JP2019506390A - 合成オピオイドワクチン - Google Patents

Abstract

フェンタニルはモルヒネより８０倍以上強力な中毒性処方オピオイドである。フェンタニルの合成上の性質は、毒物学スクリーニングを逃れるが親薬物と同等の効力を示す危険な「デザイナー薬」類似体の創製を可能にしている。驚くべきことに、多数の死亡がフェンタニル誘導体の過剰摂取に関連づけられている。本明細書において、本発明者らは、フェンタニルクラス薬物の向精神作用を低減するための有効な免疫療法を記載する。広範なパネルのフェンタニル類似体に対する交差反応性を有する高レベルの抗体を誘導する単一コンジュゲートワクチンを創製した。更に、ワクチン接種マウスは致死性フェンタニル用量からの有意な防御を獲得した。最後に、血清から直接誘導された抗体の薬物特異性プロファイリングを可能にする、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術を確立した。本発明者らの新規開発フェンタニルワクチンおよび分析方法は合成オピオイド乱用に対する闘いにおいて役立ちうる。
【選択図】図１

Description

本発明は合成オピオイドワクチンに関する。

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１６年１月２１日付け出願の米国仮特許出願第６２／２８１，２６２号（その開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の優先権を主張するものである。

本発明者による関連特許出願には以下のものが含まれる（それらの開示の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）：
ＵＳ１２／３７４９０８、ＰＣＴ０７／０７４９７６、ＷＯ０８／０１６９７６、“Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ａｄｉｐｏｓｉｔｙ”；
ＵＳ０９／０３８５４６、ＰＣＴ０９／０３８５４６、ＷＯ０９／１２０９５４、“Ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”；
ＵＳ１３／９８４２３０、ＰＣＴ１２／００００７９、ＷＯ１２／１０８９６０、“Ｇｈｒｅｌｉｎ ｍｉｍｅｔｉｃ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｈａｐｔｅｎ ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｈａｖｉｎｇ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｏｆ”；
ＵＳ１３／２６１２１７、ＰＣＴ１０／００２４８９、ＷＯ１１／０３１３２７、“Ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｈａｐｔｅｎｓ， ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ”；
ＵＳ１４／３６７５１１、ＰＣＴ１１／００１９９７、ＷＯ１３／０９５３２１、“Ｈｅｒｏｉｎ ｈａｐｔｅｎｓ，ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｕｓｅｓ”；
ＵＳ１４／９０１７９４、ＰＣＴ１４／０４５０１９、ＷＯ１５／００２９２９、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｏｂｅｓｉｔｙ”；
ＵＳ１４／９０１７９９、ＰＣＴ１４／０４５０２３、ＷＯ１５／００２３９１、“Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｏｂｅｓｉｔｙ”；および
ＰＣＴ１５／０３１５８３、ＷＯ１５／１７９４０３、“Ｅｎａｎｔｉｏｐｕｒｅ ｈａｐｔｅｎｓ ｆｏｒ ｎｉｃｏｔｉｎｅ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ”。

米国政府の援助に関する陳述
本発明は、米国薬物乱用研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ａｂｕｓｅ）により授与されたＤＡ０３９６３４に基づく米国政府の援助によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

フェンタニルは、スケジュールＩＩ処方鎮痛剤として合法的に使用される有効な合成オピオイドである。しかし、フェンタニルは、不法スケジュールＩオピオイドであるヘロインと同じ薬理学的標的である脳内ミュー−オピオイド受容体（ＭＯＲ）の活性化を介してそれが誘発する多幸感ゆえに、有意な乱用傾向を示す^［１］。ＭＯＲの過度の活性化は、致死的となりうる呼吸抑制をもたらす^［２］。フェンタニルはヘロインの効力を１０倍以上、そしてモルヒネの効力を８０倍以上、上回り、規制無しの入手源からそれが購入された場合、過剰摂取の重大なリスクをもたらす^［３］。更に、フェンタニルの合成の容易さは不法製造およびデザイナードラッグ類似体の創製を可能にする^［４］。これらの類似体の薬理学的特性が未だ適切に特徴づけられていないという事実はそれらを特に危険なものにし、たとえメチル付加であっても、特に３位における或る修飾が効力を増強しうる場合には、特にそれが言える^［５］。

昨年７月、米国薬物乱用研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｎ Ｄｒｕｇ Ａｂｕｓｅ）（ＮＩＤＡ）はフェンタニルの過剰摂取による死亡の憂慮すべき急増を報告した^［６］。これは、１９８０年代後半におけるα−メチルフェンタニル（別名：「チャイナ・ホワイト（Ｃｈｉｎａ Ｗｈｉｔｅ）」）から始まる長期にわたる過剰摂取症例における最新の更新によるものである^［７］。より新しいデザイナー類似体であるアセチルフェンタニルは、ヘロインまたはヘロイン混合物としてのその詐欺販売ゆえに、オピオイドの蔓延を更に悪化させ^［８］、それは多数の過剰摂取死に関連づけられている^［９］。米国に加えて、欧州全域においても、フェンタニルの乱用が増加しており、最も多くの過剰摂取死はエストニアで生じ、１人当たりのフェンタニルの最大消費はドイツおよびオーストリアにおいて報告された^［１０］。

概要
本発明は、種々の実施形態において、式（Ｉ）

［式中、Ｒ^１＝ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＸおよびＸ＝ＯＨまたはその活性エステル；Ｒ^２＝Ｈまたは（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基；Ｒ^３＝Ｈまたは（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基；およびＲ^４＝Ｈまたは（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基］の化合物を含む、フェンタニルクラス薬物に対する特異性を有するＩｇＧ抗体をインビボで産生させるためのワクチンを、担体とコンジュゲート化（結合）した場合に生成させるためのハプテン；および請求項１記載の式（Ｉ）（ここで、Ｘはタンパク質担体またはアミノ官能基化ビーズを含み、該タンパク質または該ビーズは該ハプテンとアミド結合を形成する）の化合物を含む、フェンタニルクラス薬物に対するインビボ「イムノアンタゴニスト（ｉｍｍｕｎｏａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）」を生成させるためのハプテンコンジュゲートを提供する。例えば、該タンパク質担体はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または破傷風トキソイド（ＴＴ）であることが可能であり、あるいは該アミノ官能基化ビーズは、Ｄｙｎａｂｅａｄ Ｍ−２７０アミンであることが可能である。

本発明は更に、前記のハプテンコンジュゲートの有効量を投与することにより哺乳動物において製造されるワクチンを提供する。例えば、ワクチン製造のために使用される哺乳動物はマウスでありうる。該ワクチンはＩｇＧ型抗体を含みうる。

追加的な実施形態においては、本発明は、該ワクチンの有効量を患者に投与することを含む、患者における作用部位におけるフェンタニルクラス薬物の濃度を有効に最小にする方法を提供する。また、該ワクチンの有効量の投与は、それ無しでは致死量となるフェンタニルクラス薬物からの有意な防御を患者にもたらす。更に、患者への該ワクチンの有効量の投与はフェンタニルクラス薬物の嗜癖傾向および過剰摂取の可能性を低減する。

詳細な説明
フェンタニルおよびその類似体の有害で嗜癖性の作用に対処するために、本発明者らは、コカイン^［１１］、ニコチン^［１２］、メタンフェタミン^［１３］およびヘロイン^［１４］に対する従来の作戦と同様に、嗜癖治療に対する免疫薬物療法アプローチを追求した。この戦略の基礎は、作用部位における標的薬物の濃度を有効に最小にするインビボ「イムノアンタゴニスト」を生成させるためのタンパク質−薬物コンジュゲートの能動的ワクチン接種を含む。結果として、該ワクチンは特定の薬物の嗜癖傾向および過剰摂取の可能性を低減する。本発明において、本発明者らは、有効なフェンタニルコンジュゲートワクチンの最初の例を記載する。免疫化後、このワクチンは、フェンタニルクラス薬物に対する特異性を有するＩｇＧ抗体の内因性生成を成功裏に刺激した。更に、マウス抗血清は、ＳＰＲ分析法により、種々のフェンタニル類似体に対してナノモルのアフィニティを示した。潜在的に致死的な量のフェンタニル類似体をマウスに投与したところ、該ワクチンは有意な防御をもたらした。現在までの他のワクチンはいずれも、乱用薬物の急性致死作用の遮断を示していない。重要なことに、本発明者らの研究努力は、フェンタニルクラス薬物の薬力学的効果を低減するための著しい進歩をもたらした。

フェンタニルワクチンの開発においては、ハプテンの設計が、初期の、そしておそらくは最も重要な課題であった。本発明者らが既に報告しているとおり、イムノコンジュゲートが成功するためには、小分子ハプテンが標的分子の天然構造を忠実に維持している必要がある^［１５］。

フェンタニルだけでなくデザイナー類似体にも対処することが求められているため、実質的に全てのフェンタニル誘導体に対する広範な免疫特異性を有する抗体を生成させるために、本発明者らのハプテンは、コアであるＮ−（１−フェネチルピペリジン−４−イル）−Ｎ−フェニルアセトアミド骨格を組み込んでいる（図１）。更に、フェンタニルにおけるプロパノイル基をリンカー結合点として選択した。なぜなら、それは該コア構造を立体的に妨害しないからである（図１）。ハプテン合成は、フェンタニルにおけるプロパノイル基をグルタル酸部分で置換することにより達成された。これは免疫原性担体タンパク質へのアミドカップリングのための標準的なバイオコンジュゲート化学法を可能にするものである。破傷風トキソイド（ＴＴ）タンパク質を選択したのは、それが、臨床的に承認された破傷風および複合糖質ワクチンの成分として使用されているからである。ＴＴ表面リジンへのフェンタニルハプテンのコンジュゲート化（結合）の後、得られたイムノコンジュゲート（免疫複合体）（Ｆｅｎｔ−ＴＴと称される；図１）をマウスに投与した。Ｆｅｎｔ−ＴＴを、ヘロインコンジュゲートワクチンに対するＩｇＧ抗体応答を増強するのに有効であることが判明しているアジュバントであるミョウバンおよびＣｐＧ ＯＤＮ １８２６と共に製剤化した^{［１４ａ］}。図２に示されているとおり、Ｆｅｎｔ−ＴＴワクチンは、１回の注射の後でさえも、ＥＬＩＳＡによる非常に高い抗フェンタニル抗体中点力価（＞１００，０００）を誘導して、フェンタニルに対する十分なインビボ中和能をもたらした。

ワクチンの性能を評価するために、本発明者らは、げっ歯類モデルにおいてオピオイド薬の鎮痛能力を測定するための標準的な方法である抗侵害受容アッセイを用いた^{［１４ａ，１６］}。フェンタニルのようなオピオイドは用量依存的に疼痛閾値を増加させ、これらの閾値は、熱い表面により誘発される侵害受容までの動物の潜時を測定することにより定量されうる。薬物ワクチンは投与用量の血清抗体媒介性免疫拮抗作用により標的薬物の薬理学的作用を鈍らせる。したがって、成功したワクチンは抗侵害受容アッセイにおける薬物用量応答曲線を「右」へシフトさせるはずである。ワクチン接種マウスおよび未ワクチン接種マウスにおける薬物ＥＤ_５０用量の比較は薬物ワクチン効力に関する有用な測定基準として役立つ。これまでに、本発明者らは、ヘロイン依存性ラットにおける薬物自己投与をなくさせた、約５〜１０倍のワクチン誘導性シフトを報告している^{［１４ａ，１４ｂ］}。本研究において、本発明者らは、３０倍を超える大きなフェンタニルＥＤ_５０シフトを観察した。注目すべきことに、最初の６週の試験セッション中に、フェンタニルの投与は該ワクチンの防御能を無効にすることができなかった。１ヵ月後（第１０週）に、ワクチン接種マウスにおける抗薬物力価は、より小さいフェンタニル用量を使用してＥＤ_５０測定のための完全用量応答曲線を作成しうる点まで減少していた。大きなワクチン媒介性シフトが観察された（尾部浸漬試験において３３倍；図３）。注目すべきことに、ワクチン接種マウスに安全に投与された２つの最大用量（２．２および４．４ｍｇ／ｋｇ）において、未処理マウスはそれぞれ１８および５５％の致死率を示し、したがって、このことは、該ワクチンが致死量のフェンタニルを遮断しうることを実証している。

該ワクチンが他のフェンタニル類似体を中和しうることの証拠として、Ｆｅｎｔ−ＴＴ免疫マウスは、最も一般的な不法フェンタニル誘導体の２つである３−メチルフェンタニルおよびα−メチルフェンタニル（別名「チャイナ・ホワイト（Ｃｈｉｎａ Ｗｈｉｔｅ）」）（構造は図１を参照されたい）からの防御を示した。α−Ｍｅ類似体は親化合物と同等の効力を有し、該ワクチンはα−ＭｅのＥＤ_５０を約８倍シフトさせることが可能であった（図３）。一方、３−Ｍｅ類似体は非常に強力であったが（フェンタニルの約１０倍大きな効力）、該ワクチンは尚も４倍のＥＤ_５０シフトを示した（図３）。総合すると、本発明者らの行動結果は、Ｆｅｎｔ−ＴＴワクチンが、大きなフェンタニル用量の十分な減弱をインビボでもたらした一方で、フェンタニル類似体に対する治療的に有用なレベルの交差反応性を示したことを示している。臨床的に、これらの結果は、Ｆｅｎｔ−ＴＴが、フェンタニルの乱用および過剰摂取誘発性致死を防ぐための有効な嗜癖治療であることを意味する。

薬物動態の観点から、本発明者らは、フェンタニル用量の生体分布に対するＦｅｎｔ−ＴＴワクチンの効果を調べた。フェンタニル用量の投与の後、ほぼｔ_ｍａｘ（最大薬物血漿濃度における時間）において対照マウスおよびワクチン接種マウスの両方を犠死させ、脳サンプルおよび血液サンプルの両方におけるフェンタニル濃度をＬＣＭＳにより測定した。本発明者らの結果は、ワクチン接種マウスにおける血清抗体が、対照マウスにおける血清タンパク質の場合に比べて４５倍の量のフェンタニルに結合するデポーとして作用することを明らかに示している。これはワクチン接種マウスのフェンタニル脳内濃度の有意な減少と解釈され、該ワクチンがフェンタニルの精神作用をどのようにして低減するのかの薬理学的説明に役立つ。

行動および薬物動態の結果はＦｅｎｔ−ＴＴワクチン接種マウス由来の抗血清の徹底的な生化学分析によって裏付けられた。これを達成するために、本発明者らは表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分光法を用いた。これは、タンパク質−タンパク質またはタンパク質−小分子結合相互作用を調べるための高感度技術である^［１７］。ＳＰＲの新たな適用において、本発明者らは種々のフェンタニル類似体に対するワクチン接種マウス血清におけるポリクローナル抗体の結合アフィニティを測定した。希釈したマウス血清を一連の濃度の選択したフェンタニル誘導体とプレインキュベートし、ついで、Ｆｅｎｔ−ＢＳＡ被覆チップを含有するＢｉａｃｏｒｅ ３０００内に注入した。本質的には、この方法は、系列希釈遊離薬物が抗体結合に関して固定化薬物ハプテンと競合する競合ＥＬＩＳＡの、より洗練された形態である^［１８］。ＳＰＲ競合実験（図５ａ）からの本発明者らの結果は、Ｆｅｎｔ−ＴＴ免疫化マウスからの抗体がフェンタニル誘導体に対する高いアフィニティを有し、低いナノモルのＩＣ_５０値およびｐＭ範囲の検出限界を伴う結合曲線を与えることを示した（図５ａおよび未加工センサーグラム；図Ｓ２）。異なるＲ_１アルキル基を有する類似体間の相対的アフィニティは非常に類似していた。これはおそらく、Ｒ_１位をリンカー結合点として用いたことによるものであろう。予想どおり、他の位置でのメチル化はより低いアフィニティをもたらしたが、依然としてＩＣ_５０値は１００ｎＭ未満であった。更に、ＳＰＲ ＩＣ_５０は行動アッセイにおける結果を反映しており、どちらの場合も、Ｆｅｎｔ＞α−Ｍｅ＞シル−３−Ｍｅの傾向に従った。Ｆｅｎｔ−ＴＴワクチンはフェンタニルクラス薬物に対する広範な特異性を示したため、臨床的に使用されている２つのオピオイドであるメタドン（ＭｅＤ）およびオキシコドン（Ｏｘｙ）を、最小の交差反応性を保証するために試験した。実際、これらのオピオイドに対するアフィニティはフェンタニルと比較して７５００倍以上低かった（図５ａ）。このことは、それらがＦｅｎｔ−ＴＴワクチン接種対象において尚も使用されうることを示している。

得られたＩＣ_５０値が実際のＫ_Ｄを代表するものであることを確認するために、ＳＰＲ法の更なる検証を続行した。ハプテンのアフィニティは遊離薬物のアフィニティを常に反映しているわけではない。この問題に対処するために、抗フェンタニル抗体をアフィニティ精製し、遊離フェンタニル結合動力学の直接測定のために、ＳＰＲチップ上にそれらをローディングした。図５ｂのセンサーグラムに示されているとおり、精製抗体のフェンタニルＫ_Ｄ（２ｎＭ）は、競合法により決定されたＩＣ_５０値（５ｎＭ）とほぼ一致している。このように、本発明者らは、ポリクローナル血清抗体の薬物アフィニティを測定するための正確な方法として、ＳＰＲ競合法を実証した。免疫薬物療法の重要な態様は抗薬物抗体の適切な特徴づけであり、ＳＰＲ法は、薬物ワクチン開発のこの側面を促進するのに役立ちうるであろう。また、この方法は、多種多様なフェンタニル誘導体の存在に関して、生物学的サンプル、例えば血液または尿をスクリーニングするために用いられうるであろう。なぜなら、特に、多数のフェンタニル類似体の検出限界は１ｎＭ未満であるからである（図５ａ）。

本研究において、オピオイドの乱用の増加に対処するのに役立ちうる潜在的な治療剤が得られた。正常な薬物誘発性「恍惚感」を得るのに必要な小さなフェンタニルクラス薬物用量を容易に除去し、そしてまた、潜在的に致死性である大きなフェンタニルクラス薬物用量を減弱する有効なフェンタニルコンジュゲートワクチンが開発された。更に、このワクチンの成功は、アカデミックな新規性から実用的な治療へと免疫薬物療法を進歩させるのに役立ち、「バス・ソルト（ｂａｔｈ ｓａｌｔ）」のような他の有害なデザイナー薬に対するワクチンの創製を促進する^{［４，１９］}。

引用文献：
［１］ Ｐ．Ａ．Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ １９６２，３４，２６０−２６８．
［２］ Ｊ．Ｍ．Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．Ｊ．Ｉｒｖｉｎｅ，Ａｄｄｉｃｔｉｏｎ １９９９，９４，９６１−９７２．
［３］ Ｇ．Ｌ．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ １９９１，３６，４２２−４３３．
［４］ Ｆ．Ｉ．Ｃａｒｒｏｌｌ，Ａ．Ｈ．Ｌｅｗｉｎ，Ｓ．Ｗ．Ｍａｓｃａｒｅｌｌａ，Ｈ．Ｈ．Ｓｅｌｔｚｍａｎ，Ｐ．Ａ．Ｒｅｄｄｙ，Ａｎｎ Ｎｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ２０１２，１２４８，１８−３８．
［５］ Ｗ．Ｆ．Ｖａｎ Ｂｅｖｅｒ，Ｃ．Ｊ．Ｎｉｅｍｅｇｅｅｒｓ，Ｐ．Ａ．Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ １９７４，１７，１０４７−１０５１．
［６］ ＮＩＤＡ，Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｔｒｅｎｄｓ ２０１５．
［７］ Ｍ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｈｅｃｋｅｒ，Ｒ．Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｆｒｙｅ，Ｄ．Ｊｅｈｌｅ，Ｅ．Ｊ．Ｌｕｃｉｄ，Ｆ．Ｈａｒｃｈｅｌｒｏａｄ，Ａｎｎ Ｅｍｅｒｇ Ｍｅｄ １９９１，２０，１５８−１６４．
［８］ Ｊ．Ｍ．Ｓｔｏｇｎｅｒ，Ａｎｎ Ｅｍｅｒｇ Ｍｅｄ ２０１４，６４，６３７−６３９．
［９］ Ｃ．Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＭＭＷＲ Ｍｏｒｂ Ｍｏｒｔａｌ Ｗｋｌｙ Ｒｅｐ ２０１３，６２，７０３−７０４．
［１０］ Ｊ．Ｍｏｕｎｔｅｎｅｙ，Ｉ．Ｇｉｒａｕｄｏｎ，Ｇ．Ｄｅｎｉｓｓｏｖ，Ｐ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｉｎｔ Ｊ Ｄｒｕｇ Ｐｏｌｉｃｙ ２０１５，２６，６２６−６３１．
［１１］ ａ）Ｂ．Ａ．Ｍａｒｔｅｌｌ，Ｅ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｐｏｌｉｎｇ，Ｋ．Ｇｏｎｓａｉ，Ｔ．Ｒ．Ｋｏｓｔｅｎ，Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈ ２００５，５８，１５８−１６４；ｂ）Ｍ．Ｒ．Ａ．Ｃａｒｒｅｒａ，Ｊ．Ａ．Ａｓｈｌｅｙ，Ｂ．Ｚｈｏｕ，Ｐ．Ｗｉｒｓｃｈｉｎｇ，Ｇ．Ｆ．Ｋｏｏｂ，Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ，ＰＮＡＳ ２０００，９７，６２０２−６２０６．
［１２］ ａ）Ｍ．Ｐｒａｖｅｔｏｎｉ，Ｄ．Ｅ．Ｋｅｙｌｅｒ，Ｒ．Ｒ．Ｐｉｄａｐａｒｔｈｉ，Ｆ．Ｉ．Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｓ．Ｐ．Ｒｕｎｙｏｎ，Ｍ．Ｐ．Ｍｕｒｔａｕｇｈ，Ｃ．Ａ．Ｅａｒｌｅｙ，Ｐ．Ｒ．Ｐｅｎｔｅｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０１２，８３，５４３−５５０；ｂ）Ｊ．Ｗ．Ｌｏｃｋｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｌｉｖｅｌｙ，Ｋ．Ｃ．Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｃ．Ｍ．Ｖｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏ，Ｍ．Ｒ．Ａｚａｒ，Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１５，５８，１００５−１０１１．
［１３］ ａ）Ａ．Ｙ．Ｍｏｒｅｎｏ，Ａ．Ｖ．Ｍａｙｏｒｏｖ，Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ，ＪＡＣＳ ２０１１，１３３，６５８７−６５９５；ｂ）Ｄ．Ｒｕｅｄｉ−Ｂｅｔｔｓｃｈｅｎ，Ｓ．Ｌ．Ｗｏｏｄ，Ｍ．Ｇ．Ｇｕｎｎｅｌｌ，Ｃ．Ｍ．Ｗｅｓｔ，Ｒ．Ｒ．Ｐｉｄａｐａｒｔｈｉ，Ｆ．Ｉ．Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｂ．Ｅ．Ｂｌｏｕｇｈ，Ｓ．Ｍ．Ｏｗｅｎｓ，Ｖａｃｃｉｎｅ ２０１３，３１，４５９６−４６０２．
［１４］ ａ）Ｐ．Ｔ．Ｂｒｅｍｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｓｃｈｌｏｓｂｕｒｇ，Ｊ．Ｍ．Ｌｉｖｅｌｙ，Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ ２０１４，１１，１０７５−１０８０；ｂ）Ｊ．Ｅ．Ｓｃｈｌｏｓｂｕｒｇ，Ｌ．Ｆ．Ｖｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏ，Ｐ．Ｔ．Ｂｒｅｍｅｒ，Ｊ．Ｗ．Ｌｏｃｋｎｅｒ，Ｃ．Ｌ．Ｗａｄｅ，Ａ．Ａ．Ｎｕｎｅｓ，Ｇ．Ｎ．Ｓｔｏｗｅ，Ｓ．Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ，Ｇ．Ｆ．Ｋｏｏｂ，ＰＮＡＳ ２０１３，１１０，９０３６−９０４１；ｃ）Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ，Ｊ．Ｂ．Ｔｒｅｗｅｅｋ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２０１２，１２，６７−７２；ｄ）Ｒ．Ｊａｌａｈ，Ｏ．Ｂ．Ｔｏｒｒｅｓ，Ａ．Ｖ．Ｍａｙｏｒｏｖ，Ｆ．Ｙ．Ｌｉ，Ｊ．Ｆ．Ｇ．Ａｎｔｏｌｉｎｅ，Ａ．Ｅ．Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｋ．Ｃ．Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｒ．Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ，Ｚ．Ｂｅｃｋ，Ｃ．Ｒ．Ａｌｖｉｎｇ，Ｇ．Ｒ．Ｍａｔｙａｓ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１５，２６，１０４１−１０５３．
［１５］ ａ）Ｇ．Ｎ．Ｓｔｏｗｅ，Ｌ．Ｆ．Ｖｅｎｄｒｕｓｃｏｌｏ，Ｓ．Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．Ｅ．Ｓｃｈｌｏｓｂｕｒｇ，Ｋ．Ｋ．Ｍｉｓｒａ，Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｅｉｓ，Ａ．Ｖ．Ｍａｙｏｒｏｖ，Ｊ．Ｓ．Ｚａｋｈａｒｉ，Ｇ．Ｆ．Ｋｏｏｂ，Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１１，５４，５１９５−５２０４；ｂ）Ｐ．Ｔ．Ｂｒｅｍｅｒ，Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ，Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１２，５５，１０７７６−１０７８０．
［１６］ Ａ．Ｗ．Ｂａｎｎｏｎ，Ａ．Ｂ．Ｍａｌｍｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２００７，Ｃｈａｐｔｅｒ ８，Ｕｎｉｔ ８ ９．
［１７］ ａ）Ｇ．Ｋｌｅｎｋａｒ，Ｂ．Ｌｉｅｄｂｅｒｇ，Ａｎａｌ Ｂｉｏａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２００８，３９１，１６７９−１６８８；ｂ）Ｇ．Ｓａｋａｉ，Ｋ．Ｏｇａｔａ，Ｔ．Ｕｄａ，Ｎ．Ｍｉｕｒａ，Ｎ．Ｙａｍａｚｏｅ，Ｓｅｎｓｏｒ Ａｃｔｕａｔ Ｂ−Ｃｈｅｍ １９９８，４９，５−１２．
［１８］ ａ）Ｗ．Ｒｕｎａｇｙｕｔｔｉｋａｒｎ，Ｍ．Ｙ．Ｌａｗ，Ｄ．Ｅ．Ｒｏｌｌｉｎｓ，Ｄ．Ｅ．Ｍｏｏｄｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １９９０，１４，１６０−１６４；ｂ）Ｇ．Ｓ．Ｍａｋｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｊ．Ｒｉｃｈｔｅｒ，Ｒ．Ｅ．Ｍｏｏｒｅ，Ｒ．Ｅｉｓｍａ，Ｄ．Ｏｓｔｈｅｉｍｅｒ，Ｍ．Ｏｎｏｒｏｓｋｉ，Ａ．Ｈ．Ｂ．Ｗｕ，Ａｎｎ Ｃｌｉｎ Ｌａｂ Ｓｃｉ １９９５，２５，１６９−１７８．
［１９］ Ｃ．Ｌ．Ｇｅｒｍａｎ，Ａ．Ｅ．Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｒ．Ｈａｎｓｏｎ，Ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２０１４，９７，２−８．

１００ｎＭ未満のアフィニティでポリクローナル抗体により認識されるフェンタニル免疫複合体および類似体の構造。 実験および抗フェンタニル抗体力価のタイムライン。Ｆｅｎｔ−ＴＴ（５０μｇ）をミョウバン（７５０μｇ）＋ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６（５０μｇ）と共にで製剤化し、各マウス（Ｎ＝６）にｉ．ｐ．投与した。フェンタニル−ＢＳＡコンジュゲートに対するＥＬＩＳＡによりＩｇＧ力価を決定した。点は平均±ＳＥＭを示す。符号：ｉ＝ワクチン注射、ａ＝抗侵害受容アッセイ、ｆ＝ＳＰＲによるアフィニティ測定、ｂ＝血液／脳 生体分布研究。 抗侵害受容アッセイにおけるフェンタニル類似体の用量応答曲線およびＥＤ_５０値。ワクチン接種マウスおよび対照マウス（それぞれＮ＝６）に、特定されている薬物を累積的に投与し、侵害受容までの潜時を尾部浸漬（上）およびホットプレート（下）試験により測定した。点は平均±ＳＥＭを示す。３つの全ての薬物に関して、独立ｔ検定による対照群とワクチン群との比較において、ｐ値は０．００１未満であった。 血液および脳サンプルにおけるフェンタニルの生体内分布。ワクチン接種マウスおよび対照マウス（それぞれＮ＝６）に０．２ｍｇ／ｋｇのフェンタニルを投与し、注射の１５分後に組織を採取した。フェンタニルの定量をＬＣＭＳ分析により行った。棒グラフは平均＋ＳＥＭを示す。^＊＊＊ ｐ＜０．００１（独立ｔ検定）。 抗血清オピオイド結合曲線およびＳＰＲセンサーグラム。ａ）第６週からの希釈マウス血清を、挙げられているオピオイドの系列希釈物と共にインキュベートし、Ｆｅｎｔ−ＢＳＡ負荷センサーチップを含有するＢｉａｃｏｒｅ ３０００内に注入した。薬物の非存在下でＳＰＲチップに結合する抗体により生成されたシグナルを１００％結合の基準として使用した。使用したフェンタニルはラセミ体であり、３−Ｍｅはシスであった。構造に関しては、図１を参照されたい。ｂ）ＢｉＯｐｔｉｘ４０４ｐｉにおいて２５℃でフェンタニル（１０００、５００、２５０、１２５、６２．５、３１．２５、１５．６３、７．８１、３．９、１．９５および０ｎＭ）と固定化抗フェンタニル抗体との間の相互作用に関して得られたセンサーグラムの重ね合わせプロット。元の実験センサーグラムは黒色で示されており、フィットされた曲線は白線でトレースされている。

実施例
化学
核磁気共鳴（^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ）、^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ））スペクトルは、特に示されていない限り、Ｂｒｕｋｅｒ ４００装置において測定した。^１Ｈ ＮＭＲの化学シフトは、クロロホルム（７．２６ｐｐｍ）に対する百万分率（ｐｐｍ）で示されており、結合定数はヘルツ（Ｈｚ）で示されている。スピン多重度に関しては、以下の略語を用いる：ｓ＝一重線、ｄ＝二重線、ｔ＝三重線、ｑ＝四重線、ｍ＝多重線、ｂｒ＝ブロード。^１３Ｃ ＮＭＲの化学シフトはクロロホルムに関する７７．０ｐｐｍにおける三重線の中心線に対するｐｐｍとして示されている。エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量はＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ ＬＴＱイオントラップで得た。マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量スペクトルはＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥで得た。分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）はＭｅｒｃｋプレコート分析用プレート（厚さ０．２５ｍｍ、シリカゲル６０Ｆ_２５４）上で行った。分取ＴＬＣ（ＰＴＬＣ）分離は、シリカゲル６０Ｆ_２５４でプレコートされたＭｅｒｃｋ分析用プレート（厚さ０．５０ｍｍ）上で行った。フラッシュクロマトグラフィー分離は、特に記載されていない限り、Ａｌｄｒｉｃｈシリカゲル（カタログ番号７１７１８５，孔径６０オングストローム、粒径４０〜６３μｍ、２３０〜４００メッシュ）で行った。

動物実験
６〜８週齢の雄Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（ｎ＝６匹／群）をＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から得た。温度および湿度が制御された部屋を含むＡＡＡＬＡＣ認証動物施設においてマウスを群で収容し、逆光周期（点灯：午後９時〜午前９時）でマウスを維持した。全ての実験は、暗期中、一般には午後１時〜午後４時に行った。全般的な健康状態はＳｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの科学者および獣医スタッフの両方によりモニターされ、全ての試験はＳｃｒｉｐｐｓ動物実験委員会（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に従い実施され、米国国立衛生研究所動物実験委員会の方針（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）を遵守していた。１００〜１５０μＬの全血を採取するために、尾端切断術（１ｃｍ未満）を用いて力価定量のための血液血清サンプル採取を行い、ついでサンプルを７５００ｒｐｍで８分間遠心分離して、血清を分離した。

フェンタニルハプテンの合成

ＣＨ_２Ｃｌ_２（７．０ｍＬ）中の１^［１］（２００ｍｇ，７１４μｍｏｌ）の溶液にピリジン（１１５μＬ，１．４２ｍｍｏｌ）およびグルタル酸モノメチルエステル塩化物（１１０μＬ，７８０μｍｏｌ）を０℃で加えた。０℃で５分間撹拌した後、反応混合物を室温に加温した。室温で１．５時間撹拌した後、反応混合物を飽和水性ＮａＨＣＯ_３でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。水層をＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空中で蒸発させた。残留油状物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ_２；ｎ−ヘキサン：ＥｔＯＡｃ＝１：１〜１：２〜０：１）で精製して、２（２８８ｍｇ，９８．７％）を淡黄色固体として得た。

^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ ７．４１−７．３５（ｍ，３Ｈ），７．２７−７．２３（ｍ，２Ｈ），７．１９−７．１３（ｍ，３Ｈ），７．０８−７．０５（ｍ，２Ｈ），４．６７（ｔｔ，Ｊ＝１２．０，４．０Ｈｚ，１Ｈ），３．５９（ｓ，３Ｈ），２．９９（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１２．８Ｈｚ，２Ｈ），２．７２（ｄｄ，Ｊ＝８．４，８．０Ｈｚ，１Ｈ），２．７２（ｄ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，１Ｈ），２．５３（ｄｄ，Ｊ＝８．４，７．２Ｈｚ，１Ｈ），２．２６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．１５（ｔｄ，Ｊ＝１２．４，２．４Ｈｚ，２Ｈ），１．９８−１．９３（ｍ，２Ｈ），１．８７（ｑｄ，Ｊ＝７．６，１．６Ｈｚ，３Ｈ），１．８５−１．７７（ｍ，２Ｈ），１．４２（ｑｄ，Ｊ＝１２．４，３．６Ｈｚ，２Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ １７３．５，１７１．７，１３９．７，１３８．４，１３０．２（２Ｃ），１２９．３（２Ｃ），１２８．５（２Ｃ），１２８．３，１２８．３（２Ｃ），１２６．０，５９．９，５２．６（２Ｃ），５１．９，５１．３，３３．９，３３．２，３３．１，２９．９（２Ｃ），２０．５；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）４０９．２４８７（Ｃ_２５Ｈ_３３Ｎ_２Ｏ_３としての計算値：４０９．２４９１）。

ＭｅＯＨ（１．０ｍＬ）中の２（４９．９ｍｇ，１２２μｍｏｌ）の溶液に、１．０Ｍ ＬｉＯＨ水溶液（２５０μＬ）を室温で加えた。室温で４時間撹拌した後、反応混合物をヘキサンで洗浄した。水層を２．０Ｍ 水性ＨＣｌで酸性化し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。合わせた有機抽出物をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、真空中で蒸発させた。残留白色固体３^［２］（５２．０ｍｇ，定量的）を、更に精製することなく次工程で使用した。ＰＴＬＣ（ＳｉＯ_２；ＣＨ_２Ｃｌ_２：ＭｅＯＨ＝９：１）による精製の後、３に関する分光学的データを収集した。

^１Ｈ−ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ ７．４１−７．３５（ｍ，３Ｈ），７．２９−７．２４（ｍ，２Ｈ），７．２２−７．１８（ｍ，１Ｈ），７．１７−７．１５（ｍ，２Ｈ），７．０６−７．０４（ｍ，２Ｈ），４．８３（ｂｒ ｓ，１Ｈ），４．６９（ｔｔ，Ｊ＝１２．０，４．０Ｈｚ，１Ｈ），３．３５（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，２Ｈ），２．９６−２．８５（ｍ，４Ｈ），２．５６（ｂｒ ｔ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，２Ｈ），２．１６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．８７（ｂｒ ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，２Ｈ），１．８３−１．７４（ｍ，２Ｈ），１．８０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ）；^１３Ｃ−ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ １７６．９，１７２．３，１３９．０，１３８．４，１３０．０（２Ｃ），１２９．５（２Ｃ），１２８．６（２Ｃ），１２８．６，１２８．５（２Ｃ），１２６．３，５９．２，５２．３（２Ｃ），５１．７，３４．３，３４．１，３２．３，２９．２（２Ｃ），２０．９；ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）３９５．２３２７（Ｃ_２４Ｈ_３１Ｎ_２Ｏ_３としての計算値：３９５．２３３５）。

ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および破傷風トキソイド（ＴＴ）へのフェンタニルハプテンのコンジュゲート化

ＤＭＦ（１４４μＬ）およびＨ_２Ｏ（１６μＬ）中の３（２．７ｍｇ，６．８μｍｏｌ）の溶液にＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）（４．８ｍｇ，４０．４μｍｏｌ）およびＥＤＣ（Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド）（７．８ｍｇ，４０．８μｍｏｌ）を室温で加えた。室温で１．５時間撹拌した後、追加的なＥＤＣ（４．２ｍｇ，２１．９μｍｏｌ）を加えた。室温で更に２時間撹拌した後、反応混合物を２つの部分に分けた。

一方の部分（８０μＬ）をＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中のＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（６６０μＬ，１．５０ｍｇ／ｍＬ）の溶液中に室温で加え、他方の部分（８０μＬ）をＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）中のＴＴ（Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ）（６５０μＬ，１．５３ｍｇ／ｍＬ）の溶液中に室温で加えた。室温で１５時間撹拌した後、反応混合物のそれぞれを、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ １０Ｋ ＭＷＣＯ透析装置を使用して、ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）に対して室温で透析した。バッファーを２時間ごとに６時間交換し、ついで透析を４℃で１２時間継続した。コンジュゲート濃度をＢＣＡアッセイにより定量し、４℃で保存した。

フェンタニルハプテン被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０アミンの製造

ＤＭＦ（２２５μＬ）およびＨ_２Ｏ（２５μＬ）中の３（３．０ｍｇ，７．６μｍｏｌ）の溶液にＮＨＳ（９．０ｍｇ，７５．８μｍｏｌ）およびＥＤＣ（１４．６ｍｇ，７６．１μｍｏｌ）を室温で加えた。室温で１２時間撹拌した後、反応混合物のアリコート５０μＬをＰＢＳバッファー中の１．０ｍＬのＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０アミン（使用前にＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で４回洗浄した）に室温で加えた。室温で１．５時間撹拌した後、該ビーズをＰＢＳバッファー（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、４℃で保存した。

ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析
この研究において製造された各フェンタニルハプテン−ＢＳＡおよびＴＴコンジュゲートのコピー数（ハプテン密度）を定量するために、サンプルをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析に付し、フェンタニルハプテン−ＢＳＡおよびＴＴコンジュゲートの分子量（ＭＷ）を、それぞれ、未修飾ＢＳＡおよびＴＴの分子量と、以下の式に従い比較した。

コピー数＝（ＭＷ_{フェンタニルハプテン−タンパク質}−ＭＷ_{タンパク質}）／（ＭＷ_{フェンタニルハプテン}−ＭＷ_水）
ＭＷ_{フェンタニルハプテン}＝３９５Ｄａ、ＭＷ_水＝１８Ｄａ
ＭＷ_{フェンタニルハプテン−ＢＳＡ}＝８０，９３９Ｄａ、ＭＷ_ＢＳＡ＝６６，５００Ｄａ
ＭＷ_{フェンタニルハプテン−ＴＴ}＝１６８，７５７Ｄａ、ＭＷ_ＴＴ＝１５３，５００Ｄａ
コピー数_{フェンタニルハプテン−ＢＳＡ}＝３８
コピー数_{フェンタニルハプテン−ＴＴ}＝４０
ＥＬＩＳＡ法
ピペット操作および洗浄工程はＢｉｏｍｅｋ ３０００液体処理ロボットで行った。ＰＢＳはアッセイ全体を通してｐＨ７．４で使用し、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの１０×粉末パケットから調製した。まず、高結合性９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ３６９０）の半分の領域をウェル当たり２５μｇのＦｅｎｔ−ＢＳＡで３７℃で一晩コート（被覆）し、液体を蒸発させた。脱脂乳で室温で１時間ブロッキングした後、ワクチン接種マウス血清を、１：５０００から開始して１２列にわたって２％ ＢＳＡ溶液中で１：１系列希釈した。室温で２時間インキュベートした後、該プレートを５回洗浄し、２％ＢＳＡ中の１：１０，０００の希釈度のロバ抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を加え、室温で１時間インキュベートした。５回の洗浄を行い、ＴＭＢ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、ＴＭＢ添加の５分後に２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４を加えた。プレートを２０分間インキュベートした後、それらの吸光度を４５０ｎｍで読取った。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭにおいて、吸光度値をサンプルごとに最高吸光度値に対して正規化し、ｌｏｇ（インヒビター）対正規化応答−可変勾配式を用いて曲線をフィットさせて、５０％ 力価および標準誤差を決定した。未ワクチン接種マウスは検出可能な抗フェンタニル力価を全く含んでいなかった。

血液／脳の生体内分布研究のための動物の処置
ナイーブマウスにおいて確立された完全鎮痛用量である０．２ｍｇ／ｋｇのフェンタニル（滅菌生理食塩水１０ｍＬ／ｋｇの容量中）をマウス（ｎ＝６（ワクチン接種）およびｎ＝６（対照））に皮下注射した。注射の１５分後、イソフルランに浸したガーゼパッドを含む５０ｍＬ Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）円錐遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）から構成されるノーズコーンを使用して、マウスを完全に麻酔した。ついで、マウスを胸骨の真下の正中線に沿って開き、横隔膜を剥がして心臓を露出させた。心臓穿刺により約１．５ｍＬの全血を得た。心臓穿刺直後に、大きな外科用ばさみを使用してマウスを迅速に断頭し、ロンジュールで脳を摘出した。ついで脳を秤量し（典型的には４．０〜６．０ｇ）、氷冷標準ＰＢＳの溶液１．０ｍＬで軽く洗浄して、過剰の外部血液を除去した。しかし、脳室内および脳物質の内部に含有されていた可能性がある全ての血液を完全に除去するための灌流にマウスを付すことはしなかった。ついで脳を５．０ｍＬ円錐サンプルチューブ内の１．０ｍＬの新鮮な氷冷ＰＢＳに加え、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅａｒｏｒ（Ｂｉｏｓｐｅｃ；Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）を使用してホモジナイズした。ついで、ＬＣＭＳ分析のためのサンプル調製まで、脳および血清の両方のサンプルを凍結した。

血液および脳におけるフェンタニルのＬＣ−ＭＳ分析のためのサンプルの調製および抽出^［３］
サンプルのアリコート（４００μＬ、血液またはホモジナイズされた脳）に内部標準としてのＭｅＯＨ中のフェンタニル−ｄ_５（２０μＬ，５０ｎｇ／ｍＬ）を加え、ついで該混合物をボルテックス混合し、平衡化させた。平衡化のために３０分間の後、Ｈ_２Ｏ（４００μＬ）を該混合物に加えた。０．１Ｍ Ｋ_２ＣＯ_３水溶液（４００μＬ）を加え、ボルテックスミキサーを使用して攪拌することにより、塩基性化が達成された。ｎ−ヘキサンとＥｔＯＡｃとの混合物（７：３）（２．８ｍＬ）で抽出を行った。２分間のボルテックス混合および３０００ｒｐｍで５分間の遠心分離の後、ＧＥＮＥＶＡＣ（登録商標）を使用して有機層を蒸発させた。５ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃ（ｐＨ４）／アセトニトリル移動相を使用するＡｇｉｌｅｎｔ Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ １２０ ＳＢ−Ｃ８カラムを備えたＬＣ−ＭＳ系内に８μＬのアリコートを注入した。各サンプルの前にブランクを注入した。重水素化および非重水素化物をＭａｓｓＨｕｎｔｅｒにおいて抽出し、得られたピークを積分した。非重水素化積分値対重水素化積分値の比を用いて、６点標準曲線によりフェンタニル濃度を決定した（後記を参照されたい）。検量線のための標準物は、既知の非重水素化フェンタニル濃度のサンプルを除き、組織サンプルと同じ方法で調製した。

ワクチンの製剤化および投与
マウスごとに、７５μＬのｐＨ７．４のＰＢＳ中の５０μｇ Ｆｅｎｔ−ＴＴ ＋ ５０μｇ ＣｐＧ ＯＤＮ １８２６（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）を７５μＬ（０．７５ｍｇ）のアルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）と一緒にし、３０分間混合した。該懸濁液（１５０μＬ／マウス）を第０週、第２週、第４週に６匹のマウスに腹腔内注射した。第２週、第４週、第６週、第１０週および第１２週にマウスから採血した。

オピオイド抗侵害受容力試験
採血の少なくとも２日後、既に記載されているとおり^［４］、主に上脊髄性（ホットプレート）および脊髄性（尾部浸漬）行動試験において、累積フェンタニル応答に関してマウスを試験した。５４℃の表面上のアクリルシリンダー（直径１４ｃｍ^＊２２ｃｍ）内にマウスを配置し、以下の侵害受容応答の１つを行うまでの潜時を計測することにより、ホットプレート試験を測定した：後足の舐め、後足の震え／引っ込め、またはジャンプ。典型的なベースライン潜時は８〜１５秒であり、組織損傷を防ぐために３５秒のカットオフを課した。応答後、マウスをプレートから取り出した。吸収性の実験用吸収バッドから構成される小袋内にマウスを軽く拘束し、尾の先端の１ｃｍを加熱水浴内に浸漬し、引っ込めまでの時間を計測することにより、尾部浸漬試験を行った。

典型的なベースライン応答は１〜２秒であり、組織損傷を防ぐために１０秒のカットオフを用いた。尾部浸漬はより反射的な挙動であるため、試験順序としては、常に最初にホットプレートを行い、ついで尾部浸漬を行う。両方の抗侵害受容アッセイの完了の直後に、フェンタニル（生理食塩水中、５．０ｍＬ／ｋｇ）を直ちに皮下注射した。各注射の約１０分後に試験を反復し、完全な抗侵害受容が観察される（すなわち、カットオフ時間を超える）まで、累積フェンタニル容量を増加させながら、試験および注射のこのサイクルを反復した。全ての試験が完了したら、後の潜在的な過剰摂取の結果を防ぐために、生理食塩水中の１．０ｍｇ／ｋｇ ナロキソンおよびナルトレキソンのカクテルをマウスに投与した。

致死性研究
雄Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウス（Ｎ＝１１）にＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２．２ｍｇ／ｋｇのフェンタニルＨＣｌを腹腔内注射した。その後、１１匹中２匹が過剰摂取で死亡した。１５分後、残りの９匹に第２の２．２ｍｇ／ｋｇ フェンタニルＨＣｌ用量を投与した。その後、更に４匹（１１匹中６匹）が過剰摂取で死亡した。同じ実験（Ｎ＝１２）を、１時間にわたる０．４、０．８、１．６、２．４および４．４ｍｇ／ｋｇの累積用量で皮下に行い、これにより１２匹中２匹のマウスにおける過剰摂取死が誘発された。

統計学
統計分析をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）において行った。全ての値は平均±ＳＥＭとして示されている。抗侵害受容データを時間から最大可能効果（％）（％ ＭＰＥ）に変換した。これは以下のとおりに計算される：％ＭＰＥ＝（試験−ベースライン）／（カットオフ−ベースライン）^＊１００として計算される。ついで、ｌｏｇ（アゴニスト）対正規化応答非線形回帰を用いて、このデータをフィットさせた。各疼痛試験および個々の治療群に関してＥＤ_５０値およびＥＤ_５０の９５％信頼区間を計算して、効力比を決定した。血液／脳フェンタニル濃度およびフェンタニルＥＤ_５０シフトに関する対照とワクチン接種群との間の統計的有意差（α＜０．００１）の検証のために、独立ｔ検定を用いた。

マウス抗フェンタニル免疫グロブリン（ＩＧ）の結合ＩＣ_５０の決定
研究等級のＣＭ３センサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ ３０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用する表面プラズモン共鳴による競合結合アッセイにより、マウスＩＧおよび遊離フェンタニルに関する結合ＩＣ_５０を決定した。リガンドであるフェンタニル−ＢＳＡコンジュゲートを、ＮＨＳ、ＥＤＣカップリング反応を用いて固定化した。全２個のフローセル（フローセル１および２）の表面を、５μＬ／分の流速で、０．１Ｍ ＮＨＳおよび０．１Ｍ ＥＤＣの１：１混合物で７分間活性化した。１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）に再懸濁させたリガンドをフローセル２上に２，０００ＲＵの密度で固定化し、一方、基準表面として働くようにフローセル２を同密度でＢＳＡに固定化した。全表面を１．０Ｍ エタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）の７分間の注入によりブロッキングした。マウスＩＧをランニングバッファー（ＨＢＳ−ＥＰ ＋ バッファー）で希釈し、両方の被覆フローセル上で滴定して、３０μＬ／分の流速での２．５分間の解離および３分間の注入で約６０ＲＵの応答が得られるようにした。定められた濃度のＨＢＳ−ＥＰ ＋ バッファー中で調製されたマウスＩＧを、競合結合アッセイを行う前に、一連の濃度の化合物と共に室温で１時間インキュベートした。該化合物およびそれらの濃度系列は以下のとおりである：ａ）３倍希釈系列で１０μＭ〜１６９ｐＭの範囲のフェンタニル；ｂ）３倍希釈で５０ｍＭ〜８５０ｐＭの範囲のアセチルフェンタニル、ブチリルフェンタニルおよびｐ−トリルフェンタニル；ｃ）４倍希釈系列で１００ｍＭ〜９５ｐＭの範囲のシス−３−メチルフェンタニルおよびα−メチルフェンタニル（チャイナ・ホワイト）；ｄ）１０倍希釈系列で１００ｍＭ〜１０ｎＭの範囲のメタドンおよびオキシコドン。全てのフェンタニルはラセミであったことに留意されたい。結合データを収集するために、アナライト、マウスＩＧおよび化合物混合物を２つのフローセル上に３０μＬ／分の流速で２５℃で３分間注入し、再生前にバッファー中で２．５分間解離させた。次ラウンドのアッセイの前に、１０ｍＭ Ｇｌｙ−ＨＣｌ（ｐＨ１．５）を３０秒間注入することにより、チップ表面を再生させた。結合分析の各サイクルの解離段階の終了時の応答を用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェアにより各化合物のＩＣ_５０値を計算した。結合曲線を図５ａに示す。

精製マウス抗フェンタニル免疫グロブリン（ＩＧ）の結合動力学の決定
マウスＩＧ（磁気フェンタニル結合Ｄｙｎａｂｅａｄｓを使用して６週の採血から直接精製されたもの）と遊離フェンタニルとの間の結合動力学を、ＣＭＤ２００ｍセンサーチップを備えたＢｉＯｐｔｉｘ ４０４ｐｉ装置（ＢｉＯｐｔｉｘ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏ．）を使用する表面プラズモン共鳴により決定した。リガンド、マウス抗フェンタニルＩｇＧ（約１５０ｋＤａ）を、ＮＨＳ、ＥＤＣカップリング反応を用いて固定化した。全２個のフローセル（フローセル２および３；２^＊２注入モードに設定されたアッセイ）の表面を０．１Ｍ ＮＨＳと０．１Ｍ ＥＤＣとの１：１混合物で５μＬ／分の流速で７分間活性化させた。１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）に再懸濁させたリガンドをフローセル３上に１２，０００ＲＵの密度で固定化し、一方、基準表面として働くようにフローセル２を同密度で無関係な抗体に固定化した。全表面を１．０Ｍ エタノールアミン−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）の７分間の注入によりブロッキングした。動力学データを収集するために、ＨＢＳ−ＥＰ ＋ バッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｐ２０（ｐＨ７．４））中で調製されたアナライトであるフェンタニル（３３６．４８Ｄａ）を、１，０００〜１．９５ｎＭ（２倍希釈系列）の範囲濃度で、５０μＬ／分の流速で２５℃の温度で、それらの２つのフローセル上に注入した。複合体を、それぞれ３００秒間および９００秒間、会合および解離させた。各アナライトサンプルの２回の注入（ランダムな順序）およびブランクバッファー注入をそれらの２つの表面上に流した。データを収集し、二重参照し、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ ２によるグローバルデータ分析を用いて１：１相互作用モデルにフィットさせた。動力学データを図５ｂに示す。

実施例において引用された文献
［１］ Ｃ．Ａ．Ｖａｌｄｅｚ，Ｒ．Ｎ．Ｌｅｉｆ，Ｂ．Ｐ．Ｍａｙｅｒ，Ｐｌｏｓ Ｏｎｅ ２０１４，９．
［２］ Ｒ．Ｖａｒｄａｎｙａｎ，Ｖ．Ｋ．Ｋｕｍｉｒｏｖ，Ｇ．Ｓ．Ｎｉｃｈｏｌ，Ｐ．Ｄａｖｉｓ，Ｅ．Ｌｉｋｔｏｒ−Ｂｕｓａ，Ｄ．Ｒａｎｋｉｎ，Ｅ．Ｖａｒｇａ，Ｔ．Ｖａｎｄｅｒａｈ，Ｆ．Ｐｏｒｒｅｃａ，Ｊ．Ｌａｉ，Ｖ．Ｊ．Ｈｒｕｂｙ，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１１，１９，６１３５−６１４２．
［３］ Ｖ．Ｃｏｏｐｍａｎ，Ｊ．Ｃｏｒｄｏｎｎｉｅｒ，Ｋ．Ｐｉｅｎ，Ｄ．Ｖａｎ Ｖａｒｅｎｂｅｒｇｈ，Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｓｃｉ Ｉｎｔ ２００７，１６９，２２３−２２７．
［４］ Ｐ．Ｔ．Ｂｒｅｍｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｓｃｈｌｏｓｂｕｒｇ，Ｊ．Ｍ．Ｌｉｖｅｌｙ，Ｋ．Ｄ．Ｊａｎｄａ，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ ２０１４，１１，１０７５−１０８０。

本発明は、当業者がそれを製造し使用するのに十分な程度に詳細に記載され例示されているが、特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱しない種々の代替、修飾および改良が当業者に明らかであろう。

本明細書中で言及されている全ての特許および刊行物を、各個の刊行物の全体が参照により本明細書に組み入れられると具体的かつ個別に示されている場合と同様に、参照により本明細書に組み入れることとする。

用いられている用語および表現は記述の用語として用いられており、限定的なものではなく、また、そのような用語および表現の使用においては、示され記載されている特徴またはその一部のいずれの均等物をも除外する意図は無く、特許請求されている本発明の範囲内で種々の修飾が可能であると認識される。したがって、本発明は好ましい実施形態および随意的特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されている概念の修飾および変更が当業者によって施されることが可能であり、そのような修飾および変更は、添付の特許請求の範囲により定められる本発明の範囲内とみなされると理解されるべきである。

Claims (9)

1. 式（Ｉ）
   

   

   
   ［式中、Ｒ^１＝ＣＨ_２ＣＨ_２Ｃ（＝Ｏ）ＸおよびＸ＝ＯＨまたはその活性エステル；Ｒ^２＝Ｈまたは（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基；Ｒ^３＝Ｈまたは（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基；およびＲ^４＝Ｈまたは（Ｃ_１−Ｃ_４）アルキル基］の化合物を含む、フェンタニルクラス薬物に対する特異性を有するＩｇＧ抗体をインビボで産生させるためのワクチンを、担体とコンジュゲート化した場合に生成させるためのハプテン。
2. 請求項１記載の式（Ｉ）（ここで、Ｘはタンパク質担体またはアミノ官能基化ビーズを含み、該タンパク質または該ビーズは該ハプテンとアミド結合を形成する）の化合物を含む、フェンタニルクラス薬物に対するインビボ・イムノアンタゴニストをインビボで生成させるためのハプテンコンジュゲート。
3. 該タンパク質担体がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または破傷風トキソイド（ＴＴ）である、請求項２記載のコンジュゲート。
4. 該アミノ官能基化ビーズがＤｙｎａｂｅａｄ Ｍ−２７０アミンである、請求項２記載のコンジュゲート。
5. 請求項２記載のハプテンコンジュゲートの有効量を投与することにより哺乳動物において製造されるワクチン。
6. 該ワクチンが、フェンタニルクラス薬物に特異的なＩｇＧ抗体を含む、請求項５記載のワクチン。
7. 請求項５記載のワクチンの有効量を患者に投与することを含む、患者における作用部位におけるフェンタニルクラス薬物の濃度を有効に最小にする方法。
8. 該ワクチンの有効量の投与が、それ無しでは致死量となるフェンタニルクラス薬物からの有意な防御を患者にもたらす、請求項７記載の方法。
9. 患者への該ワクチンの有効量の投与がフェンタニルクラス薬物の嗜癖傾向および過剰摂取の可能性を低減する、請求項７記載の方法。

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