CN103408656B - 一种半抗原与载体共价结合的吗啡/海洛因疫苗及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗原及其应用。本发明所提供的抗原为如式I所示的抗原。本发明所提供的抗原，以吗啡-6-戊二酸单酯作为半抗原，通过N-(ε-三氟醚乙酰基己酰基氧)琥珀酰亚胺酯（TFCS）衍生物的6碳原子链状连接臂连接半抗原与载体蛋白，增加了吗啡骨架结构和载体蛋白之间的距离。该抗原可以刺激机体产生高浓度的吗啡抗体，该抗体持续时间长，可以特异性与吗啡和海洛因结合，并可以长期阻断海洛因点燃所诱导的海洛因觅药行为的复燃。
Description
技术领域
本发明属于疫苗领域，涉及一种抗原及其应用，特别涉及一种半抗原与载体共价结合的吗啡/海洛因疫苗及其应用。
背景技术
药物成瘾是困扰全球人类健康和社会发展的重大公共卫生和社会问题，严重危害人类健康，影响家庭安定和社会发展，给社会造成巨大的经济损失。2011年联合国World Drug Report显示，全球各类毒品滥用人数达3.63亿；《中国禁毒报告》显示，截止2011年我国登记在册的吸毒人数以达179.4万人，实际人数倍数于此。同时，药物滥用人群是携带艾滋病病毒（HIV）、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）等病毒的高危人群。2011年《中国艾滋病疫情报告》显示，我国现存活的HIV感染者和艾滋病病人约78万人，其中经由注射吸毒传播者占28.4%。2008年一项研究显示，我国静脉注射吸毒人群中HCV阳性人数共160万，感染率高达67.0%。此外，吸毒还容易诱发诈骗、暴力犯罪、卖淫等犯罪，妨碍社会稳定与和谐发展。
目前全世界滥用的成瘾性药物主要有阿片类（如鸦片、吗啡、海洛因等）、精神兴奋剂类（如可卡因、苯丙胺）和致幻剂（如LSD、麦司卡林）。在我国，阿片类成瘾是最主要的药物滥用问题，海洛因成瘾者在所有药物滥用者中所占比例高达64.5%，对社会的发展和人民的健康造成了巨大的危害。
成瘾是一种慢性高复发的复杂性脑疾病，其特点表现为从初次用药引起冲动性觅药进行性发展为强迫性觅药，形成强烈的躯体依赖和精神依赖。即使在药物戒断之后，成瘾者对药物强烈的心理渴求也很难消除，甚至持续终生。有关阿片类成瘾的药物治疗主要是戒断症状、以及针对复吸和的维持治疗（Sevarino et al.Ann N Y Acad Sci.2000；Schulteis et al.Neurochem Res.1996）。美沙酮维持治疗、丁丙诺啡、纳洛酮等作用于阿片受体的药物近年来取得了重要的成果，但仍存在一些难以解决的问题，例如这些治疗药物本身的非法使用、其过量导致的死亡等副作用、高脱失率及高额的财政花费等（Bell et al.Drug Alcohol Depend.2009；Megarbane et al.J Subst Abuse Treat.2010；Nik Jaafar et al.J Sex Med.2013）。此外，阿片类受体拮抗剂也可以同时拮抗体内内源性阿片类物质，从而导致长期治疗的病人产生负性情绪（Kosten et al.Life Sci.1986；Ritter.Aust N Z J Psychiatry2002；Sauro&Greenberg.J Psychosom Res.2005）。因此，寻找和开发新的药物成瘾治疗药物已经成为国内外研究的重点。
近年来，药物成瘾的免疫治疗获得了越来越多的关注。成瘾性药物作为小分子，并不具备免疫原性；如果将成瘾药物与具有免疫原性的外源性大分子蛋白共价结合并暴露出药物小分子抗原部分，则可以刺激机体产生能与该成瘾药物特异性结合的抗体。当成瘾药物再次进入机体后，外周的特异性抗体将与该药物特异性结合，从而阻止其透过血脑屏障，产生中枢作用。目前针对尼古丁和可卡因的疫苗的临床试验显示，高抗体浓度的患者显示出更高的治疗效果(Hatsukami et al.Clin Pharmacol Ther.2011；Martell et al.Arch Gen Psychiatry 2009)。然而，目前针对阿片类成瘾的疫苗的研究相对滞后，亟待抗体浓度更高、持续时间更长的优化吗啡/海洛因疫苗。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种抗原。
本发明所提供的抗原为如式I所示的抗原；所述抗原由式II所示基团与载体蛋白的游离氨基通过酰胺键连接而成；
所述载体蛋白具体可为钥孔戚血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、丙种球蛋白、甲状腺球蛋白、血纤维蛋白原、卵清蛋白、绵羊红细胞、鞭毛蛋白或破伤风毒素。
在本发明的一个实施例中，所述载体蛋白具体为钥孔戚血蓝蛋白(KLH)。
本发明的另一个目的是提供所述抗原的制备方法。
本发明所提供的所述抗原的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)将所述载体蛋白溶于0.01M磷酸盐缓冲液中，调节pH到7.2-7.5(如7.2)，得到I液；
所述0.01M磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl 8.0g/L，KCl 0.2g/L，Na2HPO4·12H2O 3.6g/L，KH2PO40.24g/L。
(2)将N-(ε-三氟醚乙酰基己酰基氧)琥珀酰亚胺酯(TFCS)溶于体积分数为10-20％(如20％)的DMSO水溶液，得到II液；
（3）将所述II液与I液混合，于室温（20-25℃）孵育12-24h（如12小时），得到III液；
其中，所述II液中所述N-(ε-三氟醚乙酰基己酰基氧)琥珀酰亚胺酯的质量与所述I液中所述载体蛋白的质量比为10:1；
（4）用NaOH溶液（如浓度为1M的NaOH水溶液）将所述III液的pH调节到为8.1-8.5，于室温（20-25℃）孵育3-5小时（如3小时），得到IV液；
（5）用pH7.2-7.5（如7.2）的磷酸盐缓冲液，于4℃对所述IV液透析18-24小时（如24小时），得到载体蛋白-TFCS衍生物；
所述pH7.2-7.5的磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl8.0g/L，KCl0.2g/L，Na2HPO4·12H2O3.6g/L，KH2PO40.24g/L，pH值调至7.2-7.5。
（6）将吗啡-6-戊二酸单酯（结构式如式III所示）、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐（EDC）和水，按照100mg：100mg：100mL的比例混合，调节pH为5.5（如用1M盐酸调节），于37℃反应2小时，得到吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC（EDC-M-6-G）活化物；
（7）将步骤（5）所得载体蛋白-TFCS衍生物、步骤（6）所得吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC活化物和pH7.5的磷酸盐缓冲液混合，轻微搅拌下，于室温（20-25℃）孵育12-24h（如12小时），得到V液；
所述吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC活化物与所述载体蛋白-TFCS衍生物的质量比满足如下条件：所述吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC活化物以吗啡-6-戊二酸单酯质量计，所述载体蛋白-TFCS衍生物以所述载体蛋白质量计，前者和后者的质量比为5:1-10:1（如10：1）；
所述pH7.5的磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl8.0g/L，KCl0.2g/L，Na2HPO4·12H2O3.6g/L，KH2PO40.24g g/L，pH值调至7.5。
（8）用pH7.4的磷酸盐缓冲液，于4℃对所述V液透析2-3天（如48h），得到所述抗原；
所述pH7.4的磷酸盐缓冲液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl8.0g/L，KCl0.2g/L，Na2HPO4·12H2O3.6g/L，KH2PO40.24g/L，pH值调至7.4。
所述抗原在制备具有预防和/或治疗药物成瘾功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
在上述应用中，所述药物可为阿片类药物；在本发明中，所述阿片类药物具体为吗啡和/或海洛因。
在上述应用中，所述产品可为疫苗。
本发明的再一个目的是提供一种用于预防和/或治疗药物成瘾的疫苗。
本发明所提供的用于预防和/或治疗药物成瘾的疫苗，其活性成分为所述抗原。
所述药物可为阿片类药物；所述阿片类药物具体可为吗啡和/或海洛因。
所述抗原在制备吗啡和/或海洛因抗体中的应用也属于本发明的保护范围。
由所述抗原制备得到的抗体也属于本发明的保护范围。
本发明所提供的抗原（疫苗），以吗啡-6-戊二酸单酯作为半抗原，通过N-(ε-三氟醚乙酰基己酰基氧)琥珀酰亚胺酯（TFCS）衍生物的6碳原子链状连接臂连接半抗原与载体蛋白，增加了吗啡骨架结构和载体蛋白之间的距离。该疫苗可以刺激机体产生高浓度的吗啡抗体，该抗体持续时间长，可以特异性与吗啡和海洛因结合，并可以长期阻断海洛因点燃所诱导的海洛因觅药行为的复燃。
具体来说，本发明具有以下优点：1）采用吗啡-6-戊二酸单酯作为半抗原，增加了吗啡骨架结构和载体蛋白之间的距离，使吗啡骨架抗原决定簇充分暴露，有利于产生高浓度和高特异性抗体；2）采用TFCS衍生物的6碳原子链状连接臂连接半抗原与载体蛋白，进一步增加了吗啡骨架结构和载体蛋白之间的距离，使吗啡骨架抗原决定簇充分暴露，有利于产生高浓度和高特异性抗体；3）主动免疫所述疫苗有效刺激大鼠产生高浓度的抗体，该抗体峰浓度在第三次免疫后即可达到；4）主动免疫所述疫苗刺激大鼠所产生的抗体在体内持续时间长，可以达到长期治疗效果；5）主动免疫所述疫苗刺激大鼠所产生的抗体具有高度特异性和亲和力，可以特异性识别吗啡和海洛因结构；6）主动免疫所述疫苗可以有效防止阿片类成瘾的复吸；7）所述疫苗本身不具有成瘾性，也不靶向阿片类受体，副作用小；8）所述疫苗主动免疫后产生的抗体可以在体内循环很长时间，可以增加患者依从性，降低脱失率。
附图说明
图1为半抗原吗啡-6-戊二酸单酯的合成方法示意图。
图2为吗啡-TFCS-KLH抗原的制备方法示意图。
图3为吗啡-TFCS-KLH抗原主动免疫大鼠的免疫和采血流程，以及大鼠所产生的抗体滴度测定结果。其中，A为免疫和采血流程；B为大鼠所产生的抗体滴度测定结果。
图4为吗啡-TFCS-KLH抗原主动免疫大鼠所产生的抗体在体内的持续时间测定结 果。其中，control表示对照组，指接受KLH抗原主动免疫的大鼠。
图5为吗啡-TFCS-KLH抗原主动免疫大鼠所产生的抗体的特异性的测定结果。
图6为吗啡-TFCS-KLH抗原主动免疫大鼠对海洛因诱导的复燃的作用的操作流程和测定结果。其中，A为操作流程；B为测定结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
盐酸吗啡、盐酸海洛因、丁丙诺非、纳络酮、和烯丙吗啡：均购自青海制药厂有限公司。
戊二酸酐、N,N-二甲氨基吡啶、钥孔戚血蓝蛋白（KLH）、1-乙基-3-3二甲胺丙基碳化亚胺（EDC）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂：均购自美国Sigma-Aldrich公司。
羊抗大鼠辣根过氧化酶：购自中山金桥生物技术有限公司。
TMB试剂盒：购自北京赛驰生物科技有限公司。
SD大鼠：购自北京大学医学部实验动物中心。
实施例1、吗啡-TFCS-KLH抗原的制备
1、吗啡-6-戊二酸单酯的制备（制备流程如图1所示）
参见如下专利：申请号为201010512377.7，发明名称为一种抗原及其制备方法与应用，授权公告号为CN102002049B。具体如下：
（1）将1.3g盐酸吗啡溶解于30mL水中，滴加氨水至pH8.5，在温度为37℃和搅拌的条件下反应10min，抽滤，得类白色固体，真空干燥24h，得到1g吗啡游离碱。
（2）将步骤（1）得到的1g吗啡游离碱、1.2g戊二酸酐与催化量的N-二甲氨基吡啶混合，加入30mL苯，在95℃条件下加热回流4小时，减压蒸溜除溶剂苯，收集残留物；所述吗啡游离碱与戊二酸酐的质量比为1：1.2。
（3）将步骤（2）得到的残留物加水50mL，用1mol/L的NaOH溶液调pH至9，抽滤，收集滤液；
（4）将步骤（3）得到的滤液再用1mol/L的HCl溶液调pH至6，得到沉淀，抽滤，收集沉淀，真空干燥，得到100mg类白色固体，即吗啡-6-戊二酸单酯（M-6-G）。通过ESI-MS鉴定所得白色固体。
ESI-MS分析结果显示，所得到的白固体的准确质量为399.17，分子量为399.14。m/e：399.17（100%）、400.17（25.5%）、401.17（4.2%），其结构式如式III所示：
2、吗啡-6-戊二酸单酯与载体蛋白连接
将吗啡-6-戊二酸单酯与钥孔戚血蓝蛋白（KLH）连接，得到吗啡-TFCS-KLH抗原，其制备流程图如图2所示，具体操作如下：
（1）取10mg钥孔戚血蓝蛋白（KLH）溶于50mL0.01M磷酸盐缓冲液中，调节pH到7.2（不能超过7.5），得到I液。
其中，0.01M磷酸盐缓冲液的配方如下：8.0g NaCl、0.2g KCl、3.6g Na2HPO4·12H2O和0.24g KH2PO4，双蒸水定容到1000mL。
（2）将100mg N-(ε-三氟醚乙酰基己酰基氧)琥珀酰亚胺酯（TFCS）溶于2mL体积分数为20%的DMSO水溶液中，得到II液。
（3）将II液（2mL）迅速与I液（50mL）混合，在室温（20-25℃）下孵育过夜（12h），得到III液。
（4）小心地用1M的NaOH溶液调节III液的pH为8.1-8.5，在室温（20-25℃）下孵育3小时，以脱去TFCS上面的三氟乙酰保护基，得到载体蛋白-TFCS衍生物（式Ⅳ），得到IV液。
该步反应中，TFCS上的酯键在碱性条件下断裂，形成TFCS羧酸衍生物；羧酸中的羟基进而被KLH的游离氨基取代，从而实现通过酰胺键将KLH与TFCS衍生物连接。
（5）用pH7.2的磷酸盐缓冲液，于4℃下对IV液进行24小时彻底透析，除去DMSO及反应的副产物，得到纯化的含有KLH-TFCS衍生物的溶液。
其中，pH7.2的磷酸盐缓冲液的配方如下：8.0g NaCl、0.2g KCl、3.6g Na2HPO4·12H2O和0.24g KH2PO4，双蒸水定容到1000mL，pH值调至7.2。
（6）将100mg吗啡-6-戊二酸单酯、100mg1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐（EDC，式Ⅴ）和100mL水混合，用1M盐酸将pH调至5.5，在37℃搅拌 反应2小时，得到大约含135mg吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC活化物的溶液。该吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC活化物在水溶液中不稳定，制备好后需要立即与KLH-TFCS衍生物反应。
该步反应中，EDC作为伯胺，制备酰氨时作为羧基活化剂，将吗啡-6-戊二酸单酯的羧基活化形成活泼中间酯，即吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC活化物（EDC-M-6-G，式Ⅵ），此中间产物与胺相遇后可形成酰胺。
（其中R1：-CH2CH3；R2：-(CH2)3-NH+-(CH3)2Cl-）
（7）将步骤（5）所得KLH-TFCS衍生物与步骤（6）所得吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC活化物在100mL的pH7.5的磷酸盐缓冲液中混合，所述吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC活化物（EDC-M-6-G）与所述KLH-TFCS衍生物的质量比满足如下条件：所述吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC活化物（EDC-M-6-G）以吗啡-6-戊二酸单酯质量计，所述KLH-TFCS衍生物以KLH质量计，前者和后者的质量比为10:1。轻微搅拌下，室温（20-25℃）孵育过夜（12h），得到V液。
其中，pH7.5的磷酸盐缓冲液的配方如下：8.0g NaCl、0.2g KCl、3.6g Na2HPO4·12H2O和0.24g KH2PO4，双蒸水定容到1000mL，pH值调至7.5。
该步反应中，EDC-M-6-G的酰亚胺基团与脱保护的KLH-TFCS游离的伯氨基结合，形成酰胺键，最终获得所述抗原吗啡-TFCS-KLH（式Ⅶ）。
（8）用pH7.4的磷酸盐缓冲液中，于4℃下对V液进行48小时彻底透析，再压力透析浓缩，冷冻干燥，得到吗啡-TFCS-KLH抗原，密封储藏。
其中，pH7.4的磷酸盐缓冲液的配方如下：8.0g NaCl、0.2g KCl、3.6g Na2HPO4·12H2O和0.24g KH2PO4，双蒸水定容到1000mL，pH值调至7.4。
吗啡-TFCS-KLH抗原的结果如式VII所示；所述抗原具体由式II所示基团与载体蛋白的游离氨基通过酰胺键连接而成；
实施例2、实施例1制备的吗啡-TFCS-KLH抗原的应用
一、主动免疫大鼠
雄性SD大鼠随机分两组（9-10周龄，220-240g），每组各6只，分别进行以下处理：
A、对照组：皮下注射佐剂+KLH；
B、实验组：皮下注射佐剂+吗啡-TFCS-KLH抗原。
KLH或吗啡-TFCS-KLH抗原给药量为100μg/只，注射体积为0.5ml/只，药物平均分为四点于背部皮下注射。
其后每间隔14天进行一次疫苗注射，共注射4次，每次注射完10天后，舌下静脉取血，离心，得血清，-80℃存放，用于进行抗体滴度测定。第一次注射采用弗氏完全佐剂（将以KLH计浓度为400μg/mL的KLH或吗啡-TFCS-KLH抗原（溶剂为PBS）与等体积的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，注射体积为0.5ml乳化剂/只），随后三次注射采用弗氏不完全佐剂（将以KLH计浓度为400μg/mL的KLH或吗啡-TFCS-KLH抗原（溶剂为PBS）与等体积的弗氏不完全佐剂混合制成乳化剂，注射体积为0.5ml乳化剂/只）。
具体的免疫及采血流程如图3中A所示。在第4次疫苗注射后（连续取血7次），每隔10天舌下静脉取血一次，离心，得血清，-80℃存放，用于进行抗体持续时间测 定。
二、间接ELISA测定主动免疫大鼠所致抗体浓度
采用酶联免疫吸附测定（ELISA）对步骤一进行主动免疫的SD大鼠所产生的抗体滴度进行检测。具体操作如下：
采用吗啡-BSA抗原（制备方法参见如下专利：申请号为201010512377.7，发明名称为一种抗原及其制备方法与应用，授权公告号为CN102002049B）（2μg/100μl）包被ELISA酶标板，-4℃孵育过夜。采用含有0.5%（体积分数）Tween20的PBS溶液洗涤酶标板3次，拍干，加入100μl含有1%（1g/100mL）BSA的PBS溶液，37℃封闭2h。将酶标板拍干，加入步骤一四次免疫期间（每次免疫后第10天）所得的血清，血清稀释倍数为1：100，1：1,000，1：10,000，1：100,000，1：200,000。以PBS代替血清作为空白对照。每个稀释度设置3个复孔。37℃孵育1h。洗板，拍干，加入羊抗小鼠辣根过氧化酶（1：2000），37℃孵育1h。洗板，拍干，TMB试剂盒显色，以450nm单波长测定各孔OD值，以与对照孔（加入对照组大鼠相应稀释倍数的血清）OD值的比值（P/N）大于2.1为限，作为判断实验组大鼠血清中吗啡抗体滴度的临界点。实验重复3次。
结果显示，实验组随着四次主动免疫次数的增多，抗体滴度逐渐增加，第2次、3次和第4次免疫后，最大抗体滴度达到1：200,000。以上结果表明吗啡-TFCS-KLH抗原可刺激机体产生强烈的免疫应答。实验组的OD450的检测结果如图3中B所示，抗体滴度如表1所示。
表1实验组大鼠血清中抗体滴度测定结果（1）
| 第1次免疫后10天 | 第2次免疫后10天 | 第3次免疫后10天 | 第4次免疫后10天 |
| 1:10,000 | 1:200,000 | 1：200,000 | 1：200,000 |
三、间接ELISA测定主动免疫大鼠所致抗体持续时间
采用间接ELISA分析对步骤一进行主动免疫的SD大鼠所产生的抗体的持续时间。具体操作如下：
采用吗啡-BSA抗原（制备方法参见如下专利：申请号为201010512377.7，发明名称为一种抗原及其制备方法与应用，授权公告号为CN102002049B）（2μg/100μl）包被ELISA酶标板，-4℃孵育过夜。采用含有0.5%（体积分数）Tween20的PBS溶液洗涤酶标板3次，拍干，加入100μl含有1%（1g/100mL）BSA的PBS溶液，37℃封闭2h。将酶标板拍干，加入步骤一第四次免疫结束后所得的血清，血清稀释倍数为1：100，1：1,000，1：10,000，1：100,000，1：200,000。以PBS代替血清作为空白对照。每个稀释度设置3个复孔。37℃孵育1h。洗板，拍干，加入羊抗小鼠辣根过氧化酶（1： 2000），37℃孵育1h。洗板，拍干，TMB试剂盒显色，以450nm单波长测定各孔OD值，以与对照孔（加入对照组大鼠相应稀释倍数的血清）OD值的比值（P/N）大于2.1为限，作为判断实验组大鼠血清中吗啡抗体滴度的临界点。实验重复3次。
结果显示：末免疫结束后，血清中抗体滴度逐渐随时间依赖性降低。但末次疫苗注射后第60天，抗体滴度仍然能达到1：100,000；抗体的最高滴度出现在末次疫苗注射后10天左右。实验组的OD450的检测结果如图4所示，抗体滴度如表2所示。
表2实验组大鼠血清中抗体滴度测定结果（2）
四、竞争性ELISA测定主动免疫大鼠所致抗体的特异性
采用竞争性ELISA方法评价步骤一进行主动免疫的SD大鼠所产生的抗吗啡抗体特异性。具体方法如下：
包被、封闭步骤与步骤二和三的间接ELISA相同，在加入大鼠血清之前，分别加入竞争物吗啡、海洛因、丁丙诺啡、纳络酮、和烯丙吗啡，随后采用与步骤二和三中所述间接ELISA相同的操作。其中所述大鼠血清为步骤一中第四次免疫后10天的大鼠血清，竞争物吗啡、海洛因、丁丙诺啡、纳络酮、和烯丙吗啡在体系中的浓度均为0.0001μM-1000μM，具体为：0.0001μM、0.001μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM，1000μM。实验过程中，同时设置未加竞争性物质的阳性对照孔。反应结束后，测定450nm单波长处的OD值，计算B/B0值（比吸光度）。其中，B表示加入竞争性物质的样品孔的吸光度值，B0表示未加竞争性物质的阳性对照孔的吸光度值。
结果如图5所示：随着竞争物浓度的增加，吗啡和海洛因组呈现比吸光度的降低，而其他组则没有表现出这一趋势。这说明吗啡-TFCS-KLH抗原主动免疫产生的抗体可以特异性识别吗啡和海洛因，但不识别与吗啡结构不相似的其他阿片类化合物，如丁丙诺啡、纳络酮、和烯丙吗啡。
五、吗啡-TFCS-KLH抗原主动免疫大鼠对海洛因诱导的复燃的作用
药物成瘾者戒断后的复吸是药物成瘾领域亟待解决的问题，而成瘾药物的暴露是导致复吸的一个重要因素。本发明的发明人采用经典的海洛因自身给药模型建立大鼠成瘾模型，并在戒断后，检测海洛因点燃所诱导的觅药行为的复燃现象，以确定吗啡-TFCS-KLH抗原在复吸防治中的作用。
自我给药模型建立及复燃检测方法如前人所述（Xu et al.J Neurochem.2009；Wang et al.J Neurosci.2010）：
（1）自我给药手术：大鼠经2%（2g/100mL）戊巴比妥钠（腹腔给药）麻醉，将静脉插管置于右侧颈静脉，插管尖端位于右心房开口处。静脉插管固定后经皮下穿过耳后置于颅骨上方，与静脉自我给药套管相连。静脉插管完成后将大鼠置于脑立体定位仪上（俯卧位），用耳棒在水平方向固定好大鼠，暴露颅骨，调整至前卤与后卤水平，然后用螺丝钉和混匀的水泥将自我给药套管固定于颅骨上,水泥凝固后手术完毕。将大鼠单笼饲养，术后大鼠体重恢复至手术前即可进行实验。并每天注射青霉素以防止静脉给药套管堵塞或发生感染。
（2）实验装置：大鼠自我给药训练箱地板上方9厘米有两个鼻触装置。动物触碰有效鼻触装置会引起静脉给药并伴随5秒的灯光－声音条件线索。电脑可同步记录动物触碰有效鼻触的次数，触碰无效鼻触的行为也会被记录。动物颅骨上固定的自我给药套管通过橡胶管与给药泵相连。软管外有金属弹簧保护，顶端与旋转轴承相连，以确保动物在自我给药训练箱中可正常活动。
（3）自我给药训练：大鼠进行10天的海洛因自我给药训练，每天3小时，每小时之间有5分钟不应期。第1，2天每次触碰有效鼻触给药量为0.1mg/kg体重，第3-10天每次触碰有效鼻触给药量为0.05mg/kg体重。训练在大鼠的夜间周期进行。训练采用FR1强化程序，每两次给药之间有40秒的不应期。每个训练期以笼灯开启为信号，动物触碰有效鼻触后笼灯关闭，不应期结束后笼灯再次开启。为防止动物给药过量发生死亡，每小时海洛因给药次数被限制在20次。在训练结束后，根据训练期间的给药次数对动物进行分组，每组动物给药次数均值相等。
（4）消退训练：消退训练过程中，笼灯关闭，动物触碰有效或无效鼻触均不引起海洛因给药，但是伴有与自我给药训练期间相同的条件相关线索（灯光－声音）。动物进行消退训练直至触碰有效鼻触的次数降低到基线值的20％以下（基线值为自我给药训练最后3天的均值），且维持至少2天。
（5）复燃测试：当动物的觅药行为消退至达到上述标准后，对动物进行复燃测试。测试前5分钟给予点燃剂量（0.5mg/kg体重）的海洛因皮下注射。除了触碰有效鼻触不引起海洛因给药外，测试时的条件与训练期间相同，触碰有效鼻触会引起与训练期相同的灯光－声音条件线索。测试过程中笼灯开启。测试时间为30分钟。由电脑同步记录测试期间动物触碰有效或无效鼻触的次数。
完成后第1天（末次免疫后第10天）、第4天（末次免疫后第14天）、第15天（末次免疫后第25天）分别进行海洛因点燃测试，即大鼠皮下注射海洛因0.5mg/kg体重，5分钟之后，进行自我给药复燃测试，测试条件与训练时保持一致。
实验结果如图6中B所示：消退训练期间，大鼠自我给药主动鼻触次数逐渐减少，最后3天达到消退标准。末次免疫后的第10天海洛因点燃测试显示，吗啡-TFCS-KLH抗原组（实验组）海洛因点燃并不能恢复大鼠的鼻触反应（KLH：26.33±1.68；吗啡-TFCS-KLH抗原：11.00±2.82；F1,21=62.323，p<0.01）；末次免疫后的第14天海洛因点燃测试显示，吗啡-TFCS-KLH抗原组（实验组）海洛因点燃并不能恢复大鼠的鼻触反应（KLH：26.91±1.38；吗啡-TFCS-KLH抗原：9.09±0.68；F1,21=126.048，p<0.01）；甚至在末次免疫后的第25天，吗啡-TFCS-KLH抗原组（实验组）仍然可以抑制海洛因点燃测试所导致的大鼠鼻触反应的恢复（KLH：24.91±1.12；吗啡-TFCS-KLH抗原：14.90±2.19；F1,21=17.447，p<0.01）。这些结果表明，在体内抗体足够的情况下，吗啡-TFCS-KLH抗原能够减弱大鼠海洛因的觅药行为。
对比例1、吗啡-KLH抗原效果检测
在本对比例中，本发明的发明人对吗啡-KLH抗原（即申请号为201010512377.7，发明名称为一种抗原及其制备方法与应用，授权公告号为CN102002049B的专利申请中公开的morph-KLH）的效果进行了测定。
一、主动免疫大鼠
同实施例2步骤一，仅将吗啡-TFCS-KLH抗原替换为吗啡-KLH抗原。
即处理如下：
A、对照组：皮下注射佐剂+KLH；
B、实验组：皮下注射佐剂+吗啡-KLH抗原。
二、间接ELISA测定主动免疫大鼠所致抗体浓度
采用酶联免疫吸附测定（ELISA）对步骤一进行主动免疫的SD大鼠所产生的抗体滴度进行检测。具体操作同实施例2步骤二。
结果显示，实验组随着四次主动免疫次数的增多，抗体滴度逐渐增加，第3次和第4次免疫后，最大抗体滴度达到1：100,000，表明吗啡-KLH抗原可刺激机体产生强烈的免疫应答（但其效果不及吗啡-TFCS-KLH抗原，相关数据参见实施例2步骤二中表2）。抗体滴度如表3所示。
表3实验组大鼠血清中抗体滴度测定结果
| 第1次免疫后10天 | 第2次免疫后10天 | 第3次免疫后10天 | 第4次免疫后10天 |
| 1:1,000 | 1:10,000 | 1:100,000 | 1:100,000 |
三、间接ELISA测定主动免疫大鼠所致抗体持续时间
采用间接ELISA分析对步骤一进行主动免疫的SD大鼠所产生的抗体的持续时间。具体操作同实施例2步骤三。
结果显示：末免疫结束后，血清中抗体滴度逐渐随时间依赖性降低。但末次疫苗注射后第60天，抗体滴度仍然能达到1：10,000（但其效果不及吗啡-TFCS-KLH抗原，相关数据参见实施例2步骤二中表2）。抗体滴度如表4所示。
表4实验组大鼠血清中抗体滴度测定结果
综合本发明实施例和对比例的实验结果，可见，本发明所保护的吗啡-TFCS-KLH抗原比已授权的吗啡-KLH抗原具有更好的效果。
Claims (7)
1.如式I所示的抗原；所述抗原由式II所示基团与载体蛋白的游离氨基通过酰胺键连接而成；
2.根据权利要求1所述的抗原，其特征在于：所述载体蛋白为钥孔戚血蓝蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、丙种球蛋白、甲状腺球蛋白、血纤维蛋白原、卵清蛋白、绵羊红细胞、鞭毛蛋白或破伤风毒素。
3.权利要求1或2所述抗原的制备方法，包括如下步骤：
(1)将所述载体蛋白溶于0.01M磷酸盐缓冲液中，调节pH到7.2-7.5，得到I液；
(2)将N-(ε-三氟醚乙酰基己酰基氧)琥珀酰亚胺酯溶于体积分数为10-20％的DMSO水溶液，得到II液；
(3)将所述II液与所述I液混合，于20-25℃孵育12-24h，得到III液；
其中，所述II液中所述N-(ε-三氟醚乙酰基己酰基氧)琥珀酰亚胺酯的质量与所述I液中所述载体蛋白的质量比为10:1；
(4)将所述III液的pH调节到为8.1-8.5，于20-25℃孵育3-5小时，得到IV液；
(5)用pH 7.2-7.5的磷酸盐缓冲液，于4℃对所述IV液透析18-24小时，得到载体蛋白-TFCS衍生物；
(6)将吗啡-6-戊二酸单酯、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和水，按照100mg：100mg：100mL的比例混合，调节pH为5.5，于37℃反应2小时，得到吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC活化物；
(7)将步骤(5)所得载体蛋白-TFCS衍生物、步骤(6)所得吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC活化物和pH7.5的磷酸盐缓冲液混合，于20-25℃孵育12-24h，得到V液；
其中，所述吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC活化物与所述载体蛋白-TFCS衍生物的质量比满足如下条件：所述吗啡-6-戊二酸单酯偶联EDC活化物以吗啡-6-戊二酸单酯质量计，所述载体蛋白-TFCS衍生物以所述载体蛋白质量计，前者和后者的质量比为5:1-10:1；
(8)用pH7.4的磷酸盐缓冲液，于4℃对所述V液透析2-3天，得到所述抗原。
4.权利要求1或2所述抗原在制备具有预防和/或治疗阿片类药物成瘾功能的产品中的应用；
所述阿片类药物为吗啡和/或海洛因。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述产品为疫苗。
6.用于预防和/或治疗阿片类药物成瘾的疫苗，其活性成分为权利要求1或2所述抗原；
所述阿片类药物为吗啡和/或海洛因。
7.权利要求1或2所述抗原在制备吗啡和/或海洛因抗体中的应用。
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