JP2019506390A - 合成オピオイドワクチン - Google Patents
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Abstract
フェンタニルはモルヒネより80倍以上強力な中毒性処方オピオイドである。フェンタニルの合成上の性質は、毒物学スクリーニングを逃れるが親薬物と同等の効力を示す危険な「デザイナー薬」類似体の創製を可能にしている。驚くべきことに、多数の死亡がフェンタニル誘導体の過剰摂取に関連づけられている。本明細書において、本発明者らは、フェンタニルクラス薬物の向精神作用を低減するための有効な免疫療法を記載する。広範なパネルのフェンタニル類似体に対する交差反応性を有する高レベルの抗体を誘導する単一コンジュゲートワクチンを創製した。更に、ワクチン接種マウスは致死性フェンタニル用量からの有意な防御を獲得した。最後に、血清から直接誘導された抗体の薬物特異性プロファイリングを可能にする、表面プラズモン共鳴(SPR)に基づく技術を確立した。本発明者らの新規開発フェンタニルワクチンおよび分析方法は合成オピオイド乱用に対する闘いにおいて役立ちうる。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
本発明は合成オピオイドワクチンに関する。
関連出願に対する相互参照
本出願は、2016年1月21日付け出願の米国仮特許出願第62/281,262号(その開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする)の優先権を主張するものである。
本出願は、2016年1月21日付け出願の米国仮特許出願第62/281,262号(その開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする)の優先権を主張するものである。
本発明者による関連特許出願には以下のものが含まれる(それらの開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする):
US12/374908、PCT07/074976、WO08/016976、“Vaccines and method for controlling adiposity”;
US09/038546、PCT09/038546、WO09/120954、“Nicotine conjugates”;
US13/984230、PCT12/000079、WO12/108960、“Ghrelin mimetic polypeptide hapten immunoconjugates having improved solubility and immunogenicity and methods of use thereof”;
US13/261217、PCT10/002489、WO11/031327、“Nicotine haptens, immunoconjugates,and their uses”;
US14/367511、PCT11/001997、WO13/095321、“Heroin haptens,immunoconjugates,and related uses”;
US14/901794、PCT14/045019、WO15/002929、“Methods and compositions for treating obesity”;
US14/901799、PCT14/045023、WO15/002391、“Compositions and methods for treating obesity”;および
PCT15/031583、WO15/179403、“Enantiopure haptens for nicotine vaccine development”。
US12/374908、PCT07/074976、WO08/016976、“Vaccines and method for controlling adiposity”;
US09/038546、PCT09/038546、WO09/120954、“Nicotine conjugates”;
US13/984230、PCT12/000079、WO12/108960、“Ghrelin mimetic polypeptide hapten immunoconjugates having improved solubility and immunogenicity and methods of use thereof”;
US13/261217、PCT10/002489、WO11/031327、“Nicotine haptens, immunoconjugates,and their uses”;
US14/367511、PCT11/001997、WO13/095321、“Heroin haptens,immunoconjugates,and related uses”;
US14/901794、PCT14/045019、WO15/002929、“Methods and compositions for treating obesity”;
US14/901799、PCT14/045023、WO15/002391、“Compositions and methods for treating obesity”;および
PCT15/031583、WO15/179403、“Enantiopure haptens for nicotine vaccine development”。
米国政府の援助に関する陳述
本発明は、米国薬物乱用研究所(National Institute on Drug Abuse)により授与されたDA039634に基づく米国政府の援助によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
本発明は、米国薬物乱用研究所(National Institute on Drug Abuse)により授与されたDA039634に基づく米国政府の援助によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
フェンタニルは、スケジュールII処方鎮痛剤として合法的に使用される有効な合成オピオイドである。しかし、フェンタニルは、不法スケジュールIオピオイドであるヘロインと同じ薬理学的標的である脳内ミュー−オピオイド受容体(MOR)の活性化を介してそれが誘発する多幸感ゆえに、有意な乱用傾向を示す[1]。MORの過度の活性化は、致死的となりうる呼吸抑制をもたらす[2]。フェンタニルはヘロインの効力を10倍以上、そしてモルヒネの効力を80倍以上、上回り、規制無しの入手源からそれが購入された場合、過剰摂取の重大なリスクをもたらす[3]。更に、フェンタニルの合成の容易さは不法製造およびデザイナードラッグ類似体の創製を可能にする[4]。これらの類似体の薬理学的特性が未だ適切に特徴づけられていないという事実はそれらを特に危険なものにし、たとえメチル付加であっても、特に3位における或る修飾が効力を増強しうる場合には、特にそれが言える[5]。
昨年7月、米国薬物乱用研究所(National Institute on Drug Abuse)(NIDA)はフェンタニルの過剰摂取による死亡の憂慮すべき急増を報告した[6]。これは、1980年代後半におけるα−メチルフェンタニル(別名:「チャイナ・ホワイト(China White)」)から始まる長期にわたる過剰摂取症例における最新の更新によるものである[7]。より新しいデザイナー類似体であるアセチルフェンタニルは、ヘロインまたはヘロイン混合物としてのその詐欺販売ゆえに、オピオイドの蔓延を更に悪化させ[8]、それは多数の過剰摂取死に関連づけられている[9]。米国に加えて、欧州全域においても、フェンタニルの乱用が増加しており、最も多くの過剰摂取死はエストニアで生じ、1人当たりのフェンタニルの最大消費はドイツおよびオーストリアにおいて報告された[10]。
[式中、R1=CH2CH2C(=O)XおよびX=OHまたはその活性エステル;R2=Hまたは(C1−C4)アルキル基;R3=Hまたは(C1−C4)アルキル基;およびR4=Hまたは(C1−C4)アルキル基]の化合物を含む、フェンタニルクラス薬物に対する特異性を有するIgG抗体をインビボで産生させるためのワクチンを、担体とコンジュゲート化(結合)した場合に生成させるためのハプテン;および請求項1記載の式(I)(ここで、Xはタンパク質担体またはアミノ官能基化ビーズを含み、該タンパク質または該ビーズは該ハプテンとアミド結合を形成する)の化合物を含む、フェンタニルクラス薬物に対するインビボ「イムノアンタゴニスト(immunoantagonist)」を生成させるためのハプテンコンジュゲートを提供する。例えば、該タンパク質担体はウシ血清アルブミン(BSA)または破傷風トキソイド(TT)であることが可能であり、あるいは該アミノ官能基化ビーズは、Dynabead M−270アミンであることが可能である。
本発明は更に、前記のハプテンコンジュゲートの有効量を投与することにより哺乳動物において製造されるワクチンを提供する。例えば、ワクチン製造のために使用される哺乳動物はマウスでありうる。該ワクチンはIgG型抗体を含みうる。
追加的な実施形態においては、本発明は、該ワクチンの有効量を患者に投与することを含む、患者における作用部位におけるフェンタニルクラス薬物の濃度を有効に最小にする方法を提供する。また、該ワクチンの有効量の投与は、それ無しでは致死量となるフェンタニルクラス薬物からの有意な防御を患者にもたらす。更に、患者への該ワクチンの有効量の投与はフェンタニルクラス薬物の嗜癖傾向および過剰摂取の可能性を低減する。
詳細な説明
フェンタニルおよびその類似体の有害で嗜癖性の作用に対処するために、本発明者らは、コカイン[11]、ニコチン[12]、メタンフェタミン[13]およびヘロイン[14]に対する従来の作戦と同様に、嗜癖治療に対する免疫薬物療法アプローチを追求した。この戦略の基礎は、作用部位における標的薬物の濃度を有効に最小にするインビボ「イムノアンタゴニスト」を生成させるためのタンパク質−薬物コンジュゲートの能動的ワクチン接種を含む。結果として、該ワクチンは特定の薬物の嗜癖傾向および過剰摂取の可能性を低減する。本発明において、本発明者らは、有効なフェンタニルコンジュゲートワクチンの最初の例を記載する。免疫化後、このワクチンは、フェンタニルクラス薬物に対する特異性を有するIgG抗体の内因性生成を成功裏に刺激した。更に、マウス抗血清は、SPR分析法により、種々のフェンタニル類似体に対してナノモルのアフィニティを示した。潜在的に致死的な量のフェンタニル類似体をマウスに投与したところ、該ワクチンは有意な防御をもたらした。現在までの他のワクチンはいずれも、乱用薬物の急性致死作用の遮断を示していない。重要なことに、本発明者らの研究努力は、フェンタニルクラス薬物の薬力学的効果を低減するための著しい進歩をもたらした。
フェンタニルおよびその類似体の有害で嗜癖性の作用に対処するために、本発明者らは、コカイン[11]、ニコチン[12]、メタンフェタミン[13]およびヘロイン[14]に対する従来の作戦と同様に、嗜癖治療に対する免疫薬物療法アプローチを追求した。この戦略の基礎は、作用部位における標的薬物の濃度を有効に最小にするインビボ「イムノアンタゴニスト」を生成させるためのタンパク質−薬物コンジュゲートの能動的ワクチン接種を含む。結果として、該ワクチンは特定の薬物の嗜癖傾向および過剰摂取の可能性を低減する。本発明において、本発明者らは、有効なフェンタニルコンジュゲートワクチンの最初の例を記載する。免疫化後、このワクチンは、フェンタニルクラス薬物に対する特異性を有するIgG抗体の内因性生成を成功裏に刺激した。更に、マウス抗血清は、SPR分析法により、種々のフェンタニル類似体に対してナノモルのアフィニティを示した。潜在的に致死的な量のフェンタニル類似体をマウスに投与したところ、該ワクチンは有意な防御をもたらした。現在までの他のワクチンはいずれも、乱用薬物の急性致死作用の遮断を示していない。重要なことに、本発明者らの研究努力は、フェンタニルクラス薬物の薬力学的効果を低減するための著しい進歩をもたらした。
フェンタニルワクチンの開発においては、ハプテンの設計が、初期の、そしておそらくは最も重要な課題であった。本発明者らが既に報告しているとおり、イムノコンジュゲートが成功するためには、小分子ハプテンが標的分子の天然構造を忠実に維持している必要がある[15]。
フェンタニルだけでなくデザイナー類似体にも対処することが求められているため、実質的に全てのフェンタニル誘導体に対する広範な免疫特異性を有する抗体を生成させるために、本発明者らのハプテンは、コアであるN−(1−フェネチルピペリジン−4−イル)−N−フェニルアセトアミド骨格を組み込んでいる(図1)。更に、フェンタニルにおけるプロパノイル基をリンカー結合点として選択した。なぜなら、それは該コア構造を立体的に妨害しないからである(図1)。ハプテン合成は、フェンタニルにおけるプロパノイル基をグルタル酸部分で置換することにより達成された。これは免疫原性担体タンパク質へのアミドカップリングのための標準的なバイオコンジュゲート化学法を可能にするものである。破傷風トキソイド(TT)タンパク質を選択したのは、それが、臨床的に承認された破傷風および複合糖質ワクチンの成分として使用されているからである。TT表面リジンへのフェンタニルハプテンのコンジュゲート化(結合)の後、得られたイムノコンジュゲート(免疫複合体)(Fent−TTと称される;図1)をマウスに投与した。Fent−TTを、ヘロインコンジュゲートワクチンに対するIgG抗体応答を増強するのに有効であることが判明しているアジュバントであるミョウバンおよびCpG ODN 1826と共に製剤化した[14a]。図2に示されているとおり、Fent−TTワクチンは、1回の注射の後でさえも、ELISAによる非常に高い抗フェンタニル抗体中点力価(>100,000)を誘導して、フェンタニルに対する十分なインビボ中和能をもたらした。
ワクチンの性能を評価するために、本発明者らは、げっ歯類モデルにおいてオピオイド薬の鎮痛能力を測定するための標準的な方法である抗侵害受容アッセイを用いた[14a,16]。フェンタニルのようなオピオイドは用量依存的に疼痛閾値を増加させ、これらの閾値は、熱い表面により誘発される侵害受容までの動物の潜時を測定することにより定量されうる。薬物ワクチンは投与用量の血清抗体媒介性免疫拮抗作用により標的薬物の薬理学的作用を鈍らせる。したがって、成功したワクチンは抗侵害受容アッセイにおける薬物用量応答曲線を「右」へシフトさせるはずである。ワクチン接種マウスおよび未ワクチン接種マウスにおける薬物ED50用量の比較は薬物ワクチン効力に関する有用な測定基準として役立つ。これまでに、本発明者らは、ヘロイン依存性ラットにおける薬物自己投与をなくさせた、約5〜10倍のワクチン誘導性シフトを報告している[14a,14b]。本研究において、本発明者らは、30倍を超える大きなフェンタニルED50シフトを観察した。注目すべきことに、最初の6週の試験セッション中に、フェンタニルの投与は該ワクチンの防御能を無効にすることができなかった。1ヵ月後(第10週)に、ワクチン接種マウスにおける抗薬物力価は、より小さいフェンタニル用量を使用してED50測定のための完全用量応答曲線を作成しうる点まで減少していた。大きなワクチン媒介性シフトが観察された(尾部浸漬試験において33倍;図3)。注目すべきことに、ワクチン接種マウスに安全に投与された2つの最大用量(2.2および4.4mg/kg)において、未処理マウスはそれぞれ18および55%の致死率を示し、したがって、このことは、該ワクチンが致死量のフェンタニルを遮断しうることを実証している。
該ワクチンが他のフェンタニル類似体を中和しうることの証拠として、Fent−TT免疫マウスは、最も一般的な不法フェンタニル誘導体の2つである3−メチルフェンタニルおよびα−メチルフェンタニル(別名「チャイナ・ホワイト(China White)」)(構造は図1を参照されたい)からの防御を示した。α−Me類似体は親化合物と同等の効力を有し、該ワクチンはα−MeのED50を約8倍シフトさせることが可能であった(図3)。一方、3−Me類似体は非常に強力であったが(フェンタニルの約10倍大きな効力)、該ワクチンは尚も4倍のED50シフトを示した(図3)。総合すると、本発明者らの行動結果は、Fent−TTワクチンが、大きなフェンタニル用量の十分な減弱をインビボでもたらした一方で、フェンタニル類似体に対する治療的に有用なレベルの交差反応性を示したことを示している。臨床的に、これらの結果は、Fent−TTが、フェンタニルの乱用および過剰摂取誘発性致死を防ぐための有効な嗜癖治療であることを意味する。
薬物動態の観点から、本発明者らは、フェンタニル用量の生体分布に対するFent−TTワクチンの効果を調べた。フェンタニル用量の投与の後、ほぼtmax(最大薬物血漿濃度における時間)において対照マウスおよびワクチン接種マウスの両方を犠死させ、脳サンプルおよび血液サンプルの両方におけるフェンタニル濃度をLCMSにより測定した。本発明者らの結果は、ワクチン接種マウスにおける血清抗体が、対照マウスにおける血清タンパク質の場合に比べて45倍の量のフェンタニルに結合するデポーとして作用することを明らかに示している。これはワクチン接種マウスのフェンタニル脳内濃度の有意な減少と解釈され、該ワクチンがフェンタニルの精神作用をどのようにして低減するのかの薬理学的説明に役立つ。
行動および薬物動態の結果はFent−TTワクチン接種マウス由来の抗血清の徹底的な生化学分析によって裏付けられた。これを達成するために、本発明者らは表面プラズモン共鳴(SPR)分光法を用いた。これは、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−小分子結合相互作用を調べるための高感度技術である[17]。SPRの新たな適用において、本発明者らは種々のフェンタニル類似体に対するワクチン接種マウス血清におけるポリクローナル抗体の結合アフィニティを測定した。希釈したマウス血清を一連の濃度の選択したフェンタニル誘導体とプレインキュベートし、ついで、Fent−BSA被覆チップを含有するBiacore 3000内に注入した。本質的には、この方法は、系列希釈遊離薬物が抗体結合に関して固定化薬物ハプテンと競合する競合ELISAの、より洗練された形態である[18]。SPR競合実験(図5a)からの本発明者らの結果は、Fent−TT免疫化マウスからの抗体がフェンタニル誘導体に対する高いアフィニティを有し、低いナノモルのIC50値およびpM範囲の検出限界を伴う結合曲線を与えることを示した(図5aおよび未加工センサーグラム;図S2)。異なるR1アルキル基を有する類似体間の相対的アフィニティは非常に類似していた。これはおそらく、R1位をリンカー結合点として用いたことによるものであろう。予想どおり、他の位置でのメチル化はより低いアフィニティをもたらしたが、依然としてIC50値は100nM未満であった。更に、SPR IC50は行動アッセイにおける結果を反映しており、どちらの場合も、Fent>α−Me>シル−3−Meの傾向に従った。Fent−TTワクチンはフェンタニルクラス薬物に対する広範な特異性を示したため、臨床的に使用されている2つのオピオイドであるメタドン(MeD)およびオキシコドン(Oxy)を、最小の交差反応性を保証するために試験した。実際、これらのオピオイドに対するアフィニティはフェンタニルと比較して7500倍以上低かった(図5a)。このことは、それらがFent−TTワクチン接種対象において尚も使用されうることを示している。
得られたIC50値が実際のKDを代表するものであることを確認するために、SPR法の更なる検証を続行した。ハプテンのアフィニティは遊離薬物のアフィニティを常に反映しているわけではない。この問題に対処するために、抗フェンタニル抗体をアフィニティ精製し、遊離フェンタニル結合動力学の直接測定のために、SPRチップ上にそれらをローディングした。図5bのセンサーグラムに示されているとおり、精製抗体のフェンタニルKD(2nM)は、競合法により決定されたIC50値(5nM)とほぼ一致している。このように、本発明者らは、ポリクローナル血清抗体の薬物アフィニティを測定するための正確な方法として、SPR競合法を実証した。免疫薬物療法の重要な態様は抗薬物抗体の適切な特徴づけであり、SPR法は、薬物ワクチン開発のこの側面を促進するのに役立ちうるであろう。また、この方法は、多種多様なフェンタニル誘導体の存在に関して、生物学的サンプル、例えば血液または尿をスクリーニングするために用いられうるであろう。なぜなら、特に、多数のフェンタニル類似体の検出限界は1nM未満であるからである(図5a)。
本研究において、オピオイドの乱用の増加に対処するのに役立ちうる潜在的な治療剤が得られた。正常な薬物誘発性「恍惚感」を得るのに必要な小さなフェンタニルクラス薬物用量を容易に除去し、そしてまた、潜在的に致死性である大きなフェンタニルクラス薬物用量を減弱する有効なフェンタニルコンジュゲートワクチンが開発された。更に、このワクチンの成功は、アカデミックな新規性から実用的な治療へと免疫薬物療法を進歩させるのに役立ち、「バス・ソルト(bath salt)」のような他の有害なデザイナー薬に対するワクチンの創製を促進する[4,19]。
引用文献:
[1] P.A.Janssen,British Journal of Anaesthesia 1962,34,260−268.
[2] J.M.White,R.J.Irvine,Addiction 1999,94,961−972.
[3] G.L.Henderson,J Forensic Sci 1991,36,422−433.
[4] F.I.Carroll,A.H.Lewin,S.W.Mascarella,H.H.Seltzman,P.A.Reddy,Ann Ny Acad Sci 2012,1248,18−38.
[5] W.F.Van Bever,C.J.Niemegeers,P.A.Janssen,J Med Chem 1974,17,1047−1051.
[6] NIDA,Emerging Trends 2015.
[7] M.Martin,J.Hecker,R.Clark,J.Frye,D.Jehle,E.J.Lucid,F.Harchelroad,Ann Emerg Med 1991,20,158−164.
[8] J.M.Stogner,Ann Emerg Med 2014,64,637−639.
[9] C.Centers for Disease,Prevention,MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2013,62,703−704.
[10] J.Mounteney,I.Giraudon,G.Denissov,P.Griffiths,Int J Drug Policy 2015,26,626−631.
[11] a)B.A.Martell,E.Mitchell,J.Poling,K.Gonsai,T.R.Kosten,Biol Psych 2005,58,158−164;b)M.R.A.Carrera,J.A.Ashley,B.Zhou,P.Wirsching,G.F.Koob,K.D.Janda,PNAS 2000,97,6202−6206.
[12] a)M.Pravetoni,D.E.Keyler,R.R.Pidaparthi,F.I.Carroll,S.P.Runyon,M.P.Murtaugh,C.A.Earley,P.R.Pentel,Biochemical Pharmacology 2012,83,543−550;b)J.W.Lockner,J.M.Lively,K.C.Collins,J.C.M.Vendruscolo,M.R.Azar,K.D.Janda,J Med Chem 2015,58,1005−1011.
[13] a)A.Y.Moreno,A.V.Mayorov,K.D.Janda,JACS 2011,133,6587−6595;b)D.Ruedi−Bettschen,S.L.Wood,M.G.Gunnell,C.M.West,R.R.Pidaparthi,F.I.Carroll,B.E.Blough,S.M.Owens,Vaccine 2013,31,4596−4602.
[14] a)P.T.Bremer,J.E.Schlosburg,J.M.Lively,K.D.Janda,Mol Pharm 2014,11,1075−1080;b)J.E.Schlosburg,L.F.Vendruscolo,P.T.Bremer,J.W.Lockner,C.L.Wade,A.A.Nunes,G.N.Stowe,S.Edwards,K.D.Janda,G.F.Koob,PNAS 2013,110,9036−9041;c)K.D.Janda,J.B.Treweek,Nature Reviews Immunology 2012,12,67−72;d)R.Jalah,O.B.Torres,A.V.Mayorov,F.Y.Li,J.F.G.Antoline,A.E.Jacobson,K.C.Rice,J.R.Deschamps,Z.Beck,C.R.Alving,G.R.Matyas,Bioconjugate Chemistry 2015,26,1041−1053.
[15] a)G.N.Stowe,L.F.Vendruscolo,S.Edwards,J.E.Schlosburg,K.K.Misra,G.Schulteis,A.V.Mayorov,J.S.Zakhari,G.F.Koob,K.D.Janda,J Med Chem 2011,54,5195−5204;b)P.T.Bremer,K.D.Janda,J Med Chem 2012,55,10776−10780.
[16] A.W.Bannon,A.B.Malmberg,Curr Protoc Neurosci 2007,Chapter 8,Unit 8 9.
[17] a)G.Klenkar,B.Liedberg,Anal Bioanal Chem 2008,391,1679−1688;b)G.Sakai,K.Ogata,T.Uda,N.Miura,N.Yamazoe,Sensor Actuat B−Chem 1998,49,5−12.
[18] a)W.Runagyuttikarn,M.Y.Law,D.E.Rollins,D.E.Moody,Journal of Analytical Toxicology 1990,14,160−164;b)G.S.Makowski,J.J.Richter,R.E.Moore,R.Eisma,D.Ostheimer,M.Onoroski,A.H.B.Wu,Ann Clin Lab Sci 1995,25,169−178.
[19] C.L.German,A.E.Fleckenstein,G.R.Hanson,Life sciences 2014,97,2−8.
[1] P.A.Janssen,British Journal of Anaesthesia 1962,34,260−268.
[2] J.M.White,R.J.Irvine,Addiction 1999,94,961−972.
[3] G.L.Henderson,J Forensic Sci 1991,36,422−433.
[4] F.I.Carroll,A.H.Lewin,S.W.Mascarella,H.H.Seltzman,P.A.Reddy,Ann Ny Acad Sci 2012,1248,18−38.
[5] W.F.Van Bever,C.J.Niemegeers,P.A.Janssen,J Med Chem 1974,17,1047−1051.
[6] NIDA,Emerging Trends 2015.
[7] M.Martin,J.Hecker,R.Clark,J.Frye,D.Jehle,E.J.Lucid,F.Harchelroad,Ann Emerg Med 1991,20,158−164.
[8] J.M.Stogner,Ann Emerg Med 2014,64,637−639.
[9] C.Centers for Disease,Prevention,MMWR Morb Mortal Wkly Rep 2013,62,703−704.
[10] J.Mounteney,I.Giraudon,G.Denissov,P.Griffiths,Int J Drug Policy 2015,26,626−631.
[11] a)B.A.Martell,E.Mitchell,J.Poling,K.Gonsai,T.R.Kosten,Biol Psych 2005,58,158−164;b)M.R.A.Carrera,J.A.Ashley,B.Zhou,P.Wirsching,G.F.Koob,K.D.Janda,PNAS 2000,97,6202−6206.
[12] a)M.Pravetoni,D.E.Keyler,R.R.Pidaparthi,F.I.Carroll,S.P.Runyon,M.P.Murtaugh,C.A.Earley,P.R.Pentel,Biochemical Pharmacology 2012,83,543−550;b)J.W.Lockner,J.M.Lively,K.C.Collins,J.C.M.Vendruscolo,M.R.Azar,K.D.Janda,J Med Chem 2015,58,1005−1011.
[13] a)A.Y.Moreno,A.V.Mayorov,K.D.Janda,JACS 2011,133,6587−6595;b)D.Ruedi−Bettschen,S.L.Wood,M.G.Gunnell,C.M.West,R.R.Pidaparthi,F.I.Carroll,B.E.Blough,S.M.Owens,Vaccine 2013,31,4596−4602.
[14] a)P.T.Bremer,J.E.Schlosburg,J.M.Lively,K.D.Janda,Mol Pharm 2014,11,1075−1080;b)J.E.Schlosburg,L.F.Vendruscolo,P.T.Bremer,J.W.Lockner,C.L.Wade,A.A.Nunes,G.N.Stowe,S.Edwards,K.D.Janda,G.F.Koob,PNAS 2013,110,9036−9041;c)K.D.Janda,J.B.Treweek,Nature Reviews Immunology 2012,12,67−72;d)R.Jalah,O.B.Torres,A.V.Mayorov,F.Y.Li,J.F.G.Antoline,A.E.Jacobson,K.C.Rice,J.R.Deschamps,Z.Beck,C.R.Alving,G.R.Matyas,Bioconjugate Chemistry 2015,26,1041−1053.
[15] a)G.N.Stowe,L.F.Vendruscolo,S.Edwards,J.E.Schlosburg,K.K.Misra,G.Schulteis,A.V.Mayorov,J.S.Zakhari,G.F.Koob,K.D.Janda,J Med Chem 2011,54,5195−5204;b)P.T.Bremer,K.D.Janda,J Med Chem 2012,55,10776−10780.
[16] A.W.Bannon,A.B.Malmberg,Curr Protoc Neurosci 2007,Chapter 8,Unit 8 9.
[17] a)G.Klenkar,B.Liedberg,Anal Bioanal Chem 2008,391,1679−1688;b)G.Sakai,K.Ogata,T.Uda,N.Miura,N.Yamazoe,Sensor Actuat B−Chem 1998,49,5−12.
[18] a)W.Runagyuttikarn,M.Y.Law,D.E.Rollins,D.E.Moody,Journal of Analytical Toxicology 1990,14,160−164;b)G.S.Makowski,J.J.Richter,R.E.Moore,R.Eisma,D.Ostheimer,M.Onoroski,A.H.B.Wu,Ann Clin Lab Sci 1995,25,169−178.
[19] C.L.German,A.E.Fleckenstein,G.R.Hanson,Life sciences 2014,97,2−8.
実施例
化学
核磁気共鳴(1H NMR(400MHz)、13C NMR(100MHz))スペクトルは、特に示されていない限り、Bruker 400装置において測定した。1H NMRの化学シフトは、クロロホルム(7.26ppm)に対する百万分率(ppm)で示されており、結合定数はヘルツ(Hz)で示されている。スピン多重度に関しては、以下の略語を用いる:s=一重線、d=二重線、t=三重線、q=四重線、m=多重線、br=ブロード。13C NMRの化学シフトはクロロホルムに関する77.0ppmにおける三重線の中心線に対するppmとして示されている。エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量はThermoFinnigan LTQイオントラップで得た。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量スペクトルはApplied Biosystems Voyager DEで得た。分析用薄層クロマトグラフィー(TLC)はMerckプレコート分析用プレート(厚さ0.25mm、シリカゲル60F254)上で行った。分取TLC(PTLC)分離は、シリカゲル60F254でプレコートされたMerck分析用プレート(厚さ0.50mm)上で行った。フラッシュクロマトグラフィー分離は、特に記載されていない限り、Aldrichシリカゲル(カタログ番号717185,孔径60オングストローム、粒径40〜63μm、230〜400メッシュ)で行った。
化学
核磁気共鳴(1H NMR(400MHz)、13C NMR(100MHz))スペクトルは、特に示されていない限り、Bruker 400装置において測定した。1H NMRの化学シフトは、クロロホルム(7.26ppm)に対する百万分率(ppm)で示されており、結合定数はヘルツ(Hz)で示されている。スピン多重度に関しては、以下の略語を用いる:s=一重線、d=二重線、t=三重線、q=四重線、m=多重線、br=ブロード。13C NMRの化学シフトはクロロホルムに関する77.0ppmにおける三重線の中心線に対するppmとして示されている。エレクトロスプレーイオン化(ESI)質量はThermoFinnigan LTQイオントラップで得た。マトリックス支援レーザー脱離/イオン化(MALDI)質量スペクトルはApplied Biosystems Voyager DEで得た。分析用薄層クロマトグラフィー(TLC)はMerckプレコート分析用プレート(厚さ0.25mm、シリカゲル60F254)上で行った。分取TLC(PTLC)分離は、シリカゲル60F254でプレコートされたMerck分析用プレート(厚さ0.50mm)上で行った。フラッシュクロマトグラフィー分離は、特に記載されていない限り、Aldrichシリカゲル(カタログ番号717185,孔径60オングストローム、粒径40〜63μm、230〜400メッシュ)で行った。
動物実験
6〜8週齢の雄Swiss Websterマウス(n=6匹/群)をTaconic Farms(Germantown,NY)から得た。温度および湿度が制御された部屋を含むAAALAC認証動物施設においてマウスを群で収容し、逆光周期(点灯:午後9時〜午前9時)でマウスを維持した。全ての実験は、暗期中、一般には午後1時〜午後4時に行った。全般的な健康状態はScripps Research Instituteの科学者および獣医スタッフの両方によりモニターされ、全ての試験はScripps動物実験委員会(Scripps Institutional Animal Care and Use Committee)に従い実施され、米国国立衛生研究所動物実験委員会の方針(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)を遵守していた。100〜150μLの全血を採取するために、尾端切断術(1cm未満)を用いて力価定量のための血液血清サンプル採取を行い、ついでサンプルを7500rpmで8分間遠心分離して、血清を分離した。
6〜8週齢の雄Swiss Websterマウス(n=6匹/群)をTaconic Farms(Germantown,NY)から得た。温度および湿度が制御された部屋を含むAAALAC認証動物施設においてマウスを群で収容し、逆光周期(点灯:午後9時〜午前9時)でマウスを維持した。全ての実験は、暗期中、一般には午後1時〜午後4時に行った。全般的な健康状態はScripps Research Instituteの科学者および獣医スタッフの両方によりモニターされ、全ての試験はScripps動物実験委員会(Scripps Institutional Animal Care and Use Committee)に従い実施され、米国国立衛生研究所動物実験委員会の方針(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)を遵守していた。100〜150μLの全血を採取するために、尾端切断術(1cm未満)を用いて力価定量のための血液血清サンプル採取を行い、ついでサンプルを7500rpmで8分間遠心分離して、血清を分離した。
CH2Cl2(7.0mL)中の1[1](200mg,714μmol)の溶液にピリジン(115μL,1.42mmol)およびグルタル酸モノメチルエステル塩化物(110μL,780μmol)を0℃で加えた。0℃で5分間撹拌した後、反応混合物を室温に加温した。室温で1.5時間撹拌した後、反応混合物を飽和水性NaHCO3でクエンチし、EtOAcで抽出した。水層をEtOAcで3回抽出した。合わせた有機抽出物をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、真空中で蒸発させた。残留油状物をフラッシュカラムクロマトグラフィー(SiO2;n−ヘキサン:EtOAc=1:1〜1:2〜0:1)で精製して、2(288mg,98.7%)を淡黄色固体として得た。
1H−NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.41−7.35(m,3H),7.27−7.23(m,2H),7.19−7.13(m,3H),7.08−7.05(m,2H),4.67(tt,J=12.0,4.0Hz,1H),3.59(s,3H),2.99(br d,J=12.8Hz,2H),2.72(dd,J=8.4,8.0Hz,1H),2.72(d,J=6.4Hz,1H),2.53(dd,J=8.4,7.2Hz,1H),2.26(t,J=7.2Hz,2H),2.15(td,J=12.4,2.4Hz,2H),1.98−1.93(m,2H),1.87(qd,J=7.6,1.6Hz,3H),1.85−1.77(m,2H),1.42(qd,J=12.4,3.6Hz,2H);13C−NMR(100MHz,CDCl3)δ 173.5,171.7,139.7,138.4,130.2(2C),129.3(2C),128.5(2C),128.3,128.3(2C),126.0,59.9,52.6(2C),51.9,51.3,33.9,33.2,33.1,29.9(2C),20.5;HRMS(ESI+)409.2487(C25H33N2O3としての計算値:409.2491)。
MeOH(1.0mL)中の2(49.9mg,122μmol)の溶液に、1.0M LiOH水溶液(250μL)を室温で加えた。室温で4時間撹拌した後、反応混合物をヘキサンで洗浄した。水層を2.0M 水性HClで酸性化し、EtOAcで3回抽出した。合わせた有機抽出物をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、真空中で蒸発させた。残留白色固体3[2](52.0mg,定量的)を、更に精製することなく次工程で使用した。PTLC(SiO2;CH2Cl2:MeOH=9:1)による精製の後、3に関する分光学的データを収集した。
1H−NMR(400MHz,CDCl3)δ 7.41−7.35(m,3H),7.29−7.24(m,2H),7.22−7.18(m,1H),7.17−7.15(m,2H),7.06−7.04(m,2H),4.83(br s,1H),4.69(tt,J=12.0,4.0Hz,1H),3.35(br d,J=11.6Hz,2H),2.96−2.85(m,4H),2.56(br t,J=10.8Hz,2H),2.16(t,J=7.2Hz,2H),1.98(t,J=7.2Hz,2H),1.87(br d,J=12.4Hz,2H),1.83−1.74(m,2H),1.80(t,J=6.8Hz,2H);13C−NMR(100MHz,CDCl3)δ 176.9,172.3,139.0,138.4,130.0(2C),129.5(2C),128.6(2C),128.6,128.5(2C),126.3,59.2,52.3(2C),51.7,34.3,34.1,32.3,29.2(2C),20.9;HRMS(ESI+)395.2327(C24H31N2O3としての計算値:395.2335)。
DMF(144μL)およびH2O(16μL)中の3(2.7mg,6.8μmol)の溶液にNHS(N−ヒドロキシスクシンイミド)(4.8mg,40.4μmol)およびEDC(N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N’−エチルカルボジイミド)(7.8mg,40.8μmol)を室温で加えた。室温で1.5時間撹拌した後、追加的なEDC(4.2mg,21.9μmol)を加えた。室温で更に2時間撹拌した後、反応混合物を2つの部分に分けた。
一方の部分(80μL)をPBSバッファー(pH7.4)中のBSA(Thermo Scientific)(660μL,1.50mg/mL)の溶液中に室温で加え、他方の部分(80μL)をPBSバッファー(pH7.4)中のTT(Statens Serum Institut)(650μL,1.53mg/mL)の溶液中に室温で加えた。室温で15時間撹拌した後、反応混合物のそれぞれを、Slide−A−Lyzer 10K MWCO透析装置を使用して、PBSバッファー(pH7.4)に対して室温で透析した。バッファーを2時間ごとに6時間交換し、ついで透析を4℃で12時間継続した。コンジュゲート濃度をBCAアッセイにより定量し、4℃で保存した。
DMF(225μL)およびH2O(25μL)中の3(3.0mg,7.6μmol)の溶液にNHS(9.0mg,75.8μmol)およびEDC(14.6mg,76.1μmol)を室温で加えた。室温で12時間撹拌した後、反応混合物のアリコート50μLをPBSバッファー中の1.0mLのDynabeads(登録商標)M−270アミン(使用前にPBSバッファー(pH7.4)で4回洗浄した)に室温で加えた。室温で1.5時間撹拌した後、該ビーズをPBSバッファー(pH7.4)で2回洗浄し、4℃で保存した。
MALDI−TOF分析
この研究において製造された各フェンタニルハプテン−BSAおよびTTコンジュゲートのコピー数(ハプテン密度)を定量するために、サンプルをMALDI−TOF分析に付し、フェンタニルハプテン−BSAおよびTTコンジュゲートの分子量(MW)を、それぞれ、未修飾BSAおよびTTの分子量と、以下の式に従い比較した。
この研究において製造された各フェンタニルハプテン−BSAおよびTTコンジュゲートのコピー数(ハプテン密度)を定量するために、サンプルをMALDI−TOF分析に付し、フェンタニルハプテン−BSAおよびTTコンジュゲートの分子量(MW)を、それぞれ、未修飾BSAおよびTTの分子量と、以下の式に従い比較した。
コピー数=(MWフェンタニルハプテン−タンパク質−MWタンパク質)/(MWフェンタニルハプテン−MW水)
MWフェンタニルハプテン=395Da、MW水=18Da
MWフェンタニルハプテン−BSA=80,939Da、MWBSA=66,500Da
MWフェンタニルハプテン−TT=168,757Da、MWTT=153,500Da
コピー数フェンタニルハプテン−BSA=38
コピー数フェンタニルハプテン−TT=40
ELISA法
ピペット操作および洗浄工程はBiomek 3000液体処理ロボットで行った。PBSはアッセイ全体を通してpH7.4で使用し、Fisher Scientificの10×粉末パケットから調製した。まず、高結合性96ウェルマイクロタイタープレート(Costar 3690)の半分の領域をウェル当たり25μgのFent−BSAで37℃で一晩コート(被覆)し、液体を蒸発させた。脱脂乳で室温で1時間ブロッキングした後、ワクチン接種マウス血清を、1:5000から開始して12列にわたって2% BSA溶液中で1:1系列希釈した。室温で2時間インキュベートした後、該プレートを5回洗浄し、2%BSA中の1:10,000の希釈度のロバ抗マウスIgG HRP二次抗体(Jackson ImmunoResearch)を加え、室温で1時間インキュベートした。5回の洗浄を行い、TMB基質(Thermo Pierce)を加え、TMB添加の5分後に2M H2SO4を加えた。プレートを20分間インキュベートした後、それらの吸光度を450nmで読取った。GraphPad PRISMにおいて、吸光度値をサンプルごとに最高吸光度値に対して正規化し、log(インヒビター)対正規化応答−可変勾配式を用いて曲線をフィットさせて、50% 力価および標準誤差を決定した。未ワクチン接種マウスは検出可能な抗フェンタニル力価を全く含んでいなかった。
MWフェンタニルハプテン=395Da、MW水=18Da
MWフェンタニルハプテン−BSA=80,939Da、MWBSA=66,500Da
MWフェンタニルハプテン−TT=168,757Da、MWTT=153,500Da
コピー数フェンタニルハプテン−BSA=38
コピー数フェンタニルハプテン−TT=40
ELISA法
ピペット操作および洗浄工程はBiomek 3000液体処理ロボットで行った。PBSはアッセイ全体を通してpH7.4で使用し、Fisher Scientificの10×粉末パケットから調製した。まず、高結合性96ウェルマイクロタイタープレート(Costar 3690)の半分の領域をウェル当たり25μgのFent−BSAで37℃で一晩コート(被覆)し、液体を蒸発させた。脱脂乳で室温で1時間ブロッキングした後、ワクチン接種マウス血清を、1:5000から開始して12列にわたって2% BSA溶液中で1:1系列希釈した。室温で2時間インキュベートした後、該プレートを5回洗浄し、2%BSA中の1:10,000の希釈度のロバ抗マウスIgG HRP二次抗体(Jackson ImmunoResearch)を加え、室温で1時間インキュベートした。5回の洗浄を行い、TMB基質(Thermo Pierce)を加え、TMB添加の5分後に2M H2SO4を加えた。プレートを20分間インキュベートした後、それらの吸光度を450nmで読取った。GraphPad PRISMにおいて、吸光度値をサンプルごとに最高吸光度値に対して正規化し、log(インヒビター)対正規化応答−可変勾配式を用いて曲線をフィットさせて、50% 力価および標準誤差を決定した。未ワクチン接種マウスは検出可能な抗フェンタニル力価を全く含んでいなかった。
血液/脳の生体内分布研究のための動物の処置
ナイーブマウスにおいて確立された完全鎮痛用量である0.2mg/kgのフェンタニル(滅菌生理食塩水10mL/kgの容量中)をマウス(n=6(ワクチン接種)およびn=6(対照))に皮下注射した。注射の15分後、イソフルランに浸したガーゼパッドを含む50mL Falcon(登録商標)円錐遠心管(Corning,NY)から構成されるノーズコーンを使用して、マウスを完全に麻酔した。ついで、マウスを胸骨の真下の正中線に沿って開き、横隔膜を剥がして心臓を露出させた。心臓穿刺により約1.5mLの全血を得た。心臓穿刺直後に、大きな外科用ばさみを使用してマウスを迅速に断頭し、ロンジュールで脳を摘出した。ついで脳を秤量し(典型的には4.0〜6.0g)、氷冷標準PBSの溶液1.0mLで軽く洗浄して、過剰の外部血液を除去した。しかし、脳室内および脳物質の内部に含有されていた可能性がある全ての血液を完全に除去するための灌流にマウスを付すことはしなかった。ついで脳を5.0mL円錐サンプルチューブ内の1.0mLの新鮮な氷冷PBSに加え、Tissue Tearor(Biospec;Bartlesville,OK)を使用してホモジナイズした。ついで、LCMS分析のためのサンプル調製まで、脳および血清の両方のサンプルを凍結した。
ナイーブマウスにおいて確立された完全鎮痛用量である0.2mg/kgのフェンタニル(滅菌生理食塩水10mL/kgの容量中)をマウス(n=6(ワクチン接種)およびn=6(対照))に皮下注射した。注射の15分後、イソフルランに浸したガーゼパッドを含む50mL Falcon(登録商標)円錐遠心管(Corning,NY)から構成されるノーズコーンを使用して、マウスを完全に麻酔した。ついで、マウスを胸骨の真下の正中線に沿って開き、横隔膜を剥がして心臓を露出させた。心臓穿刺により約1.5mLの全血を得た。心臓穿刺直後に、大きな外科用ばさみを使用してマウスを迅速に断頭し、ロンジュールで脳を摘出した。ついで脳を秤量し(典型的には4.0〜6.0g)、氷冷標準PBSの溶液1.0mLで軽く洗浄して、過剰の外部血液を除去した。しかし、脳室内および脳物質の内部に含有されていた可能性がある全ての血液を完全に除去するための灌流にマウスを付すことはしなかった。ついで脳を5.0mL円錐サンプルチューブ内の1.0mLの新鮮な氷冷PBSに加え、Tissue Tearor(Biospec;Bartlesville,OK)を使用してホモジナイズした。ついで、LCMS分析のためのサンプル調製まで、脳および血清の両方のサンプルを凍結した。
血液および脳におけるフェンタニルのLC−MS分析のためのサンプルの調製および抽出[3]
サンプルのアリコート(400μL、血液またはホモジナイズされた脳)に内部標準としてのMeOH中のフェンタニル−d5(20μL,50ng/mL)を加え、ついで該混合物をボルテックス混合し、平衡化させた。平衡化のために30分間の後、H2O(400μL)を該混合物に加えた。0.1M K2CO3水溶液(400μL)を加え、ボルテックスミキサーを使用して攪拌することにより、塩基性化が達成された。n−ヘキサンとEtOAcとの混合物(7:3)(2.8mL)で抽出を行った。2分間のボルテックス混合および3000rpmで5分間の遠心分離の後、GENEVAC(登録商標)を使用して有機層を蒸発させた。5mM NH4OAc(pH4)/アセトニトリル移動相を使用するAgilent Poroshell 120 SB−C8カラムを備えたLC−MS系内に8μLのアリコートを注入した。各サンプルの前にブランクを注入した。重水素化および非重水素化物をMassHunterにおいて抽出し、得られたピークを積分した。非重水素化積分値対重水素化積分値の比を用いて、6点標準曲線によりフェンタニル濃度を決定した(後記を参照されたい)。検量線のための標準物は、既知の非重水素化フェンタニル濃度のサンプルを除き、組織サンプルと同じ方法で調製した。
サンプルのアリコート(400μL、血液またはホモジナイズされた脳)に内部標準としてのMeOH中のフェンタニル−d5(20μL,50ng/mL)を加え、ついで該混合物をボルテックス混合し、平衡化させた。平衡化のために30分間の後、H2O(400μL)を該混合物に加えた。0.1M K2CO3水溶液(400μL)を加え、ボルテックスミキサーを使用して攪拌することにより、塩基性化が達成された。n−ヘキサンとEtOAcとの混合物(7:3)(2.8mL)で抽出を行った。2分間のボルテックス混合および3000rpmで5分間の遠心分離の後、GENEVAC(登録商標)を使用して有機層を蒸発させた。5mM NH4OAc(pH4)/アセトニトリル移動相を使用するAgilent Poroshell 120 SB−C8カラムを備えたLC−MS系内に8μLのアリコートを注入した。各サンプルの前にブランクを注入した。重水素化および非重水素化物をMassHunterにおいて抽出し、得られたピークを積分した。非重水素化積分値対重水素化積分値の比を用いて、6点標準曲線によりフェンタニル濃度を決定した(後記を参照されたい)。検量線のための標準物は、既知の非重水素化フェンタニル濃度のサンプルを除き、組織サンプルと同じ方法で調製した。
ワクチンの製剤化および投与
マウスごとに、75μLのpH7.4のPBS中の50μg Fent−TT + 50μg CpG ODN 1826(Eurofins)を75μL(0.75mg)のアルヒドロゲル(Alhydrogel)(Invivogen)と一緒にし、30分間混合した。該懸濁液(150μL/マウス)を第0週、第2週、第4週に6匹のマウスに腹腔内注射した。第2週、第4週、第6週、第10週および第12週にマウスから採血した。
マウスごとに、75μLのpH7.4のPBS中の50μg Fent−TT + 50μg CpG ODN 1826(Eurofins)を75μL(0.75mg)のアルヒドロゲル(Alhydrogel)(Invivogen)と一緒にし、30分間混合した。該懸濁液(150μL/マウス)を第0週、第2週、第4週に6匹のマウスに腹腔内注射した。第2週、第4週、第6週、第10週および第12週にマウスから採血した。
オピオイド抗侵害受容力試験
採血の少なくとも2日後、既に記載されているとおり[4]、主に上脊髄性(ホットプレート)および脊髄性(尾部浸漬)行動試験において、累積フェンタニル応答に関してマウスを試験した。54℃の表面上のアクリルシリンダー(直径14cm*22cm)内にマウスを配置し、以下の侵害受容応答の1つを行うまでの潜時を計測することにより、ホットプレート試験を測定した:後足の舐め、後足の震え/引っ込め、またはジャンプ。典型的なベースライン潜時は8〜15秒であり、組織損傷を防ぐために35秒のカットオフを課した。応答後、マウスをプレートから取り出した。吸収性の実験用吸収バッドから構成される小袋内にマウスを軽く拘束し、尾の先端の1cmを加熱水浴内に浸漬し、引っ込めまでの時間を計測することにより、尾部浸漬試験を行った。
採血の少なくとも2日後、既に記載されているとおり[4]、主に上脊髄性(ホットプレート)および脊髄性(尾部浸漬)行動試験において、累積フェンタニル応答に関してマウスを試験した。54℃の表面上のアクリルシリンダー(直径14cm*22cm)内にマウスを配置し、以下の侵害受容応答の1つを行うまでの潜時を計測することにより、ホットプレート試験を測定した:後足の舐め、後足の震え/引っ込め、またはジャンプ。典型的なベースライン潜時は8〜15秒であり、組織損傷を防ぐために35秒のカットオフを課した。応答後、マウスをプレートから取り出した。吸収性の実験用吸収バッドから構成される小袋内にマウスを軽く拘束し、尾の先端の1cmを加熱水浴内に浸漬し、引っ込めまでの時間を計測することにより、尾部浸漬試験を行った。
典型的なベースライン応答は1〜2秒であり、組織損傷を防ぐために10秒のカットオフを用いた。尾部浸漬はより反射的な挙動であるため、試験順序としては、常に最初にホットプレートを行い、ついで尾部浸漬を行う。両方の抗侵害受容アッセイの完了の直後に、フェンタニル(生理食塩水中、5.0mL/kg)を直ちに皮下注射した。各注射の約10分後に試験を反復し、完全な抗侵害受容が観察される(すなわち、カットオフ時間を超える)まで、累積フェンタニル容量を増加させながら、試験および注射のこのサイクルを反復した。全ての試験が完了したら、後の潜在的な過剰摂取の結果を防ぐために、生理食塩水中の1.0mg/kg ナロキソンおよびナルトレキソンのカクテルをマウスに投与した。
致死性研究
雄Swiss Websterマウス(N=11)にPBS(pH7.4)中の2.2mg/kgのフェンタニルHClを腹腔内注射した。その後、11匹中2匹が過剰摂取で死亡した。15分後、残りの9匹に第2の2.2mg/kg フェンタニルHCl用量を投与した。その後、更に4匹(11匹中6匹)が過剰摂取で死亡した。同じ実験(N=12)を、1時間にわたる0.4、0.8、1.6、2.4および4.4mg/kgの累積用量で皮下に行い、これにより12匹中2匹のマウスにおける過剰摂取死が誘発された。
雄Swiss Websterマウス(N=11)にPBS(pH7.4)中の2.2mg/kgのフェンタニルHClを腹腔内注射した。その後、11匹中2匹が過剰摂取で死亡した。15分後、残りの9匹に第2の2.2mg/kg フェンタニルHCl用量を投与した。その後、更に4匹(11匹中6匹)が過剰摂取で死亡した。同じ実験(N=12)を、1時間にわたる0.4、0.8、1.6、2.4および4.4mg/kgの累積用量で皮下に行い、これにより12匹中2匹のマウスにおける過剰摂取死が誘発された。
統計学
統計分析をGraphPad Prism 6(La Jolla,CA)において行った。全ての値は平均±SEMとして示されている。抗侵害受容データを時間から最大可能効果(%)(% MPE)に変換した。これは以下のとおりに計算される:%MPE=(試験−ベースライン)/(カットオフ−ベースライン)*100として計算される。ついで、log(アゴニスト)対正規化応答非線形回帰を用いて、このデータをフィットさせた。各疼痛試験および個々の治療群に関してED50値およびED50の95%信頼区間を計算して、効力比を決定した。血液/脳フェンタニル濃度およびフェンタニルED50シフトに関する対照とワクチン接種群との間の統計的有意差(α<0.001)の検証のために、独立t検定を用いた。
統計分析をGraphPad Prism 6(La Jolla,CA)において行った。全ての値は平均±SEMとして示されている。抗侵害受容データを時間から最大可能効果(%)(% MPE)に変換した。これは以下のとおりに計算される:%MPE=(試験−ベースライン)/(カットオフ−ベースライン)*100として計算される。ついで、log(アゴニスト)対正規化応答非線形回帰を用いて、このデータをフィットさせた。各疼痛試験および個々の治療群に関してED50値およびED50の95%信頼区間を計算して、効力比を決定した。血液/脳フェンタニル濃度およびフェンタニルED50シフトに関する対照とワクチン接種群との間の統計的有意差(α<0.001)の検証のために、独立t検定を用いた。
マウス抗フェンタニル免疫グロブリン(IG)の結合IC50の決定
研究等級のCM3センサーチップを備えたBiacore 3000装置(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴による競合結合アッセイにより、マウスIGおよび遊離フェンタニルに関する結合IC50を決定した。リガンドであるフェンタニル−BSAコンジュゲートを、NHS、EDCカップリング反応を用いて固定化した。全2個のフローセル(フローセル1および2)の表面を、5μL/分の流速で、0.1M NHSおよび0.1M EDCの1:1混合物で7分間活性化した。10mM 酢酸ナトリウム(pH4.0)に再懸濁させたリガンドをフローセル2上に2,000RUの密度で固定化し、一方、基準表面として働くようにフローセル2を同密度でBSAに固定化した。全表面を1.0M エタノールアミン−HCl(pH8.5)の7分間の注入によりブロッキングした。マウスIGをランニングバッファー(HBS−EP + バッファー)で希釈し、両方の被覆フローセル上で滴定して、30μL/分の流速での2.5分間の解離および3分間の注入で約60RUの応答が得られるようにした。定められた濃度のHBS−EP + バッファー中で調製されたマウスIGを、競合結合アッセイを行う前に、一連の濃度の化合物と共に室温で1時間インキュベートした。該化合物およびそれらの濃度系列は以下のとおりである:a)3倍希釈系列で10μM〜169pMの範囲のフェンタニル;b)3倍希釈で50mM〜850pMの範囲のアセチルフェンタニル、ブチリルフェンタニルおよびp−トリルフェンタニル;c)4倍希釈系列で100mM〜95pMの範囲のシス−3−メチルフェンタニルおよびα−メチルフェンタニル(チャイナ・ホワイト);d)10倍希釈系列で100mM〜10nMの範囲のメタドンおよびオキシコドン。全てのフェンタニルはラセミであったことに留意されたい。結合データを収集するために、アナライト、マウスIGおよび化合物混合物を2つのフローセル上に30μL/分の流速で25℃で3分間注入し、再生前にバッファー中で2.5分間解離させた。次ラウンドのアッセイの前に、10mM Gly−HCl(pH1.5)を30秒間注入することにより、チップ表面を再生させた。結合分析の各サイクルの解離段階の終了時の応答を用いて、GraphPad Prism 6ソフトウェアにより各化合物のIC50値を計算した。結合曲線を図5aに示す。
研究等級のCM3センサーチップを備えたBiacore 3000装置(GE Healthcare)を使用する表面プラズモン共鳴による競合結合アッセイにより、マウスIGおよび遊離フェンタニルに関する結合IC50を決定した。リガンドであるフェンタニル−BSAコンジュゲートを、NHS、EDCカップリング反応を用いて固定化した。全2個のフローセル(フローセル1および2)の表面を、5μL/分の流速で、0.1M NHSおよび0.1M EDCの1:1混合物で7分間活性化した。10mM 酢酸ナトリウム(pH4.0)に再懸濁させたリガンドをフローセル2上に2,000RUの密度で固定化し、一方、基準表面として働くようにフローセル2を同密度でBSAに固定化した。全表面を1.0M エタノールアミン−HCl(pH8.5)の7分間の注入によりブロッキングした。マウスIGをランニングバッファー(HBS−EP + バッファー)で希釈し、両方の被覆フローセル上で滴定して、30μL/分の流速での2.5分間の解離および3分間の注入で約60RUの応答が得られるようにした。定められた濃度のHBS−EP + バッファー中で調製されたマウスIGを、競合結合アッセイを行う前に、一連の濃度の化合物と共に室温で1時間インキュベートした。該化合物およびそれらの濃度系列は以下のとおりである:a)3倍希釈系列で10μM〜169pMの範囲のフェンタニル;b)3倍希釈で50mM〜850pMの範囲のアセチルフェンタニル、ブチリルフェンタニルおよびp−トリルフェンタニル;c)4倍希釈系列で100mM〜95pMの範囲のシス−3−メチルフェンタニルおよびα−メチルフェンタニル(チャイナ・ホワイト);d)10倍希釈系列で100mM〜10nMの範囲のメタドンおよびオキシコドン。全てのフェンタニルはラセミであったことに留意されたい。結合データを収集するために、アナライト、マウスIGおよび化合物混合物を2つのフローセル上に30μL/分の流速で25℃で3分間注入し、再生前にバッファー中で2.5分間解離させた。次ラウンドのアッセイの前に、10mM Gly−HCl(pH1.5)を30秒間注入することにより、チップ表面を再生させた。結合分析の各サイクルの解離段階の終了時の応答を用いて、GraphPad Prism 6ソフトウェアにより各化合物のIC50値を計算した。結合曲線を図5aに示す。
精製マウス抗フェンタニル免疫グロブリン(IG)の結合動力学の決定
マウスIG(磁気フェンタニル結合Dynabeadsを使用して6週の採血から直接精製されたもの)と遊離フェンタニルとの間の結合動力学を、CMD200mセンサーチップを備えたBiOptix 404pi装置(BiOptix Diagnostics,Inc.,Boulder,Co.)を使用する表面プラズモン共鳴により決定した。リガンド、マウス抗フェンタニルIgG(約150kDa)を、NHS、EDCカップリング反応を用いて固定化した。全2個のフローセル(フローセル2および3;2*2注入モードに設定されたアッセイ)の表面を0.1M NHSと0.1M EDCとの1:1混合物で5μL/分の流速で7分間活性化させた。10mM 酢酸ナトリウム(pH4.5)に再懸濁させたリガンドをフローセル3上に12,000RUの密度で固定化し、一方、基準表面として働くようにフローセル2を同密度で無関係な抗体に固定化した。全表面を1.0M エタノールアミン−HCl(pH8.5)の7分間の注入によりブロッキングした。動力学データを収集するために、HBS−EP + バッファー(10mM HEPES,150mM NaCl,0.05% P20(pH7.4))中で調製されたアナライトであるフェンタニル(336.48Da)を、1,000〜1.95nM(2倍希釈系列)の範囲濃度で、50μL/分の流速で25℃の温度で、それらの2つのフローセル上に注入した。複合体を、それぞれ300秒間および900秒間、会合および解離させた。各アナライトサンプルの2回の注入(ランダムな順序)およびブランクバッファー注入をそれらの2つの表面上に流した。データを収集し、二重参照し、Scrubber 2によるグローバルデータ分析を用いて1:1相互作用モデルにフィットさせた。動力学データを図5bに示す。
マウスIG(磁気フェンタニル結合Dynabeadsを使用して6週の採血から直接精製されたもの)と遊離フェンタニルとの間の結合動力学を、CMD200mセンサーチップを備えたBiOptix 404pi装置(BiOptix Diagnostics,Inc.,Boulder,Co.)を使用する表面プラズモン共鳴により決定した。リガンド、マウス抗フェンタニルIgG(約150kDa)を、NHS、EDCカップリング反応を用いて固定化した。全2個のフローセル(フローセル2および3;2*2注入モードに設定されたアッセイ)の表面を0.1M NHSと0.1M EDCとの1:1混合物で5μL/分の流速で7分間活性化させた。10mM 酢酸ナトリウム(pH4.5)に再懸濁させたリガンドをフローセル3上に12,000RUの密度で固定化し、一方、基準表面として働くようにフローセル2を同密度で無関係な抗体に固定化した。全表面を1.0M エタノールアミン−HCl(pH8.5)の7分間の注入によりブロッキングした。動力学データを収集するために、HBS−EP + バッファー(10mM HEPES,150mM NaCl,0.05% P20(pH7.4))中で調製されたアナライトであるフェンタニル(336.48Da)を、1,000〜1.95nM(2倍希釈系列)の範囲濃度で、50μL/分の流速で25℃の温度で、それらの2つのフローセル上に注入した。複合体を、それぞれ300秒間および900秒間、会合および解離させた。各アナライトサンプルの2回の注入(ランダムな順序)およびブランクバッファー注入をそれらの2つの表面上に流した。データを収集し、二重参照し、Scrubber 2によるグローバルデータ分析を用いて1:1相互作用モデルにフィットさせた。動力学データを図5bに示す。
実施例において引用された文献
[1] C.A.Valdez,R.N.Leif,B.P.Mayer,Plos One 2014,9.
[2] R.Vardanyan,V.K.Kumirov,G.S.Nichol,P.Davis,E.Liktor−Busa,D.Rankin,E.Varga,T.Vanderah,F.Porreca,J.Lai,V.J.Hruby,Bioorg Med Chem 2011,19,6135−6142.
[3] V.Coopman,J.Cordonnier,K.Pien,D.Van Varenbergh,Forensic Sci Int 2007,169,223−227.
[4] P.T.Bremer,J.E.Schlosburg,J.M.Lively,K.D.Janda,Mol Pharm 2014,11,1075−1080。
[1] C.A.Valdez,R.N.Leif,B.P.Mayer,Plos One 2014,9.
[2] R.Vardanyan,V.K.Kumirov,G.S.Nichol,P.Davis,E.Liktor−Busa,D.Rankin,E.Varga,T.Vanderah,F.Porreca,J.Lai,V.J.Hruby,Bioorg Med Chem 2011,19,6135−6142.
[3] V.Coopman,J.Cordonnier,K.Pien,D.Van Varenbergh,Forensic Sci Int 2007,169,223−227.
[4] P.T.Bremer,J.E.Schlosburg,J.M.Lively,K.D.Janda,Mol Pharm 2014,11,1075−1080。
本発明は、当業者がそれを製造し使用するのに十分な程度に詳細に記載され例示されているが、特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱しない種々の代替、修飾および改良が当業者に明らかであろう。
本明細書中で言及されている全ての特許および刊行物を、各個の刊行物の全体が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。
用いられている用語および表現は記述の用語として用いられており、限定的なものではなく、また、そのような用語および表現の使用においては、示され記載されている特徴またはその一部のいずれの均等物をも除外する意図は無く、特許請求されている本発明の範囲内で種々の修飾が可能であると認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態および随意的特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の修飾および変更が当業者によって施されることが可能であり、そのような修飾および変更は、添付の特許請求の範囲により定められる本発明の範囲内とみなされると理解されるべきである。
Claims (9)
- 請求項1記載の式(I)(ここで、Xはタンパク質担体またはアミノ官能基化ビーズを含み、該タンパク質または該ビーズは該ハプテンとアミド結合を形成する)の化合物を含む、フェンタニルクラス薬物に対するインビボ・イムノアンタゴニストをインビボで生成させるためのハプテンコンジュゲート。
- 該タンパク質担体がウシ血清アルブミン(BSA)または破傷風トキソイド(TT)である、請求項2記載のコンジュゲート。
- 該アミノ官能基化ビーズがDynabead M−270アミンである、請求項2記載のコンジュゲート。
- 請求項2記載のハプテンコンジュゲートの有効量を投与することにより哺乳動物において製造されるワクチン。
- 該ワクチンが、フェンタニルクラス薬物に特異的なIgG抗体を含む、請求項5記載のワクチン。
- 請求項5記載のワクチンの有効量を患者に投与することを含む、患者における作用部位におけるフェンタニルクラス薬物の濃度を有効に最小にする方法。
- 該ワクチンの有効量の投与が、それ無しでは致死量となるフェンタニルクラス薬物からの有意な防御を患者にもたらす、請求項7記載の方法。
- 患者への該ワクチンの有効量の投与がフェンタニルクラス薬物の嗜癖傾向および過剰摂取の可能性を低減する、請求項7記載の方法。
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US20240307517A1 (en) * | 2021-05-10 | 2024-09-19 | Cornell University | Development of a highly efficient second generation fentanyl-conjugate vaccine to treat fentanyl addiction |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030170728A1 (en) * | 2001-11-16 | 2003-09-11 | Randox Laboratories Limited | Method and kit for detecting, or determining the quantity of, metabolites of fentanyl and metabolites of fentanyl analogs |
JP2008529503A (ja) * | 2005-02-08 | 2008-08-07 | ジェンザイム・コーポレイション | TGFβに対する抗体 |
JP2014502154A (ja) * | 2010-11-19 | 2014-01-30 | 俊夫 今井 | 中和抗ccl20抗体 |
US20140093525A1 (en) * | 2012-09-17 | 2014-04-03 | Minneapolis Medical Research Foundation | Compositions and methods of treating opioid addiction |
JP2015502356A (ja) * | 2011-11-30 | 2015-01-22 | ウェルスタット ダイアグノスティクス,エルエルシー | 5−fuに関連するアッセイ、抗体、免疫原および組成物 |
Family Cites Families (11)
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---|---|---|---|---|
US5283066A (en) * | 1992-02-19 | 1994-02-01 | Development Center For Biotechnology | Method of stimulating an immune response by using a hapten |
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WO2004111202A2 (en) * | 2003-03-07 | 2004-12-23 | Incyte Corporation | Neurotransmission-association proteins |
MXPA04006617A (es) | 2004-07-07 | 2006-01-12 | Inst Nac De Psiquiatria Ramon | Proceso para la preparacion y uso de una vacuna bivalente contra la adiccion a la morfina-heroina. |
US20110182918A1 (en) * | 2008-06-13 | 2011-07-28 | Nabi Biopharmaceuticals | Personalized drug treatment and smoking cessation kit and method |
JP5584752B2 (ja) * | 2009-04-15 | 2014-09-03 | ポステク アカデミー−インダストリー ファウンデイション | 標的特異的非抗体タンパク質及びこの製造方法 |
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US9213029B2 (en) * | 2013-06-25 | 2015-12-15 | Samsung Electronics Co., Ltd. | Method for diagnosing breast cancer by detection of polymeric immunoglobulin receptor in vesicles isolated from patients |
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030170728A1 (en) * | 2001-11-16 | 2003-09-11 | Randox Laboratories Limited | Method and kit for detecting, or determining the quantity of, metabolites of fentanyl and metabolites of fentanyl analogs |
JP2008529503A (ja) * | 2005-02-08 | 2008-08-07 | ジェンザイム・コーポレイション | TGFβに対する抗体 |
JP2014502154A (ja) * | 2010-11-19 | 2014-01-30 | 俊夫 今井 | 中和抗ccl20抗体 |
JP2015502356A (ja) * | 2011-11-30 | 2015-01-22 | ウェルスタット ダイアグノスティクス,エルエルシー | 5−fuに関連するアッセイ、抗体、免疫原および組成物 |
US20140093525A1 (en) * | 2012-09-17 | 2014-04-03 | Minneapolis Medical Research Foundation | Compositions and methods of treating opioid addiction |
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