™.

En una modalidad, el tratamiento de la presente invención involucra la administración combinada de un anticuerpo anti-TGF-beta ic anticuerpo) y uno o más reguladores de función inmune en un mamífero, tales como citecines, también como agentes quimioteraceuticos o agentes inhibi?ores de crecimiento, en los que se incluyen la co-administración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. Agentes quimioterepéuticos preferidos incluyen taxancs (tales como paciitexeí y docetaxel) y/o antibióticos de antraciclina. La preparación y horarios de dosificación para tales agentes quimioterapéuticos pueden ser usados de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se d.etermina empíricamente por el práctico experimentado. La preparación y horarios de dosificación para tal quimioterapia sen también descritos en Chemotherapy Service, =d., M.C. Perry, Williams & Wiikins, Baltimore, XD (1992) . El anticuerpo puede ser combinado con un compuesto anti-hcrmonal, por ejemplo un compuesto anti-estrógeno tal como tamoxifen o un inhibidor de aromatasa tal como anastrozol; una anti-progesterona tal como onapristona (véase, EP 616 812) ; o un antiandrógeno tal como flutamida, en dosificación conocidas para tales moléculas. En donde el cáncer a ser tratado es cáncer independiente de hormona, el paciente puede haber sido sometido previamente a terapia anti-hor cnal y después que el cáncer se hace independiente de hormona, el anticuerpo anti- TGF-beta (y opcionalmente otros agentes como se describe en ia presente) pueden ser administrados al paciente. Algunas veces, puede ser benéfico también co-administrar un cardioprotector (para impedir o reducir la disfunción miccardiace esociada ccn la terapia) o una o más citocinas al paciente. También se puede co-administrar un agente citotóxico. Además de los regímenes terapéuticos anteriores, el paciente puede ser sometido a la remoción quirúrgica de células de cáncer, y/o terapia de radiación. Los anticuerpos anti-TGF-beta en ia presente pueden también ser combinados con un fármaco EGFR-apuntado tales como aquellos discutidos anteriormente en la sección de definiciones dando como resultado un efecto complementario y potencialmente sinergístico, terapéutico. Dosificaciones apropiadas para cualquiera de los agentes co-aoministrados anteriores sen aquellas usadas actualmente y pueden ser disminuidas debido a la acción combinada (sinergia) del agente y anticuerpo anti-TGF-beta. Para la prevención o tratamiento de enfermedad, la dosificación apropiada de anticuerpo dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, como se define anteriormente, ía severidad y curso de la enfermedad, si el anticuerpo es administrado por propósitos de prevención o terapéuticos, terapia previa, historia clínica del paciente y respuesta al anticuerpo y la discreción del médico que atiende. El anticuerpo es administrado apropiadamente al paciente en una vez o er. una serie de tratamientos. Dependiendo dei tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 µg/kg a 15 mg/kg (por ejemplo 0.1-20 mg/kg) de anticuerpo es una dosificación candideta inicial para administración al paciente, ya sea, por ejemplo por una o más administraciones separadas o mediante infusión continua. Una dosificación diaria típica podría fluctuar de aproximadamente 1 µg/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administración repetida durante varios días o más, dependiendo de la condición, el tratamiento es sostenido hasta que se presenta una supresión deseada de ios síntomas de la enfermedad. La dosificación preferida del anticuerpo estará en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg/mg a aproximadamente 10 mg/kg. Así, una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg a 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) puede ser administrada al paciente. Tales dosis pueden ser administradas intermitentemente, por ejemplo cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal manera que el paciente recibe de aproximadamente 2 a aproximadamente 20, por ejemplo aproximadamente 6 dosis del anticuerpo anti-TGF-beta) . Una dosis de carga más alta inicial, seguida por una o más dosis más bajas puede ser administrada. Un régimen de dosificación ejemplar comprende administrar una dosis de carga inicial de aproximadamente 4 mg/kg, seguida por una dosis de mantenimiento semanal de aproximadamente 2 mg/kg dei anticuerpo anti-TGF-beta. Sin embargo, otros regímenes de dosificación pueden ser útiles. El avance de esta terapia es verificado fácilmente mediante técnicas y ana .i sis convencionales. Alternativamente, el anticuerpo es administrado apropiadamente en serie o en combinación con tratamientos radiológicos-irrediación o introducción de sustituidas radioactivas- tales como aquellas a las que se hace referencia en UZCC (?d.), Klinische Onkolcgie, Springer-Verlag (1982) . Además de la administración de ia proteína de anticuerpo al paciente, ia presente solicitud contempla la adminis ración del anticuerpo mediante terapia genética. Tal administración de ácido nucleico que codifica el anticuerpo es abarcada por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo? véase, por ejemplo, WO 1996/07321 publicado eí 14 de marzo de 1996, concerniente con el uso de terapia genética para generar anticuerpos intercelulares. Hay dos precedimientos principales para obtener el acide nucleico i opcionalmente contenido en un vector) a las células de paciente, tanto in vivo como ex vivo. Para la administración in vivo, el ácido nucleico es inyectado directamente al paciente, usualmer.te en el sitio en donde el anticuerpo es requerido. Para ei tratamiento ex vivo, las células del paciente son retiradas, el ácido nucleico es introducido a estas células aisladas y las célula modificadas son administradas a paciente ya sea directamente o por ejemplo encapsuladas dentro de membranas porosas que son implantadas al paciente (véase, por ejempio patentes estadounidenses Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Hay una variedad de técnicas disponible para introducir ácidos nucleicos a células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico es transferido a células cultivas in viere o transferidas in vivo en las células dei huésped propuesto. Técnicas apropiadas para la transferencia de ácido nucleico a células mamíferas in vítro incluyen el uso de liposomas, eiectropcreción, microinyección, fusión celular, DEAE-?excran, el método de precipitación de calcio-fosfato, etc. Un vector usado comúnmente para la administración ex vi o del gen es un retrovirus. Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de herpes simplex I o virus adeno-asociados) y sistemas a base de lípidos (lípidos útiles para la transferencia moderada por lípidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . En algunas situaciones, es deseable proporcionar ía fuente de acide nucleico con un agente que apunta las células objetivo, tales como un anticuerpo específico para una prcteíne de membrana de la superficie celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor sobre la célula objetivo, etc. en donde se usan liposomas, las proteínas que se enlazan e una proteína de membrana de superficie celular asociadas con erdocicosís pueden ser usadas para apuntamiento y/o para facilitar la absorción, por ejemplo proteínas de capsidc o fragmentos de las mismas trópicas para un tipc de célula particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización er. la ciclizacicn y proteínas que apuntan la locaíización intraceíular y mejoran la vida media intracelular. La técnica de endocitccisis moderada por receptor es descrita por ejemplo por Wu et al., J. Biol. Chem., 262:4429-4432 (1987) y Wagner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 87:3410-3414 (1990). Para una revisión de la marcación genética actualmente conocida y protocolos de terapia genética, véase Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992). Véase también WO 1993/25673 y las referencias citadas en el mismo. En una modalidad específica, el cáncer, tal como cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de pecho, cáncer de riñon, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, o cáncer de próstata es tratado en un mamífero, preferiblemente un humano, al administrar al humano una cantidad efectiva de un anticuerpo TGF-beta y un anticuerpo que se enlaza a VEGF, cpcionaimente junto con cualquier otro agente apropiado como se resume en la presente. Preferiblemente, el anticuerpo TGF-beta es un anticuerpo monoclonal, más preferiblemente se enlaza a cualquiera de uno o más de les siguientes: TGF-betal, TGF-beta2 y TGF-beta3 y todavía más preferiblemente se enlaza a por io menos TGF-betal o tanto IGF-betal y TGF-beta2 y más preferiblemente es el anticuerpo humanizado como se resume en la presente. En otra modalidad, el anticuerpo que se enlaza a VEGF es un anticuerpo monoclonel y mas preferiolemerte bloquea o neutraliza VEGF y/o bloquea el enlace de V?GF a uno o arabos de sus receptores.

VI . Artículos de manufactura En otra modalidad de ia invención, se proporciona un artícuio de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de las alteraciones descritas anteriormente. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de paquete sobre o asociado ccn el recipiente. Recipientes apropiados incluyen por ejemplo botellas, frascos, jeringas, etc. Los recipientes pueden ser formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es efectiva para el tratamiento de la condición y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o saco de solución intravenosa o un frasco que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Por io menos un agente activo en la composición es el anticuerpo anti-TGF-beta humanizado en la presente. La etiqueta o inserto de paquete indica que la composición es usada para el tratamiento de la condición de elección, tal como cáncer. En una modalidad, la etiqueta o inserte de paquete indica que la composición comprende el anticuerpo puede ser usado para tratar una alteración de TGF-beta, por ejemplo para tratar cáncer que expresa un receptor de TGF-beta. Además, la etiqueta c inserto de paquete puede indicar que el paciente a ser tratado es uno que tiene cáncer, caracterizado por ia activación excesiva de un receptor de TGF-beta. La etiqueta c inserto de paquete puede también indicar que la composición puede ser usada para tratarcáncer, en donde el cáncer no está caracterizado por schreexpresión de un receptor de TGF-beta. En otras modalidades, el inserto de paquete puede indicar que el anticuerpo o composición puede ser usado para tratar cáncer de pecho (por ejemplo, cáncer de pecho metastático) ; cáncer independiente de hormona; cáncer de próstata (por ejemplo cáncer de próstata independiente de andrógeno) ; cáncer de pulmón (por ejemplo cáncer de pulmón de célula no pequeña) ; cáncer de colon, rectal o eolerrectai o cualquiera de las enfermedades o alteraciones revelados en ía presente. Además, el artículo de manufactura puede comprender (a) un primer recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende el anticuerpo humanizado en la misma, y (b) un segundo recipiente con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente terapéutico diferente al anticuerpo humanizado. El artículo de manufactura en esta modalidad de la invención pueae comprende:-: ademas un inserto de paquete que indica que las primeras y segundas composiciones pueden ser usadas en combinación para tratar una alteración de TGF-beta tal come cáncer. Tal agente terapéutico puede ser cualquiera de las terapias adjuntas descritas en la sección precedente (per ejemplo, un agente ?uimioterapéu ico, un agente anti-angiogénico, un compuesto anti-hor onal, un cardioprotector y/o un regulador ce función inmune en un mamífero, en los que se incluyen una citocina) . Alternativa c adicionalmente, el artículo de manufactura puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprender una solución reguladora del pH aceptable farmacéuticamente, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución salina de pH regulado con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, en les que se incluyen otros agentes reguladores del pH, diluyentes, filtros, agujas y jeringas .

VII . usos No Terapéuticos para el Anticuerpo Anti-TGF-beta Los anticuerpos (por ejemplo, los anticuerpos anti-TGF-beta humanizados) de la invención tienen además aplicaciones no terapéuticas.

Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser usados como agentes de afinidad-purificación. En este proceso, los anticuerpos son inmovilizados sobre una fase sólida tal como resina S?PE.ADEX7" o filtro de papel, utilizando métodos bien conocidos en el arte. Ei anticuerpo inmovilizado es puesto en contacto con una muestra que contiene la prcteína TGF-beta (o fragmento ?e la misma) a ser purifica?a y después de esto el soporte es lavado con un solvente apropiado que eliminaré sustancialmente todo el material en la muestra excepto la proteína TGF-beta, que está enlazada al anticuerpo inmovilizado. Finalmente, ei soporte es lavado con otro solvente apropiado, tai como solución reguladora del pH de glicina, pE 5.0, que liberará la proteína TGF-beta del anticuerpo. Los anticuerpos anti-TGF-beta pueden también ser útiles en análisis de diagnóstico en cuando a proteína TGF-beta, por ejemplo detectando su expresión en céíulas, tejido o suero específicos. Para aplicaciones de diagnóstico, el anticuerpo comúnmente será marcado con una porción detectabie. Numerosas etiquetas están disponibles que pueden ser agrupadas en general en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tales como 3"S, "4C, ~2oI, 3H , 13-t . Eí anticuerpo puede ser marcado con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocols in Tmmunology, Volúmenes 1 y 2, Coligen et al., ?d. Wiley-I.nterscier.ee, New York, New York, Pubs . (1991), por ejemplo, y la radioactividad puede ser medida utilizando conteo de centelleo. ib) Etiquetas fluorescentes tales cerno quelatos de tierras raras (quelatos ce europio) o fluoresceína y sus derivados, rodamina y sus derivados, dansil, lisimina, ficoeritri e y Texas Red están ?isponibles. Las etiquetas fluorescentes pueden ser conjugadas al anticuerpo utilizando las técnicas reveladas en Current Protocols ir. Irnmunolcgy, supra, per ejemplo. La fluorescencia puede ser cuantificada utilizando un fiuorímetro. (c) Varias etiquetas de enzima-sustrato están disponibles y la patente estadounidense No. 4,275,149 proporciona una revisión de algunas de estas. La enzima cataliza en general una alteración química del sustrato cromogénico que puede ser medido utilizando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede ser medido espectrofctemétrica ente . Alternativamente, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia son descritas anteriormente. El sustrato quimioluminiscente es excitado electrónicamente por una reacción química y puede luego emitir luz que puede ser medi?a (utilizado un qui ioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen luciferasa (per ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacterina; patente estadounidense No. 4,737,456), luciferina, 2, 3-dihidroftalazinedionas, aíato deshidrogenasa, ureasa, peroxidedas tal como peroxidasa de rábano (HRPC) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoa üasa, lísczime, sacarido oxidesas (por ejemplo glucosa oxidasa, galactosa oxídase y glucosa-6-fosfato deshidrcgenasa) , oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa) , lactopercxidasa, microperoxídesa y los semejantes. Técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos son descritas en O'Sullivan et al., "Methods for the Preparation of Enzym.e- ntibody Conjugetes for use in Enzyme Im unoassay, " en Methods in Enzym. (Ed., J. Langone & E. Van Vur.akis), Academic Press, New York, 73:147-166 (1981) .

Ejemplos de combinaciones de enzima-sustrato incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como sustrato, en donde la peroxidasa de hidrógeno oxida un precursor de tinte (por ejemplo, ortofenilen diamina (OPD) o clorhidrato de 3, 3Y 5, 5' -tetrametil bencidina (TMB)); (ii) fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenil fosfate como sustrato cromogénico; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un sustrato cromogenico (por ejemplo, p-nitrofenií-ß-D-gaiactosidasa) o sustrato fiuorogénico 4-metilumbeiiferil-ß-D-gaiactosidasa . Otras numerosas combinaciones de enzima-sustrato están disponibles para aquellos experimentados en ei arte. Para una revisión general de estas, véanse, patentes estadounidenses Nos. 4,275,149 y 4,318,980. A.lgunas veces, la etiqueta es conjugada indirectamente con el anticuerpo. El experimentado en la técnica estará consciente o.e varias técnicas para obtener esto.

Per ejemplo, el anticuerpo puede ser conjugado con biotina y cualquiera de las tres amplias categorías de etiquetas mencionadas anteriormente pueden ser conjugadas con o viceversa. La biotina se enlaza selectivamente a avidina y así, la etiqueta puede ser conjugada con el anticuerpo de esta manera indirecta. Alternativamente, para obtener la conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo, el anticuerpo es conjugado con un hapteno pequeño (por ejemplo digoxina), y uno de los diferentes tipos de etiquetas mencionadas anteriormente es conjugada con un anticuerpo anti-hapteno (por ejemplo anticuerpo anti-digoxina) . Así, la conjugación indirecta de la etiqueta con ei anticuerpo puede ser obtenida. En otra modalidad de la invención, ei anticuerpo anti-TGF-beta no necesita ser marcado y ia presencia dei mismo puede ser detectada utilizando un anticuerpo marcado que se enlaza al anticuerpo TGF-beta . Los anticuerpos de ía presente invención pueden ser usados eu cualquier método de análisis conocido, tales como análisis de enlace competitivo, análisis de emparedado directo e indirecto y análisis de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp.147-158 ÍCRC Press, Inc. 1987) . Para ia inmunohistoquímica, la muestra de tumor puede ser nueva o congelada o puede ser embebida er. parafína y fija con un conservador tai como formalina, per ejemplo. Los anticuerpos pueden también ser usados para análisis de diagnóstico in vivo. En general, el anticuerpo es marcado con un radionúclido (tal co o ~AIn, "Te, i"C, t3~I, í2 I , 3H, 32P ó Jt>S) de tal manera que, por ejemplo, un tumor puede ser localizado utilizando inmunocintiografía. Como materia de conveniencia, los anticuerpos de la presente invención pueden ser proporcicnados en un equipo, esto es, una combinación empacada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para efectuar el análisis de diagnóstico. En donde el anticuerpo está marcado con una enzima, el equipo incluirá sustratos y co-factores requeridos per la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo de detectable) . Además, otros aditivos pueden ser incluidos tales como estabilizadores, soluciones reguladoras del pH (por ejemplo, una solución reguladora del pH de bloqueo o solución reguladora del pH de lisis) y lo semejantes. Las cantidades relativas de los varios reactivos pueden ser variadas ampliamente para proporcionar concentraciones en solución de los reactivos que optimizan sustanciaimente ia sensibilidad, dei análisis. Particularmente, les reactivos pueden ser provistos como polvos secos, usualmente liofilizados, incluyendo excipientes que en la disolución proporcionaran una solución de reactivo que tiene la concentración, apropiada. Eí anticuerpo en la presente es también útil para la formación de imagen in vivo, en donde el anticuerpo marcado es administrado a un huésped, preferiblemente la corriente sanguínea y la presencia y ubicación del anticuerpo marcado en el huésped es analizada. Esta técnica de formació de imágenes usada apropiadamente en la determinación de etapas y tratamiento de neoplasmas. El anticuerpo es marcado apropiadamente con cualquier porción que es detectable en un huésped, en los que se incluyen indicadores no radioactivos detectadles por ejemplo mediante resonancia magnética nuclear u otros medios conocidos en el arte. Preferiblemente, sin embargo, la etiqueta es una radioetiqueta, en los que se incluyen yodo, por ejemplo "251 y 131I, selenio, quelatos bifuncionales, cobre, por ejemplo c7Cu, tecnecio, por ejemplo 99mlc, y renio, por ejemplo -86Re y ^SRe. El radioisótopo es conjugado a la prcteíua mediante cualesquier medios, en los que se incluyen compuestos quelantes ce metal o lacteperoxidasa o técnicas de yc?ogeno para yodación. Fl anticuerpo mcnocíonel murino 2G7 fue depositado en la American Type Culture Coilectíon, 10801 üniversity Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC) cerno HB 10240 el 9/28/89; y el anticuerpo monoclonai murino 4A11 fue depositado como ATCC EB 10241 el 9/28/89. Detalles adicionales de la invención son ilustrados por los siguientes ejemplos no limitantes. Las revelaciones de todas las citas en la especificación son incorporadas expresamente en la presente por referencia.

Ejemplo 1 Producción y Caracterización de Anticuerpos Monoclonales 2G7 y 4A11 ?. Procedimientos de Análisis I . Determinación de ELISA Placas de análisis de poíiestireno de 96 cavidades fueron recubiertas con 100 ui/cavidad de TGF-betal purificado a 1 ug/ml en solución reguladora ?ei pH de carbonato pH 9.6 durante 18 horas a 4°C. Las placas recubiertas fueron bloqueadas con 0.5% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS (llamado BP3S) durante una hora a 22°C, lavadas con 0.05% de surfactante TWEEN 20-* en PBS (llamado PBST), e incubadas con 100 µl de sobrenadantes de hibridoma durante una hcra a 22 °C. Las placas fueron lavadas ccn PBST y les anticuerpos enlazados fueron detectados con IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa (Taco, Burlingame, CA) . Las placas fueron lavadas ccn PBST y sustrato de dicorhidrato de o-feniien?iamina fue agregado a 100 µl/cavidad. La reacción fue detenida después de 15 minutos y la densidad óptica a 492 nm fue determinada sobre un lector de placa UVMAX1* (Molecular Devices, Palo Alto, CA) .

I . Yodación de rTGF-betal TGF-betal purificado fue yodado mediante un procedimiento modificado utilizando sal de sodio de n-cloro-para-tcluen sulfonamida CHLORAMIN? T-? (Green ocd et al., Biochem. J. , 89: 114 (1963)). Brevemente, 10 µg ?e rTGF-betal purificado fueron marcados con 1 mCi de Na1-0! sobre hielo utilizando tres adiciones secuepciales de 20 µl de 0.1 mg/ml de sal de sodio de n-cioro-para-toiuen suifonamida CHLORAMINE T™ separada mediante incubaciones de dos minutos . La reacción fue detenida utilizando adiciones secuenciales de 20 ul de N-acetil tirosina 50 mi:, yoduro de potasio 1 14, seguido por 200 µí de urea 8 M. ?l rTGF-betal yodado fue separado de KPLC libre mediante HPLC utilizando una columna C18 y un gradiente de ácido trifiuoroacético/acetonitrilo y fracciones que contienen eí pico principal fueron acumulados y almacenados a -70 °C (actividad especifica 112 uCi/µg) .

III . Radioinraimoanálisis de Captura de Antígeno Bandas de icrotítulc de T XULON^ 2 wREMOVAWELL"t?: fueron recubiertas cor. 5 µg/ml de TgG anti-ratón de cabra (Boehringer Kar.nheim) en carbonato pE 9.6 curante 18 horas a 4°C. Las cavidades fueron lavadas con PBST, bloqueadas con PBS que contiene 0.1% de gelatina (llamada P3SG) , lavadas con PBST e incubadas con sobrenadantes de hibridoma durante 4 horas a 22 °C. Las cavidades fueron lavadas con PBST y aproximadamente 75,000 CPM/cavi?ac de :25I-rTGF-betaí en 100 µl de 0.1% de gelatina en PBST, fueron agregados e incubados durante dos hors a 22 °C. Las placas fueron lavadas ccn P3ST, y el 1251-rTGF-betal enlazado fue cuantifica?o sobre un contador GAMMAMA.S ER~'! (LKB, Suecia) .

IV. I munoprecipitación de I251-rTGP-beta La especificidad de anticuerpos monoclonales antí-TRF-beta fue también evaluada por su capacidad para inmuncprecipitar ""I-rTGF-betal derivado de plaquetas porcino ?^I-TGF-beta2 (R & D Systems, Minneapolis, MN; actividad específica 103.4 uCi/µg) . Dos microgramos de anticuerpo monocícnal purificados fueron incubados con 5 x 104 CPM de 12DI-rTGF-betal o 123l-TGF-beta2 durante des horas a 22 °C. Los inmunocompiejos fueron aglomerados con proteína A-SEPEAROSE1"' agarosa (Reeligen, Cambridge, MA) recueierta con IgG anti-ratón de conejo (Boehringer Mannheim Biochemicals, Tndianapolis, IN) y lavado subsecuentemente 3 X con PBST. Los complejos fueron disociados de la proteína A-S?PHAROSE^- agarosa co solución reguladora del pH de muestra reductora, sometidas a electroferesis a 12% de SDS-poliacriíamica gel (SDS-PAGE), y expuestas a autoraaiografía .

V. Determinación de Afinidad de .Anticuerpos Monoclonales TGF-beta El proce?i ieritc de ra?ioinmunoanálisis de fase sólida descrito por Mariani et al., J. Immunol. Methods. 71: 43 (1984) fue usado para determinar las afinidades de los anticuerpos monocloneies TGF-beta-específicos . Brevemente, anticuerpos monoclonaíes anti-TGF-beta purificados fueron recubiertos sobre bandas ?e microtítulo ?MMULQN™ 2 YREMOVAWELL"^' en solución reguladora del pE de carbonato pH 9.6 durante 18 oras a 4°C. Las cavidades fueron lavadas y bloqueadas co o se describe anteriormente. 40,000 CP /cavi?ad ya sea de ^Y-rTGF-betal o 125I-TGF-beta2 porcino (R & D Systems) , e 50 µl PBSG, fueron agregados a diluciones en serie dos veces de rTGF-betal sin marcar o TGF-beta2 porcino que fluctúa de 2500 a 9.7 ng/cavica?, e 50 ui de PBSG. La mezcla resultante fue incubada durante 18 horas a 4°C. Las cavidades fueron lavadas y contadas como se describe anteriormente y las constantes de afinidad fueron ?eter inadas medíante análisis de Scatchard (Munsor. and Poliard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980) ) , que produce resultados similares come ei análisis de regresión no lineal de Antor.i y Xariani, J. Immuncl. Xeth., 83: ¥1. Purificación de Anticuerpos Monoclonales de Fluido de Ascites Cultives de hibridoma parenterales que segregan anticuerpo que fueron positivos en el análisis anterior fueron clonados mediante dilución limitante y cultivo eu fluido de ascites en ratones Balb/c (Potter et ai., JNCI, 49: 305 Y972) ) cebados con cebador PRISTANEd Loe anticuerpos monoclonales fueron purificados ?e fluidos de ascites en proteína A S?PEA.ROSE-: de agarosa y eluidos en ácido acético 0.1 M, NaCi 0.5 M, pH 2.4, utilizando procedimientos establecidos (Gcding, J. Immunol . Methods, 20: 241 (1978)) y almacenados estériles en PBS a 4°C.

VI . Neutralización de Anticuerpo Monoclonal de Actividad Especifica de TGF-beta ín vitro El análisis de TGF-beta in vitro utilizó la línea celular ce fibroblasto de pulmón de mir.k, Xv-3D9 (seccionada de MvILu, que está disponible de la American Type Culture Collection, Manassas, VA, como ATCC No. CCL-64). Brevemente, anticuerpos mcnoclonales anti-TGF-Deta purificados y controles fueron incubados ya sea con rTGF-betal, TGF-beta2 porción natural (R & D Systems), o rTGF-beta3 (Derynck et al., Nature, supra; a una concentración final de 1000-2000 pg/ml durante 18 horas a 4°C. Cincuenta µl de estas mezclas fueron agregados a placas ?e microcítulo de 96 cavidades seguidos por 1 x 10* Mv-3D9, en 50 µi de medio esencial mínimo que contiene glutamina 2 mX y 5% de suero bovino fetal e incubados durante 18-24 horas a 37 °C er. 5% de CO- . Las cavidades fueron pulsadas con 1 µCi de Yl-tímidina en 20 ul y cosechadas después de 4 horas a 37 Y: y contadas en un conta?or de centelleo. El por ciento de inhibición de JH-timi?ina para cada dilución de estándar de TGF-beta fue usado para calcular ia actividad de TGF-beta en n/mj del anticuerpo monoclonai de control negativo y muestras tratadas con anticuerpo monoclcnal TGF-beta-específicas .

VII . Isotipificación de Anticuerpos Monoclonales La isotipificación de anticuerpos monoclonales TGF-betal-reactivcs se efectuó utilizando la tecnología de maquina de selección de fluorescencia PANDEN15. Partículas de ooliestireno recubiertas con antisuero IsG de anti-ratón de rata fueron usadas para enlazar el anticuerpo monoclonal dei sobrenadante ?e cultivo surtido a placas de análisis de 96 cavidades PANDEX™'. Las placas fueron lavadas y se agregan reactivos específicos de isotipc anti-ratón monoclonal de rata FITC-ce jugadcs (3ecton Dickinson Monoclcnal Center) . La fluorescencia de enlace fue cuantificada mediante la tecnología de máquina ce selección de fluorescencia PANDEXc IX. Análisis de Epitopo Anticuerpos moncclcnaies anti-rTGF-betal purificados fueren acoplados a percxidaea de rábano (HRP) mediante el método de Nakane y Ka aoi, J. Histochem. Cytochem., 22: 1084 (1974). Placas recubiertas con rTGF-betaí fueron incubadas con 50 µg/ml de anti-rTGF-betal purificado or. control negative en PBS durante dos horas a 22 CC. ür.a dilución predeterminada de conjugado de anticuerpo moneclonal anci-rTGF-beta-HRP fue luego agregada e las placas e incubadas durante 1 hera a 22 °C. Las placas fueron lavadas y el sustrato fue agregado y la reactividad cuantificada como se describe anteriormente. El por ciento de bloqueo de los anticuerpos monoclonales anti-rTGF-betal heterólogos fue comparada ccn el control de bloqueo positivo autólogo.

X. Análisis de Inmunoabsorción Un µg/carril de rTGF-betal fue sometido a eíectroforesis en 12% le SDS-PAGE utilizando solución reguiadora del pH de muestra no reductora para determinar las reactividades de los varios anticuerpos monoclonales con las formas diméricas de rTGF-betal. Les pépti?os fueron transinmunoabsorbidos sobre papel de celulosa y probados con el anticuerpo monocionaí apropiado conjugado con ERP. El anticuerpo enlazado fue visual! zado utilizando ei sustrato ínsoluble 4-cloro-l-naftoí {Kirkegaard and Perry, Gathersburg, MD; . La reacción fue detenida después de 15 minutos mediante lavado exhaustivo con agua destilada y los inmu oabsorbidcs fueron secados y fotografiados.

B, producción de Anticuerpos Monoclonales Anti-TGF-be al- y anti-TGF-foeta2-específicos En los protocolos de inmunización iniciales, ratones Balb/c fueron inmunizados con rTGF-betal (producido y purificado como se describe por Derynck et al., Nature, supra) mediante rutas subcutánea e intraperitoneal utilizando una variedad de preparaciones de in unégeno, dosis y horarios y utilizando tanto adyuvante de Frennd completo como incompleto. Los horarios de inmunización fueren continuados per hasta 11 semanas. Varios ratones respondieron con títulos anti-rTGF-betal mensurables paro bajos y dos de estos ratones fueron sacrificados y sus bazos usados para fusiones. De 1152 cultivos parenterales solamente 84 sobrenadantes anti-TGF-beta positivos fueron ?etectados . Diez de estos híbridomas fueron clonados y dieron como resultado anticuerpos moncclonales de baja afinida? que podrían no ser usados para ei desarrollo de análisis o purificació .

Co o una es rategia alternativa, un grupo de diez ratones Balb/c hembra (Charles River Breeding Laboratories, Wilmingtcn, MA) fueron inyectados con 5 µg/dosis de TGF-betal purificado en lOC-ul de adyuvante DETCX— (RI3I ImmunoChem Res. Inc., Hamüton, MT) en los cuartos traseros en los días 0, 3, 7, 10, y 14. En el día 17, loe animales fueron sacrificados, sus nodos linfáticos inguinal y popliteal de drenaje fueron removidos y los linfccitos fueron disociados del estroma nodo utilizando una malla de acero inoxidable. Las suspensión de lir.focito de todos los diez ratones fueron acumuladas y fusionadas con la línea de mieloma de razón X63-Ag8.653 (Kearney et al., J. Tmmunol . , 123: 1548 (1979)) utilizando 50% de pclietilengiicol 4000 mediance un procedimiento establecido (Oi y Herzenberg, en Seiected Methods in Cellular Immuncíogy. B. Mishel and S. Schiigi, eds. (WU. Freeman Ce., San Francisco, CA, 1980), p.351). Las células fusionadas fueron depositadas a un total ?e 1344 placas de microtítulo de 96 cavidades a una densidad de 2 x 10= células/cavidad seguida por selección de HAT (Littlefielc, J.W., Science. 145: 709 (1964)) en ei día 1 pcst-fusión. 1190 de ias cavidades fueron reactivas con TGF-betal recombinante inmovilizado en prueba de ELIS.A. Dieciocho de estos cultivos permanecieron estables cuando son expandidas y las líneas celulares fueron preservadas. Estos cultivos parenterales fueron isotipificados y analizados en cuando a su capacidad para capturar '"¿:>I-rTGF~be al y para neutralizar ia actividad de TGF-betal ic vitro. De los 18 cultivos parenteraies que fueron analizados para centralización de rTGF-betal y subsecuentemente isctipificados, dos fueron ce isotipo IgGl kappa; el resto fueron ei isotipo IgG2b. Solamente los anticuerpos monoclcnaies pertenecientes a la subclase IgGl fueron encontrados para demostrar la actividad inhibitoria de rTGF-betaí (neutralización) in vitro. Tres hibridomas estables fueron seleccionados que segregan anticuerpos mcnocionales anti-TGF-beta de alta afinidad. La caracterización de estos anticuerpos es detallada además posteriormente en ia presente.

C. Inmunoprecipitación de TGF-beta Radioyodado Experimentos de inmunoprecipitación fueron efectua?os para determinar la capacidad de les tres anticuerpos monocíonaies para reconocer o precipitar TGF-betal en solución. La antcra?iografía mostró que ios anticuerpos monoclonales anti-TGF-beta 2G7, 4A11 y 12H5 inmunoprecipitaron cantidades equivalentes de J~5!-rTGF-betal, mientras que el anticuerpo monoclonal de control 6G12 fue negative. Las bandas inmunoprecipitadas tuvieron un peso molecular aparente de aproximadamente 14.5 kD. ün análisis de inhibición competitivo fue usado para determinar la afinidad de interacción entre TGF-betal v cada uno de los anticuerpos mcnoclcnales . Los anticuerpos monoclonales 2G7 y 4AI1 tuvieron afinidades igualmente más altas, las cuales fueron 1.2 x 10s litros/ ol. Experimentes de inmunoprecipitaciór. fueren también efectuados para determinar la capacidad de los anticuerpos monoclcnales seleccionados para reconocer o precipitar TGF-beta2 en solución. La auteradiografía demostró que, en centraste con rTGF-betal, solamente el anticuerpo 2G7 inmunoprecipitó 1~Y-TGF-beta2 a algún grado mensurable. La comparación ?e 4A11 y 12E5 con el control negativo revela poca precipitación específica. Estos resultados fueren sorprendentes en que los experimentos de bloqueo cruzado revelaron que 4All y 2G7 fueron aptos de inhibir el enlace entre sí a rTGF-betal humano. Véase Tabla 1 Tabla 1 Enlace de anticuerpo Per ciento de bloqueo cruzado de Xabs monocional a TGF-betal Bloqueo de anticuerpo monoclonal 2 2GG77 4All 12E5 4o6 2G7 100 74 32 1.9 4All 96 100 19 1.5 12H5 28 12 100 3.4 +Xab 456 es un anticuerpo de control que reacciona con CD4. Tomados conjuntamente, los datos indican que los epítopos reconocidos por estes des anticuerpos monccionales son distintos pero estén ya sea en proximidad, estrecna o afectan un tanto el enlace de uno ae otro de una distancia. Tanto de inmunoprecipitación y experimentos de bloqueo cruzado, 12H5 parecer ser un epítopo distinto, aunque algún bloqueo fue observado. Esta conclusión es también apoyada por los datos de neutralización a conticjación.

D. Análisis de Inmunoabsorción con rTGF-betal Puesto que ia forma activa de TGF-beta es un homodímero, se efectuaron ipmunoabsorciones para determinar si les anticuerpos monoclonales reconocían esta forma. Los anticuerpos 2G7, 4.A11 y 12H5 to?os reaccionaren en una inmunoabsorción directa cen la forma dimérica de TGF-betal (no reducida). 2G7 dio una banda ucho más fuerte ya sea que 4A11 o 12H5. Cerno en el experimento de inmunoprecipitación, el anticuerpo de control 6G12 fue negativo. Este patrón de reactividad fue también observado en una absorción de Western directa con conjugados de HRP de estos anticuerpos monoclonales . En resumen, ei protocolo que emplea inmunizaciones de pata acopladas con funciones de los nodos linfáticos de drenaje fue efectuado después de múltiples intentos no exitosos a tolerancia de ruptura de rTGF-betal utilizando una variedad de procedimientos de inmucizacióc y horarios de dosificación en ratones 3alb/c y C3H con adyuvante de Freund completo e incompleto. En general, este procedimiento se encontró útil para genera una respuesta rápida ccn muy alta afinidad a estos inmunógenos débiles, en contraste con la experiencia de Dasch et al., supra, que generaron un anticuerpo monccionai TGF-betal y TGF-beta2 neutralizante utilizando TGF-beta2 derivado de hueso bovino purificado en adyuvante de Freund como inmunógeno en ratones 3alb/c. Todos los tres anticuerpos monocionales se enlazaron a rTGF-betal en ía inmuuoabsorción, ELISA, bloquee cruzado y análisis de inmunoprecípitación. Dos de los anticuerpos anti-rTGF-beta neutralizarpn la actividad de rTGF-betal in vitro, en tanto que solamente uno de les dos neutralizaron tanto actividad de TGF-beta2 y TGF-beta3 en el análisis de células de fibroblasto de pulmón de mink. Los anticuerpos neutralizantes de TGF-betal también bloquearon ei enlace de rTGF-betal radioycdado en un análisis de radiorece tor, indicando que la neutralización in vitro de la actividad de rTGF-betal fue debida al bloqueo del receptor.

Ejemplo 2 Anticuerpos 2G7 Humanizados Los dominios variables de anticuerpo monoclonal murino 2G7 fueron clonados primero a un vector que permite ia producción de un fragmento Fab quimérico de ratón/humano. ARN total fue aislado de las células de hibridoma utilizando un equipo de extracción de ARN STRAG?NE--"- siguiendo los protocolos del fabricante. Los -dominios variables fueron amplificados mediante RT-PCR, purificados con geí e insertados a un derivado ?e un plásmico a base de pUC119 que contiene un dominio constante kappa humano y dominio CY. humano como se describe previamente (Cárter et ai., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA). 89: 4285 (1992) y patente estadounidense No. 5,821,337). El plásmido resultante fue transformado a cepa de E. coii 16C9 para expresión dei fragmento de Fab. El crecimiento de los cultivos, inducción de expresión de proteína y purificación de fragmento Fab fueron cerno se describe previamente (Werther et al.,. -J. Immunol . , 157: 4986-4995 (1996); Presta et al., Cáncer Research, 57: 4593-4599 (1997) La secuenciación ?e ADN del clon quimérico permitió la identificación de residuos de CDR (Kabat et ai., supra) . Utilizando mutagénesis dirigida al sitio de oligonucieotido, tedas las seis de estas regiones de CDR fueron introducidas a una estructura humano completa (subgrupo VJ I kappa y subgrupo III VE) contenidos en ei plásmido VX4 como se describe previamente (Presta et al., Cáncer Research, 57: 4593-4599 (Í997) ) . La proteína del "CDR-incercambia?o" resultante fue expresada y purificada como antes. Estudios de enlace se efectuaron para comparar las dos versiones. Brevemente, una placa NUNC MAXISORP~? fue recubierta con 1 microgramo/ml de dominio extracelular de TGF-beta íECD; producido como se describe en WO 1990/143575 en 50 mX de solución reguladora del pH de carbonato, pE 9.6, durante toda ia noche a CC y luego bloqueado con diluyente de ELISA (0.5% 3SA, surfactante no iónico, 0.05% POLYSORBATFd 20 F3S) a temperatura ambiente durante 1 hora. Diluciones seriales de muestra en diluyente de ELISA fueren incubadas sobre las placas durante 2 horas. Después del lavado, el fragmento ?e Fab enlaza?o fue detectado ccn anticuerpo anti-humaco kappa murino biotir.iiado (ICN 6347"?1 Í seguido por peroxidasa de rábano estreptavidina-conjugada (Sigma) y utilizando 3, 3 Y 5, 5 ' -tetrametil bencidina (Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) como sustrato. La absorbancia fue leída a 450 nm. Ei enlace del Fab CDR-intercambiado fue reducido significativamente en comparación con el enlace del fragmento Fab quimérico. Para restaurar el enlace del Fab humanizado, mutantes fueron construidos utilizando ADN del CDR-intercambiado como plantilla. Utilizando un modelo generado por computadora, estas mutaciones fueron designadas para cambiar ios residuos de región estructural humana a sus contrapartes murinas en posiciones en donde el cambio podría afectar las confirmaciones de CDR o la interface de antígeno-anticuerpo. Los mutantes son-mostrados en la Tabla 2. (Nótese que to?a le numeración de aminoácido es expresada como en Kabat et al., supra.) Para secuencias, veáse Figuras 1-4.

X cIJÜJL L d¿* Designación de Mutaciones FR 2G7 Huraanirsadéts Las versiones 3 y 4 fueron usadas come intermediarios para obtener las versiones de Fab humanizadas que llevan números posteriores. Versión 5, con los cambios AíaH49Gly, PheE67Ala, y ArgH71Ala, parece tener enlace restaurado a aquel del fragmento Fab 2G7 quimérico original, como las versión 709 y 11 (Figura 5) . Se espera que las versiones 710 y 712 tengan enlace similar al fragmento quimérico, pero la versión 712 tiene una mutación estructural adicional que podría no ser deseable debido a ia posibilidad de inmunogenicidad incrementada. Residuos de FR o CDR adicionales, tales como L3, L24, L54, y/o E35, pueden ser modificados (por ejemplo, sustituidos como sigue: GlnL3 et, ArgL24Lys, Argl54Leu, GluH35Ser) . Las sustituciones que podrían ser deseables para mejorar la estabilidad son la sustitución de leucina o isoleucina por metionina para disminuir la oxidación o el cambio de asparaginas en ios CDR a otros residuos para disminuir la posibilidad ?e des-amidación. Alternativa o adicionaimente, el anticuerpo humanizado puede ser xr.adurado por afinidad (véase anteriormente) para mejorar a?icionalmente e refinar su afinidad y/u otras actividades biológicas. Los plásmidos para la expresión de IgG de plena longitud fueren construidos mediante subeíonación de los dominios VL y VH del Fab 2G7 quimerice también como versiones de Fab humaniza?as 5, 709, y 11 a vectores ?RI previamente descritos para la expresión ?e célula mamífera (Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech., 2:3-10 (1990)}. Brevemente, cada constructo de Fab fue sometido a digestión con EcoRV y Blpl para extirpar un fragmento de VL, ei cual fue clonado a los sitios EcoRV/BipI de del plásmido pDRl (véase figura 6) para la expresión de la cadena ligera completa (dominios VL-CL) . Adicionalmente, cada constructo de Fab fue sometido a digestión con PvuII y Apal para extirpar un fragmento VH, el cual fue clonado a los sitios Pulí/Apal del plásmído pDR2 (véase figura 7) para la expresión de ia cadena pesada completa (dominio VH-CH1-CH2-CH3) .

Para cada variante de I G, transfecciones transitorias fueron efectuadas al co-transfectar un plásmido que expresa cadena ligera y un plásmido que expresa cadena pesada a una línea celular de riñon e briónice humano adenovirus-transformado, 293 (Graha et al., J. Gen. Virol, 36:59-74 (1977);. Brevemente, 293 células fueron divididas en eí día previo a la trar.sfección y ?epositadas en medio que contiene suero. En el día siguiente, un precipitado de fosfato de calcio fue preparado de ADN de doble hebra de las cadenas ligeras y pesadas, junto cor. el ADN de vector pADVAl-ITAGE"*-* (Promega, Madiscn, Wl) , y agregado gota a goca a las placas. Las células fueron incubadas durante toda la noche a 37 °C, luego lavadas con P3S y cultivadas en medio libre de suero durante 4 días tiempo en el cual el medio acondicionado fue cosechado. Los anticuerpos fueron purificados de sobrenadantes de cultivo utilizando prcteína A-S?PHAROSE CL-4B-1'- de agarosa, luego intercambiadas en solución de oH regulado a succinato de sodio 10 M, NaCl 140 M, pH 6.0 y concentrados utilizando un icroconcentrador CENTRICON-IO'1''1 (Amicon) . Las concentraciones de proteína fueron determinadas al medir la absorbancia a 280 nm o mediante análisis de aminoácido cuantitativo. Xodificaciones adicionales ?e hu2G7 Versión 5 IgG fueron efectuadas con ei fin de aclarar cual CDR contribuían a enlace, cuales CDR podrían ser revertidos a ía secuencia dei sitio kappa de íínea de germinación humana sin pérdida de actividad o para estabilización del anticuerpo, cstas son nombradas co e se muestra en ia Tabla 3, y las diferencias de nminoacidos entre versicn estas versiones son aaaas.

Tabla 3 Designación de Mutaciones de CDR 2G7 Hiamanisadas El nombre para la secuencia de línea de germinación usada para CDR Ll es L8/19, como se resume en la figura 4 de Cox et al., ?ur. J. Immunol . , 24: 827-836 (1994) y en la figura 2e de Schable and Zachau, 3iol. Chem. Hcpoe-Seyier, 374: 1001-1022 (1993) . Para CDRL2, la secuencia de línea de germinación es nomorada L8/19/L14/115 (véase Cox et al., supra, and Schabie and Zachau, supra) . Las reversiones a la secuencia de sitio kappa de línea de germinación (gl) humana se hicieren en todos los CDR, pero solamente les revertientes de línea de germinación resumid anteriormente mostraron enlace (véase figura 8) . Se puede ver de esta figura que V5E.glL2, ccn CDR L2 revertido a ía secuencia del sitie kappa de línea de germinación humano, todavía se enlaza a TGF-beta también como V5H.V5L. Las dos versiones V5H.glLlglL2 y H2N? .glLIglL2, también como E2NI.V5L, nc se enlazan también como la quimera. ün análisis de proliferación celular mesangial de ratón fue usado para probar un anticuerpo ce control y varios anticuerpos humanizados (V5H.V5L, VSH.gl L2, H2NI.V5L, V5H.glLlglL2, y H2N1. glLlglL2; . El protocolo es como sigue: En el día 1: células mesangiales de ratón fueron deposita?as sobre una placa de 96 cavidades en medio (una mezcla 3:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco y medio F12 de Ham-95% de suero bovino fetal- 5% - complementado con solución reguladora deí pH HEP?S 14 mM) y cultivados toda la noche. En ei cía 2: TGF-beta con tres concentraciones diferentes (ICO ng, 10 ng y 1 ns¡ y cinco tipos diferentes de anticuerpo TGF humanizado (20 µg/ml) fueren ?iluida en medio libre de suero y agregados a las células. Un anticuerpo TGF de ratón fue usado como control (2G7). En el día 4: después de 48 horas de incubación, 20 µi ?e solución reguladora del pH de reacción (solución reguladora del pH CELLTITSR 96 AQÜEOUS ONE SOLUTION REAGENT™ (Promega Inc. Número de catálogo G3580) fue agregado a cada cavidad de la placa y se permite incubar durante 2 horas. La absorbancia (OD) fue medida a 400 nm. K2NI . 5L (20 µg/ml i bloqueó completamente la inhibición de célula inducida por TGF-beta a nivel de I ng/ml, el cual es el mismo resultado co o usar el control de ratón quimérico (véase figura 9) . La versión 5 (V5E.V5L9 también bloqueó ia inhibición de célula similarmente al control. Varios anticuerpos humanizados fueron probados en cuando a su actividad para neutralizar varios TGF-betas versus 2G7 utilizando la línea celular 3T3 ?e fibroblastos de embriones de ratón suizo desagregados estimulados con uno de tres TGF-betas in vitro y luego su proliferación fue medida como actividad. Los resultados son mostrados en las figuras 10-14. Estas figuras indican que el anticuerpo humanizado K2NI.V5L fue bastante superior en bloquear ia actividad ai anticuerpo de control 2G7. Los otros anticuerpos humanizados probados, H2NI.glL2 (CDR L2 se revirtió a ia secuencia del sitio de kappa de línea de germinación humano) y V5E.glL2 (CDR L2 se revirtió a la secuencia -del sitio kappa de línea de germinación humano) , mostraron actividad inhibitoria comparable, V5H.glL2 es el menos afectivo para todos los TGF-betal a -beta3. En resumen, los anticuerpos humanizados V5H.V5L, V5H,glL2, E2NI.V5L, E2NI.glL2, y Versiones 709, 710, y 711 son las versiones humanizadas mes preferidas, puesto que se enlazan a TGF-beta comparablemente como el anticuerpo quimérico (chimE.chimL; fragmento de 2G7 Fab) y/e neutralizan TGF-beta o bloquean la inhibición celular inducida por TGF-betas in vitro y tienen les mínimos cambios estructurales ce todos los anticuerpos humanizados probados, lo cual minimizaría el riesgo de una respuesta inmune en pacientes. Además, H2NI.V5L es un anticuerpo particularmente preferido, parece ser superior en actividad de neutralización de todas las tres isoformas TGF-beta (TGF-beta 1,2,3) y podría tener estabilidad mejorada debido a ios cambios en el CDR E2. Además, aquellos anticuerpos humanizados en la presente que exhiben capacidad mejorada para bloquear la actividad, de todos los tres iigandos TGF-beta in vitro en comparación con el anticuerpo monoclonai de ratón 2G7 se espera que funcionen mejor que 2G7 en las varias indicaciones a continuación en virtud de su capacidad superior para inhibir los efectos pan-TGF-beta-inducidos, como se muestra en el análisis en cuanto a la proliferación de fibroblastos TGF-beta-inducida (figuras 10-14) .

Ejemplo 3 Terapia de Rectarrencia o Cáncer de Próstata Refractario El anticuerpo en ia presente es un anticuerpo monoclonai humanizado de plena longitud (producido en células CHO) ?irigi?o contra TGF-beta. Es indicado como un solé agente para tratamiento ?e pacientes de cáncer de próstata refractarios a hormona (an?régeno-inoependiente) . Los puntos finales primarios para la eficacia incluyen la sobrevivencia global en comparación con el mejor cuidado disponible (Xitoxantrona/Prednisor.a) , cuando se usa como un solo agente y seguridad. Los puntos finales ?e eficacia secundarios incluyen: avance de tiempo a ia enfermedad, velocidad de respuesta, calidad de vida, dolor y/o duración de respuesta. El anticuerpo es administrado intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta el avance de ia enfermedad. El anticuerpo es suministrado cerno una formulación líquida de multidosis (llenado de 20 L a una concentración de 20 mg/mL o concentración más alta) . El anticuerpo es también indicado en combinación con quimioterapia para ei tratamiento de pacientes de cáncer de próstata refractarios a hormona fandrógeno-in?ependiente) . Los puntos finales primarios para la eficacia incluyen sobrevivencia global en comparación con quimioterapia y seguridad. Los puntos finales de eficacia secun?aria inciuyen: avance de tiempo a la enfermedad, velocidad de respuesta, calidad de vida, dolor y/o duración ce respuesta. El anticuerpo es administrado intravenosamente (IV) semanalmente o ca?a tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta el avance de ia enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida de multi?osis (llenado de 20 L a una concentración de 20 mg/mL o concentración más alza) . Ejemplos de fármacos que pueden ser combinados con el anticuerpo anti-TGF-beta humanizado para tratar cáncer de próstata (por ejemplo, cáncer de próstata an?rógeno-independiente'; incluyen un inhibidor de farnesil transferasa; un agente anti-angiogénico (por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF) ; un fármaco EGFR-apnntad (por ejemplo C225 o ZD1839) ; anticuerpo anti-HER-2 de HERCEPTJN-3 o un anticuerpo anti-Erb3 que induce apoptosis tales como 7C2 o 7F3, en ios sue se i incluyen variantes humanizados o de afinidad madurada -de los mismos; 2C4 o 2C4 humanizado; otro anticuerpo anti-TGF-beta (por ejemplo un anticuerpo TGF-beta monoclonal) ; una citocina (por ejemplo IL-2, IL-12, G-CSF o GM-CSF); un antiaudrógeno (tal como flutair.ida o proterona acetato) ; iuproluro, suramina; un agente quimioterapéutico tal como vinblastina, estramustina, mitoxantror.a, iiarozol (un que bloquea el metabolismo de ácido retinoico) , cíclofosfamida, antibióticos de antraciclina tales como doxorubicina, un taxano (por ejemplo paclitaxel o docetaxel) , o metotrexate o cualquier combinación de los anteriores, tal como vinblastina/estramustina, o ciclofosfamida/doxcrubiciña/metotrexate; predr.isona; hi?roccrtisona o combinaciones ?e los mismos. Dosis estándar para estos varios fármacos pueden ser administradas, por eje pío 40 mg/mt/semaua de decetaxel (TAXOTEREO) ; 6 (AUC) de carbopiatir.a; y 200 mg/m? ?e paclitaxel (T.AXOL®) . Puesto que el TGF-beta también ha sido implicado en cáncer de próstata (Shah et al., Cáncer Research, 62: 7135-7138 (2002)), el anticuerpo puede ser probado en modelos de cáncer ?e próstata (por ejemplo ratones transgénicos TRAK? también cerno células PC-3 trasplantadas) con una esperanza de éxito.

Ejemplo 4 Terapia da Cáncer de Pecho El anticuerpo en la presente es indicado como un solo agente para el tratamiento de pacientes con cáncer ae pecho, especialmente pero no limitados a pacientes etastáticos . Los puntos finales primarios para la eficacia incluye velocidad de respuesta y seguridad. Los puntos finales de eficacia secundaría incluyen. Sobrevivencia global, avance al tiempo de enfermedad, calidad de vida y/o duración ce respuesta. El anticuerpo humanizado en la presente es administrado intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta el avance de la enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida de multidcsis (llenado de 20 mL a una concentración de 20 mg/mL o concentración más alta) . El anticuerpo humanizado en la presente es también indicado eu combinación con quim o erapia para tratamiento de pacientes co cáncer de pecho. Los puntos finales primarios para eficacia incluyen sobrevivencia global en comparación con quimioterapia sola y seguridad.. Los puntos finales de eficacia secundaria incluyen. Avance al tiempo de enfermedad, velocidad de respuesta, calidad de vida y/o duración de respuesta. El anticuerpo humanizado es administrado intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta el avance ?e ia enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida de multidcsis (llenado ce 20 L a una concentración de 20 mg/mL o concentración más alta) . Ejemplos de fármacos que pueden ser combinados con el anticuerpo anti-TGF humanizado en la presente para tratar cáncer de pecho (por ejemplo, cáncer de pecho metastático que no está caracterizado por la sobreexpresión de TGF-beta) incluyen agentes químioterapéuticos tales como anticuerpos de antraciclina (por ejemplo doxorubicina) , ciciofosfamida, un taxano (por ejemplo paclitaxei o ?ccetaxel) , navelbina, xeloda, micormicina C, un compuesto de platino, oxalipiatina, gemcitabina o combinaciones de dos o más de estos tales como ?cxorubicir.a/ciclofosfomi?a; anticuerpo anti-HER-2 HERCEPTIN®, o un anticuerpo anti-Erb3 que induce apóptosis tai como 7C2 o 7F3, en los que se incluyen variantes humanizados o de afinidad-madura de los mismos; 2C4 o 2C4 humanizado, otro anticuerpo anti-TGF-beta (por ejemplo un anticuerpo TGF-beta mcnoclonal) ; un anti-estrógeno (por ejemplo tamoxifen) , un inhibidor de aromatasa (per ejemplo anastrozol) ; un inhibidor de farnesil transferasa, un agente anti-angiogénicc (por ejemplo un anticuerpo anti-V?GF) ; un fármaco EGFR-apuntado (por ejemplo C225 o ZD1839) ; una citocina (por ejemplo TL-2, BL-12, G-CSF o GX-CSF) ; o combinaciones de los anteriores. Dosificaciones estándar para tales fármacos adicionales pueden ser usadas. El anticuerpo humanizado en la presente es indicado adicionalmente en combinación con anticuerpo anti-HER-2 de H?RCEPIIN© o rhuMAb 2C4 para ei tratamiento de pacientes con cáncer -de pecho, especialmente aquellos con metástasis. Los puntes finales primarios para eficacia incluyen velocidad de respuesta y seguridad. Los puntos finales de eficacia secundario incluyen: tiempo al avance ?e la enfermedad, sobrevivencia global en comparación con anticuerpo anti-HER-2 de HERCEPIIN® o rhuKAb 2C4 solo, calidad de vida y/o duración de respuesta. RhuXAb 2C4 es a ministrado intravenosamente (IV) o cada tres semanas a 2 c 4 mg/kg, respectivamente, hasta el avance de la enfermedad. El anticuerpo rhuXAb 2C4 es suministrado como una formulación lísuida de multidosis (llenado de 20 L a una concentración ce 20 mg/mL o concentración es alta) . El anticuerpo anti-HER-2 de HERCEPTIN® es administrado IV como una dosis de carga inicíaí de 4 mg/kg seguida por una dosis de mantenimiento semanal de 2 mg/kg. El anticuerpo auti-HER-2 H?RCEPTIN© es suministrado co o un polvo liofiíizado. Cada frasco de anticuerpo anti-HER-2 de HERCEPTIN® contiene 440 mg de anticuerpo anti-HER-2 de HERCEPTIN®, 9.9 mg de L-histidína HCl, 6.4 mg de L-histidina, 400 mg de a-a-trehalosa dihidratada y 1.8 mg ce surfactante POLYSQRBATE 207M. La reconstitución con 20 mL de agua bacteríestática para inyección (B FI) , que contiene 1.1% de alcohol bencílico como conservador, produce 21 ml ?e solución ?e ultidosis que contiene 21 mg/mL de anticuerpo anti-HER-2 de HERCEPIIN® a un pH de aproximadamente 6.0. _ Utilizando el anticuerpo murino 2G7 en las células epiteliales 4T1 de un modelo de tumor mamario de ratón espontáneo de cáncer de pecho, células (1.5 x 1QY fueron inyectadas a la grasa mamaria de ratones (día 0) . En este modelo, un tumor primario palpable aparece por una semana; metástasis secundarias aparecen en los pulmones en la semana 2, en el hígado en la semana 3, y en ios huesos entre las semanas 4 y 5. Los tejidos son cosechados en la semana 7. El anticuerpo 2G7 y dos anticuerpos IgG de control fueron inyectados intraperitonealmente a ratones a 25 mg/kg 3x/semana y producción de TGF-beta del suero por las células 4T1 fue medida en los medios de cultivo de tejido (c sangre para los estudios in vive) mediante un ELISA, comercial de R&D systems. La figura 15A muestra la producción de TGF-beta por las células 4T1 y células epiteliales de ratón normal C57 como un control mediante ELISA in vitro. La figura 153 muestra el efecto sobre la producción de TGF-beta en el suero por células 4T1 in vivo del anticuerpo 2G7 en ratones cor. tumores (+ anti-TGF-beta) contra ratones sin tumores (-Con) tratados con anticuerpos de control (Con) (IgG isotipo-correspondiente, que es un anticuerpo anti-ambrosía) y contra ratones con tumores (+ Con': tratados con anticuerpos de control. Estos resultados demuestran que las células de tumor epitelial 4T1 produjeron mas TGF-beta que las células epiteliales C57 de control in vi tro (figura 15A) y que el anticuerpo 2G7 er. la presente disminuyó la cantidad de IGF-beta libre en las circulación en relación con ratones con tumores tratados con anticuerpos de control (figura 153) . Niveles de suero de TGF-beta libre fueron reducidos en ratones tratados cor. el anticuerpo anti-TGF-beta 2G7, consistente con los resultados previos que los anticuerpos anti-TGF-beta pueden alterar la ?isponibilidad de TGF-beta in vivo. (Woj owicz-Praga et al., Immur.cther E phasis Tumor Immunoí., 19(3): 169-75 (1996). Erratum in: J. Immunother Err.ph. sis Tumor Immuncl, 19(5) :386 (1996), Ver a UM (corrected te Verma UN) ) . Además, el anticuerpo usado en la presente (2G7) no interfirió en los análisis de ELISA como se evidencia per el hecho de que las lectura ce ELISA, no fueren afectadas por la adición de 2G7 a plasma ?e control a diluciones de 1:1, 1:100 y 1:1000 en comparación con el vehículo. Ziyadeh et al., Proc. Nati. Aca?. Sci. USA, 9'Y 8015-20 (2000). La Figura 16A muestra las puntuaciones ?e histología y la figura 163 muestra los peses del tejido para tumores de pulmón secundarios producidos por el modele ?e células de tumor usado para la figura 15 con ei control de IgG anti-a brosía y anti-TGF-beta 2G7 tal como es dado al ratón según la descripción para la figura 15, que indica que el anti-TGF-beta disminuyó ei grado, el número de lóbulos afectados, el peso del tejido en gramos y ios pesos del pulmón como un porcentaje del peso corporal contra el control. Tumores de pulmón secundarios fueron detectados mediante exploración de tomografía computada ex vive. La Figura 17 muestra la cuantificación de tumores de pulmón del modelo de ratón anterior mediante uCT, indicando el volumen y número de tumor, anti-TGF-beta 2G7 muestra un volumen de tumor más bajo que el control de IgG, tanto dos 2G7 como el control da?os a los ratones según la descripción para la figura 15 (esto es, 25 mg/kg 3 veces/semana intraperitoneaimente) . La figura 18A muésera ei volumen del tumor en el modelo ?e ratón anterior como función del tiempo en días después de la inyección celular utilizando 25 mg/kg 3x/semana intraperitoneaimente aei concrol de IgG con solución salina e con taxoi, y 25 mg/kg 3x/semana intraperitonealmente -de anti-TGF-beta 2G-7, con taxol, en tanto que el último fue mas efectivo para reducir el volumen del tumor. La figura 183 muestra que ei anticuerpo anti-TGF-beta 2G7 con quimioterapia redujo el peso del tumor -tumores de pulmón, bazo- tanto ccn respecto ai control ?e IgG/sciución salina y controles de IgG/quimioterapia . Acerías, el anticuerpo 2G7 disminuyó los niveles sistémiccs del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF] contra el control de IgG en este modele de ratón. La figura 19 muestra los niveles ?e VEGF en el plasma (pg/ml) er. ratones sin tumores (Normal) , o en ratones con tumores mamarios 4T1 tratados ya sea con IgG de control (control) o auti-TGF-beta 2G7 (aTGF-b) (25 kg/kg 3x/semana intraperitcnealmente para el control y anti-TGF-beta) . Cada punte representa un ratón individuai. La barra indica el promedio para el grupo. En resumen, en el modelo de cáncer de pecho de células epiteliales ?erivadas de tumores mamarios espontáneos en ratones Balb/c Í4T1) que son inyectados a los bloques de grasa mamarios ?e ratones singenéticos, se encontró que el anticuerpo 2G7 disminuye los niveles circulantes de TGF-betal libre y niveles ?e V?GF sistémicos y tiene una capacidad transitoria pequeña pero significativa para disminuir el crecimiento de tumor primario contra los controles. Ei tratamiento prematuro con ¿G i disminuyó los tumores ae pulmón secundarios . Además, el tratamiento prematuro cor. los anticuerpos 2G7 superó mucha de la destrucción del hueso inducida por tumor de pecho que ocurre en este modelo, utilizando la misma exploración como para los pulmones. Véase Tabla 4. En esta tabla el número trabecular se refiere al número de trabéculas (las espíenlas pequeñas de hueso que se extienden a la cavidad de médula ósea) y eí espesor trabecular se refiere al espesor promedio de estas trabéculas. Ambos de estos parámetros indican la cantidad de hueso y son determinados utilizando tomografía micro-computada y un algoritmo para cuantificar varios parámetros de hueso (Tabla 4) .

Tabla 4 Medición de Regeneración de Hueso Nótese que, los porcentajes se refieren a: 1) en relación con ratones normales (esto es, sin tumores) para las muestras "2G7 sin tumor primario" y "con tumor primario". 2) en relación con ratones con tumores tratados con anticuerpos de control IgG para ia muestra de 2G7 con tumor primario". El anticuerpo 2G7 fue también probado en un modelo de cáncer de pecho (Py T) , como se describe en Maglione et al., Trar.sger.ic Polyoma mid?le-T mice model pre alignant mammary disease, Cáncer Res., 61 (22) : 8298-305 (2001) y Lin et al., Progression to malignancy in the pcíye-ma mídale T oncoproteín mease breast cáncer modei provi?es a reliable model for human diseases, Am J Pathol., 163 (5") : 2113-2.6 (2003). Ambos anticuerpos (control de IgG i anticuerpo anti-ambrosía) y anti-TGF-beta 2G7) fueron dosificados ?e la misma manera: 25 mg/kg 3x/semana intraperitonealmente. La figura 20A muestra el efecto de anti-TGF-beta 2G7 contra ei control de IgG en el volumen del tumor como fracción de días de crecimiento de tumor en el modelo de PymT, indicando que el anticuerpo 2G7 reduce el volumen del tumor con eí paso del tiempo contra el control de IgG. La figura 203 muestra que el peso dei tumor fue también reducido cor. el anticuerpo TGF-beta 2G7 contra el control de IgG. También se encuentra que hay niveles de VEGF ?isminuidos en tumores de PymT en relación con tumores Her2. En vista de estos datos, se espera que las versiones humanizadas de los anticuerpos 2G7 en la presente actuarán similarmente a 2G7 en términos de crecimiento ?e tumor y metástasis . A diferencia de las células epiteliales 4T1, las células epiteliales Eer- no sintetizan altos niveles de TGF-beta in vitro, fueron inhibidas en el crecimiento mediante TGF-beta in vitro (Siegel et al., Transforming growth factor beta sig aling i pairs Neu-inducec mammary tumorigenesis while promoting pulmcnary metástasis. Proc Nati Acad Sci USA., 100 (14 ): 8430-5 (2003)), y no fueron inhibidos en el crecimiento por el tratamiento anti-TGF-beta in vivo. Ademas, los niveles de V?GF fueron incrementados en este modelo cuando el anticuerpo a ti-TGF-beta 2G7 fue dado contra con control de IgG. El teñido de tres ?e los mo?elos de tumor de pecho ((4T1, ?y--ít y Her2) para membrana basal (colágeno IV), células endoteliaies (CD31) o células que soportan vasos llamados pericitos (SMA o NG2 ) revelaron diferencias en estos sistemas modelo en términos de estos tres componentes. Estos componentes, sin estar limitados por alguna teoría, pueden ser predictivos con respecto a sensibilidad de tumores al tratamiento anti-TGF-beta. Dada la naturaleza bifuncional propuesta del papel de TGF-beta en cáncer, ei uso de un diagnóstico para determinar como, si el paciente responderá puede probar ser útil en la aplicación de estrategias inhibidoras de TGF-beta para el tratamiento de cáncer. Por ejemplo, ia determinación si las células ae cáncer de un paciente dado siguen o r.c siendo sensibles a los efectos inhibidores de crecimiento de TGF-beta puede ser importante. Sin estar limitados a alguna teoría, a continuación se encuentra una lista de marcadores de diagnóstico potenciales, para seleccionar pacientes /tumores más probables a responder al tratamiento anti-TGF-beta, esta lista no es limitante: 1) Expresión de una o más ?e las tres isoformas TGF-beta, TGF-betal, -2 y/o -3, especialmente aquellas con niveles de expresión más altos, con un enfoque particular sobre TGF-betal . a) Esto cubría un numere de diferentes tipos de cáncer, en los que se incluyen, pero no limitados a: pecho, páncreas, próstata, riñon, pulmón y piel (melanoma) . Se encontró que hubo una sobreexpresion significativa en estos tumores de TGF-betaí en comparación ccn muestras de tejido normal correspondientes del mismo tipo de tejido. b) Cánceres de pecho Her2 negativos en contraposición con cánceres Her2 de pecho-positivo, ya que el primero puede responder mejor al tratamiento de anticuerpo como se indica por la expresión más alta de TGF-betal. A este respecto, se encontró que hubo sobreexpresión significativa en estes tipos ?e tumor de TGF-betal en comparación con las muestras de tejido normal correspondientes del mismo tipo da tejido. 2) Como corolario al número 1, producción de céiuia ?e tumor, independiente de si TGF-beta es también elaborado en el estro a/medio ambiente. 3) Mutación en y expresión disminuida de une c más receptores TGF-beta, especialmente pero no limitados a TGF-betal PJ o TGF-betaRII (tipo-IIR) . 4) Mutaciones o cambios en íes niveles o iocalización de moléculas en la ruta ce señalización de TGF-beta, en los que se incluyen, pero no están limitados a: SXADs/fosfoSMADs, c- yc, CDC25A, pl5!NK4B, p21 AFl/Ci?í , y p27K!Pi. 5) Alteraciones en otras rutas de señalización conocidas que impactan ía actividad de TGF-beta, en las que se incluyen pero r.c limitadas a: FoxGl, Jagged/Notch, CDK2, y CD 4, y especialmente Her2/neu, niveles de receptor de estrógens, actividad Ras, fosfatidilinositoi 3-cinasa (PI3K) , actividad AXT y XAPK, también como estatus p53 status. Además de los marcadores de diagnóstico enlistados anteriormente para determinar cuales tumores tratar, varios marcadores pueden ser usados para evaluar (dentro del tumor y/o en ia periferia) ia actividad biológica de anticuerpos anti-TGF-beta en pacientes antes y después de tratamiento, en los que se incluyen pero no limitados a: 1) Niveles de TGF-beta, en el tumor o en la circulación (como se muestra per ía figura 15B también como por datos de inmunohistequímica (IHC* que muestra la expresión de proteína TGF-betal en secciones de tejido teñidas de xenoinjertos de tumor colo205 y tumores Caíud, tumores HPAC y una muestra ?e tumor humane de adenocarcinoma de pecho ductal) . 2) Niveles de VEGF, en el tumor o en la circulación (como se muestra por ía figura 19 y también por los dates que muestran que los niveles de VEGF son incrementados en el modelo Her2 positivo cuando 2G7 es previsto contra el control). 3) Niveles de moléculas tales como SMADs/fosfoSMADs dentro de la ruta de señalización de TGF-b, en las células de tumor y/o en células periféricas tales como células mononucleares ?e sangre (BMC) . 4) Indicadores ?e función celular inmune, especialmente NK, célula T y actividad de macrófago.

Ejemplo 5 Terapia de Cáncer de Txamor El anticuerpo humanizado en la presente indicado como un solo agente para el tratamiento de cáncer ?e puímón de célula pequeña de etapa lllb o IV (NSCLC) . Los puntos finales primarios para la eficacia incluyen velocidad de respuesta y seguridad. Los puntos finales de eficacia secundaria incluyen: sobrevivencia global, tiempo al avance de la enfermedad, calidad de vida y/c duración de respuesta. El anticuerpo humanizado es administrado travenosamente (IV; semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta ei avance ?e la enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida en multi?osis (llenado de 20 mL a una concentración ce 20 mg/mL o concentración más alta) . El anticuerpo humanizado es también indicado en combinación con quimioterapia para tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas metastático. Los puntos finales primarios para eficacia incluyen sobrevivencia global en comparación con terapia estándar y seguridad. Los puntos finales ?e eficacia secundaria incluyen. Tiempo al avance de la enfermedad, velocidad de respuesta, calidad de vida /o duración de respuesta. El anticuerpo humanizado es administrado intravenosamente (TV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta el avance de la enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida de multidosis (llenado de 20 L a una concentración de 20 mg/mL o concentración más alta) . Ejemplos de fármacos adicionales que pueden ser combinados cor. el anticuerpo en la presente para tratar cáncer de pulmón incluyen agentes quimioterapéuticos tales como carboplatina, un taxano (por ejemplo paclitaxei o docetaxel) , gemcitabina, navelbina, cispíatina, oxaíiplatina, o combinaciones de cualquiera ce estos tales como iplatir.a/?ocecaxel; anticuerpo anti-H?R-2 HERCEPTJN®, un auti-ErbB que induce apóptosis tales como 7C2 ó 7F3, en les que se incluyen variantes humanizadas o de afinidad-madura de los mismos; 2C4 o 2C4 humanizado; ctro anticuerpo anti-TGF-beta (por ejemplo, un anticuerpo TGF-moneclonal) ; un inhibidor de farnesil trasferasa; un agente anti-angiogénico (por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF) ; un fármaco ?GFR-apuntado (por ejemplo C225 ó ZD1839) ; una citocina (por ejemplo IL-2, IL-12, G-CSF ó GM-CSF); o combinaciones de los anteriores.

Ejemplo 6 Terapia de Cáncer Colorrectal El anticuerpo humanizado en la presente es indicado como un solo agente para tratamiento ?e cáncer coiorrectal etasfático. Les puntos finales primarios para eficacia incluyen veleci?ad de respuesta y seguridad. Los puntos finales de eficacia secundarios ín.ciuyen: sobrevivencia global, tiempo ai avance de la enfermedad, calidad de vida y/o duración de respuesta. El anticuerpo humanizado es administrado intravenosamente (IV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente, hasta ei avance de la enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida de multidcsis (llenado de 20 L a una concentración de 20 mg/mL o concentración más alta) .

El anticuerpo humanizado es también indicado en combinación con quimioterapia para tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal metastático. Los puntos finales primarios para la eficacia incluyen sobrevivencia global en comparación ccn terapia estándar y seguridad. Los puntos finales de eficacia secundaria incluyen: ciempo al avance de la enfermedad, velocidad de respuesta, calidad de vida y/o duración de respuesta. El anticuerpo humanizado es administrado intravenosamente (TV) semanalmente o cada tres semanas a 2 ó 4 mg/kg, respectivamente hasta ei avance de la enfermedad. El anticuerpo es suministrado como una formulación líquida de multidcsis (llenado ?e 20 mL a una concentración de 20 mg/mL o concentración más alta) . Ejemplos de agentes quimioterapéuticos usados para tratar cáncer colorrectal que pueden ser combinados con el anticuerpo humanizado que enlaza a TGF-beta incluyen 5-fluorouracilo (5-FU) , leucovorina (LV) , CPT-11, levamisol, o combinaciones de cualquiera de dos o más de estos, por ejemplo 5-FÜ/LV/CPT-1Í . Dosificaciones estándar de tales agentes quimioterapéuticos pueden ser administradas. Otros fármacos que pueden ser combinados con el anticuerpo anti-TGF-beta para tratar cáncer colorrectal incluyen un inhibidor de farnesil trasferaea; un agente anti-angiogénico (por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF) ; un fármaco EGFR-apuntado (por ejemplo C225 ó ZD1839); una citocina (por ejemplo IL-2, IL-12, G-GSF ó GM-CSF) ; un anticuerpo anti-HER-2 HERCEPTI Q o un anticuerpo anti-Erb3 que induce apóptcsis tal como "?c2 ó E3, en los que se incluyen variantes hnmanizaaas o ?e afinidad-madurada de los mism.es; 2C4 o 2C4 humanizado; otro anticuerpo anti-TGF-beta (por e emplo, un anticuerpo TGF-beta or.cclor.al) ; o combinaciones de les anteriores. Dado la función posible ?el TGF-beta en cáncer de colon, el anticuerpo puede ser probado en modelos de cáncer de colon (por ejemplo HT29 y IICTÍ16) y se espera que funcionen.

Ejemplo 7 Terapia de Melanoma Los resultados del anticuerpo monoclonal 2G7 en este ejemplo sugieren que los anticuerpos humanizados en la presente serían útiles para el tratamiento de melanoma maligno. El anticuerpo anti-TGF-betal murino 2G7 fue probado en modelos de animal de elancma. Específicamente, en ratones C57Black6 singénicos inyectados subcutáneamente con células de eíanoma de ratón (B16F10 ó B16316) , tratamiento con anti-TGF-beta (2G7) a 25 mg/kg 3x/semana intraperitonealmente disminuye el tamaño de tumor primario en relación con el tratamiento con el control de IgG isotipo-correspondiente (anticuerpo anti-arabrosía) (a 25 mg/kg 3x/semana intraperitonealmente) (Figuras 22, 24 y 25) . En este modelo 316, el tratamiento anti-TGF-beta 2G7 también redujo el porcentaje de ratones con tumores de pulmón (esto es, incidencia ?e tumor de pulmón) (figura 2ÍA) y el número de tumor de pulmón (figura 21E) en relación cor. el control, paira cada método de cuantíficación de tumor, eso es conteo superficial ("superficie"), examinación histológica ("patología"), cuant ficación de todos ios tumores visibles después de la elaboración del tejido transparente ("despejado") o por medio del uso ?e ro ografía icrocomputada ("CT"j . Véanse también figuras 23 y 26) . Células de tumor Calu-6 (carcinoma de pulmón de célula ne pequeña humano) (American Type Culture Coliection (ATCC) , Manassas, VA) se encontró que producen TGF-beta in vitro. Las células Caiu-6 en la expresión de VSGF y SMA en fibroblastos in vitro, un efecto el cual fue inhibido por tratamiento con el anticuerpo anti-TGF-beta murino 2G7. Estos resultados sugieren, sin estar limitados por alguna teoría, que el TGF-beta puede estar involucrado en la activación de células estromales en el ambiente ?e tumor. Xenotrar.spiantes de estas células se efectuaron a ratones desnudos (véase por ejemplo, Gourdeau et al., Mol Cáncer Ther., 3:1375-1384 (2004)) y el volumen de tumor fue probado después de tratamiento con el anticuerpo de TgG2b ?e control usado en el experimento 16 anterior (a 25 mg/kg 3x/semana intraperitcnealmeute) , junto con un anticuerpo anti-V?GF (A461) (a 5 mg/kg 3x/semana intraperitonealmente) , anticuerpo anti-TGF-beta murine 2G7 (a 25 mg/kg 3x/semana intraperitoneaimente), y una combinación de 2G7 y A461 (dosificación como antes) . Los resultados de volumen de tumor y peso de tumor, mostrados en las figuras 27 28, respectivamente, indican que la combinación de 2G7 y el anticuerpo anti-VEGF fue ei tratamiento más superior, seguido por eí anticuerpo 2G7. Los resultados muestran que les dos anticuerpos (anti-TGF-beta y anti-VEGF) son aditivos y/o actúan de manera sinergística entre sí. En base a estos datos, se espera que los anticuerpos humanizados en la presente también reducirán los tumores primarios y secundarios involucrados en melanoma maligno. Específicamente, el anticuerpo humanizado H2NI.V5L puede ser probado en dos modelos en ios cuales se demostró eficacia con el anticuerpo murino 2G7. 1) Células de elancma ?e ratón (B16) a ratones singéníccs y 2) Células ?e tumor Calu-6 (NSCLC humano) como xenotransplantes a ratones desnudos. En el modelo 316, las células son implantadas subcutáneamente a ratones. En ambos modelos, el tratamiento con varios anticuerpos anti-TGF-beta en los que se incluyen H2NI.V5L (25 mg/kg 3x/semana) o anticuerpos de control (25 mg/kg 3x/se ana) empieza cuando un tumor palpable está presente. Los tumores son medidos 2-3 veces por semana.

Antes de las pruebas de cualquier anticuerpo, la capacidad de E2NI.V5L para inhibir el crecimiento de célula de fibroblasto inducido por TGF-beta (MIH3T3) es indagado. En la parte de Fc de ratón ?e H2NI.V5L no se requiere la actividad en ratones, entonces se espera que H2NT.V51 tendrá la misma actividad como o mejor actividad que, el 2G7 monocicnai de ratón original en ratones. Si la parte de Fc de ratón del anticuerpo es requerida para actividad en ratones, entonces r.o se espera que H2NI.V5L sea tan efectivo como el 2G7 monoclcnal de ratón original en estudios de ratón. Sin embargo, se espera que E2NI.V5L (y ios otros anticuerpos humanizados como se reivindica en la presente) siga sien?o efectivos en humanos, puesto que el Fc humano será activo en el mismo.

Ejemplo 8 Farmacocinética de Anticuerpo 2G7 en Ratones Normales y Ratones que llevan Tumor Ei propósito er. ía presente es evaluar las características farmacocinétícas (PK) del 2G7 anti-TGF-beta murino en ratones normales contra ratones que llevan tumor. Diseño de Estudio: El raa?eio de animal fueron ratones 3alb/c que llevan tumores mamarios inducidos por célula 4T1. La dosificación fue una sola dosis de 43 mg/kg en cuatro grupos: - Grupo 1 : Ratones que no llevan tumor IV - Grupo 2: Ratones que llevan tumor IV - Grupo 3: Ratones que llevan tumor I? - Grupo : Ratones que llevan tumor SC N = 3 ratones por grupo per punto en el tiempo. Cada ratón sangró 3 veces. El suero fue recolectada para el ELISA ce anti-TGF-beta m rir.o a 5, 15, 30, 60 minutos; 3, 6, 24 horas; 3, 7, 10, 14, 21 días.

Resultados : Los resultados demuestran que el perfil de eliminación de anti-TGF-beta murino se aprecia más rápido en ratones que llevan tumor que en ratones normales. Además, hay más de 95% de biodisponibilidad del anticuerpo enseguida tanto de las rutas de administración IP como SC. La vida media fue de 2-3 días en las ratones que llevan tumor. .Así, el perfil de PK para el anticuerpo 2G7 parece ser aceptable. En ei ratón normal, la vida media del anticuerpo fue de 4 días, que está dentro ?el intervalo de aquel observado para otros anticuerpos y proteínas de fusión en ratones normales. En los ratones que llevan tumor, ei despeje del anticuerpo fue de aproximadamente 2 veces más rápido, el cual no es probablemente un factor a este nivel de dosis. La biodisponibilidad de más ?e 95% indica que la administració IP o SC es una ruta apropiada para las terapias. La vida media de scpoi ;a un regi ;n de dosipcacicn ce Z-J veces semana_mente ,

Claims (1)

1. KSIVIIfDICACIOMES 1. Un anticuerpo humanizado que se enlaza a un TGF-beta caracterizado porque comprende un dominio pesado variable (VH) que comprende residuos de región hipervariable no humanos incorporados a un dominio V« humano, el dominio variable comprende una sustitución de región estructural (FR) e S?Q ID NO: 6 en una posición seleccionada de grupo que consiste de 48, 49, 67, 69, 71, 73 y 78, utilizando ei sistema de numeración resumido en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) . 2. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende sustituciones de FR en posiciones 49, 67 y 71. 3. Ei anticuerpo humanizado de conformidad ccn la reivindicación 2, caracterizado porque en pcsición 49, la alanina es cambiada a glicina, en posición 67 a fe ílalanina es cambiada a una alanina y en posición 71, la arginina es cambiada a una alanina. . Ei anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, carácter!za?o comprende sustituciones de FR en posiciones 48, 49 y 71. 5. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porsue en posición 48, la valina es cambiada a una isoleucina, en posición 49, la aianina es cambiada a una glicina y en posición 71, ia arginina es camelada a una apanina . 6. El anticuerpo humanizado de conformidad ccn ia reivindicación 1, caracterizado porque comprende sustituciones de FR en posiciones 49, 69 y 71. 7. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque en posición 49, la alar.ina es cambiada a una glicina, en posición 69 la isoleucina es cambiada a una leuciua y en posición 71, la arginina es cambiada a una alamina . 8. El anticuerpo humanizado de conformidad con ia reivindicación 6, caracterizado porsue una sustitución de FR es en poeición 73. 9. El anticuerpo humanizado de conformidad con ia reivindicación 8, caracterizado porsue en posición 73, ia asparagina es cambiada a una lisina. 10. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende sustituciones de FR en posiciones 49, 71 y 73. 11. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque en posición 49, la alanina es cambiada a glicina, en posición 71, la arginina es cambiada a una alanina y en posición 73, la asparagina es cambiada a una usina. 12. El anticuerpo humanizado de conformidad con ia reivindicación 1, caracterizado porque comprende sustituciones de FR en posiciones 49, 71 y 78. 13. Ei anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque en posición 49, la aianina es cambiada a una giicina, en posición 71, la arginina es cambiada a una alar.ina y en posición 78, la leucina es cambiada a una alanina. 14. El anticuerpo humanizado de conformidad, con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, caracterizado porque comprende residuos de región que determina la ccmpiementareidad (CDR) de dominio ligero variabie (VJ RASQSVLYSSNQKKYLA (SEO ID NO: 36) ó RASQGISSYLA (S?Q ID NO: 37); ASTRES (SEQ ID NO: 38) ó YASSLQS (S?Q ID NO: 39); y HQYLSSDT (SEQ ID NO: 40). 15. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 caracterizado porque comprende residuos de región que determina la complementareidad (CDR) de dominio de ligero variable [M- RASQSVLYSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 36); WASTRES (SEQ ID NO: 38); y HQYLSSDT (S?Q ID NO: 40) . 16. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, caracterizado porque comprende la secuencia de aminoácidos de dominio VL en S?Q ID NO: 3. 17. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-26, caracterizado porque comprende residuos de región que determina la complementareidad (CDR) de dominio Vfc GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 41); VNNPGSGGSNYÍJEKFKG (SEQ ID NO: 4,2) é VIMPGSGGSNYNEKFKG (SEQ ID NO: 43); y SGGFYFDY (SEQ ID NO: 44). 18. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque comprende residuos ce región que determina la complementareidad (CDR) de dominio Vt GYAFTNYLIE (SEO ID NO: 41); VINPGSGGSNY EKFKG (SEQ ID NO: 43); y SGGFYFDY (SEQ ID NO: 44). 19. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizado porque comprende residuos de región que determina la compiementarei?ad (CDR) de dominio V3 GYAFTKYLIE (SEQ ID NO: 41); VINPGSGGSNYN?KFKG (SEQ ID NO: 43); y SGGFYFDY (SEQ ID NO: 44). 20. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 ó 14-18, caracterizado p comprende las secuencias de aminoácidos ce dominio VH en SEQ ID NO: 4. 21. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracteriza?o porque es un anticuerpo IgGl intacto. 22. El anticuerpo humanizado de conformidad con ruiera de las reivindicaciones 1-2C, caracteriza?o porque es un fragmento de anticuerpo. 23. El anticuerpo humanizado de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque es un fragmento de Fab. 24. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-23, caracterizado porque no es conjugado con un agente citotóxico. 25. El anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-23, caracterizado porque es conjugado con un agente citotóxico. 26. Una composición caracterizada porsue comprende un anticuerpo humanizado de conformidad cor. cuaiquiera de las reivindicaciones 1-25 y un portador. 27. ün ácido nucleico aislado caracterizado porsue codifica el anticuerpo humanizado de conformidad con cuaiquiera de las reivindicaciones 1-25. 28. Un vector caracterizado porque comprende el ácido nucleico ?e conformidad con la reivindicación 27. 29. Una célula huésped caracterizado porsue comprende eí ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 27. 30. Un proceso para la producción de un anticuerpo humanizado que comprende cultivar la célula huésped de conformidad con la reivindicación 29, de tal manera que el ácido nucleico es expresado y el antieueroc producido. 31. ?l procese de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque comprende además recuperar el anticuerpo ael cultivo de célula huésped. 32. ?l proceso ?e conformidad con la reivindicación 31, caracteriza?o porque el anticuerpo es recuperado del medio de cultivo de célula huésped. 33. El proceso de conformidad ccn cualquiera de las reivindicaciones 30-32, caracterizado poraue, antes del cultivo, la célula huésped es co-transfectada con un vector que comprende acide nucleico que codifica un dominio pesado variable y con un vector que comprende ácido nucleico que co?ifica un deminio ligero variable. 34. ün método para el tratamiento de une alteración ?e TGF-beta en un mamífero, caracterizado porque comprende ía administración ai mamífero de una cantidad efectiva del anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25. 35. El método de conformidad con ia reivindicación 34, caracterizado porsue el mamífero es un primate. 36. El método de conformidad con la reivindicación 34 ó 35, caracteriza?o porque el mamífero es un humano. 3Y El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34-36, caracterizado porque la alteración es fibrosis, una lesión arterial, una infección, artritis reumateide o cáncer. 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el cáncer es cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer rectal, cáncer ae pulmón, cáncer de pecho, cáncer de ovarios o elanoma maligno. 39. ?l método ?e conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 34 a 38, caracterizado perqué comprende además administrar una cantidad efectiva ?e un agente terapéutico diferente ai anticuerpo humanizado al mamífero. 40. ?i método de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el agente terapéutico es un agente quimioterapéutico, agente citotóxico, citocina, agente inhibidor de crecimiento, agente anti-angícgénico o un anticuerpo. 41. ?l método de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porsue el agente terapéutico es un agente anti-angíogenico . 42. ?i método de conformidad co cuaíquíera de las reivindicaciones 39-41, caracterizado porque el agente terapéutico es un anticuerpo. 43. ?i método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque ei anticuerpo se enlaza al factor de crecimiento endoteiial vascular. 44. ?i método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza al antígeno Her-2. 45. ?i método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42-44, caracterizado porsue el anticuerpo es un anticuerpo intacto. 46. ?l método de conformidad con cuaiquiera de las reivindicaciones 42-44, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. 47. ?l método de conformidad con la reivindicación 46, caracterizado porque el fragmento de anticuerpo es un fragmento Fab . 48. ?í método de conformidad con cuaiquiera de las reivindicaciones 42-47, caracterizado porque el anticuerpo es conjugado con un agente citotóxico. 49. ?l método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42-47, caracterizado porque ei anticuerpo no es conjugado con un agente citotóxico. 50. ün método para detectar un TGF-beta en una muestra corporal caracterizado porque comprende poner en contacto el anticuerpo humanizado de conformidad con cuaiquiera de las reivindicaciones 1-25 con la muestra corporal y determinar si ha ocurrido el enlace de anticuerpo ai TGF-beta. 51. ün artículo de manufactura caracterizado porque comprende un recipiente que contiene el anticuerpo humanizado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25 e instrucciones que instruyen al usuario a tratar una alteración de TGF-beta en un mamífero con el anticuerpo en una cantidad efectiva. 52. ?i artículo ?e conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque comprende a?icionalmente un recipiente que contiene un agente terapéutico diferente al anticuerpo humanizado, en ?onde las instrucciones instruyen al usuario a tratar la alteración cor. el anticuerpo en combinación con ei agente en cantidades efectivas. 53. El artículo de conformidad co la reivindicación 51 ó 52, caracterizado porque el mamífero es un humano. 54. ün método para tratamiento de cáncer en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva de un anticuerpo TGF-beta y un anticuerpo que se enlaza al factor de crecimiento endotelial vascular. 55. ?l método de conformidad con ia reivindicación 54, caracterizado porsue el mamífero es un humano. 56. El método de conformidad con la reivindicación 54 ó 55, caracterizado porque ei anticuerpo TGF-beta se enlaza a cualquiera o más de los siguientes: TGF-betal, TGF-beta2, y TGF-beta3. 5? ?l método de conformidad con cuaiquiera de las reivindicaciones 54-56, caracterizado porsue el anticuerpo se enlaza a TGF-betal. o8. rr>í método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54-57, caracterizado porque el anticuerpo se enlaza a TGF-betal y TCF-beta2. ANTICUERPOS ANTI-TGF-BETA HUMANIZADOS Se proporcionan anticuerpos anti-TGF-beta, también como métodos para su preparación y uso, en los que se incluyen métodos para el tratamiento de alteraciones TGF-beta, por ejemplo cáncer. También se proporcionan artículos de manufactura diseñados para varios usos que contienen los anticuerpos humanizados.