ES2711213T3 - Anticuerpos de TGFbeta - Google Patents

Abstract

Una molécula de anticuerpo que se une y neutraliza TGFß1, TGFß2 y TGFß3 humanos, en donde dicha molécula de anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio VH PET1073G12, que es SEQ ID NO: 2, y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos del dominio VL PET1073G12, que es SEQ ID NO: 7, y en donde la región constante de cadena pesada es una región constante de anticuerpo humano a partir de IgG4.

Description

DESCRIPCION

Anticuerpos de TGFp

Campo tecnico de la invencion

La presente invencion se refiere a moleculas de anticuerpos, en particular, a moleculas de anticuerpos que se unen al factor de crecimiento transformante beta (TGFp), y a usos de estas. Mas particularmente, la invencion se refiere a moleculas de anticuerpos que se unen y, preferiblemente, neutralizan las moleculas de anticuerpos de TGFpl, TGFp2 y TGFp3, denominadas "pan-especificas", y a usos de dichas moleculas de anticuerpos

Antecedentes

El TGFp se identifico por primera vez en 1981 (Roberts et al., 1981). En los seres humanos existen tres isoformas: El TGFp1, TGFp2 y TGFp3 (numeros de acceso Swiss Prot P01137, P08112 y P10600 respectivamente) que, en su estado biologicamente activo, son homodimeros de 25 kDa que comprenden dos monomeros de 112 aminoacidos unidos por medio de un puente disulfuro intercatenario. TGFp1 difiere de TGFp2 en 27 y de TGFp3 en 22 cambios de aminoacidos principalmente conservadores. Estas diferencias se han mapeado en la estructura 3D de TGFp determinada por cristalografia de rayos X (Schlunegger et al., 1992; Peer et al., 1996) y se han definido las regiones de union al receptor (Griffith et al., 1996; Qian et al., 1996).

Los TGFp humanos son muy similares a los TGFp de raton: el TGFp1 humano tiene solo una diferencia de aminoacidos con respecto al TGFp1 de raton, el TGFp2 solo tiene tres diferencias de aminoacidos con respecto al TGFp2 de raton y el TGFp3 humano es identico al TGFp3 de raton. Como resultado, la produccion de anticuerpos de TGFp humanos en ratones, incluidos ratones transgenicos, puede ser dificil.

Los TGFp son citocinas multifuncionales que estan implicadas en proliferacion y diferenciacion celular, en desarrollo embrionico, formacion de matriz extracelular, desarrollo oseo, cicatrizacion de heridas, hematopoyesis, y respuestas inmunes e inflamatorias (Border et al., 1995a). La desregulacion de los TGFp lleva a procesos patologicos que, en seres humanos, han estado implicados en numerosas condiciones, por ejemplo, defectos de nacimiento, cancer, enfermedades inflamatorias cronicas, autoinmunes y fibroticas (Border et al., 1994; Border et al., 1995b).

Se han llevado a cabo estudios en muchos modelos animales fibroticos (Border et al., 1995b; Border et al., 1994), utilizando anticuerpos neutralizantes como antagonistas, por ejemplo, glomerulonefritis (Border et al., 1990), cicatrizacion neural (Logan et al., 1994), cicatrizacion dermica (Shah et al., 1994) y fibrosis pulmonar (Giri et al., 1993). Todas las enfermedades representadas por estos modelos representan una necesidad no cubierta de nuevos productos terapeuticos (Bonewald, 1999; Jackson, 1998). Sin embargo, los anticuerpos utilizados en estos y otros estudios en animales se han producido en animales y su beneficio terapeutico en seres humanos puede ser limitado debido a su potencial a inducir respuestas inmunogenicas y a su rapido aclaramiento farmacocinetico (Vaughan et al., 1998). Los anticuerpos humanos son mas deseables para tratamiento de enfermedades mediadas por TGFp. Se conoce que una variedad de fragmentos de anticuerpo son capaces de unirse a una proteina diana especificamente y con buena afinidad. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo que comprenden solo los dominios variables de cadena pesada (VH) y variables de cadena ligera (VL) unidos conjuntamente por medio de un peptido de union corto, conocido como Fv de cadena sencilla (scFv), se han utilizado ampliamente. Los anticuerpos humanos que neutralizan TGFp1 (CAT-192) o TGFp2 (Ca T-152 o Trabio™) se han generado anteriormente (EP 0 945464, EP 0853661, Thompson et al. 1999). Sin embargo, la mayoria de anticuerpos de TGFp disponibles en la tecnica son no humanos. Ademas, antes de esta invencion, los unicos anticuerpos monoclonales pan-especificos contra el TGFp eran de roedores.

Los anticuerpos policlonales que se unen a TGFp1 humano y TGFp2 humano contra tanto epitopes neutralizantes como no neutralizantes se han producido en conejos (Danielpour et a/.1989b; Roberts et al., 1990), pollos (R&D Systems, Minneapolis, EE. UU.) y pavos (Danielpour et al., 1989c). Los peptidos que representan secuencias de TGFp parciales tambien se han utilizado como inmunogenos para producir antisueros policlonales neutralizantes en conejos (Border et al., 1990; Flanders et al., 1988). Los anticuerpos policlonales no humanos de este tipo son inadecuados para uso terapeutico humano.

El 1D11.16 es un anticuerpo anti-TGFp pan-especifico murino que neutraliza TGFp1, TGFp2 y TGFp3 humanos y de raton en un amplio intervalo de ensayos in vitro (Dasch et al., 1989; Dasch et al., 1996; R&D System ficha de producto para MAB1835) y es eficaz en estudios de prueba de principio en modelos animales de fibrosis (Ling et al., 2003; Miyajima et al., 2000; Schneider et al., 1999; Khanna et al., 1999; Shenkar et al., 1994). Sin embargo, ya que el 1D11.16 es un anticuerpo monoclonal murino (Dasch et al., 1989; Dasch et al., 1996), es inadecuado para uso terapeutico en seres humanos.

La publicacion internacional WO 2004/098637 se refiere a antagonistas de TGF-beta combinados con antagonistas del sistema renina-angiotensina-aldosterona para tratar insuficiencia renal, y se refiere a anticuerpos monoclonales murinos 1D11.16.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 muestra la neutralizacion (% de inhibicion) de produccion de fibronectina inducida (10 pM) de TGFp1 (a), TGFp2 (b) o TGFp3 (c) a partir de celulas NHLF por medio de IgG4 (cuadrados cerrados) y 1D11.16 (circulos abiertos) germinales PET1073G12. El triangulo cerrado representa un IgG4 irrelevante sometido a ensayo en la concentracion mayor (100 nM). Los datos se muestran como la media ± media SE de n experimentos llevados a cabo por duplicado. Para los valores IC⁵⁰, vease la Tabla 2.

La Figura 2 muestra la neutralizacion (% de inhibicion) de produccion de fibronectina inducida (10 pM) de TGFp1 (a), TGFp2 (b) o TGFp3 (c) a partir de celulas NHLF por medio de IgG4 (cuadrados cerrados) y 1D11.16 (circulos abiertos) germinales PET1074B9. El triangulo cerrado representa un IgG4 irrelevante sometido a ensayo en la concentracion mayor (100 nM). Los datos se muestran como la media ± media SE de n experimentos llevados a cabo por duplicado. Para los valores IC⁵⁰, vease la Tabla 2.

La Figura 3 muestra la neutralizacion (% de inhibicion) de produccion de fibronectina inducida (10 pM) de TGFp1 (a), TGFp2 (b) o TGFp3 (c) a partir de celulas NHLF por medio de IgG4 (cuadrados cerrados) y 1D11.16 (circulos abiertos) germinales PET1287A10. El triangulo cerrado representa un IgG4 irrelevante sometido a ensayo en la concentracion mayor (100 nM). Los datos se muestran como la media ± media SE de n experimentos llevados a cabo por duplicado. Para los valores IC⁵⁰, vease la Tabla 2.

Compendio de la invencion

Basada en la descripcion contenida en este documento, la presente invencion proporciona una molecula de anticuerpo que se une y neutraliza TGFp1, TGFp2 y TGFp3 humanos, en donde dicha molecula de anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos del dominio VH PET1073G12, que es SEQ ID NO: 2, y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos del dominio VL PET1073G12, que es SEQ ID NO: 7, y en donde la region constante de cadena pesada es una region constante de anticuerpo humano a partir de IgG4.

La presente invencion proporciona ademas una composicion que comprende la molecula de anticuerpo de la invencion.

La presente invencion incluso proporciona un acido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una molecula de anticuerpo segun la invencion, o un dominio VH y un dominio VL de dicha molecula de anticuerpo.

La presente invencion proporciona tambien una celula huesped que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el dominio VH de una molecula de anticuerpo de la invencion y una secuencia de nucleotido que codifica el domino VL de dicha molecula de anticuerpo.

La presente invencion incluso proporciona un metodo para producir una molecula de anticuerpo que comprende cultivar una celula huesped que comprende:

1) una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio variable VH, y

2) una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio variable VL,

de la molecula de anticuerpo segun la invencion en condiciones para producir dicha molecula de anticuerpo y aislar y/o purificar dicha molecula de anticuerpo.

La presente invencion proporciona tambien una molecula de anticuerpo de la invencion para su uso en el tratamiento de una enfermedad fibrotica, en donde la enfermedad fibrotica se selecciona de entre fibrosis renal, fibrosis pulmonar o fibrosis de pulmon.

La presente invencion proporciona tambien una molecula de anticuerpo de la invencion para su uso en el tratamiento de cancer.

La presente invencion proporciona tambien una molecula de anticuerpo de la invencion para su uso en el tratamiento de enfermedad mediada por el sistema inmune.

La presente invencion proporciona tambien una molecula de anticuerpo de la invencion para su uso en el tratamiento de enfermedad renal.

Otras realizaciones de la presente invencion se describen en las reivindicaciones anejas.

En varios aspectos de la invencion se proporciona la materia de las realizaciones incluidas a continuacion. Otros aspectos y realizaciones de la invencion se describen en la descripcion en este documento.

La presente descripcion proporciona miembros de union especificos para TGFp, en particular, TGFp humano. Los miembros de union especificos que se dirigen a TGFp1, TGFp2 y TGFp3 se proporcionan particularmente. Los casos preferidos en la presente descripcion son moleculas de anticuerpo, tanto anticuerpos completos (por ejemplo, IgG, tales como IgG 1 o IgG4) como fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, scFv, Fab, dAb). Se proporcionan regiones de union a antigeno y sitios de union a antigeno de anticuerpos, como son los dominios VH y VL de anticuerpo que contienen regiones de este tipo. En los dominios VH y VL se proporcionan regiones determinantes de complementariedad, CDR, que se pueden proporcionar en diferentes regiones estructurales, FR, para formar dominios VH o VL segun sea el caso. Un sitio de union a antigeno puede consistir en un dominio VH y/o dominio VL o porciones de union a antigeno de estos.

En un aspecto, la presente descripcion proporciona un miembro de union especifico para TGFp humano, que comprende un sitio de union a antigeno de un anticuerpo, un conjunto de HCDR, un conjunto de LCDR, o ambos y/o un dominio VH, dominio VL de anticuerpo humano o ambos.

El conjunto de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 puede tener secuencias seleccionadas de entre los siguientes grupos: HCDR1 SEQ ID NO: 3, HCDR2 SEQ ID NO: 4, HCDR3 SEQ ID NO: 5 (referido en este documento como el conjunto de "PET1073G12 de HCDR");

HCDR1 SEQ ID NO: 13, HCDR2 SEQ ID NO: 14, HCDR3 SEQ ID NO: 15 (referido en este documento como el conjunto de "PET1074B9 de HCDR");

HCDR1 SEQ ID NO: 23, HCDR2 SEQ ID NO: 24, HCDR3 SEQ ID NO: 25 (referido en este documento como el conjunto de "PET1287A10 de HCDR").

El conjunto de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 puede tener secuencias seleccionadas de entre los siguientes grupos: LCDR1 SEQ ID NO: 8, LCDR2 SEQ ID NO: 9, LCDR3 SEQ ID NO: 10 (referido en este documento como el conjunto de "PET1073G12 de LCDR");

LCDR1 SEQ ID NO: 18, LCDR2 SEQ ID NO: 19, LCDR3 SEQ ID NO: 20 (referido en este documento como el conjunto de "PET1074B9 de LCDR");

LCDR1 SEQ ID NO: 28, LCDR2 SEQ ID NO: 29, LCDR3 SEQ ID NO: 30 (referido en este documento como el conjunto de "PET1287A10 de LCDR").

El conjunto PET1073G12 de HCDR junto con el conjunto PET1073G12 de LCDR se refiere en este documento como el conjunto PET1073G12 de CDR.

El conjunto PET1074B9 de HCDR junto con el conjunto PET1074B9 de LCDR se refiere en este documento como el conjunto PET1074B9 de CDR.

El conjunto PET1287A10 de HCDR junto con el conjunto PET1287A10 de LCDR se refiere en este documento como el conjunto PET1287A10 de CDR.

Un dominio VH que comprende un conjunto de HCDR tal como se describe en este documento se proporciona tambien por la presente descripcion, como lo es por separado un dominio VL que comprende un conjunto de LCDR tal como se describe en este documento. Preferiblemente, un dominio VH de este tipo se aparea con un domino VL de este tipo y, de manera mas preferida, los apareamientos de los dominios VH y VL son los mismos en los clones tal como se expone en este documento.

Se proporciona, ademas, por medio de la presente invencion, un dominio VH que comprende un conjunto de HCDR HCDR1, HCDR² y HCDR3 en donde el conjunto de hCd R se corresponde con aquel para PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 con una o dos sustituciones de aminoacidos.

Se proporciona ademas, por medio de la presente invencion, un dominio VL que comprende un conjunto de LCDR LCDR1, LCDR2 y LCDR3 en donde el conjunto de CDR se corresponde con aquel para PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 con una o dos sustituciones de aminoacidos.

Un miembro de union especifico que comprende un sitio de union a antigeno de un anticuerpo en un dominio VH y/o VL de este tipo se proporciona tambien por medio de la presente descripcion.

Siguiendo la pista de la quimica computacional en aplicar tecnicas de analisis de datos multivariantes a las relaciones estructura/propiedad-actividad (Wold, et al. Multivariate data analysis in chemistry. Chemometrics -Mathematics and Statistics in Chemistry (Ed.: B. Kowalski), D. Reidel Publishing Company, Dordrecht, Holanda, 1984 (ISBN 90-277-1846-6)), las relaciones cuantitativas actividad-propiedad de anticuerpos se pueden derivar utilizando tecnicas matematicas conocidas tales como regresion estadistica, reconocimiento y clasificacion de patrones (Norman et al. Applied Regression Analysis. Wiley-Interscience; 3a edicion (Abril 1998) ISBN: 0471170828; Abraham Kandel, Eric Backer. Computer-Assisted Reasoning in Cluster Analysis. Prentice Hall PTR; (11 de mayo, 1995), ISBN: 0133418847; Wojtek Krzanowski. Principles of Multivariate Analysis: A User's Perspective (Oxford Statistical Science Series, N.° 22 (Documento)). Oxford University Press; (Diciembre 2000), ISBN: 0198507089; Ian H. Witten, Eibe Frank. Data Mining: Practical Machine Learning Tools and Techniques with Java Implementations. Morgan Kaufmann; (11 de octubre, 1999), ISBN: 1558605525; David G. T. Denison (Editor), Christopher C. Holmes, Bani K. Mallick, Adrian F. M. Smith. Bayesian Methods for Nonlinear Classification and Regression (Wiley Series in Probability and Statistics). John Wiley & Sons; (Julio 2002), ISBN: 0471490369; Arup K. Ghose, Vellarkad N. Viswanadhan. Combinatorial Library Design and Evaluation Principles, Software, Tools, and Applications in Drug Discovery. ISBN: 0-8247-0487-8). Las propiedades de anticuerpos se pueden derivar a partir de modelos empiricos y teoricos (por ejemplo, analisis de residuos de contacto probables o propiedad fisicoquimica calculada) de la secuencia del anticuerpo, estructuras funcionales y tridimensionales y estas propiedades se pueden considerar individualmente y en combinacion.

El analisis de anticuerpos de estructura atomica conocida ha elucidado las relaciones entre la secuencia y la estructura tridimensional de los sitios de union a anticuerpo (Chothia C. et al. Journal Molecular Biology (1992) 227, 799-817; Al-Lazikani, et al. Journal Molecular Biology (1997) 273(4), 927-948). Estas relaciones implican que, excepto para la tercera region (bucle) en dominios VH, los bucles de los sitios de union tienen una de un pequeno numero de conformaciones de cadena principal: estructuras canonicas. La estructura canonica formada en un bucle particular ha mostrado estar determinada por su tamano y la presencia de ciertos residuos en sitios clave tanto en el bucle como en regiones estructurales (Chothia et al. and Al-Lazikani et al., supra).

Este estudio de relacion secuencia-estructura se puede utilizar para predecir aquellos residuos en un anticuerpo de secuencia conocida, pero de una estructura tridimensional desconocida, los cuales son importantes para mantener la estructura tridimensional de sus bucles de CDR y, por consiguiente, para mantener la especificidad de union. Estas predicciones se pueden confirmar al comparar las predicciones con el resultado de experimentos de optimizacion lider. En un planteamiento estructural, un modelo teorico se puede crear de la molecula de anticuerpo (Chothia, et al. Science, 223, 755-758 (1986)) utilizando cualquier paquete de libre disposicion o comercial como WAM (Whitelegg, N.R.u. and Rees, A.R (2000) Prot. Eng., 12, 815-824). Entonces, se puede utilizar un paquete de software de visualizacion de proteina y analisis tal como Insight II (Accelerys, Inc.) o Deep View (Guex, N. y Peitsch, M.C. Electrophoresis (1997) 18, 2714-2723) para evaluar posibles sustituciones en cada posicion en el CDR y FR. Esta informacion se puede utilizar entonces para hacer sustituciones que probablemente tengan un efecto minimo o beneficioso en la actividad.

Las tecnicas requeridas para hacer sustituciones en secuencias de aminoacidos de CDR, dominios VH o VL de anticuerpo y miembros de union especificos generalmente estan disponibles en la tecnica. Se pueden hacer secuencias variantes, con sustituciones que pueden predecirse o no que tienen un efecto minimo o beneficioso en la actividad, y que se pueden someter a ensayo para la capacidad de unirse y/o neutralizar TGFp y/o para cualquier otra propiedad deseada. Esto se discute mas adelante.

Tal como ya se senalo, la presente descripcion proporciona miembros de union especificos que comprenden un conjunto definido de CDR, en particular, el conjunto de CDR de PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10, y conjuntos de CDR de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 con una o mas sustituciones en el conjunto de CDR.

El conjunto relevante de CDR se proporciona en regiones estructurales de anticuerpo u otro andamiaje proteico, es decir, fibronectina o citocromo B. Preferiblemente, se emplean regiones estructurales de anticuerpo.

En un caso preferido, la cadena pesada utiliza un gen de la familia V^h1 humano. En varios casos, la secuencia estructural de aminoacidos de cadena pesada contiene 1-12, preferiblemente 3-12 y mas preferiblemente 3-8 diferencias de aminoacidos en comparacion con la secuencia de aminoacidos germinal del gen de la familia VH1. En algunos casos, la secuencia de estructura de la cadena pesada es la secuencia germinal. En casos particularmente preferidos, la region estructural de anticuerpo para la cadena pesada puede ser DP-10 humano (V^h 1-69) o DP-88 humano (V^h 1-e) de la familia V^h1. Preferiblemente, los casos que utilizan un gen DP-10 humano tienen un aminoacido no germinal en los residuos 27, 78 y 94. En algunos casos, el residuo 27 es tirosina, el residuo 78 es treonina y el residuo 94 es serina o leucina. En algunos casos, la cadena ligera utiliza un gen de la familia Vk3 humano con 1-5, preferiblemente 1-4, mas preferiblemente 1-3 diferencias de aminoacidos en comparacion con la secuencia de aminoacidos germinales. En algunos casos, la secuencia estructural de la cadena ligera es la secuencia del gen de la familia V^k3 humano germinal. En casos particularmente preferidos, la region estructural para la cadena ligera puede ser DPK-22 humano (A27). En algunos casos de este tipo, el residuo 2 es un aminoacido no germinal. En algunos casos, el residuo 2 es una treonina.

En un caso sumamente preferido, se proporciona un dominio VH con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2, este se denomina "dominio VH PET1073G12", o SEQ ID NO: 12, este se denomina "dominio VH PET1074B9", o SEQ ID NO: 22, este se denomina "dominio VH PET1287A10".

En otro caso sumamente preferido, se proporciona un dominio VL con la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 7, este se denomina "dominio VL PET1073G12", o SEQ ID NO: 17, este se denomina "dominio VL PET1074B9", o SEQ ID NO: 27, este se denomina "dominio VL PET1287A10". Un caso sumamente preferido proporcionado segun la presente descripcion se compone del dominio VH PET1073G12, SEQ ID NO: 2, y el dominio VL PET1073G12, o SEQ ID NO: 7. Otro caso sumamente preferido proporcionado segun la presente descripcion se compone del dominio VH PET1074B9, SEQ ID NO: 12, y el dominio VL PET1074B9, o SeQ ID NO: 17. Otro caso sumamente preferido proporcionado segun la presente descripcion se compone del dominio VH PET1287A10, SEQ ID NO: 22, y el dominio VL PET1287A10, o SEQ ID NO: 27. Estos o cualquier otro sitio de union antigeno-anticuerpo proporcionado segun la presente descripcion se puede proporcionar en cualquier formato de molecula de anticuerpo deseado, por ejemplo, scFv, Fab, IgG1, IgG4, dAb, etc., tal como se discute mas adelante en este documento. En otro caso sumamente preferido, la presente descripcion proporciona una molecula de anticuerpo IgG4 que comprende el dominio VH PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, preferiblemente comprende tambien el correspondiente dominio VL PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10.

Otro IgG4 u otras moleculas de anticuerpo que comprenden el dominio VH PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, y/o el dominio VL PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 se proporcionan por medio de la presente descripcion tal como son otras moleculas de anticuerpo que comprenden el conjunto de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de HCDR en un dominio VH de anticuerpo, y/o el conjunto de PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de LCDR en el dominio VL de anticuerpo.

Es conveniente senalar aqui que "y/o", donde se utiliza en este documento, se debe tomar como una descripcion especifica de cada una de las dos caracteristicas o componentes especificados el uno con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" se debe tomar como descripcion especifica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, simplemente tal como si cada uno se expusiera individualmente en este documento.

Tal como se senalo, en ciertos casos de la presente descripcion, se proporciona un miembro de union especifico que une todas las tres isoformas de TGFp humano y que comprende los dominios VH y/o VL PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 y/o las porciones de union a antigeno de estos dominios.

En algunos casos, un dominio VH se aparea con un dominio VL para proporcionar un sitio de union a antigeno. En un caso preferido, el dominio VH PET1073G12 (SEQ ID NO: 2) se aparea con el dominio VL PET1073G12 (SEQ ID NO: 7) de modo que se forma un sitio de union a antigeno que comprende tanto los dominios VH como VL PET1073G12. En un caso preferido, el dominio VH PET1074B9 (SEQ ID NO: 12) se aparea con el dominio VL PET1074B9 (SEQ ID NO: 17) de modo que se forma un sitio de union a antigeno que comprende tanto los dominios VH como VL PET1074B9. En un caso preferido, el dominio VH PET1287A10 (SEQ ID N^o : 22) se aparea con el dominio VL PET1287A10 (SEQ ID NO: 27) de modo que se forma un sitio de union antigeno-anticuerpo que comprende tanto los dominios VH como ^v L PET1287A10. En otros casos, el VH PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 se aparea con un dominio VL distinto del correspondiente VL PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10. La promiscuidad de la cadena ligera esta bien establecida en la tecnica.

De manera similar, cualquier conjunto de HCDR descrito en este documento se puede proporcionar en un dominio VH que se utiliza como miembro de union especifico solo o en combinacion con un dominio VL. Un dominio VH se puede proporcionar con un conjunto de HCDR tal como se describe en este documento y, si un dominio VH de este tipo se aparea con un dominio VL, entonces el dominio VL se puede proporcionar con un conjunto de LCDR descrito en este documento. Un apareamiento de un conjunto de HCDR y un conjunto de LCDR puede ser tal como se describe en este documento para los anticuerpos PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10. Las regiones estructurales de los dominios VH y/o VL pueden ser estructuras germinales. Las regiones estructurales del dominio de cadena pesada se pueden seleccionar de entre la familia V^h-1, y una estructura V^h-1 preferida es la estructura DP-10 o DP-88. Las regiones estructurales del dominio de cadena ligera se pueden seleccionar de entre la familia V^k3, y una estructura este tipo preferida es la estructura DPK-22.

Uno o mas CDR se pueden tomar de un dominio VH o VL cuya secuencia se describe en este documento y se incorpora en una estructura adecuada. Esto se discute mas adelante en este documento. Lo mismo es aplicable a otros CDR y conjuntos de CDR de anticuerpos como los obtenidos utilizando metodos descritos en este documento. Un dominio VH de anticuerpo, un dominio VL de anticuerpo, un conjunto de HCDR, un conjunto de LCDR, un conjunto de CDR, uno o mas HCDR, por ejemplo, un HCDR3, y/o uno o mas LCR, por ejemplo, un LCDR3, se pueden emplear para otras moleculas, por ejemplo, metodos de mutacion y seleccion de sitios de union a antigeno con potencia mejorada.

Las variantes de dominios VH y VL, y CDR de la presente descripcion, incluidos aquellos cuyas secuencias de aminoacidos se exponen en este documento, y los cuales se pueden emplear en miembros de union especificos para TGFp, se pueden obtener por medio de metodos de alteracion o mutacion de secuencia y cribado. Metodos de este tipo se proporcionan tambien por medio de la presente descripcion.

Variantes de secuencia de aminoacidos de dominio variable de cualquiera de los dominios VH y VL, cuyas secuencias se describen especificamente en este documento, se pueden emplear segun la presente descripcion, tal como se discute. Las variantes particulares pueden incluir una o mas alteraciones (adicion, delecion, sustitucion y/o insercion de un residuo de aminoacido) de la secuencia de aminoacidos, pueden ser menos de aproximadamente 20 alteraciones, menos de aproximadamente 15 alteraciones, menos de aproximadamente 10 alteraciones o menos de aproximadamente 5 alteraciones, 4, 3, 2 o 1. Las alteraciones se pueden hacer en una o mas regiones estructurales y/o uno o mas CDR.

Segun otros aspectos de la presente descripcion, se proporciona un miembro de union especifico humano, humanizado, quimerico o sintetico que compite o compite de manera cruzada para unirse a un antigeno con cualquier miembro de union a antigeno que tanto se une al antigeno como comprende una region de union antigenoanticuerpo, dominio VH y/o VL descrito en este documento, conjunto de CDR o HCDR3 descrito en este documento, o una variante de cualquiera de ellos. La competicion entre miembros de union se puede ensayar facilmente in vitro, por ejemplo, utilizando ELISA y/o al marcar una molecula informadora especifica a un miembro de union que se puede detectar en presencia de otro(s) miembro(s) de union no marcado(s), para habilitar la identificacion de miembros de union especificos que se unen al mismo epitope o a un epitope solapado. La competicion cruzada entre miembros de union se puede ensayar sin inconvenientes al ejecutar el ensayo inverso, por ejemplo, al invertir los miembros de union marcados y no marcados para identificar pares que bloquean la union en ambas direcciones. Por lo tanto, otro aspecto de la presente descripcion proporciona un miembro de union especifico que comprende un sitio de union a antigeno de un anticuerpo que compite o compite de manera cruzada con una molecula de anticuerpo PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, en particular, un scFv y/o IgG4 PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, para unirse a TGFp. En varios casos, el anticuerpo es un anticuerpo humano, humanizado, quimerico o sintetico. En otros aspectos, la presente invencion proporciona un miembro de union especifico que comprende un sitio de union a antigeno de un anticuerpo humano, humanizado, quimerico o sintetico que compite o compite de manera cruzada con un sitio de union a antigeno de la presente invencion para unirse a TGFp, en donde el sitio de union a antigeno del anticuerpo humano, humanizado, quimerico o sintetico se compone de un dominio VH y un dominio VL, y en donde el dominio VH y VL comprende un conjunto de CDR tal como se describe en este documento.

Dada la informacion descrita en este documento, varios metodos estan disponibles en la tecnica para obtener anticuerpos humanos, humanizados, quimericos o sinteticos contra TGFp y que pueden competir o competir de manera cruzada con una molecula de anticuerpo PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, una molecula de anticuerpo con un conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de CDR, una molecula de anticuerpo con un conjunto de HCDR PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, o una molecula de anticuerpo con un conjunto de LCDR PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, para unirse a TGFp.

En otro aspecto, la presente descripcion proporciona un metodo para obtener uno o mas miembros de union especificos capaces de unirse a TGFp1, TGFp2 y TGFp3, el metodo incluye poner en contacto una biblioteca de miembros de union especificos segun la descripcion y dichos TGFp, y seleccionar uno o mas miembros de union especificos de la biblioteca capaces de unirse a todos dichos TGFp.

La biblioteca se puede mostrar en la superficie de particulas bacteriofagas, cada particula contiene acido nucleico que codifica el dominio variable VH de anticuerpo mostrado en su superficie y, opcionalmente, puede mostrar tambien un dominio VL si esta presente.

Despues de la seleccion de miembros de union especificos capaces de unirse al antigeno y mostrados en particulas bacteriofagas, el acido nucleico se puede tomar de una particula bacteriofaga que muestra dicho miembro de union especifico seleccionado. Un acido nucleico de este tipo se puede utilizar en la posterior produccion de un miembro de union especifico o un dominio variable VH de anticuerpo (y, opcionalmente, un dominio variable VL de anticuerpo) al expresarse a partir de un acido nucleico con la secuencia de acidos nucleicos tomada de una particula bacteriofaga que muestra dicho miembro de union especifico seleccionado.

Un dominio VH de anticuerpo con la secuencia de aminoacidos de un dominio VH de anticuerpo de dicho miembro de union especifico seleccionado se puede proporcionar de una forma aislada, tal como puede ser un miembro de union especifico que comprende un dominio VH de este tipo. La capacidad de unirse a todas las tres isoformas de TGFp se puede someter a ensayo adicionalmente, tambien la capacidad para competir o competir de manera cruzada con PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 (por ejemplo, en formato scFv y/o en formato IgG, por ejemplo, IgG4) para unirse a todas las tres isoformas humanas de TGFp. La capacidad para neutralizar TGFp se puede someter a ensayo, tal como se describe mas adelante.

Un miembro de union especifico segun la presente descripcion puede unirse a TGFp1, TGFp2 y/o TGFp3 con la afinidad de una molecula de anticuerpo PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, por ejemplo, scFv, o preferiblemente IgG4, o con una afinidad que es mayor que la de una de las moleculas anteriores. Un miembro de union especifico segun la presente descripcion puede neutralizar TGFp1, TGFp2 y/o TGFp3 con la potencia de una molecula de anticuerpo PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, por ejemplo, scFv, o preferiblemente IgG4 PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, o con una potencia que es mayor que la de una de las moleculas anteriores.

Un miembro de union especifico segun la presente descripcion puede neutralizar un TGFp que existe de manera natural con la potencia de una molecula de anticuerpo PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, por ejemplo, scFv, o preferiblemente IgG4, o con una potencia que es mayor que la de una de las moleculas anteriores. La afinidad de union y la potencia de neutralizacion de diferentes miembros de union especificos se puede comparar en condiciones apropiadas.

Un caso preferido de la presente descripcion comprende preferiblemente anticuerpos humanos, humanizados, quimericos o sinteticos que neutralizan TGFp que existe de manera natural con una potencia que es igual o mayor a la potencia de un sitio de union a antigeno TGFp formado por medio de dominio VH PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 y el correspondiente dominio VL PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10.

Ademas de las secuencias de anticuerpo, un miembro de union especifico segun la presente descripcion puede comprender otros aminoacidos, por ejemplo, que forman un peptido o polipeptido, tal como un dominio plegado, o puede impartir a la molecula otra caracteristica funcional ademas de la capacidad de unirse al antigeno. Los miembros de union especificos de la descripcion pueden llevar un marcador detectable, o se pueden conjugar con una toxina o un resto diana o enzima (por ejemplo, por medio de un enlace peptidilo o enlazador).

En otros aspectos, la descripcion proporciona un acido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica un miembro de union especifico, dominio VH y/o dominio VL o CDR segun la presente descripcion, y metodos para preparar un miembro de union especifico, un dominio VH y/o dominio VL o CDR de la descripcion, cuyos metodos comprenden expresar dicho acido nucleico en condiciones para producir dicho miembro de union especifico, dominio VH y/o dominio VL o CDR y recuperarlo.

Los miembros de union especificos segun la descripcion se pueden utilizar en un metodo para tratar o diagnosticar el cuerpo humano o animal, tal como un metodo para tratar (que puede incluir tratamiento profilactico) una enfermedad o trastorno en un paciente humano, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de un miembro de union especifico de la descripcion. Las condiciones tratables segun la presente descripcion incluyen cualquiera en la que el TGFp desempene un papel, especialmente, en el tratamiento de enfermedad fibrotica, la modulacion de cicatrizacion de heridas y el tratamiento de cancer.

Mas particularmente, los miembros de union especificos de la descripcion son utiles para inhibir la actividad de cualquiera o de todas las tres isoformas de TGFp humano in vitro o in vivo. Las actividades de este tipo incluyen, pero no se limitan a, senalizacion mediada por TGFp, deposicion de matriz extracelular (MEC), inhibicion de proliferacion celular epitelial y endotelial, promocion de proliferacion muscular lisa, induccion de expresion del colageno tipo III, induccion de TGFp, fibronectina, expresion de VEGF e IL-11, union de peptido asociado a la latencia, inmunosupresion inducida por tumor, promocion de angiogenesis, activacion de miofibroblastos, promocion de metastasis e inhibicion de la actividad celular NK.

Los miembros de union especificos de la descripcion son tambien utiles para tratar enfermedades y condiciones que son un resultado directo o indirecto de la actividad de TGFp. Debido a que los miembros de union especificos de la descripcion son pan-especificos, es decir, se unen e inhiben la actividad de todas las tres isoformas de TGFp, estos son particularmente ventajosos para tratar condiciones y enfermedades que implican dos o mas isoformas de TGFp (tales como infecciones y tumores) y condiciones graves donde la inhibicion de multiples blancos es deseable.

Los miembros de union especificos son utiles para tratar enfermedades y condiciones que incluyen, pero no se limitan a, enfermedades fibroticas (tales como glomerulonefritis, cicatrizacion neural, cicatrizacion dermica, fibrosis pulmonar, fibrosis de pulmon, fibrosis inducida por radiacion, fibrosis hepatica, mielofibrosis) quemaduras, enfermedades mediadas por el sistema inmune, enfermedades inflamatorias (incluida artritis reumatoide), rechazo de trasplante, cancer, contractura de Dupuytren y ulceras gastricas. Tambien son utiles para tratar, prevenir y reducir el riesgo de aparicion de insuficiencias renales que incluyen, pero no se limitan a, nefropatia diabetica (tipo I y tipo II), nefropatia por radiacion, nefropatia obstructiva, esclerosis sistemica difusa, fibrosis pulmonar, rechazo de injerto, insuficiencia renal hereditaria (por ejemplo, enfermedad renal poliquistica, espongiosis medular renal, rinon en herradura), glomerulonefritis, nefroesclerosis, nefrocalcinosis, lupus eritematoso sistemico, sindrome de Sjogren, enfermedad de Berger, hipertension sistemica o glomerular, nefropatia tubulointersticial, acidosis tubular renal, tuberculosis renal e infarto renal. En particular, son utiles cuando se combinan con antagonistas del sistema reninaangiotensina-aldoesterona que incluyen, pero no se limitan a, inhibidores de renina, inhibidores de enzima convertidora de angiotensina (ECA), antagonistas del receptor de Ang II (tambien conocidos como "bloqueadores del receptor de Ang II") y antagonistas de aldoesterona. Los metodos para utilizar los miembros de union especificos de la presente descripcion en combinacion con antagonistas de este tipo se describen en la solicitud PCT/US04/13677. Los miembros de union especificos de la descripcion tambien son utiles para tratar enfermedades y condiciones asociadas con la deposicion de MEC, dichas enfermedades y condiciones incluyen, pero no se limitan a, esclerosis sistemica, adherencia postoperatoria, cicatrizacion queloide e hipertrofica, vitreorretinopatia proliferativa, cirugia de drenaje del glaucoma, lesion corneal, cataratas, enfermedad de Peyronie, sindrome disneico agudo del adulto, cirrosis del higado, cicatrizacion posterior al infarto de miocardio, restenosis posterior a la angioplastia, cicatrizacion despues de hemorragia subaracnoide, esclerosis multiple, fibrosis despues de laminectomia, fibrosis despues de reparaciones de tendon y otras, cicatrizacion debido a eliminacion de tatuaje, cirrosis biliar (incluida colangitis esclerosante), pericarditis, pleuresia, traqueostomia, lesion penetrante del CNS, sindrome mialgico eosinofilico, restenosis vascular, enfermedad veno-oclusiva, pancreatitis y artropatia psoriasica.

Los miembros de union especificos de la descripcion son utiles ademas en condiciones donde la promocion de reepitelizacion es beneficiosa. Las condiciones de este tipo incluyen, pero no se limitan a, enfermedades de la piel, tales como ulceras venosas, ulceras isquemicas (llagas por presion), ulceras diabeticas, sitios de injertos, sitios de injertos en donantes, abrasiones y quemaduras; enfermedades del epitelio bronquial, tales como asma, ARDS, enfermedades del epitelio intestinal, tales como mucositis asociada con el tratamiento citotoxico, ulceras esofagicas (enfermedad de reflejo), ulceras estomacales y lesiones del intestino delgado y grueso (enfermedad inflamatoria intestinal).

Todavia otros usos de miembros de union especificos de la descripcion se dan en condiciones en las que la proliferacion celular endotelial es deseable, por ejemplo, en estabilizacion de placas ateroscleroticas, promocion de curacion de anastomosis vasculares, o en condiciones en las que la inhibicion de la proliferacion celular muscular lisa es deseable, tales como en enfermedad arterial, restenosis o asma.

Los miembros de union especificos de la descripcion tambien son utiles para potenciar la respuesta inmune a infecciones mediadas por macrofagos tales como aquellas causadas por Leishmania spp, Trypanosoma cruzi, Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, al igual que los protozoos Toxoplasma gondii, hongos Histoplasma capsulatum, Candida albicans, Candida parapsilosis y Cryptococcus neoformans, y Rickettsia, por ejemplo, R. prowazekii, R. coronii, y R. tsutsugamushi. Tambien son utiles para reducir la inmunosupresion causada, por ejemplo, por tumores, SIDA o enfermedades granulomatosas.

Los miembros de union especificos de la descripcion son utiles ademas en el tratamiento de enfermedades hiperproliferativas, tales como cancer incluidos, pero no limitados a, cancer de mama, de prostata, de ovario, de estomago, renal, pancreatico, colorrectal, de piel, de pulmon, cervical y de vejiga, glioma, mesotelioma, al igual que varias leucemias y sarcomas, tales como sarcoma de Kaposi, y, en particular, son utiles para tratar o prevenir recurrencias o metastasis de tumores de este tipo. En particular, los miembros de union especificos antagonistas de la descripcion son utiles para inhibir la metastasis mediada por ciclosporina.

Por supuesto, se apreciara que, en el contexto de la terapia contra el cancer, el "tratamiento" incluye cualquier intervencion medica que da como resultado la reduccion de la velocidad del crecimiento del tumor o reduccion en metastasis tumorales, al igual que remision parcial del cancer para prolongar la esperanza de vida del paciente. Otro aspecto de la presente descripcion proporciona un acido nucleico, generalmente aislado, que codifica un dominio variable VH y/o dominio variable VL de anticuerpo descrito en este documento.

Otro aspecto de la presente descripcion proporciona un acido nucleico, generalmente aislado, que codifica una secuencia HCDR o LCDR descrita en este documento, especialmente un HCDR seleccionado de entre los SEQ ID NO: 3, 4, 5, 13, 14, 15, 23, 24 y 25 o un VL CDR seleccionado de entre los SEQ ID NO: 8, 9, 10, 18, 19, 20, 28, 29, 30, de manera mas preferida HCDR3 PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 (SEQ ID NO: 5, 15 o 25, respectivamente). Los acidos nucleicos que codifican el conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de CDR, los acidos nucleicos que codifican el conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de HCDR y los acidos nucleicos que codifican el conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de LCDR se proporcionan tambien por medio de la presente descripcion, al igual que los acidos nucleicos que codifican CDR, HCDR, LCDR individuales y conjuntos de CDR, HCDR, LCDR PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10.

Otro aspecto proporciona una celula huesped transformada con acido nucleico de la descripcion.

Todavia otro aspecto proporciona un metodo para producir un dominio variable VH de anticuerpo, el metodo incluye provocar la expresion a partir del acido nucleico codificante. Un metodo de este tipo puede comprender cultivar celulas huesped en condiciones para producir dicho dominio variable VH de anticuerpo o para provocar que dicho dominio VH de anticuerpo se exprese in vivo.

Los metodos analogos para producir dominios variables VL y miembros de union especificos que comprenden un dominio VH y/o VL se proporcionan como otros aspectos de la presente descripcion.

Un metodo de produccion puede comprender una etapa de aislamiento y/o purificacion del producto.

Un metodo de produccion puede comprender formular el producto en una composicion que incluya al menos un componente adicional, tal como un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Estos y otros aspectos de la descripcion se describen con mas detalle mas adelante.

Descripcion detallada de la invencion

Terminologia

Miembro de union especifico

Esto describe un miembro de un par de moleculas que se han unido especificamente entre si. Los miembros de un par de union especifico pueden ser naturalmente derivados o producidos completa o parcialmente de manera sintetica. Un miembro del par de moleculas tiene un area en su superficie, o una cavidad, que se une especificamente a un area en la superficie, o a una cavidad, del otro miembro del par de moleculas. Por lo tanto, los miembros del par tienen la propiedad de unirse especificamente entre si. La presente descripcion se refiere a miembros de union especificos que se unen al antigeno diana.

Especifico

Esto se puede utilizar para referirse a la situacion en la que un miembro de union especifico no mostrara ninguna union significativa a moleculas diferentes de su(s) pareja(s) de union especifica(s) de un animal dado. Por ejemplo, un miembro de union especifico, especifico para TGFp humano, no tendra una union significativa a otras moleculas de TGFp no humano, sin embargo, este puede reaccionar de manera cruzada con un TGFp de otra especie.

Un miembro de union especifico de union a antigeno comprende un sitio de union a antigeno. Por ejemplo, un miembro de union especifico puede ser una molecula de anticuerpo. Un sitio de union a antigeno se puede proporcionar tambien por medio de disposicion de CDR en andamiajes proteicos de no anticuerpo tales como fibronectina o citocromo B, etc., Koide etal., (1998) Journal of Molecular Biology, 284:1141-1151; Nygren et al. (1997) Current Opinion in Structural Biology, Vol. 7:463-469). Los andamiajes para disenar sitios de union innovadores en proteinas se han revisado en detalle por Nygren et al., supra. Los andamiajes proteicos para mimeticos de anticuerpo se describen en la publicacion internacional WO 00/34784 que describe proteinas (mimeticos de anticuerpo) que incluyen un dominio de fibronectina tipo III que tiene al menos un bucle aleatorizado. Un andamiaje adecuado en el que se injerta uno o mas CDR, por ejemplo, un conjunto de HCDR, se puede proporcionar por medio de un miembro de dominio de la superfamilia del gen de inmunoglobulina. El andamiaje puede ser una proteina humana o no humana.

Una ventaja de un andamiaje proteico de no anticuerpo es que este puede proporcionar un sitio de union a antigeno en una region estructural conservada que es mas pequena y/o mas facil de fabricar que al menos algunas moleculas de anticuerpo. Un tamano pequeno de un miembro de union especifico le puede conferir propiedades fisiologicas utiles como capacidad para entrar en celulas, penetrar profundamente en tejidos o alcanzar blancos en otras estructuras, o unirse dentro de cavidades proteicas del antigeno diana.

Un uso de sitios de union a antigeno en andamiajes proteicos de no anticuerpo se revisa en Wess, 2004. Son tipicas las proteinas que tienen un esqueleto estable de uno o mas bucles variables, en las que la secuencia de aminoacidos del bucle o bucles muta especifica o aleatoriamente para crear un sitio de union a antigeno que tiene especificidad para unirse al antigeno diana. Las proteinas de este tipo incluyen los dominios de union a IgG de proteina A de S. aureus, transferrina, tetranectina, fibronectina (por ejemplo, dominio de la repeticion 10° de fibronectina tipo III) y lipocalinas. Otros planteamientos incluyen "microcuerpos" sinteticos (Selecore GmbH), que se basan en ciclotidos —pequenas proteinas que tienen enlaces disulfuro intramolecular.

Ademas de las secuencias de anticuerpo y/o un sitio de union a antigeno, un miembro de union especifico segun la presente descripcion puede comprender otros aminoacidos, por ejemplo, que forman un peptido o polipeptido, tal como un dominio plegado, o puede impartir a la molecula otra caracteristica funcional ademas de la capacidad de unirse al antigeno. Los miembros de union especificos de la invencion pueden llevar un marcador detectable, o se pueden conjugar con una toxina o un resto diana o enzima (por ejemplo, por medio de un enlace peptidilo o enlazador). Por ejemplo, un miembro de union especifico puede comprender un sitio catalitico (por ejemplo, en un dominio enzimatico) al igual que un sitio de union a antigeno, en donde el sitio de union a antigeno se une al antigeno y dirige asi el sitio catalitico al antigeno. El sitio catalitico puede inhibir la funcion biologica del antigeno, por ejemplo, por escision.

Aunque, como se ha senalado, los CDR pueden ser llevados por andamiajes tales como fibronectina o citocromo B (Haan y Maggos, 2004 BioCentury, 12(5): A1-A6; Koide et al., supra; Nygren et al., supra), la estructura para llevar un CDR o un conjunto de CDR de la descripcion sera generalmente de una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo o una porcion sustancial de esta en la que el CDR o conjunto de CDR se ubica en una ubicacion que se corresponde con el CDR o el conjunto de CDR de dominios variables VH y VL de anticuerpo que existen de manera natural codificados por medio de genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y ubicaciones de dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar con referencia a Kabat, et al., 1987, y las actualizaciones de estos, ahora disponibles en Internet (http://immuno.bme.nwu.edu o buscando "Kabat" utilizando cualquier motor de busqueda).

Molecula de anticuerpo

Esto describe una inmunoglobulina que se produce tanto de manera natural como parcial o completamente de manera sintetica. El termino tambien abarca cualquier polipeptido o proteina que comprende un domino de union a antigeno de un anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo que comprenden un dominio de union a un antigeno son moleculas tales como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd y anticuerpos.

En el genoma de una celula germinal humana, la informacion genetica para cadenas polipeptidicas de anticuerpo esta contenida en multiples segmentos de gen dentro de los loci esparcidos a lo largo de diferentes cromosomas. Las cadenas pesadas humanas (VH) se codifican en el cromosoma 14, las cadenas ligeras kappa (VK) en el cromosona 2 y las cadenas ligeras lambda (VA) en el cromosoma 22. Durante el desarrollo de los linfocitos B (celulas productoras de anticuerpos), los segmentos de gen en estos loci se ensamblan por medio de recombinacion que lleva a la formacion de genes completos de cadena pesada o ligera de anticuerpo (Tonegawa S. Nature, 302, 575-81, 1983). En gran parte, las regiones constantes de anticuerpo (VH, VK y VA) son identicas entre toda la poblacion humana, pero existe una diversidad considerable en los dominios variables. Una diversidad de este tipo habilita el desarrollo de muchos miles de millones de anticuerpos diferentes cada uno con especificidad para un antigeno diana diferente.

La diversidad en las regiones variables de los anticuerpos se genera de diferentes maneras. En primer lugar, a nivel genetico, existe una diversidad considerable en secuencias de genes germinales variables de anticuerpo. Aproximadamente, se han descrito 50 lineas germinales VH diferentes (Tomlinson I.M. et al, J. Mol. Biol., 227, 776­ 798, 1992), 35 lineas germinales V ^k diferentes (Tomlinson I.M. et al EMBO J, 14, 4628-38, 1995) y 30 lineas germinales VA diferentes (Williams S.C. y Winter G. Eur. J. Immunol, 23, 1456-61, 1993; Kawasaki K. et al Genome Res, 7, 250-61, 1997) Los anticuerpos se generan a partir de diferentes combinaciones de estas secuencias de genes germinales. Otra diversidad se introduce entonces en los dominios variables de anticuerpo por medio de procesos tales como recombinacion somatica o hipermutacion (Tonegawa S. Nature, 302, 575-81, 1983).

Aunque existe una diversidad considerable en las secuencias de genes germinales variables de anticuerpo, es posible agrupar las secuencias en familias basadas en homologia de secuencias. Las 50 secuencias de genes VH diferentes se pueden agrupar en 7 familias, las 35 secuencias V^k en 6 familias y las 30 familias VA en 10 familias. Los grupos pueden variar en tamano entre cada miembro (VH6 y V^k4) hasta 21 miembros (VH3) y los miembros de cada grupo comparten un alto grado de homologia de secuencias.

Los anticuerpos se pueden alinear con las bases de datos de secuencias germinales VH y VL para determinar su apareamiento germinal mas cercano y para identificar cualquier cambio de aminoacidos introducido por hipermutacion somatica. La investigacion ha mostrado que el sistema inmune humano utiliza algunas lineas germinales (por ejemplo, VH3 DP47) en preferencia a otras (por ejemplo, VH2) durante una respuesta inmune (Knappik A. et al J. Mol. Biol, 296, 57-86, 2000). Sin embargo, las poblaciones de anticuerpos aislados por presentacion en fagos utilizan tipicamente un amplio intervalo de genes germinales, incluso cuando se aislan contra un unico antigeno (Edwards B. et al J. Mol Biol, 334, 103-118, 2003).

Es posible tomar anticuerpos monoclonales y otros y utilizar tecnicas de tecnologia de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moleculas quimericas que retienen la especificidad del anticuerpo original. Las tecnicas de este tipo pueden implicar unir el ADN que codifica la region variable de inmunoglobulina a una region constante, o introducir las regiones determinantes complementarias (CDR), de un anticuerpo en la region constante mas regiones estructurales, o una inmunoglobulina diferente. Vease, por ejemplo, los documentos EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400, y un gran numero de bibliografia posterior. Un hibridoma u otra celula que produce un anticuerpo se puede someter a mutacion genetica u otros cambios, que pueden o no alterar la especificidad de union de los anticuerpos producidos.

Ya que los anticuerpos se pueden modificar de varias formas, la expresion "molecula de anticuerpo" se deberia construir para abarcar cualquier miembro o sustancia de union especificos que tienen un sitio de union a antigeno de un anticuerpo con la especificidad requerida. Por lo tanto, esta expresion abarca fragmentos de anticuerpo y derivados, incluido cualquier polipeptido que comprende un dominio de union a antigeno, tanto sea natural como completa o parcialmente sintetico. Las moleculas quimericas que comprenden un dominio de union a antigeno de un anticuerpo, o equivalente, se fusionan con otro polipeptido y, por lo tanto, se incluyen. La clonacion y expresion de anticuerpos quimericos se describen en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023, y en un gran conjunto de bibliografia posterior.

Otras tecnicas disponibles en la tecnica de diseno de anticuerpos han hecho posible aislar anticuerpos humanos y humanizados. Por ejemplo, se pueden hacer hibridomas humanos tal como se describe por Kontermann et al. (Kontermann R y Dubel Stefan; Antibody Engineering, Springer-Verlag Nueva York, LLC; 2001, ISBN: 3540413545). La presentacion en fagos, otra tecnica establecida para generar miembros de union especificos se ha descrito en detalle en muchas publicaciones tales como Kontermann et al., supra, y en la publicacion internacional WO 92/01047 (discutida mas adelante). Los ratones transgenicos, en los que los genes de anticuerpo de raton se desactivan y reemplazan funcionalmente con genes de anticuerpo humanos mientras se dejan intactos otros componentes del sistema inmune de raton, se pueden utilizar para aislar anticuerpos humanos de antigenos humanos (Mendez et al., 1997). Los anticuerpos humanos, tanto monoclonales como policlonales, se pueden crear tambien en otros animales transgenicos tales como cabras, vacas, ovejas, conejos, etc.

Las moleculas de anticuerpo sinteticas se pueden crear por medio de expresion de genes generados por medio de oligonucleotidos sintetizados y ensamblados dentro de vectores de expresion adecuados, por ejemplo, tal como se describe por Knappik et al., supra o Krebs et al., Journal of Immunological Methods 2542001 67-84.

Se ha mostrado que fragmentos de un anticuerpo completo pueden llevar a cabo la funcion de antigenos de union. Los ejemplos de fragmentos de union son I) el fragmento Fab que consiste en dominios VL, CL, VH y CHI; II) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CHI; III) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un unico anticuerpo; IV) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989), McCafferty et al. (1990) Nature, 348, 552-554) que consiste en un dominio VH; V) regiones CDR aisladas; VI) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados; VII) moleculas Fv de cadena sencilla (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL se enlazan por medio de un enlazador peptidico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de union a antigeno (Bird et al., Science, 242, 423-426, 1988; Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 85, 5879-5883; 1998 VIII) dimeros Fv de cadena sencilla biespecificos (PCT/US92/09665); y IX) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecificos construidos por fusion genetica (WO/13804); F. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 90 6444-6448, 1993). Las moleculas de diacuerpo, Fv o scFv se pueden estabilizar por medio de la incorporacion de puentes disulfuro que enlazan los dominios VH y VL (Y. Reiter et al., Nature Biotech, 14, 1239-1245, 1996). Los minicuerpos que comprenden un scFv unido a un dominio CH3 se pueden crear tambien (S. Hu et al., Cancer Res., 56, 3055-3061, 1996).

Un dAb (anticuerpo de dominio) es un pequeno fragmento de union a antigeno monomerico de un anticuerpo, concretamente, la region variable de una cadena pesada o ligera de anticuerpo (Holt et al., 2003). Los VH dAb existen de manera natural en camelidos (por ejemplo, camello, llama) y se pueden producir al inmunizar un camelido con un antigeno diana, aislando las celulas B especificas de antigeno y clonando directamente genes dAb a partir de celulas B individuales. Los dAb se pueden producir tambien en cultivo celular. Su pequeno tamano, buena solubilidad y estabilidad de la temperatura los hace particularmente utiles fisiologicamente y adecuados para seleccion de maduracion de afinidad. Un miembro de union especifico de la presente descripcion puede ser un dAb que comprende un dominio VH o VL sustancialmente tal como se establece en este documento, o un dominio VH o VL que comprende un conjunto de CDR sustancialmente tal como se establece en este documento.

Cuando se van a utilizan anticuerpos biespecificos, estos pueden ser anticuerpos biespecificos, que se pueden fabricar de una variedad de maneras (Holliger, P. y Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)) por ejemplo, preparados quimicamente o a partir de hibridomas hibridos, o pueden ser cualquier fragmento de anticuerpo biespecifico mencionado anteriormente. Los ejemplos de anticuerpos biespecificos incluyen aquellos de la tecnologia BiTETM en los que los dominios de union de dos anticuerpos con diferente especificidad se pueden utilizar y enlazar directamente por medio de peptidos flexibles cortos. Esto combina dos anticuerpos en una cadena polipeptidica sencilla corta. Los dicuerpos y scFv se pueden construir sin una region Fc, utilizando solo dominios variables, reduciendo potencialmente los efectos de reaccion anti-idiotipica.

Los diacuerpos bioespecificos, a diferencia de los anticuerpos biespecificos completos, pueden ser tambien particularmente utiles porque se pueden construir facilmente y expresar en E. coli. Los diacuerpos (y muchos de otros polipeptidos tales como fragmentos de anticuerpo) de especificidades de union apropiadas se pueden seleccionar facilmente utilizando presentacion en fagos (WO94/13804) a partir de bibliotecas. Si un brazo del diacuerpo se va a mantener constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra TGFp, entonces una biblioteca se puede crear donde se varie el otro brazo y se seleccione un anticuerpo de especificidad apropiada. Los anticuerpos biespecificos completos se pueden crear por medio de tecnologia "boton en ojal" (C. E. B. Ridgeway et al., Protein Eng., 9, 616-621, 1996).

Sitio de union a antigeno

Esto describe la parte de un miembro de union especifico, tal como una molecula de anticuerpo, que entra en contacto y es complementaria a parte de otro miembro o a todo este en el par de union, es decir, el antigeno. En una molecula de anticuerpo, el sitio de union a antigeno se puede referir como el sitio de union antigeno-anticuerpo, y comprende la parte del anticuerpo que se une especificamente y es complementaria a todo el antigeno diana o a parte de este. Cuando un antigeno es grande, un anticuerpo puede unirse solo a una parte particular del antigeno, cuya parte se denomina epitope.

Dominio de union a antigeno

Un dominio de union a antigeno es una porcion de un miembro de union especifico que comprende un sitio de union a antigeno y que se une al antigeno diana. En algunos casos, un dominio de union a antigeno se puede proporcionar por uno o mas dominios variables de anticuerpo (por ejemplo, el denominado fragmento de anticuerpo Fd que consiste en un dominio VH) o porciones de union a antigeno de estos. En algunos casos, un dominio de union a antigeno comprende una region variable de cadena ligera de anticuerpo (VL) y una region variable de cadena pesada de anticuerpo (VH).

Los miembros de union especificos se pueden glicosilar, tanto naturalmente como por medio de sistemas de varias celulas eucariotas (por ejemplo, celulas CHO o NS0 (ECACC 85110503)), o se pueden (por ejemplo, si se producen por medio de expresion de una celula procariota) no glicosidar. La glicosilacion se puede alterar tambien de manera intencionada, por ejemplo, al inhibir fucosilacion, para aumentar la actividad ADCC del anticuerpo resultante. Por consiguiente, cualquier miembro de union especifico de la invencion se puede expresar para minimizar o eliminar fucosilacion.

En algunos casos, el CDR o dominio VH o VL de la descripcion sera tanto identico como sumamente similar a las regiones especificadas cuya secuencia se establece en este documento. Se contempla que de 1 a 5, preferiblemente de 1 a 4 o 1 o 2 o 3 o 4 sustituciones de aminoacidos se pueden hacer en el CDR y/o dominios VH o VL. Los dominios VH o VL, y CDR y conjuntos de CDR que son sumamente similares a aquellos cuyas secuencias se proporcionan en este documento estan incluidos por aspectos de la presente descripcion, tal como lo estan aquellos con secuencias que son sustancialmente como las establecidas en este documento.

La estructura para llevar un CDR o un conjunto de CDR de la descripcion sera generalmente de una secuencia de cadena pesada o ligera de anticuerpo o una porcion sustancial de esta en la que el CDR o conjunto de CDR se ubica en una ubicacion que se corresponde con el CDR o el conjunto de CDR de dominios variables VH y VL de anticuerpo que existen de manera natural codificados por medio de genes de inmunoglobulina reordenados. Las estructuras y ubicaciones de dominios variables de inmunoglobulina se pueden determinar por referencia a Kabat, E.A. et a/., Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4a edicion. US Department of Health and Human Services. 1987 y las actualizaciones de este, ahora disponibles en Internet (http://immuno.bme.nwu.edu o buscando "Kabat" utilizando cualquier motor de busqueda). Los CDR se definen segun Kabat et al.

Los CDR pueden ser llevados tambien por medio de otros andamiajes tales como fibronectina o citocromo B.

Preferiblemente, una secuencia de aminoacidos de CDR, sustancialmente tal como se establece en este documento, es llevada como un CDR en un dominio variable humano o una porcion sustancial de este. Las secuencias HCDR3, sustancialmente tal como se establecen en este documento, representan casos preferidos de la presente descripcion y se prefiere que cada una de estas sea llevada como un HCDR3 en un dominio variable de cadena pesada humano o una porcion sustancial de este.

Los dominios variables empleados en la descripcion se pueden obtener o derivar a partir de cualquier dominio variable humano germinal o reorganizado, o puede ser un dominio variable sintetico basado en secuencias de consenso o reales de dominios variables humanos conocidos. Una secuencia de CDR de la descripcion (por ejemplo, CDR3) se puede introducir en un repertorio de dominios variables que carecen de un CDR (por ejemplo, CDR3) utilizando tecnologia de ADN recombinante. Las estructuras germinales preferidas se han identificado ya en este documento.

Por ejemplo, Marks et al. (Bio/Technology, 1992, 10:779-783) describe metodos para producir repertorios de dominios variables de anticuerpo en los que cebadores de consenso dirigidos o adyacentes al extremo 5' del area del dominio variable se utilizan en conjuncion con cebadores de consenso en la tercera region estructural de genes VH humanos para proporcionar un repertorio de dominios variables VK que carecen de CDR2. Marks et al. describe ademas como este repertorio se puede combinar con un CDR2 de un anticuerpo particular. Utilizando tecnicas analogas, las secuencias derivadas de CDR3 de la presente descripcion se pueden barajar con repertorios de dominios VH o VL que carecen de un CDR3, y los dominios VH o VL completos barajados se combinan con un dominio VL o VH parecido para proporcionar miembros de union especificos de la descripcion. Entonces, el repertorio se puede exponer en un sistema huesped adecuado tal como el sistema de presentacion en fagos de la publicacion internacional WO92/01047 o cualquier conjunto grande posterior de la bibliografia, incluido Kay, B.K., Winter, J., y McCafferty, J. (1996) Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, San Diego: Academic Press, de modo que se puedan seleccionar miembros de union especificos. Un repertorio puede consistir en de 104 miembros individuales en adelante, por ejemplo, de 106 a 108 a 1010 miembros. Otros sistemas huesped adecuados incluyen presentacion en levaduras, presentacion en bacterias, presentacion en T7, presentacion en ribosomas, presentacion covalente y etcetera.

Tecnicas de barajado analogas o combinatorias son descritas tambien por Stemmer (Nature, 1994, 370:389-391), quien describe la tecnica en relacion a un gen p-lactamasa pero observa que el planteamiento se puede utilizar para la generacion de anticuerpos.

Otra alternativa es para generar regiones VH o VL innovadoras que llevan secuencias derivadas de CDR de la descripcion utilizando mutagenesis aleatoria de uno o mas genes VH y/o VL seleccionados para generar mutaciones en el dominio variable entero. Una tecnica de este tipo es descrita por Gram et al. (1992, Proc. Natl. Acad. Sci., EE. UU., 89:3576-3580), quien utilizo PCR propenso al error. En casos preferidos, se hacen una o dos sustituciones de aminoacidos en un conjunto de HCDR y/o LCDR.

Otro metodo que se puede utilizar es dirigir mutagenesis a regiones CDR de los genes VH o VL. Tecnicas de este tipo son descritas por Barbas et al., (1994, Proc. Natl. Acad. Sci., EE. UU., 91:3809-3813) y Schier et al. (1996, J. Mol. Biol. 263:551-567).

Todas las tecnicas descritas anteriormente son conocidas como tales en la tecnica y en si mismas no forman parte de la presente invencion. Dada la descripcion proporcionada en este documento, el experto sera capaz de utilizar tecnicas de este tipo para proporcionar miembros de union especificos de la invencion utilizando metodologia rutinaria en la tecnica.

Otro aspecto de la descripcion proporciona un metodo para obtener un sitio de union a antigeno de un anticuerpo especifico para el antigeno de TGFp, el metodo comprende proporcionar por medio de adicion, delecion, sustitucion o insercion de uno o mas aminoacidos en la secuencia de aminoacidos de un dominio VH establecido en este documento, un dominio VH que es una variante de la secuencia de aminoacidos del domino VH, opcionalmente combinar el dominio VH proporcionado asi con uno o mas dominios VL, y someter a ensayo el dominio VH o combinacion VH/VL o combinaciones para identificar un miembro de union especifico o un dominio de union a antigeno especifico para TGFp, y opcionalmente una o mas propiedades preferidas, preferiblemente capacidad para neutralizar la actividad de TGFp. Dicho dominio VL puede tener una secuencia de aminoacidos que es sustancialmente tal como se ha establecido en este documento.

Un metodo analogo se puede emplear en el que una o mas variantes de secuencia de un dominio VL, descrito en este documento, se combina con uno o mas dominios VH.

En un caso preferido, un dominio VH PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 se puede someter a mutacion para proporcionar una o mas variantes de secuencia de aminoacidos de domino VH que se pueden combinar con uno o mas dominios VL.

Otro aspecto de la descripcion proporciona un metodo para preparar un miembro de union especifico que es especifico para todas las tres isoformas de TGFp humano, dicho metodo comprende:

a) proporcionar un repertorio inicial de acidos nucleicos que codifica un dominio VH que tanto incluye un CDR3 para ser reemplazado como carece de una region codificante de CDR3;

b) combinar dicho repertorio con un acido nucleico donante que codifica una secuencia de aminoacidos tal como se establece en este documento para un HCDR3 de tal manera que dicho acido nucleico donante se inserta en la region CDR3 en el repertorio, para proporcionar un repertorio de producto de acido nucleicos que codifican un dominio VH;

c) expresar los acidos nucleicos de dicho repertorio de producto;

d) seleccionar un miembro de union especifico que es especifico para al menos una isoforma de TGFp; y e) recuperar dicho miembro de union especifico o acido nucleico que lo codifica.

El metodo puede comprender ademas las etapas de llevar a cabo ensayos de union y ensayos de neutralizacion con cada una de las tres isoformas de TGFp para identificar miembros de union especificos que se unen y neutralizan todas las tres isoformas.

Otra vez, un metodo analogo se puede emplear en el que un LCDR3 de la descripcion se combina con un repertorio de acidos nucleicos que codifican un dominio VL que tanto incluye un CDR3 para ser reemplazado como carece de una region codificante de CDR3.

De manera similar, uno o mas, o todos los tres CDR se pueden injertar en un repertorio de dominios VH o VL que luego se van a cribar para un miembro de union especifico o miembros de union especificos para todas las isoformas de TGFp humano.

El dominio VH puede tener una secuencia germinal y, en casos preferidos, es DP-10 o DP-88. Un dominio VL puede tener una secuencia germinal y, en casos preferidos, es DPK-22.

En un caso preferido, uno o mas de HCDR1, HCDR2 y HCDR3 PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, o el conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de HCDR, se pueden emplear, y/o uno o mas de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10, o el conjunto PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 de LCDR.

Una porcion sustancial de un dominio variable de inmunoglobulina comprendera al menos las tres regiones CDR, juntas con sus regiones estructurales intermediarias. Preferiblemente, la porcion incluira tambien al menos aproximadamente un 50% de tanto las primeras como cuartas regiones estructurales o ambas, siendo el 50% el C-terminal el 50% de la primera region estructural y el N-terminal el 50% de la cuarta region estructura. Los residuos adicionales en el extremo N-terminal o C-terminal de la parte sustancial del dominio variable pueden ser aquellos que no se asocian normalmente con regiones de dominio variable que existen de manera natural. Por ejemplo, construir miembros de union especificos de la presente invencion creados por tecnicas de ADN recombinante puede dar como resultado la introduccion de residuos N- o C-terminales codificados por enlazadores introducidos para facilitar la clonacion u otras etapas de manipulacion. Otras etapas de manipulacion incluyen la introduccion de enlazadores para unir dominios variables de la descripcion a otras secuencias proteicas incluidas cadenas pesadas de inmunoglobulina, otros dominios variables (por ejemplo, en la produccion de diacuerpos) o marcadores proteicos tal como se discute en detalle en otra parte de este documento.

Aunque en un caso preferido de la descripcion se prefieren los miembros de union especificos que comprenden un par de dominios VH y VL, los dominios de union unicos basados en tanto secuencias de dominio VH como VL forman otros aspectos de la descripcion. Se conoce que dominios de inmunoglobulina unicos, especialmente dominios VH, son capaces de unirse a antigenos diana de una manera especifica.

En el caso de cualquiera de los dominios de union especificos unicos, estos dominios se pueden utilizar para cribar dominios complementarios capaces de formar un miembro de union especifico a dos dominios capaz de unirse a las tres isoformas de TGFp humano.

Esto se puede alcanzar por metodo de cribado de presentacion en fagos utilizando el enfoque combinatorio dual jerarquico tal como se describe en la publicacion internacional WO92/01047, en la que una colonia individual que contiene tanto un clon de cadena H como L se utiliza para infectar una biblioteca completa de clones que codifican la otra cadena (L o H) y el miembro de union especifico de dos cadenas resultante se selecciona segun las tecnicas de presentacion en fagos tales como las descritas en esta referencia. Esta tecnica se describe tambien en Marks et al., ibid.

Los miembros de union especificos de la presente descripcion pueden comprender ademas regiones constantes de anticuerpo o partes de estos. Por ejemplo, un domino VL se puede fijar en su extremo C-terminal a dominios constantes de cadena ligera de anticuerpo incluidas las cadenas CK o C^a humanas, preferiblemente cadenas C*. De manera similar, un miembro de union especifico basado en un dominio VH se puede fijar en su extremo C-terminal a toda o parte (por ejemplo, un dominio CH1) de una cadena pesada de inmunoglobulina derivada de cualquier isotipo de anticuerpo, por ejemplo, IgG, IgA, IgE y IgM y a cualquiera de las subclases de isotipo, particularmente IgG1 y IgG4. Se prefiere IgG4. Se prefiere IgG4 para algunas aplicaciones porque no se une al complemento y no crea funciones efectoras. Cuando se desea funcion efectora, se prefiere IgG1. La funcion efectora se puede aumentar tambien al manipular el estado de glicosilacion del anticuerpo, tal como al disminuir el contenido de fucosa, por medio de metodos que son conocidos en la tecnica. La cadena pesada puede o no tener un residuo de lisina C-terminal. Cualquier variante de region constante sintetica u otra que tiene estas propiedades y estabiliza las regiones variables se prefiere tambien para su uso en casos de la presente descripcion.

Tambien se encuentran dentro de la descripcion preparaciones heterogeneas de miembros de union especificos o fragmentos de union a antigeno de estos descritos en este documento. Por ejemplo, las preparaciones de este tipo pueden ser mezclas de anticuerpos con cadenas pesadas largas y cadenas pesadas que carecen de la lisina C-terminal, con varios grados de glicosilacion, con aminoacidos derivados, tales como ciclacion de acido glutamico N-terminal para formar un residuo de acido piroglutamico y/o con formas desamidadas de la cadena pesada o ligera.

Miembros de union especificos de la invencion se pueden marcar con un marcador detectable o funcional. Los marcadores detectables incluyen radiomarcadores tales como 131I o 99TC, que se pueden fijar a anticuerpos de la invencion utilizando quimica convencional conocida en la tecnica de diagnostico por imagenes de anticuerpos. Los marcadores incluyen tambien marcadores enzimaticos como peroxidasa de rabano. Los marcadores incluyen restos quimicos tales como biotina que se pueden detectar por medio de union a un resto detectable parecido especifico, por ejemplo, avidina marcada.

Los miembros de union especificos de la presente descripcion se disenan para utilizarlos en metodos de diagnosis o tratamiento en sujetos humanos o animales, preferiblemente en seres humanos.

En algunos casos, miembros de union especificos de la descripcion inhiben la union de TGFp1,2 y/o 3 a un receptor de TGFp de superficie celular o complejo receptor, incluido, pero no limitado a, un complejo que comprende un receptor serina/treonina quinasa de tipo I o tipo II y un proteoglicano beta-glicano (receptor de tipo III de TGFp). Por consiguiente, la descripcion comprende un metodo para inhibir la union de TGFp a un receptor de TGFp de superficie celular o un complejo de receptor que comprende la etapa de poner en contacto el TGFp con un miembro de union especifico de la descripcion y detectar la inhibicion de la union del receptor o complejo receptor. En varios casos, inhibir la union del TGFp a su(s) receptor(es) se puede indicar por medio de fosforilacion reducida de receptor de TGFp de tipo I, activacion reducida de receptor de TGFp de tipo I, fosforilacion y/o activacion reducida de proteinas R-SMAD, particularmente SMAD2 y SMAD3, translocacion reducida de dichas proteinas SMAD al nucleo, union reducida de proteina SMAD a ADN y/o modulacion de la expresion de un gen cuya expresion en dicha celula o tipo celular se conoce que es mediada por medio de senalizacion de TGFp. Otros ensayos se establecen en los ejemplos.

Por consiguiente, otros aspectos de la descripcion proporcionan metodos de tratamiento que comprenden administracion de un miembro de union especifico tal como se proporciona, composiciones farmaceuticas que comprenden un miembro de union especifico de este tipo, y uso de un miembro de union especifico de este tipo en la fabricacion de un medicamento para administracion, por ejemplo, en un metodo para crear un medicamento o composicion farmaceutica que comprende formular el miembro de union especifico con un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Miembros de union especificos de la descripcion se pueden administrar por medio de inyeccion (por ejemplo, por via subcutanea, intravenosa, intracavidad (por ejemplo, despues de reseccion de tumor), intralesional, intraperitoneal o intramuscular), por medio de inhalacion o por via topica (por ejemplo, intraocular, intranasal, rectal, en las heridas, sobre la piel), o por via oral. La via de administracion se puede determinar por las caracteristicas fisicoquimicas del producto, por consideraciones especiales para la enfermedad, por dosis o intervalo de dosis o por el requisito de optimizar la eficacia o minimizar efectos secundarios.

Se preve que el tratamiento anti-TGFp no este restringido a administracion por profesionales sanitarios. Por lo tanto, inyeccion subcutanea, especialmente utilizando un dispositivo libre de aguja puede ser apropiada.

Segun la presente descripcion, las composiciones proporcionadas se pueden administrar a individuos en necesidad de estas. La administracion es preferiblemente en una "cantidad terapeuticamente eficaz", esto es suficiente para mostrar beneficios en un paciente. Un beneficio de este tipo es al menos la mejora de al menos un sintoma de una enfermedad o trastorno particular. La cantidad real administrada, y la tasa y el tiempo de administracion dependeran de la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se va a tratar. La prescripcion del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosificacion, etc., se puede determinar con base en estudios preclinicos y clinicos cuyo diseno se encuentra dentro del nivel de experiencia en la tecnica.

La dosis concreta dependera de un numero de factores, incluidos si el anticuerpo es para diagnosis o tratamiento, el tamano y ubicacion del area que se va a tratar, la naturaleza concreta del anticuerpo (por ejemplo, anticuerpo completo, fragmento o diacuerpo), y la naturaleza de cualquier marcador detectable u otra molecula fijada al anticuerpo. Una dosis tipica de anticuerpo se encontrara en el intervalo de 100 gg a 1 gm para aplicaciones sistemicas, y de 1 gg a 1 mg para aplicaciones topicas. Tipicamente, el anticuerpo sera un anticuerpo entero, preferiblemente el isotipo IgG4. Esto es para una dosis de un tratamiento unico de un paciente adulto, que se puede ajustar proporcionalmente para ninos e infantes, y se puede ajustar tambien para otros formatos de anticuerpo en proporcion al peso molecular y actividad. Los tratamientos se pueden repetir diariamente, dos veces a la semana, semanalmente, mensualmente u en otros intervalos, a discrecion del medico. En casos preferidos de la presente descripcion, el tratamiento es periodico, y el periodo entre administraciones es aproximadamente de dos semanas o mas, preferiblemente aproximadamente tres semanas o mas, mas preferiblemente aproximadamente cuatro semanas o mas, o aproximadamente una vez al mes.

Los miembros de union especificos de la presente descripcion se administraran normalmente en forma de una composicion farmaceutica, que puede comprender al menos un componente ademas del cuerpo de union especifico.

Por lo tanto, las composiciones farmaceuticas segun la presente descripcion, y para su uso segun la presente descripcion, pueden comprender, ademas del ingrediente activo, un excipiente farmaceuticamente aceptable, vehiculo, tampon, estabilizante u otros materiales conocidos por los expertos en la tecnica. Los materiales de este tipo deberian ser no toxicos y no deberian interferir con la eficacia del ingrediente activo. Los materiales de este tipo podrian incluir, por ejemplo, todos y cualquier disolvente, medio de dispersion, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion, y similares que son fisiologicamente compatibles. Algunos ejemplos de vehiculos farmaceuticamente aceptables son agua, solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, al igual que combinaciones de estos. En muchos casos, sera preferible incluir agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio en la composicion. Los ejemplos adicionales de sustancias farmaceuticamente aceptables son agentes humectantes o cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida util en deposito o efectividad del anticuerpo. La naturaleza concreta del vehiculo u otro material dependera de la via de administracion, que puede ser oral, topica, por inhalacion o por inyeccion, por ejemplo, intravenosa. En un caso preferido, el anticuerpo se administra por infusion o inyeccion intravenosa. En otro caso preferido, el anticuerpo se administra por inyeccion intramuscular o subcutanea.

Las composiciones farmaceuticas para administracion via oral se pueden encontrar en forma de comprimido, capsula, polvo o liquido, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehiculo comestible asimilable. Un comprimido puede comprender un vehiculo solido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmaceuticas liquidas comprenden generalmente un vehiculo liquido tal como agua, nafta mineral, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintetico. Se puede incluir solucion salina fisiologica, dextrosa u otra disolucion de sacarido o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol, polietilenglicol. El miembro de union especifico (y otros ingredientes, si se desea) se puede contener tambien en una capsula de gelatina dura o blanda, comprimir en comprimidos, o incorporar directamente en la dieta del sujeto. Para administracion terapeutica por via oral, el ingrediente activo se puede incorporar con excipientes y utilizar en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, pastillas, capsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto de la descripcion por medio de administracion que no sea parental, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para evitar su inactivacion.

Para inyeccion intravenosa, o inyeccion en el sitio de afeccion, el ingrediente activo estara en forma de una disolucion acuosa parentalmente aceptable que esta libre de pirogenos y que tiene una pK, isotonicidad y estabilidad adecuadas. Aquellos con experiencia relevante en la tecnica son capaces de preparar disoluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehiculos isotonicos tales como inyeccion de cloruro de sodio, inyeccion de Ringer, inyeccion de Ringer lactato. Se pueden incluir conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos segun se requiera.

Una composicion se puede administrar sola o en combinacion con otros tratamientos, tanto de manera simultanea como secuencial dependiendo de la condicion que se va a tratar.

Los miembros de union especificos de la presente invencion se pueden formular en formas liquidas, semisolidas o solidas tales como disoluciones liquidas (por ejemplo, disoluciones inyectables e infusibles) dispersiones o suspensiones, comprimidos, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administracion, aplicacion terapeutica, las propiedades fisicoquimicas de la molecula y la via de entrega. Las formulaciones pueden incluir excipientes, o combinaciones de excipientes, por ejemplo, azucares, aminoacidos y tensioactivos. Las formulaciones liquidas pueden incluir un amplio intervalo de concentraciones de anticuerpo y pH. Las formulaciones solidas se pueden producir por medio de liofilizacion, secado por atomizacion, o secado por tecnologia fluida supercritica, por ejemplo.

Tipicamente, las composiciones terapeuticas deber ser esteriles y estables en las condiciones de fabricacion y almacenamiento. La composicion se puede formular como una disolucion, microemulsion, dispersion, liposoma, u otra estructura solicitada adecuada para una concentracion alta de farmaco. Las disoluciones inyectables esteriles se pueden preparar al incorporar el miembro de union especifico en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con un ingrediente o una combinacion de estos enumerados anteriormente, segun se requiera, seguido de esterilizacion filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo en un vehiculo esteril que contiene un medio de dispersion basico y los otros ingredientes requeridos de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos esteriles para la preparacion de disoluciones inyectables esteriles, los metodos preferidos de preparacion son secado al vacio y liofilizacion que produce un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una disolucion previamente esterilizada y filtrada de este. La fluidez correcta de una disolucion se puede mantener, por ejemplo, por medio del uso de un revestimiento tal como lecitina, por medio del mantenimiento del tamano de particula requerido en el caso de dispersion y por medio del uso de tensioactivos. Se puede provocar absorcion prolongada de composiciones inyectables al incluir en la composicion un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

En ciertas realizaciones, el compuesto activo de las composiciones de anticuerpo se puede preparar con un vehiculo que protegera al anticuerpo contra liberacion rapida, tal como una formulacion de liberacion controlada, incluidos implantes, parches transdermicos y sistemas de entrega microencapsulados. Se pueden utilizar polimeros biodegradables y biocompatibles, tales como etilvinilacetato, polianhidridos, acido poliglicolico, colageno, poliortoesteres y acido polilactico. Muchos metodos para preparar formulaciones de este tipo estan patentados o generalmente son conocidos por expertos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems (J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978).

La presente descripcion proporciona un metodo que comprende provocar o permitir la union de un miembro de union especifico tal como se proporciona en este documento a TGFp. Tal como se senalo, una union de este tipo puede tener lugar in vivo, por ejemplo, seguida de administracion de un miembro de union especifico, o acido nucleico que codifica un miembro de union especifico, a un paciente, o puede tener lugar in vitro, por ejemplo, en ELISA, Western blot, inmunocitoquimica, inmunoprecipitacion, cromatografia por afinidad, o ensayos basados en celulas, o en metodos terapeuticos basados ex vivo, por ejemplo, metodos en los que celulas o fluidos corporales estan en contacto ex vivo con un miembro de union especifico segun la descripcion, entonces se administra al paciente.

La cantidad de miembro de union especifico a TGFp se puede determinar. La cuantitacion se puede relacionar con la cantidad del antigeno en una muestra de prueba, que puede ser de interes diagnostico.

Un kit que comprende un miembro de union especifico o una molecula de anticuerpo segun cualquier aspecto o caso de la presente descripcion se proporciona tambien como un aspecto de la presente descripcion. En un kit de la descripcion, el miembro de union especifico o molecula de anticuerpo se puede marcar para permitir que se determine su reactividad en una muestra, por ejemplo, como se describe mas adelante. Generalmente, los componentes de un kit son esteriles y en estan en viales sellados u otros contenedores. Los kits se pueden emplear en analisis diagnostico u otros metodos para los cuales son utiles las moleculas de anticuerpo. Un kit puede contener instrucciones para uso de los componentes en un metodo, por ejemplo, un metodo segun la presente descripcion. Los materiales auxiliares para ayudar o habilitar la realizacion de un metodo de este tipo se pueden incluir en un kit de la descripcion.

Las reactividades de anticuerpos en una muestra se pueden determinar por cualquier medio apropiado. Una posibilidad es radioinmunoensayo (RIA). Un antigeno marcado radioactivo se mezcla con un antigeno no marcado (la muestra de prueba) y se permite que se una al anticuerpo. El antigeno unido se separa fisicamente de un antigeno no unido y se determina la cantidad de antigeno radioactivo unido al anticuerpo. Cuanto mas antigeno haya en la muestra de prueba, menos antigeno radioactivo se unira al anticuerpo. Un ensayo de union competitivo se puede utilizar tambien con antigeno no radioactivo utilizando antigeno o un analogo enlazado a una molecula informadora. La molecula informadora puede ser un tinte de fluorocromo, fosforo o laser con caracteristicas de absorcion y emision aisladas espectralmente. Los fluorocromos adecuados incluyen fluoresceina, rodamina, ficoeritrina y Texas Red. Los tintes cromogenicos adecuados incluyen diaminobencidina.

Otros informadores incluyen particulas coloidales macromoleculares o material particulado tales como perlas de latex que estan coloreadas, agentes magneticos o paramagneticos y biologica o quimicamente activos que pueden provocar directa o indirectamente senales detectables para observarlas visualmente, detectarlas electronicamente o de otra manera registrarlas. Estas moleculas pueden ser enzimas que catalizan reacciones que desarrollan o cambian colores o provocan cambios en propiedades electricas, por ejemplo. Pueden ser excitables molecularmente, de modo que las transiciones electronicas entre estados de energia den como resultado absorciones o emisiones espectrales caracteristicas. Pueden incluir entidades quimicas utilizadas en conjuncion con biosensores. Se pueden emplear sistemas de deteccion biotina/avidina o biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina. Las senales generadas por conjugados anticuerpo-informador individuales se pueden utilizar para derivar datos absolutos o relativos cuantificables de la union de anticuerpo relevante en muestras (normal y de prueba).

La presente descripcion proporciona tambien el uso de un miembro de union especifico como anteriormente para medir niveles de antigeno en un ensayo competitivo, o sea, un metodo para medir el nivel de antigeno en una muestra al emplear un miembro de union especifico tal como se proporciona por medio de la presente invencion en un ensayo competitivo. Esto puede ser donde no se requiere la separacion fisica del antigeno unido del no unido. Enlazar una molecula informadora al miembro de union especifico de modo que un cambio fisico u optico ocurra en la union es una posibilidad. La molecula informadora puede generar directa o indirectamente senales detectables y, preferiblemente, medibles. El enlace de moleculas informadoras puede ser de manera directa o indirecta, covalente, por ejemplo, por medio de un enlace peptidico o de manera no covalente. El enlace por medio de enlace peptidico puede ser un resultado de expresion recombinante de una fusion de un gen que codifica un anticuerpo y una molecula informadora.

La presente descripcion proporciona tambien para medir niveles de antigeno directamente, al emplear un miembro de union especifico segun la descripcion, por ejemplo, en un sistema biosensor.

El modo para determinar la union no es una caracteristica de la presente invencion y los expertos en la tecnica seran capaces de elegir un modo adecuado segun su preferencia y conocimiento general.

Tal como se senala, en varios aspectos y casos, la presente descripcion se extiende a un miembro de union humano, humanizado, quimerico o sintetico que compite para unirse a TGFp (TGFp1, 2 y/o 3) con cualquier miembro de union especifico definido en este documento, por ejemplo, IgG4 PET1037GR, PET1074B9 o PET1287A10. La competicion o competicion cruzada entre miembros de union se puede ensayar facilmente in vitro, por ejemplo, marcando una molecula informadora especifica a un miembro de union que se puede detectar en presencia de otro(s) miembro(s) de union no marcado(s), para habilitar la identificacion de miembros de union especificos que se unen al mismo epitope o a un epitope solapado.

La competicion se puede determinar, por ejemplo, utilizando ELISA en la que TGFp se inmoviliza en una placa y un primer miembro de union marcado (el miembro de union de referencia) se anade a la placa junto con uno o mas miembros de union no marcados. La presencia de un miembro de union no marcado que compite con el miembro de union marcado se observa por una disminucion en la senal emitida por el miembro de union marcado.

En la prueba para competicion, se puede emplear un fragmento de peptido del antigeno, especialmente un peptido que incluye un epitope de interes. Se puede utilizar un peptido que tiene una secuencia de epitope mas uno o mas aminoacidos en cualquier extremo. Se puede decir que un peptido de este tipo "consiste esencialmente" en la secuencia especificada. Miembros de union especificos segun la presente invencion pueden ser de tal manera que su union a antigeno se inhiba por un peptido con o que incluye la secuencia dada. Al someter esto a ensayo, se puede utilizar un peptido con cualquier secuencia mas uno o mas aminoacidos.

Los miembros de union especificos que se unen a un peptido especifico se pueden aislar, por ejemplo, de una biblioteca de presentacion en fagos al seleccionarlos con los peptidos.

La presente invencion proporciona ademas un acido nucleico aislado que codifica un miembro de union especifico de la presente invencion. El acido nucleico puede incluir ADN y/o ARN. En un caso preferido, la presente descripcion proporciona un acido nucleico que codifica un CDR o un conjunto de CDR o un sitio de union antigeno-anticuerpo o dominio VH o dominio VL o molecula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgG4, de la descripcion tal como se definio anteriormente.

La presente descripcion proporciona tambien constructos en forma de plasmidos, vectores, casetes de transcripcion o expresion que comprenden al menos un polinucleotico como los anteriores.

La presente descripcion proporciona tambien una celula huesped recombinante que comprende uno o mas constructos como los anteriores. Un acido nucleico que codifica cualquier CDR o conjunto de CDR o dominio VH o dominio VL o sitio de union a antigeno o molecula de anticuerpo, por ejemplo, scFv o IgG4 tal como se proporciona, forma por si mismo un aspecto de la presente descripcion, tal como lo hace un metodo para producir el producto codificado, dicho metodo comprende expresion a partir de un acido nucleico codificante para este. La expresion se puede conseguir convenientemente al cultivar, en condiciones apropiadas, celulas huesped recombinantes que contienen el acido nucleico. Despues de produccion por medio de expresion, un dominio VH o VL, o un miembro de union especifico se puede aislar y/o purificar utilizando cualquier tecnica adecuada, para utilizarlo entonces segun sea apropiado.

Los miembros de union especificos, dominios VH y/o VL, y moleculas de acido nucleico codificante y vectores segun la presente descripcion se pueden proporcionar aislados y/o purificados, por ejemplo, a partir de su entorno natural, en una forma homogenea o sustancialmente pura, o, en el caso de un acido nucleico, libre o sustancialmente libre de un origen de acido nucleico o de genes distinto a la secuencia que codifica un polipeptido con la funcion requerida. Un acido nucleico segun la presente invencion puede comprender ADN o ARN y puede ser sintetico de manera completa o parcial. La referencia a una secuencia de nucleotidos, tal como se expone en este documento, incluye una molecula de ADN con la secuencia especificada, e incluye una molecula de ARN con la secuencia especificada en la que U se sustituye con T, a menos que el contexto requiera otra cosa.

Los sistemas para clonar y expresar un polipeptido en una variedad de celulas huesped diferentes son conocidos. Las celulas huesped adecuadas incluyen bacterias, celulas de mamiferos, celulas vegetales, celulas de insectos, hongos, levaduras y plantas y animales transgenicos. Las lineas celulares de mamiferos disponibles en la tecnica para expresar un polipeptido heterologo incluyen celulas de ovario de hamster chino (CHO), celulas HeLa, celulas de rinon de hamster recien nacido, celulas de melanoma de raton NS0, celulas de mieloma de rata YB2/0, celulas de rinon embrionario humano, celulas de retina embrionaria humana y muchas otras. Una bacteria huesped preferida comun es E. coli.

La expresion de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en celulas procariotas tales como E. coli esta establecida en la tecnica. Para una revision, vease, por ejemplo, Pluckthun, A. Bio/Technology 9: 545-551 (1991). La expresion en celulas eucariotas en cultivo esta disponible tambien para los expertos en la tecnica como una opcion para producir un miembro de union especifico, por ejemplo, Chadd HE y Chamow SM (2001) 110 Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194, Andersen DC y Krummen L (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117, Larrick JW and Thomas DW (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411 -418.

Se pueden elegir o construir vectores adecuados, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, incluidas secuencias promotoras, secuencias de terminacion, secuencias de poliadenilacion, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias segun sea apropiado. Los vectores pueden ser plasmidos, viricos, por ejemplo, fagos o fagemidos, adenoviricos, AAV, lentiviricos, etc. segun sea apropiado. Para mas detalles, vease, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edicion, Sambrook y Russell, 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas tecnicas y protocolos conocidos para manipular acidos nucleicos, por ejemplo, para preparar constructos de acidos nucleicos, mutagenesis, secuenciacion, introduccion de ADN en celulas y expresion genetica, y analisis de proteinas, se describe en detalle en Current Protocols in Molecular Biology, segunda edicion, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1986, Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley y Sons, 4a edicion 1999.

Por lo tanto, otro aspecto de la presente descripcion proporciona una celula huesped que contiene acido nucleico tal como se describe en este documento. Una celula huesped de este tipo puede ser in vitro o puede ser en cultivo. Una celula de este tipo puede ser in vivo. La presencia in vivo de la celula huesped puede permitir expresion intracelular de los miembros de union especificos de la presente descripcion como "intracuerpos" o anticuerpos intracelulares. Los intracuerpos se pueden utilizar para terapia genetica (Marasco WA (1997) Gene Therapy, 4(1): 11).

Todavia otro aspecto proporciona un metodo que comprende introducir un acido nucleico de este tipo en una celula huesped. La introduccion puede emplear cualquier tecnica disponible. Para celulas eucariotas, las tecnicas adecuadas pueden incluir transfeccion con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporacion, transfeccion mediada por liposoma y transduccion utilizando retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, para celulas de insectos, baculovirus. Para introducir acido nucleico en la celula huesped, en particular en una celula eucariota, se puede utilizar un sistema virico o basado en plasmido. El sistema plasmido se puede mantener episomalmente o se puede incorporar en la celula huesped o en un cromosoma artificial (Csonka E et al. (2000) Journal of Cell Science, 113: 3207-3216; Vanderbyl S et al. (2002) Molecular Therapy, 5 (5: 10). La incorporacion puede ser tanto de manera aleatoria o por integracion dirigida de una o simples copias en un unico locus o multiples loci. Para celulas bacterianas, las tecnicas adecuadas pueden incluir transformacion de cloruro de calcio, electroporacion y transfeccion utilizando un bacteriofago.

La introduccion puede ir seguida de provocar o permitir la expresion a partir del acido nucleico, por ejemplo, al cultivar celulas huesped en condiciones para la expresion del gen.

En una realizacion, el acido nucleico de la invencion se integra en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la celula huesped. La integracion se puede promover por inclusion de secuencias que promocionan la recombinacion con el genoma, segun las tecnicas estandar.

La presente descripcion proporciona tambien un metodo que comprende utilizar un constructo, tal como se establecio anteriormente, en un sistema de expresion para expresar un miembro de union especifico o polipeptido como los anteriores.

Las moleculas de acido nucleico de la descripcion instantanea se pueden administrar a un paciente en necesidad de estas por medio de terapia genetica. La terapia puede ser tanto in vivo como ex vivo. En un caso preferido, las moleculas de acido nucleico que codifican tanto una cadena pesada como una cadena ligera se administran a un paciente. En un caso mas preferido, las moleculas de acido nucleico se administran de tal manera que se integran establemente en cromosomas de celulas B porque estas celulas se especializan en producir anticuerpos. En un caso preferido, celulas B precursoras se transfectan o infectan ex vivo y se vuelven a trasplantar en un paciente en necesidad de estas. En otro caso, celulas B precursoras u otras celulas se infectan in vivo utilizando un virus conocido por infectar el tipo de celula de interes. Los vectores tipicos utilizados para terapia genetica incluyen liposomas, plasmidos y vectores viricos. Los vectores viricos de ejemplo son retrovirus, adenovirus y virus asociados a adeno. Despues de infeccion tanto in vivo como ex vivo, los niveles de expresion de anticuerpo se pueden monitorear al tomar una muestra del paciente tratado y al utilizar cualquier inmunoensayo conocido en la tecnica o discutido en este documento. Los metodos para utilizar un anticuerpo anti-TGFp en terapia genetica son conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 5.824.655 (Border), que se incorpora en este documento como referencia en su totalidad.

En un caso preferido, el metodo de terapia genetica comprende las etapas de administrar una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una porcion de union a antigeno de esta de un anticuerpo anti-TGFp y que expresa la molecula de acido nucleico. En otro caso, el metodo de terapia genetica comprende las etapas de administrar una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena ligera o una porcion de union a antigeno de esta de un anticuerpo anti-TGFp y que expresa la molecula de acido nucleico. En un metodo mas preferido, el metodo de terapia genetica comprende las etapas de administrar una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o una porcion de union a antigeno de esta y una molecula de acido nucleico aislada que codifica la cadena ligera o la porcion de union a antigeno de esta de un anticuerpo anti-TGFp de la descripcion y que expresa las moleculas de acido nucleico.

La correccion de dosis entre especies requiere generalmente un ajuste de peso corporal solamente, si el agente activo es un anticuerpo que actua en o esta cerca del sistema vascular. Las dosis eficaces de los anticuerpos de la descripcion han sido 0,5-5 mg/kg en ratas y ratones en el contexto agudo. Por lo tanto, para una dosificacion a largo plazo, administrar 0,3-10 mg/kg en la vida media (se espera que se encuentre en la region de 21 dias en seres humanos) se considera probable. Las dosis preferidas son suficientes en terminos de eficacia, pero lo suficientemente bajas para facilitar una administracion optima. Por ejemplo, una dosis de menos de 50 mg facilita administracion por via subcutanea. La administracion intravenosa es preferible en los primeros ensayos clinicos y se puede utilizar como la via de entrega para enfermedades graves si la dosis es alta y el intervalo de dosificacion largo. En terminos generales, la inyeccion subcutanea es mas conveniente que la entrega intravenosa, porque permite autoadministracion. Sin embargo, la inyeccion subcutanea tiene el potencial de aumentar cualquier respuesta inmune al producto. La administracion por via local para una enfermedad localizada puede minimizar la cantidad de producto requerido y maximizar la concentracion en el sitio de accion. Una ventaja de seguridad (margen terapeutico) significativa se puede conferir por medio de administracion por via local, evitando cualquier efecto secundario potencial que se puede desarrollar de administracion sistemica cronica.

Ejemplo 1

Generacion de ScFv anti-TGFp

Bibliotecas de anticuerpos virgenes ScFv

Se utilizo una biblioteca de anticuerpos humanos de cadena FV sencilla larga (scFv) derivada de linfocitos de bazo a partir de 20 donantes y clonado en un vector fagemido (Hutchings et al., 2001) para selecciones.

Bibliotecas de seleccion guiada de ScFv

Una biblioteca VL humana-VH 1D11.16 se construyo y se utilizo para seleccionar anticuerpos quimericos de ratonhumanos con las propiedades de union deseadas. Las cadenas ligeras humanas de estos anticuerpos quimericos se clonaron entonces en bibliotecas aceptoras VH-VL humanas y VH humanas (CDR3 1D11 )-VL. Estas bibliotecas se cribaron para anticuerpos humanos con las propiedades de union deseadas.

Seleccion de bibliotecas de fagos ScFv

Genzyme Corp. (Framingham, MA, EE. UU.) suministraron TGFp1 y TGFp2 humanos recombinantes y se compro TGFp3 a R&D Systems.

Los scFv que reconocieron TGFp se aislaron de bibliotecas de seleccion guiada de scFv seguido de una serie de ciclos de seleccion repetidos en TGFp humano recombinante esencialmente tal como se describen en Vaughan et al. (1996). En resumen, seguido de incubacion con la biblioteca, el antigeno inmovilizado, que se habia acoplado previamente con perlas paramagneticas, y fago unido se recuperaron por separacion magnetica mientras el fago no unido se lavo. El fago unido se rescato entonces tal como se describe en Vaughan et al. (1996) y el proceso de seleccion se repitio.

Las selecciones se llevaron a cabo utilizando TGFp1, TGFp2 o TGFp3 acoplado a aminas Dynabeads M-270 (Dynal) segun las recomendaciones del fabricante. Alternativamente, las selecciones utilizaron TGFp1 o TGFp2 biotinilado preparado utilizando el reactivo especifico de amina primaria hexanoato de succinimidil-6-(biotinanido) siguiendo las instrucciones del fabricante (EZ link NHS LC Biotin, Pierce).

Los resultados de las selecciones se sometieron a ensayo como preparaciones periplasmicas en cribados de alto rendimiento basados en ensayos competitivos que midieron la capacidad de los scFv presentes en la preparacion periplasmica para competir con 1D11.16 o la quimera del receptor Fcll soluble del TGFp humano recombinante (sRII, R&D Systems) para unirse a TGFp.

Las muestras que compitieron con 1D11.16 o sRII en los cribados de alto rendimiento se sometieron a secuenciacion de ADN tal como se describe en Vaughan et al. (1996) y Osbourn et al. (1996). Los clones se expresaron y purificaron como scFv o IgG y se evaluaron para su capacidad de neutralizar TGFp en los ensayos con MLEC y/o con NHLF tal como se describe en los Ejemplos 4 y 5 respectivamente. Las preparaciones de scFv purificadas se prepararon como se describe en el Ejemplo 3 de la publicacion internacional WO 01/66754. Las concentraciones de proteina de preparaciones de scFv purificadas se determinaron utilizando el metodo BCA (Pierce). Las preparaciones de IgG purificadas se prepararon tal como se describe mas adelante en el Ejemplo 3.

Ejemplo 2

Optimizacion de scFv anti-TGFp

La union de scFv y neutralizacion de TGFp se generaron como se describe en el Ejemplo 1. Las potencias de neutralizacion de estos anticuerpos aumentaron en TGFp1 y/o TGFp2 y/o TGFp3 utilizando mutagenesis de ADN y/o tecnicas combinatorias. Los anticuerpos con potencias significativamente mejoradas en TGFp1 y/o TGFp2 y/o TGFp3 se generaron por medio de seleccion y cribado de bibliotecas de anticuerpos de fagos esencialmente tal como se describe en el Ejemplo 1. Los scFv generados se compararon con 1D11.16 en el ensayo de proliferacion con MLEC.

Se encontro que las lineas germinales particulares estaban sumamente representadas entre la poblacion de scFv neutralizantes de TGFp de alta potencia. Estas fueron DP-10/1-69 y DP-88/1-e (ambas miembros de la familia germinal VH1) para la cadena pesada, y DPK22/A27 (familia VK3) para la cadena ligera. Estas lineas germinales parecen proporcionar un marco estructural particularmente adecuado para anticuerpos pan-neutralizantes de TGFp de alta potencia. Esto no es predecible, ya que el segmento de gen VH 1D11.16 es el mas cercano a la linea germinal humana DP-7 y el segmento de gen VL 1D11.16 es el mas cercano a la linea germinal humana L16.

Los scFv PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 mostraron potencias que se acercan o exceden a aquellas de 1D11.16 en todas las tres isoformas de TGFp en el ensayo de proliferacion con MLEC.

Las secuencias de aminoacidos derivadas de los segmentos de gen VH y VL PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 se alinearon con las secuencias germinales humanas conocidas en la base de datos VBASE (Tomlinson et al., 1997) y la linea germinal humana mas cercana se identifico por medio de similaridad de secuencia. El gen germinal humano mas cercano para el segmento de gen VH de PET1073G12 y PET1074B9 se identifico como DP-10/1-69 (familia germinal VH1) y el gen germinal humano mas cercano para el segmento de gen VH de PET1287A10 se identifico como DP-88/1-e (linea germinal VH1). El gen germinal humano mas cercano para el segmento de gen VL de PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 se identifico como DPK22/A27 (familia germinal V^k3). La mutagenesis dirigida a sitio se utilizo para cambiar los residuos estructurales que difirieron de la linea germinal al residuo germinal, siempre que los cambios no produjeran una perdida de potencia en el ensayo de proliferacion con MLEC de mas de tres veces en el anticuerpo resultando en cualquier isoforma de TGFp. Si se observo una perdida de potencia de este tipo, el aminoacido estructural no germinal se mantuvo en el anticuerpo final.

En PET1073G12 germinalizado y PET1074B9 germinalizado, todos los residuos estructurales son linea germinal excepto dos residuos en VH y uno en VL. Las secuencias de aminoacidos para PET1073G12 germinalizado se describen en SEQ ID NO: 2 para VH y SEQ ID NO: 7 para VL. Las secuencias de aminoacidos para PET1074B9 germinalizado se describen en SEQ ID NO: 12 para VH y SEQ ID NO: 17 para VL.

En PET1287A10 germinalizado, todos los residuos estructurales VH y VL son lineas germinales. Las secuencias de aminoacidos para PET1287A10 germinalizado se describen en SEQ ID NO: 22 para VH y SEQ ID NO: 27 para VL.

Ejemplo 3

Produccion de IgG4

Los scFv PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 germinalizados se convirtieron a partir del formado scFv al formato IgG4 por medio de subclonacion de sus dominios VH y VL en vectores que expresan las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo completas respectivamente. El segmento de gen VH se amplifico del vector que expresa scFv pCantab6 y se clono en el vector pEU8.1(+) que contiene los dominios constantes de cadena pesada ^y4 humanos y elementos reguladores para expresar las cadenas pesadas completas en celulas de mamiferos. De manera similar, el segmento de gen VL se amplifico del vector que expresa scFv pCantab6 y se clono en el vector pEU3.1(-) que contiene los dominios constantes de cadena ligera ^k humanos y elementos reguladores para expresar las cadenas ligeras completas en celulas de mamiferos. Los vectores pEU3.1(-) y pEU8.1 (+) se basaron en los vectores descritos por Persic et al. (1987) y se modificaron para introducir la secuencia oriP para aumentar los rendimientos del anticuerpo producido (Shen. et al., 1995; Langle-Rouault et al., 1998). Despues de la clonacion, los dominios VH y VL de todos los tres anticuerpos se secuenciaron para confirmar que no se habfan introducido mutaciones durante del procedimiento de clonacion.

Los vectores para la expresion de cadena pesada y ligera PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 se transfectaron en celulas EBNA-293 (Invitrogen). Despues de la expresion y secrecion de genes en el sobrenadante celular, los IgG4 PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 IgG4 se purificaron por medio de cromatograffa de afinidad a la protefna A (Amersham). Las preparaciones de anticuerpo purificadas se filtraron de manera esteril y se almacenaron a 4°C en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) antes de evaluacion. La concentracion de IgG se determino espectrofotometricamente utilizando un coeficiente de extincion basado en la secuencia de aminoacidos del IgG tal como se describe en Mach et al. (1992). El IgG purificado se analizo por medio de SEC-HPLC utilizando una columna Biosep-SEC-S2000 (Phenomenex) para comprobar la agregacion o degradacion de la protefna. Los anticuerpos completos IgG4 humanos reformateados se compararon con el anticuerpo 1 D11.16 en los ensayos basados en celulas MLEC y NHLF tal como se describe en los Ejemplos 4 y 5 respectivamente.

Ejemplo 4

Potencia de neutralizacion de anticuerpos anti-TGFp en el ensayo de proliferacion con MLEC dependiente de TGFp La potencia de neutralizacion de preparaciones de anticuerpo purificadas contra la bioactividad de TGFp humano se evaluaron utilizando ensayo de proliferacion con celulas epiteliales de pulmon de vison (MLEC).

El ensayo de proliferacion con MLEC se basa en un ensayo descrito por Danielpour et al. (1989a). Este ensayo trabaja sobre el principio de que cuando TGFp1, TGFp2 o TGFp3 se anade a celulas epiteliales de pulmon de vison esto provoca una inhibicion de la proliferacion celular inducida por suero. Los anticuerpos se sometieron a ensayo para la neutralizacion de TGFp1, TGFp2 o TGFp3 que da como resultado la restauracion de la proliferacion celular. La proliferacion se midio por medio de la absorcion de [3H]-timidina. La potencia del anticuerpo se definio como la concentracion del anticuerpo que se neutraliza en una concentracion unica de TGFp1, TGFp2 o TGFp3 en un nivel 50% (CI⁵⁰) en nM.

Protocolo del ensayo de proliferacion con MLEC

Preparacion en placas de MLEC

La lfnea MLEC se obtuvo a partir de la American Type Culture Collection (n.° de cat. CCL-64). Las celulas crecieron en un medio Minimum Essential Media (MEM, Gibco) que contiene un 10% de FBS (Gibco), un 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco) y un 1% de la disolucion de aminoacidos no esenciales MEM (Gibco). Las celulas confluentes a partir de matraces T-175 se disociaron del matraz, se centrifugaron, se lavaron, y se volvieron a suspender en medio de ensayo con MLEC que se fabrico de MEM que contenfa un 1% de FBS, un 1% de penicilina/estreptomicina y un 1% de disolucion de aminoacidos no esenciales MEM. Una parte alfcuota de las celulas se marco entonces con azul de tripano, se contaron en un hemocitometro y la reserva de celulas de diluyo a 1,75 x 105 celulas por ml utilizando medio de ensayo. Se anadieron 100 pl de esta suspension a cada pocillo de cultivo de tejido de una placa de 96 pocillos de fondo plano de cultivo tisular y se incubo durante 3 a 5 horas.

Preparacion de disoluciones TGFp/anticuerpo

Las disoluciones de trabajo de TGFp1, TGFp2 o TGFp3 a 6 ng/ml (6 veces la concentracion final del ensayo) y anticuerpos (incluidos controles como 1D11.16) a 3 veces la concentracion maxima final del ensayo se prepararon en medio de ensayo MLEC. La concentracion final de TGFp en el ensayo (1 ng/ml o 40 pM) se correspondio con la concentracion que indujo aproximadamente un 80% de inhibicion de proliferacion celular en comparacion con el control sin TGFp (es decir, valor CE⁸⁰).

Disposicion de la placa de dilucion

Las muestras de anticuerpos de prueba y control se titularon en etapas de dilucion de 3 veces en medio de ensayo MLEC y se incubaron en presencia y ausencia de TGFp1., TGFp2 o TGFp3. Todos los controles relevantes se incluyeron en cada experimento: ensayo del anticuerpo 1D11.16 y/o de referencia segun fuera apropiado y realizacion de titulaciones de TGFp1, TGFp2 o TGFp3. Las placas completadas se dejaron en una incubadora de cultivo tisular humidificada durante 1 hora ± 15 minutos.

Adicion de disoluciones de TGFp/anticuerpo a las celulas en placas

Despues de los tiempos de incubacion apropiados, se transfirieron 100 pl a partir de cada pocillo de las placas de dilucion a MLEC en placas y las placas se devolvieron a la incubadora durante 44 ± 2 horas.

Adicion de [3H]-timidina

Se anadieron 25 pl de 10 pCi/ml [3H]-timidina (diluidos en PBS) a cada uno de los pocillos (0,25 pCi/pocillo). Las placas se devolvieron entonces a la incubadora durante 4 horas ± 30 minutos.

Recoleccion de celulas

Se anadieron 100 pL de tripsina-EDTA (0,25%, Gibco) a cada pocillo, las placas se incubaron durante 10 minutos en la incubadora y las celulas se recolectaron utilizando un recolector de celulas de 96 pocillos Tomtec o Packard. Analisis y acumulacion de datos

Los datos de las celulas recolectadas se leyeron utilizando un lector de placas beta (TopCount, Packard). Los datos se analizaron para obtener valores CI⁵⁰ y de desviacion estandar. Se obtuvieron los valores CI⁵⁰ utilizando el software Prism 2.0 (GraphPad).

Resultados

Los IgG4 germinales PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 se sometieron a ensayo junto a 1D11.16 en el ensayo de proliferacion con MLEC. Se produjeron IgG4 tal como se describe en el Ejemplo 3. La media aritmetica de CI⁵⁰ ± la desviacion estandar (donde CI⁵⁰ es la concentracion de anticuerpos requerida para neutralizar 40 pM de TGFp1, TGFp2 o TGFp3 por un 50%) se muestran en la Tabla 1.

Los datos de CI⁵⁰ media para IgG4 PET1073G12 y PET1287A10 muestran que estos anticuerpos tienen potencias o planteamientos similares a aquellos de 1D11.16 en TGFp1, TGFp2 y TGFp3.

Los datos de CI⁵⁰ media sugieren que IgG4 PET1074B9 es significativamente mas potente en TGFp1 (aunque una curva de respuesta a una dosis completa no se obtuvo en el ensayo con MLEC). Como medio de comparacion, 1D11.16 mostro un 12% de neutralizacion en TGFp1 en una concentracion de 91 pM y PET1074B9 mostro un 78% de neutralizacion en una concentracion similar de 92 pM. Ademas, PET1074B9 tambien se analizo junto a 1D11.16 en un ensayo de produccion de fibronectina en el ensayo con fibroblastos pulmonares humanos normales (NHLF) (Ejemplo 5). Los resultados obtenidos en el ensayo con NHLF confirmaron aquellos obtenidos en el ensayo con m LeC: PET1074B9 tiene potencias similares a aquellas de 1D11.16 en TGFp2 y TGFp3 y PET1074B9 es mas potente que 1D11.16 en TGFp1.

Ejemplo 5

Potencia de neutralizacion de anticuerpos anti-TGFp en el ensayo con celulas NHFL dependiente de TGFp3 La potencia de neutralizacion de preparaciones de anticuerpo purificadas contra bioactividad de TGFp humano se evaluo utilizando el ensayo de produccion de fibronectina de fibroblastos pulmonares humanos normales (NHLF). Este ensayo mide la capacidad de los anticuerpos de neutralizar la produccion de la glicoproteina de matriz extracelular (ECM), fibronectina. Los TGFp son estimuladores potentes de la produccion de fibronectina en fibroblastos cultivados (Ignotz y Massaoue, 1986) ejerciendo sus efectos por medio de activacion de la via de la quinasa N-terminal c-Jun (Hocevar et al., 1999).

Protocolo del ensayo con celulas NHLF

Se obtuvieron celulas NHLF de Clonetics™ y se mantuvieron en medios de crecimiento de fibroblastos completos 2 (FGM-2) en una atmosfera humidificada que contenia un 5% de CO² a 37°C. A una confluencia de un 90-100%, los fibroblastos se pusieron en placas (1,5 x 105/pocillo, formado de 24 pocillos) en 1,5 ml de medio FGM-2 y se permitio que se fijaran durante 24 horas a 37°C. Las celulas se lavaron con medio basal de fibroblastos libre de suero (FBM) y se privaron de suero durante la noche en 1,5 ml de FBM suplementado con insulina humana (100 pg/ml), gentamicina/fungizona (50 pg/ml) y acido ascorbico (50 (pg/ml) y se incubaron durante 24 horas a 37°C. Todos los experimentos se llevaron a cabo en celulas entre los pases tres a seis.

Preparacion de disoluciones de TGFp y anticuerpos

Las disoluciones de trabajo de TGFp1, TGFp2 o TGFp3 a 25 ng/ml (1 nM) y anticuerpos (incluidos controles como 1D11.16) se prepararon en medio de ensayo. La concentracion final de TGFp en el ensayo (250 pg/ml o 10 pM) se correspondio con la concentracion que indujo aproximadamente un 80% de simulacion de produccion de fibronectina en comparacion con el control sin TGFp (es decir, valor CE⁸⁰).

Disposicion de la placa de dilucion

Las muestras de anticuerpos de prueba y control se diluyeron en serie en etapas de dilucion de 10 veces en medio de ensayo y se preincubaron en presencia y ausencia de TGFp1, TGFp2 o TGFp3 a 32°C durante 30 minutos. Las celulas NhLf se incubaron en 2 ml/pocillo de medio de ensayo durante 48 horas a 37°C. Despues de 48 horas, 0,5 ml de parte alicuota de sobrenadante de medio de cultivo se tomo para analisis de fibronectina por medio de ELISA. ELISA con fibronectina humana

Se analizaron muestras de sobrenadante de NHLF fresco o congelado (-20°C) utilizando un kit de ELISA con antigeno de fibronectina humana Technoclone™ que comprendia un anticuerpo monoclonal de captura anti fibronectina humana (clon 6FN) y un anticuerpo secundario anti-fibronectina monoclonal conjugado HRP. La metodologia fue la siguiente:

Placas de 96 pocillos Nunc-ImmunoTM Maxisorp™ se revistieron (1 gg/pocillo) con un anticuerpo de captura antifibronectina en tampon de revestimiento (12 mM de Na2CO3, 35 mM de NaHCO3, timerosal al 0,01% (p/v) en agua destilada, pH 9,6) durante 16 horas a 4°C. El anticuerpo de captura se retiro y cada pocillo se bloqueo con 100 gl de tampon de dilucion (BSA al 1% (p/v) en PBS) durante 1 hora a 37°C. Despues de lavarlo tres veces con tampon de agua (250 gg/pocillo de Tween 20 al 0,5% (v/v) en PBS), se anadieron estandares de fibronectina en plasma humana y muestras a la placa y se incubaron durante 1 hora a 37°C. Entonces, se lavo la placa tres veces y se incubo con un anticuerpo secundario HRP anti-fibronectina (100 gg/pocillo en tampon de dilucion) durante 30 minutos a 37°C. La placa se lavo tres veces con tampon de agua y se anadieron 100 gg/pocillo de sustrato de tetrametilbenzidina (TMB) a la placa. Despues de incubacion de la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos, la reaccion se paro con 100 gg/pocillo de acido sulfurico 2 M. Entonces, se midio la absorbancia a 450 nm utilizando un lector de placa Dynex MRX.

Analisis de los datos

Los datos se presentaron como un porcentaje de la respuesta de control a la isoforma de TGFp en prueba (100%). Se estimaron los valores pCI50 medios geometricos y unos limites confianza del 95% utilizando un ajuste de curva logistica de cuatro parametros (Prism 2, GraphPad Software, San Diego, EE. UU.). Cuando fallo un ajuste de cuatro parametros, se llevo a cabo un ajuste de tres o dos parametros manteniendo constantes los valores superiores y/o inferiores de la curva.

Resultados

Los IgG4 germinales PET1073G12, PET1074B9 y PET1287A10 purificados se sometieron a ensayo junto a 1D11.16 en el ensayo de produccion de fibronectina NHLf . Se produjeron IgG4 tal como se describe en el Ejemplo 3. La media aritmetica de CI50 ± la desviacion estandar (donde CI50 es la concentracion de anticuerpos requerida para neutralizar 10 pM de TGFp1, TGFp2 o TGFp3 por un 50%) se muestran en la Tabla 2.

Ejemplo 6

Potencias en ensayo de induccion de IL-11

Se evaluo la potencia de neutralizacion de preparaciones de anticuerpo purificadas contra bioactividad de TGFp humano utilizando un ensayo de induccion de IL-11 con una celula A549 (celulas de carcinoma epitelial pulmonar humano)

Las celulas A549 (ATCC, n.° de parte: CCL-185) se mantuvieron en medio de crecimiento/ensayo (435 ml de DMEM, 50 ml de suero bovino fetal (FBS), 5 ml de penicillina/estreptomyicina 5 ml de aminoacidos no esenciales de medio Modified Eagle Medium, 5 ml de L-glutamina 100X; todos de Gibco/Invitrogen). A aproximadamente un 90% de confluencia, las celulas se colocaron en placas en 100 gl de medio de crecimiento/ensayo y se permitio a las celulas fijarse durante 24 horas a 37°C, CO² al 5%.

Preparacion de disoluciones de TGFp y anticuerpos

Se prepararon disoluciones de trabajo de TGFp1 (1,8 ng/ml), TGFp2 (4,2 ng/ml) o TGFp3 (4,2 ng/ml) y anticuerpos (incluidos controles) en medio de crecimiento/ensayo.

Disposicion de la placa de dilucion

Las muestras de anticuerpos de prueba y control se diluyeron en serie en etapas de dilucion de 5 veces (TGFp2 o TGFp3) o de 10 veces (TGFp1) en medio de crecimiento/ensayo y se preincubaron en presencia y ausencia de TGFp1, TGFp2 o TGFp3 a 37°C durante 75 minutos. Las celulas a 549 se incubaron en 200 gl/pocillo de medio de ensayo durante 18-24 horas a 37°C. Despues de 18-24 horas, una parte alicuota de 100 gl de sobrenadante de medio de cultivo se tomo para analisis de IL-11 por medio de ELISA.

Ejemplo 7

Para determinar la eficacia biologica de un anticuerpo monoclonal de TGFp pan-neutralizante humano para tratar insuficiencia renal cronica y otras indicaciones clinicas caracterizadas por fibrosis patogenica, se estudiaron los efectos del anticuerpo en un modelo de obstruccion ureteral unilateral en ratas (OUU).

Ratas Sprague Dawley adultas (Taconic Farms, Germantown, NY, EE. UU.) que pesaban 250-280 gramos (aproximadamente de 6 semanas) se alojaron en un entorno con aire, temperatura y luz controlados. Las ratas que sufrian OUU recibieron una pequena incision abdominal en la linea media ventral para exponer el rinon izquierdo y el ureter superior. Se ligo el ureter a nivel del polo inferior del rinon con sutura de seda y una segunda vez a aproximadamente 0,2 cm por debajo de la primera. Ratas operadas de forma simulada recibieron el mismo protocolo quirurgico pero sin ligadura ureteral.

Las ratas obstruidas se trataron con PBS, un anticuerpo monoclonal pan-neutralizante murino (1D11), un anticuerpo de control coincidente con isotopo (13C4) o un anticuerpo monoclonal de TGFp pan-neutralizante humano de la invencion como a continuacion. Se administraron los anticuerpos a las ratas intraperitonealmente comenzando en el dia de la ligadura ureteral durante un curso de 3 semanas. Se administraron 13C4 y 1D11 a 5 mg/kg (3 veces/semana) y se dio el anticuerpo pan-neutralizante humano a las ratas a 5 mg/kg (cada 5 dias). Al final de las 3 semanas, se sacrificaron las ratas, se perfundieron los rinones con PBS durante 3 minutos y se recolectaron los rinones perfundidos para el analisis de determinacion de ARNm de contenido de colageno y examen histologico. Para evaluar la extension de la fibrosis tisular, se determino el contenido total de colageno tisular por medio de analisis bioquimico de hidroxiprolina en extractos hidrolisados segun Kivirikko et al. Este ensayo se basa en la observacion de que esencialmente toda la hidroxiprolina en tejidos animales se encuentra en el colageno.

Tambien se llevo a cabo un ensayo de colageno Sircol para el contenido total de colageno. El ensayo de colageno Sircol mide la cantidad de colagenos solubles acido/pepsina totales basado en la union especifica de tinte rojo sirio con la cadena lateral del colageno tisular.

Las ratas OUU tratadas con el anticuerpo monoclonal pan-neutralizante humano mostraron un 43,4% de reduccion en contenido de hidroxiprolina (1,98±0,26 pg/mg de tejido seco) cuando se compara con el grupo tratado con PBS (3,5±0,3 pg/mg de tejido seco, p<0,05). La disminucion en la fibrosis renal fue apoyada por la reduccion en colageno solubilizado total en los rinones afectados, tal como se determina por un ensayo basado en tinte rojo sirio (simulado: 18,5±2,6, PBS: 69,3±3,8, y anticuerpo monoclonal pan-neutralizante humano: 35,6±5,2 pg/100 mg de tejido, p<0,05 frente a PBS).

Tambien se evaluo la capacidad de un anticuerpo monoclonal anti-TGFp pan-neutralizante humano para reducir fibrosis tisular por medio de examen inmunohistoquimico.

En animales de control, la obstruccion ureteral durante tres semanas provoco una alteracion generalizada de la estructura tubular renal con distension marcada, atrofia celular y necrosis/apoptosis, inflamacion tisular y expansion tubulointersticial con fibrosis evidente. Hubo una pequena evidencia de dano glomerular. Las ratas tratadas con 1D11 o el anticuerpo monoclonal pan-neutralizante humano, por otro lado, mostraron conservacion de la estructura renal tal como se juzgo por dilacion tubular atenuada y desorganizacion, infiltrados inflamatorios reducidos (celularidad) y expansion tubulointersticial y fibrosis disminuidas.

Tambien se midio el efecto del tratamiento con un anticuerpo monoclonal anti-TGFp pan-neutralizante humano en expresion genetica regulada por TGFp

El ARNm de TGF^1 se redujo significativamente en los animales con OUU tratados con anticuerpo monoclonal panneutralizante humano en comparacion con animales tratados tanto con PBS como tratados con anticuerpo de control 13C4. Tambien se ha visto una disminucion significativa en los niveles de ARNm para colageno tipo III en los rinones obstruidos tratados con los anticuerpos anti-TGFp murinos y humanos en comparacion con aquellos tratados con PBS o 13C4 que indican una disminucion en sintesis de colageno.

Se confirma ademas la eficacia de un anticuerpo monoclonal anti-TGFp pan-neutralizante humano para reducir la sintesis de TGFp autoinducida por medio de la medicion de la proteina TGFp1 renal total.

En comparacion con los animales operados de forma simulada, los rinones obstruidos exhibieron un aumento marcado en TGFp1 en el tejido total. Sin embargo, a las ratas obstruidas a las que se les administro anticuerpo monoclonal pan-neutralizante humano mostraron un 75% de reduccion de niveles de TGFp1 en el tejido, significativamente por debajo de los niveles registrados para ambos grupos de control. En comparacion, el anticuerpo 1D11 murino redujo los niveles de TGFp1 en el tejido en un 45%, en comparacion con los grupos de control.

Los resultados descritos anteriormente demuestran que la neutralizacion de TGFp con un anticuerpo monoclonal anti-TGFp pan-neutralizante humano interrumpe eficazmente el bucle de regulacion autocrina de TGFp concomitante con la prevencion de produccion de TGFp1 y expresion de ARNm de colageno III.

Se determino ademas el efecto de un anticuerpo monoclonal anti-TGFp pan-neutralizante humano en la expresion de actina muscular lisa (a-SMA) como indicador indirecto de inhibicion de TGFp. La expresion de actina muscular lisa es un indicador de miofibroblastos activados, que se asocian con fibrosis tisular y producen tejido conectivo fibroso. El TGFp es un importante inductor de la activacion y transformacion fenotipica de fibroblastos estromales y de celulas epiteliales residentes en celulas miofibroblasticas.

Se detecto la proteina a-SMA por medio de analisis Western blot estandar.

Cuando se comparo con animales operados de forma simulada, las ratas con rinones obstruidos mostraron una espectacular regulacion positiva en la proteina a-SMA tal como se midio por Western blot de homogenatos tisulares (los datos no se muestran). Las ratas obstruidas a las que se les administro anticuerpo monoclonal anti-TGFp pan neutralizante humano mostraron una reduccion significativa (75% en comparacion con controles con PBS) en expresion de a-SMA medible.

Estos resultados demuestran la eficacia de un anticuerpo monoclonal anti-TGFp pan-neutralizante humano en la reduccion de deposicion de colageno en los rinones fibroticos, lo que indica claramente que el anticuerpo es un potente inhibidor de produccion y deposicion de colageno renal en este modelo de lesion renal grave y fibrosis tutubulointersticial. Debido a que el proceso de fibrosis tisular en organos tales como pulmon, higado o rinon posee mecanismos o vias comunes, el experto apreciara que el anticuerpo es util en el tratamiento de enfermedades renales cronicas al igual que en otras indicaciones clinicas caracterizadas por fibrosis patogenica.

SEQ ID NO 1:

Secuencia de nucleotidos que codifica VH PET1073G12

caggtgcagctggtgcagtctgggggtgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaag

GTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCAGTAGCAATGTTATCAGCTGGGTGCGC CAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGGGGGGTCATCCCTATTGTTGATATT GCGAAGTACGCACAGAGATTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACT AGTACAACTTACATGGAGTTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTGTATTAC TGTGCGAGCACACTTGGTCTCGTCCTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACG TTGGTCACCGTCTCCTCA .

SEQ ID NO 2:

Secuencia de aminoacidos de VH PET1073G12

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTPSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDI

a n y a q r p k g r v t it a d e s t s t t y m e ls s lr s e d t a v y y c a s t lg lv ld a m d y w g q g t

LVTVSS SEQ ID NO 3:

Secuencia de aminoacidos de HCDR1 PET1073G12

SNVIS SEQ ID NO 4:

Secuencia de aminoacidos de HCDR2 PET1073G12

GVIPIVDIANYAQRFKG SEQ ID NO 5:

Secuencia de aminoacidos de HCDR3 PET1073G12

TLGLVLDAMDY SEQ ID NO 6:

Secuencia de nucleotidos que codifica VL PET1073G12

GAAACGGTACTCACGCAGTCTCCAGGTACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCC ACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTTGGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTATCAG CAGAAACCTGGTCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCACCT GGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGTACCGACTTCACTCTCACCATC

AGCCGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATGCTGACTCA CCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA

SEQ ID NO 7:

Secuencia de aminoacidos de VL PET1073G12

ETVLTQSPGTLSLSPGERA.TLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAP

GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIK

SEQ ID NO 8:

Secuencia de aminoacidos de LCDR1 PET1073G12

RASQSLGSSYLA SEQ ID NO 9:

Secuencia de aminoacidos de LCDR2 PET1073G12

GASSRAP SEQ ID NO 10:

Secuencia de aminoacidos de LCDR3 PET1073G12

QQYADSPIT SEQ ID NO 11:

Secuencia de nucleotidos que codifica VH PET1074B9

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAG GTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCAGTAGCAATGTTATCAGCTGGGTGCGC CAGGCCCCTGGACAAGGGCTCGAGTGGATGGGGGGGGTCATCCCTATTGTTGATATT GCGAACTACGCACAGAGATTCAAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACT AGTACAACTTACATGGAGTTGAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACGGCCGTGTATTAC TGTGCGCTGCCACGCGCTTTCGTCCTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGTACG TTGGTGACCGTCTCCTCA SEQ ID NO 12:

Secuencia de aminoacidos de VH PET1074B9

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDI ANYAQRFKGRVTXTADESTSTTYMELSSLRSEDTAVYYCALPRAFVLDAMDYWGQGT LVTVSS

SEQ ID NO 13:

Secuencia de aminoacidos de HCDR1 PET1074B9

SNVIS SEQ ID NO 14:

Secuencia de aminoacidos de HCDR2 PET1074B9

GVIPIVDIANYAQRFKG SEQ ID NO 15:

Secuencia de aminoacidos de HCDR3 PET1074B9

PRAFVLDAMDY SEQ ID NO 16:

Secuencia de nucleotidos que codifica VL PET1074B9

GAAACGGTACTCACGCAGTCTCCAGGTACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCC ACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTCTTGGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTATCAG CAGAAACCTGGTCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCACCT GGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGTACCGACTTCACTCTCACCATC AGCCGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTATGCTGACTCA CCGATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA

SEQ ID NO 17:

Secuencia de aminoacidos de VL PET1074B9

ETVLTQS PGTLSLSPGERATLSCRAS QSLGSS YLAWYQQKPGQAPRLLIYGAS SRAP GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYADS PITFGQGTRLEIK

SEQ ID NO 18:

Secuencia de aminoacidos de LCDR1 PET1074B9

RASQSLGSSYLA SEQ ID NO 19:

Secuencia de aminoacidos de LCDR2 PET1074B9

GASSRAP SEQ ID NO 20:

Secuencia de aminoacidos de LCDR3 PET1074B9

QQYADSPIT SEQ ID NO 21:

Secuencia de nucleotidos que codifica VH PET1287A10 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGZlAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAA GTGTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCACCTCTTTCATCAATTGGGTGCGA CAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTATCTTTGATATA

a c a aac tac g c ac ag aaatttc ag ag c ag ag tc ac tattac c g c g g a c aaatc c ac g AGCACCGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGCGCTCTGAGGACACGGCTGTGTATTAC TGCGCACGCGGAAATGGTAACTACGCCCTGGATGCTATGGACTACTGGGGTCAGGGT ACGTTGGTCACCGTCTCCTCA

. '

SEQ ID NO 22:

Secuencia de aminoacidos de VH PET1287A10

q v q lv q s g a e v k k p g s s v k v s c k a s g g t f s t s f in w v r q a p g q g le w m g g iip if d i TNYAQKFQSRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGNGNYALDAMDYWGQG TLVTVSS

SEQ ID NO 23:

Secuencia de aminoacidos de HCDR1 PET1287A10

TSFIN SEQ ID NO 24:

Secuencia de aminoacidos de HCDR2 PET1287A10

GIIPIFDITNYAQKFQS SEQ ID NO 25:

Secuencia de aminoacidos de HCDR3 PET1287A10

GNGNYALDAMDY SEQ ID NO 26:

Secuencia de nucleotidos que codifica VL PET1287A10

GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCC &CCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTTGCCTGGTACCAG CAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACT GGCATCCCTGACAGATTCAGTGGCAGCGGGTCTGGGAOAGATTTCACTCTCACCATC AGCCGCCTGGAGCCTGAAGATTTCGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATTATGATAGT CCCATCACCTTCGGCCAAGGGACACGACTGGAGATTAAA SEQ ID NO 27:

Secuencia de aminoacidos de VL PET1287A10

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYFAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYYDSPITFGQGTRLEIK

SEQ ID NO 28:

Secuencia de aminoacidos de LCDR1 PET1287A10

RASQSVSSSYFA SEQ ID NO 29:

Secuencia de aminoacidos de LCDR2 PET1287A10

GASSRAT SEQ ID NO 30:

Secuencia de aminoacidos de LCDR3 PET1287A10

QQYYDSPIT SEQ ID NO 31:

WGQGTLVTVSS

Aviso: Los CDR se definen segun Kabat et al. (1991)

Tabla 1

Isoforma de TGFp Media geometrica de CI⁵⁰ (intervalos de confianza del 95%; nM)

PET1073G12 n=6 PET1074B9 n=6 PET1287A10 n=5 1D11.16 n=25 TGFp1 0,8 (0,3-2,2) < 1 # 1,8 (1-3,6) 3,9 (2,9-5,2) TGFp2 13,0 (8,7-18,7) 1,5 (1,1-2,2) 25,0 (13,3-47,0) 9,2 (7,3-11,5) TGFp3 6,0 (4,2-8,4) 2,0 (1-4,1) 0,5 (0,2-1) 1,0 (0,5-2,0)

La neutralizacion de los efectos anti-proliferativos de TGFp1, TGFp2 y TGFp3 en MLEC utilizando IgG4 o 1D11.16 germinales PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10. El numero total de puntos de datos para cada media se indica por medio del numero n y representa una titulacion independiente de cada anticuerpo. Los valores # CI⁵⁰ no se pueden determinar como que el anticuerpo fue demasiado potente en el intervalo de concentracion sometido a ensayo y no se obtuvo una curva de respuesta de dosis completa.

Tabla 2

Isoforma de TGFp Media geometrica de CI⁵⁰ (intervalos de confianza del 95%)

PET1073G12 n=5 PET1074B9 n=4 PET1287A10 n=4 1D11.16 n=6 TGFp1 0,44 (0,24-0,82) 0,18 (0,14-0,28) 0,8 (0,44-1,3) 0,4 (0,19-0,96) TGFp2 12,0 (5,4-26) 4,6 (1,9-11) 3,9 (0,9-16,6) 4,0 (1,9-8,3) TGFp3 2,8 (1,27-6,5) 0,28 (0,02-3,45) 0,45 (0,25-0,79) 0,16 (0,04-0,18)

Las potencias de IgG4 o 1D11.16 germinales PET1073G12, PET1074B9 o PET1287A10 en el ensayo con NHLF. El numero total de puntos de datos para cada media se indica por medio del numero n y representa una titulacion independiente de cada anticuerpo.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una molecula de anticuerpo que se une y neutraliza TGFpl, TGFp2 y TGFp3 humanos, en donde dicha molecula de anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos del dominio VH PET1073G12, que es SEQ ID NO: 2, y una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos del dominio VL PET1073G12, que es SEQ ID NO: 7, y en donde la region constante de cadena pesada es una region constante de anticuerpo humano a partir de IgG4.

2. La molecula de anticuerpo segun la reivindicacion 1, en donde la cadena ligera comprende una region constante de cadena ligera ^k humana.

3. Una composicion que comprende la molecula de anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 -2.

4. Un acido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica una molecula de anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 -2, o un dominio VH y un dominio VL de dicha molecula de anticuerpo.

5. Una celula huesped que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica el dominio VH de una molecula de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y una secuencia de nucleotidos que codifica el domino VL de dicha molecula de anticuerpo.

6. Un metodo para producir una molecula de anticuerpo que comprende cultivar una celula huesped que comprende: 1) una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio variable VH, y

2) una secuencia de nucleotidos que codifica un dominio variable VL,

de la molecula de anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en condiciones para producir dicha molecula de anticuerpo y aislar y/o purificar dicha molecula de anticuerpo.

7. El metodo segun la reivindicacion 6, que comprende ademas formular la molecula de anticuerpo en una composicion que incluye al menos un componente activo adicional.

8. Una molecula de anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para su uso en el tratamiento de una enfermedad fibrotica, en donde la enfermedad fibrotica se selecciona de entre fibrosis renal, fibrosis pulmonar o fibrosis de pulmon.

9. Una molecula de anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para su uso en el tratamiento de cancer.

10. Una molecula de anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para su uso en el tratamiento de enfermedad mediada por el sistema inmune.

11. Una molecula de anticuerpo segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 para su uso en el tratamiento de enfermedad renal.

12. La molecula de anticuerpo para su uso segun la reivindicacion 11, en donde la enfermedad renal es glomerulonefritis, nefropatia o nefroesclerosis.