KR20220139888A - TGFβ 억제제 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

지속적인 억제 효과를 갖는 TGFβ1 활성화의 신규 억제제가 본원에 개시된다. 다양한 질환 상태 및 환자 집단에 적합한 TGFβ 억제제의 선택에 관한 방법이 또한 제공된다.

Description

TGFβ 억제제 및 그의 용도

관련 출원

본 국제 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 하기 출원: 2020년 1월 11일에 출원된 미국 가출원 번호 62/959,925, 2020년 6월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 63/033,904, 및 2020년 6월 12일에 출원된 미국 가출원 번호 63/038,413에 대한 우선권 및 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 명백하게 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 포맷으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 함유하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 2021년 1월 6일에 생성된 상기 ASCII 카피는 127036-03920_SL.txt로 명명되고, 209,944 바이트 크기이다.

형질전환 성장 인자 베타 1 (TGFβ1)은 각각 개별 유전자에 의해 코딩되는 2종의 다른 구조적으로 관련된 이소형, 즉 TGFβ2 및 TGFβ3과 함께, 성장 인자의 TGFβ 슈퍼패밀리의 구성원이다. TGFβ는 항상성 및 질환 상황 둘 다에서 세포 증식, 분화, 면역조정 (예를 들어, 적응 면역 반응), 및 다른 다양한 생물학적 과정을 조절하는 다면발현성 시토카인으로서 기능한다. 3종의 TGFβ 이소형은 동일한 세포-표면 수용체를 통해 신호를 전달하고, SMAD2/3 경로를 포함하는 유사한 정규 하류 신호 전달 사건을 촉발한다.

TGFβ는 다수의 질환 상태, 예컨대 섬유증, 암 및 면역 장애의 발병기전 및 진행에 연루되어 왔다. 많은 경우에, 이러한 상태는 세포외 매트릭스 (ECM)의 조절이상과 연관된다. 이들 및 다른 이유로, TGFβ는 섬유화 상태 뿐만 아니라 다양한 증식성 장애 예컨대 암의 치료를 위한 매력적인 치료 표적이었다. 그러나, 래트 및 개에서의 것을 포함한 전임상 연구로부터의 관찰은 생체내 TGFβ 신호전달을 길항하는 것과 연관된 심각한 독성을 밝혀냈고, 지금까지, 안전하면서 또한 효능있는 것으로 여겨지는 시장에서 이용가능한 TGFβ 치료제는 존재하지 않는다.

이전에, 본 출원인은 성장 인자 신호전달을 조정하기 위해 신규 작용 메카니즘으로 기능하는 모노클로날 항체의 부류를 기재하였다 (예를 들어, WO 2014/182676 참조). 이들 항체는 TGFβ1이 프로도메인 및 성장 인자로 구성된 잠재성 프로-단백질 복합체로서 발현되고, 잠재성 복합체로부터 성장 인자를 방출하는 활성화 단계가 필요하다는 사실을 이용하도록 설계되었다. 활성화 후 가용성 성장 인자 그 자체를 직접적으로 표적화하는 전통적인 접근법을 취하기보다는 (예컨대 중화 항체), 신규 부류의 억제 항체는 리간드-수용체 상호작용의 상류에서 활성화 단계를 선제적으로 차단하도록 불활성 프로-프로단백질 복합체 그 자체를 특이적으로 표적화한다. 이론에 얽매이지는 않지만, 이러한 고유한 작용 메카니즘은 이것이 공급원에서 작용한다는 점에서, 즉 활성화가 일어나기 전에 질환 미세환경 내에서 잠재성 프로TGFβ1 복합체를 표적화함으로써 공간적 및 시간적 이익 둘 다를 달성하는 데 이점을 제공할 수 있다. 실제로, 가용성 활성 종 (즉, 공급원으로부터 방출된 후의 성숙 성장 인자)에 대한 것과 대조적으로, 공급원에서 조직/세포-테더링된 복합체를 국부로 표적화하는 것의 이점이 최근의 연구에 의해 추가로 지지된다. 이시하라(Ishihara) 등 (Sci. Transl. Med. 11, eaau3259 (2019) "Targeted antibody and cytokine cancer immunotherapies through collagen affinity")은 전신 투여된 약물이 콜라겐-결합 모이어티와의 접합에 의해 이환 조직에 표적화되는 경우에, 이들이 비-표적화된 대응물과 비교하여 항종양 면역을 증진시키고 치료-관련 독성을 감소시킬 수 있었음을 보고하였다.

이에 따라, TGFβ1에 특이적으로 결합하고 그의 활성화 단계 (즉, 잠재성 복합체로부터 성숙 성장 인자의 방출)를 이소형-선택적 방식으로 억제하는 모노클로날 항체 (소위 "활성화 억제제")를 생성하였고; 이는 예를 들어 WO 2017/156500, WO 2018/129329, PCT/US2019/041373, 및 PCT/US2019/041390에 개시되어 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이들 이소형-특이적 억제제는 생체내 효능 및 안전성 둘 다를 입증하였다.

상기 기재된 이전 연구는 각각의 공지된 프로TGFβ1-제시 분자 복합체에 결합할 수 있는 항체의 유용성 및 시험관내 및 생체내 둘 다에서의 억제 활성을 입증하였지만, 본 출원의 발명자들은 증가된 친화도, 효력, 내구성 및 치료 효능을 갖는 TGFβ1 활성화의 개선된 억제제를 생성하는 것에 대해 제시한다.

유리한 특색을 갖는 TGFβ1 활성화의 이소형-선택적 억제제가 본원에 개시된다. 보다 구체적으로, TGFβ1 억제제는 느린 해리율 (즉, 오프-레이트, k_오프)을 나타내는 모노클로날 항체 (이뮤노글로불린 및 그의 항원-결합 단편 또는 부분 포함)를 포함한다. 따라서, 본 발명은 적어도 만성 및 진행성 질환, 예컨대 섬유증의 치료가 이러한 항체의 해리율에 반영될 수 있는 우수한 지속성을 갖는 억제제를 필요로 할 수 있다는 인식을 기초로 한다.

항체의 그의 항원에 대한 친화도는 전형적으로 평형 해리 상수, 또는 K_D로서 측정된다. 실험적으로 측정된 오프- 및 온-레이트의 비 (k_오프/k_온)를 사용하여 K_D 값을 계산할 수 있다. k_오프 값은 그의 결합된 항원으로부터 얼마나 빨리 해리되는지를 나타내는 항체 해리율을 나타내는 한편, k_온 값은 그의 항원에 얼마나 빨리 결합하는지를 제공하는 항체 회합률을 나타낸다. 후자는 전형적으로 농도-의존성이며, 전자는 농도-비의존성이다. K_D 값은 항체의 농도 (특정한 실험에 필요한 항체의 양)에 관한 것이고, 따라서 K_D 값이 낮을수록 (농도가 낮을수록) 항체의 친화도는 더 높다. 참조 항체와 관련하여, 보다 높은 친화도 항체는 보다 낮은 k_오프 레이트, 보다 높은 k_온 레이트, 또는 둘 다를 가질 수 있다.

k_오프 및 k_온 레이트 둘 다는 특정한 항체의 그의 항원에 대한 전체 친화도에 기여하고, 각각의 성분의 상대적인 중요성 또는 영향은 항체의 작용 메카니즘에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 성숙 성장 인자 (예를 들어, 잠재성 복합체로부터 유리된 가용성, 일시적 TGFβ1 리간드)에 결합하는 중화 항체는 생체내 리간드 결합에 대해 내인성 고친화도 수용체와 경쟁하여야 한다. 리간드-수용체 상호작용은 국부 사건이고 리간드가 수명이 짧기 때문에, 이러한 항체는 리간드가 조직에서 그의 세포 수용체를 발견하기 전에 - 그에 의해 TGFβ1 신호전달 경로가 활성화됨 - 가용성 성장 인자를 신속하게 표적화하고 봉쇄할 수 있어야 한다. 따라서, 리간드-표적화 중화 항체가 강력하기 위해서는, 표적 성장 인자에 신속하게 결합하는 능력, 즉 높은 회합률 (k_온)이 특히 중요할 수 있다.

대조적으로, 본 출원인은 잠재성 복합체로부터 성숙 성장 인자의 방출을 막음으로써 TGFβ1 신호전달을 억제하는 항체 ("활성화 억제제")는 항체가 표적 항원 (예를 들어, 프로TGFβ1 복합체)과 결속될 때 느린 해리율을 갖는 것으로부터 우선적으로 이익을 얻을 수 있는 것으로 추론하였다. 중화 항체와 달리, 이러한 항체는 세포 수용체와 직접적으로 경쟁하지 않고; 오히려, 이는 조직 환경 내에서 휴면 상태로 남아있는 불활성 전구체 형태 (예를 들어, 잠재성 프로TGFβ1 복합체)를 표적화하여 TGFβ1의 활성화를 선제적으로 막음으로써 신호전달의 상류에서 작용한다. 이러한 항체는 성숙 성장 인자가 잠재성 복합체로부터 유리되는 것을 막음으로써 그의 억제 활성을 발휘할 수 있다. 예를 들어, 이러한 항체는 활성 성장 인자를 불활성 (예를 들어, "잠재성") 상태로 유지시키기 위해 프로도메인 케이지 구조에 고정시키는 "클램프"와 같이 기능할 수 있다. 실제로, 에피토프 맵핑을 포함한 구조적 분석은 TGFβ1 활성화를 차단하는 이들 항체의 능력을 강조하는 분자 메카니즘에 대한 통찰을 제공하였다. 이와 관련하여, 프로도메인의 잠재성 라쏘 영역이 특히 유용한 표적일 수 있다.

표적 결속 시, 표적에 결합된 상태로 유지될 수 있는 (예를 들어, 잠재성 복합체로부터 매우 천천히 해리될 수 있는) 항체는 효과의 증진된 내구성 및/또는 결합력으로 인해 우수한 생체내 효력을 달성하는 데 유리할 것으로 예상된다. 이러한 인식에 기초하여, 본 개시내용의 출원인은 이전에 기재된 항체와 비교하여 특히 낮은 k_오프 값을 갖는 TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제를 확인하고자 하였다. 따라서, 본 발명에 따르면, 바람직한 항체는 빠른 회합률 (k_온)과 대조적으로, 주로 느린 해리율 (k_오프)에 기인하는 높은 친화도 (예를 들어, 나노몰-미만 내지 피코몰 범위의 K_D)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 잠재성 라쏘의 적어도 일부를 포함하는 에피토프에 결합한다.

따라서, 본 개시내용은 TGFβ1 활성화의 이소형-선택적 억제제를 제공하며, 여기서 억제제는 TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편이고; 여기서 모노클로날 항체는 표면 플라즈몬 공명 (SPR)-기반 기술에 의해 측정된 바와 같이 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 10.0e-04 이하의 1가 해리율, 및 임의로 < 1.0 nM의 K_D 값으로 결합하고; 여기서 항체 또는 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR: GFTFADYA (서열식별번호(SEQ ID NO): 276)를 포함하는 H-CDR1; ISGSG(X₁)AT를 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 A 또는 K인 (서열식별번호: 277) H-CDR2; VSSG(X₁)WD(X₂)D를 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 H, D 또는 Q이고; 여기서 추가로 임의로 X₂는 F 또는 Y인 (서열식별번호: 278) H-CDR3; QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하는 L-CDR1; AAS(X₁)(X₂)(X₃)(X₄)를 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 N, G 또는 V이고; 여기서 추가로 임의로 X₂는 L, N 또는 E이고; 여기서 추가로 임의로 X₃은 Q 또는 E이고; 여기서 추가로 임의로 X₄는 S 또는 T인 (서열식별번호: 280) L-CDR2; 및 QQTY(X₁)VPLT를 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 T 또는 G인 (서열식별번호: 281) L-CDR3을 포함한다.

바람직한 실시양태에서, 항체는 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하는 H-CDR1; ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하는 H-CDR2; VSSG(X₁₎WD(X₂₎D를 포함하며, 여기서 임의로 X₁ = H 또는 Q이고, 추가로 임의로 X₂ = Y 또는 F인 (서열식별번호: 283) H-CDR3; QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하는 L-CDR1; AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함하는 L-CDR2; 및 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함하는 L-CDR3을 포함한다.

특히 바람직한 실시양태에서, 항체는 Ab42, Ab46 또는 Ab50의 6개의 CDR 서열을 포함한다.

본 발명은 본 개시내용에 따른 항체 또는 그의 단편 중 적어도 1종, 및 부형제를 포함하는 조성물, 예컨대 인간 환자에게 투여하기에 적합한 제약 조성물 (예를 들어, 제제, 의약)을 포함한다. 따라서, 본 개시내용에 따른 항체 또는 그의 단편은 이러한 의약의 제조에 사용될 수 있다.

본 발명은 추가로 이러한 항체의 치료 용도를 제공한다. 따라서, 본 개시내용의 TGFβ1-선택적 억제제 (예를 들어, 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편)는 대상체에서 TGFβ1-관련 적응증의 치료에 사용될 수 있다. TGFβ1-선택적 억제제는, 예를 들어 섬유화 장애 (예컨대 기관 섬유증 및 만성 염증을 수반하는 섬유증), 증식성 장애 (예컨대 암, 예를 들어, 고형 종양 및 골수섬유증), 내피-중간엽 이행 (EndMT)을 수반하는 질환, 상피-중간엽 이행 (EMT)을 수반하는 질환, 프로테아제를 수반하는 질환, 본원에 기재된 특정 마커의 이상 유전자 발현을 갖는 질환을 포함한, 세포외 매트릭스 (ECM)의 조절이상을 수반하는 이러한 질환 또는 장애를 치료하는데 특히 유리할 수 있다. TGFβ1-선택적 억제제는 조합 요법 (예를 들어, 부가적 요법)으로서 또 다른 요법과 함께 사용될 수 있다. 대상체에서 TGFβ1-선택적 억제제를 단독요법 또는 조합 요법으로서 투여하는 것을 포함하는, 이러한 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본 발명에 포괄된다.

본 발명은 TGFβ1 억제 요법에 반응하거나 또는 그로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 대상체 또는 환자의 선택을 포함한다. 관련 진단 방법, 뿐만 아니라 TGFβ1 억제 요법에 대한 치료 반응을 모니터링하거나 결정하는 방법이 본원에 포괄된다.

치료 용도에 적합한 TGFβ1-선택적 억제제를 확인 또는 선택하는 과정 및 방법이 본 발명에 포괄된다. 바람직한 실시양태에서, 선택은 i) 각각의 인간 LTBP1/3-프로TGFβ1 복합체에 대해 나노몰-미만의 친화도 (예를 들어, K_D < 1 nM), 및 ii) 적합한 시험관내 결합/동역학 검정에 의해, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 (SPR), 예를 들어 비아코어(BIACORE)®-기반 시스템에 의해 측정된 바와 같이 낮은 해리율 (k_오프), 예를 들어 ≤ 5.00E-4를 특징으로 하는 특히 유리한 동역학 기준을 갖는 1종 이상의 항체 또는 항원-결합 단편을 포함한다. 선택된 항체 또는 복수의 항체는 적합한 전임상 모델을 사용하는 효능 연구 및 독성학/안전성 연구를 포함한 전임상 연구에서 평가된다. 효능 연구에서 결정된 항체 또는 항체들의 유효량은 독성학/안전성 연구에서 결정된 바람직하지 않은 독성을 발생시키는 수준 미만이다. 바람직하게는, 적어도 3-배, 6-배, 보다 바람직하게는 10-배의 치료 범위를 갖는 항체 또는 항체들이 선택된다. 본 개시내용에 따른 항체의 유효량은 매주 투여되는 경우에 약 0.1 mg/kg 내지 약 30 mg/kg일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체의 최대 허용 용량 (MTD)은 적어도 4주 동안 매주 투여되는 경우에 >100 mg/kg이다.

본 개시내용은 다중 이소형의 억제가 항섬유화 효과에 필요하다는 일반적 믿음과 달리, TGFβ3의 공동 억제가 마우스에서 섬유화유발 효과를 생성한다는 놀라운 발견을 포함한다. 이러한 관찰은 비-선택적 TGFβ 억제제 (예컨대 범-억제제 및 TGFβ1/3 억제제)가 실제로 섬유증을 악화시킬 수 있다는 가능성을 제기한다. 유리하게는, 본원에 개시된 항체는 이것이 잠재성 TGFβ1 복합체를 특이적으로 표적화하고 낮은 해리율로 표적화한다는 점에서 이소형-선택적이다. 따라서, 본 발명은 섬유화 상태 (예를 들어, ECM 조절이상을 수반하는 질환, 예컨대 심혈관 질환)를 갖는 환자를 위한 특정한 TGFβ 억제제를 선택하는 경우에, 이소형 선택성은 ECM 조절이상을 악화시킬 위험을 피하기 위해 주의깊게 고려되어야 한다는 인식을 포함한다. 따라서, 본 개시내용은 섬유화 상태를 갖는 대상체를 치료하기 위해 TGFβ3을 억제하지 않는 TGFβ 억제제를 선택하는 것을 포함하는 치료 방법을 포함하며, 여기서 임의로 대상체는 기관 섬유증 또는 암을 갖고, 여기서 추가로 임의로 암은 골수섬유증이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 심혈관 질환을 갖거나 또는 심혈관 질환이 발생할 위험이 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ2 및 TGFβ3을 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-선택적이다. 일부 실시양태에서, 기관 섬유증은 간 섬유증, 신장 섬유증 또는 폐 섬유증 (예를 들어, IPF)이다. 일부 실시양태에서, 간 섬유증은 NASH와 연관된다. 섬유증 또는 ECM 조절이상을 갖는 상태가 발생할 위험이 있는 환자는 대사 상태, 예컨대 당뇨병, 비만 및 NASH를 앓고 있는 환자를 포함할 수 있다.

도 1은 6종의 상이한 항원 복합체에 대한 Ab2의 회합 및 해리를 보여주는 대표적인 옥테트(OCTET)® 결합 곡선을 보여준다. Ab2는 TGFβ1 소형 잠재성 복합체 (SLC)에 이소형-선택적 방식으로 특이적으로 결합하지만, 성숙 성장 인자에는 그렇지 않다.
도 2는 Ab46 및 참조 항체의 회합 및 해리를 보여주는 대표적인 비아코어 결합 곡선을 보여준다. 결합 동역학의 요약이 제공된다.
도 3은 제시된 LLC에 대한 5종의 항체 (hIgG4)의 ELISA에 의한 용량-의존성 결합을 보여주는 4개의 그래프를 제공한다.
도 4는 LLC에 대한 5종의 항체 (hIgG4)의 ELISA에 의한 용량-의존성 결합을 보여주는 4개의 그래프를 제공한다.
도 5a는 UUO 마우스에서 콜라겐 유전자 (Col1a1 및 Col3a1)의 발현에 대한 Ab2 또는 Ab3의 효과를 보여주는 그래프이다. 마우스를 3, 10, 또는 30 mg/kg/wk의 Ab3 또는 3 또는 10 mg/kg/주의 Ab2로 처리하였다. IgG 단독을 대조군으로서 사용하였다.
도 5b는 UUO 마우스에서 Fn1 및 Loxl2 유전자의 발현에 대한 Ab3 또는 Ab2의 효과를 보여주는 그래프이다. 마우스를 3, 10, 또는 30 mg/kg/wk의 Ab3 또는 3 또는 10 mg/kg/주의 Ab2로 처리하였다. IgG 단독을 대조군으로서 사용하였다.
도 6은 UUO 모델에서 처리 후 유전자 발현에서의 변화 (vs. UUO + IgG)의 통계적 유의성을 요약한다.
도 7a 및 도 7b는 항체 Ab2 및 Ab3의 존재 및 부재 하에 처리된 알포트 증후군의 유전 모델로부터의 신장에서의 인산화된 SMAD2/3 vs. 총 (인산화 및 비인산화된) SMAD2/3의 상대비를 보여주는 그래프이다. 도 7c는 알포트 증후군의 유전 모델로부터의 신장에서의 유전자 발현에 대한 Ab3 및 Ab2의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8a는 6, 8, 10, 및 12주에 CDHFD 마우스 모델에서의 Ab2의 혈청 노출을 보여주는 그래프이다.
도 8b는 CDHFD-처리된 마우스로부터의 간 조직에서의 SMAD2/3 인산화에 대한 Ab2의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8c는 감소된 인산화 SMAD2/3 및 Ab2 노출 사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다.
도 8d는 CDHFD-처리된 마우스로부터의 간 조직에서의 SMAD2/3 인산화에 대한 Ab3 및 Ab2의 효과의 비교를 보여주는 그래프이다.
도 8e는 히드록시프롤린 수준에 의해 측정된 바와 같은 간 섬유증에 대한 Ab3 및 Ab2의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8f는 CDHFD-처리된 마우스에서의 IHC에 의한 α-Col1에 대한 Ab2의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 8g는 Ab2 노출 수준과 감소된 α-Col1 수준 사이의 상관관계를 보여주는 그래프이다.
도 9는 간 섬유증의 CCL4 마우스 모델에서 피크로시리우스 레드 염색 (PRS)에 대한 Ab3 및 Ab2의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 10a는 Ab3 Fab-LTBP3:프로TGFβ1 복합체에 대한 HDX-MS 열지도를 제공한다. 도 10a는 서열식별번호: 25를 개시한다.
도 10b는 프로TGFβ1의 표면 및 리본 구조 상의 Ab3에 의한 보호 영역을 보여준다. 도 10b는 출현 순서로 각각 서열식별번호: 258-260 및 304-309를 개시한다.
도 10c는 Ab2 Fab-프로TGFβ1 C4S 복합체에 대한 HDX-MS 열지도를 제공한다. 도 10c는 서열식별번호: 25를 개시한다.
도 10d는 프로TGFβ1의 표면 및 리본 구조 상의 Ab2에 의한 보호 영역을 보여준다. 영역 1은 프로TGFβ1의 프로도메인 내의 소위 "잠재성 라쏘"와 중첩되는 반면에, 영역 3은 성장 인자 도메인 내에 있다. 3개의 이소형 사이의 서열 정렬이 또한 제공된다. 도 10d는 출현 순서로 각각 서열식별번호: 261, 259, 262, 310, 305, 311-312, 308, 및 313을 개시한다.
도 11은 프로TGFβ1에 결합된 Ab2 Fab의 결정 구조를 제공하고, 프로TGFβ1 및 Ab2 상의 접촉 잔기를 보여준다. 도 11은 출현 순서로 각각 서열식별번호: 314-316을 개시한다.
도 12a는 범-TGFβ 항체로부터의 1-주 래트 독성학 연구로부터의 현미경적 심장 소견을 도시한다.
도 12b는 ALK5 억제제 또는 범-TGFβ 항체와 비교하여 Ab3으로부터의 4-주 래트 독성학 연구로부터의 현미경적 심장 소견을 도시한다.
도 12c 및 12d는 ALK5 억제제 또는 범-TGFβ 항체와 비교하여 Ab3 및 Ab2로부터의 4-주 래트 독성학 연구로부터의 현미경적 심장, 골, 및 폐 소견을 도시한다.
도 13a-13d는 TGFβ 이소형의 상대 발현을 제공한다.
도 13a는 TGFβ 이소형 발현 vs. 정상 비교자를 보여준다 (암 유형별).
도 13b는 인간 암 유형별 TGFβ 이소형 발현의 빈도를 보여준다.
도 13c는 암 유형별 개별 종양 샘플에서의 TGFβ 이소형 발현을 보여준다.
도 13d는 마우스 동계 암 세포 모델 세포주에서의 TGFβ 이소형 발현을 보여준다.
도 14는 MBT-2 종양 모델에서 항-PD-1과 조합하여 Ab3을 30 mg/kg 또는 10 mg/kg 또는 Ab2를 3 mg/kg 또는 10 mg/kg으로 투여한 후 시간 (일) 경과에 따라 측정한 종양 성장에서의 변화 (종양 부피 mm³)를 보여주는 그래프 세트를 제공한다 (P < 0.05, 만-휘트니 U 검정). 항-PD-1 단독을 대조군으로서 사용하였다.
도 15는 MBT-2 종양 모델에서 항-PD-1과 조합하여 Ab3을 30 mg/kg 또는 10 mg/kg 또는 Ab2를 3 mg/kg 또는 10 mg/kg으로 투여한 마우스에서의 제15일의 중앙 종양 부피 (mm³)를 보여주는 그래프이다 (P < 0.05, 만-휘트니 U 검정).
도 16은 시간의 함수로서 S91 중앙 종양 부피를 보여주는 그래프를 제공한다. 조합 부문은 각각 항-PD-1 처리와 조합된 2종의 용량 수준의 2종의 상이한 이소형-선택적, TGFβ1 억제제 (Ab3 및 Ab2)를 나타낸다.
도 17a 및 17b는 CD8+ 세포 마커로 염색된 S91 종양 모델의 대표적인 면역조직화학 절편을 제공한다. 도 17a는 항-PD-1 단독으로 처리된 동물로부터의 종양 절편이다. 도 17b는 항-PD-1 및 대표적인 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제 둘 다로 처리된 동물로부터의 종양 절편이다.
도 18a 및 18b는 대식세포 마커로 염색된 S91 종양의 대표적인 면역조직화학 절편을 제공한다. 도 18a는 항-PD-1 단독으로 처리된 동물로부터의 종양 절편이다. 도 18b는 항-PD-1 및 대표적인 콘텍스트-비의존성 TGFβ1 억제제 둘 다로 처리된 동물로부터의 종양 절편이다.
도 19는 상이한 pH에서의 TGFβ1 C4S에 대한 Ab2의 회합 및 해리를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 20은 Ab2 또는 대조군으로 처리된 CDHFD 마우스의 간 절편에서의 피크로시리우스 레드 면적 (%)을 보여주는 2개의 그래프를 제공한다.
도 21은 Ab2 또는 대조군으로 처리된 CDHFD 마우스로부터의 3개의 대표적인 PSR-염색 영상을 제공한다.
도 22는 Ab2 또는 대조군으로 처리된 CDHFD 마우스의 간에서의 히드록시프롤린 함량 (μg/mg 조직)을 보여주는 2개의 그래프를 제공한다.
도 23은 Ab2 또는 대조군으로 처리된 CDHFD 마우스의 간 절편의 유형 1 콜라겐-양성 면적을 보여주는 2개의 그래프를 제공한다.
도 24는 아데닌-유도된 래트 신장 섬유증 모델의 신장 절편에서의 피크로시리우스 레드 면적 (%)을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 25는 대조군, Ab2, TGFβ3 억제제, 또는 둘 다로 처리된 CDHFD 마우스로부터의 5개의 대표적인 PSR-염색된 영상을 제공하며 (좌측); 대조군과 비교하여 Ab2, TGFβ3 억제제, 또는 둘 다로 처리된 CDHFD 마우스의 간 절편에서의 피크로시리우스 레드 면적 (%)을 보여주는 그래프가 또한 제공된다 (우측).
도 26은 2개의 형광 표지로 가시화된 마우스 간 세포의 면역세포화학 영상을 제공하며: 녹색은 TGFβ1을 도시하고, 적색은 TGFβ3을 도시한다.
도 27은 리포터 세포에 의한 세포-기반 효력 검정 데이터를 보여주는 그래프를 제공한다. TGFβ 활성은 Ab2 또는 Ab46의 농도를 증가시키는 것에 의해 억제된다.
도 28은 CDHFD 마우스 간의 정중엽에서의 인산화된 것 vs. 총 SMAD2/3의 비를 보여주는 그래프를 제공한다. 정중엽에서 Ab46의 시험된 모든 용량에서 pSMAD2/3의 유의한 감소가 관찰되었다 (p < 0.05 (t 검정)).
도 29는 콜린-결핍 고지방 식이 (CDHFD) 10주 후 마우스의 간에서의 퍼센트 (%) 양성 포스포-SMAD2 (pSMAD2) 핵을 보여주는 그래프를 제공한다. 30 mg/kg 용량의 Ab46으로 처리된 마우스에서 % 양성 pSMAD2 핵의 유의한 감소가 관찰되었다.
도 30은 CDHF 식이 12주 후 래트의 간 (좌측엽)에서의 퍼센트 (%) 양성 포스포-SMAD2 (pSMAD2) 핵을 보여주는 그래프를 제공한다. 인간 IgG (HuNeg; 음성 대조군) 또는 Ab46을 CDHFD 12주 후 제1일 및 제3일에 투여하였다. ALK5 억제제 (ALK5i; 양성 대조군)를 래트의 대조군에게 래트를 수거하기 2시간 전에 제공하였다. 모든 용량의 Ab46 (3 mg/kg, 10 mg/kg, 및 30 mg/kg)으로의 처리는 양성 대조군 (ALK5i)으로의 처리와 같이 SMAD2 인산화의 억제를 발생시켰다.
도 31은 CDHF 식이 12주 후 래트의 간에서의 퍼센트 (%) 양성 포스포-SMAD2 (pSMAD2) 핵을 보여주는 그래프를 제공한다. 인간 IgG (HuNeg; 음성 대조군) 또는 Ab46을 0.3mg/kg, 1mg/kg, 3mg/kg, 10mg/kg, 및 30mg/kg의 용량으로 CDHFD 12주 후 제1일에 투여하였다. ALK5 억제제 (ALK5i; 양성 대조군)를 래트의 대조군에게 래트를 수거하기 2시간 전에 제공하였다. Ab46 10/mg/kg 및 30 mg/kg의 용량으로의 처리는 양성 대조군 (ALK5i)으로의 처리에서와 같이 SMAD2 인산화를 완전히 억제하는 것으로 보였다.

정의

본 개시내용이 보다 용이하게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 이들 정의는 본 개시내용의 나머지에 비추어 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 판독되어야 한다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 추가의 정의는 상세한 설명 전반에 걸쳐 제시된다.

진행성 암, 진행성 악성종양: 본원에 사용된 용어 "진행성 암" 또는 "진행성 악성종양"은 관련 기술분야에서 이해되는 의미를 가지며, 예를 들어 암을 갖는 대상체/환자를 진단 또는 치료하는 것과 관련하여 종양학자에 의해 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 고형 종양을 갖는 진행성 악성종양은 국부 진행성 또는 전이성일 수 있다. 용어 "국부 진행성 암"은 그것이 시작된 기관의 외부에서 성장하였지만 신체의 원위 부분으로 아직 확산되지 않은 암 (예를 들어, 종양)을 기재하는데 사용된다. 따라서, 상기 용어는 그것이 시작된 곳으로부터 근처 조직 또는 림프절로 확산된 암을 포함한다. 대조적으로, "전이성 암"은 그것이 시작된 신체의 부분 (원발성 부위)으로부터 신체의 다른 부분 (예를 들어, 원위 부분)으로 확산된 암이다.

친화도: 친화도는 분자 (예컨대 항체)의 그의 리간드 (예컨대 항원)에 대한 결합의 강도이다. 이는 전형적으로 평형 해리 상수 (KD)에 의해 측정되고 보고된다. 항체-항원 상호작용과 관련하여, KD는 항체가 그의 항원에 얼마나 빨리 결합하는지 항체의 항체 회합률 ("온-레이트" 또는 K온) 대비 항체가 그의 항원으로부터 얼마나 빨리 해리되는지 항체 해리율 ("오프-레이트" 또는 K오프 또는 Kdis)의 비이다. 예를 들어, ≤ 5 nM의 친화도를 갖는 항체는 적합한 시험관내 결합 검정에 의해 결정된 5 nM 이하의 KD 값 (즉, 5 nM 이상의 친화도)을 갖는다. 적합한 시험관내 검정, 예컨대 생물층 간섭측정법 (BLI) 및 용액 평형 적정 (예를 들어, MSD-SET)은 항체의 그의 항원에 대한 KD 값을 측정하는데 사용될 수 있다.

항체: 용어 "항체"는 본원의 다른 곳에 추가로 기재된 바와 같은 임의의 자연-발생, 재조합, 변형된 또는 조작된 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린-유사 구조 또는 항원-결합 단편 또는 그의 부분, 또는 그의 유도체를 포괄한다. 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "항원"은 항원-결합 단편 및 그의 기능적 변이체를 포괄할 것이다. 따라서, 용어는 표적 항원에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 지칭하고, 예를 들어, 키메라, 인간화, 완전 인간 및 이중특이적 항체를 포함한다. 무손상 항체는 일반적으로 적어도 2개의 전장 중쇄 및 2개의 전장 경쇄를 포함할 것이지만, 일부 경우에 단지 중쇄만을 포함할 수 있는 낙타류에서 자연 발생하는 항체와 같이 보다 적은 쇄를 포함할 수 있다. 항체는 단일 공급원으로부터만 유래될 수 있거나 또는 "키메라"일 수 있고, 즉 항체의 상이한 부분들이 2종의 상이한 항체로부터 유래될 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 하이브리도마에서, 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 무손상 항체의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다. 본원에 사용된 용어 항체는 각각 모노클로날 항체, 이중특이적 항체, 미니바디, 도메인 항체, 합성 항체 (때때로 본원에서 "항체 모방체"로 지칭됨), 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체 융합체 (때때로 본원에서 "항체 접합체"로 지칭됨)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 용어는 또한 펩티바디를 포괄한다.

항원: 용어 "항원"은 항체 또는 결합-단편이 특이적으로 결합하는 결합 영역(들) 내에 항원 결정기를 포함하는 임의의 분자를 광범위하게 포함한다. 항원은 단일-단위 분자 (예컨대 단백질 단량체 또는 단편) 또는 다중 성분으로 구성된 복합체일 수 있다. 항원은 선택적 결합제, 예컨대 항원-결합 단백질 (예를 들어, 항체 포함)에 의해 결합될 수 있는 에피토프, 예를 들어 분자 또는 분자의 부분, 또는 분자 또는 분자의 부분의 복합체를 제공한다. 따라서, 선택적 결합제는 복합체 내의 2개 이상의 성분에 의해 형성되는 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 그 항원에 결합할 수 있는 항체를 생산하기 위해 동물에서 사용될 수 있다. 항원은 상이한 항원-결합 단백질, 예를 들어, 항체와 상호작용할 수 있는 1개 이상의 에피토프를 보유할 수 있다. 본 개시내용과 관련하여, 적합한 항원은 제시 분자와 회합된 프로TGF 이량체를 함유하는 복합체 (예를 들어, 회합된 다중 성분으로 구성된 다량체 복합체)이다. 프로TGF 이량체의 각각의 단량체는 푸린 절단 서열에 의해 분리된 프로도메인 및 성장 인자 도메인을 포함한다. 2개의 이러한 단량체는 프로TGF 이량체 복합체를 형성한다. 이는 다시 디술피드 결합을 통해 제시 분자와 공유 회합되며, 이는 각각의 프로TGF 단량체의 N-말단 근처에 존재하는 시스테인 잔기를 수반한다. 제시 분자에 결합된 프로TGF 이량체에 의해 형성된 이러한 다중-복합체는 일반적으로 대형 잠재성 복합체로 지칭된다. 항체 또는 항원-결합 단편을 스크리닝하는데 적합한 항원 복합체는, 예를 들어 대형 잠재성 복합체의 제시 분자 성분을 포함한다. 이러한 제시 분자 성분은 전장 제시 분자 또는 그의 단편(들)일 수 있다. 제시 분자의 최소 필요 부분은 전형적으로 프로TGFβ1 이량체와 공유 결합을 형성할 수 있는 2개의 시스테인 잔기를 포함한, 제시 분자 폴리펩티드의 적어도 50개의 아미노산, 그러나 보다 바람직하게는 적어도 100개의 아미노산을 함유한다.

항원-결합 부분/단편: 본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분" 또는 "항원-결합 단편"은 항원 (예를 들어, TGFβ1)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항원-결합 부분은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 항체의 항원-결합 부분은, 예를 들어 전체 항체 분자로부터 임의의 적합한 표준 기술, 예컨대 단백질분해적 소화 또는 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 코딩하는 DNA의 조작 및 발현을 수반하는 재조합 유전자 조작 기술을 사용하여 유래될 수 있다. 항원-결합 부분의 비제한적 예는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일-쇄 Fv (scFv) 분자 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al., (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조); (vi) dAb 단편 (예를 들어, 문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546] 참조); 및 (vii) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위 (예를 들어, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR))를 포함한다. 다른 형태의 단일 쇄 항체, 예컨대 디아바디가 또한 포괄된다. 용어 항체의 항원-결합 부분은 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커를 포함하는, 달리 "scFab"로 공지된 "단일 쇄 Fab 단편"을 포함하며, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 링커는 N-말단에서 C-말단 방향으로 a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL의 순서 중 하나를 갖고; 여기서 상기 링커는 적어도 30개 아미노산, 바람직하게는 32 내지 50개 아미노산의 폴리펩티드이다.

편향: 본 개시내용과 관련하여, 용어 "편향"은 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 항원의 하위세트를 향한 또는 그에 대한 편중되거나 고르지 않은 친화도를 지칭한다. 예를 들어, 항체는 하나의 항원 복합체에 대한 친화도 및 또 다른 항원 복합체에 대한 친화도가 등가이지 않을 때 (예를 들어, 친화도의 5-배 초과의 차이) 편향을 갖는 것으로 언급된다. 본 개시내용의 바람직한 항체는 EMC-회합된 복합체 (LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ)에 우선적으로 결합하여, 매트릭스-회합된 복합체 중 적어도 1종과 세포-회합된 복합체 (GARP-프로TGFβ1 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체) 중 적어도 1종 사이의 상대 친화도가 5-배 초과인, "매트릭스-편향" (또는 "LTBP-편향") 항체를 포함한다. 비교상, "비편향"을 특징으로 하는 항체는 이러한 항원 복합체에 대해 대략 등가인 친화도 (예를 들어, 친화도의 5-배 미만의 차이)를 갖는다.

결합 영역: 본원에 사용된 "결합 영역"은 항체 또는 그의 단편에 결합된 경우에 항체-항원 상호작용의 계면을 형성할 수 있는 항원 (예를 들어, 항원 복합체)의 부분이다. 항체 결합 시, 결합 영역은 표면 노출로부터 "보호"되며, 이는 적합한 기술, 예컨대 HDX-MS에 의해 검출될 수 있다. 항체-항원 상호작용은 다중 (예를 들어, 2개 이상의) 결합 영역을 통해 매개될 수 있다. 결합 영역은 항원 결정기 또는 에피토프를 포함할 수 있다.

암: 본원에 사용된 용어 "암"은 전형적으로 비조절된 세포 증식 및 악성종양을 특징으로 하는 다세포 진핵생물에서의 생리학적 상태를 지칭한다. 용어는 종양, 혈액암 (예를 들어, 백혈병, 림프종 및 골수종), 뿐만 아니라 골수섬유증을 포함한 고형 및 액상 악성종양을 광범위하게 포괄한다.

세포-회합된 TGFβ1/프로TGFβ1: 용어는 막-결합된 (예를 들어, 세포 표면에 테더링된) TGFβ1 또는 그의 신호전달 복합체 (예를 들어, 프로/잠재성 TGFβ1)를 지칭한다. 전형적으로, 이러한 세포는 면역 세포이다. GARP 또는 LRRC33에 의해 제시되는 TGFβ1은 세포-회합된 TGFβ1이다. GARP 및 LRRC33은 특정 세포의 세포 표면 상에서 발현되는 막횡단 제시 분자이다. GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1은 세포-회합된 (예를 들어, 면역 세포-회합된) TGFβ1 활성화/신호전달을 매개하는 "세포-회합된" (또는 "세포-표면") 프로TGFβ1 복합체로서 집합적으로 지칭될 수 있다. 용어는 또한 세포 막에 물리적으로 부착되지 않는 용액 중 (예를 들어, 시험관내 검정) 재조합, 정제된 GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체를 포함한다. GARP-프로TGFβ1 복합체 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대한 항체 (또는 그의 단편)의 평균 KD 값은 세포-회합된 (예를 들어, 면역 세포-회합된) 프로TGFβ1 복합체에 대한 친화도를 집합적으로 나타내기 위해 계산될 수 있다. 예를 들어, 표, 칼럼 (G)을 참조한다. 제시 분자 또는 제시 분자 복합체의 인간 대응물은 단백질 또는 단백질 복합체 앞에 "h", 예를 들어 "hGARP", "hGARP-프로TGFβ1", hLRRC33" 및 "hLRRC33-프로TGFβ1"로 나타내어질 수 있다.

체크포인트 억제제: 본 개시내용과 관련하여, 체크포인트 억제제는 면역 체크포인트 억제제를 지칭하고, 관련 기술분야에서 이해되는 바와 같은 의미를 보유한다. 전형적으로, 표적은 T 세포 또는 NK 세포 상의 수용체 분자, 또는 항원-제시 세포 (APC) 또는 종양 세포 상의 상응하는 세포 표면 리간드이다. 면역 체크포인트는 "자기"에 대한 염증성 면역이 발생하는 것을 방지하기 위해 면역 세포에서 활성화된다. 따라서, 체크포인트 억제를 통해 면역계의 균형을 변화시키는 것은 그것이 암의 검출 및 제거를 위해 완전히 활성화되도록 해야 한다. 면역 반응의 제어에 연루된 가장 잘 공지된 억제 수용체는 세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4), 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1), PD-L1, T-세포 이뮤노글로불린 도메인 및 뮤신 도메인-3 (TIM3), 림프구-활성화 유전자 3 (LAG3), 킬러 세포 이뮤노글로불린-유사 수용체 (KIR), 글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 (GITR) 및 T-세포 활성화의 V-도메인 이뮤노글로불린 (Ig)-함유 억제제 (VISTA)이다. 체크포인트 억제제의 비제한적 예는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, BMS-936559, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙, 이필리무맙, 트레멜리무맙, IMP-321, BMS-986016, 및 리릴루맙을 포함한다. 키트루다(Keytruda)®는 PD-1 억제제의 한 예이다. 면역 체크포인트 억제제 중 1종 이상을 사용하는 요법 또는 치료 요법은 체크포인트 차단 요법 (CBT)으로 지칭될 수 있다.

임상 이익: 본원에 사용된 용어 "임상 이익"은 요법의 효능 및 안전성 둘 다를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 바람직한 임상 이익을 달성하는 치유적 치료는 효과적이면서 또한 안전하다 (예를 들어, 내성성이 있거나 허용되는 독성 또는 유해 사건을 가짐).

조합 요법: "조합 요법"은 2종 이상의 치료제를 포함하는 임상 적응증에 대한 치료 요법을 지칭한다. 따라서, 용어는 제1 조성물 (예를 들어, 활성 성분)을 포함하는 제1 요법이 제2 조성물 (활성 성분)을 포함하는 제2 요법과 함께 환자에게 투여되어 동일하거나 중첩되는 질환 또는 임상 상태를 치료하도록 의도되는 치료 요법을 지칭한다. 제1 및 제2 조성물은 둘 다 동일한 세포 표적 또는 별개의 세포 표적에 대해 작용할 수 있다. 조합 요법과 관련하여 어구 "와 함께"는 조합 요법을 제공받는 대상체에서 제1 요법의 치료 효과가 제2 요법의 치료 효과와 시간적으로 및/또는 공간적으로 중첩된다는 것을 의미한다. 따라서, 조합 요법은 요법의 공동 투여를 위한 단일 제제로서, 또는 순차적 투여를 위한 개별 제제로서 제제화될 수 있다. 질환의 치료를 위한 제1 요법으로 치료된 대상체에게 동일한 질환을 치료하기 위한 제2 요법을 투여하는 경우에, 제2 요법은 "부가적 요법" 또는 "보조 요법"으로 지칭될 수 있다.

조합 또는 조합적 에피토프: 조합적 에피토프는 항원의 성분 또는 성분들의 비-인접 부분에 의해 형성된 부위 (즉, 항원 결정기)에서 조합적 항체에 의해 인식되고 결합되는 에피토프이며, 이는 3차원 구조상 함께 매우 근접하여 에피토프를 형성한다. 따라서, 본 발명의 항체는 프로/잠재성 TGFβ1 복합체의 2종 이상의 성분 (예를 들어, 부분 또는 절편)에 의해 형성된 에피토프에 결합할 수 있다. 조합 에피토프는 복합체의 제1 성분으로부터의 아미노산 잔기(들), 및 복합체의 제2 성분으로부터의 아미노산 잔기(들) 등을 포함할 수 있다. 각각의 성분은 항원 복합체의 단일 단백질 또는 2개 이상의 단백질의 것일 수 있다. 조합 에피토프는 항원 또는 항원 복합체의 2종 이상의 성분 (예를 들어, 부분 또는 절편, 예컨대 아미노산 잔기)으로부터의 구조적 기여에 의해 형성된다.

경쟁 또는 교차-경쟁: 용어 "경쟁하다"는 동일한 에피토프에 대해 경쟁하는 항원-결합 단백질 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 부분)과 관련하여 사용되는 경우에 시험되는 항원-결합 단백질이 공통 항원 (예를 들어, TGFβ1 또는 그의 단편)에 대한 참조 항원-결합 단백질의 특이적 결합을 막거나 억제하는 (예를 들어, 감소시키는) 검정에 의해 결정된 바와 같은 항원-결합 단백질 사이의 경쟁을 의미한다. 수많은 유형의 경쟁적 결합 검정, 예를 들어 고체 상 직접 또는 간접 방사선면역검정 (RIA), 고체 상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정; 고체 상 직접 비오틴-아비딘 EIA; 고체 상 직접 표지된 검정, 및 고체 상 직접 표지된 샌드위치 검정이 하나의 항원-결합 단백질이 또 다른 것과 경쟁하는지 결정하는 데 사용될 수 있다. 통상적으로, 경쟁하는 항원-결합 단백질이 과량으로 존재하는 경우에, 이는 공통 항원에 대한 참조 항원-결합 단백질의 특이적 결합을 적어도 40-45%, 45-50%, 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70%, 70-75% 또는 75% 또는 그 초과만큼 억제할 (예를 들어, 감소시킬) 것이다. 일부 경우에, 결합은 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 95-97%, 또는 97% 또는 그 초과만큼 억제된다. 일부 경우에, 결합은 적어도 80-90%, 적어도 85%-95%, 적어도 95-99%만큼 억제된다. 일부 경우에, 결합은 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과만큼 억제된다. 일부 실시양태에서, 제1 항체 또는 그의 항원-결합 부분 및 제2 항체 또는 그의 항원-결합 부분은, 예를 들어 표준 시험 조건을 사용하여, 예를 들어 제조업체의 지침에 따라 (예를 들어, 실온, ~20-25℃에서 결합을 검정함) BLI (예컨대 비아코어(BIACORE)® 또는 옥테트(OCTET)®)에 의해 검정된 바와 같이, 동일한 항원에 대해 서로 교차-차단한다. 일부 실시양태에서, 제1 항체 또는 그의 단편 및 제2 항체 또는 그의 단편은 동일한 에피토프를 가질 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 항체 또는 그의 단편 및 제2 항체 또는 그의 단편은 동일하지 않지만 중첩되는 에피토프를 가질 수 있다. 추가 실시양태에서, 제1 항체 또는 그의 단편 및 제2 항체 또는 그의 단편은 항체 결합이 입체 장애를 통해 교차-차단되도록 3차원 공간에서 매우 근접한 별개의 (상이한) 에피토프를 가질 수 있다. "교차-차단"은 항원에 대한 제1 항체의 결합이 동일한 항원에 대한 제2 항체의 결합을 막고, 유사하게 항원에 대한 제2 항체의 결합이 동일한 항원에 대한 제1 항체의 결합을 막는다는 것을 의미한다.

상보성 결정 영역 (CDR): 본원에 사용된 용어 "CDR"은 항체 가변 서열 내의 상보성 결정 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄의 각각의 가변 영역에 3개의 CDR이 존재하며, 이는 각각의 가변 영역에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지정된다. 본원에 사용된 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역에서 발생하는 3개의 CDR의 군을 지칭한다. 이들 CDR의 정확한 경계는 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. 카바트에 의해 기재된 시스템 (Kabat et al., (1987; 1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md.))은 항체의 임의의 가변 영역에 적용가능한 명확한 잔기 넘버링 시스템을 제공할 뿐만 아니라, 3개의 CDR을 정의하는 정확한 잔기 경계를 제공한다. 이들 CDR은 카바트 CDR로 지칭될 수 있다. 코티아 및 동료들은 (Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; 및 Chothia et al., (1989) Nature 342: 877-883) 카바트 CDR 내의 특정 하위-부분이 아미노산 서열 수준에서 큰 다양성을 가짐에도 불구하고 거의 동일한 펩티드 백본 입체형태를 채택한다는 것을 발견하였다. 이들 하위-부분은 L-CDR1, L-CDR2 및 L-CDR3 또는 H-CDR1, H-CDR2 및 H-CDR3으로 지정되었고, 여기서 "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지정한다. 이들 영역은 코티아 CDR로 지칭될 수 있으며, 이는 카바트 CDR과 중첩되는 경계를 갖는다. 카바트 CDR과 중첩되는 CDR을 정의하는 다른 경계는 문헌 [Padlan (1995) FASEB J. 9: 133-139 및 MacCallum (1996) J. Mol. Biol. 262(5): 732-45]에 기재되어 있다. 또 다른 CDR 경계 정의는 본원의 시스템 중 하나를 엄격하게 따르지 않을 수 있으나 그럼에도 불구하고 카바트 CDR과 중첩될 것이며, 다만 이는 특정한 잔기 또는 잔기의 군 또는 심지어 전체 CDR이 항원-결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 단축되거나 연장될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Lu X et al., MAbs. 2019 Jan;11(1):45-57] 참조). 본원에 사용된 방법은 이들 시스템 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 이용할 수 있지만, 특정 실시양태는 카바트- 또는 코티아-정의된 CDR을 사용한다.

입체형태적 에피토프: 입체형태적 에피토프는 3차원 입체형태의 입체형태적 항체에 의해서는 인식되고 결합되지만, 동일한 아미노산 서열의 언폴딩된 펩티드로는 인식되고 결합되지 않는 에피토프이다. 입체형태적 에피토프는 입체형태-특이적 에피토프, 입체형태-의존성 에피토프, 또는 입체형태-감수성 에피토프로 지칭될 수 있다. 이러한 에피토프에 특이적으로 결합하는 상응하는 항체 또는 그의 단편은 입체형태-특이적 항체, 입체형태-선택적 항체, 또는 입체형태-의존성 항체로 지칭될 수 있다. 입체형태적 에피토프에 대한 항원의 결합은 항원 또는 항원 복합체의 3차원 구조 (입체형태)에 좌우된다.

불변 영역/도메인: 이뮤노글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 지칭한다. 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 아미노산 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

콘텍스트-편향된: 본원에 사용된 "콘텍스트-편향된 항체"는 항원이 상호작용 단백질 또는 그의 단편과 회합되는 (즉, 그에 결합되거나 부착되는) 경우에 차등 친화도로 항원에 결합하는 입체형태적 항체의 유형을 지칭한다. 따라서, 프로TGFβ1 내의 에피토프에 특이적으로 결합하는 콘텍스트-편향된 항체는 상이한 친화도로 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항체가 세포-회합된 프로TGFβ1 복합체 (예를 들어, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1)보다 매트릭스-회합된 프로TGFβ1 복합체 (예를 들어, LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1)에 대해 더 높은 친화도를 갖는 경우에 항체는 "매트릭스-편향된" 것으로 언급된다. [매트릭스-회합된 복합체] : [세포-회합된 복합체]의 상대 친화도는 본원에 예시된 바와 같이 전자의 평균 KD 값을 취하고, 후자의 평균 KD 값을 취하고, 2개의 비를 계산함으로써 수득할 수 있다. 콘텍스트-편향된 항체는 또한 다른 제시 분자-프로TGFβ1 복합체에 비해 하나의 제시 분자-프로TGFβ1 복합체를 향해 또는 그에 대해 편향될 수 있어서, 전자에 대한 친화도 (KD에 의해 측정된 바와 같음)는 후자의 평균보다 각각 10-배 초과로 더 약하거나 또는 더 크다.

콘텍스트-비의존성: 본 개시내용에 따르면, 프로TGFβ1에 결합하는 "콘텍스트-비의존성 항체"는 4종의 공지된 제시 분자-프로TGFβ1 복합체, 즉 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1에 걸쳐 등가의 친화도를 갖는다. 콘텍스트-비의존성 항체는 또한 "비편향" 또는 "균형잡힌" 것으로 특징화될 수 있다. 전형적으로, 콘텍스트-비의존성 항체는 친화도에 있어서 5-배 이하의 편향을 나타내어, 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 표면 플라즈몬 공명, 생물층 간섭측정법 (BLI), 및/또는 용액 평형 적정 (예를 들어, MSD-SET)에 의해 측정된 바와 같은 매트릭스-회합된 복합체와 세포-회합된 복합체 사이의 측정된 KD 값의 상대 비가 5 이하이다.

해리율: 본원에 사용된 용어 해리율은 리간드 (예를 들어, 항체 또는 단편)가 그의 결합 표적 (예를 들어, 항원)으로부터 얼마나 빨리/느리게 해리되는지에 의해 측정된 동역학적 파라미터를 지칭하는 것으로, 관련 기술분야 (예를 들어, 항체 기술)의 통상의 기술자에 의해 이해되는 의미를 갖는다. 해리율은 또한 "오프" 레이트 ("k_오프")로 지칭된다. 항체와 그의 항원 사이의 상대 온/오프 레이트 (즉, k_온 및 k_오프)는 전형적으로 해리 상수 또는 K_D로 표현되는 상호작용의 전체 강도 또는 친화도를 결정한다. 따라서, 등가의 친화도 (예를 들어, K_D 값)는 빠른 회합 (높은 k_온), 느린 해리 (낮은 k_오프), 또는 둘 다의 인자로부터의 기여를 가짐으로써 달성될 수 있다. 1가 상호작용은 1가 항원-결합 분자/단편, 예컨대 fAb (Fab)의 사용에 의해 측정될 수 있는 반면, 2가 상호작용은 2가 항원-결합 분자, 예컨대 전체 이뮤노글로불린 (예를 들어, IgG)의 사용에 의해 측정될 수 있다.

ECM-회합된 TGFβ1/프로TGFβ1: 용어는 세포외 매트릭스의 성분인 (예를 들어, 그에 침착된) TGFβ1 또는 그의 신호전달 복합체 (예를 들어, 프로/잠재성 TGFβ1)를 지칭한다. LTBP1 또는 LTBP3에 의해 제시되는 TGFβ1은 ECM-회합된 TGFβ1이다. LTBP는 ECM에서의 TGFβ의 정확한 침착 및 후속 생체이용률을 위해 중요하며, 여기서 피브릴린 (Fbn) 및 피브로넥틴 (FN)은 LTBP와 ECM의 회합을 담당하는 주요 매트릭스 단백질인 것으로 여겨진다. LTBP1-프로TGFβ1 복합체 및 LTBP3-프로TGFβ1 복합체에 대한 항체 (또는 그의 단편)의 평균 KD 값은 ECM-회합된 (또는 매트릭스-회합된) 프로TGFβ1 복합체에 대한 친화도를 집합적으로 나타내기 위해 계산될 수 있다. 예를 들어, 표, 칼럼 (D)을 참조한다. 제시 분자 또는 제시 분자 복합체의 인간 대응물은 단백질 또는 단백질 복합체 앞에 "h", 예를 들어 "hLTBP1", "hLTBP1-프로TGFβ1", hLTBP3" 및 "hLTBP3-프로TGFβ1"로 나타내어질 수 있다.

유효량: 용어 "유효한" 및 "치료상 유효한"은 질환의 파라미터에서 검출가능한 변화, 예를 들어 질환의 증상 또는 하류 효과의 둔화, 중지, 역전, 축소, 또는 호전을 충분히 발생시키는 능력 또는 양을 지칭한다. 용어는 질환을 완전히 치유하는 양의 사용을 포괄하나, 이를 필요로 하지는 않는다. 일부 실시양태에 따르면, "유효량" (또는 치료 유효량 또는 치료 용량)은 환자 집단에서 통계적으로 유의한 임상 이익 (예를 들어, 효능)을 달성하는 투여량, 농도, 또는 투여 요법이다. 예를 들어, 전임상 모델에서 3 mg/kg 내지 30 mg/kg의 용량에서 효과적인 것으로 제시된 항체의 경우, 유효량은 약 3-30 mg/kg인 것으로 언급될 수 있다.

유효 종양 제어: 용어 "유효 종양 제어"는 치료에 반응하여 달성된 종양 퇴행의 정도를 지칭하는데 사용될 수 있으며, 여기서 예를 들어 종양은 종점 종양 부피의 규정된 분율 (예컨대 <25%)만큼 퇴행된다. 예를 들어, 특정한 모델에서, 종점 종양 부피가 2,000 mm³으로 설정된 경우에, 종양이 <25%의 역치를 가정하여 500 mm³ 미만으로 감소된 경우에 유효 종양 제어가 달성된다. 따라서, 유효 종양 제어는 완전 퇴행을 포괄한다. 임상적으로, 유효 종양 제어는 관련 기술분야에서 인식되는 기준, 예컨대 RECIST 1.1 및 상응하는 iRECIST에 기초한 부분 반응 (PR) 및 완전 반응 (CR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 임상 세팅에서 유효 종양 제어는 또한, 전형적으로 특정 속도로 성장할 것으로 예상되는 종양이 수축이 달성되지는 않더라도 치료에 의해 이러한 성장이 방지된 경우인 안정 질환을 포함한다.

이펙터 T 세포: 본원에 사용된 이펙터 T 세포는 자극, 예컨대 공동-자극에 대해 즉시 능동적으로 반응하는 T 림프구이며, CD4+ T 세포 (또한 T 헬퍼 또는 Th 세포로도 지칭됨) 및 CD8+ T 세포 (또한 세포독성 T 세포로도 지칭됨)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. Th 세포는 B 세포의 형질 세포 및 기억 B 세포로의 성숙, 및 세포독성 T 세포 및 대식세포의 활성화를 비롯하여, 면역학적 과정에서 다른 백혈구를 보조한다. 이들 세포는 그의 표면 상에 CD4 당단백질을 발현하기 때문에 또한 CD4+ T 세포로도 공지되어 있다. 헬퍼 T 세포는 항원-제시 세포 (APC)의 표면 상에서 발현되는 MHC 부류 II 분자에 의해 펩티드 항원이 제시될 때 활성화된다. 활성화되면, 이는 신속하게 분열하고, 능동 면역 반응을 조절하거나 이를 보조하는 시토카인으로 불리는 소형 단백질을 분비한다. 이들 세포는 상이한 시토카인을 분비하여 상이한 유형의 면역 반응을 용이하게 하는, Th1, Th2, Th3, Th17, Th9, 또는 TFh를 비롯한 여러 하위유형 중 하나로 분화될 수 있다. APC로부터의 신호전달은 T 세포를 특정한 하위유형으로 지시한다. 세포독성 (킬러). 세포독성 T 세포 (TC 세포, CTL, T-킬러 세포, 킬러 T 세포)는, 다른 한편으로는, 바이러스-감염된 세포 및 암 세포를 파괴하고, 또한 이는 이식 거부에 연루된다. 이들 세포는 그의 표면에서 CD8 당단백질을 발현하기 때문에 또한 CD8+ T 세포로도 공지되어 있다. 이들 세포는 모든 유핵 세포의 표면 상에 존재하는 MHC 부류 I 분자와 회합된 항원에 결합함으로써 그의 표적을 인식한다. 세포독성 이펙터 세포 (예를 들어, CD8+ 세포)는, 예를 들어 퍼포린 및 그랜자임 B를 포함한다.

에피토프: 용어 "에피토프"는 또한 항원 결정기로도 지칭될 수 있고, 결합제, 이뮤노글로불린 또는 T-세포 수용체에 의해 특이적으로 결합될 수 있는 분자 결정기 (예를 들어, 폴리펩티드 결정기)이다. 에피토프 결정기는 화학적으로 활성인 표면 분자 군, 예컨대 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 술포닐을 포함하고, 특정 실시양태에서, 특이적 3차원 구조적 특징 및/또는 특이적 전하 특징을 가질 수 있다. 항체 또는 항체의 항원-결합 단편에 의해 인식되는 에피토프는 항체 또는 단편의 CDR (예를 들어, 상보적 부위)과 상호작용하는 항원의 구조적 요소이다. 에피토프는 항체의 CDR과 상호작용하여 특이성을 생성하는 여러 아미노산 잔기로부터의 기여에 의해 형성될 수 있다. 항원 단편은 1개 초과의 에피토프를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 그의 표적 항원을 인식하는 경우에 항원에 특이적으로 결합한다.

섬유증: 용어 "섬유증" 또는 "섬유화 상태/장애"는 조직 또는 기관 내에서의 세포외 매트릭스 (ECM) 성분, 예컨대 콜라겐의 병리학적 축적을 특징으로 하는 과정 또는 징후를 지칭한다.

섬유화 미세환경: 용어 "섬유화 미세환경"은 섬유증이 생체내에서 발생하는, 조직 내의 국부 질환 함요를 지칭한다. 섬유화 미세환경은 질환-연관 분자 서명 (케모카인, 시토카인 등의 세트), 질환-연관 세포 집단 (예컨대 활성화된 대식세포, MDSC 등) 뿐만 아니라 질환-연관 ECM 환경 (ECM 성분 및/또는 구조의 변경)을 포함할 수 있다. 섬유화 미세환경은 TGFβ-의존성 방식으로 섬유모세포에서 α-평활근 액틴-양성 근섬유모세포로의 전이를 지지하는 것으로 생각된다. 섬유화 미세환경은 특정 면역 세포 (예컨대 대식세포 및 MDSC)의 침윤을 추가로 특징으로 할 수 있다.

GARP-TGFβ1 복합체: 본원에 사용된 용어 "GARP-TGFβ1 복합체" (또는 "GARP-프로TGFβ1 복합체")는 프로-단백질 형태 또는 잠재성 형태의 형질전환 성장 인자-β1 (TGFβ1) 단백질 및 당단백질-A 반복 우세 단백질 (GARP) 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 단백질 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 단백질의 프로-단백질 형태 또는 잠재성 형태는 "프로/잠재성 TGFβ1 단백질"로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체는 1개 이상의 디술피드 결합을 통해 프로/잠재성 TGFβ1과 공유 연결된 GARP를 포함한다. 사실상, 이러한 공유 결합은 프로TGFβ1 이량체 복합체의 N-말단 (예를 들어, 아미노산 위치 4) 근처에 존재하는 시스테인 잔기와 함께 형성된다. 다른 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체는 프로/잠재성 TGFβ1과 비-공유 연결된 GARP를 포함한다. 일부 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체는 자연-발생 복합체, 예를 들어 세포에서의 GARP-TGFβ1 복합체이다. 용어 "hGARP"는 인간 GARP를 나타낸다.

인간 항체: 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 개시내용의 인간 항체는, 예를 들어 CDR, 특히 CDR3에, 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 상에 그라프팅된 항체를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.

인간화 항체: 용어 "인간화 항체"는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스)으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하나, VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 보다 "인간-유사"하도록, 즉 인간 배선 가변 서열과 보다 유사하도록 변경된 항체를 지칭한다. 인간화 항체의 한 유형은 인간 CDR 서열이 비-인간 VH 및 VL 서열 내로 도입되어 상응하는 비인간 CDR 서열을 대체한, CDR-그라프팅된 항체이다. 또한, "인간화 항체"는 관심 항원에 면역특이적으로 결합하고 인간 항체의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 FR 영역 및 비-인간 항체의 아미노산 서열을 실질적으로 갖는 CDR 영역을 포함하는 항체, 또는 그의 변이체, 유도체, 유사체 또는 단편이다. CDR과 관련하여 본원에 사용된 용어 "실질적으로"는 비-인간 항체 CDR의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 지칭한다. 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역이 비-인간 이뮤노글로불린 (즉, 공여자 항체)의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역이 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것인 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인 (Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv)을 실질적으로 모두 포함한다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는 또한 이뮤노글로불린 Fc 영역, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 것의 적어도 일부를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄뿐만 아니라 적어도 중쇄의 가변 도메인을 함유한다. 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 인간화 경쇄만을 함유한다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 인간화 중쇄만을 함유한다. 구체적 실시양태에서, 인간화 항체는 경쇄의 인간화 가변 도메인 및/또는 인간화 중쇄만을 함유한다.

수소/중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS): HDX-MS는 용매 접근성의 정도를 측정함으로써 용액 중 단백질 확인 및 단백질-단백질 상호작용을 조사하는데 사용되는 널리 공지된 기술이다. 예를 들어, 문헌 [Wei et al., (2014) Drug Discov Today 19(1): 95-102. "Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry for probing higher order structure of protein therapeutics: methodology and applications."]을 참조한다. HDX-MS 기술은 항체에 의해 결합된 항원의 영역 또는 영역들 (즉, "결합 영역(들)")을 결정하는데 사용될 수 있다. 따라서, 이러한 결합 영역(들)은 에피토프를 함유하거나 형성할 수 있다.

면역억제, 면역억제성: 용어는 면역 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포 및 B 세포를 억제하는 능력을 지칭한다. 면역억제성 기능을 평가하기 위한 최적 표준은 항원-특이적 억제 및 비-특이적 억제를 포함할 수 있는 T 세포 활성의 억제이다. 조절 T 세포 (Treg) 및 MDSC는 면역억제성 세포로 간주될 수 있다. M2-분극화된 대식세포 (예를 들어, TAM)가 또한 면역억제성으로서 특징화될 수 있다.

이소형-특이적/선택적: 용어 "이소형 특이성" 또는 "이소형 선택성"은 하나의 이소형을 다른 구조적으로 관련된 이소형과 구별하는 작용제의 능력 (즉, 선택성)을 지칭한다. 이소형-특이적 TGFβ 억제제는 주어진 농도에서 TGFβ의 하나의 이소형에 대해 그의 억제 활성을 발휘하지만 TGFβ의 다른 이소형에 대해서는 그렇지 않다. 예를 들어, 이소형-특이적 TGFβ1 항체는 TGFβ1에 선택적으로 결합한다. TGFβ1-특이적 억제제 (항체)는 TGFβ2 또는 TGFβ3보다 TGFβ1 이소형을 실질적으로 더 큰 친화도로 우선적으로 표적화한다 (결합하여 억제한다). 예를 들어, 이와 관련하여 선택성은 시험관내 결합 검정, 예컨대 옥테트® 및 비아코어®에 의해 측정된 바와 같은 각각의 친화도에서의 적어도 500-1000-배 차이를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택성은 생체내에서 TGFβ1을 억제하는데 효과적인 투여량으로 사용되는 경우에 억제제가 TGFβ2 및 TGFβ3은 억제하지 않도록 하는 것이다. 예를 들어, 항체는 ~1 pM의 친화도로 TGFβ1에 우선적으로 결합할 수 있는 반면, 동일한 항체는 ~0.5-50 nM로 TGFβ2 및/또는 TGFβ3에 결합할 수 있다. 이러한 억제제가 치료제로서 유용하기 위해서는, 바람직한 효과를 달성하기 위한 투여량 (예를 들어, 치료 유효량)은 억제제가 TGFβ2 또는 TGFβ3을 억제하지 않으면서 TGFβ1 이소형을 효과적으로 억제할 수 있는 범위 내에 속해야 한다. 용어 "이소형-특이적" 및 "이소형-선택적"은 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.

단리된: 본원에 사용된 "단리된" 항체는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단리된 항체는 다른 의도하지 않은 세포 물질 및/또는 화학물질이 실질적으로 없다.

대형 잠재성 복합체: 본 개시내용과 관련하여 용어 "대형 잠재성 복합체" ("LLC")는 소위 제시 분자에 결합된 프로TGFβ1 이량체로 구성된 복합체를 지칭한다. 따라서, 대형 잠재성 복합체는 제시 분자-프로TGFβ1 복합체, 예컨대 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1이다. 이러한 복합체는 복합체를 형성할 수 있는 재조합, 정제된 성분을 사용하여 시험관내에서 형성될 수 있다. 스크리닝 목적을 위해, 이러한 LLC를 형성하는데 사용되는 제시 분자는 전장 폴리펩티드일 필요는 없지만; 그의 N-말단 영역 근처의 시스테인 잔기를 통해 프로TGFβ1 이량체 복합체와 디술피드 결합을 형성할 수 있는 단백질의 부분이 전형적으로 요구된다.

잠재성 연관 펩티드 (LAP): LAP는 소위 프로TGFβ1의 "프로도메인"이다. 본원에 보다 상세히 기재된 바와 같이, LAP는 "직쇄형 재킷" 도메인 및 "아암" 도메인으로 구성된다. 직쇄형 재킷 자체는 알파-1 헬릭스 및 잠재성 라쏘 도메인으로 추가로 나뉜다.

잠재성 라쏘: 본원에 사용된 "잠재성 라쏘"는 때때로 또한 잠재성 루프로도 지칭되며, 이는 프로TGFb1의 프로도메인 내의 알파-1 헬릭스 및 아암과 플랭킹된 도메인이다. 그의 비돌연변이된 형태에서, 인간 프로TGFβ1의 잠재성 라쏘는 아미노산 서열: LASPPSQGEVPPGPL (서열식별번호: 270)을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "연장된 잠재성 라쏘 영역"은 프로도메인의 알파-2 헬릭스 (α2-헬릭스)로 지칭되는 그의 바로 옆 C-말단 모티프와 함께 잠재성 라쏘를 지칭한다. 잠재성 라쏘의 C-말단에 있는 프롤린 잔기는 라쏘 루프를 α2-헬릭스에 연결하는 "엘보"와 같은 수직 "턴"을 제공한다. 특정의 고친화도 TGFβ1 활성화 억제제는 적어도 부분적으로 잠재성 라쏘 또는 그의 부분에 결합하여 억제 효력 (예를 들어, 활성화를 차단하는 능력)을 부여하며, 여기서 임의로 잠재성 라쏘의 부분은 ASPPSQGEVPPGPL (서열식별번호: 286)이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 ASPPSQGEVPPGPL (서열식별번호: 286) 또는 그의 부분에서 프로TGFβ1 복합체에 결합한다. 특정의 고친화도 TGFβ1 활성화 억제제는 적어도 부분적으로 연장된 잠재성 라쏘 또는 그의 부분에 결합하여 억제 효력 (예를 들어, 활성화를 차단하는 능력)을 부여하며, 여기서 임의로 연장된 잠재성 라쏘의 부분은 LASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTR (서열식별번호: 271)이다.

국재화된: 본 개시내용과 관련하여, 용어 "국재화된"은 ("국재화된 종양"에서와 같음) 전신 질환과는 대조적으로 해부학적으로 단리되거나 단리가능한 이상, 예컨대 고형 악성종양을 지칭한다. 예를 들어, 특정 백혈병은 질환에 대해 국재화된 성분 (예를 들어 골수) 및 전신 성분 (예를 들어 순환 혈액 세포) 둘 다를 가질 수 있다.

LRRC33-TGFβ1 복합체: 본원에 사용된 용어 "LRRC33-TGFβ1 복합체" (또는 "LRRC33-프로TGFβ1 복합체")는 프로-단백질 형태 또는 잠재성 형태의 형질전환 성장 인자-β1 (TGFβ1) 단백질과 류신-풍부 반복부-함유 단백질 33 (LRRC33; 또한 반응성 산소 종의 음성 조절제 또는 NRROS로도 공지됨) 또는 그의 단편 또는 변이체 사이의 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, LRRC33-TGFβ1 복합체는 1개 이상의 디술피드 결합을 통해 프로/잠재성 TGFβ1과 공유 연결된 LRRC33을 포함한다. 사실상, 이러한 공유 결합은 프로TGFβ1 이량체 복합체의 N-말단 (예를 들어, 아미노산 위치 4) 근처에 존재하는 시스테인 잔기와 함께 형성된다. 다른 실시양태에서, LRRC33-TGFβ1 복합체는 프로/잠재성 TGFβ1과 비-공유 연결된 LRRC33을 포함한다. 일부 실시양태에서, LRRC33-TGFβ1 복합체는 자연-발생 복합체, 예를 들어 세포에서의 LRRC33-TGFβ1 복합체이다. 용어 "hLRRC33"은 인간 LRRC33을 나타낸다.

LTBP1-TGFβ1 복합체: 본원에 사용된 용어 "LTBP1-TGFβ1 복합체" (또는 "LTBP1-프로TGFβ1 복합체")는 프로-단백질 형태 또는 잠재성 형태의 형질전환 성장 인자-β1 (TGFβ1) 단백질 및 잠재성 TGF-베타 결합 단백질 1 (LTBP1) 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 단백질 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체는 1개 이상의 디술피드 결합을 통해 프로/잠재성 TGFβ1과 공유 연결된 LTBP1을 포함한다. 사실상, 이러한 공유 결합은 프로TGFβ1 이량체 복합체의 N-말단 (예를 들어, 아미노산 위치 4) 근처에 존재하는 시스테인 잔기와 함께 형성된다. 다른 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체는 프로/잠재성 TGFβ1과 비-공유 연결된 LTBP1을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체는 자연-발생 복합체, 예를 들어 세포에서의 LTBP1-TGFβ1 복합체이다. 용어 "hLTBP1"은 인간 LTBP1을 나타낸다.

LTBP3-TGFβ1 복합체: 본원에 사용된 용어 "LTBP3-TGFβ1 복합체" (또는 "LTBP3-프로TGFβ1 복합체")는 프로-단백질 형태 또는 잠재성 형태의 형질전환 성장 인자-β1 (TGFβ1) 단백질 및 잠재성 TGF-베타 결합 단백질 3 (LTBP3) 또는 그의 단편 또는 변이체를 포함하는 단백질 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, LTBP3-TGFβ1 복합체는 1개 이상의 디술피드 결합을 통해 프로/잠재성 TGFβ1과 공유 연결된 LTBP3을 포함한다. 사실상, 이러한 공유 결합은 프로TGFβ1 이량체 복합체의 N-말단 (예를 들어, 아미노산 위치 4) 근처에 존재하는 시스테인 잔기와 함께 형성된다. 다른 실시양태에서, LTBP3-TGFβ1 복합체는 프로/잠재성 TGFβ1과 비-공유 연결된 LTBP1을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP3-TGFβ1 복합체는 자연-발생 복합체, 예를 들어 세포에서의 LTBP3-TGFβ1 복합체이다. 용어 "hLTBP3"은 인간 LTBP3을 나타낸다.

M2 또는 M2-유사 대식세포: M2 대식세포는 활성화된 또는 분극화된 대식세포의 하위세트를 나타내고, 섬유화 및 종양 미세환경 둘 다에서의 질환-연관 대식세포를 포함한다. M2-분극화된 대식세포에 대한 세포-표면 마커는 전형적으로 CD206 및 CD163 (즉, CD206+/CD163+)을 포함한다. 본 출원인은 최근에 M2-분극화된 대식세포가 또한 세포-표면 LRRC33을 발현할 수 있다는 것을 발견하였다. M2 대식세포의 활성화는 주로 IL-4, IL-13, IL-10 및 TGFβ에 의해 촉진되고; 이들은 이들을 활성화시키는 동일한 시토카인 (IL-4, IL-13, IL-10 및 TGFβ)을 분비한다. 이들 세포는 높은 식세포 능력을 갖고, ECM 성분, 혈관신생 및 화학주성 인자를 생산한다. 대식세포에 의한 TGFβ의 방출은 섬유화 조직에서 근섬유모세포 활성화, EMT 및 EndMT 유도를 영속시킬 수 있다. 예를 들어, M2 대식세포는 TGFβ-구동된 폐 섬유증에 본질적이고, 또한 다수의 종양에서 풍부화된다.

매트릭스-회합된 프로TGFβ1: LTBP1 및 LTBP3은 세포외 매트릭스 (ECM)의 성분인 제시 분자이다. LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1은 ECM-회합된 TGFβ1 활성화/신호전달을 매개하는 "ECM-회합된" (또는 "매트릭스-회합된") 프로TGFβ1 복합체로서 집합적으로 지칭될 수 있다. 용어는 또한 매트릭스 또는 기질에 물리적으로 부착되지 않는 용액 중 (예를 들어, 시험관내 검정) 재조합, 정제된 LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1 복합체를 포함한다.

최대 허용 용량 (MTD): 용어 MTD는 일반적으로, 안전성/독성학 고려사항과 관련하여, 무관찰 부작용 수준 (NOAEL)으로 평가된 시험 물품 (예컨대 TGFβ1 억제제)의 가장 높은 양을 지칭한다. 예를 들어, 래트에서의 Ab2에 대한 NOAEL이 평가된 최고 용량 (100 mg/kg)이었고, 이는 4-주 독성학 연구에 기초하여 Ab2에 대한 MTD가 > 100 mg/kg임을 시사한다.

메소-스케일 디스커버리: "메소-스케일 디스커버리" 또는 "MSD"는 단백질 (예를 들어, 항체)을 포획하기 위해 높은 결합 탄소 전극을 사용하는 면역검정의 한 유형이다. 항체는 특정한 항원과 함께 인큐베이션될 수 있고, 결합은 전기화학발광 표지에 접합된 2차 항체로 검출될 수 있다. 전기 신호 시, 광 강도를 측정하여 샘플 중의 분석물을 정량화할 수 있다.

골수섬유증: 골-골수섬유증으로도 공지되어 있는 "골수섬유증"은 비교적 희귀한 골수 증식성 장애 (예를 들어, 암)이며, 이는 골수증식성 장애로 불리는 질환 군에 속하고, 원발성 골수섬유증 및 속발성 골수섬유증을 포함한다. 골수 및 다른 부위에서의 조혈 줄기 세포의 비정상적 클론의 증식을 특징으로 하는 골수섬유증은 섬유증, 또는 골수의 반흔 조직으로의 대체를 발생시킨다. 골수섬유증은 하류 JAK 경로의 상향조절 또는 과다활성화를 유발하는 돌연변이를 특징으로 한다.

골수-유래 억제 세포: 골수-유래 억제 세포 (MDSC)는 다양한 병적 상태 동안 생성되고 단핵구 및 비교적 미성숙한 호중구의 활성화의 병리학적 상태를 나타내는 것으로 생각되는 세포의 이종 집단이다. MDSC는 i) 호중구와 표현형적으로 및 형태학적으로 유사한 "과립구성" (G-MDSC) 또는 다형핵 (PMN-MDSC); 및 ii) 단핵구와 표현형적으로 및 형태학적으로 유사한 단핵구성 (M-MDSC)으로 명명되는 적어도 2종의 카테고리의 세포를 포함한다. MDSC는 별개의 세트의 게놈 및 생화학적 특색을 특징으로 하고, 특이적 표면 분자에 의해 구별될 수 있다. 예를 들어, 인간 G-MDSC/PMN-MDSC는 전형적으로 세포-표면 마커 CD11b, CD33, CD15 및 CD66을 발현한다. 또한, 인간 G-MDSC/PMN-MDSC는 또한 HLA-DR 및/또는 아르기나제를 발현할 수 있다. 비교상, 인간 M-MDSC는 전형적으로 세포 표면 마커 CD11b, CD33 및 CD14를 발현한다. MDSC는 또한 CD39 및 CD73을 발현하여 기관 섬유증 (예컨대 간 섬유증 및 폐 섬유증), 암 및 골수섬유증에 수반되는 아데노신 신호전달을 매개할 수 있다. 또한, 인간 M-MDSC는 또한 HLA-DR을 발현할 수 있다. 이러한 세포-표면 마커에 더하여, MDSC는 면역 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포 및 B 세포를 억제하는 능력을 특징으로 한다. MDSC의 면역 억제 기능은 항원-비-특이적 기능의 억제 및 항원-특이적 기능의 억제를 포함할 수 있다. MDSC는 세포 표면 LRRC33 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1을 발현할 수 있다.

근섬유모세포: 근섬유모세포는 섬유모세포 및 평활근 세포의 특정 표현형을 갖는 세포이고, 일반적으로 비멘틴, 알파-평활근 액틴 (α-SMA; 인간 유전자 ACTA2) 및 팔라딘을 발현한다. 세포외 매트릭스 조절이상 (예컨대 증가된 매트릭스 강성)을 수반하는 많은 질환 상태에서, 정상 섬유모세포는 TGFβ-의존성 방식으로 근섬유모세포로 탈분화된다. TGFβ의 이상 과다발현은 근섬유모세포-구동된 병리상태 사이에서 공통적이다. TGFβ는 근섬유모세포 분화, 세포 증식, 및 매트릭스 생산을 촉진하는 것으로 공지되어 있다. 섬유화 미세환경 내의 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포는 섬유증-연관 섬유모세포 (또는 "FAF")로 지칭될 수 있고, 종양 미세환경 내의 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포는 암-연관 섬유모세포 (또는 "CAF")로 지칭될 수 있다.

오프 레이트 (k_오프): 오프 레이트는 항체 (예컨대 mAb) 또는 항원-결합 단편 (예컨대 fAb)이 그의 항원으로부터 얼마나 빨리 또는 얼마나 느리게 해리되는지의 동역학적 파라미터이고, 또한 해리율로도 지칭될 수 있다. 해리율은 적합한 시험관내 결합 검정, 예컨대 옥테트®- 및 비아코어®-기반 시스템에서 실험적으로 측정될 수 있다.

범-TGFβ 억제제/TGFβ의 범-억제: 용어 "범-TGFβ 억제제" 또는 "TGFβ의 범 억제제"는 TGFβ의 모든 3종의 이소형을 억제 또는 길항할 수 있는 임의의 작용제를 지칭한다. 이러한 억제제는 TGFβ 이소형의 소분자 억제제일 수 있다. 용어는 각각의 TGFβ 이소형, 즉 TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3에 결합할 수 있는 임의의 항체를 지칭하는 범-TGFβ 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 범-TGFβ 항체는 모든 3종의 이소형의 활성, 즉 TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3 활성에 결합하고 이를 중화시킨다. 항체 1D11 (또는 인간 유사체 프레솔리무맙 (GC1008))은 TGFβ의 모든 3종의 이소형을 중화시키는 범-TGFβ 항체의 널리 공지된 예이다. 소분자 범-TGFβ 억제제의 예는 모든 3종의 TGFβ 이소형의 신호전달을 매개하는 TGFβ 수용체 I 키나제/ALK5에 대한 길항제인 갈루니세르팁 (LY2157299 1수화물, CAS 번호 700874-72-2)을 포함한다.

효력: 본원에 사용된 용어 "효력"은 규정된 효과를 생성하는 약물의 농도 또는 양과 관련하여 억제 활성을 갖는 약물, 예컨대 억제 항체 (또는 단편)의 활성을 지칭한다. 예를 들어, 주어진 투여량에서 특정 효과를 생성할 수 있는 항체는 등가의 효과를 생성하기 위해 2배의 양 (투여량)을 필요로 하는 또 다른 항체보다 더 강력하다. 효력은 세포-기반 검정, 예컨대 TGFβ 활성화/억제 검정에서 측정될 수 있고, 이에 의해 TGFβ 활성화, 예컨대 인테그린 결합에 의해 촉발되는 활성화의 정도는 세포-기반 시스템에서 시험 물품 (예를 들어, 억제 항체)의 존재 또는 부재 하에 측정될 수 있다. 전형적으로, 항원의 동일한 또는 중첩되는 결합 영역에 결합할 수 있는 항체 (예를 들어, 교차-차단 항체) 중에서, 더 높은 친화도 (더 낮은 K_D 값)를 갖는 항체는 더 낮은 친화도 (더 큰 K_D 값)를 갖는 항체보다 더 높은 효력을 나타내는 경향이 있다.

예측 바이오마커: 예측 바이오마커는 특정한 요법에 대한 반응의 확률 또는 가능성에 대한 정보를 제공한다. 전형적으로, 예측 바이오마커는 치료 전 및 후에 측정되고, 대상체로부터 수집된 샘플에서의 마커의 변화 또는 상대 수준은 치료 이익을 나타내거나 예측한다.

제시 분자: 본 개시내용과 관련하여 제시 분자는 잠재성 프로-단백질 (예를 들어, 프로TGFβ1)과 공유 결합을 형성할 수 있고, 불활성 복합체를 세포외 함요 (예컨대 ECM 또는 면역 세포 표면)에 "제시"하여 활성화 사건이 발생할 때까지 그의 잠재성을 유지시킬 수 있는 앵커링 단백질을 지칭한다. 프로TGFβ1에 대한 공지된 제시 분자는 LTBP1, LTBP3, GARP (또한 LRRC32로도 공지됨) 및 LRRC33을 포함하며, 이는 제시 분자-프로TGFβ1 복합체 (LLC), 즉 각각 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1을 형성할 수 있다. 사실상, LTBP1 및 LTBP3은 세포외 매트릭스 (ECM)의 성분이며; 따라서, LTBP1-프로TGFβ1 및 LTBP3-프로TGFβ1은 ECM-회합된 TGFβ1 신호전달/활성을 매개하는 "ECM-회합된" (또는 "매트릭스-회합된") 프로TGFβ1 복합체로 집합적으로 지칭될 수 있다. 다른 한편으로는, GARP 및 LRRC33은 특정 세포의 세포 표면 상에 발현된 막횡단 단백질이고; 따라서, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1은 세포-회합된 (예를 들어, 면역 세포-회합된) TGFβ1 신호전달/활성을 매개하는 "세포-회합된" (또는 "세포-표면") 프로TGFβ1 복합체로 집합적으로 지칭될 수 있다.

(용매 노출로부터의) 보호: 단백질-단백질 상호작용, 예컨대 항체-항원 결합의 HDX-MS-기반 평가와 관련하여, 단백질 (예를 들어, 에피토프를 함유하는 단백질의 영역)이 용매에 노출되어 양성자 교환이 일어나게 하는 정도는 결합/상호작용의 정도와 역으로 상관된다. 따라서, 본원에 기재된 항체가 항원의 영역에 결합하는 경우에, 단백질-단백질 상호작용은 결합 영역에 주위 용매가 접근가능하지 못하게 하기 때문에 결합 영역은 용매에 노출되는 것으로부터 "보호된다". 따라서, 보호된 영역은 상호작용 부위를 나타낸다. 전형적으로, 적합한 용매는 생리학적 완충제이다.

프로TGFβ1: 본원에 사용된 용어 "프로TGFβ1"은 복합체 내에 TGFβ1의 프로도메인 서열을 포함하는 불활성 TGFβ1 이량체 복합체의 전구체 형태를 포괄하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어는 TGFβ1의 프로-, 뿐만 아니라 잠재성-형태를 포함할 수 있다. 표현 "프로/잠재성 TGFβ1"은 상호교환가능하게 사용될 수 있다. TGFβ1의 "프로" 형태는 푸린 부위에서의 단백질분해적 절단 전에 존재한다. 절단되면, 생성된 형태는 TGFβ1의 "잠재성" 형태인 것으로 언급된다. "잠재성" 복합체는 추가의 활성화, 예컨대 인테그린-구동 활성화 사건이 촉발될 때까지 회합된 채로 남아있다. 프로TGFβ1 복합체는 디술피드 결합으로 연결된 이량체 TGFβ1 프로-단백질 폴리펩티드로 구성된다. 잠재성 이량체 복합체는 각각의 프로TGFβ1 폴리펩티드의 위치 4에서의 시스테인 잔기 (Cys4)를 통해 단일 제시 분자에 공유 연결된다. 형용사 "잠재성"은 일반적으로 인테그린-매개 또는 다른 활성화 사건 전의 TGFβ1의 "불활성" 상태를 기재하는데 사용될 수 있다. 프로TGFβ1 폴리펩티드는 프로도메인 (LAP) 및 성장 인자 도메인 (서열식별번호: 24)을 함유한다.

퇴행: 종양 또는 종양 성장의 퇴행은 생체내 효능 척도로서 사용될 수 있다. 전임상 세팅에서, 중앙 종양 부피 (MTV) 및 퇴행 반응 치료 효능에 대한 기준은 마지막 날에 연구에 남아있는 동물의 종양 부피로부터 결정될 수 있다. 치료 효능은 또한 연구 동안 관찰된 퇴행 반응의 발생률 및 규모로부터 결정될 수 있다. 치료는 동물에서 종양의 부분 퇴행 (PR) 또는 완전 퇴행 (CR)을 유발할 수 있다. 요법 (예를 들어, 약물의 투여)에 반응하여 달성된 완전 퇴행은 "완전 반응"으로 지칭될 수 있고, 완전 반응을 달성한 대상체는 "완전 반응자"로 지칭될 수 있다. 전임상 종양 모델의 일부 실시양태에서, PR 반응은 연구 과정 동안 3회 연속 측정에 대해 그의 제1일 부피의 50% 이하이고, 이들 3회의 측정 중 1회 이상에 대해 13.5 mm³ 이상인 종양 부피로서 정의된다. 일부 실시양태에서, CR 반응은 연구 과정 동안 3회 연속 측정에 대해 13.5 mm³ 미만인 종양 부피로서 정의된다. 전임상 모델에서, 연구 종료 시에 CR 반응을 갖는 동물은 무종양 생존자 (TFS)로서 추가로 분류될 수 있다. 용어 "유효 종양 제어"는 치료에 반응하여 달성된 종양 퇴행의 정도를 지칭하는데 사용될 수 있으며, 여기서 예를 들어 종양 부피는 종점 종양 부피의 <25%로 감소된다. 예를 들어, 특정한 모델에서, 종점 종양 부피가 2,000 mm³인 경우에, 종양이 500 mm³ 미만으로 감소된 경우에 유효 종양 제어가 달성된다. 따라서, 유효 종양 제어는 완전 퇴행, 뿐만 아니라 역치 감소에 도달한 부분 퇴행을 포괄한다. 유사하게, 섬유증의 퇴행은 요법 예컨대 TGFβ1 억제제의 생체내 효능 척도로서 사용될 수 있다. 섬유화 상태의 퇴행은 질환 병기별 섬유화 징후의 중증도를 평가하기 위한 표준 기준에 기초하여 결정될 수 있다.

조절 T 세포: "조절 T 세포" 또는 Treg는 바이오마커 CD4, FOXP3, 및 CD25의 발현을 특징으로 하는 면역 세포의 유형이다. Treg는 때때로 억제 T 세포로 지칭되며, 면역계를 조정하고, 자기-항원에 대한 관용을 유지하고, 자가면역 질환을 예방하는 T 세포의 하위집단을 나타낸다. Treg는 면역억제성이고, 일반적으로 이펙터 T (Teff) 세포의 유도 및 증식을 억제하거나 하향조절한다. Treg는 흉선에서 발생할 수 있거나 (소위 CD4+ Foxp3+ "천연" Treg), 또는 예를 들어 TGFβ 또는 레티노산에의 노출 후에 말초에서 나이브 CD4+ T 세포로부터 분화될 수 있다. Treg는 세포 표면 GARP-프로TGFβ1을 발현할 수 있다.

(요법에 대한) 저항성: 특정한 요법 (예컨대 CBT)에 대한 저항성은 질환, 예컨대 암의 선천성 특징으로 인한 것일 수 있거나 ("1차 저항성"), 또는 치료 후 시간 경과에 따라 발생하는 획득 표현형으로 인한 것일 수 있다 ("획득 저항성"). 요법에 대해 치료 반응을 나타내지 않는 환자 (예를 들어, 요법에 대해 비-반응자이거나 또는 불량하게 반응성인 자)는 요법에 대해 1차 저항성을 갖는 것으로 언급되고, 1차 비-반응자로서 특징화될 수 있다. 초기에 요법에 대한 치료 반응을 나타내지만 나중에 효과를 상실한 (예를 들어, 계속된 요법에도 불구하고 진행 또는 재발) 환자는 요법에 대한 획득 저항성을 갖는 것으로 언급된다.

고형 종양의 반응 평가 기준 (RECIST) 및 iRECIST: RECIST는 암 환자에서의 종양이 치료 동안 개선 ("반응")되거나, 동일하게 유지 ("안정화")되거나, 또는 악화 ("진행")된 경우를 정의하는 공개된 규칙 세트이다. 기준은 유럽 암 연구 및 치료 기구 (EORTC), 미국 국립 암 연구소 및 캐나다 임상 시험 그룹의 국립 암 연구소를 비롯한 국제적 협력에 의해 2000년 2월에 공개되었다. 후속적으로, RECIST 가이드라인의 개정된 버전 (RECIST v 1.1)이 광범위하게 채택되었다 (문헌 [Eisenhauera et al., (2009), "New response evaluation criteria in solid tumours: Revised RECIST guideline (version 1.1)" Eur J Cancer 45: 228-247] 참조, 본원에 포함됨). 반응 기준은 하기와 같다: 완전 반응 (CR): 모든 표적 병변의 소멸; 부분 반응 (PR): 기준선 합계 LD를 참조하여, 표적 병변의 LD의 합계에서 적어도 30% 감소; 안정 질환 (SD): 치료를 시작한 이후 최소 합계 LD를 참조하여, PR 자격을 갖기에 충분한 수축도 아니고 PD 자격을 갖기에 충분한 증가도 없음; 진행성 질환 (PD): 치료를 시작한 이후 기록된 최소 합계 LD를 참조하여, 표적 병변의 LD의 합계에서 적어도 20% 증가 또는 1개 이상의 새로운 병변의 출현. 다른 한편으로는, iRECIST는 면역-관련 반응을 고려한 변형된 기준 세트를 제공한다. www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5648544/를 참조한다. RECIST 및 iRECIST 기준은 표준화되어 있고, 보다 많은 데이터가 이용가능해짐에 따라 때때로 수정될 수 있고, 관련 기술분야에서 널리 이해된다.

고형 종양: 용어 "고형 종양"은 통상적으로 낭 또는 액체 영역을 함유하지 않는 조직의 비정상적 성장 또는 덩이를 발생시키는 증식성 장애를 지칭한다. 고형 종양은 양성 (비-암성) 또는 악성 (암성)일 수 있다. 고형 종양은 전형적으로 암성 (악성) 세포, 기질 세포, 예컨대 CAF, 및 침윤 백혈구, 예컨대 대식세포 및 림프구를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다중 세포 유형으로 구성된다. TGFβ1의 이소형-선택적 억제제, 예컨대 본원에 기재된 것으로 치료될 고형 종양은 전형적으로 TGFβ1-양성 (TGFβ1+) 종양이다.

용액 평형 적정 (SET): SET는 2종의 분자 (예컨대 항원 및 항원에 결합하는 항체) 사이의 결합을 용액 중 평형에서 측정할 수 있는 검정이다. 예를 들어, 메소-스케일 디스커버리 ("MSD")-기반 SET 또는 MSD-SET는 평형에서의 특히 고친화도 단백질-단백질 상호작용, 예컨대 그의 항원에 결합하는 피코몰-친화도 항체에 대한 해리 상수를 결정하는 유용한 모드이다 (예를 들어, 문헌 [Ducata et al., (2015) J Biomolecular Screening 20(10): 1256-1267] 참조). SET-기반 검정은 나노몰-미만 (예를 들어, 피코몰) 친화도를 갖는 항체의 KD 값을 결정하는데 특히 유용하다.

특이적 결합: 본원에 사용된 용어 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합한다"는 항체 또는 그의 항원-결합 부분과 항원 또는 아미노산 잔기의 상호작용이 특정한 구조 (예를 들어, 항원 결정기 또는 에피토프)의 존재에 의존한다는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 일반적 단백질보다는 특이적 단백질에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 항체가 표적, 예를 들어 TGFβ1에 대해 적어도 약 10^-9 M, 10^-10 M, 10^-11 M, 10^-12 M, 또는 그 미만의 KD를 갖는 경우에 표적에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 사용된 용어 "프로TGFβ1의 에피토프에 대한 특이적 결합", "프로TGFβ1의 에피토프에 특이적으로 결합하다", "프로TGFβ1에 대한 특이적 결합", 또는 "프로TGFβ1에 특이적으로 결합한다"는 프로TGFβ1에 결합하고 적합한 시험관내 결합 검정에 의해 결정된 바와 같이 1.0 x 10^-8 M 이하의 해리 상수 (KD)를 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 지칭한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 프로TGFβ1의 인간 및 비-인간 (예를 들어, 마우스) 오르토로그 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있다.

대상체: 치료 용도와 관련하여 용어 "대상체"는 임상 관리 또는 개입, 예컨대 치료, 진단 등을 받는 개체를 지칭한다. 적합한 대상체는 포유동물 (예를 들어, 인간 및 비-인간 포유동물)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 척추동물을 포함한다. 대상체가 인간 대상체인 경우에, 용어 "환자"는 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 임상 상황에서, 용어 "환자 집단" 또는 "환자 하위집단"은 일련의 기준, 예컨대 임상 기준 (예를 들어, 질환 제시, 질환 병기, 특정 상태에 대한 감수성, 요법에 대한 반응성 등), 의료 병력, 건강 상태, 성별, 연령 군, 유전적 기준 (예를 들어, 특정 돌연변이, 다형성, 유전자 중복, DNA 서열 반복부 등의 보인자) 및 생활방식 인자 (예를 들어, 식이, 흡연, 알콜 소모, 운동 등) 내에 속하는 개체의 군을 지칭하는데 사용된다.

표적 결속: 본원에 사용된 용어 표적 결속은 생체내 그의 의도된 표적 (예를 들어, 내인성 TGFβ)에 결합하는 분자 (예를 들어, TGFβ 억제제)의 능력을 지칭한다. 활성화 억제제의 경우에, 의도된 표적은 대형 잠재성 복합체일 수 있다.

TGFβ1-관련 적응증: "TGFβ1-관련 적응증"은 TGFβ1의 발현, 활성 및/또는 대사와 관련된 임의의 질환, 장애 및/또는 상태 또는 TGFβ1의 활성 및/또는 수준의 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 질환, 장애 및/또는 상태를 의미한다. 특정 TGFβ1-관련 적응증은 TGFβ1 이소형에 의해 우세하게 구동된다. TGFβ1-관련 적응증은 섬유화 상태 (예컨대 기관 섬유증, 및 만성 염증을 수반하는 조직의 섬유증), 증식성 장애 (예컨대 암, 예를 들어, 고형 종양 및 골수섬유증), ECM 조절이상과 연관된 질환 (예컨대 매트릭스 강직화 및 재형성을 수반하는 상태), 내피-중간엽 이행 (EndMT)을 수반하는 질환, 상피-중간엽 이행 (EMT)을 수반하는 질환, 프로테아제를 수반하는 질환, 본원에 기재된 특정 마커의 이상 유전자 발현을 갖는 질환을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 질환 카테고리는 상호 배타적인 것으로 의도되지 않는다.

TGFβ 억제제: 용어 "TGFβ 억제제"는 TGFβ 성장 인자 (예를 들어, TGFβ1, TGFβ2 및/또는 TGFβ3)의 생물학적 활성, 신호전달 또는 기능을 길항할 수 있는 임의의 작용제를 광범위하게 지칭한다. 용어는 그의 작용 메카니즘을 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 예를 들어 TGFβ의 중화 항체, 수용체 길항제 (예를 들어, 키나제 억제제), 가용성 리간드 트랩, 및 활성화 억제제를 포함한다. 비-선택적 TGFβ 억제제는 통상적으로 TGFβ의 "범-억제제"로 지칭된다. TGFβ 억제제는 또한, 예를 들어 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 및/또는 항체-의존성 세포성 식세포작용 (ADPC)을 유도함으로써 함요에서 활성화될 수 있는 잠재성 프로TGFβ의 이용가능성을 감소시킬 수 있는 항체, 뿐만 아니라 잠재성 프로TGFβ를 포함하는 세포-표면 복합체의 내재화를 발생시켜, 세포 자체를 고갈시키지 않으면서 형질 막으로부터 전구체를 제거하는 항체를 포함한다. 내재화는 세포 표면 상에서 LRRC33-함유 단백질 복합체 (예컨대 인간 LRRC33-프로TGFβ1)를 발현하는 세포의 감소된 수준을 발생시키는 LRRC33-함유 단백질 복합체에 대한 적합한 작용 메카니즘일 수 있다.

"TGFβ 패밀리"는 TGFβ 슈퍼패밀리 내의 부류이고, 인간에서는 구조적으로 유사하고 개별 유전자에 의해 코딩된 3종의 구성원: TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3을 함유한다. 3종의 성장 인자는 동일한 수용체를 통해 신호를 전달하는 것으로 공지되어 있다.

치료 범위: 용어 "치료 범위"는 대상체에서 유의한/관찰가능한/허용되지 않는 유해 효과를 유발하지 않으면서 (예를 들어, 허용되거나 관용되는 유해 효과 내에서) 치료 반응을 생성하는 용량/농도의 범위를 지칭한다. 치료 범위는 최소 유효 농도 (MEC) 대 최소 독성 농도 (MTC) 사이의 비로서 계산될 수 있다. 예시를 위해, 10 mg/kg에서 생체내 효능을 달성하고 100 mg/kg에서 내약성 또는 허용되는 독성을 나타내는 TGFβ1 억제제는 적어도 10배 (예를 들어, 10x)의 치료 범위를 제공한다. 대조적으로, 10 mg/kg에서 효과적이지만 5 mg/kg에서 유해 효과를 유발하는 TGFβ의 범-억제제는 "용량-제한 독성"을 갖는 것으로 언급된다. 예를 들어, Ab2는 전임상 모델, 예컨대 래트에서 약 <3 내지 30 mg/kg/주 범위의 투여량에서 효과적인 것으로 제시되었고, 또한 4주 동안 적어도 100 mg/kg/주의 TGFβ의 범-억제와 연관된 관찰가능한 독성이 없는 것으로 제시되었다. 이에 기초하면, Ab2는 최소 3.3-배 내지 최대 33-배의 치료 범위를 나타낸다.

독성: 본원에 사용된 용어 "독성" 또는 "독성들"은 대상체 (예를 들어, 환자)에게 투여되는 요법과 연관된 대상체 (예를 들어, 환자)에서의 원치 않는 생체내 효과, 예컨대 바람직하지 않은 부작용 및 유해 사건을 지칭한다. "내약성"은 독성으로 인해 요법을 중단하지 않으면서 환자에 의해 합리적으로 허용될 수 있는, 요법 또는 치료 요법과 연관된 독성의 수준을 지칭한다. 전형적으로, 독성/독성학 연구는 약물 후보 (예를 들어, 모노클로날 항체 요법)의 안전성 프로파일을 평가하기 위해 임상 개발 전에 1종 이상의 전임상 모델에서 수행된다. 독성/독성학 연구는 시험 물품의 "무관찰 부작용 수준 (NOAEL)" 및 "최대 허용 용량 (MTD)"을 결정하는 것을 도울 수 있으며, 이에 기초하여 치료 범위가 추론될 수 있다. 바람직하게는, 특정한 개입에 감수성인 것으로 나타난 종은 안전성/독성 연구가 수행되어야 하는 전임상 동물 모델로서 선택되어야 한다. TGFβ 억제의 경우에, 적합한 종은 래트, 개 및 시노를 포함한다. 마우스는 TGFβ의 약리학적 억제에 덜 감수성인 것으로 보고되어 있고, 특정 연구가 마우스에서 TGFβ의 범-억제에 의해 관찰된 독성을 보고하기는 하지만, 인간을 포함한 다른 종에서 잠재적으로 위험한 독성을 밝혀내지 못할 수 있다. 본 개시내용과 관련하여 예시하기 위해, 래트에서의 Ab2에 대한 NOAEL이 평가된 최고 용량 (100 mg/kg)이었고, 이는 4-주 독성학 연구에 기초하여 MTD가 >100 mg/kg임을 시사한다.

치료하다/치료: 용어 "치료하다" 또는 "치료"는 대상체에서 장애 또는 다른 위험 인자가 발생할 위험을 감소시키는 치유적 치료, 예방적 치료, 및 적용을 포함한다. 따라서, 용어는 예를 들어 질환 진행을 늦추고/거나, 특정 질환 특색을 역전시키고/거나, 유전자 발현을 정상화하고/거나, 신체의 면역을 증진 또는 부스팅하고/거나; 면역 억제를 감소 또는 역전시키고/거나; 신체로부터 유해 세포 또는 물질을 감소, 제거 또는 근절시키고/거나; 질환 부담 (예를 들어, 섬유증 및 종양 부담)을 감소시키고/거나; 재발 또는 재발생을 방지하고/거나; 불응성 기간을 연장시키고/거나, 달리 생존을 개선시킴으로써 환자에서 치료 이익을 유발하는 것을 광범위하게 의미하는 것으로 의도된다. 용어는 대상체에서 장애 또는 다른 위험 인자가 발생할 위험을 감소시키는 치유적 치료, 예방적 치료, 및 적용을 포함한다. 치료는 장애의 완전한 치유를 요구하지 않고, 증상 또는 기저 위험 인자를 감소시키는 실시양태를 포괄한다. 조합 요법과 관련하여, 용어는 또한 i) 부작용을 감소시키고 내약성을 증가시키기 위해 제1 치료제의 유효 투여량을 감소시키는 제2 치료제의 능력; ii) 환자가 제1 요법에 보다 반응성이 되도록 하는 제2 요법의 능력; 및/또는 iii) 상가적 또는 상승작용적 임상 이익을 달성하는 능력을 지칭할 수 있다.

종양-연관 대식세포 (TAM): TAM은 종양-촉진 표현형을 갖는 분극화된/활성화된 대식세포 (M2-유사 대식세포)이다. TAM은 종양 부위로 동원된 골수-유래 단핵구/대식세포 또는 적혈구-골수 전구세포로부터 유래된 조직-상주 대식세포일 수 있다. 단핵구/대식세포의 TAM으로의 분화는 국부 화학적 신호, 예컨대 시토카인, 케모카인, 성장 인자 및 리간드로서 작용하는 다른 분자, 뿐만 아니라 함요 (종양 미세환경)에 존재하는 단핵구/대식세포 사이의 세포-세포 상호작용을 포함한 다수의 인자에 의해 영향을 받는다. 일반적으로, 단핵구/대식세포는 소위 "M1" 또는 "M2" 하위유형으로 분극화될 수 있으며, 후자는 보다 더 종양-촉진 표현형과 연관된다. 고형 종양에서, 종양 덩이의 최대 50%가 우선적으로 M2-분극화된 대식세포에 상응할 수 있다. 종양-연관 단핵구 및 골수 세포 집단 중에서, M1 대식세포는 전형적으로 세포 표면 HLA-DR, CD68 및 CD86을 발현하고, M2 대식세포는 전형적으로 세포 표면 HLA-DR, CD68, CD163 및 CD206을 발현한다. 종양-연관, M2-유사 대식세포 (예컨대 M2c 및 M2d 하위유형)는 세포 표면 LRRC33 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1을 발현할 수 있다. M2-유사 대식세포는 또한 섬유화 미세환경에서 풍부화될 수 있다.

종양 미세환경: 용어 "종양 미세환경 (TME)"은 종양 (예를 들어, 고형 종양)이 생체내에 존재하는 국부 질환 함요를 지칭한다. TME는 질환-연관 분자 서명 (한 세트의 케모카인, 시토카인 등), 질환-연관 세포 집단 (예컨대 TAM, CAF, MDSC 등) 뿐만 아니라 질환-연관 ECM 환경 (ECM 성분 및/또는 구조의 변경)을 포함할 수 있다.

가변 영역: 용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 전형적으로 중쇄에서 대략 아미노-말단 120 내지 130개의 아미노산 및 경쇄에서 약 100 내지 110개의 아미노 말단 아미노산을 포함하는, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 부분을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 상이한 항체의 가변 영역은 동일한 종의 항체들 사이에서도 아미노산 서열이 광범위하게 상이하다. 항체의 가변 영역은 전형적으로 특정한 항체의 그의 표적에 대한 특이성을 결정한다.

작업 실시예 외에서, 또는 달리 나타낸 경우에, 본원에 사용된 성분의 양 또는 반응 조건을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 사용되는 경우에 용어 "약"은 ±1%를 의미할 수 있다.

본원의 명세서 및 청구범위에서 사용된 단수형은, 달리 명백하게 나타내지 않는 한, "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.

본원의 명세서 및 청구범위에서 사용된 어구 "및/또는"은 이와 같이 결합된 요소 중 "어느 하나 또는 둘 다", 즉 일부 경우에는 공동으로 존재하고 다른 경우에는 분리되어 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 구체적으로 확인된 요소와 관련되든 관련되지 않든, "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인된 요소 외의 다른 요소가 임의로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 언급은, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용되는 경우에, 한 실시양태에서, B가 없는 A (B 외의 요소를 임의로 포함함); 또 다른 실시양태에서, A가 없는 B (A 외의 요소를 임의로 포함함); 또 다른 실시양태에서, A 및 B 둘 다 (다른 요소를 임의로 포함함) 등을 지칭할 수 있다.

하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 본원의 명세서 및 청구범위에서 사용된 어구 "적어도 하나"는 요소의 목록에서 요소 중 어느 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 열거된 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함하는 것은 아니며, 요소의 목록에서 요소의 임의의 조합을 배제하는 것은 아닌 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한, 구체적으로 확인된 요소와 관련되든 관련되지 않든, 어구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소의 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소 외의 요소가 임의로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나" (또는 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 한 실시양태에서, B가 존재하지 않는, 임의로 하나 초과를 포함한 적어도 하나의 A (및 임의로 B 외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서, A가 존재하지 않는, 임의로 하나 초과를 포함한 적어도 하나의 B (및 임의로 A 외의 요소를 포함함); 또 다른 실시양태에서, 임의로 하나 초과를 포함한 적어도 하나의 A, 및 임의로 하나 초과를 포함한 적어도 하나의 B (및 임의로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.

청구범위에서 "제1", "제2", "제3" 등과 같은 서수 용어를 사용하여 청구범위 요소를 수식하는 것은 그 자체로 한 청구범위 요소의 또 다른 것에 대한 임의의 우선순위, 우위 또는 순서, 또는 방법의 행위가 수행되는 시간적 순서를 내포하는 것이 아니라, 단지 특정 명칭을 갖는 한 청구범위 요소를 (서수 용어를 사용하는 것을 제외하고) 동일한 명칭을 갖는 또 다른 요소와 구별하여 청구범위 요소를 구별하기 위한 라벨로서 사용된다.

본원에 제공된 범위는 범위 내의 모든 값에 대한 약칭인 것으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 50의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50으로 이루어진 군으로부터의 임의의 숫자, 숫자의 조합, 또는 하위-범위, 예를 들어 10-20, 1-10, 30-40 등을 포함하는 것으로 이해된다.

형질전환 성장 인자-베타 (TGFβ)

형질전환 성장 인자-베타 (TGFβ) 활성 및 가용성 성장 인자의 후속 부분 정제는 1970년대 후반부터 1980년대 초반에 최초로 기재되었으며, 이에 의해 TGFβ 분야는 약 40년 전에 시작되었다. 지금까지, 대형 TGFβ 슈퍼패밀리를 구성하는 33종의 유전자 생성물이 확인되었다. TGFβ 슈퍼패밀리는 구조적 유사성에 의해 적어도 3종의 하위부류: TGFβ, 성장-분화 인자 (GDF) 및 골-형태발생 단백질 (BMP)로 카테고리화될 수 있다. TGFβ 하위부류는 인간에서 3종의 개별 유전자에 의해 코딩되는 3종의 고도로 보존된 이소형, 즉 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3으로 구성된다.

TGFβ는 다양한 과정, 예컨대 세포 증식의 억제, 세포외 매트릭스 (ECM) 재형성 및 면역 항상성에서 주요 역할을 하는 것으로 생각된다. T 세포 항상성을 위한 TGFβ1의 중요성은 TGFβ1-/- 마우스가 단지 3-4주 생존하며, 대량 면역 활성화로 인한 다기관 부전으로 사망한다는 관찰에 의해 입증된다 (Kulkarni, A.B., et al., Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(2): p. 770-4; Shull, M.M., et al., Nature, 1992. 359(6397): p. 693-9). TGFβ2 및 TGFβ3의 역할은 덜 명확하다. 3종의 TGFβ 이소형은 별개의 시간적 및 공간적 발현 패턴을 갖지만, 동일한 수용체, TGFβRI 및 TGFβRII를 통해 신호전달하며, 일부 경우에, 예를 들어 TGFβ2 신호전달의 경우는, 유형 III 수용체, 예컨대 베타글리칸이 또한 요구된다 (Feng, X.H. and R. Derynck, Annu Rev Cell Dev Biol, 2005. 21: p. 659-93; Massague, J., Annu Rev Biochem, 1998. 67: p. 753-91). TGFβRI/II의 리간드-유도된 올리고머화는 SMAD 전사 인자의 인산화를 촉발시켜 표적 유전자, 예컨대 Col1a1, Col3a1, ACTA2, 및 SERPINE1의 전사를 발생시킨다 (Massague, J., J. Seoane, and D. Wotton, Genes Dev, 2005. 19(23): p. 2783-810). SMAD-비의존성 TGFβ 신호전달 경로가 또한, 예를 들어 마르팡 마우스의 암 또는 대동맥 병변에서 기재되었다 (Derynck, R. and Y.E. Zhang, Nature, 2003. 425(6958): p. 577-84; Holm, T.M., et al., Science, 2011. 332(6027): p. 358-61).

인간에서의 TGFβ 경로의 생물학적 중요성은 유전 질환에 의해 검증되었다. 카무라티-엥겔만병은 TGFβ1 신호전달의 구성적 활성화를 초래하는 TGFB1 유전자의 상염색체 우성 돌연변이로 인해 골 이형성증을 발생시킨다 (Janssens, K., et al., J Med Genet, 2006. 43(1): p. 1-11). 로이스/디에츠 증후군을 갖는 환자는 대동맥류, 양안과다격리증, 및 이분구개수를 유발하는 TGFβ 신호전달 경로의 성분에서의 상염색체 우성 돌연변이를 보유한다 (Van Laer, L., H. Dietz, and B. Loeys, Adv Exp Med Biol, 2014. 802: p. 95-105). TGFβ 경로 조절이상은 다중 질환에 연루되어 있기 때문에, TGFβ 경로를 표적화하는 여러 약물이 개발되어 환자에서 시험되었지만, 성공은 제한적이었다.

TGFβ 신호전달의 조절이상은 광범위한 인간 질환과 연관되어 왔다. 실제로, 다수의 질환 상태에서, 이러한 조절이상은 TGFβ 기능의 다중 양상을 수반할 수 있다. 이환 조직, 예컨대 섬유화 및/또는 염증발생 조직 및 종양은 TGFβ 활성화가 질환의 악화 또는 진행을 유발할 수 있는 국부 환경을 생성할 수 있으며, 이는 특정한 질환 세팅에서 소정의 역할을 하는 다수의 다른 시토카인, 케모카인 및 성장 인자와 함께 자가분비 및/또는 주변분비 방식으로 활성화되는 다중 TGFβ-반응성 세포 사이의 상호작용에 의해 적어도 부분적으로 매개될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 실시예는 하기 도면: 도 1 - 도 31을 참조한다.

신규하고 고도로 강력한 TGFβ1-선택적 억제제

본 개시내용은, 예를 들어 표면 플라즈몬 공명 (SPR)에 의해 측정된 바와 같이, 각각의 4종의 공지된 인간 LLC (hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1)에 높은 친화도 (예를 들어, 1 nM 미만의 K_D) 및 느린 해리율 (즉, 낮은 k_오프 값)로 결합할 수 있는 신규 모노클로날 항체 및 그의 항원-결합 단편을 제공한다. 신규 항체 및 단편은 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제이다. 이러한 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 및 L-CFR3을 포함하며, 여기서 H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고; H-CDR2는 식 ISGSGX₁AT에 의해 나타내어지는 서열을 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 A 또는 K이고 (서열식별번호: 277); H-CDR3은 식 VSSGX₁WDX₂D에 의해 나타내어지는 서열을 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 H, D 또는 Q이고, 여기서 추가로 임의로 X₂는 F 또는 Y이고 (서열식별번호: 278); L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고; L-CDR2는 식 AASX₁X₂X₃X₄에 의해 나타내어지는 서열을 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 N, G 또는 V이고; 여기서 추가로 임의로 X₂는 L, N 또는 E이고; 여기서 추가로 임의로 X₃은 Q 또는 E이고; 여기서 추가로 임의로 X₄는 S 또는 T이고 (서열식별번호: 280); L-CDR3은 식 QQTYX₁VPLT에 의해 나타내어지는 서열을 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 T 또는 G이다 (서열식별번호: 281). 바람직한 실시양태에서, H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고; H-CDR3은 VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)를 포함하고; L-CDR2는 AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함하고; L-CDR3은 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 프로TGFβ1 폴리펩티드 서열의 하기 아미노산 잔기: S35, G37, E38, V39, P40, P41, G42, P43, R274, K280, H283 및 K309 중 1개 이상을 포함하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, H-CDR1은 서열 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함할 수 있고; H-CDR2는 서열 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함할 수 있고; H-CDR3은 식 VSSGX₁WDX₂D에 의해 나타내어지는 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 임의로 X₁은 H 또는 Q이고, 여기서 추가로 임의로 X₂는 Y 또는 F이고 (서열식별번호: 283); L-CDR1은 서열 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함할 수 있고; L-CDR2는 서열 AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함할 수 있고; L-CDR3은 서열 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, H-CDR3은 VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 프로TGFβ1 폴리펩티드 서열의 하기 아미노산 잔기: S35, G37, E38, V39, P40, P41, G42, P43, R274, K280, H283 및 K309 중 1개 이상을 포함하는 에피토프에 결합한다.

하기 표는 유용한 변이체의 CDR 서열을 제공한다.

표 1: 예시적인 항체의 CDR 서열

임의로, 6개의 CDR 중 1개 이상은 1개 이상 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변화를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 사용 또는 제작을 위해 선택된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3, L-CDR1, L-CDR2 및 L-CFR3을 포함하며, 여기서 H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고; H-CDR2는 식 ISGSGX₁AT에 의해 나타내어지는 서열을 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 A 또는 K이고 (서열식별번호: 277); H-CDR3은 식 VSSGX₁WDX₂D에 의해 나타내어지는 서열을 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 H, D 또는 Q이고, 여기서 추가로 임의로 X₂는 F 또는 Y이고 (서열식별번호: 278); L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고; L-CDR2는 식 AASX₁X₂X₃X₄에 의해 나타내어지는 서열을 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 N, G 또는 V이고; 여기서 추가로 임의로 X₂는 L, N 또는 E이고; 여기서 추가로 임의로 X₃은 Q 또는 E이고; 여기서 추가로 임의로 X₄는 S 또는 T이고 (서열식별번호: 280); L-CDR3은 식 QQTYX₁VPLT에 의해 나타내어지는 서열을 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 T 또는 G이다 (서열식별번호: 281). 바람직한 실시양태에서, H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고; H-CDR3은 VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)를 포함하고; L-CDR2는 AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함하고; L-CDR3은 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 프로TGFβ1 폴리펩티드 서열의 하기 아미노산 잔기: S35, G37, E38, V39, P40, P41, G42, P43, R274, K280, H283 및 K309 중 1개 이상을 포함하는 에피토프에 결합한다.

하기 표는 유용한 변이체의 CDR 서열을 추가로 제공한다.

표 2: CDR 변이체

일부 실시양태에서, 6개의 CDR 중 1개 이상은 1개 이상 (예를 들어, 1 또는 2개)의 아미노산 변화를 포함할 수 있다.

TGFβ1의 바람직한 활성화 억제제의 비제한적 예가 하기 표에 제공되며, 이는 본원에서 Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51 및 Ab52로 지칭된다. 각각의 이들 항체는 전체 이뮤노글로불린 (예컨대 IgG) 또는 그의 항원-결합 단편, 예컨대 Fab 단편의 형태일 수 있다. 항원-결합 단편은 단편 또는 그의 유도체를 포함하는 조작된 구축물, 예컨대 TGFβ1 억제제로서 기능하는 이중특이적 항체 및 다른 융합 단백질을 제조하는데 사용될 수 있다. 각각의 예시적인 항체의 6개의 CDR이 하기 표에 열거된다.

표 3: 예시적인 CDR 서열

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 도메인 (V_H) 및 경쇄 가변 도메인 (V_L)을 포함하며, 여기서 V_H는 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYAMTWVRQAPGKGLEWVSAISGSGAATYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSSGHWDYDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 297)에 대해 적어도 90% (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 여기서 V_L은 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASGLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYGVPLTFGGGTKVEIK (서열식별번호: 298)에 대해 적어도 90% (예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%) 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 프로TGFβ1 폴리펩티드 서열의 하기 아미노산 잔기: S35, G37, E38, V39, P40, P41, G42, P43, R274, K280, H283 및 K309 중 1개 이상을 포함하는 에피토프에 결합한다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 도메인 (V_H) 및 경쇄 가변 도메인 (V_L)을 포함하며, 여기서 V_H는 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYAMTWVRQAPGKGLEWVSAISGSGAATYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSSGHWDYDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 297)를 포함하고, V_L은 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASGLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYGVPLTFGGGTKVEIK (서열식별번호: 298)를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 중쇄 가변 도메인 (V_H) 및 경쇄 가변 도메인 (V_L)을 포함하며, 여기서 V_H는 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYAMTWVRQAPGKGLEWVSAISGSGAATYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSSGHWDFDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 299)를 포함하고, 여기서 V_L은 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDFATYYCQQTYTVPLTFGGGTKVEIK (서열식별번호: 300)를 포함한다.

본 발명은 상기 제공된 아미노산 서열 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 핵산 서열을 포함하는 벡터 (예를 들어, DNA 플라스미드, 예컨대 포유동물 발현 벡터, 및 관련 핵산 제제); 벡터(들)로 형질감염된 세포; 핵산의 안정한 발현을 갖는 세포주; 세포를 포함하는 세포 배양물이며, 임의로 항체를 대규모 생산할 수 있는 포유동물 세포 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 단백질 구축물을 포함하는 세포 배양물이 본원에 포괄된다.

일부 실시양태에서, TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)에 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRH1); ISGSGAAT (서열식별번호: 282)에 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDRH2); VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)에 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDRH3); QSISSY (서열식별번호: 279)에 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRL1); AASGLES (서열식별번호: 284)에 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDRL2); 및 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)에 제시된 서열과 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDRL3)을 포함한다.

일부 실시양태에서, TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)에 제시된 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRH1); ISGSGAAT (서열식별번호: 282)에 제시된 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDRH2); VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)에 제시된 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDRH3); QSISSY (서열식별번호: 279)에 제시된 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRL1); AASGLES (서열식별번호: 284)에 제시된 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDRL2); 및 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)에 제시된 서열과 적어도 96% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDRL3)을 포함한다.

일부 실시양태에서, TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)에 제시된 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRH1); ISGSGAAT (서열식별번호: 282)에 제시된 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDRH2); VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)에 제시된 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDRH3); QSISSY (서열식별번호: 279)에 제시된 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRL1); AASGLES (서열식별번호: 284)에 제시된 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDRL2); 및 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)에 제시된 서열과 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDRL3)을 포함한다.

일부 실시양태에서, TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)에 제시된 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRH1); ISGSGAAT (서열식별번호: 282)에 제시된 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDRH2); VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)에 제시된 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDRH3); QSISSY (서열식별번호: 279)에 제시된 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRL1); AASGLES (서열식별번호: 284)에 제시된 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDRL2); 및 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)에 제시된 서열과 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDRL3)을 포함한다.

일부 실시양태에서, TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRH1); ISGSGAAT (서열식별번호: 282)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDRH2); VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDRH3); QSISSY (서열식별번호: 279)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRL1); AASGLES (서열식별번호: 284)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDRL2); 및 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)에 제시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDRL3)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 서열식별번호: 297에 대해 적어도 95% 동일성, 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성, 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 297을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 중쇄 가변 도메인 (V_H); 및 서열식별번호: 298에 대해 적어도 95% 동일성, 96% 동일성, 97% 동일성, 98% 동일성, 99% 동일성을 갖는 서열을 포함하거나, 서열식별번호: 298을 포함하거나, 또는 그로 이루어진 경쇄 가변 도메인 (V_L)을 포함한다.

신규 항체의 결합 동역학

본원에 개시된 신규 항체 및 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab)은 증진된 결합 특성을 특징으로 한다. 항체 및 단편은 각각의 제시 분자-프로TGFβ1 복합체 (때때로 "대형 잠재성 복합체" 또는 LLC로 지칭됨, 이는 단일 제시 분자에 커플링된 프로TGFβ1 이량체로 구성된 3원 복합체임), 즉 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1에 특이적으로 결합할 수 있다. 재조합적으로 생산된, 정제된 단백질 복합체는 적합한 시험관내 결합 검정에서 항원 복합체에 결합하는 항체의 능력을 스크리닝, 평가 또는 확인하기 위한 항원 (예를 들어, 항원 복합체)으로서 사용될 수 있다. 이러한 검정은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 생물층 간섭측정법 (BLI)-기반 검정 (예컨대 옥테트®) 및 표면 플라즈몬 공명 (SPR)-기반 검정 (예컨대 비아코어®)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

이전에, LLC에 대해 높은 친화도 (예를 들어, 나노몰 미만의 K_D)를 나타내는 항체 및 단편이 확인되었다. 여기서, 유리하게는, 특히 지속적인 억제 효과를 달성하는 것을 목표로, 특히 느린 해리율을 갖는 항체 및 단편을 특이적으로 선택하였다.

따라서, 본 개시내용에 따른 방법 및 치료 용도를 수행하기 위한 적합한 TGFβ 억제제의 선택은 시험관내 결합 검정을 수행하여 결합 동역학을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 단편은 각각의 하기의 대형 잠재성 복합체: hLTBP1-프로Tc, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1에 나노몰-미만의 친화도로, 예를 들어, 1.0 nM 이하의 K_D로, 및 10E-4 (1/s) 이하의 k_오프로 결합한다. 바람직하게는, 항체 또는 단편은 추가로 각각의 뮤린 LLC 대응물, 즉 mLTBP1-프로TGFβ1, mLTBP3-프로TGFβ1, mGARP-프로TGFβ1 및 mLRRC33-프로TGFβ1에 인간 LLC와 등가의 친화도로 결합한다. 시험관내 결합 동역학은 시험 항체 (예컨대 항원-결합 단편) 및 적합한 항원, 예컨대 대형 잠재성 복합체 (LLC) 및 소형 잠재성 복합체 (SLC)의 상호작용을 측정함으로써 용이하게 결정될 수 있다. 결합 동역학의 파라미터를 결정하기 위한 시험관내 결합 검정에 적합한 방법은 BLI-기반 검정, 예컨대 옥테트®, 및 표면 플라즈몬 공명-기반 검정, 예컨대비아코어 ® 시스템을 포함한다. 옥테트-기반 시험관내 결합 검정의 예가 도 1에 제공된다. SPR-기반 시험관내 결합 검정의 예가 도 2에 제공된다. 둘 다 TGFβ1의 활성화 억제제인 Ab46 및 참조 항체의 Fab 단편이 이러한 실험에 사용되었다. 도 2에 예시된 바와 같이, 2개의 Fab는 유사한 "온" 레이트 (k_온)를 가지며, 이는 이들이 유사한 레이트로 항원과 결속 (즉, 회합)한다는 것을 나타낸다. 그러나, 그의 "오프" 레이트 (k_오프)는 Ab46의 t_1/2이 130분을 초과하는 반면, 참조 항체는 단지 2.4분의 t_1/2 값을 갖는다는 점에서 현저하게 상이하며, 이는 상호작용의 결합/회합 단계가 유사한 동역학으로 발생하더라도, Ab46이 비교적 빠르게 항원으로부터 "떨어지는" (예를 들어, 해리되는) 참조 항체보다 훨씬 더 긴 지속 기간 (예를 들어, 더 큰 t_1/2) 동안 항원에 결합된 상태로 유지될 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서, 해리 동역학의 차이는 우세하게 그의 전체 친화도에서의 주목할 만한 차이 (K_D)에 기여하며, 이는 증진된 효력을 발생시킬 수 있다 (하기 참조). 따라서, 결합 동역학의 특징화는 효과의 잠재적 지속성 및 생체내 효력 생성에 관한 유용한 정보를 제공한다.

따라서, 본 발명은 SPR에 의해 측정된 바와 같이 10.0e-4 (s^-1) 이하의 해리율을 갖는 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 선택을 포함하는, 치료 용도를 위한 TGFβ 활성화 억제제를 선택하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 1 nM 미만 (즉, 나노몰 미만), 예를 들어 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 또는 50 pM 미만의 친화도로 항원에 결합한다.

하기 표는 옥테트®-기반 결합 검정에 의해 수득된 열거된 항체 (예를 들어, Fab)의 결합 동역학을 예시한다. 용액 중 고정된 비오티닐화된 항원 및 Fab 단편 (예를 들어, 시험 항체)을 사용하여 실험을 수행하였다.

표 4: 예시적인 항체의 옥테트 결합 동역학

이들 항체 중에서, Ab42, Ab46 및 Ab50을 추가의 평가를 위해 선택하였다. 표면 플라즈몬 공명 (SPR)을 사용하여 비아코어® 시스템을 사용하여 결합 동역학을 측정하였다. 항원 복합체에 대한 Ab42, Ab46, Ab50 및 참조 항체 ("Ref"로 제시됨)의 Fab 단편의 회합 및 해리 동역학을 측정하였고, 생성된 평형 해리 상수 (KD)를 하기에 제공한다. 8가지 유형의 LLC, 즉, hLTBP1-프로TGFβ1, mLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, mLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1, mGARP-프로TGFβ1, hLRRC33-프로TGFβ1 및 mLRRC33-프로TGFβ1을 사용하여 실험을 수행하였다.

표 5: hLTBP1-프로TGFβ1

표 6: mLTBP1-프로TGFβ1

표 7: hLTBP3-프로TGFβ1

표 8: mLTBP3-프로TGFβ1

표 9: hGARP-프로TGFβ1

표 10: mGARP-프로TGFβ1

표 11: hLRRC33-프로TGFβ1

표 12: mLRRC33-프로TGFβ1

효능; 억제 활성

본원에 개시된 항체는 TGFβ1 신호전달을 억제하는 그의 능력으로 인해 "기능적 항체"로서 광범위하게 특징화될 수 있다. 본원에 사용된 "기능적 항체"는 항원 (예를 들어, 항원 복합체)에 결합하는 그의 능력에 의해 1종 이상의 생물학적 활성을 부여한다. 따라서, 기능적 항체는 표적 분자 (즉, 항원)의 활성/기능을 조정할 수 있는 것을 광범위하게 포함한다. 이러한 조정 항체는 억제 항체 (또는 억제성 항체) 및 활성화 항체를 포함한다. 본 개시내용은 TGFβ1의 다중 콘텍스트와 연관된 TGFβ1 신호전달에 의해 매개되는 생물학적 과정을 억제할 수 있는 항체에 관한 것이다. 본 발명을 수행하는데 사용되는 억제제, 예컨대 본원에 기재된 항체는 치료 유효 용량 (허용되는 독성 수준 내에서 충분한 효능이 달성되는 용량)으로 투여되는 경우에 TGFβ1-선택적이고 TGFβ2 및 TGFβ3을 표적화하거나 방해하지 않도록 의도된다. 본 개시내용의 신규 항체는 TGFβ1의 이전에 확인된 활성화 억제제와 비교하여 증진된 억제 활성 (효력)을 갖는다.

약역학 (PD) 효과를 측정하여 억제 항체의 상대 효력을 결정할 수 있다. TGFβ 신호전달 경로에 대해 통상적으로 사용되는 PD 척도는, 비제한적으로, SMAD2/3의 인산화, 및 전사가 TGFβ 활성화에 감수성인 하류 이펙터 유전자, 예컨대 TGFβ-반응성 프로모터 요소 (예를 들어, SMAD-결합 요소)를 갖는 것의 발현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 전임상 섬유증 모델에서 동물에게 3 mg/kg 이하의 용량으로 투여되는 경우에 질환-유도된 SMAD2/3 인산화를 완전히 차단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 질환-유도된 SMAD2/3 인산화를 감소시키고/거나 완전히 차단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 (예를 들어, SMAD3에서의 임의의 변화에 관계없이) 질환-유도된 SMAD2 인산화를 감소시키고/거나 완전히 차단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 감소는 총 SMAD2/3에 대한 인산화된 SMAD2/3의 비로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 감소는 총 SMAD2에 대한 인산화된 SMAD2의 비로서 측정된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는, 예를 들어 IHC에 의해 측정된 바와 같이, 인산화된 SMAD2의 핵 국재화를 감소시킬 수 있다. 이론에 얽매이지는 않지만, 일부 실시양태에서, SMAD2 인산화를 측정하는 것은 (SMAD3은 측정하지 않음)은 치료-관련 효과의 정확한 검출을 개선시킬 수 있다. 문헌 [Denis et al., Development 143: 3481-90 (2016); Liu et al., J. Biol. Chem. 278: 11721-8 (2003); David et al., Oncoimmunology 6: e1349589 (2017)]. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 UUO 신장 섬유증 모델에서 동물에게 10 mg/kg 이하의 용량으로 투여되는 경우에, Acta2, Col1a1, Col3a1, Fn1, Itga11, Lox, Loxl2를 포함한 마커 유전자 패널의 섬유증-유도된 발현을 유의하게 억제할 수 있다.

일부 실시양태에서, 억제 항체의 효력은 적합한 세포-기반 검정, 예컨대 본원에 기재된 CAGA 리포터 검정에서 측정될 수 있다. 일반적으로, 배양된 세포, 예컨대 이종 세포 및 1차 세포는 세포-기반 효력 검정을 수행하는데 사용될 수 있다. 내인성 TGFβ1 및/또는 관심 제시 분자, 예컨대 LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33을 발현하는 세포가 사용될 수 있다. 대안적으로, 관심 단백질(들), 예컨대 TGFβ1 및/또는 관심 제시 분자, 예컨대 LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33을 코딩하는 외인성 핵산은, 예를 들어 형질감염 (예를 들어, 안정한 형질감염 또는 일시적 형질감염)에 의해 또는 바이러스 벡터-기반 감염에 의해 이러한 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, LN229 세포가 이러한 검정에 사용된다. TGFβ1 및 관심 제시 분자 (예를 들어, LTBP1, LTBP3, GARP 또는 LRRC33)를 발현하는 세포는 배양물 중에서 성장되며, 이는 세포 표면 상에 대형 잠재성 복합체를 "제시"하거나 (GARP 또는 LRRC33과 회합된 경우) 또는 ECM 내로 침착된다 (LTBP와 회합된 경우). TGFβ1의 활성화는 또 다른 세포 표면 상에서 발현된 인테그린에 의해 촉발될 수 있다. 인테그린-발현 세포는 대형 잠재성 복합체를 공동-발현하는 동일한 세포일 수 있거나, 또는 별개의 세포 유형일 수 있다. 리포터 세포는 TGFβ-반응성 요소를 포함하는 검정 시스템에 첨가된다. 이러한 방식으로, TGFβ 활성화의 정도는 TGFβ 활성화 시 리포터 세포 (예를 들어, TGFβ-반응성 리포터 유전자, 예컨대 TGFβ-반응성 프로모터 요소에 커플링된 루시페라제)로부터의 신호를 검출함으로써 측정될 수 있다. 이러한 세포-기반 검정 시스템을 사용하여, 항체의 억제 활성은 시험 항체의 존재 또는 부재 하에 리포터 신호 (예를 들어, 형광 판독에 의해 측정된 바와 같은 루시페라제 활성)의 변화 (감소) 또는 차이를 측정함으로써 결정될 수 있다.

세포-기반 효력 연구로부터의 결과가 하기 예시된다. 이들 연구에서, 인간 LM229 세포를 사용하여 TGFβ 신호전달을 억제하는 그의 능력에 있어서 시험 항체의 효력을 측정하였다. 이들 세포는 내인성 LTBP-프로TGFβ1을 발현한다. i) 모노클로날 항체 (hIgG4 이뮤노글로불린), 및 ii) 제시된 바와 같은 시험 항체의 동일한 패널의 Fab 단편을 사용하여 검정을 수행하였다.

표 13: 신규 활성화 억제제의 전장 IgG 및 Fab 단편의 시험관내 효력

벤치마크로서 사용된 참조 항체 ("참조 Ab")는 검사된 많은 신규 항체와 유사한 회합 동역학을 갖는 것으로 제시되었지만, 전체 효력은, 아마도 참조 항체와 비교하여 훨씬 더 느린 해리율을 갖는 것에 의해, 신규 항체에서 현저하게 개선되었다.

일부 실시양태에서, 세포-기반 검정 (예컨대 본원의 다른 곳에 기재된 LN229 세포 검정)에 기초하여 계산된 본 개시내용의 신규 항체의 억제 효력 (예를 들어, IC₅₀)은 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1 및 hLTBP3-프로TGFβ1 복합체에 대해 측정된 10 nM 미만일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1 및 hLTBP3-프로TGFβ1 복합체에 대해 측정된 5 nM 이하 (즉, ≤ 5 nM)의 IC50을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, hLTBP1-프로TGFβ1 및 hLTBP3-프로TGFβ1 복합체 중 적어도 1종에 대해 측정된 항체의 IC50은 1nM 미만이다. 일부 실시양태에서, 항체는 hLTBP1-프로TGFβ1 및 hLTBP3-프로TGFβ1 복합체 중 적어도 1종 및 추가로 mLTBP1-프로TGFβ1 및 mLTBP3-프로TGFβ1 복합체 중 적어도 1종에 대해 1 nM 미만의 IC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대해 10 nM 이하 (즉, ≤ 10 nM)의 IC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 각각의 hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 대해 5 nM 이하 (즉, ≤ 5 nM) (예를 들어, 1 nM 이하)의 IC50을 갖는다.

일부 실시양태에서, 효력은 효능 및/또는 약역학 효과의 척도로서 적합한 생체내 모델에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 제1 항체가 생체내 모델에서 특정 농도에서 효과적이고, 제2 항체가 동일한 생체내 모델에서 제1 항체보다 더 낮은 농도에서 동등하게 효과적인 경우에, 제2 항체는 제1 항체보다 더 강력한 것으로 언급될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 질환 모델, 예를 들어 암 모델 및 섬유증 모델은 특정한 관심 적응증에 따라 TGFβ1 억제제의 상대 효력을 평가하는데 사용될 수 있다. 바람직하게는, 각각의 시험 항체의 다중 용량 또는 농도가 이러한 연구에 포함된다.

유사하게, 약역학 (PD) 효과를 측정하여 억제 항체의 상대 효력을 결정할 수 있다. TGFβ 신호전달 경로에 대해 통상적으로 사용되는 PD 척도는, 비제한적으로, SMAD2/3의 인산화, 및 전사가 TGFβ 활성화에 감수성인 하류 이펙터 유전자, 예컨대 TGFβ-반응성 프로모터 요소 (예를 들어, SMAD-결합 요소)를 갖는 것의 발현을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 전임상 섬유증 모델에서 동물에게 3 mg/kg 이하의 용량으로 투여되는 경우에 질환-유도된 SMAD2/3 인산화를 완전히 차단할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 UUO 신장 섬유증 모델에서 동물에게 10 mg/kg 이하의 용량으로 투여되는 경우에, Acta2, Col1a1, Col3a1, Fn1, Itga11, Lox, Loxl2를 포함한 마커 유전자 패널의 섬유증-유도된 발현을 유의하게 억제할 수 있다.

결합 영역

본 개시내용과 관련하여, 항원의 "결합 영역"은 항체-항원 상호작용을 위한 구조적 근거를 제공한다. 본원에 사용된 "결합 영역"은, 생리학적 용액 중에서 프로TGFβ1 복합체 ("항원")에 결합되었을 때, 항체 또는 단편이 적합한 기술, 예컨대 수소-중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS)에 의해 결정된 바와 같이 용매 노출로부터 결합 영역을 보호하는, 항체와 항원 사이의 계면의 영역을 지칭한다.

관련 기술분야는 용액 중 단백질 입체형태 또는 단백질-단백질 상호작용을 탐구하기 위해 널리 사용되는 기술인 HDX-MS에 친숙하다. 이 방법은 단백질 백본 아미드 내의 수소의, 용액 중에 존재하는 중수소로의 교환에 의존한다. 수소-중수소 교환율을 측정함으로써, 단백질 역학 및 입체형태에 대한 정보를 수득할 수 있다 (문헌 [Wei et al., (2014) "Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry for probing higher order structure of protein therapeutics: methodology and applications." Drug Disc Today. 19(1): 95-102]에서 검토되며, 이는 참조로 포함됨). 이러한 기술의 적용은 항체-항원 복합체가 형성될 때, 결합 파트너 사이의 계면이 용매를 폐쇄하여 용매의 입체 배제로 인해 교환율을 감소시키거나 막을 수 있다는 전제를 기초로 한다.

이러한 기술을 사용하여, 프로TGFβ1의 결합 (따라서 보호된) 영역을 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서, Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52 및 그의 변이체 (예를 들어, 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 VH 서열 및 적어도 90% 서열 동일성, 예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 VL 서열을 가짐) 중 어느 하나의 결합에 중요한 것으로 확인된 프로TGFβ1 상의 부분은 아미노산 스트레치 SPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNST (서열식별번호: 261) ("제1 결합 영역")의 적어도 일부를 포함하며, 이는 통상적으로 잠재성 라쏘로 지칭되는 LAP 내의 단백질 도메인과 대부분 중첩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 LAP의 아암 도메인 내의 아미노산 서열 LREAVPE (서열식별번호: 259) ("제2 결합 영역")의 적어도 일부에 결합한다 (따라서 보호한다). 일부 실시양태에서, 항체는 아미노산 서열 WKWIHEPKGYHANFCLG (서열식별번호: 262) ("제3 결합 영역")의 적어도 일부에 결합하며 (따라서 보호하며), 이는 성장 인자 도메인 내의 소위 핑거-1과 대부분 중첩된다. 일부 실시양태에서, 항체는 SPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNST (서열식별번호: 261) ("제1 결합 영역"), LREAVPE (서열식별번호: 259) ("제2 결합 영역")의 1개 이상의 아미노산 잔기, 및/또는 WKWIHEPKGYHANFCLG (서열식별번호: 262) ("제3 결합 영역")의 1개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 프로TGFβ1 복합체의 에피토프에 결합한다.

일부 실시양태에서, 추가의 잔기(들), 예를 들어 HD-X에 의해 보호된 3개의 확인된 결합 영역 외부의 잔기는 본원에 개시된 신규 항체의 증진된 항체-항원 결합을 달성하는데 추가로 기여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로TGFβ1 폴리펩티드 서열의 성장 인자 도메인 내의 위치 309의 리신 (Lys) 잔기 (즉, K309)는 Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52 및 그의 변이체 (예를 들어, 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 V_H 서열 및 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 V_L 서열을 가짐) 중 1종 이상과의 강한 상호작용을 매개하는데 수반될 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로TGFβ1 폴리펩티드 서열의 프로도메인 내의 위치 43의 프롤린 (Pro) 잔기 (즉, P43)는 Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51, Ab52 및 그의 변이체 (예를 들어, 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 V_H 서열 및 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 V_L 서열을 가짐) 중 1종 이상과의 강한 상호작용을 매개하는데 수반될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 프로TGFβ1 폴리펩티드 서열의 하기 아미노산 잔기: S35, G37, E38, V39, P40, P41, G42, P43, R274, K280, H283 및 K309 중 1개 이상을 포함하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 P43 및 K309를 포함하는 조합 에피토프 (하기 참조)이다.

일부 실시양태에서, 제1 결합 영역 및/또는 제2 결합 영역은 항체 또는 단편의 이소형 선택성을 부여한다.

유리하게는, 본 개시내용의 바람직한 억제 항체는 잠재성 복합체로부터 성숙 성장 인자의 방출을 억제함으로써 성장 인자 신호전달을 감소시킬 수 있다. 이러한 항체는, 이러한 항체와 회합되는 경우에 성장 인자 방출 또는 활성의 감소를 발생시키는 임의의 에피토프를 표적화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 조합 에피토프, 즉 항원 또는 항원 복합체의 2개 이상의 성분/부분에 의해 형성된 에피토프에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 조합 에피토프는 단일 단백질의 다중 부분, 즉, 동일한 단백질의 1개 초과의 비-인접 절편으로부터의 아미노산 잔기의 기여에 의해 형성될 수 있다. 대안적으로, 조합 에피토프는 항원 복합체의 다중 단백질 성분의 기여에 의해 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 입체형태적 에피토프 (또는 입체형태-특이적 에피토프), 예를 들어 항원 또는 항원 복합체의 3차원 구조 (즉, 입체형태)에 감수성인 에피토프에 특이적으로 결합한다. 바람직한 실시양태에서, 조합 에피토프는 잠재성 라쏘 내의 아미노산 잔기 및 성장 인자 도메인 내의 아미노산 잔기를 포함한다.

표 14: 인간 TGFβ1 폴리펩티드의 선택된 단백질 도메인/모듈

항원 복합체 및 성분

본 개시내용의 신규 항체는 각각의 4종의 공지된 인간 대형 잠재성 복합체 (예를 들어, hLTBP1-프로TGFβ1, hLTBP3-프로TGFβ1, hGARP-프로TGFβ1 및 hLRRC33-프로TGFβ1)에 낮은 해리율로 특이적으로 결합하고, TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하고, 본원에 논의된 안전성 기준을 충족시킨다. 이러한 항체의 스크리닝 (예를 들어, 확인 및 선택)은 전형적으로 재조합적으로 생산되는 적합한 항원 복합체의 사용을 수반한다. TGFβ 이소형 및 관련 폴리펩티드, 단편 및 변이체, 제시 분자 (예를 들어, LTBP, GARP, LRRC33) 및 관련 폴리펩티드, 단편 및 변이체를 포함한, 이러한 항원 복합체를 구성할 수 있는 유용한 단백질 성분이 제공된다. 이들 성분은 발현되고, 정제되고, 단백질 복합체 (예컨대 대형 잠재성 복합체)를 형성하도록 허용될 수 있으며, 이는 항체 스크리닝 과정에 사용될 수 있다. 스크리닝은 바람직한 결합제가 결합제 및 비-결합제의 풀 또는 라이브러리로부터 선택되는 양성 선택, 및 바람직하지 않은 결합제가 풀로부터 제거되는 음성 선택을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, TGFβ1은 자연 발생 포유동물 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1은 자연 발생 인간 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1은 인간, 원숭이, 래트 또는 마우스 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ2에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ3에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ2 또는 TGFβ3에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ2 및 TGFβ3에 특이적으로 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 서열식별번호: 24에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 TGFβ1에 특이적으로 결합한다. TGFβ2의 아미노산 서열 및 TGFβ3 아미노산 서열은 각각 서열식별번호: 28 및 32에 제시된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 비-자연 발생 아미노산 서열을 포함하는 TGFβ1 (달리 본원에서 비-자연 발생 TGFβ1로 지칭됨)에 특이적으로 결합한다. 예를 들어, 비-자연 발생 TGFβ1은 자연 발생 TGFβ1 아미노산 서열에 비해 1개 이상의 재조합적으로 생성된 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1, TGFβ2, 또는 TGFβ3 아미노산 서열은 표 10에 제시된 바와 같은 서열식별번호: 24-35에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1, TGFβ2, 또는 TGFβ3 아미노산 서열은 표 11에 제시된 바와 같은 서열식별번호: 36-43에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

TGFβ1 (프로도메인 + 성장 인자 도메인) LSTCKTIDMELVKRKRIEAIRGQILSKLRLASPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNSTRDRVAGESAEPEPEPEADYYAKEVTRVLMVETHNEIYDKFKQSTHSIYMFFNTSELREAVPEPVLLSRAELRLLRLKLKVEQHVELYQKYSNNSWRYLSNRLLAPSDSPEWLSFDVTGVVRQWLSRGGEIEGFRLSAHCSCDSRDNTLQVDINGFTTGRRGDLATIHGMNRPFLLLMATPLERAQHLQSSRHRRALDTNYCFSSTEKNCCVRQLYIDFRKDLGWKWIHEPKGYHANFCLGPCPYIWSLDTQYSKVLALYNQHNPGASAAPCCVPQALEPLPIVYYVGRKPKVEQLSNMIVRSCKCS (서열식별번호: 24)

TGFβ2 (프로도메인 + 성장 인자 도메인) SLSTCSTLDMDQFMRKRIEAIRGQILSKLKLTSPPEDYPEPEEVPPEVISIYNSTRDLLQEKASRRAAACERERSDEEYYAKEVYKIDMPPFFPSENAIPPTFYRPYFRIVRFDVSAMEKNASNLVKAEFRVFRLQNPKARVPEQRIELYQILKSKDLTSPTQRYIDSKVVKTRAEGEWLSFDVTDAVHEWLHHKDRNLGFKISLHCPCCTFVPSNNYIIPNKSEELEARFAGIDGTSTYTSGDQKTIKSTRKKNSGKTPHLLLMLLPSYRLESQQTNRRKKRALDAAYCFRNVQDNCCLRPLYIDFKRDLGWKWIHEPKGYNANFCAGACPYLWSSDTQHSRVLSLYNTINPEASASPCCVSQDLEPLTILYYIGKTPKIEQLSNMIVKSCKCS (서열식별번호: 28)

TGFβ3 (프로도메인 + 성장 인자 도메인) SLSLSTCTTLDFGHIKKKRVEAIRGQILSKLRLTSPPEPTVMTHVPYQVLALYNSTRELLEEMHGEREEGCTQENTESEYYAKEIHKFDMIQGLAEHNELAVCPKGITSKVFRFNVSSVEKNRTNLFRAEFRVLRVPNPSSKRNEQRIELFQILRPDEHIAKQRYIGGKNLPTRGTAEWLSFDVTDTVREWLLRRESNLGLEISIHCPCHTFQPNGDILENIHEVMEIKFKGVDNEDDHGRGDLGRLKKQKDHHNPHLILMMIPPHRLDNPGQGGQRKKRALDTNYCFRNLEENCCVRPLYIDFRQDLGWKWVHEPKGYYANFCSGPCPYLRSADTTHSTVLGLYNTLNPEASASPCCVPQDLEPLTILYYVGRTPKVEQLSNMVVKSCKCS (서열식별번호: 32)

표 15: 예시적인 TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3 아미노산 서열

표 16: 예시적인 비-인간 아미노산 서열

일부 실시양태에서, 항원 단백질 복합체는 LAP (또는 프로도메인) 및 성장 인자 도메인의 이량체 복합체로 구성된 소위 소형 잠재성 복합체 (또는 SLC)일 수 있다. 다른 실시양태에서, 항원 단백질 복합체는 SLC에 결합된 제시 분자를 추가로 포함하는 소위 대형 잠재성 복합체 (또는 LLC)일 수 있다. 제시 분자는 LTBP 단백질 (예를 들어, LTBP1, LTBP2, LTBP3, 및 LTBP4), GARP 단백질, LRRC33 단백질, 또는 그의 단편(들)을 포함한다. LLC가 항원 단백질 복합체로서 사용되는 경우에, 전형적으로, 본원에 개시된 실시양태를 수행하는데 적합한 최소 요구 단편은 프로TGFβ1 복합체와 디술피드 결합을 형성할 수 있는 적어도 2개의 시스테인 잔기를 포함하여, 제시 분자 단백질의 적어도 50개의 아미노산, 바람직하게는 적어도 100개의 아미노산을 포함한다. 구체적으로, 이들 Cys 잔기는 프로TGFβ1 복합체의 각각의 단량체의 N-말단 근처에 존재하는 시스테인 잔기와 공유 결합을 형성한다.

본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 잠재성 LTBP1-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 자연 발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 비-자연 발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 재조합 단백질이다. 이러한 재조합 LTBP1 단백질은 LTBP1, 대안적으로 그의 스플라이싱된 변이체 및/또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 재조합 LTBP1 단백질은 또한 1개 이상의 검출가능한 표지를 포함하도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 리더 서열 (예를 들어, 천연 또는 비-천연 리더 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 리더 서열을 포함하지 않는다 (즉, 리더 서열이 프로세싱되거나 절단됨). 이러한 검출가능한 표지는 비오틴 표지, 폴리히스티딘 태그, myc 태그, HA 태그 및/또는 형광 태그를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 포유동물 LTBP1 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 인간, 원숭이, 마우스, 또는 래트 LTBP1 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 표 11의 서열식별번호: 46 및 47에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 표 12의 서열식별번호: 50에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 잠재성 LTBP3-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 자연 발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 비-자연 발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 재조합 단백질이다. 이러한 재조합 LTBP3 단백질은 LTBP3, 대안적으로 그의 스플라이싱된 변이체 및/또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 리더 서열 (예를 들어, 천연 또는 비-천연 리더 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 리더 서열을 포함하지 않는다 (즉, 리더 서열이 프로세싱되거나 절단됨). 재조합 LTBP3 단백질은 또한 1개 이상의 검출가능한 표지를 포함하도록 변형될 수 있다. 이러한 검출가능한 표지는 비오틴 표지, 폴리히스티딘 태그, myc 태그, HA 태그 및/또는 형광 태그를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 포유동물 LTBP3 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 인간, 원숭이, 마우스, 또는 래트 LTBP3 단백질이다. 일부 실시양태에서, LTBP3 단백질은 표 11의 서열식별번호: 44 및 45에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, LTBP1 단백질은 표 12의 서열식별번호: 51에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 잠재성 GARP-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 자연-발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 비-자연 발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 재조합 단백질이다. 이러한 GARP는 본원에서 재조합 GARP로 지칭되는 재조합일 수 있다. 일부 재조합 GARP는 야생형 GARP와 비교하여 1개 이상의 변형, 말단절단 및/또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 재조합 GARP는 가용성이 되도록 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 리더 서열 (예를 들어, 천연 또는 비-천연 리더 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 리더 서열을 포함하지 않는다 (즉, 리더 서열이 프로세싱되거나 절단됨). 다른 실시양태에서, 재조합 GARP는 1개 이상의 검출가능한 표지를 포함하도록 변형된다. 추가 실시양태에서, 이러한 검출가능한 표지는 비오틴 표지, 폴리히스티딘 태그, 플래그 태그, myc 태그, HA 태그 및/또는 형광 태그를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 포유동물 GARP 단백질이다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 인간, 원숭이, 마우스, 또는 래트 GARP 단백질이다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 표 11의 서열식별번호: 48-49에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, GARP 단백질은 표 13의 서열식별번호: 52 및 53에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1에 콘텍스트-의존성 방식으로 결합하지 않으며, 예를 들어 TGFβ1에 대한 결합은 TGFβ1 분자가 특이적 제시 분자, 예컨대 GARP와 복합체화된 경우에만 일어날 것이다. 대신에, 항체 및 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1에 콘텍스트-비의존성 방식으로 결합한다. 다시 말해서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1에 임의의 제시 분자: GARP, LTBP1, LTBP3, 및/또는 LRCC33에 결합된 경우에 결합한다.

본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 잠재성 LRRC33-TGFβ1 복합체에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 자연-발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 비-자연 발생 단백질 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 재조합 단백질이다. 이러한 LRRC33은 본원에서 재조합 LRRC33으로 지칭되는 재조합일 수 있다. 일부 재조합 LRRC33 단백질은 야생형 LRRC33과 비교하여 1개 이상의 변형, 말단절단 및/또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 재조합 LRRC33 단백질은 가용성이 되도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, LRRC33의 엑토도메인은 가용성 LRRC33 단백질 (sLRRC33; 예를 들어, 서열식별번호: 84 참조)을 발현하기 위해 C-말단 His-태그와 함께 발현될 수 있다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 리더 서열 (예를 들어, 천연 또는 비-천연 리더 서열)을 포함한다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 리더 서열을 포함하지 않는다 (즉, 리더 서열이 프로세싱되거나 절단됨). 다른 실시양태에서, 재조합 LRRC33 단백질은 1개 이상의 검출가능한 표지를 포함하도록 변형된다. 추가 실시양태에서, 이러한 검출가능한 표지는 비오틴 표지, 폴리히스티딘 태그, 플래그 태그, myc 태그, HA 태그 및/또는 형광 태그를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 포유동물 LRRC33 단백질이다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 인간, 원숭이, 마우스, 또는 래트 LRRC33 단백질이다. 일부 실시양태에서, LRRC33 단백질은 표 13의 서열식별번호: 83, 84, 및 101에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

표 17: 예시적인 LTBP 아미노산 서열

표 18: 예시적인 GARP 및 LRRC33 아미노산 서열

안전성/독성 고려사항

조직병리학, 독성학

상기 언급된 바와 같이, 모든 TGFβ 이소형, 즉 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3을 길항하는 공지된 범-억제제는 다중 포유동물 종에 걸쳐 다양한 독성을 유발하는 것으로 문서화되어 있다. 가장 주목할 만한 공지된 독성은 심혈관 독성 (예컨대 판막증) 및 상피 증식증, 피부 병변, 염증 및 출혈을 포함한다. 보다 구체적으로, 문헌에 보고된 범-TGFβ 억제제 (예를 들어, TGFβR의 소분자 길항제 및 비-선택적 중화 항체)와 연관된 관찰된 독성 중 일부는 하기를 포함한다.

TGFβ 억제와 연관된 심혈관 독성은 대동맥 판막, 우측 AV 판막 및 좌측 AV 판막에서의 증식증; 대동맥 판막, 좌측 AV 판막 및 상행 대동맥에서의 염증; 상행 대동맥, 대동맥 판막 및 좌측 AV 판막에서의 출혈; 상행 대동맥에서의 결합 조직 변성을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Strauber et al., (2014) "Nonclinical safety evaluation of a Transforming Growth Factor β receptor I kinase inhibitor in Fischer 344 rats and beagle dogs" J. Clin. Pract 4(3): 1000196] 참조).

또한, 모든 3종의 TGFβ 이소형에 결합하는 중화 항체는 특정 상피 독성과 연관되었고, 이는 하기 표에 요약된다.

표 19: 1D11 및 GC1008의 경우의 종에 걸친 상피 및 다른 독성

본 개시내용의 출원인은 이전에, 잠재성 프로TGFβ1 복합체를 표적화함으로써 TGFβ1의 활성화 단계를 선택적으로 차단하는 모노클로날 항체의 개선된 안전성 프로파일을 입증하였다 (예를 들어, WO 2017/156500 및 WO 2018/129329 참조). 상기 문헌에 기재된 래트 독성학 연구에서, 동물에게 4주 동안 1주에 100 mg/kg 이하의 억제제를 투여한 경우에 관찰가능한 시험 물품-관련 독성은 없었다.

통상적인 TGFβ 길항제의 이소형-특이성의 결여가 TGFβ 억제와 연관된 독성 공급원의 기저를 이룰 수 있다는 본 개시내용의 출원인에 의한 초기 인식 (예를 들어, WO 2017/156500 참조)에 기초하여, 본 발명자들은 이소형-선택적 억제제의 안전성/내약성 측면을 유지하면서, 다면적인 TGFβ1 조절이상을 나타내는 다양한 질환을 치료하기 위한 광범위한 TGFβ1 억제를 추가로 달성하고자 하였다. 따라서, 본원에 제시된 연구의 목표 중 하나는 적어도 동일하거나 등가 수준의 안전성 프로파일을 유지시키면서, 지속성을 개선시키기 위해 고친화도 억제제 중에서 특히 낮은 해리율 (k_오프)을 갖는 항체의 하위세트를 특이적으로 선택함으로써 이러한 억제제의 효력을 증가시키는 것이었다. 실제로, 본원에 제시된 데이터는 목적이 달성되었음을 나타낸다.

따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 신규 항체는 적어도 4주 (예를 들어, 4, 6, 8, 10, 12주) 동안 매주 투여되는 경우에 >100 mg/kg의 최대 허용 용량 (MTD)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 신규 항체는 래트에서 적어도 4주 동안 매주 투여되는 경우에 최대 100 mg/kg의 무관찰 부작용 수준 (NOAEL)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 마우스에서 4주 또는 12주 동안 투여되는 경우에 적어도 100 mg/kg/주의 NOAEL을 갖는다. TGFβ 억제제 및 TGFβ1 억제제에 대한 안전성/독성학 연구를 수행하는데 사용될 적합한 동물 모델은 래트, 개, 시노, 및 마우스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 적합한 전임상 효능 연구에 기초한 항체의 최소 유효량은 NOAEL 미만이다. 보다 바람직하게는, 항체의 최소 유효량은 NOAEL의 약 1/3 이하이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항체의 최소 유효량은 NOAEL의 약 1/6 이하이다. 일부 실시양태에서, 항체의 최소 유효량은 NOAEL의 약 1/10 이하이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 투여되는 경우에 TGFβ1-관련 적응증을 치료하는데 효과적인 용량에서 심혈관 또는 공지된 상피 독성을 유발하지 않는, TGFβ1 신호전달을 억제할 수 있는 이소형-선택적 항체를 포괄한다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ2를 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-이소형 선택적이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ3을 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-이소형 선택적이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ2 및 TGFβ3을 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-이소형 선택적이다. 일부 실시양태에서, 항체는 매주, 격주 또는 매월 투여되는 약 3-10 mg/kg의 최소 유효량을 갖는다. 바람직하게는, 항체는 최소 유효량의 적어도 6-배인 용량 (예를 들어, 6-배 치료 범위)에서 독성을 유발하지 않거나 최소한으로 유발한다. 보다 바람직하게는, 항체는 최소 유효량의 적어도 10-배인 용량 (예를 들어, 10-배 치료 범위)에서 독성을 유발하지 않거나 최소한으로 유발한다. 보다 더 바람직하게는, 항체는 최소 유효량의 적어도 15-배인 용량 (예를 들어, 15-배 치료 범위)에서 독성을 유발하지 않거나 최소한으로 유발한다.

따라서, 치료 용도를 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 선택은 하기를 포함할 수 있다: TGFβ 억제제 중 1종 이상의 기준을 충족시키는 항체 또는 항원-결합 단편 (예컨대, 예를 들어 느린 해리율, 예를 들어, 10.0E-4 이하의 k_오프를 갖도록 선택된 모노클로날 항체 및 항원-결합 단편)을 선택하는 것; 항체 또는 단편의 유효량을 결정하기 위해 적합한 전임상 모델에서 생체내 효능 연구를 수행하는 것; 안전하거나 독성인 항체의 양 (예를 들어, MTD, NOAEL, 또는 안전성/독성을 평가하기 위한 관련 기술분야에서 인식되는 임의의 파라미터)을 결정하기 위해 적합한 모델에서 생체내 안전성/독성학 연구를 수행하는 것; 및 적어도 3-배의 치료 범위 (바람직하게는 6-배, 보다 바람직하게는 10-배의 치료 범위, 보다 더 바람직하게는 15-배의 치료 범위)를 제공하는 항체 또는 단편을 선택하는 것. 선택된 항체 또는 단편은 항체 또는 단편을 포함하는 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 대상체에서 TGFβ1 적응증의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, TGFβ1 적응증은 섬유화 장애 및/또는 증식성 장애일 수 있다. 바람직하게는, 치료 용도 또는 대규모 제조를 위해 선택되는 TGFβ 억제제는 처리된 동물에서 적어도 4주, 예를 들어 8주 및 12주의 지속 노출 후에 관찰가능한 유해 효과를 생성하지 않는다. 일부 실시양태에서, 조직병리학적 분석에서 관찰된 특정 독성은 비-유해한 것으로 간주된다.

면역 안전성 평가

시토카인은 정상 면역 반응에서 중요한 역할을 하지만, 면역계가 과다활성이 되도록 촉발되는 경우에, 시토카인 생산의 양성 피드백 루프는 과도한 시토카인 생산이 기관, 특히 폐 및 신장을 손상시킬 수 있는 면역 반응을 유발하고 심지어 사망에까지 이를 수 있는 상황인 "시토카인 폭풍" 또는 고시토카인혈증으로 이어질 수 있다. 이러한 상태는 혈청에서 현저하게 상승된 염증유발 시토카인을 특징으로 한다. 과거, 건강한 지원자에서의 항-CD28 모노클로날 항체 TGN1412의 1상 시험은 염증유발 시토카인의 예상외의 전신 및 신속한 유도로부터 비롯된 생명을 위협하는 "시토카인 폭풍" 반응으로 이어졌다 (Suntharalingam G et al., N Engl J Med. 2006 Sep 7;355(10):1018-28). 이러한 사건은 T 세포의 약리학적 자극과 연관된 잠재적 위험에 대한 고조되는 인식을 촉진하였다.

TGFβ-지정 요법은 특이적 T 세포 수용체 또는 그의 리간드를 표적화하지 않지만, 예를 들어 시험관내 시토카인 방출 검정, TGFβ 억제제로 처리된 비-인간 영장류의 혈장 샘플로부터의 생체내 시토카인 측정 및 인간 혈소판을 사용한 혈소판 검정을 포함한 면역 안전성 평가를 수행하는 것이 현명한 것으로 고려된다.

일부 실시양태에서, 치료 용도 및/또는 그의 대규모 생산을 위한 TGFβ 억제제의 선택은 TGFβ 억제제가 시토카인-생산 세포로부터 시토카인 방출을 촉발하는 능력의 평가를 포함한다. 이러한 평가에서, 시토카인 (예를 들어, 염증성 시토카인) IL-2, TNFα, IFNγ, IL-1β, CCL2 (MCP-1) 및 IL-6 중 1종 이상이 검정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토카인-생산 세포는 건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 구성성분을 포함할 수 있다. 본원의 TGFβ 억제제 (예컨대 개시된 항체)에 대한 노출 후의 시토카인 반응은 시험될 TGFβ 억제제에 따라 대조군, 예를 들어 IgG이소형 음성 대조군 또는 임의의 다른 적합한 대조군에 대한 노출 후의 방출과 비교될 수 있다. 시토카인 활성화는 플레이트-결합된 (예를 들어, 고정된) 및/또는 가용성 검정 포맷으로 평가될 수 있다. IFNγ, IL-2, IL-1β, TNFα, IL-6, 및 CCL2 (MCP-1)의 수준은 음성 대조군에서의 활성화의 10-배, 예를 들어 8-, 6-, 4-, 또는 2-배를 초과하지 않아야 한다. 일부 실시양태에서, 양성 대조군이 또한 샘플에서, 예를 들어 PBMC에서 시토카인 활성화를 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 시험관내 시토카인 방출 결과는 생체내에서, 예를 들어 동물 모델, 예컨대 원숭이 독성학 연구, 예를 들어 4-주 GLP 또는 비-GLP 반복-용량 원숭이 연구에서 추가로 확인될 수 있다.

인간 혈소판은 GARP를 발현하는 것으로 보고되어 있고, 이는 TGFβ1 LLC를 형성할 수 있다 (Tran et al., 2009. Proc. Nat'l. Acad. Sci. U S A. 106(32): 13445-13450). 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체는 혈소판 상에 발현된 GARP에 유의하게 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 혈소판 활성화는 시험관내에서 평가된다. 일부 실시양태에서, 혈소판 응집, 결합, 및 활성화는 건강한 공여자로부터의 인간 전혈 또는 혈소판-풍부 혈장에서 평가될 수 있다. 본원에 개시된 항체에 대한 노출 후의 혈소판 응집 및 결합은 음성 대조군, 예를 들어 염수 용액, 또는 비히클, 예를 들어 완충 용액 중 참조 물품에 대한 노출과 비교될 수 있다. 치료 용도에 적합한 TGFβ 억제제를 선택하는데 있어서, 후보 약물은 자발적 또는 효능제-유도된 활성화를 촉발하지 않는 것을 보장하기 위해 평가되어야 한다. 또한, 약물은 혈소판의 정상적인 기능 (예를 들어, 응집 또는 응고)을 방해하지 않아야 한다.

특정 실시양태에서, 혈소판 응집 및 결합은 음성 대조군에서의 응집보다 10%를 초과하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 항체에 대한 노출 후의 혈소판 활성화는 양성 대조군, 예를 들어 아데노신 디포스페이트 (ADP)에 대한 노출과 비교될 수 있다. 혈소판의 활성화 상태는 유동 세포측정법에 의해 검출가능한 활성화 마커, 예를 들어 CD62P (P-셀렉틴) 및 GARP의 표면 발현에 의해 결정될 수 있다. 혈소판 활성화는 음성 대조군에서의 활성화보다 10%를 초과해서는 안된다. 일부 실시양태에서, 시험관내 혈소판 반응 결과는 생체내, 예를 들어 동물 모델에서, 예컨대 비-인간 영장류에서의 면역-지시된 안전성 연구에서 추가로 확인될 수 있다.

일부 실시양태에서, 치료 용도를 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 선택은 본원에 기재된 것 중 1종 이상의 기준을 충족시키는 항체 또는 항원-결합 단편을 확인하는 것; 항체 또는 단편의 유효량을 결정하기 위해 적합한 전임상 모델에서 생체내 효능 연구를 수행하는 것; 안전하거나 독성인 항체의 양 (예를 들어, MTD, NOAEL, 또는 안전성/독성을 평가하기 위한 관련 기술분야에서 인식되는 임의의 파라미터)을 결정하기 위해 적합한 모델에서 생체내 안전성/독성학 연구를 수행하는 것; 및 적어도 3-배의 치료 범위 (바람직하게는 6-배, 보다 바람직하게는 10-배의 치료 범위, 보다 더 바람직하게는 15-배의 치료 범위)를 제공하는 항체 또는 단편을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 생체내 효능 연구는 인간 상태를 재현한 2종 이상의 적합한 전임상 모델에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 이러한 전임상 모델은 TGFβ1-양성 섬유증을 포함한다. 일부 실시양태에서, 전임상 모델은 간 섬유증 모델, 신장 섬유증 모델, 폐 섬유증 모델, 심장 (심장의) 섬유증 모델, 피부 섬유증 모델로부터 선택된다.

치료 용도를 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 확인은 시토카인 방출을 측정하는 것 및/또는 혈소판 결합, 활성화 및/또는 응집에 대한 항체 또는 항원-결합 단편의 영향을 결정하는 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 면역 안전성 검정을 수행하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 시토카인 방출은 PBMC를 사용하여 시험관내에서 또는 전임상 모델, 예컨대 비-인간 영장류를 사용하여 생체내에서 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 면역 안전성 평가에서 IgG 대조군 샘플에서의 수준과 비교하여 IL-6, IFNγ, 및/또는 TNFα 수준에서 10-배 초과의 방출을 유도하지 않는다. 특정 실시양태에서, 혈소판 결합, 활성화, 및 응집의 평가는 PBMC를 사용하여 시험관내에서 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 면역 안전성 평가에서 완충제 또는 이소형 대조군과 비교하여 혈소판 결합, 활성화 및/또는 응집의 10% 초과의 증가를 유도하지 않는다.

선택된 항체 또는 단편은 항체 또는 단편을 포함하는 제약 조성물의 제조에 사용될 수 있다. 이러한 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 대상체에서 TGFβ 적응증의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, TGFβ 적응증은 섬유화 장애, 예컨대 기관 섬유증, 예를 들어 간 섬유증일 수 있다. 따라서, 본 발명은 TGFβ 억제제를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 방법을 포함하며, 여기서 방법은 시토카인 방출 검정을 포함하고 임의로 혈소판 검정을 추가로 포함하는 면역 안전성 평가에 의해 평가되는 바와 같이 면역 안전성에 대해 시험되는 TGFβ 억제제를 선택하는 단계를 포함한다. 방법에 의해 선택된 TGFβ 억제제는 대조군 (예컨대 IgG 대조군)과 비교하여 허용되지 않는 수준의 시토카인 방출을 촉발하지 않는다. 유사하게, 방법에 의해 선택된 TGFβ 억제제는 허용되지 않는 수준의 혈소판 응집, 혈소판 활성화 및/또는 혈소판 결합을 유발하지 않는다. 이어서, 이러한 TGFβ 억제제는 TGFβ 억제제를 포함하는 제약 조성물의 상업적 생산을 위해 대규모, 예를 들어 250L 이상, 예를 들어 1000L, 2000L, 3000L, 4000L 또는 그 초과로 제조된다.

TGFβ 억제제의 이소형 선택성 및 작용 메카니즘

본 발명의 다양한 실시양태를 수행하는데 유용한 TGFβ 억제제는 생체내 TGFβ1 기능의 1종 이상의 측면을 약리학적으로 방해하는 것을 목표로 한다. TGFβ 억제제는 TGFβ1 억제제, 예컨대 TGFβ1-이소형 선택적 억제제, 또는 이소형-비-선택적 억제제일 수 있다. 이소형-비-선택적 억제제는, 비제한적으로, 저분자량 ALK5 길항제, TGFβ1/2/3 중 2종 이상, 예를 들어 GC1008 및 변이체에 결합하는 중화 항체, TGFβ1/3에 결합하는 항체, 및 리간드 트랩, 예를 들어 TGFβ1/3 억제제를 포함한다.

안전성 관점에서, 이소형에 걸친 TGFβ의 광범위한 억제가 관찰된 독성의 원인일 수 있다는 인식이 증가하고 있으며, 이는 TGFβ 억제제가 지금까지 성공적으로 개발되지 않았다는 사실을 강조한다. 잠재적으로 위험한 유해 효과를 피하기 위해, 다수의 그룹이 최근에 이소형의 하위세트 - 전부는 아님 - 를 표적화하고 여전히 효능을 보유하는 억제제를 확인하는 것으로 전환하였다. 그러나, 효능 관점에서, 관련 기술분야의 지배적인 견해는 TGFβ의 다중 이소형을 억제하여 치료 효과를 달성하고, 이를 수용하는 것이 유리하다는 것으로 남아있으며, "주의깊은 투여 요법"에 의한 독성 관리가 해결책으로서 시사된다 (Brennan et al., (2018) mAbs, 10:1, 1-17). 이러한 전제와 일치하게, 수많은 그룹이 1종 초과의 이소형을 표적화하는 TGFβ 억제제를 개발하고 있다. 이들은 TGFβ 수용체의 저분자량 길항제, 예를 들어, ALK5 길항제, 예컨대 갈루니세르팁 (LY2157299 1수화물, 일라이 릴리(Eli Lilly)); 모든 3종의 이소형을 억제하는 모노클로날 항체 (예컨대 중화 항체) ("범-억제제" 항체) (예를 들어, WO 2018/134681 참조); 3종의 이소형 중 2종을 우선적으로 억제하는 모노클로날 항체 (예를 들어, TGFβ1/2 (예를 들어, WO 2016/161410) 및 TGFβ1/3 (예를 들어, WO 2006/116002 및 WO 2020/051333)에 대한 항체); 인테그린 억제제, 예컨대 α_Vβ₃, α_Vβ₅, α_Vβ₆, α_Vβ₈, α₅β₁, α_IIbβ₃, 또는 α₈β₁ 인테그린에 결합하고 TGFβ의 하류 활성화를 억제하는, 예를 들어 TGFβ1 및/또는 TGFβ3의 선택적 억제 항체 (예를 들어, PLN-74809, α_Vβ₁ / α_Vβ₆의 소분자, 이중 선택적 억제제, 플리언트 테라퓨틱스(Pliant Therapeutics), 캘리포니아주 샌프란시스코), 및 조작된 분자 (예를 들어, 융합 단백질), 예컨대 리간드 트랩 (예를 들어, 국제 공개 번호 WO 2018/029367; WO 2018/129331 및 WO 2018/158727 참조)을 포함한다. 유사하게, α_Vβ₆과 같은 인테그린의 억제제도 또한 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다의 인테그린-의존성 활성화를 차단하고, 따라서 TGFβ 신호전달의 이소형-비-선택적 억제제로서 간주될 수 있다.

이전에, 본 출원인은 TGFβ1 단독의 억제가 TGFβ1/3이 둘 다 공동-발현되는 종양에서도 체크포인트 억제제 요법에 대해 면역억제 종양을 감작화시키는데 충분하였음을 입증하였다 (국제 공개 번호 WO/2020/014460 참조). 유사하게, TGFβ1-선택적 억제제는 비록 별개의 세포 유형이기는 하지만 섬유화 조직에서 TGFβ1/3 이소형 둘 다가 공동-발현되는 마우스 간 섬유증 모델을 포함한 전임상 모델에서 섬유증을 완화시키는 것으로 제시된다 (본원). 놀랍게도, TGFβ3의 억제는 섬유화유발 표현형을 촉진하였다. TGFβ3 억제제가 단독으로 사용되는 경우에 섬유증의 악화가 관찰된다. 또한, TGFβ3 억제제는 TGFβ1-선택적 억제제와 조합되어 사용되는 경우에, 섬유화 간에서의 증가된 콜라겐 축적에 의해 입증된 바와 같이 TGFβ1-선택적 억제제의 항섬유화 효과를 약화시켰다. 이들 결과는 TGFβ3에 대한 억제 효력이 섬유증이 우려되는 상황에서 요법으로서 사용될 TGFβ 억제제의 바람직하지 않은 특색일 수 있다는 가능성을 제기한다.

섬유증 상황을 넘어서, 섬유화유발 표현형 (예를 들어, ECM 내로의 증가된 콜라겐 침착)은 섬유증뿐만 아니라 암 진행의 측면, 예컨대 종양 침습 및 전이와 연관되기 때문에, 이러한 예상외의 발견에 대한 보다 넓은 암시가 존재한다. 예를 들어, 문헌 [Chakravarthy et al., (Nature Communications, (2018) 9:4692. "TGF-β-associated extracellular matrix genes link cancer-associated fibroblasts to immune evasion and immunotherapy failure")]을 참조한다. 다양한 종양 유형의 섬유화 조직 및 기질을 포함한, 조절이상 ECM을 갖는 이환 조직은 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다를 발현할 수 있다. 오늘날, 이들 이소형 둘 다를 표적화하는 TGFβ 억제제, 예컨대 리간드 트랩, 중화 항체 및 인테그린 억제제를 개발하기 위해 다수의 그룹이 노력하고 있다. 그러나, 본원에 제시된 발견은 이러한 접근법이 실제로 질환을 악화시킬 수 있음을 시사한다.

따라서, 본 개시내용은 ECM 조절이상을 수반하는 장애, 예컨대 섬유증 및 암의 치료를 위해, TGFβ3을 특이적으로 표적화하지 않는 TGFβ 억제제가 선택되어야 한다는 교시를 제공한다. 바람직하게는, 이러한 억제제는 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제이다. 관련 방법은 대상체에서 섬유화 장애의 치료에 사용하기 위한 TGFβ 억제제를 선택하는 방법을 포함하며, 여기서 방법은 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3을 억제하는 능력에 대한 1종 이상의 후보 억제제의 효력을 시험하는 단계, 및 치료 용도를 위해 TGFβ1은 억제하지만 TGFβ3은 억제하지 않는 억제제를 선택하는 단계를 포함한다. 관련 치료 방법은 대상체에게 TGFβ1은 억제하지만 TGFβ3은 억제하지 않는 억제제를, 섬유화 장애를 치료하거나 또는 섬유화 장애 및/또는 심혈관 질환을 갖거나 발생할 위험이 있는 대상체를 치료하기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 섬유화 장애가 발생할 위험이 있는 대상체는 대사 장애, 예컨대 당뇨병, 비만 및 NASH를 앓을 수 있다. 제안되는 환자의 하위집단의 배제는 섬유화유발 효과를 촉발, 촉진 또는 악화시킬 위험을 감소시키는 것을 목표로 한다.

바람직한 실시양태에서, 섬유화 장애의 치료에 사용하기 위한 TGFβ 억제제는 생체내에서 TGFβ1-함유 잠재성 복합체를 표적화할 수 있는 TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 (예컨대 본원에 개시된 낮은 k_오프를 갖는 신규 항체)이다. 일부 실시양태에서, 억제제는 Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51 및 Ab52로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체이다. 바람직하게는, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab46 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

따라서, 본 발명의 항체는 질환 부위 (예를 들어, TME 또는 섬유화 조직)에서 하기 복합체를 표적화하고, 여기서 잠재성 복합체에 선제적으로 결합하여 성장 인자가 방출되는 것을 방지하는 것을 목표로 한다: i) GARP에 의해 제시된 프로TGFβ1; ii) LRRC33에 의해 제시된 프로TGFβ1; iii) LTBP1에 의해 제시된 프로TGFβ1; 및 iv) LTBP3에 의해 제시된 프로TGFβ1. 전형적으로, 상기 복합체 (i) 및 (ii)는 GARP 및 LRRC33 둘 다가 GARP 또는 LRRC33을 발현하는 세포의 세포외 면 상에 잠재성 프로TGFβ1을 제시하거나 테더링할 수 있는 막횡단 단백질이기 때문에 세포 표면 상에 존재하는 반면에, 복합체 (iii) 및 (iv)는 세포외 매트릭스의 성분이다. 이러한 방식에서, 본원에 구현된 억제제는 억제 효과를 발휘하기 위해 내인성 고친화도 수용체와의 완전한 결합을 제거한다. 또한, 리간드/수용체 상호작용의 상류를 표적화하는 것은 표적 접근가능성의 범위가 잠재성 복합체로부터 방출된 후에만 활성, 가용성 성장 인자를 표적화하는 통상적인 억제제보다 더 길고 관련 조직에 더 국재화되기 때문에 보다 지속적인 효과를 가능하게 할 수 있다.

다수의 연구는 TGFβ1 활성화의 메카니즘을 밝혀내었다. 3종의 인테그린, αVβ6, α_Vβ₈, 및 α_Vβ₁은 잠재성 TGFβ1의 주요 활성화제인 것으로 입증되었다 (Reed, N.I., et al., Sci Transl Med, 2015. 7(288): p. 288ra79; Travis, M.A. and D. Sheppard, Annu Rev Immunol, 2014. 32: p. 51-82; Munger, J.S., et al., Cell, 1999. 96(3): p. 319-28). αV 인테그린은 TGFβ1 및 TGFβ1 LAP에 존재하는 RGD 서열에 높은 친화도로 결합한다 (Dong, X., et al., Nat Struct Mol Biol, 2014. 21(12): p. 1091-6). 인테그린 결합은 방지하지만 분비는 방지하지 않는, TGFβ1 RGD 부위에 돌연변이를 갖는 트랜스제닉 마우스는 TGFβ1-/- 마우스를 표현형모사한다 (Yang, Z. et al., J Cell Biol, 2007. 176(6): p. 787-93). β6 및 β8 인테그린 둘 다가 결여된 마우스는 다기관 염증 및 구개열을 포함한, TGFβ1 및 TGFβ3 녹아웃 마우스의 모든 본질적 표현형을 재현하며, 이는 발생 및 항상성에서 TGFβ1/3 활성화를 위한 이들 2종의 인테그린의 본질적 역할을 확인시켜 준다 (Aluwihare, P., et al., J Cell Sci, 2009. 122(Pt 2): p. 227-32). 잠재성 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화에 대한 핵심은 제시 분자에 대한 공유 테더이고; 돌연변이유발에 의한 GARP와 TGFβ1 LAP 사이의 디술피드 결합의 파괴는 복합체 형성을 손상시키지 않지만, α_Vβ₆에 의한 TGFβ1 활성화를 완전히 제거한다 (Wang, R., et al., Mol Biol Cell, 2012. 23(6): p. 1129-39). 잠재성 TGFβ1의 최근 구조는 인테그린이 잠재성 복합체로부터 활성 TGFβ1의 방출을 가능하게 하는 방법을 명확하게 한다: 잠재성 TGFβ1의 그의 제시 분자에 대한 공유 연결은 잠재성 TGFβ1을 LTBP를 통해 ECM에, 또는 GARP 또는 LRRC33을 통해 세포골격에 앵커링한다. RGD 서열에 대한 인테그린 결합은 LAP의 구조에서 힘-의존성 변화를 발생시켜, 활성 TGFβ1이 방출되고 인근 수용체에 결합하도록 한다 (Shi, M., et al., Nature, 2011. 474(7351): p. 343-9). 질환에서의 인테그린-의존성 TGFβ1 활성화의 중요성이 또한 널리 검증되어 있다. αVβ1의 소분자 억제제는 블레오마이신-유도된 폐 섬유증 및 사염화탄소-유도된 간 섬유증에 대해 보호하고 (Reed, N.I., et al., Sci Transl Med, 2015. 7(288): p. 288ra79), 항체에 의한 α_Vβ₆ 차단 또는 인테그린 β6 발현의 상실은 블레오마이신-유도된 폐 섬유증 및 방사선-유도된 섬유증을 억제한다 (Munger, J.S., et al., Cell, 1999. 96(3): p. 319-28); Horan, G.S., et al., Am J Respir Crit Care Med, 2008. 177(1): p. 56-65). 인테그린에 더하여, 트롬보스폰딘-1, 및 프로테아제 예컨대 트롬빈, 플라스민, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP, 예를 들어, MMP2, MMP9 및 MMP12), 카텝신 D 및 칼리크레인에 의한 활성화를 포함한, TGFβ1 활성화의 다른 메카니즘이 연루되었다. 트롬보스폰딘-1의 녹아웃은 일부 조직에서 TGFβ1-/- 표현형의 일부 측면을 재현하지만, TGFβ-의존성인 것으로 공지된 블레오마이신-유도된 폐 섬유증에서는 보호적이지 않다 Ezzie, M.E., et al., Am J Respir Cell Mol Biol, 2011. 44(4): p. 556-61). 추가적으로, 후보 프로테아제의 녹아웃은 TGFβ1 표현형을 발생시키지 않았다 (Worthington, J.J., J.E. Klementowicz, and M.A. Travis, Trends Biochem Sci, 2011. 36(1): p. 47-54). 이는 중복에 의해, 또는 발생 및 항상성보다는 특정 질환에서 중요한 이들 메카니즘에 의해 설명될 수 있다.

본 개시내용의 항체는 TGFβ1 활성화의 단계를 방지함으로써 작용한다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 TGFβ1의 인테그린-의존성 (예를 들어, 기계적 또는 힘-구동된) 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 TGFβ1의 프로테아제-의존성 또는 프로테아제-유도된 활성화를 억제할 수 있다. 후자는 인테그린-비의존성 방식으로 TGFβ1 활성화 단계를 억제하는 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 활성화 방식에 관계없이 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있고, 예를 들어 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화 및 프로테아제-의존성 활성화 둘 다를 억제할 수 있다. TGFβ1을 활성화시킬 수 있는 프로테아제의 비제한적 예는 세린 프로테아제, 예컨대 칼리크레인, 케모트립신, 트립신, 엘라스타제, 플라스민, 트롬빈, 뿐만 아니라 아연 메탈로프로테아제 (MMP 패밀리), 예컨대 MMP-2, MMP-9, MMP-12, MMP-13 및 ADAM 프로테아제 (예를 들어, ADAM10 및 ADAM17)를 포함한다. 칼리크레인은 혈장-칼리크레인 및 조직 칼리크레인, 예컨대 KLK1, KLK2, KLK3, KLK4, KLK5, KLK6, KLK7, KLK8, KLK9, KLK10, KLK11, KLK12, KLK13, KLK14 및 KLK15를 포함한다. 본원에 제시된 데이터는 시험관내에서 TGFβ1의 칼리크레인-의존성 활성화를 억제할 수 있는 이소형-특이적 TGFβ1 억제제의 예를 입증한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 억제제는 잠재성 복합체로부터의 활성 (성숙) TGFβ1 성장 인자의 방출 또는 해리를 방지한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체는 세포 표면 상의 LRRC33 또는 GARP에 결합된 프로TGFβ1을 포함하는 복합체의 내재화를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 세포-회합된 TGFβ1 (예를 들어, GARP-제시된 프로TGFβ1 및 LRRC33-제시된 프로TGFβ1)의 억제제이다. 본 발명은 이러한 복합체 (예를 들어, GARP-프로/잠재성 TGFβ1 및 LRRC33-프로/잠재성 TGFβ1)에 특이적으로 결합하여 복합체의 내재화 (예를 들어, 세포내이입)를 촉발하는 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 이러한 작용 방식은 세포 표면 (예를 들어, Treg, 대식세포, MDSC 등)으로부터 불활성 TGFβ1 복합체의 제거 또는 고갈을 유발하여, 따라서 활성화에 이용가능한 잠재성 TGFβ1을 감소시킨다.

치료 용도에 적합한 TGFβ 억제제

다수의 증거는 많은 질환이 TGFβ 신호전달의 복잡한 교란을 나타내며, 이는 소위 제시 분자와의 상호작용에 의해 매개되는 TGFβ 기능의 상이한 효과를 부여하는 이종 세포 유형의 참여를 수반할 가능성이 있다는 개념을 지지한다. 적어도 4종의 이러한 제시 분자가 확인되었으며, 이는 다양한 세포외 함요에서 TGFβ를 "제시"하여 국부 자극에 반응하여 그의 활성화를 가능하게 할 수 있다. 한 카테고리에서, TGFβ는 ECM-회합된 TGFβ 활성을 매개하는 ECM-회합된 제시 분자, 예컨대 LTBP1 및 LTBP3과 회합되어 ECM 내로 침착된다. 또 다른 카테고리에서, TGFβ는 특정 면역 기능을 매개하는 제시 분자, 예컨대 GARP 및 LRRC33을 통해 세포 (예를 들어, 면역 세포)의 표면 상에 테더링된다. 이들 제시 분자는 상이한 조직 및 세포 유형에서 차등 발현, 국재화 및/또는 기능을 나타내며, 이는 TGFβ 활성화의 촉발 사건 및 결과가 생물학적 또는 병리학적 미세환경에 따라 달라질 것임을 나타낸다. 많은 TGFβ 효과가 상호작용하여 질환 진행에 기여할 수 있다는 개념에 기초하여, TGFβ 기능의 다중 양상을 길항할 수 있는 치료제는 보다 큰 효능을 제공할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 섬유화 장애의 치료에 사용하기 위한 TGFβ 억제제는 생체내에서 TGFβ1-함유 잠재성 복합체를 표적화할 수 있는 TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 (예컨대 본원에 개시된 낮은 k_오프를 갖는 신규 항체)이다. 가장 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체이다. 바람직하게는, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab46 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

다양한 질환이 질환의 발병기전 및/또는 진행에 집합적으로 기여하는 TGFβ1의 다중 공급원으로서 세포의 이종 집단을 수반하는 것으로 인식되었다. 1종 초과의 유형의 TGFβ1-함유 복합체 ("콘텍스트")는 동일한 질환 미세환경 내에 공존할 가능성이 있다. 따라서, 상이한 생물학적 콘텍스트에서 TGFβ1을 억제하는 능력이 중요할 수 있다.

그러나, 특정 상황에서, 모든 4종의 항원 복합체에 여전히 특이적으로 결합하지만 세포-회합된 복합체에 비해 매트릭스-회합된 복합체에 대해 더 강한 친화도를 갖는 소위 콘텍스트-편향된 항체가 유리할 수 있다. 특색, 즉 면역 세포 복합체에 비해 ECM 복합체에 대한 이들 항체의 차등 결합 친화도는 이러한 억제제가 섬유화 상태, 예컨대 기관 섬유증을 치료하기 위한 치료제로서 특히 적합할 수 있다는 가능성을 상승시킬 수 있으며, 여기서 이환 환자는 만성 상태를 치료하기 위해 장기간 치료 요법을 제공받는다. 이들 상황에서, 면역 자극에 의해 촉발된 원치않는 염증을 최소화하는 것이 바람직하다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는, 예를 들어 용액 평형 적정에 의해 결정된 바와 같이, 세포-회합된 복합체에 비해 EMC-복합체, 예를 들어 hLTBP1-프로TGFβ1 및 hLTBP3-프로TGFβ1에 대해 더 큰 친화도 (KD < 1 nM)를 갖는다. EMC-편향된 항체는 생체내에서 EMC-회합된 TGFβ1을 우선적으로 표적화하고 억제할 수 있는 것으로 고려된다. 이러한 항체는 ECM 조절이상을 갖는 상태, 예컨대 ECM의 비정상적 재형성 및/또는 강성의 치료에 사용하기에 유리할 수 있다. 전형적으로, ECM 조절이상은 질환 환경, 예컨대 종양 미세환경 및 섬유화 미세환경에서 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포의 증가된 수를 동반할 수 있다. ECM의 많은 비정상적 특색은 종종 섬유증을 포함한 광범위한 병리학적 상태에서 나타나고, 증식성 장애는 적어도 부분적으로 TGFβ1 경로에 의해 구동된다.

GARP-회합된 TGFβ 복합체 (예를 들어, 인간 GARP-프로TGFβ1)에 대해 보다 약한 결합을 갖는 콘텍스트-편향된 항체는 대상체의 면역 반응을 자극하는 것이 바람직하지 않은 상태의 치료에서 및/또는 대상체가 만성 상태, 예컨대 많은 유형의 섬유증을 관리하기 위해 장기간 TGFβ 억제 요법으로부터 이익을 얻을 것으로 예상되는 상황에서 사용될 수 있다. GARP-프로TGFβ1에 대해 보다 약한 결합 친화도를 갖는 TGFβ1 억제제의 치료 용도에 대한 근거는 적어도 3중으로 존재한다:

첫째, GARP는 자기-항원에 대한 면역 관용을 유지시키고 자가면역 질환을 예방하는데 중대한 역할을 하는 조절 T 세포 상에서 우세하게 발현된다. Treg는 일반적으로 이펙터 T 세포의 유도 및 증식을 억제, 약화 또는 하향조절하기 때문에, 이러한 기능의 전신 억제는 Treg 세포에 의해 정상적으로 제공되는 "파괴"를 불능화함으로써 숙주에서 과활성 또는 과장된 면역 반응으로 이어질 수 있다. 따라서, 본원에서 취해지는 접근법 (예를 들어, Treg 기능을 완전히 불능화하지 않는 TGFβ1 억제)은 자가면역을 도출할 위험을 회피하는 것을 목표로 한다. 또한, 과민성 면역 반응 또는 자가면역이 발생할 성향을 이미 갖는 환자는 특히 기능적 Treg의 이용가능성의 부재 하에 이러한 상태를 촉발하거나 악화시킬 위험이 있을 수 있고; 따라서, GARP-매개된 TGFβ1 기능을 적어도 부분적으로 보존하는 억제제는 유리하게는 이러한 위험을 최소화할 수 있다.

둘째, 증거는 Th17/Treg 비의 변경이 섬유증, 예컨대 간 섬유증의 중증도와 상관관계가 있는 섬유화유발 Th17 시토카인의 불균형을 유발한다는 것을 시사한다 (예를 들어, 문헌 [Shoukry et al., (2017) J Immunol 198 (1 Supplement): 197.12] 참조). 본 발명자들은 TGFβ1 기능의 GARP 아암의 교란을 불능화하는 것이 섬유화 상태를 직접적으로 또는 간접적으로 악화시킬 수 있는 것으로 추론하였다.

셋째로, 조절 T 세포는 면역 항상성 및 자가면역의 예방에 필수적이다. 특히 장기간 또는 만성 투여를 위해 의도되는 TGFβ1 억제 요법의 경우에, GARP-매개된 TGFβ1의 적어도 일부를 보존하고 면역 항상성을 유지시키는데 있어서 정상 Treg 기능의 완전한 교란으로부터 기인하는 잠재적 부작용을 회피하는 것이 바람직할 것으로 추론되었다 (예를 들어, 문헌 [Richert-Spuhler and Lund (2015) Prog Mol Biol Transl Sci. 136: 217-243]에서 검토됨). 이러한 전략은 적어도 부분적으로, 특히 감염을 퇴치하기 위해 요구되는 정상 면역 기능을 보존하는 것을 목표로 한다.

TGFβ1-관련 적응증

본원에 기재된 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 대상체에서 TGFβ1-관련 적응증을 치료하는데 사용될 수 있다. 기여 인자로서 TGFβ 신호전달의 조절이상을 수반하는 다양한 질환 상태가 시사되었다. 실제로, 특정 인간 상태의 발병기전 및/또는 진행은 TGFβ1 활성에 의해 우세하게 구동되거나 또는 그에 좌우되는 것으로 보인다. 더욱이, TGFβ1-반응성 세포 사이에 크로스토크가 존재하는 것으로 고려된다. 일부 경우에, TGFβ1 축의 다면적 활성 사이의 상호작용은 질환 진행, 악화, 및/또는 질환을 퇴치하는 숙주의 능력의 억제로 이어지는 사건의 캐스케이드를 촉발할 수 있다. 예를 들어, 특정 질환 미세환경, 예컨대 종양 미세환경 (TME)은 다중 상이한 제시 분자에 의해 제시된 TGFβ1과, 예를 들어 LTBP1-프로TGFβ1, LTBP3-프로TGFβ1, GARP-프로TGFβ1, LRRC33-프로TGFβ1, 및 그의 임의의 조합과 회합될 수 있다. 한 콘텍스트의 TGFβ1 활성은 차례로 또 다른 콘텍스트의 TGFβ1 활성을 조절하거나 그에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 조절이상 시 질환 상태의 악화를 유발할 수 있는 가능성을 상승시킨다. 따라서, TGFβ1 이소형에 대한 이러한 억제 효과를 선택적으로 제한하면서 TGFβ1 기능의 다중 모드 (즉, 다중 콘텍스트)에 걸쳐 광범위하게 억제하는 것이 바람직하다. 목표는 상처 치유에서 중요한 역할을 하는 TGFβ3을 포함한 다른 이소형에 의해 매개되는 항상성 TGFβ 신호전달을 교란시키지 않는 것이다.

더욱이, 뮤린 섬유증 모델에서의 최근의 관찰은 조절이상 ECM을 갖는 조직에서 TGFβ3 억제의 유해한 효과 (실시예 17 참조)를 시사하며, 이는 TGFβ3의 역할이 항상성을 넘어 확장될 가능성을 상승시킨다. 충분한 증거는 ECM의 조절이상이 섬유증 및 암을 비롯한 다수의 질환 상태에서 발견된다는 것을 시사한다. 실제로, 주요 섬유화유발 유전자 중 다수가 또한 다양한 암의 마커 중에서 인식된다. 이들 마커는, 예를 들어 col1A1, col3A1, PAI-1, CCL2, ACTA2, FN-1, CTGF 및 TGFB1을 포함한다. 따라서, TGFβ3의 공동 차단이 섬유증에 유해한 것으로 보인다는 발견은 ECM 조절이상과 연관된 보다 넓은 범주의 상태에 적용가능할 수 있다.

상기 다루어진 TGFβ3을 억제하는 것에 대한 가능한 우려에 더하여, 문헌 [Takahashi et al., (Nat Metab. 2019, 1(2): 291-303)]은 최근에 대사를 조절하는데 있어서 TGFβ2의 유익한 역할을 보고하였다. 저자들은 TGFβ2를 운동-유도된 아디포카인으로서 확인하였으며, 이는 시험관내 글루코스 및 지방산 흡수, 뿐만 아니라 생체내 조직 글루코스 흡수를 자극하고; 비만 마우스에서 대사를 개선시키고; 고지방 식이-유도된 염증을 감소시켰다. 더욱이, 저자들은 운동 동안 근육으로부터 방출된 대사물인 락테이트가 인간 지방세포에서 TGFβ2 발현을 자극하였고, 락테이트-저하제가 순환 TGFβ2 수준을 감소시켰고, 운동-자극된 글루코스 내성의 개선을 감소시켰음을 관찰하였다. 이들 관찰은 TGFβ2이소형에 대한 억제 활성을 갖는 TGFβ 억제제의 치료 용도가 적어도 대사 측면에서 유해할 수 있다는 것을 시사한다.

따라서, 본 개시내용은 대상체에서 TGFβ-관련 적응증 (예를 들어, 섬유증)의 치료에 사용하기 위한 TGFβ 억제제를 제공하며, 여기서 TGFβ 억제제는 TGFβ1은 억제하지만 TGFβ2는 억제하지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 개선된 대사로부터 이익을 얻으며, 여기서 임의로, 대상체는 대사 질환, 예컨대 비만, 고지방 식이-유도된 염증, 글루코스 조절이상 (예를 들어, 당뇨병)을 갖거나 또는 그의 발생 위험이 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ-관련 적응증은 암이며, 여기서 임의로 암은 고형 종양, 예컨대 국부 진행성 암 및 전이성 암을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGFβ-관련 적응증은 골수섬유증이다. 일부 실시양태에서, TGFβ-관련 적응증은 면역 장애이다. 일부 실시양태에서, TGFβ-관련 적응증은 섬유증이다.

일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ2를 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-선택적이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ3을 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-선택적이다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ2 및 TGFβ3을 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-선택적이다.

치료 용도를 위한 TGFβ 억제제를 선택하는 관련 방법이 또한 본원에 포괄된다. 일부 실시양태에 따르면, TGFβ 억제제는 TGFβ-1 선택적이다.

바람직한 실시양태에 따르면, TGFβ1-선택적 억제제는 지방간 (예를 들어, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)) 또는 비-알콜성 지방간염 (NASH)과 연관된 섬유증을 갖는 환자를 치료하는데 사용하기 위해 선택된다. 이는 적어도 i) TGFβ3 억제를 회피하는 것이 ECM 조절이상 (이는 섬유증을 증가시킬 수 있음)을 악화시킬 위험을 감소시킬 수 있고, ii) TGFβ2 억제를 회피하는 것이 환자에서 대사 부담을 증가시킬 위험을 감소시킬 수 있다는 근거에 기초한다. 본 발명은 특정 기준 및/또는 임상 특색을 갖는 질환 상태를 치료하기 위해 "올바른 환자 집단"에 대한 "올바른 TGFβ1 억제제"를 선택하는 개념을 확장시킨다. 본원에 기재된 TGFβ1의 억제제가 유리한 효과 (예를 들어, 임상 이익)를 가질 가능성이 있는 적합한 적응증 및/또는 환자 집단을 확인/선택하는 것에 대해 적어도 2가지 의문이 이루어질 수 있다: i) 질환이 인간에서 다른 이소형에 비해 TGFβ1 이소형에 의해 우세하게 구동되거나 또는 그에 의존하는지 (또는 적어도 공동-우성); 및 ii) 질환이 매트릭스-회합된 및/또는 면역 세포-회합된 TGFβ1 기능 둘 다를 수반하는지.

3종의 공지된 TGFβ 이소형, 즉, TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3의 차등 발현은 정상 (건강한; 항상성)뿐만 아니라 질환 상태 하에서도 다양한 조직에서 관찰되었다 ("TGFB"는 때때로 단백질과 대조적으로 유전자를 지칭하는데 사용된다는 것을 주목한다). 그럼에도 불구하고, 이소형 선택성의 개념은 다중 이소형에 걸쳐 TGFβ의 범-억제를 선호하는 통상적인 접근법으로 완전히 활용되지도 달성되지도 않았다. 또한, 이소형의 발현 패턴은 정상 (항상성) vs. 비정상 (병리학적) 상태에서뿐만 아니라 환자의 상이한 하위집단에서 차등 조절될 수 있다. 대부분의 전임상 연구는 제한된 수의 동물 모델에서 수행되기 때문에, 이러한 모델을 사용하여 수득된 데이터는 편향되어, 인간 상태에 대한 적용가능성 (즉, 번역가능성)에 대한 데이터의 오해석 또는 잘못된 결론을 초래할 수 있다.

따라서, 본 발명은 전임상 동물 모델에서의 TGFβ 이소형의 차등 발현이 특정한 억제제의 유효성을 예측하는 데에서, 뿐만 아니라 인간 임상 상태로의 번역가능성에 관하여 전임상 데이터의 의미있는 해석에서 고려되어야 한다는 인식을 포함한다. 본원에 예시된 바와 같이, TGFβ1 및 TGFβ3은 전임상 연구에서 널리 사용되는 특정 뮤린 동계 암 모델 (예를 들어, EMT-6 및 4T1)에서 공동-우세하다 (도 13d 참조). 대조적으로, 수많은 다른 암 모델 (예를 들어, S91, B16 및 MBT-2)은 많은 인간 종양에서 관찰된 것과 유사하게 거의 독점적으로 TGFβ1을 발현하며, 여기서 TGFβ1은 TGFβ2/3보다 더 빈번하게 우성 이소형인 것으로 보인다 (도 13b 및 13c 참조). 또한, 항상성 조건 하에 우세하게 발현되는 TGFβ 이소형(들)은 질환-연관 이소형(들)이 아닐 수 있다. 예를 들어, 건강한 래트의 정상 폐 조직에서, 긴장성 TGFβ 신호전달은 주로 TGFβ3에 의해 매개되는 것으로 보인다. 그러나, TGFβ1은 질환 상태, 예컨대 폐 섬유증에서 현저하게 상향조절되는 것으로 보인다. 종합하면, 환자가 반응할 가능성이 있는 적합한 치료제를 선택하기 위해 임상 샘플에서 TGFβ 이소형의 상대 발현을 시험 또는 확인하는 것이 유익하다.

본원에 기재된 바와 같이, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 TGFβ1 이소형이 다른 이소형 (예를 들어, TGFβ1-우성으로 지칭됨)에 비해 우세하게 발현되는 질환의 치료에 특히 유리하다. 예로서, TGFB1 (좌측), TGFB2 (중앙) 및 TGFB3 (우측)의 상대 발현 수준을 갖는 인간 암 임상 샘플의 비제한적 목록을 도 13c에 제공한다. 3종의 이소형을 가로지르는 각각의 수평선은 단일 환자를 나타낸다. 관찰할 수 있는 바와 같이, 전체 TGFβ1 발현 (TGFB1)은 많은 종양/암 유형에 걸쳐 대부분의 이들 인간 종양/암에서 다른 2종의 이소형보다 유의하게 더 높으며, 이는 TGFβ1-선택적 억제가 이들 질환 유형에서 유익할 수 있음을 시사한다. 보다 최근의 생물정보학적 분석은 또한 TGFβ1이 다수의 질환 상태에서 1차 구동자라는 개념을 지지한다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGFβ1-선택적 억제제는 TGFβ1 및 TGFβ3의 공동-발현에도 불구하고 질환 (예를 들어, 섬유증, 고형 종양 등)을 치료하기에 충분하다. 일부 실시양태에서, 항체는 Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51 및 Ab52의 군으로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체이다. 바람직하게는, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab46 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

특정 경우에, 개별 환자로부터 수집된 임상 샘플에서 3종의 TGFβ 이소형 (즉, TGFβ1/TGFB1, TGFβ2/TGFB2 및 TGFβ3/TGFB3)의 상대 발현 수준을 시험 또는 확인하는 것이 유익하다. 이러한 정보는 개별 환자 또는 환자 집단에서 특정한 요법의 유효성에 대한 보다 우수한 예측을 제공할 수 있으며, 이는 임상 반응의 가능성을 증가시키기 위해 적절한 치료 요법 (예를 들어, 개별화/개인화 치료)의 선택을 보장하는 것을 도울 수 있다.

따라서, 본 발명은 본 개시내용에 따른 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 포함하는 요법에 반응할 가능성이 있는 환자 집단 또는 대상체를 선택하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 대상체로부터 수집된 생물학적 샘플 (예를 들어, 임상 샘플)을 제공하는 단계, 샘플에서 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3의 상대 수준을 결정 (예를 들어, 측정 또는 검정)하는 단계, 및 TGFβ1이 TGFβ2 및 TGFβ3에 비해 우성 이소형인 경우에; 및/또는 TGFβ1이 대조군과 비교하여 유의하게 과다발현되거나 상향조절되는 경우에, 대상체에게 TGFβ1 억제제를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 방법은 이전에 결정된 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3의 상대 발현 수준에 대한 정보를 수득하는 단계; TGFβ1-양성, 바람직하게는 TGFβ1-우성 질환을 갖는 대상체를 확인하는 단계; 및 대상체에게 TGFβ1 억제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 대상체는 요법 (예컨대 암 요법)에 저항성인 질환 (예컨대 암)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이러한 대상체는 요법에 대해 불내성을 나타내고, 따라서 요법을 중단하였거나 중단할 가능성이 있다. 치료 요법에 대한 TGFβ1 억제제의 부가는 제1 요법의 투여량을 감소시키는 것을 가능하게 할 수 있고, 여전히 조합된 임상 이익을 달성할 수 있다. 바람직하게는, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab46 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

이소형의 상대 수준은 관련 기술분야에 널리 공지된 RNA-기반 검정 및/또는 단백질-기반 검정에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 단계는 또 다른 요법, 예컨대 면역 체크포인트 억제제 또는 본원의 다른 곳에 제공된 다른 작용제를 또한 포함할 수 있다. 이러한 방법은 임의로 2개 이상의 시점에서 TGFβ1/TGFB1, TGFβ2/TGFB2 및 TGFβ3/TGFB3의 상대 수준의 변화를 모니터링함으로써 치료 반응을 평가하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 임상 샘플 (예컨대 생검)은 투여 전 및 후 둘 다에 수집된다. 일부 실시양태에서, 임상 샘플 (예컨대 생검)은 시간 경과에 따른 생체내 효과를 평가하기 위해 치료 후에 다수회 수집된다.

이소형 특이성의 측면에 대해 도출된 제1 문의에 더하여, 제2 문의는 특정한 질환에 수반되는 TGFβ1 기능의 폭을 조사한다. 이는 TGFβ1 콘텍스트의 수, 즉 제시 분자(들)가 질환-연관 TGFβ1 기능을 매개하는 것의 수에 의해 나타내어질 수 있다. TGFβ1-특이적, 넓은-콘텍스트 억제제, 예컨대 콘텍스트-비의존성 억제제는 TGFβ1 기능의 ECM 성분 및 면역 성분 둘 다를 수반하는 질환의 치료에 유리하다. 이러한 질환은 ECM의 조절이상뿐만 아니라 면역 세포 기능 또는 면역 반응의 교란과 연관될 수 있다.

환자의 특정한 상태가 TGFβ1 기능의 다중 측면을 수반하는지 또는 그에 의해 구동되는지는 환자로부터 수집된 임상 샘플에서 제시 분자의 발현 프로파일을 평가함으로써 평가될 수 있다. 발현 프로파일을 수득하기 위해 수행될 수 있는 RNA-기반 검정 및 단백질-기반 검정을 비롯한 다양한 검정이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 샘플(들)에서의 LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33의 상대 발현 수준 (및/또는 그의 변화/변경)은 상태와 연관된 TGFβ1 활성의 공급원 및/또는 콘텍스트를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 고형 종양으로부터 취한 생검 샘플은 모든 4종의 제시 분자의 높은 발현을 나타낼 수 있다. 예를 들어, LTBP1 및 LTBP3은 종양 기질 내의 CAF에서 고도로 발현될 수 있는 반면, GARP 및 LRRC33은 질환-연관 면역 세포, 예컨대 각각 Treg, MDSC 및 백혈구 침윤물에 의해 고도로 발현될 수 있다. 유사하게, LTBP1 및 LTBP3은 섬유화 미세환경 내에서 FAF (예를 들어, 근섬유모세포)에서 고도로 발현될 수 있는 반면, LRRC33은 섬유증-연관 면역 세포, 예컨대 M2 대식세포 및 MDSC에 의해 고도로 발현될 수 있다.

따라서, 본 발명은 질환에서 TGFβ2 및 TGFβ3에 비해 TGFβ1의 수반을 결정 (예를 들어, 시험 또는 확인)하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 질환-연관 TGFβ1의 공급원 (또는 콘텍스트)을 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 공급원/콘텍스트는 환자로부터 수집된 임상 샘플에서 TGFβ 제시 분자, 예를 들어, LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33의 발현을 결정하는 것에 의해 평가된다. 일부 실시양태에서, 조직 생검이 사용된다. 일부 실시양태에서, 조직병리학적 분석은 디지털 병리학을 포함할 수 있다.

이소형-선택적 TGFβ1 억제제, 예컨대 본원에 기재된 것은 인간 대상체에서 TGFβ1 조절이상과 연관된 매우 다양한 질환, 장애 및/또는 상태 (즉, TGFβ1-관련 적응증)를 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "TGFβ1 조절이상과 연관된 질환 (장애 또는 상태)" 또는 "TGFβ1-관련 적응증"은 TGFβ1의 발현, 활성 및/또는 대사와 관련된 임의의 질환, 장애 및/또는 상태 또는 TGFβ1의 활성 및/또는 수준의 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 임의의 질환, 장애 및/또는 상태를 의미한다. 바람직하게는, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab46 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

본 발명은 인간 대상체에서 TGFβ1 조절이상과 연관된 질환을 치료하는 방법에서의 이러한 이소형-특이적 TGFβ1 억제제의 용도를 포함한다. 이러한 억제제는 전형적으로 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 제약 조성물로 제제화된다. TGFβ는 ECM 성분, 구조 및 기능의 주요 조절인자이다. 유리하게는, 억제제는 ECM-회합된 TGFβ1 신호전달 및 면역 세포-회합된 TGFβ1 신호전달 둘 다를 표적화하지만, 생체내 TGFβ2 및/또는 TGFβ3 신호전달은 표적화하지 않는다. 일부 실시양태에서, 억제제는 ECM-회합된 프로TGFβ1 복합체에 우선적으로 결합함으로써 매트릭스 함요에서 TGFβ1 신호전달을 차단한다. 질환은 ECM 성분 또는 기능의 조절이상 또는 손상을 수반할 수 있고, 증가된 콜라겐 침착을 포함한다. 일부 실시양태에서, ECM 성분 또는 기능의 조절이상 또는 손상은 증가된 강성 및/또는 ECM 재편성을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ECM 성분 또는 기능의 조절이상 또는 손상은 질환 부위 내의 증가된 근섬유모세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, ECM의 조절이상은 매트릭스의 증가된 강성을 포함한다. 일부 실시양태에서, ECM의 조절이상은 피브로넥틴 및/또는 피브릴린을 포함한다. 바람직하게는, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab46 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

일부 실시양태에서, 질환은 골수 세포 증식 또는 분화의 조절이상 또는 손상을 특징으로 하며; 여기서 임의로 골수 세포의 조절이상 또는 손상은 질환 부위로의 단핵구 동원 또는 분극화된 M2 세포로의 분화, 및/또는 비정상적 대식세포 기능을 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포의 조절이상은 증가된 수준의 MDSC를 포함한다. 상승된 MDSC는, 예를 들어 말초 혈액에서 순환 MDSC의 증가된 수/빈도를 포함할 수 있다. 상승된 MDSC는 질환 부위, 예컨대 섬유화 조직 및 고형 종양에서 관찰될 수 있다. 용어 순환 및 순환성 ("순환 MDSC" 및 "순환성 MDSC"에서와 같음)은 상호교환가능하게 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 질환은 섬유화 장애 또는 질환 (예컨대 기관 섬유증)이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 TGFβ 억제제를 투여받는 대상체에서 섬유증을 치료하는데 순환 MDSC의 측정을 사용하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ2를 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-이소형 선택적이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ3을 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-이소형 선택적이다. 바람직하게는, TGFβ 억제제는 TGFβ2 및 TGFβ3을 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-이소형 선택적이다. 또한, 일부 실시양태에서, 순환 MDSC 집단은, 예를 들어 치료 효능의 다른 마커가 검출될 수 있기 전의 시점에, 섬유화 장애의 치료 효능의 초기 예측 바이오마커로서 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 질환은 상피-중간엽 이행 (EMT) 및/또는 내피-중간엽 이행 (EndMT)을 수반하는 비정상적 세포 분화를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 질환 부위 (예컨대 TME 및 섬유화 미세환경)에서 일어나는 이들 과정은 부위에서 증가된 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포를 발생시킨다. 이들은, 예를 들어 CAF 및 FAF를 포함한다.

일부 실시양태에서, 질환은 PAI-1, ACTA2, CCL2, Col1a1, Col3a1, FN-1, CTGF, 및 TGFB1로 이루어진 군으로부터 선택된 마커 유전자 중 1종 이상에서의 비정상적 유전자 발현을 특징으로 한다.

이러한 억제제의 치료 유효량은 질환을 앓고 있거나 질환으로 진단된 대상체에게 투여된다.

일부 실시양태에서, 섬유모세포 분화의 조절이상 또는 손상은 증가된 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포는 암-연관 섬유모세포 (CAF)이다. 일부 실시양태에서, CAF는 종양 기질과 연관되고, CCL2/MCP-1 및/또는 CXCL12/SDF-1을 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포는 섬유화 조직에 국재화된다.

일부 실시양태에서, 조절 T 세포의 조절이상 또는 손상은 증가된 Treg 활성을 포함한다.

일부 실시양태에서, 이펙터 T 세포 (Teff) 증식 또는 기능의 조절이상 또는 손상은 억제된 CD4+/CD8+ 세포 증식을 포함한다.

일부 실시양태에서, 골수 세포 증식 또는 분화의 조절이상 또는 손상은 골수 전구 세포의 증가된 증식을 포함한다. 골수 세포의 증가된 증식은 골수에서 발생할 수 있다.

일부 실시양태에서, 단핵구 분화의 조절이상 또는 손상은 질환 부위, 예컨대 섬유화 조직 및/또는 고형 종양에서 골수-유래 및/또는 조직 상주 단핵구의 대식세포로의 증가된 분화를 포함한다.

일부 실시양태에서, 단핵구 동원의 조절이상 또는 손상은 질환 부위, 예컨대 TME로의 증가된 골수-유래 단핵구 동원을 포함하며, 이는 증가된 대식세포 분화 및 M2 분극화, 이어서 증가된 TAM으로 이어진다.

일부 실시양태에서, 대식세포 기능의 조절이상 또는 손상은 대식세포의 M2 표현형으로의 증가된 분극화를 포함한다.

일부 실시양태에서, 골수 세포 증식 또는 분화의 조절이상 또는 손상은 증가된 수의 Treg, MDSC 및/또는 TAN을 포함한다.

TGFβ-관련 적응증은 부분적으로 이펙터 면역 세포 (예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)를 배제함으로써 신체의 정상 방어 메카니즘/면역을 억제하는 면역-배제된 질환 미세환경, 예컨대 종양 또는 암성 조직을 포함하는 상태를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 면역-배제 상태는 치료 (예를 들어, 암 요법)에 대한 불량한 반응성과 연관된다. 환자가 불량하게 반응하는 암 요법의 비제한적 예는 체크포인트 억제제 요법, 암 백신, 화학요법, 및 방사선 요법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정한 이론에 얽매이는 것을 의도하지는 않지만, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ 억제제는, T 세포 확장 및/또는 종양 내로의 침윤을 촉진함으로써 T 세포 (예를 들어, CD8+ 세포) 접근을 회복시킴으로써 항암 면역을 회피하거나 배제하는 종양의 능력에 대응하는 것을 도울 수 있는 것으로 고려된다.

따라서, TGFβ 억제는 이펙터 T 세포 접근 및 세포독성 이펙터 기능을 차단해제하고 회복시킴으로써 면역-배제된 질환 환경 (예컨대 TME)에서 치료 저항성 (예를 들어, 면역 체크포인트 저항성, 암 백신 저항성, CAR-T 저항성, 화학요법 저항성, 방사선 요법 저항성 등)을 극복할 수 있다. TGFβ 억제의 이러한 효과는, 예를 들어 CD8+ T 세포에 의해 매개되는 장기-지속 면역 기억을 추가로 제공할 수 있다.

TGFβ-관련 적응증의 비제한적 예는 기관 섬유증 (예를 들어, 신장 섬유증, 간 섬유증, 심장/심혈관 섬유증, 근육 섬유증, 피부 섬유증, 자궁 섬유증/자궁내막증 및 폐 섬유증)을 포함한 섬유증, 경피증, 알포트 증후군, 암 (혈액암 예컨대 백혈병, 골수섬유증, 다발성 골수종, 결장암, 신암, 유방암, 악성 흑색종, 교모세포종을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 고형 종양과 연관된 섬유증 (예를 들어, 암 결합조직형성, 예컨대 결합조직형성 흑색종, 췌장암-연관 결합조직형성 및 유방 암종 결합조직형성), 기질 섬유증 (예를 들어, 유방의 기질 섬유증), 방사선-유도된 섬유증 (예를 들어, 방사선 섬유증 증후군), 화학요법 후 신속 조혈의 촉진, 골 치유, 상처 치유, 치매, 골수섬유증, 골수이형성증 (예를 들어, 골수이형성 증후군 또는 MDS), 신질환 (예를 들어, 말기 신질환 또는 ESRD), 일측성 요관 폐쇄 (UUO), 치아 손실 및/또는 변성, 내피 증식 증후군, 천식 및 알레르기, 위장 장애, 노화의 빈혈, 대동맥류, 고아 적응증 (예컨대 마르팡 증후군 및 카무라티-엥겔만병), 비만, 당뇨병, 관절염, 다발성 경화증, 근육 이영양증 (예를 들어, 근긴장성 근육 이영양증, 뒤시엔느 근육 이영양증, 베커 근육 이영양증, 지대 근육 이영양증, 안면견갑상완 근육 이영양증, 선천성 근육 이영양증, 안인두 근육 이영양증, 원위 근육 이영양증 및 에머리-드레이푸스 근육 이영양증), 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 파킨슨병, 골다공증, 골관절염, 골감소증, 대사 증후군, 영양 장애, 기관 위축, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 및 식욕부진을 포함한다.

TGFβ-관련 적응증은 또한 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 부류 I이 결실 또는 결핍 (예를 들어, 하향조절)된 상태를 포함할 수 있다. 이러한 상태는 MHC-매개 신호전달의 1종 이상의 성분이 손상된 유전 장애, 뿐만 아니라 MHC 발현이 다른 인자, 예컨대 암, 감염, 섬유증 및 의약에 의해 변경된 상태를 포함한다.

예를 들어, 종양에서의 MHC I 하향조절은 면역 감시로부터의 종양 회피와 연관된다. 실제로, 종양 MHC 부류 I 발현의 상실을 포함한 T-세포 인식을 회피하는 것을 목표로 하는 면역 회피 전략이 악성 세포에서 통상적으로 발견된다. 종양 면역 회피는 면역 체크포인트 분자를 차단하는 항체를 사용하는 치료를 포함한 암 면역요법의 임상 결과에 대해 부정적 영향을 갖는 것으로 관찰되었다 (예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Garrido et al., (2017) Curr Opin Immunol 39: 44-51. "The urgent need to recover MHC class I in cancers for effective immunotherapy"]에서 검토됨). 따라서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 이소형-선택적, TGFβ1 억제제는 단독요법으로서 또는 또 다른 요법 (예컨대 체크포인트 억제제, 화학요법, 방사선 요법 등)과 함께 투여되어 항암 면역을 촉발시키거나 부스팅하고/거나 또 다른 요법에 대한 반응성 또는 그의 유효성을 증진시킬 수 있다.

MHC 부류 I 단백질의 하향조절은 또한 바이러스 감염, 예컨대 HIV를 비롯한 특정 감염성 질환과 연관된다. 예를 들어, 본원에 참조로 포함되는 문헌 [Cohen et al., (1999) Immunity 10(6): 661-671. "The selective downregulation of class I major histocompatibility complex proteins by HIV-1 protects HIV-infected cells from NK Cells"]을 참조한다. 따라서, 본 개시내용에 의해 포괄되는 이소형-선택적, TGFβ1 억제제는 단독요법으로서 또는 또 다른 요법 (예컨대 항바이러스 요법, 프로테아제 억제제 요법 등)과 함께 투여되어 숙주 면역을 촉발시키거나 부스팅하고/거나 또 다른 요법에 대한 반응성 또는 그의 유효성을 증진시킬 수 있다.

섬유화 상태

물리적 손상/외상, 독성 물질, 및/또는 감염으로 인한 조직 손상에 반응하여, 섬유모세포, 여러 상이한 유형의 면역 세포, 및 상주 상피 및 내피 세포를 포함한 여러 세포 유형을 수반하는 자연 복구 과정이 시작된다. 그러나, 체크하지 않고 방치하면, 이러한 과정은 세포외 매트릭스 (ECM)의 과도한 축적 및 섬유증으로 이어질 수 있고, 이는 다시 조직 기능의 진행성 상실 및 기관 부전으로 이어질 수 있다 (Caja et al., Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1294).

섬유증은 폐, 신장, 간, 심장 및 피부를 비롯한 여러 상이한 기관에서 발생할 수 있다. 기관에 비의존적으로, 섬유화 반응은 염증, 변경된 상피-중간엽 상호작용, 및 섬유모세포의 증식을 특징으로 한다. 섬유증의 특징 중 하나는 섬유모세포의 근섬유모세포로의 분화이며, 이는 ECM의 조절이상에 크게 기여한다. 그러나, 근섬유모세포는 또한 다른 세포 공급원 (예를 들어, 내피 세포, 상피 세포, 및 중간엽 줄기 세포)으로부터 유래되는 것으로 제안되었다 (Kim, K.K. et al., Cold Spring Harb. Perspect. Biol., 2017; Okabe, H. Histol. Histophathol., 2016, 31, 141-148; 및 Li, C et al., Nat Commun., 2016, 7, 11455). 더욱이, 면역 세포는 근섬유모세포의 분화를 촉진하고, ECM 침착을 자극하고, 추가의 면역 세포를 손상된 조직으로 동원하는 시토카인 및 케모카인을 분비함으로써 과정에서 중요한 역할을 한다 (Caja et al., Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 1294).

섬유화 조직에서의 섬유모세포의 활성화와 유사하게, 암-연관 섬유모세포 (CAF)의 활성화가 종양 환경에서 발생할 수 있으며, 이는 과량의 ECM을 생산한다. ECM은 다른 세포 (예를 들어, 종양발생촉진 면역 세포)의 침윤을 위한 스캐폴드 및 세포 이동을 위한 기질을 제공한다. 다른 경우에, 과도한 ECM은 항종양발생 면역 세포에 대한 장벽으로서 작용할 수 있다.

TGFβ는 섬유화 반응의 중심 조정자로서 인식된다. TGFβ는 근섬유모세포 분화를 촉진하고, 면역 세포를 동원하고, 상피 및 내피 세포 분화에 영향을 미칠 수 있다. 특히, TGFβ는 ECM 및 기저막 단백질, 예컨대 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 오스테오폰틴, 테나신, 엘라스틴, 데코린의 생산을 상향조절한다. TGFβ-유도된 근섬유모세포 분화는 ECM 단백질의 추가의 침착, 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)의 분비, 및 근섬유모세포 증식으로 이어질 수 있다 (Fabregat et al., FEBS J. 2016, 283, 2219-2232; Meng et al., Nat. Rev. Nephrol. 2016, 12, 325-338; 및 Kulkarni et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2016, 54, 751-760). 추가적으로, TGFβ는 혈관 평활근 세포 (VSCM)에서 수축 단백질 및 콜라겐 I에 영향을 미치는 표현형 변화를 매개하고, 근섬유모세포 및 다른 기질 세포를 활성화시켜 콜라겐 가교 단백질, 예컨대 리실 옥시다제 (LOX) 패밀리의 매트릭스-재형성 효소의 합성을 증진시킬 수 있다 (Busnadiego et al., Mol. Cell. Biol. 2013, 33, 2388-2401). 또한, TGFβ는 섬유화유발 세포 유형, 예컨대 근섬유모세포 및 CAF의 분화에 기여하는 EMT 및 EndMT 둘 다를 조절하는 것으로 제시되었다. 또한, TGFβ는 상피 아폽토시스를 유도하며, 이는 다른 조직 중에서도 폐 및 간 섬유증을 촉진할 수 있는 것으로 제시되었다 (Barbas-Filho et al., J. Clin. Pathol. 2001, 54, 132-138; 및 Wang et al., Dev. Dyn. 2017, 247, 492-508).

선천성이든 동원된 것이든, 대식세포는 조직 손상 및 복구에 반응하는데 중요한 역할을 한다. 그러나, 특정 신호 시 이들은 섬유화유발성이 될 수 있다. TGFβ는, 다른 시토카인 중에서도, 또한 염증유발성인 M2 대식세포를 활성화시키는 것으로 제시되었다. 활성화 시, 이들 대식세포는 TGFβ, ECM 성분, 혈관신생 인자 및 화학주성 인자를 포함한 그 자신의 시토카인을 분비한다. M2 대식세포는 TGFβ-구동된 폐 섬유증에 본질적인 것으로 제시되었다 (Murray et al., Int. J. Biochem. Cell Biol. 2011, 43, 154-162).

따라서, 본 발명에 따르면, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 대상체에서 섬유증 (예를 들어, 섬유화 적응증, 섬유화 상태)의 치료에 사용된다. 본 발명을 수행하기에 적합한 억제제는 섬유증을 변경시키거나 호전시키는데 유용할 수 있는 본 개시내용에 따른 항체 및/또는 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로, 이러한 항체 및/또는 조성물은 다양한 유형의 제시 분자에 의해 제시된 TGFβ1을 표적화할 수 있는 TGFβ1의 선택적 길항제이다.

TGFβ를 표적화하는 항체는 수많은 전임상 모델에서 섬유증을 감소시킨다. 이러한 항체 및/또는 항체-기반 화합물은 LY2382770 (일라이 릴리, 인디애나주 인디애나폴리스, 예를 들어 크리에이티브 바이오랩스(Creative Biolabs)로부터 입수가능함, CAT#: TAB-605CL)을 포함한다. 또한, 미국 특허 번호 US 6,492,497, US 7,151,169, US 7,723,486 및 US 8,383,780에 기재된 것이 포함되며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 선행 기술 TGFβ 길항제는, 예를 들어 TGFβ의 인테그린-의존성 활성화를 표적화하고 차단하는 작용제를 포함한다.

그러나, 증거는 이러한 선행 기술 작용제가 이소형-특이적 억제를 매개하지 않을 수 있고, TGFβ2 및/또는 TGFβ3의 정상 기능을 의도치 않게 차단함으로써 원치않는 효과를 유발할 수 있음을 시사한다. 실제로, 본원에 제시된 데이터는 이러한 개념을 지지한다. 정상 (비이환) 폐 조직은 비교적 낮지만 측정가능한 수준의 TGFβ2 및 TGFβ3을 함유하지만, 현저하게 더 적은 TGFβ1을 함유한다. 비교하면, 특정 질환 상태 예컨대 섬유증에서, TGFβ1은 다른 이소형에 비해 우선적으로 상향조절된다. 바람직하게는, 이러한 상태의 치료에 사용하기 위한 TGFβ 길항제는 조직에서 장성 신호전달을 매개하도록 정상적으로 발현되는 다른 이소형의 기능을 보존하면서, 단지 질환-유도되거나 질환-연관된 이소형에 대해서만 그의 억제 활성을 발휘한다. 선행 기술 억제제 (LY2109761 (CAS 번호 700874-71-1, 일라이 릴리), 소분자 TGFβ 수용체 길항제, 및 α_Vβ₆ 인테그린을 표적화하는 모노클로날 항체) 둘 다는 비-이환 래트 BAL에서 TGFβ 하류 장성 신호전달을 억제하는 것으로 제시되며, 이는 이들 억제제가 원치 않는 부작용을 유발할 수 있는 가능성을 제기한다. 대안적으로 또는 추가적으로, TGFβ의 인테그린-의존성 활성화를 표적화하고 차단하는 작용제는 다양한 세포 유형에 의해 발현되고 발병기전에서 소정의 역할을 하는 수많은 인테그린 유형 중에서, 질환-연관 TGFβ1 활성화를 담당하는 인테그린의 하위세트만을 차단할 수 있다. 또한, 이러한 길항제가 TGFβ1 이소형의 인테그린-매개 활성화를 선택적으로 차단할 수 있는 경우에도, 이는 다른 방식, 예컨대 프로테아제-의존성 활성화에 의해 촉발된 TGFβ1 활성화를 차단하는데 비효과적일 수 있다. 대조적으로, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 이소형 선택성을 유지하면서 특정한 활성화 방식에 상관없이 TGFβ1의 활성화 단계를 막는 것을 목표로 한다. 바람직하게는, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab46 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

세포-회합된 항원 복합체보다 매트릭스-회합된 항원 복합체를 우선적으로 억제하는 (즉, 콘텍스트-편향을 나타내는) 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 특정 임상 상황에서 치료 이점을 제공할 수 있는 것으로 추가로 고려된다. 예를 들어, TGFβ1 억제제 (모든 4종의 항원 복합체를 표적화함)는 세포-회합된 TGFβ1 (예를 들어, 조절 T 세포 상에서 발현되는 GARP-TGFβ1)의 표적화를 통해 면역 활성화를 증가시킬 수 있다. 면역 활성화는 특정 환자, 예를 들어 자가면역 질환을 갖거나 패혈증의 위험이 있는 환자에게 불리할 수 있다. 따라서, 콘텍스트-편향 항체는 면역 활성화를 최소화하면서 매트릭스-회합된 TGFβ1 복합체와 연관된 질환 (예를 들어, 섬유증)을 치료하는데 유용할 수 있다.

상기 논의된 바와 같이, TGFβ3에 대한 억제 효력은 섬유증이 우려되는 상황에서 요법으로서 사용될 TGFβ 억제제의 바람직하지 않은 특색일 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ3을 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-이소형 선택적이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ2를 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-이소형 선택적이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ2 및 TGFβ3을 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-이소형 선택적이다.

이소형-특이적 TGFβ3 억제제는 특정한 질환 상태에서 치료 이익을 제공할 수 있는 것으로 추가로 고려된다. 예를 들어, TGFβ1 억제제로 치료될 특정 섬유화 질환은 또한 질환 조직 (예를 들어, 섬유화 조직)이 이소형 둘 다를 발현하는 것을 특징으로 하는 TGFβ3-양성일 수 있다 (즉, TGFβ1+/TGFβ3+ 섬유화 조직). 따라서, 본 발명은 이러한 상태 (즉, TGFβ1+/TGFβ3+ 섬유화 조직)의 치료에서의 이소형-선택적 TGFβ3 억제제와 함께 이소형-선택적 TGFβ1 억제제의 용도를 포함한다. 이러한 TGFβ3 억제제는 콘텍스트-비의존성 또는 콘텍스트-편향일 수 있다.

본 개시내용의 항체 및/또는 조성물이 치료적으로 사용될 수 있는 섬유화 적응증은 폐 적응증 (예를 들어, 특발성 폐 섬유증 (IPF), 만성 폐쇄성 폐 장애 (COPD), 알레르기성 천식, 급성 폐 손상, 호산구성 식도염, 폐동맥 고혈압 및 화학적 기체-손상), 신장 적응증 (예를 들어, 당뇨병성 사구체경화증, 초점성 분절성 사구체경화증 (FSGS), 만성 신장 질환 (CKD), 신장 이식 및 만성 거부와 연관된 섬유증, IgA 신병증, 당뇨병성 신장 질환 (DKD), 및 용혈성 요독성 증후군), 간 섬유증 (예를 들어, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 만성 바이러스성 간염, 기생충혈증, 선천성 대사 이상, 독소-매개 섬유증, 예컨대 알콜 섬유증, 비-알콜성 지방간염-간세포성 암종 (NASH-HCC), 원발성 담즙성 간경변증, 및 경화성 담관염과 연관되거나 그에 의해 유발된 것), 심혈관 섬유증 (예를 들어, 심근병증, 비대성 심근병증, 아테롬성동맥경화증 및 재협착), 전신 경화증, 피부 섬유증 (예를 들어, 전신 경화증에서의 피부 섬유증, 미만성 피부 전신 경화증, 경피증, 병리학적 피부 반흔형성, 켈로이드, 수술후 반흔형성, 반흔 교정 수술, 방사선-유도된 반흔형성 및 만성 상처), 눈-관련 상태, 예컨대 망막하 섬유증, 포도막염 증후군, 특발성 복막후 섬유증과 연관된 포도막염, 외안근 섬유증, 주요 조직적합성 복합체 (MHC 부류 I) 또는 조직적합성 항원과 연관된 안질환, 황반 변성 (예를 들어, 연령-관련 황반 변성)에서의 망막하 섬유증 및 암 또는 속발성 섬유증 (예를 들어, 골수섬유증, 두경부암, M7 급성 거핵모구성 백혈병 및 점막염)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 섬유증과 관련된 다른 질환, 장애 또는 상태 (퇴행성 장애 포함)는 자궁선근증, 자궁내막증, 마르팡 증후군, 강직 피부 증후군, 경피증, 류마티스 관절염, 골수 섬유증, 크론병, 궤양성 결장염, 전신 홍반성 루푸스, 근육 이영양증 (예컨대 DMD), 파킨슨병, ALS, 듀피트렌 구축, 카무라티-엥겔만병, 신경 반흔형성, 치매, 증식성 유리체망막병증, 각막 손상, 녹내장 배액 수술 후의 합병증, 및 다발성 경화증 (MS)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 많은 이러한 섬유화 적응증은 또한 이환 조직(들)의 염증과 연관되며, 이는 면역 성분의 수반을 나타낸다. 이러한 염증은 이상 면역 세포 집단, 예컨대 Th17 세포의 증가된 수, Treg 세포의 감소된 수, 및/또는 둘 다를 동반할 수 있다. 각각의 경우에, 이환된 환자는 증가된 Th17/Treg 세포 비를 나타낼 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법으로 치료될 수 있는 섬유화 적응증은 기관 섬유증, 예컨대 폐의 섬유증 (예를 들어, IPF), 신장의 섬유증 (예를 들어, CKD와 연관된 섬유증), 간의 섬유증 (예를 들어, NASH와 연관되거나 또는 그로 인한 것), 심장 또는 심장 조직의 섬유증, 피부의 섬유증 (예를 들어, 경피증), 자궁 (예를 들어, 자궁내막, 자궁근층)의 섬유증, 근육 (예를 들어, 골격근)의 섬유증, 및 골수의 섬유증을 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 요법은 환자에서 기관 이식에 대한 필요를 감소시키거나 지연시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 요법은 환자의 생존을 연장시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 개시된 것과 같은 TGFβ1 억제제는 기관 이식에 대한 필요를 지연시키거나 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 기관 이식은 폐 이식, 간 이식 또는 신장 이식이다.

IPF를 치료하기 위해, 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 환자는 가족성 IPF를 갖는 자 및 산발성 IPF를 갖는 자를 포함한다. TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 치료 유효량의 투여는 폐 조직에서 근섬유모세포 축적을 감소시키고, 콜라겐 침착을 감소시키고, IPF 증상을 감소시키고, 폐 기능을 개선시키거나 유지시키고, 생존을 연장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 IPF의 섬유화 환경 내에서 ECM-회합된 TGFβ1 (예를 들어, LTBP1/3에 의해 제시된 프로/잠재성 TGFβ1)의 활성화를 차단한다. 억제제는 임의로 대식세포-회합된 TGFβ1 (예를 들어, LRRC33에 의해 제시된 프로/잠재성 TGFβ1), 예를 들어 폐포 대식세포의 활성화를 추가로 차단할 수 있다. 그 결과, 억제제는 피브로넥틴 방출 및 다른 섬유증-연관 인자를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 간 성상 세포 활성화를 차단한다.

일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 치료 유효량)로의 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 IPF를 갖는 환자는 폐 이식에 대한 후보인 대상체이다. 일부 실시양태에 따르면, 본원에 기재된 조성물 (예를 들어, TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 치료 유효량)로의 치료로부터 이익을 얻을 수 있는 IPF를 갖는 대상체자는 폐 이식에 대한 후보가 아닌 대상체이다.

일부 실시양태에 따라, IPF를 갖는 환자에게 본원에 기재된 조성물이 제2 작용제와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에 따르면, 제2 작용제는 피르페니돈, 닌테다닙 및/또는 N-아세틸시스테인 중 1종 이상이다. 일부 실시양태에 따르면, IPF를 갖는 환자에게 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 치료 유효량이 피르페니돈, 닌테다닙 및/또는 N-아세틸시스테인 중 1종 이상과 조합되어 투여된다.

간 성상 세포 (HSC)의 활성화가 간 손상에서 섬유증의 중심 구동자라는 것은 널리 확립되어 있다. 이러한 과정에서, 정지 비타민-A-저장 세포는 증식성 섬유발생 근섬유모세포 (세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 축적의 주요 공급원)로 전환분화된다. 그러나, 이러한 과정은 자가포식, 내형질 세망 스트레스, 산화성 스트레스, 레티놀 및 콜레스테롤 대사, 후성학, 및 수용체-매개된 신호를 포함한 많은 상이한 경로에 의해 매개되는 것으로 제시되었다. 더욱이, 대식세포, 간세포, 간 동모양혈관 내피 세포, 자연 킬러 세포, 자연 킬러 T 세포, 혈소판 및 B 세포를 포함한 염증 세포가 또한 HSC 활성화를 조정하는 것으로 제시되었다 (Tsuchida and Friedman, Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology volume 14, pages 397-411 (2017)). 단지 하나의 특정한 예에서, 세키(Seki) 등은 TLR4 (박테리아에 의해 제시된 LPS를 인식함) 활성화가 케모카인 분비의 상향조절로 이어지고, 쿠퍼 세포의 화학주성을 유도하고, 또한 HSC를 TGFβ-유도된 신호에 대해 감작화시키고, 쿠퍼 세포의 비제한적 활성화를 가능하게 한다는 것을 입증하였다 (Seki et al., Nature Medicine volume 13, pages 1324-1332 (2007)).

염증은 간 섬유증 발생 및 진행에서 주요 역할을 하는 것으로 널리 공지되어 있다. 구체적으로, 간 손상은 염증, 및 TGFβ를 포함한 섬유화유발 인자를 생산하는 단핵구/대식세포 (뿐만 아니라 림프구, 호산구 및 형질 세포)의 동원으로 이어진다. 또한, 연구는 간 조직-상주 대식세포 (쿠퍼 세포) 및 골수-유래 동원된 대식세포 둘 다가 간 섬유증의 진행에서 중요한 역할을 하고, TGFβ 경로가 간 섬유증 동안 대식세포의 분극화 및 섬유화유발 기능을 촉진할 수 있다는 것을 나타낸다. 실제로, 쿠퍼 세포 및 동원된 대식세포 둘 다는 HSC를 활성화시키고, TGFβ를 포함한 주변분비 메카니즘에 의해 그의 근섬유모세포로의 전환분화를 유도할 수 있는 것으로 제시되었다. 이어서, 근섬유모세포는 섬유증으로 이어지는 ECM 성분을 생산하고 침착시킨다 (Fabregat and Caballero-Diaz, Front Oncol. 2018; 8: 357).

그러나, 근섬유모세포는 또한 문맥 및 상주 섬유모세포, 골수-유래 섬유세포, EMT를 겪은 간 상피 세포, EndMT를 겪은 내피 세포, 및 혈관 평활근 세포 및 혈관주위세포를 비롯한 다른 공급원으로부터 기원할 수 있다. 실제로, TGFβ는 또한 EndMT 및 EMT 둘 다를 조절하여 근섬유모세포 증가를 발생시키며, 이는 간 섬유증을 구동하는 것으로 제시되었다. (Pardali et al., Int J Mol Sci. 2017 Oct; 18(10): 2157). 따라서, TGFβ를 표적화하는 것은 섬유화 상태의 치료를 위한 매력적인 치료 표적이었다.

TGFβ는 간 섬유증 및 질환 진행에서 많은 역할을 하는 것으로 제시되었다. 예를 들어, TGFβ는 HSC의 근섬유모세포로의 활성화를 담당하는 것으로 제시되었다. TGFβ는 또한 근섬유모세포 집단을 증가시키는데 기여할 수 있는 간세포에서의 상피-중간엽 이행 (EMT)을 매개하는 것으로 제시되었다. 또한, TGFβ는 종양 세포 가소성의 변화를 유도하는 것으로 제시되었다 (Fabregat and Caballero-Diaz, Front Oncol. 2018; 8: 357).

TGFβ는 섬유화 및/또는 종양 미세환경에서 많은 상이한 세포 공급원 상에서 발견될 수 있고, 따라서 이는 다수의 상이한 제시 분자 (예를 들어, LTBP1, LTBP3, GARP 및/또는 LRRC33)에 의한 TGFb 제시를 시사할 수 있지만, 특정 상황에서 다른 것보다 TGFβ의 특정한 공급원을 표적화하는 것이 유익할 수 있다. 예를 들어, 헨더슨(Henderson) 등은 HSC에서 αv 인테그린을 결실시키는 것이 마우스를 CCL₄-유도된 간 섬유증으로부터 보호하였음을 나타내었다 (Henderson et al., Nat. Med. 2013, 19, 1617-16-24). 인테그린은 LTBP-제시된 TGFβ의 주요 활성화제이기 때문에, 이러한 결과는 LTBP-제시된 TGFβ를 표적화하는 것이 특정 상황에서 섬유증을 치료하는데 충분할 수 있다는 것을 시사한다. 그러나, 면역 세포는 섬유화 반응에서 중요한 역할을 하기 때문에, 대부분의 또는 모든 제시-분자 TGFβ 복합체에 의해 제시된 TGFβ를 표적화하는 TGFβ 억제제가 유익할 수 있다.

최근 수년간, 간 섬유증의 치료는 전세계적으로 그의 증가하는 유병률로 인해 관심 분야가 되었다. 예를 들어, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD)은 대사 이상, 예컨대 비만, 인슐린 저항성, 공복 고혈당증, 이상지혈증 및 변경된 아디포카인 프로파일과 연관된다. NAFLD는 간세포에서의 과도한 지질 축적을 특징으로 하고, 간 지방증 (간세포에서의 지질/지방 액적 축적)으로부터 비-알콜성 지방간염 (NASH), 간 섬유증, 및 궁극적으로 가장 중증 사례인 간경변증으로 진행되는 질환의 스펙트럼이다. 섬유증 또는 간경변증을 갖는 NASH는 간세포성 암종 (HCC)의 발생 위험을 증가시킨다 (Starley BQ, et al., Hepatology 2010; 51: 1820-1832). 지방증에서 NASH로의 진행은 '다중-히트' 모델에 의해 조절되는 것으로 제안되었으며, 여기서 제1 히트는 인슐린 저항성 및 대사 장애이고, 이는 간 지방증에 이어서 산화성 스트레스, 염증유발 시토카인-매개된 간세포 손상, 유리 지방산에 의해 매개되는 변경된 지질 분할 및 간독성, 비정상적 간내 콜레스테롤 로딩, 고인슐린혈증, 고렙틴혈증 및 저아디포넥틴혈증으로 이어진다 (Tilg H, Moschen AR, Hepatology 2010; 52: 1836-1846; 및 Yilmaz Y., Aliment Pharmacol Ther 2012; 36: 815-823).

간 섬유증을 연구하기 위해 개발된 많은 동물 모델이 존재한다. 예를 들어, 마우스에서의 고지방 식이는 인간 NAFLD의 조직병리학 및 발병기전 둘 다를 모방하는 것으로 제시되었다. 또한, 일부 유전 모델, 예컨대 db/db 및 ob/ob 마우스 모델은 또한 인간 대사 증후군 및 NAFLD의 특색을 나타낸다. 또한, NASH의 연구를 위한 동물 모델이 존재하며, 이는 주로 메티오닌 및 콜린-결핍 식이 (MCD), 고콜레스테롤 식이 (HCD), 콜린-결핍 고지방 식이 (CDHFD), 콜린-결핍 L-아미노산-결핍 식이, 콜린-결핍 L-아미노산-결핍 식이 + 사염화탄소, 고지방 식이 + 스트렙토조토신, 고지방 + 고콜레스테롤 식이 (HFHC), 고프룩토스 식이 (HFD), 및 고프룩토스 고지방 식이 (HFHF)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 식이-유도된 모델로 이루어진다. NASH의 연구를 위한 유전 마우스 모델은 foz/foz 마우스, 간세포-특이적 PTEN-결핍 마우스, Db/db 마우스 + 디에틸니트로사민 (DEN), 및 db/db 마우스 + MCD를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 각각의 플러스 및 마이너스를 포함한 모든 이들 모델의 세부사항은 문헌 [Jennie Ka Ching Lau et al., J Pathol 2017; 241: 36-44]에 요약되어 있으며; 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

간 섬유증에서 이소형-특이적 TGFβ 억제제의 효능을 시험하는데 유용한 또 다른 모델은 사염화탄소 (CCL₄) 모델 및 콜린 결핍 고지방 식이 (CDHFD) 간 섬유증 모델을 포함한다. 간 섬유증에서 이소형-특이적 TGFβ 억제제의 효능을 시험하는데 유용한 또 다른 모델은 담관 결찰 (BDL) 모델을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Tag et al., J Vis Exp. 2015; (96): 52438] 참조).

본원에 논의된 바와 같이, TGFβ2/3 억제의 유해 효과의 가능성을 시사하는 일련의 증거에 기초하여, TGFβ2 및/또는 TGFβ3에 대한 억제 효력은 섬유증이 우려되는 상황에서 요법으로서 사용될 TGFβ 억제제의 바람직하지 않은 특색일 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 간 상태 예컨대 NAFLD 및 NASH의 치료에 사용하기 위한 바람직한 억제제는 TGFβ1-이소형 선택적이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ3을 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-이소형 선택적이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ2를 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-이소형 선택적이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ2 및 TGFβ3을 억제하지 않는다는 점에서 TGFβ1-이소형 선택적이다.

본원에 제공된 것과 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 간의 섬유화 상태, 예컨대 지방간 (예를 들어, 비-알콜성 지방간 질환 (NAFLD) 및 비-알콜성 지방간염 (NASH))을 치료하는데 사용될 수 있다. 지방간은 염증화될 수 있거나 염증화되지 않을 수 있다. 지방간으로 인한 간의 염증 (즉, 지방간염)은 반흔형성 (섬유증)으로 발달할 수 있고, 이는 이어서 종종 간경변증 (간의 구조를 왜곡시키고 그의 기능을 손상시키는 반흔형성)으로 진행한다. 따라서, 억제제는 이러한 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 간의 섬유화 환경 내에서 ECM-회합된 TGFβ1 (예를 들어, LTBP1/3에 의해 제시된 프로/잠재성 TGFβ1)의 활성화를 차단한다. 억제제는 임의로 대식세포-회합된 TGFβ1 (예를 들어, LRRC33에 의해 제시된 프로/잠재성 TGFβ1), 예를 들어 쿠퍼 세포 (또한 성상 대식세포로도 공지됨)뿐만 아니라 침윤 단핵구-유래 대식세포 및 MDSC의 활성화를 추가로 차단할 수 있다. 그 결과, 억제제는 섬유증-연관 인자 (예를 들어, 본원에 기재된 섬유화 마커)를 억제할 수 있다. 이러한 상태를 갖는 대상체에서의 억제제의 투여는, 억제제로 치료되지 않은 대조군 집단과 비교하여, 억제제로 치료된 환자 집단에서 1종 이상의 증상을 감소시키고/거나, 질환의 진행을 방지 또는 지연시키고/거나, 간에서의 지방 축적을 감소 또는 안정화시키고/거나, 질환-연관 바이오마커 (예컨대 혈청 콜라겐 단편)를 감소시키고/거나, 간 반흔형성을 감소시키고/거나, 간 강성을 감소시키고/거나, 달리 임상적으로 의미있는 결과를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제의 유효량은 NASH 환자에서 감소된 간 지방 및 감소된 섬유증 (예를 들어, 반흔형성) 둘 다를 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제의 유효량은 NASH 환자에서 지방간염을 악화시키지 않으면서 섬유증의 적어도 하나의 병기만큼 개선을 달성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제의 유효량은 NASH 환자에서 간부전 및/또는 간암의 발생률을 감소시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 억제제의 유효량은, 대조군과 비교하여, 요법의 시작 후에, 예를 들어 12-36주에 평가된 바와 같이 다중 염증성 또는 섬유화 혈청 바이오마커의 수준을 정상화할 수 있다. 일부 실시양태에서, 염증성 또는 섬유화 바이오마커는 NAFLD의 중증도를 평가하고/거나 (간 지방증의 수준을 측정함으로써), 치료를 위한 환자를 선택하고/거나, 질환 진행 또는 치료 반응을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 혈액 바이오마커 및 패널은 하기를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다:

i) 지방간 지수 (BMI, 허리 둘레, 혈청 트리글리세리드, 및 감마-글루타밀트랜스퍼라제 (GGT);

ii) 간 지방증 지수 (혈청 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST):알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 비, BMI, 성별, 및 당뇨병의 존재);

i) NAFLD 간 지방 점수 (혈청 ALT, HDL 콜레스테롤, 트리글리세리드, 헤모글로빈 A_1c 및 백혈구 계수);

ii) 스테아토테스트(SteatoTest) (바이오프레딕티브(BioPredictive)) (총 빌리루빈, GGT, α2-마크로글로빈, 합토글로빈, ALT, 아포지단백질 AI, 총 콜레스테롤, 트리글리세리드, 글루코스의 혈청 수준 (연령 및 성별에 대해 조정됨) 및 BMI); 및

iii) NAFLD 릿지 점수 (ALT, HDL 콜레스테롤, 트리글리세리드, 헤모글로빈 A_1c의 혈청 수준, 백혈구 계수, 및 동반이환율 데이터 (및 고혈압의 존재)).

일부 실시양태에서, 영상화 바이오마커는 간 지방증의 수준을 평가하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 영상화 바이오마커는 초음파검사, 제어된 감쇠 파라미터 (CAP), MRI-추정 양성자 밀도 지방 분율 (MRI-PDFF), 및 자기 공명 분광분석법 (MRS)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

간 생검은 NASH 진단을 위한 현행 표준이지만, 병리학자들 사이의 가변성은 이러한 진단 방법의 유효성을 제한한다. 따라서, 지방간 진행 억제 (FLIP) 알고리즘 (조직학적 지방증, 활성 및 섬유증 점수를 포함함)의 사용은 생검에 의한 NASH 진단의 일관성을 개선시키기 위해 사용될 수 있다. 더욱이, 많은 비침습적 바이오마커가 또한 질환을 진단하고 모니터링하는데 유용할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 염증성 또는 섬유화 바이오마커는 NASH의 중증도를 평가하고/거나, 치료를 위한 환자를 선택하고/거나, 질환 진행 또는 치료 반응을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 혈액 바이오마커는 다음을 포함할 수 있다:

i) 아폽토시스 마커, 예컨대 CK18 단편, 총 시토케라틴 및 sFAS;

ii) 염증 마커, 예컨대 CRP, TNF, IL-8, 및 CXCL10;

iii) 지질 산화 생성물, 예컨대 11-HETE, 9-HODE, 13-HODE, 12-옥소-ODE, LA-13-HODE (oxNASH점수), 및 11,12-디HETrE;

iv) 리소솜 효소, 예컨대 카텝신 D; 및

v) 조합 패널, 예컨대 NASH테스트 (바이오프레딕티브) 및 NASH 진단 패널 (당뇨병의 존재, 성별, BMI, 및 트리글리세리드, CK18 단편, 및 총 CK18의 혈청 수준을 포함함).

일부 실시양태에서, 바이오마커 및 관련 패널은 섬유증 및/또는 간경변증의 수준을 진단하고/거나, 치료를 위한 환자를 선택하고/거나, 질환 진행 또는 치료 반응을 모니터링하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 간 섬유증 및 간경변증의 비침습적 시험은 AST:ALT 비, AST:혈소판 비 지수, 섬유증-4 지수 (연령, AST, ALT, 및 혈소판 계수), NAFLD 섬유증 점수 (연령, BMI, 공복 글루코스 장애 및/또는 당뇨병, AST ALT, 혈소판 계수, 및 알부민), BARD 점수 (AST, ALT, BMI, 및 당뇨병)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

구체적 섬유증 마커 및 패널이 또한 유용할 수 있고, 히알루론산; PIIPNP; 프로-C3; TIMP1; 라미닌; 증진된 간 섬유증 (ELF) 패널 (PIINP, 히알루론산, TIMP1); 피브로테스트 (GGT, 총 빌리루빈, α₂m, 아포지단백질 AI, 및 합토글로빈); 및 피브로미터 NAFLD (체중, 프로트롬빈 지수, ALT, AST, 페리틴, 및 공복 글루코스)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 간 섬유증에 대한 영상화 바이오마커는 피브로스캔 (TE), 점 전단파 탄성측정법 (pSWE) (일명 음향 방사력 임펄스 (ARFI)), 2D-3D SWE, 자기 공명 탄성측정법 (MRE), 및 다중파라미터 MRI를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, 간 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제 (ALP), 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT), 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST), 또는 G-글루타밀 트랜스퍼라제 (GGT)의 혈청 수준은 간에서의 섬유증의 지표로서 측정될 수 있다.

일부 실시양태에서, 유전자 및 게놈 바이오마커는 다양한 SNP, 무세포 ncRNA, 및 miRNA의 평가를 포함하는 NAFLD 위험 및 중증도를 평가하는데 유용할 수 있다. 공지된 유전자 및 게놈 바이오마커, 뿐만 아니라 상기 논의된 혈액 바이오마커, 패널, 영상화 바이오마커, 및 시험의 포괄적 검토는 문헌 [VWS Wong et al., Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2018 Aug;15(8):461-478]에 요약되어 있고; 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

일부 실시양태에서 NASH 환자에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 일반적으로 NASH 및 NAFLD를 포함한 대사 증후군의 임상 징후를 갖는 환자에서 대사 조절을 증진시킬 수 있는 미오스타틴 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 추가의 요법을 제공받는 환자에게 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

일부 실시양태에서, NASH 환자에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 아세틸 CoA 카르복실라제 억제제 (ACCi) (예를 들어, 피르소코스타트 (일명 GS-0976) 또는 PF-05221304)를 제공받는 환자에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 개선된 이소형-특이적 TGFβ1 억제제와 조합하는데 유용할 수 있는 다른 치료제는 GLP-1 수용체 효능제 또는 유사체 (예를 들어, 세마글루티드), 파르네소이드 X 수용체 (FXR) 효능제 (예를 들어, GS-9674; 일명 실로펙소르), ASK1 억제제 (예를 들어, 세론세르팁); 오베티콜산, PPAR 효능제 (예를 들어, GFT505; 일명 엘라피브라노르); 니타족사니드, 케토헥소키나제 (KHK) 억제제 (예를 들어, PF-06835919); 및/또는 디아실글리세롤 O-아실트랜스퍼라제 2 (DGAT2) 억제제 (예를 들어, PF-06865571)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 상기 언급된 치료제 중 임의의 1종 이상은 본 개시내용의 이소형 특이적 TGFβ1 억제제, 예를 들어 FXR 효능제, ACC 억제제 및/또는 GLP-1 유사체와 조합된 이소형-특이적 TGFβ1 억제제와 조합되어 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 이소형 특이적 TGFβ1 억제제를 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 사용한 치료는 MRI-PDFF에 의해 측정된 바와 같이 간 지방을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 간 지방의 감소는 적어도 20%, 예를 들어, ≥20%, ≥ 25%, ≥ 30%, ≥ 35%, ≥ 40%, ≥ 45%, 또는 ≥ 50%이다. 일부 실시양태에서, 이소형 특이적 TGFβ1 억제제를 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 사용한 치료는 혈청 ALT 및/또는 GGT를 적어도 20%, 예를 들어, ≥20%, ≥ 25%, ≥ 30%, ≥ 35%, ≥ 40%, ≥ 45%, 또는 ≥ 50% 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 이소형 특이적 TGFβ1 억제제를 단독으로 또는 1종 이상의 추가의 치료제와 조합하여 사용한 치료는 담즙산 합성을 감소시킨다.

일부 실시양태에서, NASH 환자는 진행성 간 섬유증 (F3/F4기)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 환자는 F3기 진행성 간 섬유증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 이러한 환자는 간경변증을 특징으로 하는 F4기 간 섬유증을 갖는다. 일부 실시양태에서, NASH 환자는 간세포성 암종 및/또는 식도 정맥류가 발생하거나 또는 발생할 위험이 있다.

비알콜성 지방간염 임상 연구 네트워크 병리학 위원회에 의해 유래된 분류에 따른 비알콜성 지방간 질환에서의 섬유증 병기결정이 하기에 제공된다:

표 20: 섬유증의 병기

요법 동안 다양한 조직학적 특색의 평가를 가능하게 하고 NAFLD의 전체 스펙트럼을 포괄하기 위해, NASH 임상 연구 네트워크 (CRN) 병리학 위원회는 NASH에서 관찰된 상이한 조직학적 특색과 병리학 위원회에 따른 NASH의 진단 사이의 연관성에 대해 철저한 단변량 및 다변량 분석을 수행하였다. 결과는 NASH 활성 (등급) 및 콜라겐 침착 플러스 아키텍처 재형성 (병기) 둘 다의 점수화 시스템이었다. 등급화 시스템, NASH 활성 점수 (NAS)는 3가지 조직학적 성분: 지방증 (0-3), 소엽 염증 (0-3) 및 풍선 변성 (0-2)의 비가중 합계였다. 이는 0 내지 8의 범위였다. NAS는 잠재적으로 가역적인 능동 손상의 특색을 포함한다. 추가적으로, 브룬트(Brunt) 등의 섬유증 병기결정 시스템이 추가로 개발되었다. NASH CRN 시스템에서, 1기에 대한 섬유증 점수는 섬세한 (1A) 및 조밀한 (1B) 동모양혈관-주위 섬유증으로 세분된 반면, 1C기는 수반되는 동모양혈관-주위 섬유증이 없는 문맥 섬유증으로 정의되었다 (본원에 참조로 포함되는 문헌 [Stal, World J. Gastroenterol. 2015 Oct 21; 21(39): 11077-11087]에 의해 검토됨).

본원에 제공된 것과 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 신장의 섬유화 상태, 예를 들어, 사구체 및 세관간질에서의 TGFβ의 유의하게 증가된 발현이 관찰된 세포외 매트릭스 축적을 특징으로 하는 질환 (IgA 신병증, 초점성 및 분절성 사구체경화증, 초승달 사구체신염, 루푸스 신염 및 당뇨병성 신병증)을 치료하는데 사용될 수 있다. TGFβ에 의해 유도된 2종의 매트릭스 성분인 피브로넥틴 EDA+ 및 PAI-1의 사구체 및 세관간질성 침착이 매트릭스 축적과 함께 모든 질환에서 유의하게 상승되었지만, 상관관계 분석은 주로 TGFβ1 이소형과 밀접한 관계를 밝혀내었다. 따라서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 TGFβ가 세포외 매트릭스의 병리학적 축적과 연관된 인간 사구체 장애의 스펙트럼을 위한 치료제로서 유용하다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

일부 실시양태에서, 신장의 섬유화 상태는 만성 신장 질환 (CKD)과 연관된다. CKD는 주로 고혈압 또는 당뇨병에 의해 유발되고, 매년 1백만명이 넘은 생명을 앗아간다. CKD 환자는 엄격한 식이 및 의약으로부터 투석 및 이식에 이르는 평생의 의료 관리를 필요로 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1 억제제 요법은 투석 및/또는 이식에 대한 필요를 감소시키거나 지연시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 요법은 다른 치료에 대한 필요 (예를 들어, 투여량, 빈도)를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 일반적으로 CKD를 갖는 환자에서 대사 조절을 증진시킬 수 있는 미오스타틴 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 추가의 요법을 제공받는 환자에게 투여될 수 있다.

본 개시내용의 TGFβ1 억제제로 치료될 수 있는 섬유화 상태는 섬유증 및/또는 만성 염증을 수반하는 상태를 포함한다. 이러한 상태는 뒤시엔느 근육 이영양증 (DMD), 및 다른 유전 장애, 예컨대 다발성 경화증 (MS) 및 낭성 섬유증 (CF)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 신경근육 장애일 수 있다. ECM- 및 면역 세포-회합된 TGFβ1 아암 둘 다의 억제를 통해, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1 억제제는 섬유화 진행을 억제하고 M1/M2 대식세포 분극화를 회복시키는 것으로 생각된다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

CKD 및 신장 섬유증을 연구하는데 유용한 모델은 NZB/W, MRL/lpr 및 BXSB 마우스 계통, 항-GBM 모델, 항-Thy1 모델, 5/6 신절제술, 방사선 신병증, 퓨로마이신 아미노뉴클레오시드 신증 (PAN) 및 아드리아마이신 신병증, 폴산 신병증, CyA 신병증, DOCA-염 신병증, HIV-연관 신병증 (HIVAN) 트랜스제닉 마우스 모델, 자발성 고혈압 래트 (SHR), 버팔로/mna 래트, 뮌헨 위스타 프룀터 (MWF) 래트, 일측성 요관 폐쇄 (UUO), Col4A 녹-아웃 마우스 (알포트 증후군)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다 (문헌 [Yang et al., Drug Discov Today Dis Models. 2010; 7(1-2): 13-19] 참조; 그의 내용은 본원에 참조로 포함됨).

본원에 제공된 방법으로 치료될 수 있는 기관 섬유증은 심장 (예를 들어, 심혈관) 섬유증을 포함한다. 일부 실시양태에서, 심장 섬유증은 심부전, 예를 들어 만성 심부전 (CHF)과 연관된다. 일부 실시양태에서, 심부전은 심근 질환 및/또는 대사 질환과 연관될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 심장 섬유증 및 대사 장애를 수반하는 심장 기능장애를 갖는 환자에서 미오스타틴 억제제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 추가의 요법을 제공받는 환자에게 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

심장 섬유증을 연구하는데 유용한 유전 모델은 심장 근세포-특이적 FAK- KO 마우스, 유전자 변형된 SR-BI / apoE 이중 KO (dKO) 마우스, 신데칸-1 널 마우스, EC-SOD-과다발현 마우스, PKC-δ 녹아웃 마우스를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 심장 섬유증을 연구하는데 유용한 외과적 마우스 모델은 관상 동맥 결찰, 허혈성-재관류 모델 (개방 및 폐쇄 흉부), 만성 허혈 모델, 허혈성-재관류 및 허혈성 전제조건화 모델, 랑겐도르프 모델, 횡단 대동맥 협착 (TAC), 상행 대동맥 협착, 복부 대동맥 협착, 폐동맥 밴딩, TAC 및 원위 좌측 전방 관상동맥 결찰, 대동정맥루 (ACF) 모델, 및 대동맥 기능부전 모델을 포함하나 이에 제한되지는 않는다 (문헌 [Rai et al., Mol Cell Biochem. 2017 Jan; 424(1-2): 123-145] 참조; 그의 내용은 본원에 참조로 포함됨).

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물 및/또는 방법으로 치료될 수 있는 섬유화 상태는 결합조직형성을 포함한다. 결합조직형성은 신생물 주위에서 발생하여, 종양 주위의 조밀한 섬유증 (예를 들어, 결합조직형성 기질), 또는 복부 수술 후 복부 내의 반흔 조직을 유발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합조직형성은 악성 종양과 연관된다. 악성종양을 둘러싼 그의 조밀한 형성으로 인해, 통상적인 항암 치료제 (예를 들어, 화학요법)는 임상 효과를 위해 암성 세포에 도달하는데 효과적으로 침투하지 못할 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 결합조직형성을 파괴하는데 사용될 수 있어서, 섬유화 형성을 느슨하게 하여 항암 요법의 효과를 보조할 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 단독요법으로서 사용될 수 있다 (하기 계속).

일부 실시양태에서, 환자는 섬유화 고형 종양 (예를 들어, 결합조직형성)을 갖고, 외과적 후보 풀로부터 배제되었거나 또는 배제되어, 섬유화 고형 종양은 비-절제가능한 것 또는 비-수술가능한 것으로 간주된다. 이러한 환자는 본 개시내용의 TGFβ1 억제 요법을 제공받기 위한 후보일 수 있다. 본 발명의 TGFβ1 억제제는 환자가 외과적 절제에 대한 후보가 될 수 있도록 투여 후에 종양을 절제가능하게 하거나 수술가능하게 할 수 있다.

섬유화 상태를 갖는 환자를 치료하기 위해, TGFβ1 이소형-특이적 억제제는 섬유증을 치료하는데 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다. 이러한 항체의 유효량은 대상체에서 치료 효능 및 임상 안전성 둘 다를 달성하는데 유효한 양이다. 일부 실시양태에서, 억제제는 ECM에 국재화된 (예를 들어, 테더링된) LTBP-매개 TGFβ1 및 면역 세포에 국재화된 (예를 들어, 테더링된) GARP-매개 TGFβ1의 활성화를 차단할 수 있는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 ECM에 국재화된 LTBP-매개 TGFβ1 및 단핵구/대식세포에 국재화된 (예를 들어, 테더링된) LRRC33-매개 TGFβ1의 활성화를 차단할 수 있는 항체이다. 일부 실시양태에서, LTBP는 LTBP1 및/또는 LTBP3이다. 일부 실시양태에서, 섬유화 미세환경에서 섬유화유발 M2-유사 대식세포 상의 LRRC33에 의해 제시된 TGFβ1을 표적화하고 억제하는 것은 유익할 수 있다.

섬유증의 변경을 위한 본 개시내용의 항체 및/또는 조성물의 효능을 결정하는데 유용한 검정은 섬유모세포를 계수하기 위한 조직학적 검정 및 관련 기술분야에 공지된 기초 면역조직화학적 분석을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, 순환 LAP 단편(들)은 섬유생성의 혈청 마커로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,198,412를 참조하며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

ECM 조절이상을 수반하는 질환

세포외 매트릭스는 세포를 둘러싸는 세포-분비 네트워크이고, 주로 프로테오글리칸 및 섬유성 단백질로 구성되며, 이들 중 가장 풍부한 것은 콜라겐이다. 본원에 개시된 신규 항체는 세포외 매트릭스 조절이상과 연관된 질환의 치료에 사용될 수 있다. 세포외 매트릭스 조절이상과 연관된 질환은 전형적으로 근섬유모세포-유도된 병리상태이고, 암, 섬유증 및 심혈관 질환을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Lampi and Reinhart-King (2018) "Targeting extracellular matrix stiffness to attenuate disease: From molecular mechanisms to clinical trials" Sci Transl Med 10(422): eaao0475]에서 검토됨). 섬유화 상태의 진행은 ECM에 침착된 매트릭스 성분의 증가된 수준 및/또는 ECM의 유지/재형성을 수반한다. TGFβ1은 적어도 부분적으로 이러한 과정에 기여한다. 이는, 예를 들어 ECM 성분, 예컨대 콜라겐의 증가된 침착이 ECM의 기계물리적 특성 (예를 들어, 매트릭스/기질의 강성)을 변경시킬 수 있고, 이러한 현상이 TGFβ1 신호전달과 연관된다는 관찰에 의해 지지된다. 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 억제제는 ECM 변경을 수반하는 질환 진행, 예컨대 섬유증, 종양 성장, 침습, 전이 및 결합조직형성에 대응하기 위해 이러한 과정을 차단하는데 사용될 수 있다. 이러한 억제제의 LTBP-아암은 LTBP1 및/또는 LTBP3에 의해 제시된 ECM-회합된 프로/잠재성 TGFβ 복합체를 직접 차단함으로써, 질환 함요에서 복합체로부터의 성장 인자의 활성화/방출을 방지할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 ECM 강성을 정상화하여 인테그린-의존성 신호전달을 수반하는 질환을 치료할 수 있다. 일부 실시양태에서, 인테그린은 α11 쇄, β1 쇄, 또는 둘 다를 포함한다.

따라서, 항체는 세포외 매트릭스 조절이상을 갖는 질환으로 진단된 대상체에게 질환을 치료하는데 유효한 양으로 투여될 수 있다. 항체의 치료 유효량은 근섬유모세포의 1종 이상의 마커, 예컨대 α-SMA의 발현을 감소시키기에 충분한 양일 수 있다. 양은 이환 조직 (예를 들어, 섬유화 조직)의 세포외 매트릭스의 강성을 감소시키기에 충분한 양일 수 있다. 양은 TGFβ1 하류 이펙터, 예컨대 SMAD2 및/또는 SMAD3의 인산화를 감소시키기에 충분한 양일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

내피-중간엽 이행 (EndMT)을 수반하는 질환

유사하게, TGFβ는 또한 정상 발생, 예컨대 심장 형성에서 관찰되는 내피-중간엽 이행 (EndMT)의 주요 조절인자이다. 그러나, 동일하거나 유사한 현상이 또한 많은 질환, 예컨대 암 기질에서 관찰된다. 일부 질환 과정에서, 내피 마커 예컨대 CD31은 TGFβ1 노출 시 하향조절되고, 대신 중간엽 마커 예컨대 FSP-1, α-SMA 및 피브로넥틴의 발현이 유도된다. 실제로, 기질 CAF는 혈관 내피 세포로부터 유래될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 EndMT에 의해 개시 또는 구동되는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

상피-중간엽 이행 (EMT)을 수반하는 질환

EMT (상피 중간엽 전이)는 치밀 접합부를 갖는 상피 세포가 중간엽 특성 (표현형), 예컨대 느슨한 세포-세포 접촉으로 전환되는 과정이다. 상기 과정은 배아발생, 상처 치유, 암 전이 및 섬유증을 포함한 수많은 정상 생물학적 과정뿐만 아니라 병리학적 상황에서 관찰된다 (예를 들어, 문헌 [Shiga et al., (2015) "Cancer-Associated Fibroblasts: Their Characteristics and Their Roles in Tumor Growth." Cancers, 7: 2443-2458]에서 검토됨). 일반적으로, EMT 신호는 주로 TGFβ에 의해 유도되는 것으로 여겨진다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

상피 세포는 또한 여러 섬유화 조직, 예컨대 신장, 폐 및 간에서 EMT 과정을 겪음으로써 근섬유모세포를 생성하는 것으로 제안되었다. EMT는 상피 세포가 그의 입방 형상을 잃고, 약한 세포-세포 접촉 및 그의 액틴 세포골격의 재조직화로 이어지는 부착 및 치밀 접합부 단백질의 발현을 잃는 경우에 발생하고; 세포는 중간엽 단백질 (피브로넥틴, 비멘틴, N-카드헤린)의 발현을 획득하는 한편, 세포 이동 및 침습에 유리한 섬유모세포-유사 아키텍처를 채택한다. EMT는 많은 성장 인자에 의해 유도되며, 그 중 TGFβ는 매우 강력한 유도인자이고, 이는 EMT인 세포 분화에서 변화를 실행하기 위한 담당 행위인자인 EMT-TF (Snail1/Snail, Snail2/Slug, ZEB1, ZEB2, Twist1/Twist 등)로 공지된 여러 전사 인자의 발현 및 활성을 조절한다. 섬유증과 관련하여 EMT 후 중간엽 세포의 생성을 확인하는데 사용되는 유전자 및 단백질 마커는 비멘틴 및 데스민과 함께 FSP1 (섬유모세포-특이적 단백질 1), α-SMA 및 콜라겐 I이며, 그의 발현은 상피 마커 (E-카드헤린 및 특정 시토케라틴)의 발현 수준의 감소와 공동으로 증가한다. 상피 및 중간엽 마커를 공동-발현하는 세포는 EMT의 중간 단계를 나타낸다 (예를 들어, 문헌 [Caja et al., Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(5), 1294]에 의해 검토됨).

많은 유형의 암은, 예를 들어, 보다 불량한 예후와 상관관계가 있는 중간엽 표현형 (예컨대 CAF)으로의 세포의 전환분화를 수반하는 것으로 보인다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 EMT에 의해 개시 또는 구동되는 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 실제로, 본원 (예를 들어, 도 12 및 13)에 예시된 데이터는 이러한 억제제가 생체내 CAF 마커, 예컨대 α-SMA, Col1 (제I형 콜라겐) 및 FN (피브로넥틴)의 발현을 억제하는 능력을 갖는다는 것을 나타낸다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

프로테아제를 수반하는 질환

TGFβ의 그의 잠재성 복합체로부터의 활성화는 인테그린에 의해 힘-의존성 방식으로 및/또는 프로테아제에 의해 촉발될 수 있다. 증거는 Ser/Thr 프로테아제, 예컨대 칼리크레인, 케모트립신, 엘라스타제, 플라스민, 트롬빈, 뿐만 아니라 ADAM 패밀리의 아연 메탈로프로테아제, 예컨대 ADAM 10 및 ADAM 17, 뿐만 아니라 MMP 패밀리, 예컨대 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 부류의 프로테아제가 과정에 수반될 수 있음을 시사한다. MMP-2는 기저막의 가장 풍부한 성분인 콜라겐 IV를 분해하여, ECM-회합된 TGFβ1 조절에서 소정의 역할을 할 수 있는 가능성을 상승시킨다. MMP-9는 종양 진행, 혈관신생, 기질 재형성 및 전이에서 중추적 역할을 하는 것으로 연루되었다. 따라서, ECM에서 TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화는 암을 치료하는데 중요할 수 있다.

칼리크레인 (KLK)은 혈장 칼리크레인 및 조직 칼리크레인을 포함하는 트립신- 또는 키모트립신-유사 세린 프로테아제이다. ECM은 악성 성장을 억제하기 위한 구조적 및 신호전달 스캐폴드 및 장벽으로서 작용하는, 조직 항상성에서 소정의 역할을 한다. KLK는 종양 확장 및 침습을 용이하게 할 수 있는 ECM 단백질 및 다른 성분을 분해하는데 소정의 역할을 할 수 있다. 예를 들어, KLK1은 특정 유방암에서 고도로 상향조절되고, 프로-MMP-2 및 프로-MMP-9를 활성화시킬 수 있다. KLK2는 잠재성 TGFβ1을 활성화시켜, 섬유모세포에 인접한 전립선암의 암 성장을 허용적이게 한다. KLK3은 전립선암 (PSA)에 대한 진단 마커로서 널리 연구되어 왔다. KLK3은 플라스미노겐을, LAP를 단백질분해적으로 절단하는 플라스민으로 프로세싱함으로써 TGFβ1을 직접 활성화시킬 수 있다. KLK6은 알츠하이머병에 대한 잠재적 마커일 수 있다.

TGFβ1의 공지된 활성화제, 예컨대 플라스민, TSP-1 및 αVβ6 인테그린은 모두 LAP와 직접 상호작용한다. LAP의 단백질분해적 절단은 LAP-TGFβ 상호작용을 탈안정화시킴으로써 활성 TGFβ1을 방출할 수 있는 것으로 가정된다. 54-LSKLRL-59 (서열식별번호: 301)를 함유하는 영역은 TGFβ1 잠재성을 유지하는데 중요한 것으로 시사되었다. 따라서, 상호작용을 안정화시키거나 또는 LAP의 단백질분해적 절단을 차단하는 작용제 (예를 들어, 항체)는 TGFβ 활성화를 방지할 수 있다.

병리학적 상태 (예를 들어, 암)와 연관된 이들 프로테아제 중 다수는 별개의 작용 메카니즘을 통해 기능한다. 따라서, 특정한 프로테아제 또는 프로테아제의 조합의 표적화된 억제는 프로테아제-TGFβ 축을 수반하는 상태의 치료를 위한 치료 이익을 제공할 수 있다. 따라서, TGFβ1의 프로테아제-유도된 활성화를 선택적으로 억제하는 억제제 (예를 들어, TGFβ1 항체)가 이러한 질환 (예를 들어, 섬유증 및 암)의 치료에 유리할 수 있는 것으로 고려된다. 유사하게, 치료될 상태에 따라, 또 다른 프로테아제에 비해 하나의 프로테아제에 의한 TGFβ1 활성화의 선택적 억제가 또한 바람직할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

플라스민은 플라스미노겐으로 불리는 전구체 형태로서 생산되는 세린 프로테아제이다. 방출 시, 플라스민은 순환에 진입하고, 따라서 혈청에서 검출된다. 플라스민의 상승된 수준은, 가능하게는 종양 세포 운동성, 침습 및 전이를 용이하게 하는 세포외 매트릭스 (예를 들어, 기저막 및 기질 장벽)의 파괴를 수반하는 메카니즘을 통해 암 진행과 상관관계가 있는 것으로 보인다. 플라스민은 또한 부착, 증식, 아폽토시스, 암 영양, 산소 공급, 혈관의 형성, 및 VEGF의 활성화에 영향을 미칠 수 있다 (Didiasova et al., Int. J. Mol. Sci, 2014, 15, 21229-21252). 또한, 플라스민은 대식세포의 종양 미세환경 내로의 이동을 촉진할 수 있다 (Philips et al., Cancer Res. 2011 Nov 1;71(21):6676-83 및 Choong et al., Clin. Orthop. Relat. Res. 2003, 415S, S46-S58). 실제로, 종양-연관 대식세포 (TAM)는 종양 성장, 침습, 전이 및 혈관신생을 촉진하는 그의 능력을 통해 종양발생의 널리 특징화된 구동자이다.

플라스민 활성은 주로 ECM의 파괴와 관련되었다. 그러나, 플라스민이 또한 하류 MMP 및 TGF 베타 활성화를 조절한다는 증거가 늘어나고 있다. 구체적으로, 플라스민은 TGF 베타 유전자 생성물의 N-말단 영역으로부터 유래된 잠재성 연관 펩티드 (LAP)의 단백질분해적 절단을 통해 TGF 베타의 활성화를 유발하여 (Horiguchi et al., J Biochem. 2012 Oct; 152(4):321-9), 활성 성장 인자의 방출을 발생시키는 것으로 시사되었다. TGFβ1은 암 진행을 촉진할 수 있기 때문에, 이는 TGFb의 플라스민-유도된 활성화가 적어도 부분적으로 이러한 과정을 매개할 수 있는 가능성을 상승시킨다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

TGFβ1은 또한 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환에서 중요한 역할자인 uPA의 발현을 조절하는 것으로 제시되었다 (Santibanez, Juan F., ISRN Dermatology, 2013: 597927). uPA는 독립적으로, 그의 세포 표면 수용체 (uPAR)에 결합하고 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환을 촉진함으로써 암 진행 (예를 들어, 부착, 증식 및 이동)을 촉진하는 것으로 제시되었다. 또한, 연구는 uPA 및/또는 플라스미노겐 활성화제 억제제-1 (PAI-1)의 발현이 결장직장암 (D. Q. Seetoo, et al., Journal of Surgical Oncology, vol. 82, no. 3, pp. 184-193, 2003), 유방암 (N. Harbeck et al., Clinical Breast Cancer, vol. 5, no. 5, pp. 348-352, 2004), 및 피부암 (Santibanez, Juan F., ISRN Dermatology, 2013: 597927)에서 불량한 예후의 예측인자임을 제시하였다. 따라서, 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 플라스민, TGFβ1 및 uPA 사이의 상호작용은 암 진행을 촉진하는 것에 대한 양성 피드백 루프를 생성할 수 있다. 따라서, 플라스민-의존성 TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하는 억제제는 플라스민/TGFβ1 신호전달 축에 의존하는 암의 치료에 특히 적합할 수 있다.

트롬빈은 GARP-연관 TGFβ1의 활성화에 수반될 수 있다. 혈소판은 GARP-프로TGFβ1을 발현하는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 트롬빈은 이 축을 인테그린-비의존성 방식으로 표적화함으로써 TGFβ1 활성화를 매개할 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 TGFβ1의 프로테아제-의존성 활성화를 억제할 수 있는 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제제는 인테그린-비의존성 방식으로 프로테아제-의존성 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 활성화 방식에 관계없이 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있고, 예를 들어 TGFβ1의 인테그린-의존성 활성화 및 프로테아제-의존성 활성화 둘 다를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로테아제는 세린 프로테아제, 예컨대 칼리크레인, 케모트립신, 트립신, 엘라스타제, 플라스민, 트롬빈, 뿐만 아니라 아연 메탈로프로테아제 (MMP 패밀리), 예컨대 MMP-2, MMP-9 및 MMP-13으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 억제제는 TGFβ1의 플라스민-유도된 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 플라스민- 및 인테그린-유도된 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제는 TGFβ1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 프로TGFβ1에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 잠재성 프로TGFβ1에 결합함으로써 잠재성 복합체로부터 성숙 성장 인자의 방출을 억제한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1의 플라스민-의존성 활성화를 억제하는 방법에 사용하기에 적합한 TGFβ1 활성화의 억제제는 본원에 개시된 이소형-특이적 억제제 중 어느 하나이다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

일부 실시양태에서, 억제제 (예를 들어, TGFβ1 항체)는 암 세포 이동을 억제한다. 일부 실시양태에서, 억제제는 단핵구/대식세포 이동을 억제한다. 일부 실시양태에서, 억제제는 TAM의 축적을 억제한다.

또 다른 측면에서, 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 TGFβ1 억제제 (예를 들어, TGFβ1 항체)를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 억제제는 TGFβ1의 프로테아제-유도된 활성화 (예를 들어, 플라스민)를 억제하여 대상체에서 암을 치료하는 것인, 대상체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.

또 다른 측면에서, 종양 성장의 감소를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 TGFβ1 억제제 (예를 들어, TGFβ1 항체)를 투여하는 것을 포함하며, 여기서 억제제는 TGFβ1의 프로테아제-유도된 활성화 (예를 들어, 플라스민)를 억제하여 대상체에서 종양 성장을 감소시키는 것인, 대상체에서 종양 성장을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다.

이상 유전자 발현을 수반하는 질환

다양한 질환 상태에서의 TGFβ1 신호 전달 경로의 비정상적 활성화는 다수의 마커의 변경된 유전자 발현과 연관된 것으로 관찰되었다. 이들 유전자 발현 마커 (예를 들어, mRNA에 의해 측정된 바와 같음)는 세르핀 1 (PAI-1을 코딩함), MCP-1 (또한 CCL2로도 공지됨), Col1a1, Col3a1, FN1, TGFβ1, CTGF, ACTA2 (α-SMA를 코딩함), SNAI1 (E-카드헤린 (Cdh1)을 하향조절함으로써 섬유증 및 전이에서 EMT를 구동함), MMP2 (EMT와 연관된 매트릭스 메탈로프로테아제), MMP9 (EMT와 연관된 매트릭스 메탈로프로테아제), TIMP1 (EMT와 연관된 매트릭스 메탈로프로테아제), FOXP3 (Treg 유도의 마커), CDH1 (TGFβ에 의해 하향조절되는 E 카드헤린 (상피 세포의 마커)), 및 CDH2 (TGFβ에 의해 상향조절되는 N 카드헤린 (중간엽 세포의 마커))를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 흥미롭게도, 이들 유전자 중 다수는 다양한 유형의 기관 섬유증을 포함한 다양한 세트의 질환 상태, 뿐만 아니라 골수섬유증을 포함한 많은 암에 연루되어 소정의 역할을 한다. 실제로, 섬유화 상태와 비정상적 세포 증식, 종양발생 및 전이 사이에 병리생리학적 연관성이 시사되었다. 예를 들어, 문헌 [Cox and Erler (2014) Clinical Cancer Research 20(14): 3637-43 "Molecular pathways: connecting fibrosis and solid tumor metastasis"; Shiga et al., (2015) Cancers 7:2443-2458 "Cancer-associated fibroblasts: their characteristics and their roles in tumor growth"; Wynn and Barron (2010) Semin. Liver Dis. 30(3): 245-257 "Macrophages: master regulators of inflammation and fibrosis"]을 참조하며, 그의 내용은 본원에 참조로 포함된다. 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본 개시내용의 본 발명자들은 TGFβ1 신호전달 경로가 실제로 이들 광범위한 병리상태 사이에서의 주요 연관성일 수 있다는 것을 고려한다.

손상 또는 질환 조직으로의 백혈구 동원 (예를 들어, 단핵구/대식세포)을 매개하는 화학주성 시토카인 (또는 케모카인)의 능력은 질환 진행에서 중대한 결과를 갖는다. C-C 케모카인 패밀리의 구성원, 예컨대 CCL2로도 공지된 단핵구 화학유인물질 단백질 1 (MCP-1), CCL3으로도 공지된 대식세포 염증성 단백질 1-알파 (MIP-1α), 및 CCL4로도 공지된 MIP-1β가 이러한 과정에 연루되었다.

예를 들어, MCP-1/CCL2는 섬유증 및 암 둘 다에서 소정의 역할을 하는 것으로 생각된다. MCP-1/CCL2는 섬유화유발 케모카인으로서 특징화되고, 단핵구 화학유인물질이며, 증거는 이것이 암의 개시 및 진행 둘 다에 수반될 수 있음을 시사한다. 섬유증에서, MCP-1/CCL2는 섬유증의 염증 단계에서 중요한 역할을 하는 것으로 제시되었다. 예를 들어, MCP-1의 중화는 사구체 초승달 형성 및 유형 I 콜라겐 침착의 극적인 감소를 발생시켰다. 유사하게, 항-MCP-1 또는 항-MIP-1 알파 항체를 사용한 수동적 면역요법은 블레오마이신-챌린지된 마우스에서 일핵 식세포 축적을 유의하게 감소시키는 것으로 제시되며, 이는 MIP-1 알파 및 MCP-1이 폐 염증 반응 동안 백혈구의 동원에 기여한다는 것을 시사한다 (Smith, Biol Signals. 1996 Jul-Aug;5(4):223-31, "Chemotactic cytokines mediate leukocyte recruitment in fibrotic lung disease"). 낭성 섬유증 및 다발성 골수종을 갖는 환자에서 상승된 수준의 MIP-1알파가 보고되었으며 (예를 들어, 문헌 [Mrugacz et al., J Interferon Cytokine Res. 2007 Jun;27(6):491-5] 참조), 이는 MIP-1α가 국재화된 또는 전신 염증 반응과 연관된다는 개념을 지지한다.

일련의 증거는 종양 진행에서의 C-C 케모카인의 수반을 가리킨다. 예를 들어, 종양-유래 MCP-1/CCL2는 대식세포에서 "암-촉진" 표현형을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 폐암에서, MCP-1/CCL2는 기질 세포에 의해 생산되고 전이를 촉진하는 것으로 제시되었다. 인간 췌장암에서, 종양은 CCL2를 분비하고, 면역억제 CCR2-양성 대식세포는 이들 종양에 침윤한다. 높은 CCL2 발현/낮은 CD8 T-세포 침윤을 나타내는 종양을 갖는 환자는 유의하게 감소된 생존을 갖는다. 손상 또는 이환 조직 환경으로 동원되는 단핵구는 후속적으로 국부 신호에 반응하여 (예컨대 종양-유래 시토카인에 반응하여) 분극화되어, 질환 진행에 추가로 기여할 수 있는 것으로 고려된다. 이들 M2-유사 대식세포는 이펙터 세포, 예컨대 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 억제함으로써 면역 회피에 기여할 가능성이 있다. 일부 실시양태에서, 이 과정은 부분적으로, 활성화된 대식세포에 의해 발현된 LRRC33-TGFβ1에 의해 매개된다. 일부 실시양태에서, 과정은 부분적으로, Treg에 의해 발현된 GARP-TGFβ1에 의해 매개된다.

유사하게, PAI-1/세르핀1의 수반은 다양한 암, 혈관신생, 염증, 신경변성 질환 (예를 들어, 알츠하이머병)에 연루되어 왔다. 종양 및/또는 혈청에서의 PAI-1의 상승된 발현은 다양한 암, 예컨대 유방암 및 방광암 (예를 들어, 이행 세포 암종)뿐만 아니라 골수섬유증에서의 불량한 예후 (예를 들어, 보다 짧은 생존, 증가된 전이)와 상관관계가 있다. 섬유화 상태와 관련하여, PAI-1은 TGFβ1-유도된 섬유증의 중요한 하류 이펙터로서 인식되었고, 증가된 PAI-1 발현은 폐 섬유증 (예컨대 특발성 폐 섬유증 (IPF)), 신장 섬유증, 간 섬유증 및 경피증을 포함한 다양한 형태의 조직 섬유증에서 관찰되었다. 일부 실시양태에서, 과정은 부분적으로 ECM-회합된 TGFβ1에 의해, 예를 들어 LTBP1 및/또는 LTBP3을 통해 매개된다.

일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제 요법의 생체내 효과는 유전자 마커의 변화를 측정함으로써 평가될 수 있다. 적합한 마커는 TGFβ (예를 들어, TGFβ1, TGFβ2, 및 TGFβ3)를 포함한다. 적합한 마커는 또한 TGFβ (예를 들어, TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3)에 대한 1종 이상의 제시 분자, 예컨대 LTBP1, LTBP3, GARP (또는 LRRC32) 및 LRRC33을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 마커는 중간엽 이행 유전자 (예를 들어, 피브로넥틴, 비멘틴, N-카드헤린, AXL, ROR2, WNT5A, LOXL2, TWIST2, TAGLN, 및/또는 FAP), 면역억제 유전자 (예를 들어, IL10, VEGFA, VEGFC), 단핵구 및 대식세포 화학주성 유전자 (예를 들어, CCL2, CCL3, CCL4, CCL7, CCL8 및 CCL13), 및/또는 본원에 논의된 다양한 섬유화 마커를 포함한다. 바람직한 마커는 혈장 마커이다.

본원의 실시예에 제시된 바와 같이, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 TGFβ1-의존성인 것으로 제시된 기계론적 동물 모델, 예컨대 UUO에서 많은 이들 마커의 발현 수준을 감소시킬 수 있다. 따라서, 이러한 억제제는 유전자 발현 마커 중 1종 이상의 비정상적 발현 (예를 들어, 과다발현/상향조절 또는 과소발현/하향조절)을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.

따라서, 일부 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 하기: PAI-1 (세르핀1에 의해 코딩됨), MMP2, MMP9, MCP-1 (또한 CCL2로도 공지됨), Col1a1, Col3a1, FN1, TGFβ1, CTGF, α-SMA, ITGA11, 및 ACTA2 중 1종 이상의 과다발현과 연관된 질환의 치료에 사용되며, 여기서 치료는 질환을 앓고 있는 대상체에게 질환을 치료하는데 유효한 양으로 억제제를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 억제제는 PAI-1, MCP-1/CCL2, CTGF, 및/또는 α-SMA의 과다발현과 연관된 질환을 치료하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 질환은 골수섬유증이다. 일부 실시양태에서, 질환은 암, 예를 들어 고형 종양을 포함하는 암이다. 일부 실시양태에서, 질환은 기관 섬유증, 예를 들어 간, 신장, 폐, 근육, 피부 및/또는 심장 또는 심혈관 조직의 섬유증이다. 일부 실시양태에서, 질환은 알포트 증후군이다. 일부 실시양태에서, 억제제는 하기: PAI-1 (세르핀1에 의해 코딩됨), MMP2, MMP9, MCP-1 (또한 CCL2로도 공지됨), Col1a1, Col3a1, FN1, TGFβ1, CTGF, α-SMA, ITGA11, 및 ACTA2 중 1종 이상의 발현을 감소시킨다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1-선택적 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

TGFβ1 억제제 요법의 생체내 효과를 평가하는데 사용될 수 있는 또 다른 바이오마커는 혈액 우레아 질소 (BUN)이다. 우레아는 단백질 분해의 부산물로서 신체 내에서 자연적으로 형성된다. 우레아는 간에서 신장으로 이동하고, 여기서 혈액으로부터 여과/제거된다. 따라서, 환자의 신장이 적절하게 기능하지 않는 상황에서 BUN 수준이 증가할 수 있다. 예를 들어, 신장 섬유증을 갖는 환자는 증가된 BUN을 나타낼 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, BUN은 본원에 기재된 바와 같은 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 생체내 효과를 평가하기 위해 측정된다. 다른 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 증가된 BUN과 연관된 질환 (예를 들어, 신장 섬유증 및/또는 급성 또는 만성 신장 질환, 손상 또는 부전)의 치료에 사용된다. 특정한 실시양태에서, 증가된 BUN과 연관된 질환은 알포트 증후군이다.

따라서, 본 개시내용은 TGFβ1 억제 요법에 반응할 가능성이 있는 후보 환자 또는 환자 집단을 선택하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 환자 (또는 환자 집단)로부터 수집된 생물학적 샘플, 예컨대 생검 샘플을 본원에 논의된 마커 중 1종 이상의 발현에 대해 시험하는 단계를 포함할 수 있다. 유사하게, 이러한 유전자 마커(들)는 요법에 대한 환자의 반응성을 모니터링하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 모니터링은 환자로부터 수집된 2개 이상의 생물학적 샘플을, 예를 들어 요법의 투여 전 및 후에, 및 시간 경과에 따른 치료 요법의 과정 동안 시험하여, 치료 반응 또는 유효성을 나타내는 마커 중 1종 이상의 유전자 발현 수준의 변화를 평가하는 것을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, TGFβ1 억제 요법에 반응할 가능성이 있는 후보 환자 또는 환자 집단을 선택하는 방법은 유전자 마커(들), 예컨대 본원에 기재된 것에 대해 이전에 시험된, 그의 이상 발현을 나타낸 환자 또는 환자 집단을 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이상 마커 발현은 하기: TGFβ1, LRRC33, GARP, LTBP1, LTBP3, CCL2, CCL3, PAI-1/세르핀1, MMP2, MMP9, Col1a1, Col3a1, FN1, CTGF, α-SMA, ITGA11, 및 ACTA2 중 적어도 1종의 상승된 수준을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자 또는 환자 집단 (예를 들어, 그로부터 수집된 생물학적 샘플)은 상승된 TGFβ1 활성화, 포스포-SMAD2/3, 또는 그의 조합을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 환자 또는 환자 집단은 상승된 BUN을 나타낸다.

바이오마커로서의 순환/순환성 MDSC

MDSC는 그의 골수성 기원 및 그의 주요 면역 억제 기능에 대해 명명된 세포의 이종 집단이다 (Gabrilovich. Cancer Immunol Res. 2017 Jan; 5(1): 3-8). MDSC는 일반적으로, T 조절 세포 (Treg) 확장을 촉진하고 이어서 T 이펙터 세포 기능을 억제하는 능력을 포함하여, 높은 가소성 및 T 세포 및 자연 킬러 (NK) 세포의 세포독성 기능을 감소시키는 강한 능력을 나타낸다 (Gabrilovich et al., Nat Rev Immunol. (2012) 12:253-68). MDSC는 전형적으로 표면 마커의 발현을 기초로 하여 2개의 하위세트, 단핵구성 (m-MDSC) 및 과립구성 (G-MDSC 또는 PMN-MDSC)으로 분류된다 (Consonni et al., Front Immunol. 2019 May 3; 10:949). 억제성 G-MDSC는 면역 억제의 주요 메카니즘으로서 반응성 산소 종 (ROS)의 생산을 특징으로 할 수 있다. 대조적으로, M-MDSC는 주로 유도성 산화질소 신타제 유전자 (iNOS)를 상향조절함으로써 면역 억제를 매개하고, 산화질소 (NO)뿐만 아니라 면역 억제 시토카인 어레이를 생산한다 (Youn and Garilovich, Eur J Immunol. 2010 Nov; 40(11): 2969-2975).

일부 실시양태에서, 환자 또는 환자 집단 (예를 들어, 그로부터 수집된 생물학적 샘플)은 상승된 MDSC를 나타낸다. 일부 실시양태에서, 샘플은 전혈 샘플 또는 혈액 성분 (예를 들어, 혈장 또는 혈청)이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 (예를 들어, 이전에 동결되지 않은 샘플의) 신선한 전혈 또는 혈액 성분이다.

일부 실시양태에서, 환자 또는 환자 집단은 섬유화 장애 또는 질환 (예컨대 기관 섬유증)을 갖는다. 일부 실시양태에서, 환자는 NASH를 갖는다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ 억제제, 예를 들어 TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체, 이소형-비-선택적 억제제, 예를 들어 저분자량 ALK5 길항제, TGFβ1/2/3 중 2종 이상에 결합하는 중화 항체, 예를 들어 GC1008 및 변이체, TGFβ1/3에 결합하는 항체, 리간드 트랩, 예를 들어 TGFβ1/3 억제제, 및/또는 인테그린 억제제 (예를 들어, αVβ3, αVβ5, αVβ6, αVβ8, α5β1, αIIbβ3, 또는 α8β1 인테그린에 결합하고, TGFβ의 하류 활성화를 억제하는, 예를 들어, TGFβ1 및/또는 TGFβ3의 선택적 억제 항체)는 투여되는 TGFβ1 억제의 양 (예를 들어, 용량)이 기준선 MDSC 수준과 비교하여 순환 MDSC 수준을 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 또는 그 초과만큼 감소시키기에 충분하도록 투여된다. 순환 MDSC 수준은 순환 MDSC 수준의 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 또는 그 초과의 감소가 치료 효능을 나타내거나 예측할 수 있도록 TGFβ 억제제의 각각의 치료 또는 각각의 용량 전 또는 후에 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 순환 MDSC의 수준은 질환 부담 (예를 들어, 치료 요법 전 및 후에 섬유증에서의 변화에 의해 측정된 바와 같음)을 결정하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 순환 MDSC 수준의 감소는 질환 부담의 감소 (예를 들어, 섬유증의 감소)를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 순환 MDSC 수준은 본원에 기재된 TGFβ 억제제, 예를 들어 TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체, 이소형-비-선택적 TGFβ 억제제, 예를 들어 저분자량 ALK5 길항제, TGFβ1/2/3 중 2종 이상에 결합하는 중화 항체, 예를 들어, GC1008 및 변이체, TGFβ1/3에 결합하는 항체, 리간드 트랩, 예를 들어 TGFβ1/3 억제제, 및/또는 인테그린 억제제 (예를 들어, αVβ3, αVβ5, αVβ6, αVβ8, α5β1, αIIbβ3, 또는 α8β1 인테그린에 결합하고, TGFβ의 하류 활성화를 억제하는, 예를 들어 TGFβ1 및/또는 TGFβ3의 선택적 억제 항체)의 용량의 투여 전 및 후에 측정될 수 있고, 순환 MDSC 수준의 감소는 약리학적 효과, 예를 들어 질환 부담의 감소 (예를 들어, 섬유증의 감소)의 지표 또는 예측일 수 있다. 특정 실시양태에서, 순환 MDSC 수준은 TGFβ 억제제, 예컨대 본원에 기재된 TGFβ 억제제, 예를 들어 TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체, 이소형-비-선택적 억제제, 예를 들어 저분자량 ALK5 길항제, TGFβ1/2/3 중 2종 이상에 결합하는 중화 항체, 예를 들어 GC1008 및 변이체, TGFβ1/3에 결합하는 항체, 리간드 트랩, 예를 들어 TGFβ1/3 억제제, 및/또는 인테그린 억제제 (예를 들어, αVβ3, αVβ5, αVβ6, αVβ8, α5β1, αIIbβ3, 또는 α8β1 인테그린에 결합하고, TGFβ의 하류 활성화를 억제하는, 예를 들어 TGFβ1 및/또는 TGFβ3의 선택적 억제 항체)의 제1 용량의 투여 전 및 후에 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 순환 MDSC 수준의 감소는 약리학적 효과를 나타내거나 예측케 하고, 추가로 TGFβ 억제제의 제2 또는 그 초과의 용량(들)의 투여를 정당화한다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제의 제1 용량은 환자가 제공받는 TGFβ 억제제의 바로 제1 용량이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제의 제1 용량은 TGFβ 억제제의 1회 초과의 용량을 포함하는 주어지는 치료 요법의 제1 용량이다. 또 다른 실시양태에서, 순환 MDSC 수준은 본원에 기재된 TGFβ 억제제, 예를 들어 TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체를 포함하는 조합 치료 전 및 후에 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ 억제제, 예를 들어 TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체, 이소형-비-선택적 억제제, 예를 들어 저분자량 ALK5 길항제, TGFβ1/2/3 중 2종 이상에 결합하는 중화 항체, 예를 들어 GC1008 및 변이체, TGFβ1/3에 결합하는 항체, 리간드 트랩, 예를 들어 TGFβ1/3 억제제, 및/또는 인테그린 억제제 (예를 들어, αVβ3, αVβ5, αVβ6, αVβ8, α5β1, αIIbβ3, 또는 α8β1 인테그린에 결합하고, TGFβ의 하류 활성화를 억제하는, 예를 들어, TGFβ1 및/또는 TGFβ3의 선택적 억제 항체)의 치료 후의 순환 MDSC 수준의 감소는 치료의 계속을 정당화할 수 있다.

일부 측면에서, 본 개시내용은 TGFβ1을 억제하지만 TGFβ2 및 TGFβ3 중 하나 또는 둘 다는 억제하지 않는 TGFβ 억제제를 선택하는 단계; 섬유화 상태를 갖는 대상체에게 순환 MDSC 수준을 감소시키기에 충분한 양의 TGFβ 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 섬유증을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 순환 MDSC 수준은 대상체로부터 수집된 전혈 또는 혈액 성분으로부터 결정된다. 일부 실시양태에서, 순환 MDSC 수준은 적어도 10%, 임의로 적어도 15%, 20%, 25%, 또는 그 초과만큼 감소된다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 대상체에서 순환 MDSC 수준을 감소시키는 방법에 사용된다. 일부 실시양태에서, 순환 MDSC 수준은 대상체로부터 수집된 전혈 또는 혈액 성분으로부터 결정된다. 일부 실시양태에서, 순환 MDSC 수준은 적어도 10%, 임의로 적어도 15%, 20%, 25%, 또는 그 초과만큼 감소된다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 순환 MDSC 수준을 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다.

본 개시내용의 특정 실시양태에서, 순환 MDSC 수준은 단독으로 또는 또 다른 요법과 함께 투여된 TGFβ 억제제, 예컨대 본원에 기재된 TGFβ 억제제, 예를 들어 TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체, 이소형-비-선택적 억제제, 예를 들어 저분자량 ALK5 길항제, TGFβ1/2/3 중 2종 이상에 결합하는 중화 항체, 예를 들어 GC1008 및 변이체, TGFβ1/3에 결합하는 항체, 리간드 트랩, 예를 들어 TGFβ1/3 억제제, 및/또는 인테그린 억제제 (예를 들어, αVβ3, αVβ5, αVβ6, αVβ8, α5β1, αIIbβ3, 또는 α8β1 인테그린에 결합하고, TGFβ의 하류 활성화를 억제하는, 예를 들어 TGFβ1 및/또는 TGFβ3의 선택적 억제 항체)의 용량을 포함하는 치료의 약리학적 효과를 예측, 결정, 및 모니터링하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 순환 MDSC는 초기 치료 (예를 들어, TGFβ 억제제의 (제1) 용량)의 투여 후 6주 내에 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 순환 MDSC 수준은 TGFβ 억제제의 초기 용량의 투여 후 30일 내에 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, MDSC 수준은 TGFβ 억제제의 초기 용량의 투여 후 약 3주 내에 또는 약 3주째에 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, MDSC 수준은 TGFβ 억제제의 초기 용량의 투여 후 약 2주 내에 또는 약 2주째에 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, MDSC 수준은 TGFβ 억제제의 초기 용량의 투여 후 약 10일 내에 또는 약 10일째에 측정될 수 있다.

일부 실시양태에서, 이러한 환자 또는 환자 집단은 암을 갖고, 이는 고형 종양을 포함할 수 있다. 고형 종양은 TGFβ1이 다른 이소형에 비해 종양에서 발현되는 우세한 이소형인 TGFβ1-우성 종양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 환자 또는 환자 집단은 암 요법, 예컨대 화학요법, 방사선 요법 및/또는 면역 체크포인트 요법, 예를 들어 항-PD-1 (예를 들어, 펨브롤리주맙 및 니볼루맙), 항-PD-L1 (예를 들어, 아테졸리주맙), 항-CTLA4 (예를 들어, 이필리무맙), 조작된 면역 세포 요법 (예를 들어, CAR-T), 및 암 백신 등에 대해 저항성을 나타낸다. 본 발명에 따르면, 본원에 개시된 것과 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 이펙터 세포가 암 세포에 접근하게 하여 항종양 효과를 달성하도록 면역억제를 차단해제함으로써 저항성을 극복한다.

증식성 장애 (예를 들어, 골수증식성 장애)

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 증식성 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 대상체에서 골수증식성 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다. 일부 실시양태에서, 증식성 장애는 암 또는 골수증식성 장애이다. 일부 실시양태에서, 골수증식성 장애는 골수섬유증이다.

골-골수섬유증으로도 공지되어 있는 골수섬유증은 비교적 희귀한 골수 증식성 장애 (암)으로, 골수증식성 장애로 불리는 질환 군에 속한다. 골수섬유증은 골수증식성 신생물의 필라델피아 염색체-음성 (-) 분지로 분류된다. 골수섬유증은 클론 골수증식, 이상 시토카인 생산, 골수외 조혈, 및 골수 섬유증을 특징으로 한다. 골수 및 다른 부위에서의 조혈 줄기 세포의 비정상적 클론의 증식은 섬유증 또는 골수의 반흔 조직으로의 대체를 발생시킨다. 용어 골수섬유증은, 달리 명시되지 않는 한, 원발성 골수섬유증 (PMF)을 지칭한다. 이는 또한 만성 특발성 골수섬유증 (cIMF)으로 지칭될 수 있다 (용어 특발성 및 원발성은 이들 경우에 질환이 미지의 또는 자발적 기원의 것임을 의미함). 이는 진성 다혈구혈증 또는 본태성 혈소판혈증에 속발성으로 발생하는 골수섬유증과 대조적이다. 골수섬유증은 골수 화생의 형태이며, 이는 골수의 혈액-형성 조직에서의 세포 유형의 변화를 지칭하고, 종종 2개의 용어는 동의어로 사용된다. 용어 원인불명 골수 화생 및 골수 화생 동반 골수섬유증 (MMM)은 또한 원발성 골수섬유증을 지칭하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 치료될 수 있는 혈액 증식성 장애는 골수증식성 장애, 예컨대 골수섬유증을 포함한다. BCR-ABL (Ph) 음성 만성 골수증식성 장애의 소위 "전형적" 군은 본태성 혈소판혈증 (ET), 진성 다혈구혈증 (PV) 및 원발성 골수섬유증 (PMF)을 포함한다.

골수섬유증은 신체의 정상적인 혈액 세포 생산을 방해한다. 결과는 골수에서의 광범위한 반흔형성이며, 이는 중증 빈혈, 쇠약, 피로 및 종종 비대 비장으로 이어진다. 비정상적 조혈 세포 클론에 의한 (특히 거핵구에 의한) 시토카인, 예컨대 섬유모세포 성장 인자의 생산은 콜라겐 섬유증을 통해 골수의 조혈 조직의 결합 조직으로의 대체를 야기한다. 조혈 조직의 감소는 새로운 혈액 세포를 생성하는 환자의 능력을 손상시켜, 모든 혈액 세포 유형이 부족한 진행성 범혈구감소증을 초래한다. 그러나, 섬유모세포의 증식 및 콜라겐의 침착은 2차 현상인 것으로 생각되고, 섬유모세포 자체는 비정상적 세포 클론의 일부가 아닐 수 있다.

골수섬유증은 골수에서의 비정상적 혈액 줄기 세포에 의해 유발될 수 있다. 비정상적 줄기 세포는 빠르게 성장하고 골수를 대체하는 성숙 및 불량하게 분화된 세포를 생산하고, 이는 섬유증 (반흔 조직 형성) 및 만성 염증 둘 다를 유발한다.

원발성 골수섬유증은 야누스 키나제2 (JAK2), 트롬보포이에틴 수용체 (MPL) 및 칼레티쿨린 (CALR)에서의 돌연변이와 연관되며, 이는 JAK-STAT 경로의 구성적 활성화로 이어질 수 있고, 골수의 진행성 반흔형성 또는 섬유증이 발생한다. 조혈 세포는 다른 영역, 특히 간 및 비장으로 이동하도록 강제되기 때문에, 환자에서 골수외 조혈, 즉 골수 이외의 부위에서 발생하는 혈액 세포 형성이 발생할 수 있다. 이는 이들 기관의 비대를 유발한다. 간에서, 비정상적 크기는 간비대로 불린다. 비장의 비대는 비장비대로 불리며, 이는 또한 범혈구감소증, 특히 혈소판감소증 및 빈혈의 유발에 기여한다. 골수외 조혈의 또 다른 합병증은 변형적혈구증가증, 또는 비정상적으로 형상화된 적혈구의 존재이다.

골수섬유증에서 골수외 조혈의 주요 부위는 비장이며, 이는 통상적으로 골수섬유증을 앓고 있는 환자에서 현저하게 비대해진다. 비장의 대규모 비대의 결과로서, 다발성 피막하 경색이 종종 비장에서 발생하며, 이는 비장으로의 중단된 산소 공급으로 인해 부분적 또는 완전한 조직 사멸이 발생한다는 것을 의미한다. 세포 수준에서, 비장은 적혈구 전구체, 과립구 전구체 및 거핵구를 함유하며, 거핵구는 그의 수 및 그의 비정상적 형상에 있어서 현저하다. 거핵구는 이러한 상태에서 관찰되는 속발성 섬유증을 유발하는데 수반될 수 있다.

TGFβ가 골수섬유증의 발병기전의 섬유화 측면에 수반될 수 있는 것으로 시사되었다 (예를 들어, 문헌 [Agarwal et al., "Bone marrow fibrosis in primary myelofibrosis: pathogenic mechanisms and the role of TGFβ" (2016) Stem Cell Investig 3:5] 참조). 원발성 골수섬유증에서 골수 병리상태는 섬유증, 신생혈관신생 및 골경화증을 특징으로 하고, 섬유증은 ECM에 침착되는 콜라겐 생산의 증가와 연관된다.

다수의 바이오마커가 기재되어 있으며, 그의 대체는 질환을 나타내거나 또는 그와 상관관계가 있다. 일부 실시양태에서, 바이오마커는 세포 마커이다. 이러한 질환-연관 바이오마커는 질환 진행뿐만 아니라 요법의 유효성 (예를 들어, 요법에 대한 환자의 반응성)의 진단 및/또는 모니터링에 유용하다. 이들 바이오마커는 다수의 섬유화 마커, 뿐만 아니라 세포 마커를 포함한다. 폐암에서, 예를 들어, 기관지폐포 세척 (BAL) 액 중 TGFβ1 농도는 양성 질환을 갖는 환자와 비교하여 폐암을 갖는 환자에서 유의하게 더 높은 것으로 보고되며 (~2+ 배 증가), 이는 또한 폐암의 진행 또는 치료 효과를 진단 및/또는 모니터링하기 위한 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다.

원발성 골수섬유증은 비정상적 거핵구 발생과 연관되기 때문에, 거핵구뿐만 아니라 줄기 세포 계통의 그의 전구세포의 특정 세포 마커는 질환 진행뿐만 아니라 요법의 유효성을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 마커로서의 역할을 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 유용한 마커는 분화된 거핵구의 세포 마커 (예를 들어, CD41, CD42 및 Tpo R), 거핵구-적혈구 전구 세포의 세포 마커 (예를 들어, CD34, CD38, 및 CD45RA-), 통상의 골수 전구 세포의 세포 마커 (예를 들어, IL-3α/CD127, CD34, SCF R/c-kit 및 Flt-3/Flk-2), 및 조혈 줄기 세포의 세포 마커 (예를 들어, CD34, CD38-, Flt-3/Flk-2)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 유용한 바이오마커는 섬유화 마커를 포함한다. 이는 비제한적으로: TGFβ1, PAI-1 (또한 세르핀1로도 공지됨), MCP-1 (또한 CCL2로도 공지됨), Col1a1, Col3a1, FN1, CTGF, α-SMA, ACTA2, Timp1, Mmp8, 및 Mmp9를 포함한다. 일부 실시양태에서, 유용한 바이오마커는 혈청 마커 (예를 들어, 혈청 샘플에서 발견되고 검출되는 단백질 또는 단편)이다.

TGFβ가 백혈병성 골수 함요의 성분이라는 발견에 기초하여, 골수 미세환경을 TGFβ 억제제로 표적화하는 것은 이환 조직에서 국부 TGFβ 이용가능성을 조절하는 제시 분자를 발현하는 백혈병성 세포를 감소시키기 위한 유망한 접근법일 수 있는 것으로 고려된다.

실제로, (용어 "골수섬유증" 자체가 시사하는 바와 같이) 골수-증식성 및 섬유화 측면 둘 다에서 TGFβ-의존성 조절이상을 나타내는 병리상태의 다면적 성질로 인해, 본원에 기재된 것과 같은 매트릭스- 및 세포-회합된 TGFβ1 복합체를 표적화하는 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 골수섬유증을 앓고 있는 환자에게 특히 유리한 치료 효과를 제공할 수 있다. 이러한 억제제의 LTBP-아암은 골수에서 ECM-회합된 TGFβ1 복합체를 표적화할 수 있는 반면, 억제제의 LRRC33-아암은 골수 세포-회합된 TGFβ1을 차단할 수 있는 것으로 고려된다. 또한, 골수섬유증과 연관된 비정상적 거핵구 생물학은 GARP- 및 LTBP-매개 TGFβ1 활성 둘 다를 수반할 수 있다. TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 이러한 복합체를 표적화함으로써 함요에서 활성 TGFβ1의 방출을 억제할 수 있다.

따라서, 이러한 TGFβ1 억제제는 다른 (또는 표준 관리) 치료, 예컨대 히드록시우레아 및 JAK 억제제에 대해 부적절한 반응을 가졌거나 또는 그에 대해 불내성인 진성 다혈구혈증을 갖는 환자의 치료에 유용하다. 이러한 억제제는 또한 원발성 골수섬유증 (MF), 진성 다혈구혈증-후 MF 및 본태성 혈소판혈증-후 MF를 비롯한 중간 또는 고-위험 MF를 갖는 환자의 치료에 유용하다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

따라서, 본 발명의 한 측면은 원발성 골수섬유증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 방법은 원발성 골수섬유증을 앓고 있는 환자에게 감소된 TGFβ 이용가능성을 유발하는 TGFβ 억제제를 포함하는 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 활성화의 억제제는 골수섬유증을 갖는 환자에게 투여된다. 이러한 항체는 0.1 내지 100 mg/kg, 예컨대 1 내지 30 mg, 예를 들어 1 mg/kg, 3 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg 등의 범위의 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 적합한 투여 요법은 매주 투여되는 1-20 mg/kg을 포함한다. 항체를 포함하는 제약 조성물의 바람직한 투여 경로는 정맥내 또는 피하 투여이다. 조성물이 정맥내로 투여되는 경우에, 환자에게 치료당 적합한 지속기간, 예를 들어 대략 30-120분 (예를 들어, 30분, 60분, 75분, 90분, 및 120분)에 걸쳐 치료제를 제공한 다음, 총 수회의 주기, 예를 들어 4주기, 6주기, 8주기, 10주기, 12주기 등 동안 수주, 예를 들어 3주, 4주, 6주 등마다 반복할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 6주기 또는 12주기 동안 28일 (4주)마다 정맥내 투여를 통해 1-10 mg/kg (예를 들어, 투여당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 mg/kg)의 용량 수준의 억제 항체를 포함하는 조성물로 치료된다. 일부 실시양태에서, 이러한 치료는 설정된 횟수의 투여 주기 후에 중단되는 것 대신에 만성 (장기) 요법 (예를 들어, 유익한 것으로 간주되는 한, 무기한으로 계속됨)으로서 투여된다.

골수섬유증은 백혈병의 유형으로 간주되지만, 이는 또한 섬유증의 징후를 특징으로 한다. TGFβ는 ECM 항상성의 측면을 조절하는 것으로 공지되어 있고, 그의 조절이상은 조직 섬유증으로 이어질 수 있기 때문에, ECM과 연관된 TGFβ 활성을 억제하는 것이 바람직하다. 따라서, 본원에 기재된 항체 또는 단편은 LTBP (예컨대 LTBP1 및 LTBP3)에 의해 제시된 프로TGFβ를 억제할 뿐만 아니라 GARP 및 LRRC33에 의해 제시된 프로TGFβ도 억제한다.

초기 생체내 데이터는 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제가 원발성 골수섬유증의 번역가능한 뮤린 모델에서 골수섬유증을 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 단지 증상 완화만을 제공하지만 임상 또는 생존 이익은 제공하지 않는 현행 표준 관리 JAK2 억제제와 달리, TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 이환 마우스의 골수에서 유의한 항섬유화 효과를 달성하고, 또한 생존을 연장시킬 수 있으며, 이는 TGFβ1 억제제가 인간 환자에서 골수증식성 장애를 치료하는데 효과적일 수 있다는 개념을 지지한다.

본원에 기재된 조성물 및 방법으로 치료될 수 있는 적합한 골수증식성 신생물 환자 집단은 a) 필라델피아 (+)인 환자 집단; b) 필라델피아 (-)인 환자 집단; c) "전형적"으로 카테고리화된 (PV, ET 및 PMF) 환자 집단; d) 돌연변이 JAK2V617F(+)를 보유하는 환자 집단; e) JAK2V617F(-)를 보유하는 환자 집단; f) JAK2 엑손 12(+)를 갖는 환자 집단; g) MPL(+)을 갖는 환자 집단; 및 h) CALR(+)을 갖는 환자 집단을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, 환자 집단은 중간-2 또는 고위험 골수섬유증을 갖는 환자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자 집단은 이용가능한 요법에 대해 불응성이거나 또는 그에 대한 후보가 아닌 골수섬유증을 갖는 대상체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 100-200 x 10⁹개/L의 혈소판 계수를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 치료를 받기 전에 > 200 x 10⁹개/L의 혈소판 계수를 갖는다.

일부 실시양태에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제 요법을 제공받을 (및 제공받는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는) 대상체는 중간-1 또는 그 초과의 원발성 골수섬유증 (PMF), 또는 진성 다혈구혈증/본태성 혈소판혈증-후 골수섬유증 (PV/ET-후 MF)으로 진단된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 치료 전에 골수 섬유증으로 기록되었다. 일부 실시양태에서, 대상체는 치료 전에 유럽 컨센서스 등급화 점수에 의해 평가된 바와 같은 MF-2 또는 그 초과 및 변형된 바우어마이스터 척도에 의해 평가된 바와 같은 등급 3 또는 그 초과를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 치료 전에 ECOG 수행 상태 1을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 치료 전에 5 내지 120 범위의 백혈구 계수 (10⁹개/L)를 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 10-100% 범위인 JAK2V617F 대립유전자 부담을 갖는다.

일부 실시양태에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제 요법을 제공받을 (및 제공받는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는) 대상체는, 대상체가 임상적으로 명백한 출혈과 연관되지 않은 8.5 g/dL 미만의 헤모글로빈 수준으로 인해 마지막 달에 적어도 2 단위의 적혈구 수혈 이력을 갖는 것을 특징으로 하는 (치료 전) 수혈-의존성이다.

일부 실시양태에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제 요법을 제공받을 (및 제공받는 것으로부터 이익을 얻을 수 있는) 대상체는 이전에 골수섬유증을 치료하기 위한 요법을 제공받았다. 일부 실시양태에서, 대상체는 AZD1480, 파노비노스타트, EPO, IFNα, 히드록시우레아, PEG화 인터페론, 탈리도미드, 프레드니손, 및 JAK2 억제제 (예를 들어, 레스타우르티닙, CEP-701)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 요법 중 1종 이상으로 치료받았다.

일부 실시양태에서, 환자는 골수외 조혈을 갖는다. 일부 실시양태에서, 골수외 조혈은 간, 폐, 비장, 및/또는 림프절에 존재한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 질환 징후의 국재화된 부위 중 1개 이상에 국부로 투여된다.

일부 실시양태에 따르면, TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 대상체에서 골수증식성 장애의 치료에 사용하기 위한 것이다. 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 골수섬유증을 치료하는데 효과적인 양으로 환자에게 투여된다.

치료 유효량은 골수 기질에서의 ECM의 과도한 침착, 신혈관신생, 골경화증, 비장비대, 간비대, 빈혈, 출혈, 골통 및 다른 골-관련 이환율, 골수외 조혈, 혈소판증가증, 백혈구감소증, 악액질, 감염, 혈전증 및 사망을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 환자에서 골수섬유증의 1종 이상의 증상 및/또는 합병증을 완화시키기에 충분한 양이다. 바람직한 실시양태에서, 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

일부 실시양태에서, 양은 환자에서 (예컨대 거핵구성 세포의) TGFβ1 발현 및/또는 분비를 감소시키는데 효과적이다. 따라서, 이러한 억제제는 치료된 환자에서 TGFβ1 mRNA 수준을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 억제제는 골수에서, 예컨대 단핵 세포에서 TGFβ1 mRNA 수준을 감소시킨다. PMF 환자는 전형적으로 ~2,500 pg/mL 초과, 예를 들어 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 및 10,000 pg/mL 초과의 상승된 혈장 TGFβ1 수준을 나타낸다 (ELISA에 의해 측정된 바와 같은 ~600-2,000 pg/mL의 정상 범위와 대조적임) (예를 들어, 문헌 [Mascaremhas et al., (Leukemia & Lymphoma, 2014, 55(2): 450-452)] 참조). 문헌 [Zingariello (Blood, 2013, 121(17): 3345-3363)]은 PMF 환자 및 대조군 개체의 혈장에서의 생물활성 및 총 TGFβ1 함량을 정량화하였다. 이러한 참고문헌에 따르면, PMF 환자에서의 중앙 생물활성 TGFβ1은 43 ng/mL (4-218 ng/mL 범위)였고, 총 TGFβ1은 153 ng/mL (32-1000 ng/mL)인 반면, 대조군 대응물에서의 값은 각각 18 (0.05-144) 및 52 (8-860)였다. 따라서, 이들 보고에 기초하여, PMF 환자에서의 혈장 TGFβ1 함량은 대조군 또는 건강한 혈장 샘플과 비교하여 수배, 예를 들어, 2배, 3배, 4배, 5배 등만큼 상승된다. 본원에 기재된, 예를 들어 4-12 투여 주기 (예를 들어, 2, 4, 6, 8, 10, 12주기) 또는 예를 들어 4주마다의 만성 또는 장기 치료에 따라 0.1-100 mg/kg, 예를 들어 1-30 mg/kg 모노클로날 항체의 투여량으로 억제제로 치료하는 것은 혈장 TGFβ1 수준을 상응하는 기준선 (치료전)에 비해 적어도 10%, 예를 들어 적어도 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 및 50%만큼 감소시킬 수 있다.

치료 효과의 일부는 치료의 시작 후에, 예를 들어 1주, 2주, 3주, 4주, 5주 또는 6주 후에 비교적 신속하게 관찰될 수 있다. 예를 들어, 억제제는 1-8주 내에 억제제로 치료된 환자의 골수 내의 줄기 세포 및/또는 전구체 세포의 수를 효과적으로 증가시킬 수 있다. 이들은 조혈 줄기 세포 및 혈액 전구체 세포를 포함한다. 골수 생검을 수행하여 골수 세포의 빈도/수에서의 변화를 평가할 수 있다. 상응하게, 환자는 개선된 증상, 예컨대 골통 및 피로를 보일 수 있다.

골수섬유증의 형태학적 특징 중 하나는, 부분적으로 이상 ECM을 특징으로 하는 골수 (예를 들어, 골수 기질)에서의 섬유증이다. 일부 실시양태에서, 양은, 예를 들어 중간엽 기질 세포에 의한 과도한 콜라겐 침착을 감소시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 억제제는 치료를 받지 않은 대조군 대상체와 비교하여 치료받은 대상체에서 CD41-양성 세포, 예를 들어 거핵구의 수를 감소시키는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 무작위로 선택된 절편을 사용하여 결정된 바와 같이, PMF 골수에서 거핵구의 기준선 빈도는 제곱 밀리미터 (mm²)당 200-700개 세포 범위일 수 있고, PMF 비장에서는 제곱 밀리미터 (mm²)당 40-300개 거핵구 범위일 수 있다. 대조적으로, 정상 공여자의 골수 및 비장에서의 거핵구 빈도는 각각 140 미만 및 10 미만이다. 억제제로의 치료는 골수 및/또는 비장에서 거핵구의 수 (예를 들어, 빈도)를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제로의 치료는 하류 이펙터 신호전달, 예컨대 SMAD2/3의 인산화의 감소된 수준을 유발할 수 있다.

골수섬유증을 갖는 환자는 비대 비장을 앓을 수 있다. 따라서, 치료제의 임상 효과는 비장 크기의 변화를 모니터링함으로써 평가될 수 있다. 비장 크기는 공지된 기술, 예컨대 촉진에 의한 비장 길이의 평가 및/또는 초음파에 의한 비장 부피의 평가에 의해 검사될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-특이적 억제제로 치료될 대상체는 촉진에 의해 평가된 바와 같이 5 cm 이상, 예를 들어 5 내지 30 cm 범위의 기준선 비장 길이 (치료 전)를 갖는다. 일부 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-특이적 억제제로 치료될 대상체는 초음파에 의해 평가된 바와 같이 300 mL 이상, 예를 들어, 300-1500 mL 범위의 기준선 비장 부피 (치료 전)를 갖는다. 본원에 기재된, 예를 들어 4주마다, 0.1-30 mg/kg 모노클로날 항체의 투여량으로의, 예를 들어 4-12 투여 주기 (예를 들어, 2, 4, 6, 8, 10, 12주기)에 따른 억제제로의 치료는 대상체에서 비장 크기를 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 억제제의 유효량은 억제제 치료를 받는 환자 집단에서 비장 크기를 상응하는 기준선 값에 비해 적어도 10%, 20%, 30%, 35%, 40%, 50% 및 60%만큼 감소시키기에 충분하다. 예를 들어, 치료는 위약 대조군과 비교하여 MRI 또는 CT 스캔에 의해 측정된 바와 같이 12-24주 내에 기준선으로부터 비장 부피의 ≥35% 감소를 달성하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 치료는 최상의 이용가능한 요법 대조군과 비교하여 MRI 또는 CT 스캔에 의해 측정된 바와 같이 24-48주 내에 기준선으로부터 비장 부피의 ≥35% 감소를 달성하는데 효과적이다. 최상의 이용가능한 요법은 히드록시우레아, 글루코코르티코이드, 뿐만 아니라 의약 없음, 아나그렐리드, 에포에틴 알파, 탈리도미드, 레날리도미드, 메르캅토퓨린, 티오구아닌, 다나졸, 페그인터페론 알파-2a, 인터페론-α, 멜팔란, 아세틸살리실산, 시타라빈, 및 콜키신을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제로 치료된 환자 집단은, 예를 들어 골수섬유증 연구 및 치료의 국제 실무 그룹 (IWG-MRT) 기준, 치료 (예를 들어, 4, 6, 8, 또는 12주기) 후 변형된 바우어마이스터 스케일 및 유럽 컨센서스 등급화 시스템에 의해 측정된 골수 섬유증 등급의 변화 정도, 골수증식성 신생물 증상 평가 형태 (MPN-SAF)를 사용한 증상 반응에 의해 평가된 바와 같이 통계적으로 개선된 치료 반응을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제로의 치료는, 예를 들어 0 내지 10의 스케일 (여기서 0은 부재하다는 것이고 10은 상상할 수 있는 나쁜 것임)을 사용하여 골수섬유증의 쇠약 증상 (복부 불편감, 조기 포만감, 좌측 늑골하 통증, 소양증, 야간 발한, 및 골통/근육통)을 포착하는 1일 다이어리인 변형된 골수섬유증 증상 평가 형태 (MFSAF) 툴 (예컨대 v2.0)에 의해 증상이 측정되는 MFSAF에 의해 평가된 바와 같이 통계적으로 개선된 치료 반응을 달성한다. 일부 실시양태에서, 치료는 예를 들어 12-24주 내에 기준선으로부터 총 MFSAF 점수의 50%≥ 감소를 달성하는데 효과적이다. 일부 실시양태에서, 요법을 제공받는 환자의 유의한 분율은 위약을 복용한 환자와 비교하여 총 증상 점수에서 ≥50% 개선을 달성한다. 예를 들어, ≥50% 개선을 달성한 환자 풀의 분율은 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 초과일 수 있다.

일부 실시양태에서, 억제제의 치료 유효량은 빈혈 반응에 의해 평가된 바와 같은 임상 개선을 달성하기에 충분한 양이다. 예를 들어, 개선된 빈혈 반응은 4-12주기, 예를 들어 6주기의 치료 후 수혈-독립성의 보다 긴 지속기간, 예를 들어 8주 이상을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 억제제의 치료 유효량은 지속 기간, 예를 들어 6주, 8주, 12주, 6개월 등 동안 안정한 질환을 유지시키기에 충분한 양이다. 일부 실시양태에서, 질환의 진행은 전체 골수 세포충실성의 변화, 레티쿨린 또는 콜라겐 섬유증의 정도, 및/또는 JAK2V617F 대립유전자 부담의 변화에 의해 평가될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제로 치료된 환자 집단은 치료를 받지 않은 대조군 집단과 비교하여 통계적으로 개선된 생존을 나타낸다. 예를 들어, 대조군에서, PMF 환자의 중앙 생존은 대략 6년 (고위험 환자에서는 대략 16개월)이고, 환자의 20% 미만은 진단후 10년 이상 생존할 것으로 예상된다. 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 사용한 치료는 생존 시간을 적어도 6개월, 12개월, 18개월, 24개월, 30개월, 36개월 또는 48개월 연장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 위약을 제공받는 환자와 비교하여 26주, 52주, 78주, 104주, 130주, 144주 또는 156주의 개선된 전체 생존을 달성하는데 효과적이다.

상기 예시된 것과 같은 요법의 임상 이익은 새로운 발병 빈혈이 있거나 없는 환자에서 관찰될 수 있다.

이소형-특이적 TGFβ1 억제제의 유리한 특색 중 하나는 이들이 선택성이 결여된 통상적인 TGFβ 길항제와 비교하여 이소형 선택성에 의해 가능해진 개선된 안전성 프로파일을 유지한다는 것이다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제를 사용한 치료는 이러한 사건의 빈도 및/또는 중증도와 관련하여, 통상적인 TGFβ 길항제로 치료된 등가의 환자 집단과 비교하여 환자 집단에서 유해 사건을 감소시킬 수 있는 것으로 예상된다. 따라서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 치료의 투여량 및/또는 지속기간에 대해 보다 큰 치료 범위를 제공할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

유해 사건은 관련 기술분야에 인식된 적합한 방법, 예컨대 유해 사건에 대한 통상 용어 기준 (CTCAE) 버전 4에 의해 등급화될 수 있다. TGFβ 길항제, 예컨대 GC1008을 제공받은 인간 환자에서의 이전에 보고된 유해 사건은 백혈구증가증 (등급 3), 피로 (등급 3), 저산소증 (등급 3), 심장무수축 (등급 5), 백혈구감소증 (등급 1), 재발성, 일시적, 경도 홍반성, 결절성 피부 병변, 화농성 피부염 및 대상 포진을 포함한다.

이소형-특이적 TGFβ1 억제제 요법은 예를 들어 빈혈, 혈소판감소증, 호중구감소증, 고콜레스테롤혈증, 상승된 알라닌 트랜스아미나제 (ALT), 상승된 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST), 타박상, 어지럼증 및 두통과 관련하여 골수섬유증 환자에서의 JAK 억제제 요법과 비교하여 덜 빈번하고/거나 덜 중증인 유해 사건 (부작용)을 유발할 수 있으며, 따라서 보다 안전한 치료 옵션을 제공한다.

TGFβ1 신호전달의 억제제는 조합 요법으로서 골수섬유증의 치료를 위한 1종 이상의 치료제와 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1 활성화의 억제제는 JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제를 제공받은 골수섬유증을 앓고 있는 환자에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 이러한 환자는 JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제 요법에 반응성인 반면, 다른 실시양태에서 이러한 환자는 JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제 요법에 불량하게 반응성이거나 반응성이지 않다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 사용은 JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제 요법에 불량하게 반응성이거나 반응성이지 않은 자를 보다 반응성이게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 사용은 환자에서 여전히 등가의 임상 효능을 생성하지만 더 적거나 더 낮은 정도의 약물-관련 독성 또는 유해 사건 (예컨대 상기 열거된 것)을 생성하는 감소된 투여량의 JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제를 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제 요법과 함께 사용되는 본원에 기재된 TGFβ1 활성화의 억제제로의 치료는 환자에서 상승작용적 또는 상가적 치료 효과를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1 활성화의 억제제를 사용한 치료는 JAK1 억제제, JAK2 억제제 또는 JAK1/JAK2 억제제 또는 골수섬유증을 치료하기 위해 제공되는 다른 요법의 이익을 부스팅할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 골수섬유증과 연관된 빈혈을 다루기 위한 치료제를 추가로 제공받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 체크포인트 억제제, 예컨대 PD-(L)1 항체를 포함한다.

TGFβ1-양성 암:

다양한 암은 TGFβ1 활성을 수반하고, 본 개시내용의 항체 및/또는 조성물로 치료될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "암"은 주위 조직을 침습하고 새로운 신체 부위로 전이하는 경향이 있는 역형성 세포의 증식을 특징으로 하는 다양한 TGFβ1-양성 악성 신생물 중 임의의 것을 지칭하고, 또한 이러한 악성 신생물성 성장을 특징으로 하는 병리학적 상태를 지칭한다. 암은 국재화된 암 (예를 들어, 고형 종양) 또는 전신 암일 수 있다. 본 개시내용과 관련하여, 용어 "국재화된" ("국재화된 종양"에서와 같음)은 전신 질환 (예를 들어, 소위 액상 종양 또는 혈액암)과는 대조적으로 해부학적으로 단리되거나 단리가능한 이상/병변, 예컨대 고형 악성종양을 지칭한다. 특정 암, 예컨대 특정 백혈병 (예를 들어, 골수섬유증) 및 다발성 골수종은, 예를 들어 질환에 대한 국재화된 성분 (예를 들어 골수) 및 전신 성분 (예를 들어 순환 혈액 세포) 둘 다를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 암은 전신 암, 예컨대 혈액 악성종양일 수 있다. 본 개시내용에 따라 치료될 수 있는 암은 TGFβ1-양성이고, 모든 유형의 림프종/백혈병, 암종 및 육종, 예컨대 항문, 방광, 담관, 골, 뇌, 유방, 자궁경부, 결장/직장, 자궁내막, 식도, 눈, 담낭, 두경부, 간, 신장, 후두, 폐, 종격 (흉부), 구강, 난소, 췌장, 음경, 전립선, 피부, 소장, 위, 척수, 꼬리골, 고환, 갑상선 및 자궁에서 발견되는 암 또는 종양을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 암에서, TGFβ (예를 들어, TGFβ1)는 성장 촉진 또는 성장 억제성일 수 있다. 예로서, 췌장암에서, SMAD4 야생형 종양은 TGFβ에 반응하여 억제된 성장을 경험할 수 있지만, 질환이 진행됨에 따라, 구성적으로 활성화된 유형 II 수용체가 전형적으로 존재한다. 추가적으로, SMAD4-널 췌장암이 존재한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 그의 항원-결합 부분 및/또는 조성물은 1종 이상의 형태의 암에서 고유하게 기능하는 TGFβ 신호전달 경로의 성분을 선택적으로 표적화하도록 설계된다. 백혈병, 또는 백혈구, 즉 류코사이트의 비정상적 증식을 특징으로 하는 혈액암 또는 골수암은 4가지 주요 분류로 분류될 수 있으며 이는 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 급성 골수 백혈병 또는 급성 골수성 백혈병 (AML) (염색체 10과 11 [t(10, 11)], 염색체 8과 21 [t(8;21)], 염색체 15와 17 [t(15;17)] 사이의 전위, 및 염색체 16에서의 역위 [inv(16)]를 갖는 AML; 선행 골수이형성 증후군 (MDS) 또는 AML로 변형된 골수증식성 질환을 갖는 환자를 포함한, 다계열 이형성증을 동반한 AML; AML 및 골수이형성 증후군 (MDS), 요법-관련 (이 카테고리는 선행 화학요법 및/또는 방사선을 받았고 후속적으로 AML 또는 MDS가 발생한 환자를 포함함); d) 상기 카테고리에 속하지 않는 AML의 하위유형을 포함하는, 달리 카테고리화되지 않는 AML; e) 백혈병성 세포가 골수성 또는 림프성 세포로서 분류될 수 없는 경우, 또는 둘 다의 세포 유형이 존재하는 경우에 발생하는, 모호한 계통의 급성 백혈병); 및 만성 골수 백혈병 (CML)을 포함한다.

본 발명의 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 BCR/ABL 종양단백질이 신생물성 세포의 비정상적 성장 및 축적에 필수적인 것으로 간주되는 줄기 세포 질환인 만성 골수성 백혈병을 앓고 있는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 이마티닙은 이러한 상태를 치료하기 위해 승인된 요법이지만; 골수성 백혈병 환자의 유의한 분율은 이마티닙-저항성을 나타낸다. 본원에 기재된 것과 같은 억제제에 의해 달성된 TGFβ1 억제는 재증식/확장을 강화시켜 신생물성 세포의 BCR/ABL-구동된 비정상적 성장 및 축적에 대응함으로써, 임상 이익을 제공할 수 있다.

본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제는 다발성 골수종을 치료하는데 사용될 수 있다. 다발성 골수종은 골수에서 발생 및 확장되어 파괴성 골 병변 (즉, 골용해성 병변)을 유발하는 B 림프구 (예를 들어, 형질 세포, 형질모세포, 기억 B 세포)의 암이다. 전형적으로, 질환은 부분적으로 골용해성 병변, 골감소증, 골다공증, 고칼슘혈증, 뿐만 아니라 형질세포종, 혈소판감소증, 호중구감소증 및 신경병증을 특징으로 하는, 증진된 파골세포 골 흡수, 억제된 골모세포 분화 (예를 들어, 분화 정지) 및 손상된 골 형성을 나타낸다. 본원에 기재된 TGFβ1-선택적 억제제 요법은 환자에서 1종 이상의 이러한 임상 징후 또는 증상을 호전시키는데 효과적일 수 있다. TGFβ1 억제제는 본원의 다른 곳에 열거된 것을 포함한, 다발성 골수종을 치료하기 위한 추가의 요법 또는 요법들을 제공받는 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다발성 골수종은 미오스타틴 억제제 또는 IL-6 억제제와 조합된 TGFβ1 억제제를 사용하여 치료할 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 전통적인 다발성 골수종 요법, 예컨대 보르테조밉, 레날리도미드, 카르필조밉, 포말리도미드, 탈리도미드, 독소루비신, 코르티코스테로이드 (예를 들어, 덱사메타손 및 프레드니손), 화학요법 (예를 들어, 멜팔란), 방사선 요법, 줄기 세포 이식, 플리티뎁신, 엘로투주맙, 익사조밉, 마시티닙, 및/또는 파노비노스타트와 함께 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 암종의 유형은 유두종/암종, 융모막암종, 내배엽동 종양, 기형종, 선종/선암종, 흑색종, 섬유종, 지방종, 평활근종, 횡문근종, 중피종, 혈관종, 골종, 연골종, 신경교종, 림프종/백혈병, 편평 세포 암종, 소세포 암종, 대세포 미분화 암종, 기저 세포 암종 및 부비동비강 미분화 암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

육종의 유형은 연부 조직 육종, 예컨대 폐포 연부 육종, 혈관육종, 피부섬유육종, 데스모이드 종양, 결합조직형성 원형 소세포 종양, 골격외 연골육종, 골격외 골육종, 섬유육종, 혈관주위세포종, 혈관육종, 카포시 육종, 평활근육종, 지방육종, 림프관육종, 림프육종, 악성 섬유성 조직구종, 신경섬유육종, 횡문근육종, 활막 육종 및 아스킨 종양, 유잉 육종 (원시 신경외배엽 종양), 악성 혈관내피종, 악성 슈반세포종, 골육종 및 연골육종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1 활성화의 이소형-선택적 억제제는 신경 능선 기원의 세포를 수반하는 악성종양을 치료하는데 적합할 수 있다. 신경 능선 계통의 암 (즉, 신경 능선-유래 종양)은 흑색종 (멜라닌세포의 암), 신경모세포종 (교감신경부신 전구체의 암), 신경절신경종 (말초 신경계 신경절의 암), 수질성 갑상선 암종 (갑상선 C 세포의 암), 크롬친화세포종 (부신 수질의 크로마핀 세포의 암), 및 MPNST (슈반 세포의 암)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 및 방법은 결장암, 신암, 유방암, 악성 흑색종 및 교모세포종을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는 암 또는 암-관련 상태의 1종 이상의 유형을 치료하는데 사용될 수 있다 (Schlingensiepen et al., 2008. Cancer Res. 177: 137-50; Ouhtit et al., 2013. J Cancer. 4 (7): 566-572).

Treg는 건강한 개체에서 면역 반응을 약화시키는데 중요한 역할을 하는 한편, 암에서 상승된 Treg의 수는 불량한 예후와 연관되었다. 예를 들어, 인간 난소암 복수는 Foxp3+ GARP+ Treg로 침윤된다 (Downs-Canner et al., Nat Commun. 2017, 8: 14649). 유사하게, Treg는 진행성 간세포성 암종에서 보다 면역억제성이고 보다 공격성인 표현형과 양의 상관관계가 있었다 (Kalathil et al., Cancer Res. 2013, 73(8): 2435-44). Treg는 이펙터 T 세포의 증식을 억제할 수 있다. 또한, Treg는 TGFβ1의 생산을 통해 면역 세포 (예를 들어, 나이브 CD4+ T 세포)의 접촉-의존성 억제를 발휘한다. 따라서, 종양을 퇴치하기 위해, 충분한 이펙터 T 세포가 항종양 활성을 발휘하는데 이용가능할 수 있도록 Treg를 억제하는 것이 유리하다.

증가하는 일련의 증거는 종양/암 진행에서의 대식세포의 역할을 시사한다. 본 발명은 이것이 부분적으로 질환 환경, 예컨대 TME에서 TGFβ1 활성화에 의해 매개된다는 개념을 포괄한다. 골수-유래 단핵구 (예를 들어, CD11b+)는 종양-유래 시토카인/케모카인 (예컨대 CCL2, CCL3, 및 CCL4)에 반응하여 종양 부위로 동원되며, 여기서 단핵구는 분화 및 분극을 거쳐 암-촉진 표현형 (예를 들어, M2-편향, TAM 또는 TAM-유사 세포)을 획득한다. 많은 종양에서 대다수의 TAM은 M2-편향된다. M2-유사 대식세포 중에서, M2c 및 M2d 하위유형은 세포 표면 상에 상승된 LRRC33을 발현하지만 M1은 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다. 또한, 대식세포는 M-CSF 노출에 의해 추가로 편향 또는 활성화되어, TGFβ1 발현과 동시에 일어나는 LRRC33 발현의 현저한 증가를 발생시킬 수 있다. 골수증식성 질환 (예를 들어, 골수섬유증)을 갖는 환자에서 증가된 순환 M-CSF (즉, 혈청 M-CSF 농도)가 또한 관찰되었다. 일반적으로, 높은 대식세포 (TAM) 및/또는 MDSC 침윤을 갖는 종양은 불량한 예후와 연관된다. 유사하게, 상승된 수준의 M-CSF도 또한 불량한 예후를 나타낸다.

다른 한편으로는, 종양으로의 대식세포 침윤은 또한 요법의 유효성을 나타낼 수 있다. 도 17a-17b 및 18a-18b에 예시된 바와 같이, 체크포인트 억제제 및 콘텍스트-비의존성 (또는 콘텍스트 편향된) TGFβ1 억제제의 조합으로의 처리 후에 이펙터 T 세포 (예를 들어, CD8+ T 세포)에 의해 효과적으로 침투된 종양은 세포 파편을 세정하는 식세포 단핵구/대식세포의 동원을 유도할 수 있다. 도 17b로부터 명백한 바와 같이, 항-PD-1 및 TGFβ1 억제제의 조합은 항-PD-1 치료 단독과 비교하여 종양 전반에 걸쳐 강건한 CD8 T 세포 유입을 발생시켰다. 병행하여, F4/80-양성 대식세포에 의한 종양의 광범위한 침윤이 관찰된다 (도 18b 참조). 이는 대식세포가 세포독성 세포에 의해 생성된 암 세포 파편을 소거한다는 것을 나타낼 수 있고, 이는 아마도 TGFβ1 억제의 직접적인 결과일 것이다.

상기 언급된 바와 같이, TGFβ1 활성화의 억제제는 흑색종의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 억제제로 치료될 수 있는 흑색종의 유형은 악성 흑색점; 악성 흑자 흑색종; 표재 확산성 흑색종; 말단 흑자 흑색종; 점막 흑색종; 결절성 흑색종; 폴립양 흑색종 및 결합조직형성 흑색종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 흑색종은 전이성 흑색종이다.

보다 최근에, 면역 체크포인트 억제제는 진행성 흑색종 환자를 효과적으로 치료하는데 사용되어 왔다. 특히, 항-프로그램화된 사멸 (PD)-1 항체 (예를 들어, 니볼루맙 및 펨브롤리주맙)는 현재 특정 유형의 암, 예컨대 진행성 흑색종에 대한 표준 관리가 되었고, 이는 관리가능한 독성 프로파일과 함께 유의한 활성 및 지속적인 반응을 입증하였다. 그러나, PD-1 길항제의 효과적인 임상 적용은 높은 비율의 선천성 저항성 (~60-70%)에 의해 지장을 받으며 (문헌 [Hugo et al., (2016) Cell 165: 35-44] 참조), 이는 진행 중인 도전과제가 계속해서 환자 선택 및 반응 및 저항성의 예측인자뿐만 아니라 조합 전략의 최적화를 포함한다는 것을 예시한다 (Perrot et al., (2013) Ann Dermatol 25(2): 135-144). 더욱이, 연구는 초기에 항-PD-1 요법에 반응한 흑색종 환자의 대략 25%가 결국 후천성 내성을 발생시켰다는 것을 시사하였다 (Ribas et al., (2016) JAMA 315: 1600-9).

PD-1 및/또는 CTLA-4를 발현하는 종양-침윤 CD8+ T 세포의 수는 체크포인트 억제에 의한 성공의 주요 지표인 것으로 보이고, PD-1 및 CTLA-4 차단 둘 다는 침윤 T 세포를 증가시킬 수 있다. 그러나, 종양-연관 대식세포가 더 많이 존재하는 환자에서, CD8 세포의 항암 효과는 억제될 수 있다.

LRRC33-발현 세포, 예컨대 골수 전구체, MDSC 및 TAM을 포함한 골수 세포는 T 세포, 예컨대 CD4 및/또는 CD8 T 세포를 억제함으로써 (예를 들어, T 세포 고갈) 면역억제 환경 (예컨대 TME 및 골수섬유화 골수)을 생성하거나 지지할 수 있는 것으로 고려되며, 이는 적어도 부분적으로 특정 환자 집단에서 관찰되는 항-PD-1 저항성을 강조할 수 있다. 실제로, 증거는 항-PD-1 단독요법에 대한 저항성이 CD8+ 세포독성 T 세포의 축적 실패 및 감소된 Teff/Treg 비에 의해 표시되었음을 시사한다. 특히, 본 발명자들은 LRRC33 발현 수준과 관련하여 특정 암 환자, 예컨대 흑색종 환자 집단 사이에 분기가 존재한다는 것을 인식하였다: 하나의 군은 높은 LRRC33 발현 (LRRC33^고)을 나타내는 반면, 다른 군은 비교적 낮은 LRRC33 발현 (LRRC33^저)을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 LRRC33^고 환자 집단이 면역 체크포인트 억제제 요법에 불량하게 반응하거나 또는 그에 저항성인 자를 나타낼 수 있다는 개념을 포함한다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 LRRC33을 억제하는 작용제는 체크포인트 억제제 요법 (예를 들어, 항-PD-1)에 저항성인 암, 예컨대 흑색종, 림프종, 및 골수증식성 장애의 치료에 특히 유익할 수 있다.

일부 실시양태에서, 암/종양은 면역 체크포인트 억제제에 대해 고유하게 저항성이거나 비반응성이다. 한 예를 들자면, 특정 림프종은 항-PD-1 요법과 같은 면역 체크포인트 억제에 불량하게 반응성인 것으로 보인다. 유사하게, 흑색종 환자 집단의 하위세트는 면역 체크포인트 억제제에 대해 저항성을 보이는 것으로 공지되어 있다. 특정한 이론에 얽매이는 것을 의도하지는 않지만, 본 개시내용의 발명자들은 이것이 적어도 부분적으로 체크포인트 억제제가 그의 효과를 발휘하지 못하는 면역억제 미세환경을 생성할 수 있는 TGFβ1 신호전달 경로의 상향조절로 인한 것일 수 있다는 것을 고려한다. TGFβ1 억제는 이러한 암을 체크포인트 억제제 요법에 보다 반응성이게 할 수 있다. 면역 체크포인트 억제제 및 TGFβ1 억제제의 조합으로부터 이익을 얻을 수 있는 암 유형의 비제한적 예는 골수섬유증, 흑색종, 신세포 암종, 방광암, 결장암, 혈액 악성종양, 비소세포 암종, 비소세포 폐암 (NSCLC), 림프종 (전형적 호지킨 및 비-호지킨), 두경부암, 요로상피암, 높은 미소위성체 불안정성을 갖는 암, 미스매치 복구 결핍을 갖는 암, 위암, 신암 및 간세포성암을 포함한다. 그러나, 예를 들어 생검에 의해 결정된 바와 같이 TGFβ1이 과다발현되거나 TGFβ2/3에 비해 우성 이소형인 임의의 암 (예를 들어, 이러한 암을 갖는 환자)은 본 개시내용에 따라 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제로 치료될 수 있다.

일부 실시양태에서, 암/종양은 시간 경과에 따라 저항성이 된다. 이러한 현상은 획득 저항성 또는 적응 저항성으로 지칭된다. 고유 저항성과 같이, 일부 실시양태에서, 획득 저항성은 적어도 부분적으로 TGFβ1-의존성 경로에 의해 매개되고, 본원에 기재된 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 이들 경우에 항암 면역을 회복시키는데 효과적일 수 있다.

일부 실시양태에서, 면역 체크포인트 억제제 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체를 표적화하는 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제 (예컨대 본원에 기재된 것)를 포함하는 조합 요법은 이러한 암을 치료하는데 효과적일 수 있다. 또한, 종양 또는 달리 비정상적 세포 증식을 갖는 부위/조직에서의 높은 LRRC33-양성 세포 침윤은 숙주 면역억제 및 면역 체크포인트 저항성에 대한 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다. 유사하게, 이펙터 T 세포는 암을 퇴치하는 신체의 능력을 제한하는 면역억제 함요로부터 배제될 수 있다. 또한, 하기 실시예 섹션에서 입증된 바와 같이, GARP-제시된 TGFβ1을 발현하는 Treg는 이펙터 T 세포 증식을 억제한다. 종합하면, TGFβ1은 면역 억제 질환 미세환경 (예컨대 TME)의 생성 및 유지에서 주요 구동자일 가능성이 있고, 다중 TGFβ1 제시 콘텍스트는 종양과 관련된다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 보다 유리한 Teff/Treg 비를 달성할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 암의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 암이 치료되도록 대상체에게 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암은 결장암이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 고형 종양을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 전형적으로 치료 분자가 침투하기에 조밀하고 경질인 결합조직형성 종양일 수 있다. 이러한 종양의 ECM 성분을 표적화함으로써, 이러한 항체는 조밀한 종양 조직이 붕해되도록 "이완"시켜, 그의 항암 효과를 발휘하기 위한 치료적 접근을 용이하게 할 수 있다. 따라서, 추가의 치료제, 예컨대 임의의 공지된 항종양 약물이 조합되어 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

추가적으로 또는 대안적으로, 본원에 개시된 것과 같은 TGFβ1 활성화를 억제할 수 있는 이소형-특이적 항체 또는 그의 단편은 세포-기반 면역요법, 예컨대 암을 퇴치하기 위한 암 면역요법으로서 키메라 항원 수용체 T-세포 ("CAR-T") 기술과 함께 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 고형 종양을 갖는 대상체에서 고형 종양 성장을 억제하거나 감소시키는 방법에 사용될 수 있으며, 상기 방법은 고형 종양 성장이 억제 또는 감소되도록 대상체에게 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 고형 종양은 결장 암종 종양이다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하는데 유용한 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1 활성화의 이소형-특이적 억제제이다.

본 발명은 대상체에서의 고형 종양을 포함한 암의 치료에서 본원에 기재된 바와 같은 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 용도를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 이소형-특이적 억제제는 TGFβ1의 활성화를 억제할 수 있다. 일부 실시양태에서, 고형 종양은 CAF 및 콜라겐 섬유와 직접 접촉하는 CD8+ T 세포가 풍부한 기질을 갖는 것을 특징으로 한다. 이러한 종양은 항종양 면역 세포 (예를 들어, 이펙터 T 세포)가 종양에 효과적으로 침윤하는 것을 방지하여 암과 싸우는 신체의 능력을 제한하는 면역억제 환경을 생성할 수 있다. 대신에, 이러한 세포는 종양 기질 내에 또는 그 근처에 축적될 수 있다. 이들 특색은 이러한 종양을 면역 체크포인트 억제제 요법에 불량하게 반응성이게 할 수 있다. 하기에 보다 상세히 논의된 바와 같이, 본원에 개시된 TGFβ1 억제제는, 예를 들어 면역 체크포인트 억제제와 함께 사용되어, 이펙터 세포가 암 세포에 도달하고 이를 사멸시키도록 억제를 차단해제할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

TGFβ1은 종양 성장, 숙주 면역 억제, 악성 세포 증식, 혈관분포, 혈관신생, 이동, 침습, 전이, 및 화학요법저항성을 포함하여, 종양 미세환경에서 다면적인 역할을 하는 것으로 고려된다. 따라서, 환경에서의 TGFβ1 제시의 각각의 "콘텍스트"는 질환 진행의 조절 (또는 조절이상)에 참여할 수 있다. 예를 들어, GARP 축은 암 세포를 퇴치하기 위해 숙주 면역 반응을 매개하기 위해 이펙터 T 세포 반응을 조절하는 Treg 반응에서 특히 중요하다. LTBP1/3 축은 기질을 포함한 ECM을 조절할 수 있으며, 여기서 암-연관 섬유모세포 (CAF)는 암의 발병기전 및 진행에서 역할을 한다. LRRC33 축은 순환 단핵구의 종양 미세환경으로의 동원, 종양-연관 대식세포 (TAM)로의 후속 분화, 종양 조직으로의 침윤 및 질환의 악화에서 중대한 역할을 할 수 있다.

종양 미세환경 (TME)은 암 (즉, 악성) 세포에 더하여 TGFβ1을 발현하는 다중 세포 유형, 예컨대 활성화된 근섬유모세포-유사 섬유모세포, 기질 세포, 침윤 대식세포, MDSC 및 다른 면역 세포를 함유한다. 따라서, TME는 함요 내에서 TGFβ1을 발현하고/거나 그에 반응성이지만 1종 초과의 유형의 제시 분자, 예를 들어 LTBP1, LTBP3, LRRC33 및 GARP와 회합된 세포의 이종 집단을 나타낸다.

보다 최근에, 항종양 이펙터 T 세포 (예를 들어, CD8+ T 세포)가 면역억제 국부 신호에 의해 떨어져 있는 (따라서 "배제된") 종양 환경을 설명하기 위해 "면역 배제"로 지칭되는 현상이 만들어졌고, TGFβ는 적어도 부분적으로 이 과정을 매개하는 것으로 생각된다. 면역-배제된 종양에서, 달리 세포-표면 종양 항원을 인식함으로써 암 세포를 공격할 수 있을 이펙터 세포는 암 세포의 부위에 접근하는 것이 막힌다. 이러한 방식으로, 암 세포는 이러한 면역을 이용하고 이에 의존하는 숙주 면역 및 면역-종양학적 치료제, 예컨대 체크포인트 억제제를 피한다. 실제로, 이러한 종양은 아마도 표적 T 세포가 종양에 진입하는 것이 차단되어 항암 효과를 발휘하지 못하기 때문에, 체크포인트 억제, 예컨대 항-PD-1 및 항-PD-L1 항체에 대해 저항성을 나타낸다.

증가하는 증거는 TGFβ가 면역-배제된 종양 환경을 포함한 질환 조직에서 면역억제를 생성 및/또는 유지시키는데 있어서 1차 역할자일 수 있음을 시사한다. 따라서, TGFβ 억제는 면역억제를 차단해제하고, 이펙터 T 세포 (특히 세포독성 CD8+ T 세포)가 표적 암 세포에 접근하여 이를 사멸시키는 것을 가능하게 할 수 있다. 종양 침윤에 더하여, TGFβ 억제는 또한 CD8+ T 세포 확장을 촉진할 수 있다. 이러한 과정의 기저를 이루는 정확한 메카니즘은 아직 규명되지 않았지만, 면역억제는 조절 T 세포 및 활성화된 대식세포를 수반하는 면역 세포-연관 TGFβ1 활성화에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 것으로 고려된다. TGFβ가 CD4+ T 세포에서 Foxp3 발현을 직접적으로 촉진함으로써, 이를 조절 표현형 (즉, Treg)으로 전환시키는 것으로 보고되었다. 또한, Treg는 이펙터 T 세포 증식을 억제함으로써 (예를 들어, 도 26 참조), 면역 반응을 감소시킨다. 이러한 과정은 TGFβ1-의존성인 것으로 제시되고, GARP-연관 TGFβ1 신호전달을 수반할 가능성이 있다. 인간 및 동물 모델 둘 다에서의 관찰은 TME에서의 Treg의 증가가 다중 유형의 암에서의 불량한 예후와 연관된다는 것을 나타내었다. 또한, 본 출원인은 이전에, 종양-유래 인자, 예컨대 M-CSF에 노출된 M2-분극화된 대식세포가 TGFβ1에 대한 제시 분자인 LRRC33의 세포-표면 발현을 극적으로 상향조절한다는 것을 밝혀내었다 (예를 들어, PCT/US2018/031759 참조). 이들 소위 종양-연관 대식세포 (또는 TAM)는 TME에서 관찰된 TGFβ1-의존성 면역억제에 기여하고 종양 성장을 촉진하는 것으로 생각된다.

다수의 고형 종양은 근섬유모세포 또는 근섬유모세포-유사 세포가 풍부한 종양 기질을 갖는 것을 특징으로 한다. 이들 세포는 종양을 둘러싸거나 감싸는 콜라겐성 매트릭스를 생산하며 (예컨대 결합조직형성), 이는 적어도 부분적으로 과다활성 TGFβ1 신호전달에 의해 유발될 수 있다. TGFβ1 활성화는 종양 기질 내의 ECM-회합된 제시 분자, 예를 들어, LTBP1 및 LTBP3을 통해 매개되는 것으로 고려된다.

일부 실시양태에서, TGFβ1-발현 세포는 종양에 침윤하여 면역억제 국부 환경을 생성한다. 이러한 침윤이 관찰되는 정도는 악화된 예후와 상관관계가 있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 보다 높은 침윤은 또 다른 암 요법, 예컨대 면역 체크포인트 억제제에 대한 보다 불량한 치료 반응을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 종양 미세환경에서의 TGFβ1-발현 세포는 Treg 및/또는 골수 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 골수 세포는 대식세포, 단핵구 (조직 상주 또는 골수-유래), 및 MDSC를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, TME에서의 LRRC33-발현 세포는 골수-유래 억제 세포 (MDSC)이다. MDSC 침윤 (예를 들어, 고형 종양 침윤물)은 숙주의 항종양 면역 세포가 배제되는 면역억제 함요를 생성함으로써 적어도 1종의 면역 회피 메카니즘을 강조할 수 있다. 증거는 MDSC가 염증-연관 신호, 예컨대 종양-연관 염증 인자에 의해 가동화된다는 것을 시사한다. 가동화 시, MDSC는 질환-퇴치 세포, 예컨대 CD8+ T 세포 및 NK 세포를 손상시킴으로써 면역억제 효과에 영향을 미칠 수 있다. 또한, MDSC는 TGFβ 및 IL-10을 분비함으로써 Treg의 분화를 유도할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 질환 (예컨대 종양)과 싸우는 신체의 능력을 회복시키거나 부스팅하기 위해 면역 회피 (예를 들어, 손상된 면역 감시)를 갖는 환자에게 투여될 수 있다. 본원에 보다 상세히 기재된 바와 같이, 이는 또 다른 요법, 예컨대 암 요법에 대한 신체의 반응성 또는 감수성을 추가로 증진 (예를 들어, 회복 또는 강화)시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, 환자에서 순환 MDSC의 상승된 빈도 (예를 들어, 수)는 체크포인트 차단 요법, 예컨대 PD-1 길항제 및 PD-L1 길항제에 대한 불량한 반응성을 예측케 한다. 예를 들어, 바이오마커 연구는 순환 치료전 HLA-DR lo/CD14+/CD11b+ 골수-유래 억제 세포 (MDSC)가 진행 및 악화된 OS와 연관되었음을 나타내었다 (p = 0.0001 및 0.0009). 또한, 염증발생 두경부 암종 (HNC)에서의 PD-1 체크포인트 차단에 대한 저항성은 GM-CSF 및 골수 유래 억제 세포 (MDSC) 마커의 발현과 연관된다. 이러한 관찰은 MDSC를 고갈시키는 전략, 예컨대 화학요법이 항-PD-1과 조합되어 또는 그와 순차적으로 고려되어야 한다는 것을 시사하였다. LRRC33 또는 LRRC33-TGFβ 복합체는 면역억제 골수 세포 상에서의 선택적 발현으로 인해 암 면역요법을 위한 신규 표적을 나타낸다. 따라서, 특정한 이론에 얽매이는 것을 의도하지는 않지만, 이러한 복합체를 표적화하는 것은 환자 집단에서 표준 관리 체크포인트 억제제 요법의 유효성을 증진시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 고형 종양을 포함하는 암의 치료를 위한 본원에 기재된 이소형-특이적 TGFβ1 억제제의 용도를 제공한다. 이러한 치료는 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 적어도 1종의 국재하된 종양 (고형 종양)을 포함하는 암으로 진단된 대상체에게 암을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

증거는 암 진행 (예를 들어, 종양 증식/성장, 침습, 혈관신생 및 전이)이 적어도 부분적으로 종양-기질 상호작용에 의해 유도될 수 있음을 시사한다. 특히, CAF는 다양한 시토카인 및 성장 인자의 분비 및 ECM 재형성에 의해 이러한 과정에 기여할 수 있다. 과정에 수반되는 인자는 기질-세포-유래 인자 1 (SCD-1), MMP2, MMP9, MMP3, MMP-13, TNF-α, TGFβ1, VEGF, IL-6, M-CSF를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, CAF는 CCL2/MCP-1 및 SDF-1/CXCL12와 같은 인자를 종양 부위로 분비함으로써 TAM을 동원할 수 있고; 후속적으로, TAM이 우선적으로 부착되는 프로-TAM 함요 (예를 들어, 히알루로난-풍부 기질 영역)가 생성된다. TGFβ1이 정상 섬유모세포의 근섬유모세포-유사 CAF로의 활성화를 촉진하는 것으로 시사되었기 때문에, 본원에 기재된 것과 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제의 투여는 CAF의 암-촉진 활성에 대응하는데 효과적일 수 있다. 실제로, 본원에 제시된 데이터는 TGFβ1의 활성화를 차단하는 이소형-특이적 항체가, 또한 많은 암에 연루되는 마커 유전자, 예컨대 CCL2/MCP-1, α-SMA. FN1 및 Col1의 UUO-유도된 상향조절을 억제할 수 있음을 시사한다.

특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 암 또는 종양을 갖는 대상체에게 단독으로 또는 추가의 작용제, 예를 들어 항-PD-1 항체 (예를 들어, 항-PD-1 길항제)와 조합되어 투여된다. 본 발명에 포함되는 다른 조합 요법은 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 방사선 또는 화학요법제와 함께 투여하는 것이다. 예시적인 추가의 작용제는 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, PD-L1 또는 PD-L2 융합 단백질, CTLA4 길항제, GITR 효능제, 항-ICOS 항체, 항-ICOSL 항체, 항-B7H3 항체, 항-B7H4 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-OX40 항체, 항-CD27 항체, 항-CD70 항체, 항-CD47 항체, 항-41BB 항체, 항-PD-1 항체, 항-CD20 항체, 종양용해 바이러스, 및 PARP 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, 특정한 암 유형 또는 환자 집단에 적합한 조합 요법에 대한 치료 접근법의 결정 또는 선택은 하기: a) 표준 관리 요법이 이용가능한 암 유형에 관한 고려사항 (예를 들어, 면역요법-승인된 적응증); b) 치료-저항성 하위집단에 관한 고려사항; 및 c) "TGFβ1 경로-활성"이거나 또는 달리 적어도 부분적으로 TGFβ1-의존성 (예를 들어, TGFβ1 억제-감수성)인 암/종양에 관한 고려사항을 수반할 수 있다. 예를 들어, 많은 암 샘플은, 예를 들어 TCGA RNAseq 분석에 의해 TGFβ1이 우세한 이소형임을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 각각의 종양 유형으로부터의 샘플의 50% 초과 (예를 들어, 50%, 60%, 70%, 80% 및 90% 초과)가 TGFβ1이소형 발현에 대해 양성이다. 일부 실시양태에서, "TGFβ1 경로-활성"이거나 또는 달리 적어도 부분적으로 TGFβ1-의존성 (예를 들어, TGFβ1 억제-감수성)인 암/종양은 적어도 1종의 Ras 돌연변이, 예컨대 K-ras, N-ras 및/또는 H-ras에서의 돌연변이를 함유한다. 일부 실시양태에서, 암/종양은 적어도 1종의 K-ras 돌연변이를 포함한다.

일부 실시양태에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 1종 이상의 체크포인트 억제제 요법이 승인되거나 또는 효과를 제시하는 암으로 진단된 환자에게 체크포인트 억제 요법과 함께 투여된다. 이들은 방광 요로상피 암종, 편평 세포 암종 (예컨대 두경부), 신장 투명 세포 암종, 신장 유두상 세포 암종, 간 간세포성 암종, 폐 선암종, 피부 흑색종, 및 위 선암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 환자는 체크포인트 억제제 요법에 불량하게 반응성이거나 또는 비-반응성이다. 일부 실시양태에서, 불량한 반응성은 1차 저항성으로 인한 것이다. 일부 실시양태에서, 체크포인트 차단에 대해 저항성인 암은 TCF7 발현의 하향조절을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 체크포인트 억제-저항성 종양에서의 TCF7 하향조절은 적은 수의 종양내 CD8+ T 세포와 상관될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 화학요법- 또는 방사선요법-저항성 암의 치료에 사용될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 이소형-특이적 TGFβ1 억제제는 화학요법 및/또는 방사선 요법을 제공받거나 제공받았던 암으로 진단된 환자에게 투여된다. 특히, TGFβ1 억제제의 사용은 암 (환자)이 이러한 요법에 저항성인 경우에 유리하다. 일부 실시양태에서, 이러한 암은 정지 종양 증식성 암 세포 (TPC)를 포함하며, 여기서 TGFβ 신호전달은 화학요법 또는 방사선 요법으로부터 TPC를 보호하는 성장 정지 상태로의 그의 가역적 진입을 제어한다. TGFβ1의 약리학적 억제 시, 손상된 TPC는 정지기에 진입하는데 실패하여 화학요법 및/또는 방사선 요법에 대해 감수성이 되는 것으로 고려된다. 이러한 암은 다양한 암종, 예를 들어 편평 세포 암종을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Brown et al., (2017) "TGF-β-Induced Quiescence Mediates Chemoresistance of Tumor-Propagating Cells in Squamous Cell Carcinoma." Cell Stem Cell. 21(5):650-664]을 참조한다.

조직 재생 및 줄기 세포 재증식으로부터 이익을 얻는 상태

증거는 TGFβ1이 조직 내에서 다양한 줄기 세포 집단 및 그의 분화/재증식의 항상성을 조절하는데 소정의 역할을 한다는 것을 시사한다. 항상성 동안, 조직-특이적 줄기 세포는 우세하게 정지상태로 유지되지만, 특정 스트레스 시에 세포 주기에 진입하도록 촉발된다. TGFβ1은 줄기 세포 분화 및 재구성을 엄격하게 조절하는 과정 동안 "파괴"로서 기능하는 것으로 생각되고, 세포 주기 진입을 촉발하는 스트레스는 "파괴"를 제거하는 TGFβ1 억제와 동시에 일어난다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 특정한 조직 내의 줄기 세포/전구 세포의 세포 주기 및 G0 진입 결정을 왜곡하거나 교정하는데 사용될 수 있는 것으로 고려된다.

따라서, 본 개시내용의 발명자들은 i) 줄기 세포/전구 세포 분화/재구성이 질환으로 인해 중지 또는 교란되거나 요법/의약의 부작용으로서 유도된 상태; ii) 환자가 건강한 세포의 사멸 또는 고갈을 유발하는 요법 또는 의약을 받고 있는 상태; iii) 환자가 증가된 줄기 세포/전구 세포 분화/재구성으로부터 이익을 얻을 수 있는 상태; iv) 질환이 비정상적 줄기 세포 분화 또는 재구성과 연관된 상태에서 이소형-선택적 TGFβ1 억제제의 용도를 고려한다.

예를 들어, 중간엽 기질/줄기 세포 (MSC)는 대부분의 성인 결합 조직, 예컨대 골수, 지방 조직 및 제대혈에 존재하는 작은 기질 세포 집단이다. MSC는 생체내에서 상대적 정지 상태로 유지되지만, 다양한 생리학적 및 병리학적 자극에 반응하여 증식한 후, 골모세포, 연골세포, 지방세포, 또는 평활근 세포 (SMC) 및 심근세포와 같은 다른 중배엽-유형 계통으로 분화할 수 있다. 다중 신호전달 네트워크는 기능적 중간엽 계통으로 분화하는 MSC를 조직하고, 그 중 TGF-β1이 주요 역할자로서 출현하였다 (예를 들어 문헌 [Zhao & Hantash (2011). Vitam Horm 87:127-41]에서 검토됨).

유사하게, 조혈 줄기 세포는 평생 혈액 세포 생산을 위해 요구되고; 소진을 방지하기 위해, 대다수의 조혈 줄기 세포는 정상-상태 조혈 동안 정지상태로 유지된다. 그러나, 혈액학적 스트레스 동안, 이들 세포는 세포 주기로 신속하게 동원되고, 증가된 조혈 요구를 충족시키기 위해 광범위한 자가-재생 및 분화를 겪는다. TGFβ1은 정지-재증식 이행/균형을 제어하는 "스위치"로서 작용할 수 있다.

따라서, TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 조혈 줄기 세포 결함 및 골수 부전을 수반하는 상태의 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조혈 줄기 세포 저장소의 고갈 또는 손상은 조혈 부전 또는 혈액 악성종양으로 이어진다. 일부 실시양태에서, 이러한 상태는 진행성 골수 부전을 특징으로 하는 DNA 복구 장애이다. 일부 실시양태에서, 이러한 상태는 줄기 및 전구 세포 마모에 의해 유발된다. 일부 실시양태에서, 이러한 상태는 빈혈과 연관된다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

치료-유도된 조혈 조절이상을 수반하는 상태

다양한 질환 상태를 치료하도록 설계된 특정 약물은 종종 치료될 환자에서 빈혈 (예를 들어, 치료- 또는 약물-유도된 빈혈, 예컨대 화학요법-유도된 빈혈 및 방사선 요법-유도된 빈혈)을 유도하거나 악화시키는 것으로 인식된다. 일부 실시양태에서, 환자는 빈혈을 포함한 부작용을 유발할 수 있는 골수억제 약물로 치료된다. 이러한 환자는 조혈을 부스팅하기 위해 약리학적 TGFβ1 억제로부터 이익을 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 억제제는 정지 상태로의 진입을 방지함으로써 환자에서 조혈을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 환자는 G-CSF 요법 (예를 들어, 필그라스팀)을 제공받을 수 있다.

따라서, 본 발명은 골수억제 요법 (예를 들어, 골수억제 효과를 포함한 부작용을 갖는 요법)을 제공받는 환자에게 투여될 본원에 개시된 것과 같은 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제의 용도를 포함한다. 골수억제 요법의 예는 페그인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-n3, 페그인터페론 알파-2b, 알데스류킨, 겜투주맙 오조가미신, 인터페론 알파콘-1, 리툭시맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙, 알렘투주맙, 베바시주맙, L-페닐알라닌, 보르테조밉, 클라드리빈, 카르무스틴, 암사크린, 클로람부실, 랄티트렉세드, 미토마이신, 벡사로텐, 빈데신, 플록수리딘, 티오구아닌, 비노렐빈, 덱스라족산, 소라페닙, 스트렙토조신, 겜시타빈, 테니포시드, 에피루비신, 클로람페니콜, 레날리도미드, 알트레타민, 지도부딘, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 시클로포스파미드, 플루오로우라실, 프로필티오우라실, 펜토스타틴, 메토트렉세이트, 카르바마제핀, 빈블라스틴, 리네졸리드, 이마티닙, 클로파라빈, 페메트렉세드, 다우노루비신, 이리노테칸, 메티마졸, 에토포시드, 다카르바진, 테모졸로미드, 타크롤리무스, 시롤리무스, 메클로레타민, 아자시티딘, 카르보플라틴, 닥티노마이신, 시타라빈, 독소루비신, 히드록시우레아, 부술판, 토포테칸, 메르캅토퓨린, 탈리도미드, 멜팔란, 플루다라빈, 플루시토신, 카페시타빈, 프로카르바진, 삼산화비소, 이다루비신, 이포스파미드, 미톡산트론, 로무스틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 다사티닙, 데시타빈, 넬라라빈, 에베롤리무스, 보리노스타트, 티오테파, 익사베필론, 닐로티닙, 벨리노스타트, 트라벡테딘, 트라스투주맙 엠탄신, 템시롤리무스, 보수티닙, 벤다무스틴, 카바지탁셀, 에리불린, 룩솔리티닙, 카르필조밉, 토파시티닙, 포나티닙, 포말리도미드, 오비누투주맙, 테디졸리드 포스페이트, 블리나투모맙, 이브루티닙, 팔보시클립, 올라파립, 디누툭시맙, 및 콜키신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

추가의 적응증은 미국 특허 번호 8,871,209, 미국 특허 번호 8,415,459, 또는 국제 공개 번호 WO 2011/151432에 개시된 것 중 임의의 것을 포함할 수 있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 그의 항원-결합 부분 및 조성물은 TGFβ1 신호전달과 연관된 매우 다양한 질환, 장애 및/또는 상태를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 조직/세포는 다른 이소형에 비해 TGFβ1 이소형을 우선적으로 발현한다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 제약 조성물을 사용하여 TGFβ1 발현과 연관된 이러한 상태 (예를 들어, TGFβ1 신호전달의 조절이상 및/또는 TGFβ1 발현의 상향조절)를 치료하는 방법을 포함한다.

일부 실시양태에서, 질환은 다중 세포 공급원과 연관된 (예를 들어, 그 상에 제시되거나 그로부터 침착된) TGFβ1을 수반한다. 일부 실시양태에서, 이러한 질환은 TGFβ1 기능의 면역 성분 및 ECM 성분 둘 다를 수반한다. 일부 실시양태에서, 이러한 질환은 i) ECM의 조절이상 (예를 들어, ECM 성분, 예컨대 콜라겐 및 프로테아제의 과다생산/침착; ECM 기질의 변경된 강성; 섬유모세포, 예컨대 근섬유모세포 및 CAF의 비정상적 또는 병리학적 활성화 또는 분화); ii) 증가된 Treg 및/또는 억제된 이펙터 T 세포 (Teff), 예를 들어 Treg/Teff의 상승된 비로 인한 면역 억제; CD4 및/또는 CD8 T 세포의 억제를 유발하는 증가된 백혈구 침윤물 (예를 들어, 대식세포 및 MDSC); 및/또는 iii) 골수 세포, 예컨대 대식세포 (예를 들어, 골수-유래 단핵구/대식세포 및 조직 상주 대식세포), 단핵구, 골수-유래 억제 세포 (MDSC), 호중구, 수지상 세포, 및 NK 세포의 비정상적 또는 병리학적 활성화, 분화 및/또는 동원을 수반한다.

일부 실시양태에서, 상태는 1종 초과의 유형의 제시 분자 (예를 들어, GARP, LRRC33, LTBP1 및/또는 LTBP3 중 2종 이상)에 의해 제시된 TGFβ1을 수반한다. 일부 실시양태에서, 이환 조직/기관/세포는 다중 세포 공급원으로부터의 TGFβ1을 포함한다. 한 예를 들자면, 고형 종양 (이는 또한 골수를 수반하는 증식성 질환, 예를 들어 골수섬유증 및 다발성 골수종을 포함할 수 있음)은 상이한 유형의 제시 분자를 수반하는 다중 공급원, 예컨대 암 세포, 기질 세포, 주변의 건강한 세포, 및/또는 침윤 면역 세포 (예를 들어, CD45+ 백혈구)로부터의 TGFβ1을 포함할 수 있다. 관련 면역 세포는 골수 세포 및 림프성 세포, 예를 들어, 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구 (예를 들어, B 세포, T 세포, 및 NK 세포), 및 단핵구를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

치료 요법 및 투여

본원에 개시된 방법을 실시하기 위해, 유효량의 상기 기재된 제약 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간)에게 적합한 경로, 예컨대 정맥내 투여를 통해, 예를 들어 볼루스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 투여될 수 있다. 제트 네뷸라이저 및 초음파 네뷸라이저를 비롯한 액체 제제를 위한 상업적으로 입수가능한 네뷸라이저가 투여에 유용하다. 액체 제제는 직접 연무화될 수 있고, 동결건조된 분말은 재구성 후에 연무화될 수 있다. 대안적으로, GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 플루오로카본 제제 및 계량 용량 흡입기를 사용하여 에어로졸화될 수 있거나, 또는 동결건조되고 밀링된 분말로서 흡입될 수 있다.

본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상체는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간일 수 있다. 포유동물은 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 치료를 필요로 하는 인간 대상체는 TGFβ-관련 적응증, 예컨대 상기 언급된 것을 갖거나, 그의 위험이 있거나, 또는 그를 갖는 것으로 의심되는 인간 환자일 수 있다. TGFβ-관련 적응증을 갖는 대상체는 상용 의학적 검사, 예를 들어 실험실 시험, 기관 기능 시험, CT 스캔, MRI, 또는 초음파에 의해 확인될 수 있다. 이러한 적응증 중 임의의 것을 갖는 것으로 의심되는 대상체는 적응증의 1종 이상의 증상을 나타낼 수 있다. 적응증의 위험이 있는 대상체는 그러한 적응증에 대한 위험 인자 중 1개 이상을 갖는 대상체일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "유효량" 및 "유효 용량"은 그의 의도된 목적(들), 즉 허용되는 이익/위험 비로 조직 또는 대상체에서 목적하는 생물학적 또는 의학적 반응을 충족시키기에 충분한 화합물 또는 조성물의 임의의 양 또는 용량을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 특정 실시양태에서, 의도된 목적은 TGFβ-1 억제와 연관된 임상적으로 의미있는 결과를 달성하기 위해 생체내에서 TGFβ-1 활성화를 억제하는 것일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 유효량은 치료될 특정한 상태, 상태의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중을 포함한 개별 환자 파라미터, 치료 지속기간, 공동 요법 (존재하는 경우)의 성질, 구체적 투여 경로, 및 건강 진료의의 지식 및 경험 내의 기타 인자에 따라 달라진다. 이들 인자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 단지 상용 실험으로 다루어질 수 있다. 개별 성분 또는 그의 조합의 최대 용량, 즉 타당한 의학적 판단에 따른 최고 안전 용량이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 환자가 의학적 이유, 심리적 이유 또는 실질적으로 임의의 다른 이유로 보다 낮은 용량 또는 허용되는 용량을 주장할 수 있음을 이해할 것이다.

실험적 고려사항, 예컨대 반감기는 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 상용성인 항체, 예컨대 인간화 항체 또는 완전 인간 항체는 항체의 반감기를 연장시키고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지하는데 사용될 수 있다. 투여 빈도는 요법 과정에 걸쳐 결정 및 조정될 수 있고, 반드시는 아니지만 일반적으로 TGFβ-관련 적응증의 치료 및/또는 억제 및/또는 호전 및/또는 지연에 기초한다. 대안적으로, GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체, 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체의 지속 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 본 개시내용의 범주 내에 있다.

한 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체, 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체에 대한 투여량은 항체의 1회 이상의 투여(들)가 주어지는 개체에서 실험적으로 결정될 수 있다. 개체에게 길항제의 증분 투여량을 제공한다. 효능을 평가하기 위해, TGFβ-관련 적응증의 지표를 추적할 수 있다. 예를 들어, 근섬유 손상, 근섬유 복구, 근육에서의 염증 수준, 및/또는 근육에서의 섬유증 수준을 측정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.

본 발명은 이소형-특이적 방식으로 TGFβ의 활성화 단계를 조정할 수 있는 작용제가 의약으로서 사용되는 경우에 개선된 안전성 프로파일을 제공할 수 있다는 인식을 포괄한다. 따라서, 본 발명은 낮은 해리율로 특이적으로 결합하고, TGFβ1의 활성화를 억제하지만, TGFβ2 또는 TGFβ3의 활성화는 억제하지 않음으로써, TGFβ2 및/또는 TGFβ3 신호전달에 영향을 미치는 것으로부터 원치 않는 부작용을 최소화하면서 생체내 TGFβ1 신호전달의 특이적 억제를 부여하는 항체 및 그의 항원-결합 단편을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 대상체에게 투여되는 경우에 독성이 아니다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1 및 TGFβ2 둘 다에 특이적으로 결합하는 항체와 비교하여 대상체에게 투여되는 경우에 감소된 독성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다에 특이적으로 결합하는 항체와 비교하여 대상체에게 투여되는 경우에 감소된 독성을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3에 특이적으로 결합하는 항체와 비교하여 대상체에게 투여되는 경우에 감소된 독성을 나타낸다.

일반적으로, 본원에 기재된 임의의 항체의 투여의 경우, 초기 후보 투여량은, 예를 들어 매주, 2주마다, 3주마다, 매월 등 투여당 약 1-20 mg/kg일 수 있다. 예를 들어, 환자는 질환 (예를 들어, 섬유증 또는 암)을 치료하는데 유효한 양으로 1주에, 2주에, 3주에, 또는 4주에 등 약 1-10 mg/kg의 주사를 제공받을 수 있으며, 여기서 양은 (허용되는 독성 또는 유해 사건 내에서) 내약성이 우수하다.

본 개시내용의 목적상, 전형적인 투여량 (투여, 예컨대 주사 및 주입당)은 상기 언급된 인자에 따라 약 0.1 mg/kg 내지 1 mg/kg 내지 2 mg/kg 내지 3 mg/kg, 내지 5 mg/kg 내지 10 mg/kg 내지 20 mg/kg 내지 30 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과 중 임의의 것의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 적합한 투여량은 용량당 약 10-3000 mg, 예를 들어 약 10 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 60 mg, 70 mg, 80 mg, 90 mg, 100 mg, 120 mg, 150 mg, 180 mg, 200 mg, 240 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 800 mg, 1000 mg, 1600 mg, 2000 mg, 2400 mg 등을 포함한다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라, 치료는 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 또는 TGFβ-관련 적응증 또는 그의 증상을 완화시키기에 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 지속된다. 예시적인 투여 요법은 초기 용량에 이어서 1회 이상의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 진료의가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 약동학 실험은 본원에 개시된 항체의 혈청 농도를 평가하기 위해 용이하게 수행될 수 있다. 이러한 투여후 안정성은 항체가 투여되는 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에서 임상적으로 효과적인 혈청 농도가 유지되는 동안 항체가 덜 빈번하게 투여될 수 있기 때문에 유리할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도는 매주, 2주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다, 또는 10주마다 1회; 또는 매월, 2개월마다, 또는 3개월마다, 또는 그 초과마다 1회이다. 이러한 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 요법 (사용된 항체 포함)은 시간 경과에 따라 달라질 수 있다.

일부 실시양태에서, 정상 체중의 성인 환자의 경우, 약 0.3 내지 5.00 mg/kg 범위의 용량이 투여될 수 있다. 특정한 투여 요법, 예를 들어 용량, 시기 및 반복은 특정한 개체 및 그러한 개체의 의료 병력, 뿐만 아니라 개별 작용제의 특성 (예컨대 작용제의 반감기, 및 다른 관련 고려사항)에 좌우될 것이다.

본 개시내용의 목적상, 본원에 개시된 항체의 적절한 투여량은 사용되는 특이적 항체 (또는 그의 조성물), 적응증의 유형 및 중증도, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 길항제에 대한 반응, 및 담당 의사의 판단에 좌우될 것이다. 일부 실시양태에서, 임상의는 목적하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 항체를 투여할 것이다. 항체의 투여는, 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료적인지 예방적인지, 및 숙련된 진료의에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적 또는 간헐적일 수 있다. 항체의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나, 또는 예를 들어 TGFβ-관련 적응증의 발생 전, 발생 동안, 또는 발생 후의 일련의 이격된 용량일 수 있다.

본 개시내용에 따라 TGFβ1-관련 적응증을 치료하는데 치료상 유효한 TGFβ1 항체의 혈청 농도는 적어도 약 10 μg/mL, 예를 들어, 약 10 μg/mL 내지 1.0 mg/mL일 수 있다. 일부 실시양태에서, 혈청 농도에 의해 측정된 바와 같은 항체의 유효량은 약 20-400 μg/mL이다. 일부 실시양태에서, 혈청 농도에 의해 측정된 바와 같은 항체의 유효량은 약 100-800 μg/mL이다. 일부 실시양태에서, 혈청 농도에 의해 측정된 바와 같은 항체의 유효량은 적어도 약 20 μg/mL, 예를 들어 적어도 약 50 μg/mL, 100 μg/mL, 150 μg/mL 또는 200 μg/mL이다.

일부 경우에, 간헐적 투여 요법이 고려된다. 환자가 TGFβ1에 대해 선택적이지 않은 TGFβ 억제제를 포함하는 요법을 제공받는 경우에, 이는 독성 위험이 더 클 수 있기 때문에, 간헐적 투여 요법이 특히 적절할 수 있다. 이러한 위험을 완화시키거나 관리하기 위해, 비-선택적 TGFβ 억제제는, 예를 들어 "필요에 따라" 드물게 또는 간헐적으로 투여될 수 있다.

TGFβ3을 억제하는 것이 섬유증에서 콜라겐 침착 또는 축적을 증가시킬 수 있다는 관찰에 기초하여, TGFβ3-억제 활성을 갖는 TGFβ 억제제, 예를 들어 TGFβ1/2/3, TGFβ1/3 및 TGFβ3의 억제제로 치료되는 환자에 대해 TGFβ1-선택적 억제제 (예컨대 본원에 개시된 신규 항체)를 포함하는 부가적 요법이 고려될 수 있다. TGFβ3-억제 활성을 갖는 TGFβ 억제제의 예는 TGFβ 수용체의 저분자량 길항제, 예를 들어, ALK5 길항제, 예컨대 갈루니세르팁 (LY2157299 1수화물); 모든 3종의 이소형을 억제하는 모노클로날 항체 (예컨대 중화 항체) ("범-억제제" 항체) (예를 들어, WO 2018/134681 참조); 3종의 이소형 중 2종을 우선적으로 억제하는 모노클로날 항체 (예를 들어, TGFβ1/3 (예를 들어 WO 2006/116002); 및 조작된 분자 (예를 들어, 융합 단백질), 예컨대 리간드 트랩 (예를 들어, WO 2018/029367; WO 2018/129331 및 WO 2018/158727)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 리간드 트랩은 WO/2018/15872의 개시내용에 따른 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 트랩은 WO 2018/029367; WO 2018/129331의 개시내용에 따른 구조를 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드 트랩은 M7824로 공지된 구축물이다. 일부 실시양태에서, 리간드 트랩은 AVID200으로 공지된 구축물이다. 일부 실시양태에서, 중화 범-TGFβ 항체는 GC1008 또는 그의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 WO/2018/134681의 개시내용에 따른 서열을 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체는 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다에 특이적으로 결합하는 중화 항체이다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체는 TGFβ3보다 TGFβ1에 우선적으로 결합한다. 예를 들어, 항체는 WO/2006/116002의 개시내용에 따른 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 21D1이다.

부가적 요법은 TGFβ3 억제의 섬유화유발 효과에 대응하거나 이를 극복하는 것을 목표로 한다. 일부 실시양태에서, 환자는 섬유화 장애를 갖거나, 또는 섬유화 장애 및/또는 심혈관 질환이 발생할 위험이 있다. 예를 들어, 환자는 간 섬유증 발병의 보다 높은 위험과 연관된 대사 상태를 앓을 수 있다. 이러한 위험과 연관된 대사 상태는 비만, 제2형 당뇨병 및 NASH를 포함한다. 따라서, 본 발명은 TGFβ3 억제제로 치료된 대상체의 부가적 요법에 사용하기 위한 TGFβ1-선택적 억제제를, TGFβ3 억제제의 섬유화유발 효과를 감소시키기에 충분한 양으로 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 섬유증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 골수섬유증을 갖는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 진행성 암, 예를 들어 전이성 또는 국부 진행성 종양을 갖는다. 일부 실시양태에서, TGFβ1-선택적 억제제는 Ab2, Ab46, Ab42, Ab50, 또는 그의 유도체이다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1-선택적 억제제는 Ab46이다.

이론에 얽매이지는 않지만, 일부 실시양태에서, 항-TGFβ3 활성을 갖는 TGFβ 억제제를 삼가하는 것은 고도로 전이성, 골수섬유화인 것으로 공지된 유형의 암으로 진단된 환자, 및/또는 섬유화 상태 및/또는 심혈관 질환을 갖거나 또는 그의 발생 위험이 있는 환자를 치료하는데 특히 유용할 수 있다. 따라서, 본원의 개시내용은 암의 치료에 사용하기 위한 TGFβ 억제제를 포함하며, 여기서 억제제는 TGFβ3을 억제하지 않고, 여기서 환자는 전이성 암 또는 골수섬유증을 갖거나, 또는 환자는 섬유화 상태 및/또는 심혈관 질환을 갖거나 또는 그의 발생 위험이 있고, 여기서 임의로 섬유화 상태는 비-알콜성 지방간염 (NASH)이다.

본원에 사용된 용어 "치료하는"은 TGFβ-관련 적응증, 적응증의 증상, 또는 적응증에 대한 소인을 갖는 대상체에게, 적응증, 적응증의 증상, 또는 적응증에 대한 소인을 치유하거나, 낫게 하거나, 완화시키거나, 경감시키거나, 변경하거나, 해소하거나, 호전시키거나, 개선시키거나, 또는 이에 영향을 미칠 목적으로 1종 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 적용 또는 투여하는 것을 지칭한다.

본원에 개시된 항체를 사용하여 TGFβ-관련 적응증을 완화시키는 것은 적응증의 발생 또는 진행을 지연시키거나, 또는 적응증의 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 적응증을 완화시키는 것은 반드시 치유적 결과를 요구하지는 않는다. 본원에 사용된 TGFβ-관련 적응증과 연관된 적응증의 발생을 "지연시키는 것"은 적응증의 진행을 연기, 방해, 둔화, 지체, 안정화 및/또는 연기시키는 것을 의미한다. 이러한 지연은 치료될 적응증 및/또는 개체의 병력에 따라 다양한 시간 길이일 수 있다. 적응증의 발생을 "지연" 또는 완화시키거나, 또는 적응증의 발병을 지연시키는 방법은, 방법을 사용하지 않는 것과 비교하여, 주어진 시간 프레임에서 적응증의 1종 이상의 증상이 발생할 확률을 감소시키고/거나 주어진 시간 프레임에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의한 결과를 제공하기에 충분한 다수의 대상체를 사용하는 임상 연구에 기초한다.

조합 요법

본 개시내용은 생체내 TGFβ 억제로부터 이익을 얻을 수 있는 대상체를 치료하기 위한 조합 요법으로서 사용되는 제약 조성물 및 관련 방법을 추가로 포괄한다. 이들 실시양태 중 임의의 것에서, 이러한 대상체는 본원에 기재된 적어도 1종의 TGFβ 억제제, 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 제1 조성물을, 동일하거나 중첩되는 질환 또는 임상 상태를 치료하도록 의도되는 적어도 1종의 추가의 치료제를 포함하는 제2 조성물과 함께 포함하는 조합 요법을 제공받을 수 있다. 제1 및 제2 조성물은 둘 다 동일한 세포 표적 또는 별개의 세포 표적에 대해 작용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 조성물은 동일하거나 중첩되는 세트의 질환 또는 임상 상태의 증상 또는 측면을 치료하거나 완화시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 조성물은 개별 세트의 질환 또는 임상 상태의 증상 또는 측면을 치료하거나 완화시킬 수 있다. 한 예를 들자면, 제1 조성물은 TGFβ 신호전달과 연관된 질환 또는 상태를 치료할 수 있는 한편, 제2 조성물은 동일한 질환 등과 연관된 염증 또는 섬유증을 치료할 수 있다. 이러한 조합 요법은 서로 함께 투여될 수 있다. 조합 요법과 관련하여 어구 "와 함께"는 조합 요법을 제공받는 대상체에서 제1 요법의 치료 효과가 제2 요법의 치료 효과와 시간적으로 및/또는 공간적으로 중첩된다는 것을 의미한다. 따라서, 조합 요법은 요법의 공동 투여를 위한 단일 제제로서, 또는 순차적 투여를 위한 개별 제제로서 제제화될 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 조합 요법은 질환의 치료에서 상승작용적 효과를 생성한다. 용어 "상승작용적"은 총괄적으로 각각의 단독요법의 상가적 효과 (예를 들어, 보다 큰 효능)보다 더 큰 효과를 지칭한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물을 포함하는 조합 요법은 또 다른 요법 (예컨대 제2 작용제의 단독요법)에 의해 생성되는 것과 전반적으로 등가인 효능을 생성하지만, 제2 작용제의 단독요법과 비교하여 제2 작용제와 연관된 보다 적은 원치 않는 유해 효과 또는 덜 중증인 독성과 연관된다. 일부 실시양태에서, 이러한 조합 요법은 제2 작용제의 보다 낮은 투여량을 가능하게 하지만, 전체 효능은 유지한다. 이러한 조합 요법은 장기간 치료가 정당화되고/거나 소아과 환자를 수반하는 환자 집단에 특히 적합할 수 있다.

따라서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같은, TGFβ1 단백질 활성화의 감소 및 TGFβ1 신호전달과 연관된 질환 또는 상태의 치료 또는 예방을 위한 조합 요법에 사용하기 위한 제약 조성물 및 방법을 제공한다. 따라서, 방법 또는 제약 조성물은 제2 요법을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 요법은 TGFβ1 신호전달과 연관된 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 제2 요법은 표적화된 질환과 연관된 적어도 1종의 증상(들)을 감소시키거나 치료할 수 있다. 제1 및 제2 요법은 유사하거나 비관련된 작용 메카니즘에 의해 그의 생물학적 효과를 발휘할 수 있거나; 또는 제1 및 제2 요법 중 하나 또는 둘 다는 다수의 작용 메카니즘에 의해 그의 생물학적 효과를 발휘할 수 있다.

본원에 기재된 제약 조성물은 각각의 기재된 실시양태에 대해 동일한 제약상 허용되는 담체 중에 또는 상이한 제약상 허용되는 담체 중에 제1 및 제2 요법을 가질 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 추가로, 제1 및 제2 요법은 기재된 실시양태 내에서 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명의 1종 이상의 항-TGFβ 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 추가의 치료제 중 1종 이상과 조합되어 사용될 수 있다. 본 발명의 항-TGFβ 항체와 함께 사용될 수 있는 추가의 치료제의 예는 암 백신, 조작된 면역 세포 요법, 화학요법, 방사선 요법, TGFβ 슈퍼패밀리의 구성원의 조정제, 예컨대 미오스타틴 억제제 및 GDF11 억제제; VEGF 효능제; IGF1 효능제; FXR 효능제; CCR2 억제제; CCR5 억제제; 이중 CCR2/CCR5 억제제; 리실 옥시다제-유사-2 억제제; ASK1 억제제; 아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC) 억제제; p38 키나제 억제제; 피르페니돈; 닌테다닙; M-CSF 억제제 (예를 들어, M-CSF 수용체 길항제 및 M-CSF 중화제); MAPK 억제제 (예를 들어, Erk 억제제), 면역 체크포인트 효능제 또는 길항제; IL-11 길항제; 및 IL-6 길항제 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. TGFβ 억제제와 함께 사용될 수 있는 추가의 치료제의 다른 예는 인돌아민 2,3-디옥시게나제 (IDO) 억제제, 티로신 키나제 억제제, Ser/Thr 키나제 억제제, 이중-특이적 키나제 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제는 PI3K 억제제, PKC 억제제 또는 JAK 억제제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제는 TGFβ3-선택적 억제제일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제는 Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 체크포인트 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, PD-L1 또는 PD-L2 융합 단백질, CTLA4 길항제, GITR 효능제, 항-ICOS 항체, 항-ICOSL 항체, 항-B7H3 항체, 항-B7H4 항체, 항-TIM3 항체, 항-LAG3 항체, 항-OX40 항체, 항-CD27 항체, 항-CD70 항체, 항-CD47 항체, 항-41BB 항체, 항-PD-1 항체, 종양용해 바이러스, 및 PARP 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 TGFβ1 활성화의 이소형-특이적 억제제는 본원에 열거된 것과 같은 체크포인트 억제 요법의 불량한 반응자 또는 비-반응자인 대상체에서 암의 치료에 사용된다.

일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 T-세포 공동자극 분자, 예컨대 억제 공동자극 분자 및 활성화 공동자극 분자에 결합한다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 항-CD40 항체, 항-CD38 항체, 항-KIR 항체, 항-CD33 항체, 항-CD137 항체, 및 항-CD74 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 실시양태에서, 추가의 요법은 방사선이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 화학요법제이다. 일부 실시양태에서, 화학요법제는 탁솔이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 항염증제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 단핵구/대식세포 동원 및/또는 조직 침윤의 과정을 억제한다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 간 성상 세포 활성화의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 작용제는 케모카인 수용체 길항제, 예를 들어 CCR2 길항제 및 CCR5 길항제이다. 일부 실시양태에서, 이러한 케모카인 수용체 길항제는 이중 특이적 길항제, 예컨대 CCR2/CCR5 길항제이다. 일부 실시양태에서, 조합 요법으로서 투여될 추가의 작용제는 성장 인자 또는 그의 조절제의 TGFβ 슈퍼패밀리의 구성원이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제는 GDF8/미오스타틴 및 GDF11의 조정제 (예를 들어, 억제제 및 활성화제)로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제는 GDF8/미오스타틴 신호전달의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 이러한 작용제는 프로/잠재성 미오스타틴 복합체에 특이적으로 결합하고 미오스타틴의 활성화를 차단하는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 프로/잠재성 미오스타틴 복합체에 특이적으로 결합하고 미오스타틴의 활성화를 차단하는 모노클로날 항체는 유리, 성숙 미오스타틴에 결합하지 않는다.

일부 실시양태에서, 추가의 요법은 세포 요법, 예컨대 CAR-T 요법 또는 CAR-NK 요법을 포함한다.

일부 실시양태에서, 추가의 요법은 암 백신이다. 펩티드-기반 암 백신을 시험한 수많은 임상 시험은 혈액 악성종양 (혈액의 암), 흑색종 (피부암), 유방암, 두경부암, 위식도암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 난소암, 및 결장직장암을 표적화하였다. 항원은 HER2, 텔로머라제 (TERT), 서바이빈 (BIRC5), 및 윌름스 종양 1 (WT1)로부터의 펩티드를 포함하였다. 여러 시험은 또한 12-15종의 별개의 펩티드의 "개인맞춤형" 혼합물을 사용하였다. 즉, 이들은 환자가 면역 반응을 나타내는 환자의 종양으로부터의 펩티드의 혼합물을 함유한다. 일부 시험은 고형 종양, 신경교종, 교모세포종, 흑색종, 및 유방암, 자궁경부암, 난소암, 결장직장암, 및 비소세포 폐암을 표적화하고, MUC1, IDO1 (인돌아민 2,3-디옥시게나제), CTAG1B, 및 2종의 VEGF 수용체, FLT1 및 KDR로부터의 항원을 포함한다. 특히, IDO1 백신은 면역 체크포인트 억제제 이필리무맙 및 BRAF (유전자) 억제제 베무라페닙과 조합되어, 흑색종을 갖는 환자에서 시험된다.

암 백신으로서 유용한 종양 항원의 비제한적 예는 NY-ESO-1, HER2, HPV16 E7 (파필로마비리다에#E7), CEA (암배아성 항원), WT1, MART-1, gp100, 티로시나제, URLC10, VEGFR1, VEGFR2, 서바이빙, MUC1 및 MUC2를 포함한다.

그러나, 이러한 암 백신에 의해 프라이밍된 활성화된 면역 세포는 부분적으로 TGFβ1-의존성 메카니즘을 통해 TME로부터 배제될 수 있다. 면역억제를 극복하기 위해, 본원에 기재된 바와 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제의 사용이 백신의 잠재력을 촉발시키기 위해 고려될 수 있다.

본원에서 고려되는 조합 요법은 유리하게는 투여되는 치료제의 보다 낮은 투여량을 이용할 수 있고, 따라서 다양한 단독요법과 연관된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 사용은 요법 (예를 들어, 표준 관리)에 불량하게 반응성이거나 반응성이지 않은 것을 보다 반응성이게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 TGFβ1의 이소형-특이적 억제제의 사용은 환자에서 여전히 등가의 임상 효능을 생성하지만 더 적거나 더 낮은 정도의 약물-관련 독성 또는 유해 사건을 생성하는 요법 (예를 들어, 표준 관리)의 감소된 투여량을 가능하게 할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에서 고려되는 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 TGFβ3 억제제와 함께 (예를 들어, 조합 요법, 부가 요법 등으로) 사용될 수 있다. 이러한 용도는 추가의 요법, 예컨대 섬유증을 치료하도록 의도되는 요법, 암 요법, 예를 들어 면역 체크포인트 억제제, 암 백신, 방사선 요법, 및/또는 화학요법을 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본원에서 고려되는 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제는 미오스타틴 (GDF8)의 선택적 억제제와 함께 (예를 들어, 조합 요법, 부가 요법 등으로) 사용될 수 있다.

조합 요법에 대해 본원에서 고려되는 실시양태 중 임의의 것에서, 본원에 개시된 항체, 예를 들어 Ab37, Ab38, Ab39, Ab40, Ab41, Ab42, Ab43, Ab44, Ab45, Ab46, Ab47, Ab48, Ab49, Ab50, Ab51 및 Ab52가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 바람직한 TGFβ1 억제제는 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 그의 유도체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 분자이다.

진단, 환자 선택, 모니터링

TGFβ1 억제 요법을 포함하는 치료 방법은 TGFβ1 적응증의 진단 및/또는 이러한 요법에 반응할 가능성이 있는 환자의 선택을 포함할 수 있다. 추가적으로, TGFβ1 억제제를 제공받는 환자는 치료의 치료 효과에 대해 모니터링될 수 있으며, 이는 전형적으로 상태를 나타내고 치료 전 및 후에 측정 (예를 들어, 검정)될 수 있는 1종 이상의 적합한 파라미터를 측정하고, 파라미터에서의 치료-관련 변화를 평가하는 것을 수반한다. 예를 들어, 이러한 파라미터는 환자로부터 수집된 생물학적 샘플에 존재하는 바이오마커의 수준을 포함할 수 있다. 바이오마커는 RNA-기반, 단백질-기반, 세포-기반 및/또는 조직-기반일 수 있다. 예를 들어, 특정 질환 상태에서 과다발현되는 유전자는 질환 또는 요법에 대한 반응을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다. 질환-연관 세포 집단의 세포-표면 단백질은 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다. 이러한 방법은 특정한 질환의 정도를 나타내는 질환 파라미터, 예컨대 종양 크기/부피의 직접 측정을 포함할 수 있다. 임의의 적합한 샘플링 방법, 예컨대 혈청/혈액 샘플, 생검 및 영상화가 사용될 수 있다. 생검은 조직 생검 (예컨대 종양) 및 액체 생검을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 액체 생검은 혈액 중 (예를 들어, 혈청 및/또는 혈장 샘플 중) 면역 세포, 예를 들어 순환 림프구, 예컨대 순환 MDSC를 측정 또는 검출하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 순환 MDSC 수준은 예측 바이오마커로서의 역할을 한다.

순환 MDSC 수준은 샘플, 예컨대 전혈 샘플 또는 혈액 성분 (예를 들어, 혈장 또는 혈청)에서 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 이전에 동결되지 않은 샘플의 신선한 전혈 또는 혈액 성분이다. 특정 실시양태에서, 순환 MDSC는 말초 혈액을 헤파린처리된 튜브 내로 채혈함으로써 수집될 수 있다. 말초 혈액으로부터, 말초 혈액 단핵 세포가 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 현탁분리, 자기 비드 분리, 또는 밀도 구배 원심분리 방법 (예를 들어, 피콜-파크(Ficoll-Paque)®)을 사용하여 단리될 수 있다. 일부 실시양태에서, MDSC는 말초 혈액 단핵 세포로부터 CD11b+ 마커 선택에 의해 (예를 들어, CD11b+ 마이크로비드 또는 항체를 사용함) 분리될 수 있다. G-MDSC 및 M-MDSC는, 예를 들어 표면 마커 발현에 기초한 유동 세포측정법/FACS 분석을 통해 CD11b+ 세포와 추가로 구별될 수 있다. 예를 들어, 인간 G-MDSC는 세포-표면 마커 CD11b, CD33, CD15 및 CD66b의 발현에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 G-MDSC는 또한 LOX-1, 아르기나제, 및/또는 낮은 수준의 HLA-DR을 발현할 수 있다. 인간 M-MDSC는 세포 표면 마커 CD11b, CD33 및 CD14, 뿐만 아니라 일부 실시양태에서 낮은 수준의 HLA-DR의 발현에 의해 확인될 수 있다. 순환 MDSC의 정량화는 총 CD45+ 세포의 백분율로서 나타내어질 수 있다.

생검이 전통적으로 다양한 질환, 예컨대 섬유증 (예를 들어, 기관 섬유증) 및 증식성 장애 (예를 들어, 암)를 진단 및 모니터링하기 위한 표준이었지만, 덜 침습성인 대안이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 많은 비-침습성 생체내 영상화 기술이 치료를 위해 환자를 진단, 모니터링, 및 선택하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자 또는 대상체에서 질환을 진단 및/또는 모니터링하기 위한 생체내 영상화 기술의 사용을 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자 또는 대상체는 본원에 기재된 바와 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 제공받고 있다. 다른 실시양태에서, 생체내 영상화 기술은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 사용한 치료를 위한 환자를 선택하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 기술은 환자가 요법, 예를 들어 TGFβ1 억제 요법에 반응하는지 또는 어떻게 반응하는지를 결정하는데 사용될 수 있다.

방법에 사용되는 예시적인 생체내 영상화 기술은 X선 방사선촬영, 자기 공명 영상화 (MRI), 의료 초음파검사 또는 초음파, 내시경검사, 탄성측정법, 촉각 영상화, 온도기록술, 의료 사진촬영을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 영상화 기술은 핵 의학 기능적 영상화, 예를 들어 양전자 방출 단층촬영 (PET) 및 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT)을 포함한다. 이들 기술을 수행하고 결과를 분석하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

암을 진단하고 모니터링하는데 통상적으로 사용되는 비-침습성 영상화 기술은 자기 공명 영상화 (MRI), 컴퓨터 단층촬영 (CT), 초음파, 양전자 방출 단층촬영 (PET), 단일-광자 방출 컴퓨터 단층촬영 (SPECT), 형광 반사 영상화 (FRI), 및 형광 매개 단층촬영 (FMT)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 하이브리드 영상화 플랫폼이 또한 암을 진단하고 모니터링하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 하이브리드 기술은 PET-CT, FMT-CT, FMT-MRI, 및 PET-MRI를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 동적 조영 증강 MRI (DCE-MRI)는 유방암을 검출하는데 통상적으로 사용되는 또 다른 영상화 기술이다. 이들 기술을 수행하고 결과를 분석하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

섬유증을 진단 및 모니터링하는데 통상적으로 사용되는 비-침습성 영상화 기술은 초음파 (예를 들어, 통상적인 또는 조영-증강 초음파), 초음파 탄성측정법 (예를 들어, 일시적 탄성측정법, 점 전단파 탄성측정법 및 2D-전단파 탄성측정법), CT 스캔 (예를 들어, 통상적인 CT 또는 CT 관류 영상화), 자기 공명 영상화 (MRI) (예를 들어, 통상적인 MRI, 자기 공명 탄성측정법, 확산 가중 자기 공명 영상화, 가독세트산 이나트륨, 및 자기 공명 관류 영상화)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, 간 섬유증 또는 간 지방증의 수준을 평가하기 위해 비-침습성 영상화 기술이 사용된다. 예를 들어, 간 섬유증을 평가하는데 특히 유용한 영상화 기술은 피브로스캔 (일시적 탄성측정법; TE), 점 전단파 탄성측정법 (pSWE; 일명 음향 방사력 임펄스 (ARFI)), 2D-3D SWE, 자기 공명 탄성측정법 (MRE), 및 다중파라미터 MRI를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 간 지방증을 평가하는데 특히 유용한 영상화 기술은 초음파검사, 제어 감쇠 파라미터 (CAP) 탄성측정법, MRI-추정 양성자 밀도 지방 분율 (MRI-PDFF), 및 자기 공명 분광분석법 (MRS)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화 기술을 사용하여 간 강성을 평가한다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화 기술은 간내 트리글리세리드 수준을 검출하고 평가하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화 기술은 간 표면 결절형성 (LSN; 일명 "간 점수"), 간 강성 및/또는 간 분절 부피 비 (LSVR)를 평가하는데 사용되며, 이들은 모두 간 섬유증의 병기결정 및 간경변증의 하위-병기결정에 유익하다. 이들 기술을 수행하고 결과를 분석하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다.

보다 최근에, 생체내 관심 세포 (예를 들어, 세포독성 T 세포, 대식세포, 및 암 세포)의 검출을 가능하게 할 비-침습성 영상화 방법이 개발되고 있다. 예를 들어, www.imaginab.com/technology/; 문헌 [Tavare et al., (2014) PNAS, 111(3): 1108-1113; Tavare et al., (2015) J Nucl Med 56(8): 1258-1264; Rashidian et al., (2017) J Exp Med 214(8): 2243-2255; Beckford Vera et al., (2018) PLoS ONE 13(3): e0193832; and Tavare et al., (2015) Cancer Res 76(1): 73-82]을 참조하며, 각각은 본원에 참조로 포함된다. 소위 "T-세포 추적"은 생체내에서 항종양 이펙터 T-세포를 검출하고 국재화하는 것을 목표로 한다. 이는 고형 종양의 면역억제성 표현형을 이해하는데 유용한 통찰을 제공할 수 있다. 세포독성 T 세포가 널리-침윤된 종양 ("염증발생" 또는 "핫" 종양)은 체크포인트 차단 요법 (CBT)과 같은 암 요법에 반응할 가능성이 있다. 다른 한편으로는, 면역억제 표현형을 갖는 종양은 항종양 면역 반응이 존재하는 경우에도 불량한 T-세포 침윤을 갖는 경향이 있다. 이들 소위 "면역 배제된" 종양은 아마도 암 요법, 예컨대 CBT에 반응하는데 실패할 것이다. T-세포 추적 기술은 이들 상이한 표현형을 밝힐 수 있고, 환자에게 유익할 가능성이 있는 치료 접근법을 안내하기 위한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, "면역 배제된" 종양을 갖는 환자는 아마도 TGFβ1 억제제 요법으로부터 이익을 얻어 면역억제성 표현형을 역전시키는 것을 도울 수 있다. 유사한 기술을 사용하여 다른 질환, 예를 들어 섬유증을 진단 및 모니터링할 수 있는 것으로 고려된다. 전형적으로, 검출 모이어티 (예를 들어, 방사성표지, 형광 등)로 조작된 항체 또는 항체-유사 분자는 환자에게 주입될 수 있고, 이는 이어서 특정한 마커 (예를 들어 CD8+ 및 M2 대식세포)의 부위에 분포 및 국재화될 것이다.

비-침습성 생체내 영상화 기술은 환자를 진단하고/거나; TGFβ1 억제제 요법으로부터 이익을 얻을 가능성이 있는 환자를 선택 또는 확인하고/거나; 치료 시 치료 반응에 대해 환자를 모니터링하는 목적에 적합한 다양한 방법에 적용될 수 있다. 공지된 세포-표면 마커를 갖는 임의의 세포는 세포 마커에 특이적으로 결합하는 항체 또는 유사한 분자를 사용함으로써 검출/국재화될 수 있다. 전형적으로, 이러한 기술의 사용에 의해 검출될 세포는 면역 세포, 예컨대 세포독성 T 림프구, 조절 T 세포, MDSC, 질환-연관 대식세포, (M2 대식세포, 예컨대 TAM 및 FAM), NK 세포, 수지상 세포, 및 호중구이다.

적합한 면역 세포 마커의 비제한적 예는, CD8, CD3, CD4, CD11b, CD163, CD206, CD68, CD14, CD15, CD66, CD34, CD25, 및 CD47을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 단핵구 마커, 대식세포 마커 (예를 들어, M1 및/또는 M2 대식세포 마커), CTL 마커, 억제 면역 세포 마커, MDSC 마커 (예를 들어, G- 및/또는 M-MDSC에 대한 마커)를 포함한다.

상기 기재된 생체내 영상화 기술은 TGFβ1-연관 질환, 예컨대 암 및 섬유증으로 진단된 환자에서 특정 MDSC를 검출, 국재화 및/또는 추적하는데 사용될 수 있다. 건강한 개체는 순환계 내에 MDSC가 없거나 낮은 빈도를 갖는다. 이러한 질환의 발병 또는 진행으로, 순환 및/또는 질환-연관 MDSC의 상승된 수준이 검출될 수 있다. 예를 들어, CCR2-양성 M-MDSC는 염증을 갖는 조직에 축적되는 것으로 보고되었고, 조직에서 섬유증 (예컨대 폐 섬유증)의 진행을 유발할 수 있으며, 이는 TGFβ1 발현과 상관관계가 있는 것으로 제시된다. 유사하게, MDSC는 다수의 고형 종양 (삼중-음성 유방암 포함)에서 풍부화되고, 부분적으로 TME의 면역억제 표현형에 기여한다. 따라서, 본 개시내용에 따른 TGFβ1 억제 요법에 대한 치료 반응은 MDSC를 국재화하거나, 추적하거나 또는 측정함으로써 모니터링될 수 있다. 검출가능한 MDSC의 감소 또는 낮은 빈도는 전형적으로 치료 이익 또는 보다 우수한 예후를 나타낸다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 TGFβ 억제제, 예를 들어, TGFβ1-선택적 억제제 (예컨대 본원에 기재된 바와 같은 선택적 프로- 또는 잠재성-TGFβ1 억제제), 이소형-비-선택적 TGFβ 억제제 (예컨대 저분자량 ALK5 길항제, TGFβ1/2/3 중 2종 이상에 결합하는 중화 항체, 예를 들어 GC1008 및 변이체, TGFβ1/3에 결합하는 항체, 리간드 트랩, 예를 들어 TGFβ1/3 억제제), 및/또는 인테그린 억제제 (및 인테그린 억제제 (예를 들어, αVβ3, αVβ5, αVβ6, αVβ8, α5β1, αIIbβ3, 또는 α8β1 인테그린에 결합하고, TGFβ 의 하류 활성화를 억제하는, 예를 들어 TGFβ1 및/또는 TGFβ3의 선택적 억제 항체)를 제공받은 환자로부터 수득된 샘플에서 (예를 들어, 환자의 혈액에서, 예를 들어, 혈청 및/또는 혈장에서) 순환 MDSC의 수준을 모니터링함으로써 섬유증을 치료하고/거나, 효능을 예측 또는 결정하고/거나, 약리학적 반응을 확인하는 방법을 제공한다. 예시적인 인테그린 억제제는 그의 개시내용이 참조로 포함되는 WO2020051333에 제공된 항-αVβ8 인테그린 항체를 포함한다. 본원에 개시된 다양한 실시양태에서, 순환 MDSC는 대상체에게 치료의 투여, 예를 들어 TGFβ 억제제의 치료 용량의 투여 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 내에, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10주 (예를 들어, 바람직하게는 6주 미만) 내에 측정될 수 있다.

많은 인간 암은 건강한 대조군과 비교하여 환자에서 상승된 수준의 MDSC를 유발하는 것으로 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Elliott et al., (2017) "Human tumor-infiltrating myeloid cells: phenotypic and functional diversity" Frontiers in Immunology, Vol. 8, Article 86]에서 검토됨). 이들 인간 암은 방광암, 결장직장암, 전립선암, 유방암, 교모세포종, 간세포성 암종, 두경부 편평 세포 암종, 폐암, 흑색종, NSCL, 난소암, 췌장암, 및 신세포 암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 상승된 수준의 MDSC는 생물학적 샘플, 예컨대 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 조직 샘플 (예를 들어, 종양 생검)에서 검출될 수 있다. 예를 들어, MDSC의 빈도 또는 수의 변화는 적합한 세포 표면 마커 (표현형)를 사용하여 총 PBMC의 퍼센트 (%), CD14+ 세포의 퍼센트 (%), CD45+ 세포의 퍼센트 (%); 단핵 세포의 퍼센트 (%), 총 세포의 퍼센트 (%), CD11b+ 세포의 퍼센트 (%), 단핵구의 퍼센트 (%), 비-림프구성 MNC의 퍼센트 (%), KLA-DR 세포의 퍼센트 (%)로서 측정될 수 있다.

추가적으로, 면역 세포 마커를 사용하여, 암의 경우에, 종양이 면역-배제된 표현형을 갖는지 결정하는 것이 가능하다. 종양이 면역-배제된 표현형을 갖는 것으로 결정된 경우에, 암 요법 (예컨대 CBT) 단독은 종양이 종양 환경 내에서 충분한 세포독성 세포가 결여되어 있기 때문에 효과적이지 않을 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 것과 같은 TGFβ1 억제제와의 부가적 요법이, 면역-억제를 감소시킴으로써 암 요법-저항성 종양이 암 요법에 보다 반응성이 되도록 할 수 있다. 면역 마커는 또한 섬유화 콘텍스트에서 면역 세포를 추적하고/거나 섬유화 조직의 면역 세포 조성을 결정하는데 (예를 들어, 대식세포 및/또는 근섬유모세포의 존재를 추적하는데) 사용될 수 있는 것으로 고려된다.

따라서, 본 발명은 또한 하기 단계: i) TGFβ1-관련 질환 또는 상태로 진단된 환자를 선택하는 단계; 및, ii) 환자에게 본원에 포괄되는 항체 또는 단편을 질환 또는 상태를 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있는, TGFβ1-관련 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)는 질환 마커 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 섬유증 또는 암 마커)의 검출을 포함하며, 여기서 임의로 검출은 생검 분석, 혈청 마커 분석, 및/또는 생체내 영상화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)는 본원에 기재된 바와 같은 생체내 영상화 기술을 포함한다.

일부 실시양태에서, TGFβ1-관련 질환 또는 상태는 섬유화 상태이다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)는 근섬유모세포, 또는 그의 1종 이상의 마커의 검출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)는 간 지방증, 간 트리글리세리드, 면역 세포, 및/또는 근섬유모세포의 검출을 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출은 생검 분석, 혈청 마커 분석, 및/또는 생체내 영상화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 초음파, 초음파 탄성측정법, CT 스캔, MRI, PET-SPECT, 광학 형광/생물발광 피브로스캔 (TE), pSWE, 2D-3D SWE, MRE, 초음파검사, CAP, MRI-PDFF, 및/또는 MRS를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 면역 세포 또는 면역 세포의 세포-표면 마커에 결합하는 항체의 직접 또는 간접 표지화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 추적자의 사용을 포함한다.

일부 실시양태에서, 생체내 영상화 기술은 간 지방증, 간 트리글리세리드, 면역 세포 (예를 들어, 하기 기재된 바와 같음), 및/또는 근섬유모세포를 측정한다. 일부 실시양태에서, 치료는 이환 조직에서 트리글리세리드, 지방증, 간 표면 결절, 염증, 및/또는 대식세포를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 선택된 환자는 간 부피의 >5.5%의 간내 트리글리세리드 함량을 갖고, 임의로 여기서 간내 트리글리세리드 함량은 간 부피의 >10%이다. 일부 실시양태에서, 치료는 간내 트리글리세리드 함량을 간 부피의 ≤ 5.5%로 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 치료는 이환 조직에서 MDSC를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 치료는 이환 조직에서 대식세포를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 유효량은 0.1 mg/kg 내지 30 mg/kg, 임의로 3 mg/kg 내지 30 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 치료 반응 (예를 들어, 감소된 트리글리세리드, 감소된 지방증, 감소된 간 표면 결절, 감소된 염증, 감소된 대식세포, 및/또는 감소된 간 점수)에 대해 대상체를 모니터링하는 것을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한 하기 단계: i) 고형 종양을 포함하는 암으로 진단된 환자를 선택하는 단계이며, 여기서 고형 종양은 면역 배제된 종양이거나 또는 면역 배제된 종양인 것으로 의심되는 것인 단계; 및 ii) 환자에게 본원에 포괄되는 항체 또는 단편을 암을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있는, 암을 치료하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 환자는 암 요법 예컨대 면역 체크포인트 억제 요법 (예를 들어, PD-(L)1 항체), 화학요법, 방사선 요법, 조작된 면역 세포 요법, 및 암 백신 요법을 받았거나, 또는 이를 받기 위한 후보이다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)는 면역 세포 또는 그의 1종 이상의 마커의 검출을 포함하며, 여기서 임의로 검출은 종양 생검 분석, 혈청 마커 분석, 및/또는 생체내 영상화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택 단계 (i)는 본원에 기재된 바와 같은 생체내 영상화 기술을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 치료 반응에 대해 모니터링하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 대상체에서 TGFβ1 억제 요법에 대한 치료 반응을 모니터링하기 위해 수행된다. 생체내 영상화는 본원에 기재된 영상화 기술 중 어느 하나를 포함할 수 있고, 본원에 기재된 마커 및/또는 파라미터 중 어느 하나를 측정할 수 있다. 예를 들어, 간 섬유증의 경우에, 치료 반응은 감소된 간 지방증, 감소된 트리글리세리드 함량, 감소된 ECM 침착/섬유증, 감소된 간경변증, 및/또는 감소된 질환 진행을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 이소형-특이적 TGFβ1 억제제를 사용한 치료는 간내 트리글리세리드 함량을 MRI에 의해 측정된 바와 같이 ≤ 5.5%의 수준으로 감소시킨다. 암의 경우에, 치료 반응은 면역 배제된 종양의 염증발생 종양으로의 전환 (이는 종양 내로의 증가된 면역 세포 침윤과 상관됨), 감소된 종양 크기, 및/또는 감소된 질환 진행을 포함할 수 있다. 증가된 면역 세포 침윤은 증가된 종양내 면역 세포 빈도 또는 검출 신호, 예컨대 방사성표지 및 형광의 정도에 의해 가시화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 환자를 진단, 선택, 치료, 또는 모니터링하는데 사용되는 생체내 영상화는 MDSC 추적, 예컨대 G-MDSC (또한 PMN-MDSC로도 공지됨) 및 M-MDSC를 포함한다. 예를 들어, MDSC는 질환 부위 (예컨대 섬유화 조직 및 고형 종양)에서 기준선에서 풍부화될 수 있다. 요법 (예를 들어, TGFβ1 억제제 요법) 시, 표지 (예컨대 방사성동위원소 및 형광)의 감소된 강도에 의해 측정된 바와 같이, 보다 적은 MDSC가 관찰될 수 있으며, 이는 치료 효과를 나타낸다.

일부 실시양태에서, 생체내 영상화는 LRRC33-양성 세포의 추적 또는 국재화를 포함한다. LRRC33-양성 세포는, 예를 들어 MDSC 및 활성화된 M2-유사 대식세포 (예를 들어, 섬유화 조직과 연관된 TAM 및 활성화된 대식세포)를 포함한다. 예를 들어, LRRC33-양성 세포는 질환 부위 (예컨대 섬유화 조직 및 고형 종양)에서 기준선에서 풍부화될 수 있다. 요법 (예를 들어, TGFβ1 억제제 요법) 시, 표지 (예컨대 방사성동위원소 및 형광)의 감소된 강도에 의해 측정된 바와 같이, 세포 표면 LRRC33을 발현하는 보다 적은 세포가 관찰될 수 있으며, 이는 치료 효과를 나타낸다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 생체내 영상화 기술은 관심 세포를 검출하기 위해 PET-SPECT, MRI 및/또는 광학 형광/생물발광의 사용을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항체-유사 분자의 검출 모이어티로의 표지화는 직접 표지화 또는 간접 표지화를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 검출 모이어티는 추적자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 추적자는 방사성동위원소일 수 있으며, 여기서 임의로 방사성동위원소는 양전자-방출 동위원소일 수 있다. 일부 실시양태에서, 방사성동위원소는 ¹⁸F, ¹¹C, ¹³N, ¹⁵O, ⁶⁸Ga, ¹⁷⁷Lu, 및 ⁸⁹Zr로 이루어진 군으로부터 선택된다.

따라서, 이러한 방법은 면역-PET에서 표지된 항체를 사용하여 생체내 영상화를 수행하는데 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 영상화 기술을 이용하는 진단, 환자 선택, 및/또는 치료 효과의 모니터링 단계를 포함하는, 대상체에서 TGFβ1 적응증을 치료하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 고친화도, 이소형-선택적 TGFβ1 억제제는 TGFβ1 적응증의 치료에 사용되며, 여기서 치료는 적응증을 치료하기 위한 유효량의 TGFβ1 억제제의 투여를 포함하고, 추가로 생체내 영상화에 의해 대상체에서 치료 효과를 모니터링하는 단계를 포함한다. 임의로, 대상체는 생체내 영상화를 포함하는 진단 또는 선택 단계를 사용하여 TGFβ1 억제제 요법을 제공받기 위한 후보로서 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 적응증은 증식성 장애 (예컨대 고형 종양을 갖는 암 및 골수섬유증)이다. 일부 실시양태에서, TGFβ1 적응증은 섬유화 장애 (예컨대 기관 섬유증)이다.

순환/순환성 잠재성-TGFβ

본 개시내용에 따르면, 순환 잠재성 TGFβ는 표적 결속 바이오마커로서의 역할을 할 수 있다. 활성화 억제제가 치료 후보로서 선택되는 경우에, 예를 들어, 이러한 바이오마커는 투여 전 및 후에 순환 잠재성 TGFβ의 수준을 모니터링함으로써 생체내 표적 결속을 평가 또는 확인하는데 사용될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 본 개시내용은 TGFβ 억제제를 제공받는 환자로부터 수득된 샘플에서 (예를 들어, 환자의 혈액, 예를 들어, 혈장 및/또는 혈청에서) 순환 잠재성 TGFβ (예를 들어, TGFβ1)의 수준을 모니터링하는 것을 포함하는, TGFβ-관련 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 순환 잠재성 TGFβ의 수준은 단독으로 또는 본원에 개시된 바이오마커 중 1종 이상 (예를 들어, MDSC)과 함께 모니터링될 수 있다. 특정 실시양태에서, TGFβ 억제제는 단독으로 또는 추가의 요법과 함께 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 치료는 섬유화 장애 (예를 들어, 기관 섬유증)를 앓고 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 본원에 기재된 TGFβ1-선택적 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 이소형-비-선택적 TGFβ 억제제 (예컨대 저분자량 ALK5 길항제, TGFβ1/2/3 중 2종 이상에 결합하는 중화 항체, 예를 들어 GC1008 및 변이체, TGFβ1/3에 결합하는 항체, 및 리간드 트랩, 예를 들어 TGFβ1/3 억제제)이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 인테그린 억제제 (예를 들어, αVβ3, αVβ5, αVβ6, αVβ8, α5β1, αIIbβ3, 또는 α8β1 인테그린에 결합하고, TGFβ의 하류 활성화를 억제하는, 예를 들어 TGFβ1 및/또는 TGFβ3의 선택적 억제 항체)이다.

다양한 실시양태에서, 순환 잠재성 TGFβ (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)는 대상체로부터 수득된 샘플 (예를 들어, 전혈 또는 혈액 성분)에서 측정될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 순환 잠재성 TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)은 대상체에게 TGFβ 억제제를 투여한 후 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 21, 25, 28, 30, 35, 40, 45, 48, 50, 또는 56일 내에, 예를 들어, 치료 용량의 TGFβ 억제제를 투여한 후 최대 7일 내에 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 순환 잠재성 TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법 (예를 들어, ELISA)에 의해 측정될 수 있다.

다양한 실시양태에서, 섬유화 장애 또는 다른 TGF-관련 장애를 치료하는 방법은 TGFβ 억제제 (예를 들어, 항-TGFβ1 항체, 예를 들어 TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제, 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체)를 섬유화 장애 또는 다른 TGF-관련 장애의 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하고, 억제제에 의한 표적 결속의 수준을 확인하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 결속의 수준을 결정하는 것은 TGFβ 억제제를 제공받는 환자로부터 수득된 샘플에서 (예를 들어, 환자의 혈액 또는 혈액 성분에서) 순환 잠재성 TGFβ (예를 들어, TGFβ1)의 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, TGF 억제제의 투여 후 순환 잠재성 TGFβ (예를 들어, TGFβ1)의 증가는 표적 결속을 나타낸다. 일부 실시양태에서, TGF 억제제의 투여 후 순환 잠재성 TGFβ (예를 들어, TGFβ1)의 적어도 2-배, 적어도 3-배, 적어도 4-배, 적어도 5-배, 적어도 6-배, 적어도 7-배, 적어도 8-배, 적어도 9-배, 적어도 10-배, 또는 그 초과의 증가는 표적 결속을 나타낸다. 다양한 실시양태에서, 본 개시내용은 또한 순환 잠재성 TGFβ 수준 (예를 들어, TGFβ1 수준)을 예측 바이오마커로서 사용하는, 즉, 치료 반응을 예측하는 방법, 뿐만 아니라 추가의 치료 결정 (예를 들어, 증가가 관찰되는 경우에 치료를 계속하는 것에 의함)을 통지하는 방법을 제공한다.

본 개시내용의 한 측면에서, 순환 잠재성 TGFβ의 수준은 TGFβ 억제제 예컨대 본원에 기재된 TGFβ1-선택적 억제제 (예를 들어, Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체)가 투여된 대상체에서 치료를 통지하고 치료 효능을 예측하기 위해 결정된다. 특정 실시양태에서, TGFβ 억제제 (예를 들어, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체)는 투여되는 TGFβ1 억제의 양이 기준선 순환 잠재성-TGFβ 수준과 비교하여 순환 잠재성-TGFβ (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)의 수준을 증가시키기에 충분하도록, 단독으로 또는 추가의 요법과 공동으로 (예를 들어, 동시에), 개별적으로, 또는 순차적으로 투여된다. 순환 잠재성-TGFβ 수준은 각각의 치료 전 또는 후에 측정될 수 있으며, 치료 후 순환 잠재성-TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 예를 들어, 순환 잠재성-TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)은 TGFβ 억제제의 투여 전 및 후에 측정될 수 있고, 치료 후의 순환 잠재성-TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)의 증가는 치료 효능을 예측케 한다. 일부 실시양태에서, 치료는 증가가 검출되는 경우에 계속된다. 특정 실시양태에서, 순환 잠재성-TGFβ 수준은 TGFβ 억제제 예컨대 본원에 기재된 TGFβ1 억제제 (예를 들어, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체)의 제1 용량의 투여 전 및 후에 측정될 수 있고, 투여 후 순환 잠재성-TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)의 증가는 치료 효능을 예측케 하고, 추가로 TGFβ 억제제의 제2 또는 그 초과의 용량(들)의 투여를 정당화한다. 일부 실시양태에서, 순환 잠재성-TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)은 TGFβ 억제제 예컨대 TGFβ1-선택적 억제제 (예를 들어, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체), 및 공동으로 (예를 들어, 동시에), 개별적으로, 또는 순차적으로 투여되는 추가의 요법의 조합 치료 전 및 후에 측정될 수 있고, 치료 후의 순환 잠재성-TGFβ 수준의 변화는 치료 효능을 예측케 한다. 일부 실시양태에서, 치료는 증가가 검출되는 경우에 계속된다. 일부 실시양태에서, 조합 치료 후의 순환 잠재성-TGFβ 수준의 증가는 치료의 계속을 정당화할 수 있다.

다양한 실시양태에서, 본 개시내용은 TGFβ-관련 장애를 갖는 대상체에게 치료 유효량의 TGFβ 억제제 (예를 들어, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제, 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체)를 투여하는 것을 포함하는, TGFβ-관련 장애, 예를 들어 섬유화 장애를 치료하는 방법을 포괄하며, 여기서 치료 유효량은 순환 잠재성 TGFβ (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)의 수준을 증가시키기에 충분한 양이다. 특정 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ 활성화 억제제이다. 특정 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ1 억제제이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체이다. 특정 실시양태에서, 순환 잠재성 TGFβ는 잠재성 TGFβ1이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제 (예를 들어, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체)의 치료 유효량은 용량당 0.1-30 mg/kg이다. 일부 실시양태에서, TGFβ 억제제는 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 매월, 6주마다, 8주마다, 격월, 10주마다, 12주마다, 3개월마다, 4개월마다, 6개월마다, 8개월마다, 10개월마다, 또는 1년에 1회 투여된다.

다양한 실시양태에서, 순환 잠재성 TGFβ (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)는 대상체로부터 수득된 샘플 (예를 들어, 전혈 또는 혈액 성분)에서 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 순환 잠재성 TGFβ1은 산 처리 후에 총 유리 TGFβ1을 측정하는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA)을 사용하여 측정될 수 있다. TGF-β1 ELISA에 의한 잠재성 TGF-β1의 분석은 먼저, 예를 들어 샘플의 산성화에 의해, 잠재성 복합체로부터 TGF-β1의 해리를 필요로 한다. 이어서, ELISA는, 순환 TGFβ1의 단지 작은 분획인 것으로 공지되어 있는, 산성화 전에 존재하는 임의의 유리 TGF-β1에 더하여, 해리된 잠재성 TGF-β1에 등가인 총 TGF-β1을 측정한다. 특정 실시양태에서, TGFβ 억제제의 투여 후의 순환 잠재성 TGFβ (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)의 수준은 투여 전의 순환 잠재성 TGFβ 수준과 비교하여 적어도 2-배 (예를 들어, 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배 및 10-배)만큼 증가된다.

특정 실시양태에서, 순환 총 TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 및 성숙 TGFβ1)은 TGFβ 억제제 요법 (예를 들어, TGFβ1의 이소형-선택적 활성화 억제제 예컨대 Ab2, Ab42, Ab46, Ab50, 또는 그의 유도체)을 제공받는 대상체에서 TGFβ 억제제의 표적 결속 및 약리학적 활성을 모니터링하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 순환 총 TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 및 성숙 TGFβ1 수준)은 TGFβ 억제제의 제1 용량의 투여 전 및 후에 측정될 수 있으며, 투여 후 순환 TGFβ 수준의 적어도 2-배 (예를 들어 적어도 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 6-배, 7-배, 8-배, 9-배, 10-배, 또는 그 초과)의 증가는 표적 결속 (예를 들어, 인간 대형 잠재성 프로TGFb1 복합체에 대한 TGFβ 억제제의 결합)을 나타낸다. 특정 실시양태에서, 순환 잠재성 TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)은 TGFβ 억제제의 제1 용량의 투여 전 및 후에 측정될 수 있으며, 투여 후 순환 잠재성 TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)의 증가는 치료 효능을 나타낸다. 특정 실시양태에서, TGFβ 억제제의 투여 후 순환 잠재성-TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)의 증가가 검출되는 경우에 치료는 계속된다. 일부 실시양태에서, 혈액 샘플 (예를 들어, 혈청) 중 총 TGFβ1은 잠재성 및 성숙 형태 둘 다를 포함하며, 전자는 대다수의 순환 TGFβ1을 나타낸다. 샘플의 산 처리는 잠재성 복합체로부터 성숙 성장 인자를 방출한다. 이어서, 널리 공지된 검정, 예컨대 ELISA를 사용하여 유리 TGFβ1의 양을 측정할 수 있다. 대안적으로, 시약 예컨대 잠재성 형태의 TGFβ1에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 순환 잠재성 TGFβ1을 특이적으로 측정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 순환 잠재성-TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)은 TGFβ 억제제의 제1 용량의 투여 전 및 후에 측정될 수 있고, 투여 후 순환 잠재성-TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 TGFβ1)의 증가는 표적 결속 및/또는 치료 반응을 나타내고/거나, 추가로 TGFβ 억제제의 제2 또는 그 초과의 용량(들)의 투여를 정당화한다. 또 다른 실시양태에서, 순환 잠재성-TGFβ 수준은 TGFβ 억제제 예컨대 TGFβ1-선택적 억제제의 제1 용량의 투여 전 및 후에 측정될 수 있고, 투여 후 순환 잠재성-TGFβ 수준의 증가는 표적 결속 및/또는 치료 반응을 나타내고/거나, 추가로 치료의 계속을 정당화한다. 다양한 실시양태에서, TGFβ 억제제 예컨대 TGFβ1-선택적 억제제, 이소형-비-선택적 억제제 (예를 들어, 저분자량 ALK5 길항제), TGFβ1/2/3 중 2종 이상에 결합하는 중화 항체 (예를 들어, GC1008 및 변이체), TGFβ1/3에 결합하는 항체, 및/또는 인테그린 억제제 (예를 들어, αVβ3, αVβ5, αVβ6, αVβ8, α5β1, αIIbβ3, 또는 α8β1 인테그린에 결합하고, TGFβ의 하류 활성화를 억제하는, 예를 들어 TGFβ1 및/또는 TGFβ3의 선택적 억제 항체)이다.

일부 실시양태에서, 혈액의 혈청으로의 프로세싱은 혈소판을 활성화시키고, 잠재성 TGFβ1의 대형 풀의 방출로 이어지며, 이는 측정을 혼동시킨다. 따라서, 일부 실시양태에 따르면, 혈청 대신 혈장에서 TGFβ1의 순환 수준을 측정하는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 순환 TGFβ (예를 들어, 순환 잠재성-TGFβ 수준 (예를 들어, 잠재성 TGFβ1))는 대상체로부터 수집된 혈장 샘플에서 측정된다.

다양한 변형 및 변이체

본 개시내용에 의해 포괄되는 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 비제한적 변경, 변형, 및 특색이 하기에 간략하게 논의된다. 관련 분석 방법의 실시양태가 또한 제공된다.

자연 발생 항체 구조 단위는 전형적으로 사량체를 포함한다. 각각의 이러한 사량체는 전형적으로 2개의 동일한 쌍의 폴리펩티드 쇄로 구성되며, 각각의 쌍은 1개의 전장 "경쇄" (특정 실시양태에서, 약 25 kDa) 및 1개의 전장 "중쇄" (특정 실시양태에서, 약 50-70kDa)를 갖는다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 전형적으로 항원 인식을 담당하는, 약 100 내지 110개 또는 그 초과의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카르복시-말단 부분은 전형적으로 이펙터 기능을 담당할 수 있는 불변 영역을 규정한다. 인간 항체 경쇄는 전형적으로 카파 및 람다 경쇄로 분류된다. 중쇄는 전형적으로 뮤, 델타, 감마, 알파, 또는 엡실론으로 분류되고, 이는 항체의 이소형을 규정한다. 항체는 임의의 유형 (예를 들어, IgM, IgD, IgG, IgA, IgY, 및 IgE) 및 부류 (예를 들어, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgM₁, IgM₂, IgA₁, 및 IgA₂)의 것일 수 있다. 전장 경쇄 및 중쇄 내에서, 전형적으로 가변 및 불변 영역은 약 12개 이상의 아미노산의 "J" 영역에 의해 연결되고, 중쇄는 또한 약 10개 이상의 아미노산의 "D" 영역을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2^nd ed. Raven Press, N.Y. (1989))] 참조 (그 전문은 참조로 포함됨)). 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 전형적으로 항원-결합 부위를 형성한다.

일부 실시양태에서, 2개의 아미노산 서열의 "퍼센트 동일성"은 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 변형된 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)에 혼입된다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 점수=50, 워드 길이=3으로 수행하여 관심 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 2개의 서열 사이에 갭이 존재하는 경우에, 갭드 BLAST가 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다.

본원에 기재된 임의의 항체 또는 항원-결합 단편에서, 1개 이상의 보존적 돌연변이는 잔기가 항체-항원 상호작용에 수반될 가능성이 없는 위치에서 CDR 또는 프레임워크 서열 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 보존적 돌연변이(들)는 결정 구조에 기초하여 결정된 바와 같이 잔기가 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체, 및 LRRC33-TGFβ1 복합체와의 상호작용에 수반될 가능성이 없는 위치(들)에서 CDR 또는 프레임워크 서열 내로 도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가능성 있는 계면 (예를 들어, 항원-항체 상호작용에 수반되는 잔기)은 구조적 유사성을 공유하는 또 다른 항원에 대해 공지된 구조적 정보로부터 추론될 수 있다.

본원에 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질의 상대 전하 또는 크기 특징을 변경시키지 않는 아미노산 치환을 지칭한다. 변이체는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 폴리펩티드 서열을 변경시키는 방법에 따라 제조될 수 있으며, 예컨대 이는 이러한 방법을 컴파일링한 참고문헌, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, 또는 Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York]에서 발견된다. 아미노산의 보존적 치환은 하기 군 내의 아미노산: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D 중에서 이루어진 치환을 포함한다.

가변 영역은 전형적으로 상보성 결정 영역 또는 CDR로도 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된 비교적 보존된 프레임워크 영역 (FR)의 동일한 일반적 구조를 나타낸다. 각각의 쌍의 2개의 쇄로부터의 CDR은 전형적으로 프레임워크 영역에 의해 정렬되며, 이는 특이적 에피토프에 대한 결합을 가능하게 할 수 있다. N-말단에서 C-말단으로, 경쇄 및 중쇄 가변 영역 둘 다는 전형적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4를 포함한다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 배정은 전형적으로 문헌 [Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)), 또는 Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., (1989) Nature 342: 878-883]의 정의에 따른다. 경쇄의 CDR은 또한 L-CDR1, L-CDR2, 및 L-CDR3으로 지칭될 수 있고, 중쇄의 CDR은 또한 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3으로 지칭될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 중쇄(들)의 카르복시 말단으로부터 소수의 아미노산 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 중쇄의 카르복시 말단에서 1-5개의 아미노산 결실을 갖는 중쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, CDR의 명확한 묘사 및 항체의 결합 부위를 포함하는 잔기의 확인은 항체의 구조를 해석하고/거나 항체-리간드 복합체의 구조를 해석함으로써 달성된다. 특정 실시양태에서, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 기술 중 임의의 것, 예컨대 X선 결정학에 의해 달성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 다양한 분석 방법을 이용하여 CDR 영역을 확인하거나 근사화할 수 있다. 이러한 방법의 예는 카바트 정의, 코티아 정의, AbM 정의, 및 접촉 정의를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

"친화도 성숙" 항체는 그의 1개 이상의 CDR에서 1개 이상의 변경을 갖는 항체이며, 이는 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시킨다. 예시적인 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 관련 기술분야에 공지된 절차에 의해 생산된다. 문헌 [Marks et al., (1992) Bio/Technology 10: 779-783]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 기재한다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas, et al., (1994) Proc Nat. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813; Schier et al., (1995) Gene 169: 147- 155; Yelton et al., (1995) J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., (1995) J. Immunol. 154(7): 3310-9; 및 Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226: 889-896]에 기재되어 있고; 활성 증진 아미노산 잔기를 갖는 선택적 돌연변이유발 위치, 접촉 또는 과다돌연변이 위치에서의 선택적 돌연변이는 미국 특허 번호 6,914,128에 기재되어 있다.

용어 "CDR-그라프트된 항체"는 하나의 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL의 CDR 영역 중 1개 이상의 서열이 또 다른 종의 CDR 서열로 대체된 항체, 예컨대 뮤린 CDR 중 1개 이상 (예를 들어, CDR3)이 인간 CDR 서열로 대체된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다.

용어 "키메라 항체"는 하나의 종으로부터의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열 및 또 다른 종으로부터의 불변 영역 서열을 포함하는 항체, 예컨대 인간 불변 영역에 연결된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "프레임워크" 또는 "프레임워크 서열"은 CDR을 제외한 가변 영역의 나머지 서열을 지칭한다. CDR 서열의 정확한 정의는 상이한 시스템에 의해 결정될 수 있기 때문에, 프레임워크 서열의 의미는 상응하게 상이한 해석에 적용된다. 6개의 CDR (경쇄의 L-CDR1, L-CDR2, 및 L-CDR3 및 중쇄의 H-CDR1, H-CDR2, 및 H-CDR3)은 또한 경쇄 및 중쇄 상의 프레임워크 영역을 각각의 쇄 상에서 4개의 하위-영역 (FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 나누고, 여기서 CDR1은 FR1과 FR2 사이에, CDR2는 FR2와 FR3 사이에, CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치한다. 특정한 하위-영역을 FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 명시하지 않고, 다른 것으로 지칭되는 프레임워크 영역은 단일 자연 발생 이뮤노글로불린 쇄의 가변 영역 내의 조합된 FR을 나타낸다. 본원에 사용된 FR은 4개의 하위-영역 중 1개를 나타내고, FR은 프레임워크 영역을 구성하는 4개의 하위-영역 중 2개 이상을 나타낸다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 IgM 불변 도메인, 인간 IgG 불변 도메인, 인간 IgG1 불변 도메인, 인간 IgG2 불변 도메인, 인간 IgG2A 불변 도메인, 인간 IgG2B 불변 도메인, 인간 IgG2 불변 도메인, 인간 IgG3 불변 도메인, 인간 IgG3 불변 도메인, 인간 IgG4 불변 도메인, 인간 IgA 불변 도메인, 인간 IgA1 불변 도메인, 인간 IgA2 불변 도메인, 인간 IgD 불변 도메인, 또는 인간 IgE 불변 도메인의 중쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 IgG1 불변 도메인 또는 인간 IgG4 불변 도메인의 중쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 IgG4 불변 도메인의 중쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 IgG1-유사 힌지를 생산하고 쇄간 디술피드 결합의 형성을 허용하는 Ser에서 Pro로의 백본 치환을 갖는 인간 IgG4 불변 도메인의 중쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체에 바람직한 특성을 부여하는 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 천연 IgG4 mAb에서 발생하는 것으로 공지된 Fab-아암 교환으로 인한 잠재적 합병증을 피하기 위해, 본원에 제공된 항체는 세린 228 (EU 넘버링; 잔기 241 카바트 넘버링)이 프롤린으로 전환되어 IgG1-유사 (CPPCP (서열식별번호: 54)) 힌지 서열을 생성하는 안정화 'Adair' 돌연변이를 포함할 수 있다 (Angal et al., "A single amino acid substitution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibody," Mol Immunol 30, 105-108; 1993). 따라서, 항체 중 임의의 것은 안정화 'Adair' 돌연변이 또는 아미노산 서열 CPPCP (서열식별번호: 54)를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 인간 Ig 람다 불변 도메인 또는 인간 Ig 카파 불변 도메인을 포함하는 경쇄 이뮤노글로불린 불변 도메인을 추가로 포함한다.

일부 실시양태에서, 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄인 4개의 폴리펩티드 쇄를 갖는 IgG이다.

일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체, 디아바디, 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 배선 아미노산 서열을 갖는 프레임워크를 포함한다.

일부 실시양태에서, 항원-결합 부분은 Fab 단편, F(ab')2 단편, scFab 단편, 또는 scFv 단편이다.

본원에 사용된 용어 "배선 항체 유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정한 이뮤노글로불린의 발현을 위한 유전자 재배열 및 돌연변이로 이어지는 성숙 과정을 거치지 않은 비-림프성 세포에 의해 코딩된 이뮤노글로불린 서열을 지칭한다 (예를 들어, 문헌 [Shapiro et al., (2002) Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200; Marchalonis et al., (2001) Adv. Exp. Med. Biol. 484: 13-30] 참조). 본 개시내용의 다양한 실시양태에 의해 제공되는 이점 중 하나는 배선 항체 유전자가 성숙 항체 유전자보다 종에서 개체의 특징인 필수 아미노산 서열 구조를 보존할 가능성이 더 크며, 따라서 그러한 종에서 치료적으로 사용되는 경우에 외래 공급원으로 인식될 가능성이 더 적다는 인식으로부터 유래한다.

본원에 사용된 용어 "중화"는 결합 단백질이 항원에 특이적으로 결합하는 경우에 항원의 생물학적 활성을 상쇄시키는 것을 지칭한다. 한 실시양태에서, 중화 결합 단백질은 항원/표적, 예를 들어, 시토카인, 키나제, 성장 인자, 세포 표면 단백질, 가용성 단백질, 포스파타제, 또는 수용체 리간드에 결합하고, 그의 생물학적 활성을 적어도 약 20%, 40%, 60%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 초과만큼 감소시킨다.

본원에 사용된 용어 "결합 단백질"은 항체 또는 그의 항원-결합 부분, DVD-IgTM, TVD-Ig, RAb-Ig, 이중특이적 항체 및 이중 특이적 항체를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 항원 (예를 들어, TGFβ1)에 특이적으로 결합하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다.

용어 "모노클로날 항체" 또는 "mAb"는, 이를 포함하는 조성물과 관련하여 사용되는 경우에, 실질적으로 동종인 항체의 집단, 즉 집단을 구성하는 개별 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 집단으로부터 수득된 항체 제제를 지칭할 수 있다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이고, 단일 항원에 대해 지시된다. 또한, 전형적으로 상이한 결정기 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 달리, 각각의 mAb는 항원 상의 단일 결정기에 대해 지시된다. 수식어 "모노클로날"은 임의의 특정한 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다.

본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예컨대 숙주 세포 내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현된 항체 (하기 섹션 II C에 추가로 기재됨), 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 (문헌 [Hoogenboom, H.R. (1997) TIB Tech. 15: 62-70; Azzazy, H. and Highsmith, W.E. (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo, J.V. and Larrick, J.W. (2002) BioTechniques 29: 128-145; Hoogenboom, H. and Chames, P. (2000) Immunol. Today 21: 371-378], 본원에 참조로 포함됨), 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉인 동물 (예를 들어, 마우스)로부터 단리된 항체 (문헌 [Taylor, L. D. et al., (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295; Kellermann, S-A. and Green, L.L. (2002) Cur. Opin. In Biotechnol. 13: 593-597; Little, M. et al., (2000) Immunol. Today 21: 364-370] 참조), 또는 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 특정 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관내 돌연변이유발 (또는, 인간 Ig 서열에 대해 트랜스제닉인 동물이 사용되는 경우에, 생체내 체세포 돌연변이유발)에 적용되고, 따라서 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 이와 관련되지만, 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.

일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 항체 단편, 예를 들어 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 단일-쇄 Fv (scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 또는 (vii) 항체의 초가변 영역 (예를 들어, 단리된 상보성 결정 영역 (CDR))을 모방하는 아미노산 잔기로 이루어진 최소 인식 단위이다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원-결합 부분은 (i) "이중 가변 도메인 이뮤노글로불린" 또는 "DVD-IgTM", (ii) "삼중 가변 도메인 이뮤노글로불린" 또는 "TVD-Ig", (iii) "수용체-항체 이뮤노글로불린" 또는 "RAb-Ig", (iv) "이중특이적 항체", 또는 (v) "이중-특이적 항체"이다.

본원에 사용된 "이중 가변 도메인 이뮤노글로불린" 또는 "DVD-IgTM" 등은 쌍형성된 중쇄 DVD 폴리펩티드 및 경쇄 DVD 폴리펩티드를 포함하며, 각각의 쌍형성된 중쇄 및 경쇄가 2개의 항원-결합 부위를 제공하는 결합 단백질을 포함한다. 각각의 결합 부위는 항원-결합 부위당 항원-결합에 수반되는 총 6개의 CDR을 포함한다. DVD-IgTM은 전형적으로 적어도 부분적으로 CH3 도메인의 이량체화에 의해 서로 결합된 2개의 아암을 갖고, DVD의 각각의 아암은 이중특이적이어서, 4개의 결합 부위를 갖는 이뮤노글로불린을 제공한다. DVD-IgTM은 미국 특허 공개 번호 2010/0260668 및 미국 특허 번호 9,109,026에 제공되며, 이들 각각은 서열 목록을 포함하여 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용된 "삼중 가변 도메인 이뮤노글로불린" 또는 "TVD-Ig" 등은 쌍형성된 중쇄 TVD 결합 단백질 폴리펩티드 및 경쇄 TVD 결합 단백질 폴리펩티드를 포함하며, 각각의 쌍형성된 중쇄 및 경쇄가 3개의 항원-결합 부위를 제공하는 결합 단백질이다. 각각의 결합 부위는 항원-결합 부위당 항원-결합에 수반되는 총 6개의 CDR을 포함한다. TVD 결합 단백질은 적어도 부분적으로 CH3 도메인의 이량체화에 의해 서로 결합된 2개의 아암을 가질 수 있고, TVD 결합 단백질의 각각의 아암은 삼중특이적이어서, 6개의 결합 부위를 갖는 결합 단백질을 제공한다.

본원에 사용된 "수용체-항체 이뮤노글로불린" 또는 "RAb-Ig" 등은 함께 총 3개의 항원-결합 부위를 형성하는 중쇄 RAb 폴리펩티드 및 경쇄 RAb 폴리펩티드를 포함하는 결합 단백질이다. 1개의 항원-결합 부위는 각각의 중쇄 RAb 폴리펩티드 및 경쇄 RAb 폴리펩티드에 존재하는 중쇄 및 경쇄 항체 가변 도메인의 쌍형성에 의해 형성되어, 제1 항원-결합 부위를 제공하는 총 6개의 CDR을 갖는 단일 결합 부위를 형성한다. 각각의 중쇄 RAb 폴리펩티드 및 경쇄 RAb 폴리펩티드는 제2 및 제3 "항원" 결합 부위를 제공하는 리간드에 독립적으로 결합하는 수용체 서열을 포함한다. RAb-Ig는 전형적으로 적어도 부분적으로 CH3 도메인의 이량체화에 의해 서로 결합된 2개의 아암을 갖고, RAb-Ig의 각각의 아암은 삼중특이적이어서, 6개의 결합 부위를 갖는 이뮤노글로불린을 제공한다. RAb-Ig는 미국 특허 출원 공개 번호 2002/0127231에 기재되어 있으며, 서열 목록을 포함한 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

본원에 사용되고, "이중특이적 절반-Ig 결합 단백질" 또는 "이중특이적 (절반-Ig) 결합 단백질"과 구별되는 용어 "이중특이적 항체"는 쿼드로마 기술 (문헌 [Milstein, C. and Cuello, A.C. (1983) Nature 305(5934): p. 537-540] 참조)에 의해, 2종의 상이한 모노클로날 항체의 화학적 접합 (문헌 [Staerz, U.D. et al., (1985) Nature 314(6012): 628-631] 참조)에 의해, 또는 CH3-CH3 이량체화를 억제하지 않는 Fc 영역에 돌연변이를 도입하여 오직 1종만이 기능적 이중특이적 항체인 다중 상이한 이뮤노글로불린 종을 생성하는 노브-인투-홀 또는 유사한 접근법 (문헌 [Holliger, P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90(14): 6444-6448] 참조)에 의해 생성된 전장 항체를 지칭한다. 분자 기능에 의해, 이중특이적 항체는 그의 2개의 결합 아암 (한 쌍의 HC/LC) 중 1개 상의 1종의 항원 (또는 에피토프)에 결합하고, 그의 제2 아암 (상이한 쌍의 HC/LC) 상의 상이한 항원 (또는 에피토프)에 결합한다. 이러한 정의에 의해, 이중특이적 항체는 (특이성 및 CDR 서열 둘 다에서) 2개의 별개의 항원-결합 아암을 갖고, 그것이 결합하는 각각의 항원에 대해 1가이다.

본원에 사용되고 이중특이적 절반-Ig 결합 단백질 또는 이중특이적 결합 단백질과 구별되는 용어 "이중-특이적 항체"는 각각의 그의 2개의 결합 아암 (한 쌍의 HC/LC)에서 2종의 상이한 항원 (또는 에피토프)에 결합할 수 있는 전장 항체를 지칭한다 (PCT 공개 번호 WO 02/02773 참조). 따라서, 이중-특이적 결합 단백질은 동일한 특이성 및 동일한 CDR 서열을 갖는 2개의 동일한 항원-결합 아암을 갖고, 그것이 결합하는 각각의 항원에 대해 2가이다.

본원에 사용된 용어 "K온"은, 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 항체/항원 복합체를 형성하기 위한 항원에 대한 결합 단백질 (예를 들어, 항체)의 회합에 대한 온 레이트 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. "K온"은 또한 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "회합률 상수" 또는 "ka"로도 공지되어 있다. 항체의 그의 표적 항원에 대한 결합률 또는 항체와 항원 사이의 복합체 형성률을 나타내는 이러한 값은 또한 식: 항체 ("Ab") + 항원 ("Ag")→Ab-Ag에 의해 제시된다.

본원에 사용된 용어 "K오프"는, 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 항체/항원 복합체로부터의 결합 단백질 (예를 들어, 항체)의 해리에 대한 오프 레이트 상수를 지칭하는 것으로 의도된다. "K오프"는 또한 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "해리율 상수" 또는 "kdis"로 공지되어 있다. 이러한 값은 하기 방정식에 의해 제시된 바와 같이, 항체의 그의 표적 항원으로부터의 해리율 또는 시간 경과에 따른 Ab-Ag 복합체의 유리 항체 및 항원으로의 분리를 나타낸다: Ab + Ag←Ab-Ag.

본원에서 상호교환가능하게 사용되는 용어 "평형 해리 상수" 또는 "KD"는 평형 시 적정 측정에서, 또는 해리율 상수 (k오프)를 회합률 상수 (k온)로 나눔으로써 수득된 값을 지칭한다. 회합률 상수, 해리율 상수, 및 평형 해리 상수는 항원에 대한 결합 단백질, 예를 들어 항체의 결합 친화도를 나타내는데 사용된다. 회합률 및 해리율 상수를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 형광-기반 기술을 사용하는 것은 평형 시 생리학적 완충제 중에서 샘플을 검사하기 위한 높은 민감도 및 능력을 제공한다. 다른 실험적 접근법 및 기기, 예컨대 비아코어® (생체분자 상호작용 분석) 검정이 사용될 수 있다 (예를 들어, 스웨덴 웁살라 소재의 지이 헬스케어 캄파니(GE Healthcare company), 비아코어 인터내셔널 아베(BIAcore International AB)에서 입수가능한 기기). 추가적으로, 사피다인 인스트루먼츠(Sapidyne Instruments) (아이다호주 보이스)로부터 입수가능한 키넥사(KinExA)® (동역학적 배제 검정) 검정이 또한 사용될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "결정" 및 "결정화된"은 결정의 형태로 존재하는 결합 단백질 (예를 들어, 항체) 또는 그의 항원-결합 부분을 지칭한다. 결정은 물질의 고체 상태의 한 형태이며, 무정형 고체 상태 또는 액정질 상태와 같은 다른 형태와 구분된다. 결정은 원자, 이온, 분자 (예를 들어, 단백질, 예컨대 항체) 또는 분자 어셈블리 (예를 들어, 항원/항체 복합체)의 규칙적이고 반복되는 3차원 어레이로 구성된다. 이들 3차원 어레이는 관련 기술분야에서 널리 이해되는 특정 수학적 관계에 따라 배열된다. 결정에서 반복되는 기본 단위 또는 빌딩 블록은 비대칭 단위로 불린다. 주어진, 널리 규정된 결정학적 대칭에 부합하는 배열에서의 비대칭 단위의 반복은 결정의 "단위 셀"을 제공한다. 모든 3차원에서의 규칙적 번역에 의한 단위 셀의 반복은 결정을 제공한다. 문헌 [Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 201-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999)]을 참조한다.

용어 "링커"는 펩티드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하며 1개 이상의 항원-결합 부분을 연결하는데 사용되는 폴리펩티드를 나타내기 위해 사용된다. 이러한 링커 폴리펩티드는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Holliger, P. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J. et al., (1994) Structure 2:1121-1123] 참조). 예시적인 링커는 ASTKGPSVFPLAP (서열식별번호: 55), ASTKGP (서열식별번호: 56); TVAAPSVFIFPP (서열식별번호: 57); TVAAP (서열식별번호: 58); AKTTPKLEEGEFSEAR (서열식별번호: 59); AKTTPKLEEGEFSEARV (서열식별번호: 60); AKTTPKLGG (서열식별번호: 61); SAKTTPKLGG (서열식별번호: 62); SAKTTP (서열식별번호: 63); RADAAP (서열식별번호: 64); RADAAPTVS (서열식별번호: 65); RADAAAAGGPGS (서열식별번호: 66); RADAAAA(G4S)4 (서열식별번호: 67); SAKTTPKLEEGEFSEARV (서열식별번호: 68); ADAAP (서열식별번호: 69); ADAAPTVSIFPP (서열식별번호: 70); QPKAAP (서열식별번호: 71); QPKAAPSVTLFPP (서열식별번호: 72); AKTTPP (서열식별번호: 73); AKTTPPSVTPLAP (서열식별번호: 74); AKTTAP (서열식별번호: 75); AKTTAPSVYPLAP (서열식별번호: 76); GGGGSGGGGSGGGGS (서열식별번호: 77); GENKVEYAPALMALS (서열식별번호: 78); GPAKELTPLKEAKVS (서열식별번호: 79); GHEAAAVMQVQYPAS (서열식별번호: 80); TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP (서열식별번호: 81); 및 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP (서열식별번호: 82)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

"표지" 및 "검출가능한 표지" 또는 "검출가능한 모이어티"는, 예를 들어 특이적 결합 쌍의 구성원, 예컨대 항체 및 분석물 사이의 반응을 검출가능하게 하기 위해 특이적 결합 파트너, 예컨대 항체 또는 분석물에 부착된 모이어티를 의미하고, 이렇게 표지된 특이적 결합 파트너, 예를 들어 항체 또는 분석물은 "검출가능하게 표지된" 것으로 지칭된다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "표지된 결합 단백질"은 결합 단백질의 확인을 제공하는 혼입된 표지를 갖는 단백질을 지칭한다. 한 실시양태에서, 표지는 시각적 또는 기기 수단, 예를 들어 방사성표지된 아미노산의 혼입 또는 마킹된 아비딘에 의해 검출될 수 있는 비오티닐 모이어티의 폴리펩티드 (예를 들어, 광학 또는 비색 방법에 의해 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 함유하는 스트렙타비딘)에 대한 부착에 의해 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 검출가능한 마커이다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 방사성동위원소 또는 방사성핵종 (예를 들어, ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, ¹⁶⁶Ho, 및 ¹⁵³Sm); 발색원; 형광 표지 (예를 들어, FITC, 로다민, 및 란타나이드 인광체); 효소적 표지 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, 루시페라제, 및 알칼리성 포스파타제); 화학발광 마커; 비오티닐 기; 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 및 에피토프 태그); 및 자기 작용제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트. 면역검정에 통상적으로 사용되는 표지의 대표적인 예는 광을 생성하는 모이어티, 예를 들어 아크리디늄 화합물, 및 형광을 생성하는 모이어티, 예를 들어 플루오레세인을 포함한다. 다른 표지가 본원에 기재되어 있다. 이와 관련하여, 모이어티 그 자체는 검출가능하게 표지되지 않을 수 있지만, 또 다른 모이어티와의 반응 시에 검출가능하게 될 수 있다. "검출가능하게 표지된"의 사용은 후자의 유형의 검출가능한 표지를 포괄하는 것으로 의도된다.

일부 실시양태에서, 항원 (예를 들어, 단백질 복합체), 예컨대 제시 분자-프로TGFβ1 복합체에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 결합 친화도는 옥테트 검정을 사용하여 결정된다. 일부 실시양태에서, 옥테트 검정은 항체와 항원 사이의 결합을 나타내는 1개 이상의 동역학적 파라미터를 결정하는 검정이다. 일부 실시양태에서, 옥테트® 시스템 (포르테바이오(FORTEBIO)®, 캘리포니아주 멘로 파크)은 제시 분자-프로TGFβ1 복합체에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 결합 친화도를 결정하는데 사용된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도는 생물층 간섭측정법을 이용하는 포르테바이오® 옥테트 QKe 딥 앤드 리드 무표지 검정 시스템을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항원은 바이오센서 (예를 들어, 스트렙타비딘-코팅된 바이오센서)에 고정되고, 항체 및 복합체 (예를 들어, 비오티닐화된 제시 분자-프로TGFβ1 복합체)는 결합 상호작용을 측정하기 위해 용액 중에 고농도 (50 μg/mL)로 존재한다. 일부 실시양태에서, 제시 분자-프로TGFβ1 복합체에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 결합 친화도는 표 14에 약술된 프로토콜을 사용하여 결정된다.

본 개시내용에 따른 항체는 pH-감수성 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체 또는 그의 단편은 pH-의존성 방식으로 표적 복합체에 결합하여, 중성 또는 생리학적 pH에서는 비교적 높은 친화도 결합이 발생하지만, 산성 pH에서는 항체가 그의 항원으로부터 보다 신속하게 해리되거나; 또는 해리율이 중성 pH에서보다 산성 pH에서 더 높다. 이러한 항체 또는 그의 단편은 재순환 항체로서 기능할 수 있다. 이러한 항체는 또한 "pH-감수성" 항체로 지칭될 수 있다.

따라서, 본 발명은 항체가 산성 pH (예를 들어, 대략 pH 5)와 비교하여 중성 pH (예를 들어, 대략 pH 7)에서 보다 낮은 해리율을 갖는 것을 특징으로 하는, 프로TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하는 pH-감수성 항체를 포괄한다. 하나의 이러한 항체의 Ph-의존성 결합 프로파일을 본원의 실시예 14에 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 항체는 세포 표면 상의 LRRC33 또는 GARP에 결합된 프로TGFβ1을 포함하는 복합체의 내재화를 유도할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 본 발명에 따른 세포-회합된 TGFβ1 (예를 들어, GARP-제시된 프로TGFβ1 및 LRRC33-제시된 프로TGFβ1)의 억제제이고, 이러한 복합체 (예를 들어, GARP-프로/잠재성 TGFβ1 및 LRRC33-프로/잠재성 TGFβ1)에 특이적으로 결합하여 복합체의 내재화 (예를 들어, 세포내이입)를 촉발하는 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 이러한 작용 방식은 세포 표면 (예를 들어, Treg, 대식세포, MDSC 등)으로부터 불활성 TGFβ1 복합체의 제거 또는 고갈을 유발하여, 따라서 활성화에 이용가능한 잠재성 TGFβ1을 감소시킨다. 이러한 항체 또는 그의 단편은 재순환 항체로서 기능할 수 있다. 이러한 항체는 또한 "pH-감수성" 항체로 지칭될 수 있다.

일부 실시양태에서, 이러한 "pH 감수성" 항체는 적합한 친화도 검정 (예를 들어, 생물층 간섭측정법, 표면 플라즈몬 공명, 및/또는 용액 평형 적정)에 의해 측정된 바와 같이, pH 5에서 ≥ 5 x 10^-3 s^-1 (예를 들어, ≥ 5.1 x 10^-3, ≥ 5.2 x 10^-3, ≥ 5.3 x 10^-3, ≥ 5.4 x 10^-3, ≥ 5.5 x 10^-3, ≥ 5.6 x 10^-3, ≥ 5.7 x 10^-3, ≥ 5.8 x 10^-3, ≥ 5.9 x 10^-3, 또는 ≥ 6.0 x 10^-3)의 K_dis (일명 K_오프)를 갖는다. 특정한 실시양태에서, 이러한 "pH-감수성" 항체는 pH 5에서 K_dis ≥ 5.6 x 10^-3를 갖는다.

일부 실시양태에서, 이러한 "pH-감수성" 항체는 적합한 친화도 검정 (예를 들어, 생물층 간섭측정법, 표면 플라즈몬 공명, 및/또는 용액 평형 적정)에 의해 측정된 바와 같이 ≥ 1.5 (예를 들어, ≥ 1.6, ≥ 1.7, ≥ 1.8, ≥ 1.9, 또는 ≥ 2.0)의 pH 5 K_dis 대 pH 7 K_dis 비 (즉, pH 5에서의 K_dis : pH7에서의 K_dis)를 갖는다. 특정한 실시양태에서, 이러한 "pH-감수성" 항체는 생물층 간섭측정법에 의해 측정된 바와 같이 ≥ 2.0의 K_dis 비를 갖는다.

스크리닝 과정; 제조

본 발명은 각각의 hGARP-프로TGFβ1 복합체, hLTBP1-프로TGFβ1 복합체, hLTBP3-프로TGFβ1 복합체, 및 hLRRC33-프로TGFβ1 복합체에 결합하고 그로부터 느린 속도로 해리되는 항체 또는 그의 단편의 스크리닝 방법, 생산 방법 및 제조 방법, 및 그를 포함하는 제약 조성물 및 관련 키트를 포괄한다.

항체 (또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 구축물)를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 방법은 바람직한 속성을 갖는 이러한 항체의 확인 및 선택을 필요로 한다. 여기서, 본 발명은 낮은 k_오프 값 (즉, 오프 레이트)을 갖는 항체가 이들 활성화 억제제의 작용 메카니즘을 반영하는 지속성을 제공할 수 있다는 인식을 포함하며, 이는 내인성 수용체와 결합하는 것에 신속하게 경쟁하는 능력에 의존하지 않고, 오히려 조직 내의 TGFβ1의 불활성 잠재성 형태에 래치되는 것에 의해 억제 효과를 발휘한다. 잠재성 항원 복합체에 결합된 채로 머무르는 능력 (낮은 해리율에 상응함)은 생체내에서 지속적인 효력을 달성할 수 있다.

따라서, 본 발명은 낮은 해리율 (예를 들어, 10.0E-4 (1/s) 미만) 또는 긴 반감기 (예를 들어, 적어도 90분의 t½)로 인간 LLC에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계, 및 항체를 대규모로 생산하는 단계를 포함하는, TGFβ1-선택적 활성화 억제제를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

유리한 오프 레이트 (낮은 해리)를 갖는 억제제의 선택은 1가 항체 (예를 들어, Fab 단편) 또는 전장 항체 (예를 들어, IgG)를 사용하여 결정될 수 있다.

일부 실시양태에서, 생산 단계는 250L 이상, 예를 들어, 1000L, 2000L, 3000L, 4000L의 부피를 갖는 포유동물 세포 배양물을 포함한다. 방법은 세포 배양물로부터 항체를 정제하는 단계, 및 임의로 정제된 항체를 제약 조성물로 제제화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 선택된 항체를 효능 및 안전성에 대해 적합한 전임상 모델에서 시험하는 단계, 및 항체가 NOAEL에서 효과적인지 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 안전성 평가는 조직병리학 및 면역-지정 안전성 평가를 포함하는 생체내 독성학 연구, 예를 들어 시험관내 시토카인 방출 검정 및 혈소판 검정을 포함할 수 있다.

지속적인 억제 효과를 달성하기 위해, 10.0E-4 이하 (s^-1) (예를 들어, 5.0E-4 이하, 1.0E-4 이하, 5.0E-5 이하)의 해리율 (예를 들어, 1가 해리율)을 갖는 항체가 본 개시내용에 따른 치료 용도 및/또는 대규모 제조를 위해 선택될 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 용도 또는 제조를 위해 선택된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR 서열을 포함하며: H-CDR1은 서열 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함할 수 있고; H-CDR2는 서열 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함할 수 있고; H-CDR3은 식 VSSGX₁WDX₂D에 의해 나타내어지는 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 임의로 X₁은 H 또는 Q이고, 여기서 추가로 임의로 X₂는 Y 또는 F이고 (서열식별번호: 283); L-CDR1은 서열 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함할 수 있고; L-CDR2는 서열 AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함할 수 있고; L-CDR3은 서열 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, H-CDR3은 서열 VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 단편은 프로TGFβ1 폴리펩티드 서열의 하기 아미노산 잔기: S35, G37, E38, V39, P40, P41, G42, P43, R274, K280, H283 및 K309 중 1개 이상을 포함하는 에피토프에 결합한다.

수많은 방법이 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 수득하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체는 재조합 DNA 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 모노클로날 항체는 또한 공지된 방법에 따라 하이브리도마의 생성에 의해 생산될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499] 참조). 이어서, 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마는 명시된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 1개 이상의 하이브리도마를 확인하기 위해 표준 방법, 예컨대 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) 및 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 옥테트® 또는 비아코어®) 분석을 사용하여 스크리닝된다. 명시된 항원의 임의의 형태, 예를 들어 재조합 항원, 그의 자연 발생 형태, 임의의 변이체 또는 단편, 뿐만 아니라 그의 항원 펩티드 (예를 들어, 선형 에피토프로서 본원에 기재된 에피토프 중 임의의 것 또는 입체형태적 에피토프로서 스캐폴드 내의 것)가 면역원으로서 사용될 수 있다. 항체를 제조하는 하나의 예시적인 방법은 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, scFv)을 발현하는 단백질 발현 라이브러리, 예를 들어 파지 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 파지 디스플레이는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,223,409 (Ladner et al.); 문헌 [Smith (1985) Science 228:1315-1317; Clackson et al., (1991) Nature, 352: 624-628; Marks et al., (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597]; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; and WO 90/02809에 기재되어 있다.

디스플레이 라이브러리의 사용에 더하여, 명시된 항원 (예를 들어, 제시 분자-TGFβ1 복합체)은 비-인간 숙주, 예를 들어 토끼, 기니 피그, 래트, 마우스, 햄스터, 양, 염소, 닭, 낙타류, 뿐만 아니라 비-포유동물 숙주, 예컨대 상어를 면역화하는데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 비-인간 동물은 마우스이다.

또 다른 실시양태에서, 모노클로날 항체는 비-인간 동물로부터 수득된 다음, 적합한 재조합 DNA 기술을 사용하여 변형, 예를 들어 키메라화된다. 키메라 항체를 제조하기 위한 다양한 접근법이 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985; Takeda et al., Nature 314:452, 1985], 미국 특허 번호 4,816,567 (Cabilly et al.); 미국 특허 번호 4,816,397 (Boss et al.); 유럽 특허 공개 EP171496 (Tanaguchi et al.); 유럽 특허 공개 0173494, 영국 특허 GB 2177096B를 참조한다.

추가의 항체 생산 기술에 대해서는 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]을 참조한다. 본 개시내용은 항체의 임의의 특정한 공급원, 생산 방법, 또는 다른 특수한 특징에 반드시 제한되지는 않는다.

본 개시내용의 일부 측면은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 숙주 세포에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있거나 또는 염색체외에서 유지될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 원핵 또는 진핵 세포, 예컨대 박테리아, 곤충, 진균, 식물, 동물 또는 인간 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진균 세포는, 예를 들어 사카로미세스(Saccharomyces) 속의 것, 특히 에스. 세레비지아에(S. cerevisiae) 종의 것이다. 용어 "원핵"은 항체 또는 상응하는 이뮤노글로불린 쇄의 발현을 위해 DNA 또는 RNA 분자로 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 모든 박테리아를 포함한다. 원핵 숙주는 그람 음성뿐만 아니라 그람 양성 박테리아, 예컨대 예를 들어 이. 콜라이(E. coli), 에스. 티피뮤리움(S. typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함할 수 있다. 용어 "진핵"은 효모, 고등 식물, 곤충 및 척추동물 세포, 예를 들어 포유동물 세포, 예컨대 NSO 및 CHO 세포를 포함한다. 재조합 생산 절차에 사용되는 숙주에 따라, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 항체 또는 이뮤노글로불린 쇄는 글리코실화될 수 있거나 또는 비-글리코실화될 수 있다. 항체 또는 상응하는 이뮤노글로불린 쇄는 또한 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 벡터가 적절한 숙주 내로 혼입되면, 숙주는 뉴클레오티드 서열의 높은 수준 발현에 적합한 조건 하에 유지될 수 있고, 원하는 경우에, 이뮤노글로불린 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 이량체 또는 무손상 항체, 항원-결합 단편 또는 다른 이뮤노글로불린 형태의 수집 및 정제가 이어질 수 있으며; 문헌 [Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979)]을 참조한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터가 세포 내로 도입되고, 이는 차례로 항체 또는 항원-결합 단편을 생산한다. 또한, 상기 언급된 숙주 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물, 바람직하게는 포유동물은 항체 또는 항체 단편의 대규모 생산에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "대규모" 생산은 적어도 250L의 부피를 포함한다. 전형적으로, 생물제제를 생산하는데 사용되는 상업적 규모의 생물반응기는 1000-12000L 범위이다.

형질전환된 숙주 세포는 발효기에서 성장되고, 최적의 세포 성장을 달성하기 위해 임의의 적합한 기술을 사용하여 배양될 수 있다. 발현되면, 전체 항체, 그의 이량체, 개별 경쇄 및 중쇄, 다른 이뮤노글로불린 형태, 또는 항원-결합 단편은 황산암모늄 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함한 관련 기술분야의 표준 절차에 따라 정제될 수 있고; 문헌 [Scopes, Protein Purification, Springer Verlag, N.Y. (1982)]을 참조한다. 이어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 성장 배지, 세포 용해물, 또는 세포 막 분획으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어 미생물에 의해 발현된 항체 또는 항원-결합 단편의 단리 및 정제는 임의의 통상적인 수단, 예컨대 예를 들어 정제용 크로마토그래피 분리 및 면역학적 분리, 예컨대 예를 들어 항체의 불변 영역에 대해 지시된 모노클로날 또는 폴리클로날 항체의 사용을 수반하는 것에 의한 것일 수 있다.

본 개시내용의 측면은 모노클로날 항체의 무기한 연장된 공급원을 제공하는 하이브리도마에 관한 것이다. 하이브리도마의 배양물로부터 직접 이뮤노글로불린을 수득하는 것에 대한 대안으로서, 불멸화 하이브리도마 세포가 후속 발현 및/또는 유전자 조작을 위한 재배열된 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 공급원으로서 사용될 수 있다. 재배열된 항체 유전자는 적절한 mRNA로부터 역전사되어 cDNA를 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중쇄 불변 영역은 상이한 이소형의 것으로 교환되거나 또는 완전히 제거될 수 있다. 가변 영역은 단일 쇄 Fv 영역을 코딩하도록 연결될 수 있다. 다중 Fv 영역이 연결되어 1개 초과의 표적에 대한 결합 능력을 부여할 수 있거나, 또는 키메라 중쇄 및 경쇄 조합이 사용될 수 있다. 임의의 적절한 방법이 항체 가변 영역의 클로닝 및 재조합 항체의 생성에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 적절한 핵산이 수득되고, 표준 재조합 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있는 발현 벡터 내로 삽입된다. 다양한 이러한 숙주 세포가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포는 효율적인 프로세싱 및 생산에 유리할 수 있다. 이러한 목적에 유용한 전형적인 포유동물 세포주는 CHO 세포, 293 세포, 또는 NSO 세포를 포함한다. 항체 또는 항원-결합 단편의 생산은 변형된 재조합 숙주를 숙주 세포의 성장 및 코딩 서열의 발현에 적절한 배양 조건 하에 배양하는 것에 의해 수행될 수 있다. 항체 또는 항원-결합 단편은 이들을 배양물로부터 단리하는 것에 의해 회수될 수 있다. 발현 시스템은 생성된 항체가 배지 내로 분비되도록 신호 펩티드를 포함하도록 설계될 수 있지만; 세포내 생산이 또한 가능하다.

본 개시내용은 또한 적어도 본원에 기재된 항체의 이뮤노글로불린 쇄의 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 가변 영역은 상기 기재된 하이브리도마 중 어느 하나에 의해 생산된 항체의 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 적어도 1개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.

항체 또는 항원-결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 DNA, cDNA, RNA 또는 합성적으로 생산된 DNA 또는 RNA, 또는 이들 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 포함하는 재조합적으로 생산된 키메라 핵산 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부이다. 이러한 벡터는 추가의 유전자, 예컨대 적합한 숙주 세포에서 및 적합한 조건 하에 벡터의 선택을 가능하게 하는 마커 유전자를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 원핵 또는 진핵 세포에서의 발현을 가능하게 하는 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결된다. 폴리뉴클레오티드의 발현은 폴리뉴클레오티드의 번역가능한 mRNA로의 전사를 포함한다. 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서의 발현을 보장하는 조절 요소는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이는 전사의 개시를 용이하게 하는 조절 서열 및 임의로 전사의 종결 및 전사체의 안정화를 용이하게 하는 폴리-A 신호를 포함할 수 있다. 추가의 조절 요소는 전사뿐만 아니라 번역 인핸서, 및/또는 자연적으로 회합된 또는 이종 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 원핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 가능한 조절 요소는, 예를 들어 이. 콜라이에서의 PL, Lac, Trp 또는 Tac 프로모터를 포함하고, 진핵 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 조절 요소의 예는 효모에서의 AOX1 또는 GAL1 프로모터, 또는 포유동물 및 다른 동물 세포에서의 CMV-프로모터, SV40-프로모터, RSV-프로모터 (라우스 육종 바이러스), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이다.

전사의 개시를 담당하는 요소 이외에, 이러한 조절 요소는 또한 폴리뉴클레오티드의 하류에 전사 종결 신호, 예컨대 SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위를 포함할 수 있다. 또한, 사용되는 발현 시스템에 따라, 폴리펩티드를 세포 구획으로 지시하거나 또는 이를 배지 내로 분비할 수 있는 리더 서열이 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에 부가될 수 있고, 이는 이전에 기재되었다. 리더 서열(들)은 적절한 단계에서 번역, 개시 및 종결 서열과 어셈블리되고, 바람직하게는 리더 서열은 번역된 단백질 또는 그의 부분의, 예를 들어 세포외 배지 내로의 분비를 지시할 수 있다. 임의로, 목적하는 특징, 예를 들어 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제를 부여하는 C- 또는 N-말단 식별 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 적어도 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이뮤노글로불린 쇄 둘 다 또는 오직 하나의 가변 도메인을 코딩할 수 있다. 마찬가지로, 폴리뉴클레오티드는 동일한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있거나, 또는 발현에 대해 개별적으로 제어될 수 있다. 또한, 일부 측면은 항체 또는 항원-결합 단편의 이뮤노글로불린 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를; 임의로 항체의 다른 이뮤노글로불린 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 조합하여 포함하는, 유전자 조작에서 통상적으로 사용되는 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 발현 제어 서열은 진핵 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵 프로모터 시스템으로서 제공되지만, 원핵 숙주에 대한 제어 서열이 또한 사용될 수 있다. 바이러스, 예컨대 레트로바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 포진 바이러스, 또는 소 유두종 바이러스로부터 유래된 발현 벡터는 (예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편을 발현하도록 세포를 조작하기 위해) 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 표적화된 세포 집단 내로 전달하는데 사용될 수 있다. 다양한 적절한 방법을 사용하여 재조합 바이러스 벡터를 구축할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 표적 세포로의 전달을 위해 리포솜 내로 재구성될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 이뮤노글로불린 쇄의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인(들)을 코딩하는 서열 및 발현 제어 서열)를 함유하는 벡터는 세포 숙주의 유형에 따라 달라지는 적합한 방법에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.

스크리닝 방법은 항체 또는 그의 단편의 목적하는 활성을 평가 또는 확인하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계는 표적 기능을 억제하는 능력, 예를 들어 잠재성 복합체로부터 성숙/가용성 성장 인자 (예를 들어, TGFβ1)의 방출을 억제하는 능력을 선택하는 것을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 단계는 활성화 시, 프로TGFβ 복합체가 세포 표면 상에서 발현되거나 ECM에 존재하는 경우, 배지 (예를 들어, 검정 용액)에서 방출된 성장 인자의 수준을 측정함으로써 시험 항체 또는 항체들의 억제 활성을 검정하는 세포-기반 효력 검정을 포함한다. 배지/용액으로 방출된 성장 인자의 수준은, 예를 들어 TGFβ 활성을 측정함으로써 검정될 수 있다. 유용한 세포-기반 효력 검정의 비제한적 예는 하기 (예를 들어, "TGFβ 활성화 및/또는 억제 효력을 측정하기 위한 세포-기반 검정" 참조) 및 본원의 실시예 3에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 스크리닝 방법은 적합한 세포-기반 효력 검정에 의해 측정된 바와 같이 5 nM 초과 (예를 들어, 10 nM 초과)의 IC50을 갖는 항체를 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스크리닝 방법은 LTBP1-TGFβ1, LTBP3-TGFβ1, GARP-TGFβ1, 및/또는 LRRC33-TGFβ1에 대한 적합한 세포-기반 효력 검정에 의해 측정된 바와 같이 5 nM 초과 (예를 들어, 10 nM 초과)의 IC50을 갖는 항체를 제거하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 스크리닝 방법은 1종 이상의 제시 분자-TGFb1 친화도에 대한 항체의 편향 (또는 비-편향)에 기초하여 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 스크리닝 방법은 매트릭스-회합된 TGFβ1 복합체에 대한 편향을 갖는 항체를 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 스크리닝 방법은 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체, 및 LRRC33-TGFβ1 복합체에 대해 비교적 등가의 친화도를 갖는 항체를 선택하는 것을 포함한다.

일부 실시양태에서, 스크리닝 방법은 ADCC를 유도하는 항체 또는 그의 단편을 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계는 생체내 목적하는 부위(들) (예를 들어, 세포 유형, 조직, 또는 기관)에 축적되는 항체 또는 그의 단편을 선택하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계는 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 능력을 갖는 항체 또는 그의 단편을 선택하는 것을 포함한다. 방법은 안정성, 결합 친화도, 기능성 (예를 들어, 억제 활성, Fc 기능 등), 면역원성, pH 감수성 및 개발가능성 (예를 들어, 높은 용해도, 낮은 자기-회합 등)과 같은 기준에 의해 결정된 바와 같은 바람직한 프로파일을 보유하는 변이체 대응물을 제공하기 위해 1종 이상의 항체 또는 그의 단편을 최적화하는 단계를 임의로 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 스크리닝 방법은 pH-감수성인 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스크리닝 방법은 적합한 친화도 검정 (예를 들어, 생물층 간섭측정법, 표면 플라즈몬 공명, 및/또는 용액 평형 적정)에 의해 측정된 바와 같이, pH 5에서 ≥ 5 x 10^-3 s^-1 (예를 들어, ≥ 5.1 x 10^-3, ≥ 5.2 x 10^-3, ≥ 5.3 x 10^-3, ≥ 5.4 x 10^-3, ≥ 5.5 x 10^-3, ≥ 5.6 x 10^-3, ≥ 5.7 x 10^-3, ≥ 5.8 x 10^-3, ≥ 5.9 x 10^-3, 또는 ≥ 6.0 x 10^-3)의 K_dis를 갖는 항체를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 스크리닝 방법은 적합한 친화도 검정 (예를 들어, 생물층 간섭측정법, 표면 플라즈몬 공명, 및/또는 용액 평형 적정)에 의해 측정된 바와 같이, ≥ 1.5 (예를 들어, ≥ 1.6, ≥ 1.7, ≥ 1.8, ≥ 1.9, 또는 ≥ 2.0)의 pH 5 K_dis 대 pH 7 K_dis 비 (즉, pH 5에서의 K_dis : pH7에서의 K_dis)를 갖는 항체를 선택하는 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 스크리닝 방법은 다른 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 및/또는 시노몰구스)으로부터의 프로TGFβ1과 교차-반응성인 항체를 선택하는 단계를 포함한다.

변형

본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 GARP-프로TGFβ1 복합체, LTBP1-프로TGFβ1 복합체, LTBP3-프로TGFβ1 복합체, 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체의 검출 및 단리를 위한 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 양전자 방출 금속, 비방사성 상자성 금속 이온, 및 친화성 표지를 포함하나 이에 제한되지는 않는 검출가능한 표지 또는 검출가능한 모이어티로 변형될 수 있다. 검출가능한 물질 또는 모이어티는 적합한 기술을 사용하여 본 개시내용의 폴리펩티드에 직접적으로 또는 중간체 (예컨대, 예를 들어, 링커 (예를 들어, 절단가능한 링커))를 통해 간접적으로 커플링 또는 접합될 수 있다. 적합한 효소의 비제한적 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고; 적합한 보결분자단 복합체의 비제한적 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고; 적합한 형광 물질의 비제한적 예는 비오틴, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드, 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 비제한적 예는 루시페라제, 루시페린, 및 에쿼린을 포함하고; 적합한 방사성 물질의 예는 방사성 금속 이온, 예를 들어, 알파-방출체 또는 다른 방사성동위원소, 예컨대, 예를 들어, 아이오딘 (¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ¹²¹I), 탄소 (¹⁴C), 황 (³⁵S), 삼중수소 (³H), 인듐 (¹¹⁵mIn, ¹¹³mIn, ¹¹²In, ¹¹¹In), 및 테크네튬 (⁹⁹Tc, ⁹⁹mTc), 탈륨 (²⁰¹Ti), 갈륨 (⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga), 팔라듐 (¹⁰³Pd), 몰리브데넘 (⁹⁹Mo), 크세논 (¹³³Xe), 플루오린 (¹⁸F), ¹⁵³Sm, Lu, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁵Yb, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y, ⁴⁷Sc, ⁸⁶R, ¹⁸⁸Re, ¹⁴²Pr, ¹⁰⁵Rh, ⁹⁷Ru, ⁶⁸Ge, ⁵⁷Co, ⁶⁵Zn, ⁸⁵Sr, ³²P, ¹⁵³Gd, ¹⁶⁹Yb, ⁵¹Cr, ⁵⁴Mn, ⁷⁵Se, 지르코늄 (⁸⁹Zr) 및 주석 (¹¹³Sn, ¹¹⁷Sn)을 포함한다. 검출가능한 물질은 적합한 기술을 사용하여 GARP-프로TGFβ1 복합체, LTBP1-프로TGFβ1 복합체, LTBP3-프로TGFβ1 복합체, 및/또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체, 또는 그의 임의의 성분에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 항체에 직접적으로 또는 중간체 (예컨대, 예를 들어, 링커)를 통해 간접적으로 커플링 또는 접합될 수 있다. 검출가능한 물질에 접합된 본원에 제공된 임의의 항체는 본원에 기재된 것과 같은 임의의 적합한 진단 검정에 사용될 수 있다. 이러한 검정은 질환 진행 및/또는 요법, 예컨대 본원에 기재된 TGFβ1 억제 요법에 대한 반응을 모니터링하는데 사용될 수 있는 생체내 영상화를 포함한다.

또한, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 또한 약물에 의해 변형될 수 있다. 약물은 적합한 기술을 사용하여 본 개시내용의 폴리펩티드에 직접적으로 또는 중간체 (예컨대, 예를 들어, 링커 (예를 들어, 절단가능한 링커))를 통해 간접적으로 커플링 또는 접합될 수 있다.

제약 조성물 및 제제

본 발명은 추가로 인간 및 비-인간 대상체에서의 투여에 적합한 의약으로서 사용되는 제약 조성물을 제공한다. 본 발명에 의해 포괄되는 1종 이상의 이소형-특이적 항체는, 예를 들어 완충제를 포함한 제약상 허용되는 담체 (부형제)와 함께 제제화되거나 혼합되어 제약 조성물을 형성할 수 있다. 이러한 제제는 TGFβ 신호전달을 수반하는 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이러한 제제는 면역-종양학 적용에 사용될 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 TGFβ-관련 적응증 (예를 들어, 섬유증, 면역 장애 및/또는 암)을 완화시키기 위해 환자에게 투여될 수 있다. "허용되는"은 담체가 조성물의 활성 성분과 상용성이고 (바람직하게는, 활성 성분을 안정화시킬 수 있고), 치료될 대상체에게 유해하지 않다는 것을 의미한다. 완충제를 포함한 제약상 허용되는 부형제 (담체)의 예는 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 이전에 기재되었다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20^th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]을 참조한다. 한 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 GARP-프로TGFβ1 복합체, LTBP1-프로TGFβ1 복합체, LTBP3-프로TGFβ1 복합체, 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 1종 초과의 항체를 함유하며, 여기서 항체는 복합체의 상이한 에피토프/잔기를 인식한다.

본 방법에 사용될 제약 조성물은 동결건조 제제 또는 수용액 형태의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다 (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20^th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉(PLURONIC)® 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 본원에 추가로 기재된다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 그의 단편, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 포함한다.

따라서, 항체 또는 이러한 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 분자는 인간 투여에 적합한 제약 조성물로 제제화될 수 있다.

제약 제제는 1종 이상의 부형제를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 부형제(들)는 하기에 제공된 목록으로부터 선택될 수 있다: accessdata.fda.gov/scripts/cder/iig/index.Cfm?event=browseByLetter.page&Letter=A

제약 조성물은 전형적으로 활성 생물제제 (예를 들어, 모노클로날 항체, 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 결합 분자 등)의 최종 농도가 약 2 mg/mL 내지 약 200 mg/mL이 되도록 제제화된다. 예를 들어, 제제의 최종 농도 (wt/vol)는 약 2-200, 2-180, 2-160, 2-150, 2-120, 2-100, 2-80, 2-70, 2-60, 2-50, 2-40, 5-200, 5-180, 5-160, 5-150, 5-120, 5-100, 5-80, 5-70, 5-60, 5-50, 5-40, 10-200, 10-180, 10-160, 10-150, 10-120, 10-100, 10-80, 10-70, 10-60, 10-50, 10-40, 20-200, 20-180, 20-160, 20-150, 20-120, 20-100, 20-80, 20-70, 20-60, 20-50, 20-40, 30-200, 30-180, 30-160, 30-150, 30-120, 30-100, 30-80, 30-70, 30-60, 30-50, 30-40, 40-200, 40-180, 40-160, 40-150, 40-120, 40-100, 40-80, 40-70, 40-60, 40-50, 50-200, 50-180, 50-160, 50-150, 50-120, 50-100, 50-80, 50-70, 50-60, 60-200, 60-180, 60-160, 60-150, 60-120, 60-100, 60-80, 60-70, 70-200, 70-180, 70-160, 70-150, 70-120, 70-100, 70-80 mg/mL의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 제제 중 생물제제의 최종 농도는 약 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 200 mg/mL이다.

본 발명의 제약 조성물은 바람직하게는 적합한 완충제와 함께 제제화된다. 적합한 완충제는 포스페이트 완충제, 시트르산 완충제, 및 히스티딘 완충제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

제제의 최종 pH는 전형적으로 pH 5.0 내지 8.0이다. 예를 들어, 제약 조성물의 pH는 약 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7 또는 7.8일 수 있다.

본 개시내용의 제약 조성물은 제약 제제에서의 사용에 대해 승인된 계면활성제, 예컨대 비이온성 세제를 포함할 수 있다. 이러한 계면활성제는, 예를 들어 폴리소르베이트, 예컨대 폴리소르베이트 20 (트윈™-20), 폴리소르베이트 80 (트윈™-80) 및 NP-40을 포함한다.

본 개시내용의 제약 조성물은 안정화제를 포함할 수 있다. 액체-단백질 제제의 경우에, 안정성은 pH-완충 염의 선택에 의해 증진될 수 있고, 종종 아미노산이 또한 사용될 수 있다. 액체/공기 계면 또는 액체/고체 계면 (패키징에 의함)에서의 상호작용은 종종 단백질의 흡착 및 언폴딩 후 응집으로 이어진다. 적합한 안정화제는 수크로스, 말토스, 소르비톨, 뿐만 아니라 특정 아미노산, 예컨대 히스티딘, 글리신, 메티오닌 및 아르기닌을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본 개시내용의 제약 조성물은 하기 부형제 중 하나 또는 임의의 조합을 함유할 수 있다: 인산나트륨, 아르기닌, 수크로스, 염화나트륨, 트로메타민, 만니톨, 벤질 알콜, 히스티딘, 수크로스, 폴리소르베이트 80, 시트르산나트륨, 글리신, 폴리소르베이트 20, 트레할로스, 폴록사머 188, 메티오닌, 트레할로스, rh히알루로니다제, 숙신산나트륨, 인산칼륨, 에데트산이나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 말토스, 히스티딘 아세테이트, 소르비톨, 펜테트산, 인간 혈청 알부민, 펜테트산.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 보존제를 함유할 수 있다.

본 개시내용의 제약 조성물은 전형적으로 액체 또는 동결건조된 형태로 제공된다. 전형적으로, 생성물은 바이알 (예를 들어, 유리 바이알)에 제공될 수 있다. 시린지, 펜, 또는 자동주사기에 이용가능한 제품은 이들 용기/폐쇄 시스템에 사전-충전된 액체로서 제공될 수 있다.

일부 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 GARP-프로TGFβ1 복합체, LTBP1-프로TGFβ1 복합체, LTBP3-프로TGFβ1 복합체, 및 LRRC33-프로TGFβ1 복합체에 특이적으로 결합하는 항체를 함유하는 리포솜을 포함하며, 이는 예컨대 문헌 [Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 순환 시간이 증진된 리포솜은 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 한정된 세공 크기의 필터를 통해 압출되어 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 생성한다.

일부 실시양태에서, 표적화 특성을 갖는 리포솜은 제약 조성물을 특정 조직 또는 세포 유형에 우선적으로 전달하거나 국재화하도록 선택된다. 예를 들어, 골수-표적화 특성을 갖는 특정 나노입자-기반 담체, 예를 들어 지질-기반 나노입자 또는 리포솜이 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sou (2012) "Advanced drug carriers targeting bone marrow", ResearchGate publication 232725109]을 참조한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물은 아주반트를 포함할 수 있거나 또는 그와 함께 사용될 수 있다. 특정 아주반트는, 예를 들어 종양 항원에 대한 대상체의 면역 반응을 부스팅하고, T이펙터 기능, 단핵구로부터의 DC 분화, APC에 의한 증진된 항원 흡수 및 제시 등을 용이하게 할 수 있는 것으로 고려된다. 적합한 아주반트는 레티노산-기반 아주반트 및 그의 유도체, 수중유 에멀젼-기반 아주반트, 예컨대 MF59 및 다른 스쿠알렌-함유 아주반트, 톨-유사 수용체 (TRL) 리간드, α-토코페롤 (비타민 E) 및 그의 유도체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 기재된 항체는 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀젼 내에 포획될 수 있다. 예시적인 기술은 이전에 기재되었으며, 예를 들어 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20^th Ed. Mack Publishing (2000)]을 참조한다.

다른 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 지속-방출 포맷으로 제제화될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여에 사용될 제약 조성물은 멸균되어야 한다. 이는, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 놓인다.

본원에 기재된 제약 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위한 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌제일 수 있다.

적합한 표면-활성제는 특히 비-이온성 작용제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어, 트윈™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄 (예를 들어, 스팬(Span)™ 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성제를 갖는 조성물은 편리하게는 0.05 내지 5%의 표면-활성제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요한 경우에, 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 다른 제약상 허용되는 비히클이 첨가될 수 있는 것으로 인지될 것이다.

적합한 에멀젼은 상업적으로 입수가능한 지방 에멀젼, 예컨대 인트라리피드(Intralipid)™, 리포신(Liposyn)™, 인포누트롤(Infonutrol)™, 리포푼딘(Lipofundin)™ 및 리피피산(Lipiphysan)™을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 사전-혼합된 에멀젼 조성물 중에 용해될 수 있거나 또는 대안적으로 오일 (예를 들어, 대두 오일, 홍화 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일) 중에 용해될 수 있고, 인지질 (예를 들어, 난 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과 혼합 시 에멀젼이 형성될 수 있다. 에멀젼의 장성을 조정하기 위해 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 첨가될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 20% 이하, 예를 들어 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다.

에멀젼 조성물은 본 발명의 항체를 인트라리피드™ 또는 그의 성분 (대두 오일, 난 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조된 것일 수 있다.

TGFβ1 활성의 억제

본 개시내용의 방법은 1종 이상의 생물계에서 TGFβ1 성장 인자 활성을 억제하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 1종 이상의 생물계를 본 개시내용의 항체 및/또는 조성물과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이들 방법은 생물계에서 (예를 들어, 세포 함요 또는 대상체에서) 유리 성장 인자의 수준을 변형시키는 것을 포함한다. 이러한 방법에 따른 항체 및/또는 조성물은 본원에 기재된 재조합 단백질, 단백질 복합체 및/또는 항체, 또는 그의 항원 부분을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생체분자를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 방법은 성장 인자 활성을 감소시키거나 제거하는데 사용될 수 있으며, 이는 본원에서 "억제 방법"으로 명명된다. 일부 이러한 방법은 TGFβ 복합체 (예를 들어, GARP, LTBP1, LTBP3 및/또는 LRRC33과 복합체화된 TGFβ1)에서의 성숙 성장 인자 체류 및/또는 성장 인자의 TGFβ 복합체 내로의 재회합의 촉진을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 억제 방법은 본원에 개시된 항체의 사용을 포함할 수 있다. 일부 억제 방법에 따르면, 1종 이상의 억제 항체가 제공된다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 그의 항원-결합 부분, 및 조성물은 TGFβ1 활성화를 억제하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체, 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체를 본원에 기재된 항체, 그의 항원-결합 부분, 또는 제약 조성물에 노출시키는 것을 포함하는, TGFβ1 활성화를 억제하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체, 그의 항원-결합 부분, 또는 제약 조성물은 GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체, 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체로부터 성숙 TGFβ1의 방출을 억제한다. 일부 실시양태에서, 방법은 시험관내에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법은 생체내에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 방법은 생체외에서 수행된다.

일부 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체 또는 LRRC33-TGFβ1 복합체는 세포의 외부 표면에 존재한다.

일부 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체 또는 LRRC33-TGFβ1 복합체를 발현하는 세포는 섬유모세포, 근섬유모세포, 대식세포, T-세포, 단핵구, 수지상 세포, 항원 제시 세포, 호중구, 골수-유래 억제 세포 (MDSC), 림프구, 비만 세포, 또는 소교 세포이다. 근섬유모세포는 암-연관 섬유모세포 (CAF) 중 섬유증-연관 섬유모세포 (FAF)일 수 있다. T-세포는 조절 T 세포 (예를 들어, 면역억제 T 세포)일 수 있다. 호중구는 활성화된 호중구일 수 있다. 대식세포는 상주 대식세포 (예를 들어, 간 쿠퍼 세포) 또는 침윤 대식세포일 수 있다. 대식세포는 섬유화유발 및/또는 종양-연관 대식세포 (TAM), 예를 들어 M2c 하위유형 및 M2d 하위유형 대식세포를 포함한 활성화된 (예를 들어, 분극화된) 대식세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대식세포는 대식세포에서 암-촉진 표현형을 추가로 유도할 수 있는 종양-유래 인자 (예를 들어, 시토카인, 성장 인자 등)에 노출된다. 일부 실시양태에서, 이러한 종양-유래 인자는 CSF-1/M-CSF이다.

일부 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체 또는 LRRC33-TGFβ1 복합체를 발현하는 세포는 암 세포, 예를 들어 순환 암 세포 및 종양 세포이다.

일부 실시양태에서, LTBP1-TGFβ1 복합체 또는 LTBP3-TGFβ1 복합체는 세포외 매트릭스 (즉, ECM의 성분)에 결합된다. 일부 실시양태에서, 세포외 매트릭스는 피브릴린 및/또는 피브로넥틴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 매트릭스는 RGD 모티프를 포함하는 단백질을 포함한다.

LRRC33은 선택적 세포 유형, 특히 단핵구 및 대식세포를 포함한 골수계의 것에서 발현된다. 단핵구는 골수 내의 전구세포로부터 기원하고, 혈류 내에서 순환하고, 말초 조직에 도달한다. 이어서, 순환 단핵구는 단핵구의 대식세포, 수지상 세포 등으로의 분화를 촉발하는 다양한 인자의 패널, 예컨대 시토카인 및 케모카인을 포함하는 국부 환경 (예를 들어, 조직-특이적, 질환-연관 등)에 노출되게 되는 조직 내로 이동할 수 있다. 이들은, 예를 들어 폐의 폐포 대식세포, 골수의 파골세포, CNS의 소교세포, 결합 조직의 조직구, 간의 쿠퍼 세포, 및 갈색 지방 조직의 갈색 지방 조직 대식세포를 포함한다. 섬유화 조직에서, 침윤 골수 세포는 전형적으로 M2-유사 대식세포인 섬유증-연관 대식세포 (FAM), 뿐만 아니라 MDSC를 포함할 수 있다. 고형 종양에서, 침윤 대식세포는 종양-연관 대식세포 (TAM), 종양-연관 호중구 (TAN), 및 골수-유래 억제 세포 (MDSC) 등일 수 있다. 이러한 대식세포는 활성화된 섬유모세포, 예컨대 암종-연관 (또는 암-연관) 섬유모세포 (CAF) 및/또는 기질을 활성화시키고/거나 그와 회합될 수 있다. 따라서, LRRC33-함유 복합체로부터 성숙 TGFβ1의 방출을 억제하는 본원에 기재된 TGFβ1 활성화의 억제제는 세포 표면 상에 LRRC33-프로TGFβ1을 발현하는 이들 세포 중 임의의 것을 표적화할 수 있다.

일부 실시양태에서, LRRC33-TGFβ1 복합체는 섬유화유발 (M2-유사) 대식세포의 외부 표면에 존재한다. 일부 실시양태에서, 섬유화유발 (M2-유사) 대식세포는 섬유화 미세환경에 존재한다. 일부 실시양태에서, 섬유화유발 (M2-유사) 대식세포의 외부 표면의 LRRC33-TGFβ1 복합체를 표적화하는 것은 단지 LTBP1-TGFβ1 및/또는 LTBP1-TGFβ1 복합체를 표적화하는 것과 비교하여 우수한 효과를 제공한다. 일부 실시양태에서, M2-유사 대식세포는 차등 표현형을 갖는 다중 하위유형, 예컨대 M2c 및 M2d TAM-유사 대식세포로 추가로 분극화된다. 일부 실시양태에서, 대식세포는 TGFβ1, CCL2 (MCP-1), CCL22, SDF-1/CXCL12, M-CSF (CSF-1), IL-6, IL-8, IL-10, IL-11, CXCR4, VEGF, PDGF, 프로스타글란딘-조절제, 예컨대 아라키돈산 및 시클로옥시게나제-2 (COX-2), 부갑상선 호르몬-관련 단백질 (PTHrP), RUNX2, HIF1α 및 메탈로프로테이나제를 포함하나 이에 제한되지는 않는, 종양 미세환경에 존재하는 다양한 인자 (예를 들어, 성장 인자, 케모카인, 시토카인 및 ECM-재형성 분자)에 의해 활성화될 수 있다. 이러한 인자 중 1종 이상에 대한 노출은 단핵구/대식세포를 종양-촉진 표현형으로 추가로 유도할 수 있다. 하나의 예를 들자면, 종양에서의 CCL2 및 VEGF 공동-발현은 증가된 TAM 및 불량한 진단과 상관관계가 있는 것으로 제시되었다. 차례로, 이들 활성화된 종양-연관 세포는 또한 다른 세포의 종양유발 세포, 예를 들어 CAF, TAN, MDSC 등으로의 동원 및/또는 분화를 용이하게 할 수 있다. 기질 세포는 또한 대식세포 활성화에 반응할 수 있고, ECM 재형성, 및 궁극적으로 혈관화, 침습 및 전이에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, CCL2는 단핵구 유인제로서 기능할 뿐만 아니라, 활성화된 내피에서 발현되는 ICAM-1에 대한 수용체인 MAC-1을 상향조절함으로써 세포 부착을 촉진한다. 이는 CCL2-의존성 동맥신생 및 암 진행으로 이어질 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 TGFβ1 억제제는 CCL2 신호전달 축을 방해함으로써 동맥신생을 억제하는 방법에 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, GARP-TGFβ1 복합체, LTBP1-TGFβ1 복합체, LTBP3-TGFβ1 복합체, 및/또는 LRRC33-TGFβ1 복합체는 세포외 매트릭스에 결합된다. 일부 실시양태에서, 세포외 매트릭스는 피브릴린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 매트릭스는 RGD 모티프를 포함하는 단백질을 포함한다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체, 그의 항원-결합 부분, 또는 제약 조성물을 대상체에게 투여함으로써 대상체에서 TGFβ1 단백질 활성화를 감소시키는 것을 포함하는, 대상체에서 TGFβ1 단백질 활성화를 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 섬유증을 갖거나 또는 가질 위험이 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖거나 또는 가질 위험이 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 치매를 갖거나 또는 가질 위험이 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 조절 T 세포 (Treg)의 억제 활성을 감소시킨다.

TGFβ 활성화 및/또는 억제 효력을 측정하기 위한 세포-기반 검정

TGFβ의 활성화 (및 TGFβ 시험 억제제, 예컨대 항체에 의한 그의 억제)는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, TGFβ의 인테그린-매개 활성화는 본원에 보다 상세하게 기재된 세포-기반 검정, 예컨대 "CAGA12" 루시페라제 검정에 이용될 수 있다.

TGFβ1 활성화의 신규 콘텍스트-의존성 세포-기반 검정의 개발은 미국 특허 가출원 번호 62/538,476 및 상응하는 국제 출원 공개 번호 WO 2019/023661에 기재되어 있으며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이전 검정 포맷은 내인성 제시 분자에 의해 제시된 프로TGFβ1의 활성화와 외인성 LTBP에 의해 제시된 프로TGFβ1의 활성화 사이를 구별할 수 없었다. 인테그린-발현 세포를 직접 형질감염시킴으로써, 국제 출원 공개 번호 WO 2019/023661에 개시되고 본원에 사용된 신규 검정은 내인성 제시자-프로TGFβ1 활성과 외인성 LTBP-프로TGFβ1 활성 사이의 범위를 확립한다.

세포의 표면 상에 제시되는 GARP- 또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체와 대조적으로, LTBP-프로TGFβ1 복합체는 세포외 매트릭스에 포매된다. 따라서, 검정 플레이트 코팅은 LTBP (예를 들어, LTBP1/3)와 복합체화된 프로TGFβ1의 활성화를 평가할 때 검정의 중요한 성분이다. 이와 관련하여, 피브로넥틴 안딘은 매트릭스와의 LTBP 회합 및 잠재성 TGFβ의 활성화에 중요한 것으로 보이는 2종의 ECM 성분인 것으로 제시되었다 (Robertson et al., Matrix Biol. 2015 Sep; 47:44-53). 예를 들어, LTBP3 ECM-혼입은 시험관내 및 생체내 모델 둘 다에서 피브릴린 발현에 의존성인 것으로 보인다 (Zilberberg et al., J Cell Physiol. 2012;227(12):3828-3836).

다른 한편으로는, LTBP1은 각각 그의 C- 및 N-말단을 통해 피브릴린 미세원섬유 및 피브로넥틴과 상호작용하는 것으로 제시되었다 (Dallas et al., J Biol Chem. 2005;280(19):18871-18880; Fontana et al., FASEB J. 2005;19(13):1798-1808; 및 Kantola et al., Exp Cell Res. 2008;314(13):2488-2500). 또한, 피브릴린의 부재 하에, LTBP1은 여전히 피브로넥틴 섬유와 공동-국재화된다 (Robertson et al., Matrix Biol. 2015 Sep; 47:44-53). LTBP1은 또한 ADAMTSL2 및 3 (Sengle et al., PloS Genet. 2012;8(1):e1002425), IGFBP3 (Gui and Murphy, Mol Cell Biochem. 2003;250(1-2):189-195), 피불린-4 (Massam-Wu et al., J Cell Sci. 2010 Sep 1;123(Pt 17):3006-18), 및 헤파린 (Chen et al., J Biol Chem. 2007;282(36):26418-26430)과 상호작용하는 것으로 제시되었다.

전통적인 ECM 성분/단백질 이외에, 조직 트랜스글루타미나제 (TG2)도 또한 ECM에서의 TGFβ 국재화에 중요한 역할을 할 수 있다. TG2는 ECM 피브릴을 가교시키는 분자간 및 분자내 이소펩티드 결합을 촉매하여, ECM을 효과적으로 강직화하고, ECM을 단백질분해적 분해로부터 보호하는 것으로 공지되어 있다 (Benn et al., Current Opinion in Biomedical Engineering., 2019, https://doi.org/10.1016/j.cobme.2019.06.003). 또한, TG2는 LTBP1을 ECM에 가교시켜, TGFβ의 매트릭스 저장소를 촉진할 수 있다 (Nunes et al., J Cell Biol. 1997;136(5):1151-1163).

따라서, LTBP의 N-말단은 이소펩티드 결합을 통해 ECM에 공유 결합될 수 있으며, 그의 형성은 트랜스글루타미나제에 의해 촉매될 수 있다. ECM의 구조적 완전성은 LTBP-연관 TGFβ1 활성을 매개하는데 중요한 것으로 여겨진다. 예를 들어, 매트릭스의 강성은 TGFβ1 활성화에 유의하게 영향을 미칠 수 있다. 또한, 스캐폴드에 피브로넥틴 및/또는 피브릴린을 혼입하는 것은 LTBP-매개 TGFβ1 활성화를 유의하게 증가시킬 수 있다. 유사하게, LTBP 검정 (예를 들어, 세포-기반 효력 검정)에서 피브로넥틴 및/또는 피브릴린의 존재는 검정 범위를 증가시킬 수 있다.

따라서, TGFβ1 활성화를 측정하기 위한 세포-기반 검정은 하기 성분을 포함할 수 있다: i) TGFβ의 공급원 (재조합, 내인성, 또는 형질감염된 것); ii) 인테그린과 같은 활성화제의 공급원 (재조합, 내인성, 또는 형질감염된 것); 및 iii) TGFβ 활성화에 반응하는 리포터 시스템, 예컨대 TGFβ에 반응하여 신호를 판독가능한 출력 (예를 들어, CAGA12 세포 또는 다른 리포터 세포주에서의 루시페라제 활성)으로 번역할 수 있는 TGFβ 수용체를 발현하는 세포. 일부 실시양태에서, 리포터 세포주는 TGFβ-반응성 프로모터 (예를 들어, PAI-1 프로모터)의 제어 하의 리포터 유전자 (예를 들어, 루시페라제 유전자)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 감수성을 부여하는 특정 프로모터 요소가 리포터 시스템 내로 혼입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이러한 프로모터 요소는 CAGA12 요소이다. 검정에 사용될 수 있는 리포터 세포주는, 예를 들어 본원에 참조로 포함된 문헌 [Abe et al., (1994) Anal Biochem. 216(2): 276-84]에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 각각의 상기 언급된 검정 성분은 동일한 공급원 (예를 들어, 동일한 세포)으로부터 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 언급된 검정 성분 중 2종은 동일한 공급원으로부터 제공되고, 제3 검정 성분은 상이한 공급원으로부터 제공된다. 일부 실시양태에서, 모든 3종의 검정 성분은 상이한 공급원으로부터 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 인테그린 및 잠재성 TGFβ 복합체 (프로TGFβ 및 제시 분자)는 동일한 공급원 (예를 들어, 동일한 형질감염된 세포주)으로부터 검정에 제공된다. 일부 실시양태에서, 인테그린 및 TGF는 별개의 공급원 (예를 들어, 2종의 상이한 세포주, 정제된 인테그린 및 형질감염된 세포의 조합)으로부터 검정에 제공된다. 세포가 검정 성분 중 1종 이상의 공급원으로서 사용되는 경우에, 이러한 검정 성분은 세포에 내인성이거나, 세포에서 안정하게 발현되거나, 일시적으로 형질감염되거나, 또는 그의 임의의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 검정은 조직 배양 플레이트 또는 접시에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 조직 배양 플레이트 또는 접시는 세포외 매트릭스 (ECM)의 성분으로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 조직 배양 플레이트 또는 접시는 피브로넥틴 및/또는 피브릴린으로 코팅된다. 일부 실시양태에서, 세포-기반 검정은 TG2의 공급원을 포함하는 제4 성분을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, TG2 성분은 상기 언급된 성분 중 어느 하나와 동일하거나 상이한 공급원으로부터 제공된다. LTBP1-프로TGFβ1 복합체, LTBP3-프로TGFβ1 복합체, GARP-프로TGFβ1 복합체, 또는 LRRC33-프로TGFβ1 복합체의 억제를 입증하는 TGFβ 활성화를 측정하기 위한 세포-기반 검정의 비제한적 예시적인 실시양태로부터의 결과가 본원에 개시된다 (예를 들어, 실시예 3 참조).

통상의 기술자는 다양한 적합한 구성에 이러한 검정을 용이하게 적합화할 수 있다. 예를 들어, TGFβ의 다양한 공급원이 고려될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ의 공급원은 TGFβ를 발현하고 침착시키는 세포 (예를 들어, 1차 세포, 증식된 세포, 불멸화 세포 또는 세포주 등)이다. 일부 실시양태에서, TGFβ의 공급원은 적합한 수단을 사용하여 검정 시스템에 고정된 정제된 및/또는 재조합 TGFβ이다. 일부 실시양태에서, 검정 시스템에 고정된 TGFβ는 탈세포화의 존재 또는 부재 하의 검정 플레이트 상의 세포외 매트릭스 (ECM) 조성물 내에 제시되며, 이는 섬유모세포-유래 TGFβ를 모방한다. 일부 실시양태에서, TGFβ는 검정에 사용된 세포의 세포 표면 상에 제시된다. 추가적으로, 선택된 제시 분자가 검정 시스템에 포함되어 적합한 잠재성-TGFβ 복합체를 제공할 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 어떠한 제시 분자(들)가 특정 세포 또는 세포 유형에 존재하거나 발현될 수 있는지 용이하게 결정할 수 있다. 이러한 검정 시스템을 사용하여, 시험 작용제 (예컨대 항체)의 존재 또는 부재 하의 TGFβ 활성화의 상대 변화를 용이하게 측정하여 시험관내 TGFβ 활성화에 대한 시험 작용제의 효과를 평가할 수 있다. 예시적인 세포-기반 검정으로부터의 데이터는 하기 실시예 섹션에 제공된다.

이러한 세포-기반 검정은 연구되는 TGFβ 이소형, 잠재성 복합체 (예를 들어, 제시 분자)의 유형 등에 따라 다수의 방식으로 변형 또는 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, TGFβ를 활성화시킬 수 있는 인테그린을 발현하는 것으로 공지된 세포가 검정에서 인테그린의 공급원으로서 사용될 수 있다. 이러한 세포는 전형적으로 LN229 세포를 포함한다. 다른 적합한 세포는 SW480/β6 세포 (예를 들어, 클론 1E7)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포주(들)는 (예를 들어, CRISPR-매개 유전자 제거를 통해) 1종 이상의 제시 분자의 발현을 감소시키거나 제거하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 세포주는 LTBP1 녹아웃 세포주 (예를 들어, 엑손 7을 표적화하는 것에 의한 CRISPR-매개된 유전자 제거)일 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포주는 LTBP3 녹아웃 세포주일 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포주는 GARP 녹아웃 세포주일 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포주는 LRRC33 녹아웃 세포주일 수 있다.

일부 실시양태에서, 인테그린-발현 세포는 관심 제시 분자 (예컨대 GARP, LRRC33, LTBP (예를 들어, LTBP1 또는 LTBP3) 등)를 코딩하는 플라스미드 및 관심 TGFβ 이소형의 프로-형태 (예컨대 프로TGFβ1)를 코딩하는 플라스미드와 공동-형질감염될 수 있다. 형질감염 후, 세포를 형질감염된 유전자의 발현을 허용하기에 충분한 시간 (예를 들어, 약 24시간) 동안 인큐베이션하고, 세포를 세척하고, 시험 작용제 (예를 들어, 항체)의 연속 희석물과 함께 인큐베이션한다. 이어서, 리포터 세포주 (예를 들어, CAGA12 세포)를 검정 시스템에 첨가하고, 이어서 적절한 인큐베이션 시간으로 TGFβ 신호전달을 허용한다. 시험 작용제의 첨가에 이은 인큐베이션 기간 (예를 들어, 약 18-20시간) 후에, 신호/판독 (예를 들어, 루시페라제 활성)을 적합한 수단을 사용하여 검출한다 (예를 들어, 루시페라제-발현 리포터 세포주의 경우, 브라이트-글로(Bright-Glo)™ 시약 (프로메가(Promega)®)을 사용할 수 있음). 일부 실시양태에서, 루시페라제 형광은 오토게인 세팅으로 바이오텍(BioTek)® (시너지(Synergy)™ H1) 플레이트 판독기를 사용하여 검출될 수 있다.

데이터는 본 발명의 예시적인 항체가 TGFβ1의 활성화를 선택적으로 억제할 수 있다는 것을 입증한다 (예를 들어, 실시예 3 및 표 15 참조).

핵산

일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 그의 항원-결합 부분 및/또는 조성물은 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있다. 이러한 핵산 분자는 비제한적으로 DNA 분자, RNA 분자, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, mRNA 분자, 벡터, 플라스미드 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 화합물 및/또는 조성물을 코딩하는 핵산 분자를 발현하도록 프로그램화되거나 생성된 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 핵산은 코돈-최적화된 핵산을 포함한다. 코돈-최적화된 핵산을 생성하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 미국 특허 번호 5,786,464 및 6,114,148에 기재된 것을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 어떠한 방식으로든 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 본 출원 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌, 특허 및 공개된 특허 출원, 뿐만 아니라 도면의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.

TGFβ-관련 적응증과 연관된 질환/장애를 완화시키는데 사용하기 위한 키트

본 개시내용은 또한 TGFβ-관련 적응증과 연관된 질환/장애를 완화시키는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 포함하는 1개 이상의 용기를 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 키트는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따른 사용에 대한 지침서를 포함할 수 있다. 포함된 지침서는 본원에 기재된 것과 같은 표적 질환을 치료하거나, 그의 발병을 지연시키거나, 또는 이를 완화시키기 위한 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 투여의 설명을 포함할 수 있다. 키트는 개체가 표적 질환을 갖는지 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 개체를 선택하는 것에 대한 설명을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 지침서는 표적 질환의 위험이 있는 개체에게 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 투여하는 것에 대한 설명을 포함한다.

항체 또는 그의 항원-결합 부분의 사용에 관한 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄, 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에 제공되는 지침서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 상의 서면 지침서 (예를 들어, 키트에 포함된 종이 시트)이지만, 기계-판독가능한 지침서 (예를 들어, 자기 또는 광학 저장 디스크 상에 보유된 지침서)가 또한 허용된다.

라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 TGFβ-관련 적응증과 연관된 질환 또는 장애를 치료하고/거나, 그의 발병을 지연시키고/거나, 그를 완화시키는데 사용된다는 것을 나타낸다. 지침서는 본원에 기재된 방법 중 임의의 것을 실시하기 위해 제공될 수 있다.

본 개시내용의 키트는 적합한 포장 내에 있다. 적합한 포장은 바이알, 병, 단지, 가요성 포장 (예를 들어, 밀봉된 마일라 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들어, 아토마이저) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 용기도 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 본원에 기재된 바와 같은 항체 또는 그의 항원-결합 부분이다.

키트는 임의로 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.

실시예

실시예 1: 항체 스크리닝 및 선택 방법론

항원-결합 단편을 양성 선택 및 음성 선택 단계에서 정제된 재조합 단백질 항원 복합체를 사용하여 라이브러리로부터 스크리닝하였다. 양성 선택을 위한 항원은 각각 인간 프로TGFβ1을 갖는 모든 4종의 인간 LLC 및 모든 4종의 뮤린 LLC를 포함하였다. 음성 선택을 위한 항원은 성숙 성장 인자 (즉, 인간 TGFβ1, TGFβ2, TGFβ3)를 포함하였다. 특이적 및 선택적 결합제를 옥테트에 의해 확인한 후, 이들을 추가의 평가를 위해 전장 IgG로 제조하였다. 확인된 고친화도 결합제 중에서, 느린 오프 레이트를 갖는 것을 선택하였다.

세포-기반 효력 검정에 의해 측정된 바와 같이 증진된 해리율 (보다 느린 K_오프) 및 억제 활성을 나타내는 16종의 신규 항체 중에서, 3종의 항체, 즉 Ab42, Ab46 및 Ab50을 추가의 평가를 위해 선택하였다.

Ab42, Ab46 및 Ab50의 특이적 및 선택적 결합을 ELISA에 의해 확인하였다 (도 3 및 4). Ab2는 도 1에 제시된 바와 같이 TGFβ1의 선택적 결합제 및 억제제인 것으로 이전에 입증되었기 때문에 Ab2를 양성 대조군으로서 사용하였다. TGFβ3의 이소형-선택적 활성화 억제제를 음성 대조군으로서 사용하여 신규 항체의 이소형-선택성을 입증하였다.

시험관내 결합 동역학 (온/오프 레이트)을 비아코어-기반 검정에서 측정하고, 각각에 대한 인간 및 뮤린 대응물 둘 다를 사용하여 모든 4종의 공지된 LLC에 대해 친화도를 결정하였다. 회합률 및 해리율에 기초하여, K_D를 각각에 대해 계산하였다. 또한, 벤치마크로서 참조 항체와 비교하여 상대 친화도를 계산하고, 참조 항체 대비 "배수 차이"로서 표현하였다.

실시예 2. 시험관내 결합/동역학 프로파일

1) BLI-기반 결합 검정

Ab1, Ab2 및 Ab3의 친화도는 인간 프로TGFβ1 세포에 대한 옥테트® 검정에 의해 측정하였고, 활성은 인간 프로TGFβ1 억제를 시험하는 CAGA12 리포터 세포에 의해 측정하였다. 본원에 제공된 복합체에 대한 항체의 친화도를 측정하는데 사용된 프로토콜을 하기 표 14에 요약하며, 본 개시내용의 예시적인 항체의 친화도 프로파일의 요약 목록을 본원의 표 6에 제공한다.

표 21: 옥테트 결합 검정을 수행하기 위한 프로토콜

2) SET-기반 결합 검정

Ab2, Ab3, Ab11, Ab12, Ab19, Ab20, 및 Ab35, C1, 및 C2의 친화도를 또한 메소-스케일 디스커버리 (MSD) 용액 평형 적정 (SET)에 의해 측정하였다. MSD-SET는 용액-상 평형 K_D의 결정에 사용될 수 있는 널리-특징화된 기술이다. 용액-기반 평형 검정, 예컨대 MSD-SET는 실시간 회합률 및 해리율보다는 평형상태에서의 유리 리간드 결합을 측정하여 친화도를 결정하는, 동역학적 배제의 원리에 기초한 것이다.

간략하게, 표준 MSD 플레이트를 관심 모노클로날 항체 (포획 항체)의 20 nM 용액으로 30분 동안 실온에서 또는 밤새 4℃에서 코팅하였다. 이어서 별개의 비-결합 96 웰 플레이트 상에서, 포획 항체로서 사용되는 동일한 모노클로날 항체를 μM에서 fM 농도로 적정하고, 한 세트 농도의 비오티닐화 항원과 함께 밤새 실온에서 진탕 없이 인큐베이션하였다. 20-24시간의 평형 후, 포획 항체 플레이트를 차단하고 세척한 후, 평형화된 항체-항원 샘플 용액을 정확하게 150초 동안 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 세척한 후, 스트렙타비딘-술포태그 2차 시약을 3분 동안 첨가하였다. 플레이트를 세척한 후, 메소(MESO)® 퀵플렉스 SQ 120을 사용하여 MSD 판독 완충제 중에서 판독하였다. 상기 기재된 바와 같은 MSD-SET에 의한 친화도 프로파일을 본원의 표 7에 제공한다.

3) 표면 플라즈몬 공명 (SPR)-기반 검정

비아코어® 시스템을 사용하여 시험 항체의 항원 결합에 대한 1가 결합 친화도 및 동역학적 파라미터를 결정하였다. 결합 동역학을 비아코어 8K (지이 헬스케어)를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가하였다. 비오틴 CAP 센서 칩을 사용하여 비오티닐화된 항원을 포획하였다. 다양한 농도 (0 nM, 0.62 nM, 1.25 nM, 2.5 nM, 5 nM 및 10 nM)의 Fab를 포획된 항원 상에 주입하였다. 다중-주기 동역학을 이용하였고, 여기서 각각의 분석물 농도를 개별 주기에 주입하고, 각각의 주기 후에 센서 칩 표면을 재생시켰다. 모든 검정은 새로이 제조된 1x HBS-EP+ 완충제 (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.05% 트윈20, pH 7.4) 중에서 수행하였다. 각각의 상호작용에 대한 모든 분석물 농도에 대한 데이터를 1:1 결합 모델에 전반적으로 피팅하여 동역학적 파라미터를 수득하였다. 0 nM 분석물 농도에 대한 센소그램을 참조로서 사용하였다.

각각의 항원 복합체, 인간 LTBP1-프로TGFβ1, 인간 LTBP3-프로TGFβ1, 인간 GARP-프로TGFβ1, 및 인간 LRRC33-프로TGFβ1과의 항체 상호작용의 결합 동역학을 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가하였다. 결합 동역학을 비아코어® 8K (지이) 기기를 사용하여 표면 플라즈몬 공명에 의해 평가하였다. 비오티닐화된 항원을 비오틴 CAP 칩 상에 포획하고, 항체의 Fab 단편을 분석물로서 사용하였다. 가변 농도 (0.6 - 10 nM)에서의 Fab 결합에 대한 센소그램을 전반적으로 피팅하여 동역학적 파라미터를 수득하였다.

Fab에 대한 결합 동역학을 4종의 인간 항원, LTBP1-프로TGFb1, LTBP3-프로TGFb1, GARP-프로TGFb1, 및 LRRC33-프로TGFb1 각각에 대해 평가하였다. 데이터를 Fab 농도 0.62 nM, 1.25 nM, 2.5 nM, 5 nM 및 10 nM에서 수집하고, 1:1 결합 모델에 전반적으로 피팅하여 각각의 상호작용에 대한 동역학적 파라미터 및 결합 친화도를 수득하였다. 이들 실험을 반복하였다.

도 2는 TGFβ1의 활성화 억제제이기도 한, 벤치마크로서 사용된 참조 항체와 비교하여 Ab46의 현저하게 개선된 오프 레이트를 입증하는 대표적인 데이터 세트를 보여준다. Fab 형태의 2종의 항체는 유사한 회합 동역학을 보여주지만, Ab46은 참조 항체보다 50배 초과로 더 길게 항원에 결합된 채로 유지된다.

표 22: 비아코어에 의한 Fab 결합 동역학

실시예 3: 활성화된 재조합 잠재성 TGFβ1의 억제를 검출하기 위한 기능적 검정

TGFβ1 활성화의 신규 콘텍스트-의존성 세포-기반 검정의 개발은 미국 특허 가출원 번호 62/538,476에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이전 검정 포맷은 내인성 제시 분자에 의해 제시된 프로TGFβ1의 활성화와 외인성 LTBP에 의해 제시된 프로TGFβ1의 활성화 사이를 구별할 수 없었다. 인테그린-발현 세포를 직접 형질감염시킴으로써, 미국 특허 가출원 번호 62/538,476에 개시되고 본원에 사용된 신규 검정은 내인성 제시자-프로TGFβ1 활성과 외인성 LTBP-프로TGFβ1 활성 사이의 범위를 확립한다. LTBP-프로TGFβ1 복합체가 세포외 매트릭스에 포매되기 때문에, 검정 플레이트 코팅은 또한 검정의 중요한 구성요소이다. ECM 단백질 피브로넥틴으로 코팅된 조직 배양 플레이트의 사용은 LTBP 검정을 보다 강건하게 만들었다.

본원에 기재된 이소형-특이적 항체 중 어느 것이 기능적인지 결정하기 위해, 각각의 공지된 제시 분자: LTBP1, LTBP3, GARP 및 LRRC33에 특이적인 TGFβ1 대형 잠재성 복합체 (LLC)의 αVβ 인테그린 활성화의 세포-기반 검정을 개발하였다. 검정 개발 및 최적화 과정을 통해, 피브로넥틴은 LTBP 제시된 TGFβ1 LLC의 인테그린-의존성 시험관내 활성화를 위한 중요한 ECM 단백질인 것으로 결정되었다.

검정 I. ECM에 침착된 잠재성 TGFβ1의 활성화

세포-기반 효력 검정을 위해, 하기 프로토콜을 개발하였다. 이 검정은 인테그린 세포에 의한 세포외 매트릭스 (LTBP 제시됨) 활성화에 최적이다.

재료:

MvLu1-CAGA12 세포 (클론 4A4)

SW480/β6 세포 (클론 1E7) (αV 서브유닛은 높은 수준으로 내인성으로 발현되고; β6 서브유닛은 안정하게 과다발현됨)

LN229 세포주 (높은 수준의 내인성 αVβ8 인테그린) ATCC® CRL-2611™

코스타 백색 벽 TC 처리된 96 웰 검정 플레이트 #3903

그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One)® 높은 결합 백색 μ투명 96 웰 검정 플레이트 #655094

인간 피브로넥틴 (코닝(Corning)® #354008)

P200 다중채널 피펫

각각에 대한 멸균 필터 팁을 갖는 P20, P200, 및 P1000 피펫

멸균 미세원심분리기 튜브 및 랙

멸균 시약 저장소

0.4% 트리판 블루

2mL, 5mL, 10mL, 및 25mL 멸균 피펫

조직 배양물 처리된 100mm 또는 150mm 플레이트

70%에탄올

Opti-MEM 혈청 감소된 배지 (라이프 테크(Life Tech) #31985-070)

리포펙타민® 3000 (라이프 테크 #L3000015)

브라이트-글로™ 루시페라제 검정 시약 (프로메가® #E2620)

0.25% 트립신 + 0.53mM EDTA

프로TGFβ1 발현 플라스미드, 인간

LTBP1S 발현 플라스미드, 인간

LTBP3 발현 플라스미드, 인간

LRRC32 (GARP) 발현 플라스미드, 인간

LRRC33 발현 플라스미드, 인간

장비:

바이오텍 시너지 H1 플레이트 판독기

TC 후드

벤치 탑 원심분리기

CO₂ 인큐베이터 37C 5% CO2

37℃ 물/비드 조

플랫폼 진탕기

현미경

혈구계/카운테스

정의:

CAGA12 4A4 세포: 루시페라제 유전자 발현을 구동하는 CAGA12 합성 프로모터로 안정하게 형질감염된 MvLu1 세포 (밍크 폐 상피 세포)의 유도체

DMEM-0.1%BSA: 검정 배지; 기초 배지는 DMEM (깁코(Gibco) Cat# 11995-065)이고, 배지는 또한 0.1% w/v로 희석된 BSA, 페니실린/스트렙티노마이신, 및 4mM 글루타민을 함유한다.

D10: DMEM 10% FBS, P/S, 4mM 글루타민, 1% NEAA, 1X 글루타맥스 (깁코 Cat# 35050061)

SW480/β6배지: D10 + 1000μg/mL G-418

CAGA12 (4A4) 배지: D10 + 0.75μg/mL 퓨로마이신

절차:

제0일에, 세포를 형질감염을 위해 시딩하였다. SW480/β6 (클론 1E7) 세포를 트립신으로 탈착시키고 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 세포 펠릿을 D10 배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 5.0 x 10⁶개 세포/12ml/100mm 조직 배양 접시에 시딩하였다. CAGA12 세포의 경우, 세포를 T75 플라스크당 1.0백만개의 밀도로 계대배양하여 제3일에 검정에 사용하였다. 배양물을 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다.

제1일에, 인테그린-발현 세포를 형질감염시켰다. 리포펙타민® 3000 시약으로의 형질감염에 대한 제조업체의 프로토콜을 따랐다. 하기를 Opti-MEM™ I 내로 웰당 125μl로 희석하였다: 7.5μg DNA (제시 분자) + 7.5μg DNA (프로TGFβ1), 30μl P3000, 및 OptiMEM I로 125μl까지. DNA를 함께 피펫팅함으로써 웰을 혼합한 후, Opti-MEM™을 첨가하였다. P3000을 첨가하고, 모든 것을 피펫팅에 의해 잘 혼합하였다. DNA 믹스에 첨가할 리포펙타민® 3000의 마스터 믹스를 제조하였다: LTBP1 검정의 경우: 웰당 15μl 리포펙타민® 3000, OptiMEM I 중 125μl까지; LTBP3 검정의 경우: 웰당 45μl 리포펙타민® 3000, Opti-MEM™ I 중 125μl까지. 희석된 리포펙타민® 3000을 DNA에 첨가하고, 피펫팅에 의해 잘 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 용액을 피펫팅에 의해 수회 혼합한 다음, 접시당 250μl의 DNA:리포펙타민® 3000 (2 x 125μl)을 적가하였다. 각각의 접시를 부드럽게 와류시켜 혼합하고, 접시를 ~24시간 동안 조직 배양 인큐베이터로 되돌렸다.

제1일-제2일에, 검정 플레이트를 인간 피브로넥틴으로 코팅하였다. 구체적으로, 동결건조된 피브로넥틴을 초순수 증류수 (멸균) 중에 1mg/ml로 희석하였다. 1mg/ml 원액을 PBS (멸균) 중에 19.2μg/ml로 희석하였다. 50μl/웰로 검정 플레이트에 첨가하고 (높은 결합), 조직 배양 인큐베이터 (37℃ 및 5% CO₂)에서 O/N 인큐베이션하였다. 최종 농도는 3.0μg/cm²이었다.

제2일에, 형질감염된 세포를 검정 및 억제제 첨가를 위해 플레이팅하였다. 먼저, 이미 검정 플레이트에 있는 피브로넥틴 용액에 200μl/웰 PBS를 첨가함으로써 피브로넥틴 코팅을 세척하였다. 세척액을 다중채널 피펫으로 수동으로 제거하였다. 세척을 총 2회 세척 동안 반복하였다. 세포를 첨가하기 전에 플레이트를 뚜껑을 열어 실온에서 건조되도록 하였다. 이어서, 세포를 트립신으로 탈착시켜 플레이팅하고 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 펠릿을 검정 배지 중에 재현탁시키고, 생존 세포를 ml당 계수하였다. LTBP1 검정의 경우, 세포를 0.10 x 10⁶개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50μl (웰당 5,000개 세포)로 시딩하였다. LTBP3 검정의 경우, 세포를 0.05 x 10⁶개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50μl (웰당 2,500개 세포)로 시딩하였다. 기능적 항체 희석물을 제조하기 위해, 항체를 비히클 중 일관된 작업 농도로 사전-희석하였다. 스톡 항체를 비히클 중에 연속 희석하였다 (PBS가 최적이며, 시트르산나트륨 완충제는 피함). 각각의 포인트의 연속 희석물을 항체의 4X 최종 농도를 위해 검정 배지 내로 희석하였다. 웰당 25μl의 4X 항체를 첨가하고, 배양물을 37℃ 및 5% CO₂에서 ~ 24시간 동안 인큐베이션하였다.

제3일에, TGFβ 리포터 세포를 첨가하였다. 검정을 위한 CAGA12 (클론 4A4) 세포를 트립신으로 탈착시키고 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 펠릿을 검정 배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 0.4 x 10⁶개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50μl (웰당 20,000개 세포)로 시딩하였다. 세포를 인큐베이터로 되돌렸다.

제4일에, 검정을 판독하였다 (항체 및/또는 리포터 세포 첨가 16-20시간 후). 브라이트-글로™ 시약 및 시험 플레이트를 판독 전에 실온이 되도록 하였다. 바이오-텍® 시너지™ H1 상의 판독 세팅은 TMLC_std 프로토콜을 사용하여 설정하였고 - 이 방법은 오토-게인 세팅을 갖는다. 오토스케일 (높음)을 위해 선택된 양성 대조군 웰. 웰당 100μL의 브라이트-글로 시약을 첨가하였다. 실온에서 진탕시키면서 2분 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 광으로부터 보호하였다. 플레이트를 바이오텍 시너지 H1 상에서 판독하였다.

도 27에 도시된 검정을 위해, 하기 프로토콜을 개발하였다. 이 검정 또는 "직접-형질감염" 프로토콜은 인테그린 세포에 의한 세포-표면 제시된 TGFβ1 (GARP 또는 LRRC33 제시자) 활성화에 최적이다.

재료:

MvLu1-CAGA12 세포 (클론 4A4)

SW480/β6 세포 (클론 1E7) (αV 서브유닛은 높은 수준으로 내인성으로 발현되고; β6 서브유닛은 안정하게 과다발현됨)

LN229 세포주 (높은 수준의 내인성 αVβ8 인테그린)

코스타 백색 벽 TC 처리된 96 웰 검정 플레이트 #3903

그라이너 바이오-원(Greiner Bio-One)® 높은 결합 백색 μ투명 96 웰 검정 플레이트 #655094

인간 피브로넥틴 (코닝 #354008) P200 다중채널 피펫

각각에 대한 멸균 필터 팁을 갖는 P20, P200, 및 P1000 피펫

멸균 미세원심분리기 튜브 및 랙

멸균 시약 저장소

0.4% 트리판 블루

2mL, 5mL, 10mL, 및 25mL 멸균 피펫

조직 배양물 처리된 100mm 또는 150mm 플레이트

70% 에탄올

Opti-MEM® 혈청 감소된 배지 (라이프 테크(Life Tech) #31985-070)

리포펙타민® 3000 (라이프 테크 #L3000015)

브라이트-글로™ 루시페라제 검정 시약 (프로메가® #E2620)

0.25% 트립신 + 0.53mM EDTA

프로TGFβ1 발현 플라스미드, 인간

LTBP1S 발현 플라스미드, 인간

LTBP3 발현 플라스미드, 인간

LRRC32 (GARP) 발현 플라스미드, 인간

LRRC33 발현 플라스미드, 인간

장비:

바이오-텍® 시너지™ H1 플레이트 판독기

조직 배양 후드

벤치 탑 원심분리기

CO₂ 인큐베이터 37℃ 5% CO₂

37℃ 물/비드 조

플랫폼 진탕기

현미경

혈구계/카운테스

정의:

CAGA12 4A4 세포: 루시페라제 유전자 발현을 구동하는 CAGA12 합성 프로모터로 안정하게 형질감염된 MvLu1 세포 (밍크 폐 상피 세포)의 유도체

DMEM-0.1% BSA: 검정 배지; 기초 배지는 DMEM (깁코(Gibco) Cat# 11995-065)이고, 배지는 또한 0.1% w/v로 희석된 BSA, 페니실린/스트렙티노마이신, 및 4mM 글루타민을 함유한다.

D10: DMEM 10% FBS, P/S, 4mM 글루타민, 1% NEAA, 1X 글루타맥스 (깁코 Cat# 35050061)

SW480/β6배지: D10 + 1000ug/mL G-418

CAGA12 (4A4) 배지: D10 + 0.75ug/mL 퓨로마이신

방법:

제0일에, 인테그린 발현 세포를 형질감염을 위해 시딩하였다. 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 세포 펠릿을 D10배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 0.1 x 10⁶개 세포/ml로 희석하고, 검정 플레이트에 웰당 100μl (웰당 10,000개 세포)로 시딩하였다. CAGA12 세포의 경우, T75 플라스크당 1.5백만의 밀도로 계대배양하여 제2일에 검정에 사용하였다. 배양물을 37℃ 및 5% CO₂에서 인큐베이션하였다.

제1일에, 세포를 형질감염시켰다. 리포펙타민® 3000 시약으로의 형질감염을 위해 제조업체의 프로토콜을 따랐다. 하기를 OptiMEM® I 내로 웰당 5μl로 희석하였다: 0.1μg DNA (제시 분자) + 0.1μg DNA (프로TGFβ1), 0.4μl P3000, 및 OptiMEM I로 5μl까지. DNA를 함께 피펫팅함으로써 웰을 혼합한 다음, OptiMEM®을 첨가하였다. P3000을 첨가하고, 모든 것을 피펫팅에 의해 잘 혼합하였다. DNA 믹스에 첨가할 마스터 믹스를 리포펙타민® 3000으로 제조하였다: 웰당 0.2μl 리포펙타민® 3000, OptiMEM I 중 5μl까지. 희석된 리포펙타민® 3000을 DNA에 첨가하고, 피펫팅에 의해 잘 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 용액을 피펫팅에 의해 수회 혼합한 다음, 웰당 10μl의 DNA:리포펙타민® 3000 (2 x 5μl)을 첨가하였다. 세포 플레이트를 ~24시간 동안 조직 배양 인큐베이터로 되돌렸다.

제2일에, 항체 및 TGFβ 리포터 세포를 첨가하였다. 기능적 항체 희석물을 제조하기 위해, 비히클 (PBS가 최적임) 중 스톡 항체를 연속 희석하였다. 이어서, 각각의 지점을 항체의 2X 최종 농도를 위해 검정 배지 내로 희석하였다. 항체를 제조한 후, 세포 플레이트를 흡인 (진공 흡인기)에 의해 검정 배지로 2회 세척하고, 이어서 웰당 100μl 검정 배지를 첨가하였다. 2차 세척 후에, 검정 배지를 웰당 50μl의 2X 항체로 대체하였다. 세포 플레이트를 ~15-20분 동안 인큐베이터로 되돌렸다.

검정을 위한 CAGA12 (클론 4A4) 세포를 제조하기 위해, 세포를 트립신으로 탈착시키고, 펠릿화하였다 (200 x g에서 5분 회전). 펠릿을 검정 배지 중에 재현탁시키고, ml당 생존 세포를 계수하였다. 세포를 0.3 x 10⁶개 세포/ml로 희석하고, 웰당 50μl (웰당 15,000개 세포)로 시딩하였다. 세포를 인큐베이터로 되돌렸다.

제3일에, 항체 및/또는 리포터 세포 첨가 약 16-20시간 후에 검정을 판독하였다. 브라이트-글로™ 루시페라제 검정 시스템 (프로메가®) 및 시험 플레이트를 판독 전에 실온이 되도록 하였다. 바이오-텍® 시너지™ H1 상의 판독 세팅은 TMLC_std 프로토콜을 사용하도록 설정하였고 - 이 방법은 오토-게인 세팅을 갖는다. 양성 대조군 웰을 오토스케일 (높음)로 설정하였다. 웰당 100μL의 브라이트-글로 시약을 첨가하였다. 실온에서 진탕시키면서 2분 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 광으로부터 보호하였다. 플레이트를 바이오-텍® 시너지™ H1 상에서 판독하였다.

IC50 값을 계산하기 위해, 미가공 발광 값을 PBS 단독 (비히클)으로 처리된 웰에 대해 정규화하였다. 정규화된 값을 프리즘(PRISM)® 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하고, 값을 3-포인트 비-선형 회귀를 사용하여 계산하였다.

표 23은 이소형-특이적 항체에 대한 계산된 IC50 값을 보여준다. 보고된 IC50 값은 단일 용량-반응 실험의 이중 웰로부터 평균하였고; 용량 반응 곡선 및 IC50 값은 다중 독립적 실험을 대표한다.

표 23: 시험관내 효력 검정에 의해 측정된 바와 같은 프로TGFβ1-제시 분자 복합체에 대한 이소형-특이적 항체에 대한 IC50

실시예 4. 급성 신장 섬유증의 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 모델에서 항-프로TGFβ1 항체에 의한 급성 섬유증의 억제

급성 신장 섬유증의 일측성 요관 폐쇄 (UUO) 모델에서 항-TGFβ1 항체에 의한 급성 섬유증의 억제를 시험하였다. 이 모델에서, 연구 제0일에 수컷 마우스에서 좌측 요관의 영구적 외과적 결찰에 의해 섬유증을 유도하였다. 수술을 받았지만 그의 요관이 폐쇄되지 않은 모의-처리된 마우스를 이들 실험에 건강한 대조군으로서 포함시켰다.

대조군 또는 시험 항체 (Ab3, Ab2)를 연구 제-1일 및 제4일에 마우스에게 복강내 (i.p.) 주사에 의해 투여하였다. 수술 후 제5일 연구 종료 시, 신장을 수집하고, 이들 조직으로부터 RNA를 수거하였다. 후속적으로, 콜라겐 I (Col1a1), 콜라겐 III (Col3a1), 피브로넥틴 1 (Fn1), 리실 옥시다제 (Lox), 리실 옥시다제-유사 2 (Loxl2), 평활근 액틴 (Acta2), 매트릭스 메탈로프로테아제 (Mmp2), 및 인테그린 알파 11 (Itga11)을 포함한 섬유증-연관 유전자의 패널에 대한 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해 섬유증 유도의 정도를 평가하였다 (Rolfe et al., 2007. Sound Repair Regen. 15(6): 897-906) (Tamaki et al., 1994. Kidney Int. 45(2): 525-536) (Bansal et al., 2017. Exp Mol Med. 49(11): e396) (Leaf & Duffield, 2016. J Clin Invest. 127(1): 321-334).

콜라겐 유전자 발현에 대한 Ab2 또는 Ab3 처리의 효과

Col1a1 및 Col3a1은 섬유증의 주요 구동자이다. 도 5a에 제시된 바와 같이, Col1a1은 폐쇄된 신장에서 10- 내지 40-배 유도되고, Col3a1은 5- 내지 25-배 상향조절된다 (P < 0.005, 모의 + IgG 처리된 마우스를 UUO + IgG 군과 비교함). 3, 10, 또는 30 mg/kg/wk의 Ab3으로 처리된 UUO 마우스는 UUO + IgG와 비교하여 둘 다의 콜라겐 유전자의 감소된 발현을 나타낸다 (P < 0.05). 10 mg/kg/wk의 Ab2로의 처리는 또한 UUO에 의한 섬유화 유전자 유도를 억제하였다 (UUO + IgG와 비교하여 P < 0.005). 3 mg/kg/wk Ab2 군으로부터의 샘플도 또한 감소된 Col3a1 발현 경향을 나타내지만, 이러한 효과는 통계적 유의성에 도달하지 못했다. 종합하면, 이들 데이터는 Ab2 또는 Ab3에 의한 TGFβ1 억제가 UUO와 연관된 콜라겐 유도를 강력하게 호전시킨다는 것을 시사한다.

피브로넥틴 및 리실 옥시다제-유사 2 유전자 발현에 대한 Ab2 또는 Ab3 처리의 효과

Fn1 및 Loxl2는 섬유증에서 세포외 매트릭스의 침착 및 강성에서 소정의 역할을 하는 단백질을 코딩한다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 둘 다의 유전자는 UUO + IgG 군으로부터의 샘플에서 상향조절되지만 (P < 0.005 vs. 모의 + IgG), 둘 다의 유전자, 특히 Loxl2에 대한 유전자 발현의 배수 증가는 콜라겐 유전자에 대한 것보다 작다. 3, 10, 또는 30 mg/kg/wk의 Ab3으로 처리된 샘플에서, 감소된 Fn1 및 Loxl2 (vs. UUO + IgG) 경향이 주목되었지만, 이러한 처리 효과는 Loxl2 발현에 대해서만, 3 mg/kg/wk 용량에서만 통계적으로 유의하다 (10 mg/kg/wk 용량에서 Fn1은 통계적 유의성에 근접함, P = 0.07). 그러나, 10 mg/kg/wk Ab2로의 처리는 Fn1 및 Loxl2 둘 다의 고도로 유의한 (P < 0.005 vs UUO + IgG) 억제로 이어진다. 보다 낮은 3 mg/kg/wk 용량의 Ab2는 Fn1 및 특히 Loxl2 둘 다의 감소로 이어지지만 (P = 0.06), 어느 유전자의 억제도 통계적으로 유의하지 않다.

도 6은 UUO 모델에서 처리 후 유전자 발현에서의 변화 (vs. UUO + IgG)의 통계적 유의성을 요약한다. Ab3은 시험된 모든 용량에서 Col1a1 및 Col3a1의 감소를 나타내었다. 통계적으로 유의한 변화가 또한 Itga11 및 Loxl2에서 관찰되었지만 (둘 다의 수준이 UUO + IgG에 비해 감소되었음), 단지 3 mg/kg/wk 용량에서만 관찰되었다. 대조적으로, Mmp2를 제외한 검사된 모든 유전자는 10 mg/kg/wk Ab2로의 처리 후에 통계적으로 유의한 발현 변화를 나타내었다 (모든 수준은 UUO + IgG에 비해 감소됨). Col1a1 및 Lox 발현은 또한 3 mg/kg/wk 용량에서 감소하였다.

실시예 5: 알포트 증후군의 유전 모델에서 항-프로TGFβ1 항체에 의한 TGFβ 신호전달의 억제

뮤린 Col4a3 -/- 모델은 상염색체 열성 알포트 증후군의 확립된 유전 모델이다. 알포트 마우스는 기능적 콜라겐 4A3 유전자가 결여되어 있고 (Col4A3-/-), 따라서 α3, α4, 및 α5 쇄를 필요로 하는 정상 유형 IV 콜라겐 삼량체를 형성할 수 없다. Col4a3-/- 마우스에서는 간질성 섬유증 및 세뇨관 위축을 비롯한 인간 환자에서의 신장 섬유증과 일치하는 신장에서의 섬유증이 발생하고, Col4a3-/- 마우스에서는 마우스의 유전 배경에 따라 10 내지 30주령에 말기 신질환 (ESRD)이 발생한다. Col4a3-/- 마우스에서의 신장 병리상태의 구조적 및 기능적 징후는 ESRD로의 진행과 조합되어 Col4a3-/- 마우스를 신장 섬유증을 이해하기 위한 이상적인 모델로 만든다. 이전의 보고는 이 과정에서 TGFβ 신호전달 경로의 중요성을 지적하고, TGFβ의 공지된 활성인자인 αvβ6 인테그린, 또는 TGFβ 리간드 트랩으로의 치료는 알포트 마우스에서 신 섬유증 및 염증을 예방하는 것으로 보고되어 있다 (Hahm et al., (2007) The American Journal of Pathology, 170(1): 110-125).

TGFβ1 활성화의 이소형-특이적 억제제인 Ab3 및 Ab2를 알포트 마우스에서 신 섬유증을 억제 또는 완화시키는 그의 능력에 대해 하기와 같이 시험하였다.

C57/Bl6 유전적 배경의 Col4a3 +/- 암컷과 교배된 129/Sv 유전적 배경의 Col4a3 +/- 수컷으로부터의 F1 자손을 연구에 사용하였다. 이들 마우스는 전형적으로 4-5주령까지 단백뇨를 나타내고, 전형적으로 14-15주령까지 ESRD로 진행되어, 치료의 효능을 시험하기 위한 우수한 치료 범위를 제공한다.

TGFβ 수용체 활성화가 SMAD2/3의 인산화를 포함한 세포내 사건의 하류 신호전달 캐스케이드로 이어진다는 것은 널리 기록되어 있다. 따라서, TGFβ 신호전달을 억제하는 Ab2 항체 처리의 능력은 제조업체의 지침에 따라 ELISA (셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies))에 의해 검정되는 바와 같이 SMAD2/3의 상대 인산화 수준을 측정함으로써 신장 용해물 샘플에서 평가될 수 있다. 따라서, 9주령 Col4a3-/- 마우스에게 동물 희생 및 조직 수집 48시간 전에 10 mg/kg Ab2를 복강내로 (i.p.) 투여하였다. 도 7a는 인산화된 것 vs. 총 (인산화 및 비인산화된) SMAD2/3의 상대비를 보여주는 그래프를 제공한다. 단일 용량의 Ab2는 9주령 Col4a3 -/- 마우스로부터의 전체 신장 용해물에서 pSMAD2/3 신호전달을 유의하게 억제하기에 충분하였으며, 이는 이 모델에서의 Ab2에 의한 효율적인 표적 결속을 입증한다.

별개의 연구에서, Col4a3 -/- 마우스를 출생 6주 후에 시작하여 Ab2 또는 Ab3으로 처리하였다. 마우스에게 6주의 시험 기간 동안 5 mg/kg 또는 1.5 mg/kg Ab3 또는 1.5 mg/kg Ab2를 매주 2회 i.p. 투여하였다. IgG를 이형접합 (Col4a3+/-; Het) 및 녹아웃 (Col4a3-/-; KO) 마우스 둘 다에서 음성 대조군으로서 사용하였다. 항체 처리 6주 후 (출생 후 12주), 동물을 희생시키고, 분석을 위해 신장을 수집하였다.

도 7b는 Ab3 또는 Ab2로 처리된 동물의 샘플로부터 제조된 전체 신장 용해물에서의 인산화된 것 vs. 총 SMAD2/3의 상대비를 보여준다. 어느 하나의 항체로의 처리는 IgG 처리된 Col4a3-/- 마우스와 비교하여 SMAD2/3의 상대 인산화의 유의한 감소를 나타내었다. 처리된 KO 마우스에서의 평균 SMAD 비는 이형접합 대조군의 것과 등가였다.

TGFβ 억제의 기능적 효과를 평가하기 위해, 신장 섬유증의 Col4a3 -/- 모델에서 제3 연구를 수행하였다. 이 경우에, 출생 6주 후에 시작하여 마우스를 14주령에 희생시킬 때까지 계속하여 마우스를 5 mg/kg 용량의 Ab3 또는 Ab2로 1주 2회 i.p. 처리하였다. 처리 효과를 유전자 발현에 의해 평가하였고, 이는 본 연구에서는 마우스의 신장으로부터 생성된 cDNA를 사용하여 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해 평가하였다. 도 7c는 섬유증과 통상적으로 연관된 3종의 단백질, 즉 콜라겐 1 (Col1a1), 콜라겐 3 (Col3a1), 및 피브로넥틴 1 (Fn1)을 코딩하는 유전자의 발현을 보여준다. IgG 대조군 항체로 처리된 동물로부터의 Col4a3 -/- 신장에서, 모든 3종의 유전자의 발현은 이형접합 Col4a3 +/- 마우스에서의 것에 비해 유의하게 상향조절된다. Ab2로의 처리는 Col4a3 -/- 마우스에서 Col1a1 및 Col3a1의 발현을 유의하게 감소시켰다. Fn1의 발현은 Ab2-처리된 Col4a3 -/- 마우스에서 유사한 경향을 보였지만, 이러한 효과는 통계적으로 유의하지 않았다 (P < 0.09).

실시예 6: 마우스 NASH의 콜린-결핍 고지방 식이 (CDHFD) 모델에서 항-프로TGFβ1 항체에 의한 TGFβ 신호전달의 억제.

콜린 결핍 고지방 식이 (CDHFD)는 비-알콜성 지방간염 (NASH)의 확립된 식이 모델이다. 이 모델에서, 수컷 C57BL/6J 마우스에게 콜린 결핍, 0.1% 메티오닌, 고지방 식이를 12주 동안 공급하였다. CDHFD의 시작 3 내지 6주 후에, α-sma 단백질 (간 성상 세포의 활성화에 대한 마커)의 발현이 증가하고, 간 섬유증의 발생은 간내 콜라겐 합성 및 침착의 상승을 동반하는 히드록시프롤린 함량의 증가를 동반한다 (Matsumoto et al., Int J Exp Pathol. 2013 Apr;94(2):93-103).

Ab3 및 Ab2를 CDHFD 중인 마우스에서 간 섬유증을 억제하고/거나 그의 정도를 감소시키는 그의 능력에 대해 하기와 같이 시험하였다.

시험 코호트의 동물은 연구 기간 동안 CDHFD 중이었다. 마우스의 별개의 코호트에 연구 대조군으로서 정규 사료 식이를 투여하였다. 항체 Ab3 및 Ab2를 CDHFD 시작 4주 후에 시작하여 복강내 (i.p.) 주사에 의해 마우스에게 투여하였다. 항체 시험 농도는 하기와 같았다: 8주 (즉, 제4주에서 제12주)의 시험 기간 동안 15mg/kg, 5mg/kg 또는 1.5mg/kg 1주 2회 (즉, 30, 10, 또는 3 mg/kg/주). IgG 이소형 항체를 15mg/kg으로 매주 2회 (30 mg/kg/주) 음성 대조군으로서 사용하였다. 투여 8주 후, 동물을 희생시키고, 분석을 위해 간을 수집하였다.

또한 혈청 측정을 행하여 연구 동안 순환 항체 노출을 결정하였다. 제6주, 제8주, 및 제10주에 Ab2 투여 72시간 후에 혈청 샘플을 수집하였다. 제12주에, 동물에게 최종 Ab2 주사를 제공하고, 주사 6시간 후 및 희생 시점에 혈청을 채취하였다. 도 8a는 연구 기간 동안의 Ab2의 혈청 수준을 보여주며, 이는 본 발명자들이 연구 전반에 걸쳐 혈청 내의 Ab2 노출 수준을 정량화할 수 있다는 것을 나타낸다. 15 및 5 mg/kg (2x/주)의 Ab2의 2종의 최고 시험 용량은 투여 8주에 걸친 항-약물 항체의 상승에 의한 임의의 추정되는 효과에도 불구하고 연구 전반에 걸쳐 최상의 적용범위를 제공한다 (van Brummelen et al., The Oncologist. 2016 Jul;21:1-9).

TGFβ1 수용체 결속은 SMAD2 및 SMAD3의 인산화를 포함한 세포내 신호전달 사건으로 이어진다. 따라서, Ab3 및 Ab2를 제조업체의 프로토콜에 따라 ELISA (셀 시그널링 테크놀로지스)에 의해 CDHFD-처리된 마우스로부터의 간 용해물에서 SMAD2/3을 억제하는 그의 능력에 대해 시험하였다. 도 8b에 제시된 바와 같이, Ab2는 IgG 대조군과 비교하여 인산화된 SMAD2/3의 상대비를 유의하게 감소시켰다. 도 8c는 Ab2의 혈청 수준과 인산화된 SMAD2/3 사이의 역 상관관계를 입증한다. 도 8d는 Ab2가 CDHFD 중인 Ab3 및 IgG 처리된 마우스와 비교하여 SMAD2/3의 인산화를 유의하게 감소시킨다는 것을 보여준다 (예를 들어, 1.5 mg/kg 용량 참조).

히드록시프롤린은 원섬유성 콜라겐에 대한 서명 아미노산이고, 단백질의 대략 13.5%를 구성한다. 간에서 발생하는 섬유증은 만성 간염, 간 경화증, 간암, 폐 섬유증 및 사구체신염으로 발달할 능력을 갖는다 (Qui et al., 2014 Mol.Med. Reports 2014 10;1157-1163). 히드록시프롤린은 섬유증의 중증도의 중요한 진단 지표로서 작용한다. 도 8e에 제시된 바와 같이, Ab3 및 Ab2로의 처리를 받고 있는 동물은 IgG 대조군 Ab가 투여된 대조군 CDHFD 동물과 비교하여 콜라겐 침착의 현저한 감소를 입증하였고, 이는 양성 처리 효과를 나타낸다.

CDHFD-처리된 마우스로부터의 간에서 유형 1 콜라겐 침착의 수준을 평가하기 위해, 레이카 본드 RX 염색 시스템을 사용하여 항-마우스 유형 I 콜라겐 항체 (토끼 폴리클로날; 압캠(Abcam); ab21286)에 대한 면역조직화학 (IHC) 프로토콜을 개발하였다. 마우스 간을 수집하고, 실온에서 24시간 동안 10% 중성 완충 포르말린 (NBF) 중에 고정시켰다. 이어서, 고정된 간을 3-5 mm 단면으로 트리밍하고, 파라핀 침윤 및 포매를 위해 프로세싱될 때까지 70% 에탄올 중에 저장하였다. 파라핀 포매된 간을 4μm로 절편화하고, IHC 염색을 위해 슬라이드 상에 마운팅하였다. 유형 1 콜라겐 1차 항체를 매칭되는 이소형 1차 대조군 (토끼 모노클로날 IgG; 셀 시그널링 테크놀로지스(Cell Signaling Technologies); 3900S)과 함께 5μg/mL 최종 농도로 사용하였다. 에피토프 회복은 100℃에서 20분 동안 인큐베이션된 pH 6 시트레이트 완충제를 사용하여 수행하였다. 슬라이드를 트리스-기반 완충제 중에서 세척하고, 퍼옥시드 차단 시약과 함께 인큐베이션한 다음, 완충제 중에서 3x 세척하고, 단백질 차단 시약과 함께 20분 동안 인큐베이션한 후, 30분 1차 항체 인큐베이션하였다. 슬라이드를 다시 완충제로 세척한 후, 레이카 HRP-중합체 접합체와 함께 8분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 슬라이드를 완충제 중에서 2x 및 탈이온 (DI)수 중에서 1x 세척한 후, 레이카 디아미노벤지딘 (DAB) 발색원과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 슬라이드를 DI 수로 3x 세척한 후, 헤마톡실린으로 5분 동안 대조염색하였다. 최종 세척 단계 후, 염색된 IHC 슬라이드를 탈수시키고, 크실렌 기반 마운팅 배지를 사용하여 커버슬립을 덮었다.

염색된 슬라이드를 아페리오 AT2 전체 슬라이드 스캐너로 영상화하기 위해 히스토톡스 랩스(HistoTox Labs)로 보내고, 콜라겐 염색을 비지오팜(Visiopharm) 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 조직 주변을 디지털 추적하고, 분석을 위해 각각의 영역을 표시함으로써 관심 영역 (ROI)을 선택하였다. 접힘이나 찢어짐을 나타내는 조직 영역은 분석에서 제외하였다. 영상의 각각의 픽셀을 높은 양성, 중간 양성, 낮은 양성, 또는 음성 염색 면적으로 분류하는 강도-기반 역치화 알고리즘을 사용하여 총 콜라겐 양성 면적을 측정하였다. 총 높은, 중간, 및 낮은 픽셀 면적을 단일 양성 값으로서 함께 합산하고, 조직의 총 분석 면적으로 나누어, 조직에서 콜라겐 양성 면적의 백분율을 생성하였다. 도 8f에 제시된 바와 같이, Ab2로의 15 mg/kg 처리를 받고 있는 동물은 대조군 CDHFD 동물보다 더 적은 총 콜라겐 I 양성 면적을 가졌다. 도 8g에서, Ab2 처리된 동물은 그의 연구 종료 노출 수준과 그의 콜라겐 IHC 양성 면적 사이에서 역 상관관계를 나타내었고; 높은 노출을 갖는 동물은 IHC에 의해 훨씬 더 적은 콜라겐 함량을 나타내었으며, 이는 간에서의 섬유증의 보다 낮은 수준을 나타낸다.

실시예 7: 간 섬유증의 CCL₄ 모델에서 항-프로TGFβ1 항체에 의한 TGFβ 신호전달의 억제.

마우스의 사염화탄소 (CCl₄) 처리는 널리-특징화된 간 섬유증 모델이다. 이 모델에서, Balb/C 마우스에게 체중 그램당 옥수수 오일 중 20% CCl₄ 용액 2.5μl를 매주 2회 복강내로 (i.p.) 투여하였다. 이러한 CCl₄ 투여는 연구 기간 (6주) 전반에 걸쳐 유지되었다. CCl₄ 투여의 2주 후에, 시험 물품의 투여를 시작하였다. 마우스에게 매주 2회 용량의 15mg/kg, 5mg/kg 또는 1.5mg/kg의 Ab2 또는 Ab3를 1주 2회 (즉, 30, 10, 또는 3 mg/kg/주), 매주 2회 5 mg/kg (10 mg/kg/주) 용량의 범-TGFβ 항체 1D11, 또는 매주 2회 용량의 15mg/kg (30 mg/kg/주)의 대조군 IgG 항체를 i.p. 투여하였다. 6주의 CCl₄ 투여 (4주의 항체 처리) 후, 마우스를 희생시키고, 간 조직을 수집하였다.

히드록시프롤린 검정 (상기 설명 참조)을 사용하여 본 연구로부터의 간 용해물에서 섬유증을 측정하였다. 도 9는 본 검정의 결과를 보여주며, 여기서 모든 용량의 Ab3 또는 높은 (15 mg/kg) 용량의 Ab2로의 처리는 간 히드록시프롤린에서 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다. 보다 낮은 용량의 Ab2 (5 또는 1.5 mg/kg)로 처리된 마우스는 감소된 간 히드록시프롤린 경향을 나타내었지만, 이들 차이는 이러한 모델에서의 실험적 변동으로 인해 통계적으로 유의하지 않았다. 둘 다의 TGFβ1-특이적 항체의 처리 효과는 범-TGFβ 억제제 1D11의 것과 유사하였다.

실시예 8. HDX-MS에 의한 Ab3 및 Ab2에 대한 결합 영역의 결정.

수소/중수소 교환 질량 분광측정법 (HDX-MS)은 용액 중 단백질 입체형태를 조사하는데 널리 사용되는 기술이다. HDX-MS 방법론은, 예를 들어 문헌 [Wei et al., Drug Discov Today. 2014 January; 19(1): 95-102; Engen JR. Anal Chem. 2009 Oct 1;81(19):7870-5]에 기재되어 있고, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. HDX-MS는 단백질 백본 아미드 수소의 용액 중 중수소로의 교환에 의존한다. 약한 수소 결합에 수반되거나 단백질의 표면에 위치하는 백본 아미드 수소는 빠르게 교환될 수 있는 반면, 내부에 매립되거나 수소 결합을 안정화하는데 수반되는 것은 보다 느리게 교환된다. 예를 들어 질량 분광측정법에 의해 검출될 수 있는 수소 (1 Da)와 중수소 (2 Da) 사이의 질량 차이에 기초하여, H-D 교환을 시간 경과에 따라 모니터링할 수 있다. 따라서, 백본 아미드 수소의 HDX 비율을 측정함으로써, 단백질 역학, 입체형태 및 단백질-단백질 상호작용, 예컨대 항체-항원-결합에 대한 정보를 수득할 수 있다.

에피토프 맵핑을 위한 통찰을 얻기 위해, HDX-MS를 수행하여 Ab3-항원-결합에 수반되는 프로TGFβ1의 결합 영역 (예를 들어, 프로TGFβ 복합체에서 Ab3이 결합하는 곳)을 결정하였다. HDX-MS에서, 항체에 의해 단단히 결합된 항원의 영역은 단백질-단백질 상호작용으로 인해 양성자 교환으로부터 보호되는 반면, 용매에 노출된 영역은 양성자 교환을 용이하게 겪을 수 있다. 이에 기초하여, 항체의 특이적 결합에 의해 보호되는 항원 내의 결합 영역을 확인하였다.

프로-도메인의 위치 4에서의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 변형된 프로TGFβ1 복합체 (프로TGFβ1 C4S) (WO 2014/182676에 기재됨)를 사용하여 HDX-MS에 의해 Ab3 결합을 평가하였다. 프로TGFβ1 동종이량체로부터의 시스테인은 제시 분자, 예컨대 LTBP, GARP 및 LRRC33과 공유 결합을 형성하는데 수반되는 것으로 공지되어 있다. 1:3 몰비의 프로TGFβ1 대 Ab3 Fab를 실험에 사용하였다. 결과를 도 10a에 요약한다. 제시된 바와 같이, Ab3 Fab에의 결합 시 H/D 교환이 유의하게 보호되는 프로TGFβ1 내의 적어도 3개의 영역 (도 10a에서 영역 1, 2 및 3으로 표지됨)이 존재하며, 이는 이들 영역 또는 그의 부분이 프로TGFβ1에 대한 Ab3의 결합 영역(들)을 나타낼 수 있음을 시사한다. 영역 1 (SQGEVPPGPLPEAVLALYNST; 서열식별번호: 258)은 프로TGFβ1에서 해상된 모든 펩신 펩티드 중에서 가장 높은 H/D 교환을 발생시켰고, 이는 프로TGFβ1의 프로도메인 내의 잠재성 라쏘 상에 맵핑된다. 유의한 H/D 교환 보호를 나타내는 다른 2개의 영역은 영역 2 (LREAVPE; 서열식별번호: 259) 및 영역 3 (YHANFCLG; 서열식별번호: 260)이고, 이는 각각 프로TGFβ1의 프로도메인 및 성장 인자 부분 내의 α3 헬릭스 상에 맵핑된다. 모든 3종의 프로TGFβ 이소형을 비교한 영역 1 및 2의 아미노산 서열 정렬은 이들 영역에서의 유의한 서열 다양성을 보여주었고 (도 10b 참조), 따라서 다른 이소형에 비해 프로TGFβ1에 대한 Ab3의 특이성에 대한 구조적 논점을 제공한다.

프로TGFβ1에 대한 Ab2의 결합 메카니즘에 대한 추가의 구조적 통찰을 얻기 위해, 본 발명자들은 Ab2 Fab로 1:3 몰비의 프로TGFβ1 대 Ab2 Fab를 사용하여 프로TGFβ1 C4S에 대해 HDX-MS를 수행하였다 (도 10c 참조). 도 10c에 제시된 바와 같이, 유의한 H/D 교환 보호를 나타내는 프로TGFβ1 내의 적어도 3개의 영역이 존재하며, 이는 이들 영역 또는 그의 부분이 프로TGFβ1 내의 Ab2의 결합 영역(들)을 나타낼 수 있음을 시사한다. 영역 1 (SPPSQGEVPPGPLPEAVLALYNST; 서열식별번호: 261)은 프로TGFβ1에서 해상된 모든 펩신 펩티드 중에서 가장 높은 H/D 교환을 나타내었고, 이는 프로TGFβ1의 프로도메인 내의 잠재성 라쏘 상에 맵핑된다. 영역 2 (LREAVPE; 서열식별번호: 259) 및 3 (WKWIHEPKGYHANFCLG; 서열식별번호: 262)은 각각 프로TGFβ1의 프로도메인 및 성장 인자 부분 내의 α3 헬릭스 상에 맵핑된다. 모든 프로TGFβ 이소형 -1. -2, 및 -3을 비교한 영역 1 및 2의 아미노산 서열 정렬은 이들 영역에서의 서열 다양성을 나타내었고 (도 10d 참조), 다른 이소형에 비해 프로TGFβ1에 대한 Ab2의 특이성에 대한 구조적 논점을 제공할 수 있다.

실시예 9: X선 결정학에 의한 Ab2에 대한 프로TGFβ1 결합 영역의 결정

프로TGFβ1 내의 Ab2의 에피토프는 인간 프로TGFβ1:Ab2-Fab:AbX-Fab의 3원 복합체의 결정 구조를 해석함으로써 추가로 규명되었다. 이 작업에서, 인간 프로TGFβ1의 전장 서열 (유니프롯 ID P01137)에 기초하여 잔기 30-390에 걸쳐 있는 절단불가능한 인간 프로TGFβ1 C4S/R249A 변이체를 사용하였다. 본 문헌의 나머지에 사용될 넘버링 시스템은 프로TGFβ 이소형에 대한 신호 서열의 제거 후에 제1 아미노산 잔기로서 위치 1을 지정할 것이다. C4S 돌연변이는 프로TGFβ1이 임의의 공지된 제시 분자, 예를 들어 LTBP 및 GARP에 공유 가교될 수 없게 하는 반면, R249A는 프로TGFβ1이 프로단백질 컨버타제/푸린 프로테아제 절단에 저항성이게 하여, 프로TGFβ1을 그의 비절단된, 프로단백질 형태로 유지시킨다. 프로TGFβ1 C4S/R249A를 키푸넨신-처리된 expi293 포유동물 발현 시스템에서 C-말단 6x-His 태그부착된 (서열식별번호: 302) Ab2-Fab와 공동-발현시켜 N-연결된 글리코실화 사건을 감소시켰다. 프로TGFβ1 C4S/R249A:Ab2-Fab를 친화도 정제하고, 엔도글리코시다제 H로 처리하고, 겔 여과에 의해 정제하였다. 이어서, 프로TGFβ1 C4S/R249A:Ab2-Fab 복합체를 AbX-Fab와 함께 인큐베이션하여 3원 복합체를 생성하였다. 이와 관련하여 AbX Fab를 보조 단백질로서 사용하였으며, 이는 결정화 샤페론으로서 작용하여 단백질 결정을 수득할 확률을 증가시켰다.

결정화 실험을 실온에서 시팅 드롭 포맷으로 수행하였다. 18% 폴리에틸렌 글리콜 6000, 0.2 M MgCl₂, 0.1 M 아세트산나트륨 완충제, pH 5.0을 사용하여 X선 분석에 적합한 결정을 수득하였다. 결정을 25% 글리세롤로 보충된 모액 중에 침지시킴으로써 동결보호하고, 액체 질소 중에서 급속 동결시켰다. X선 회절 데이터를 덱트리스 아이거(Dectris Eiger) 16M 검출기를 사용하여 아르곤 국립 실험실 (ANL)에서 어드밴스드 포톤 소스 (APS)의 SER-CAT 빔라인 22-ID에서 수집하였다. 회절 영상을 2:2:2 복합체의 1/2를 함유하는 비대칭 유닛을 사용하여 공간군 C2221에서 X선 검출기 소프트웨어 (XDS)로 프로세싱하였다. 3원 복합체의 구조를 페이저(Phaser)를 사용하여 분자 대체에 의해 해석하였다. Ab2-Fab를 동일한 인간 배선 IGKV1-39/IGHV3-23 (PDB ID 5I19)의 Fab 구조를 사용하여 모델링하였다. AbX-Fab를 인간 배선 IGHV1/IGKV3-11 (PDB ID 5I16)의 Fab 구조를 사용하여 모델링하였다. 프로TGFβ1 단량체의 코어는 이전에 보고된 프로TGFβ1의 결정 구조 (PDB ID 5VQP)를 사용하여 모델링하였다. 구조를 Coot로 수동으로 재구축하고, Refmac5를 사용하여 3.4 Å의 최종 해상도로 각각 R_워크 및 R_프리 값 21% 및 29%로 정밀화하였다.

본 발명의 결정 형태에서, 프로TGFβ1은 결정학적 2-폴드 축 상에 위치하는 동종이량체로서 존재하여, 비대칭 단위는 1개의 프로TGFβ1 단량체 및 2개의 Fab를 함유하고, 전체 복합체는 2:2:2 화학량론을 갖는다 (도 11). Ab2-Fab 및 AbX-Fab는 프로TGFβ1에의 결합에 대해 경쟁하지 않는다. 이러한 사실과 일치하게, 프로TGFβ1 상의 그의 결합 에피토프는 공간적으로 떨어져 있다. Ab2-Fab는 잠재성 라쏘 내의 프로TGFβ1의 프롤린-풍부 루프 내의 잔기 35-43에 의해 형성된 선형 에피토프에 결합한다. 프로TGFβ1의 Pro40 및 Pro41은 이들이 각각 Ab2-Fab의 H-CDR3 및 H-CDR1의 Trp104 및 Tyr59와의 파이 스태킹 상호작용에서 결속되기 때문에 결합을 위해 특히 중요하다. 성장 인자 잔기 (R274, K280, H283)에서 Ab2 Fab의 중쇄 (S101, G102 H103) 및 경쇄 (Y49) 잔기와의 관련 상호작용이 또한 존재한다. 마지막으로, TGFβ 패밀리에 걸친 잠재성 라쏘에서의 에피토프 영역의 서열 정렬은 유의한 다양성을 나타내었고, 이는 TGFβ 패밀리에서의 다른 관련 구성원, 예를 들어 TGFβ2, TGFβ3에 비해 Ab2의 정교한 특이성을 제공한다. 프로TGFβ1과 Ab2-Fab 사이의 상호작용에 대한 에피토프 및 파라토프를 표 24에 열거한다.

표 24. 프로TGFβ1과 Ab2-Fab 사이의 상호작용에 대한 에피토프 및 파라토프. 문자 h 및 l은 각각 중쇄 및 경쇄를 나타낸다.

실시예 10. Ab3 및 Ab2는 ALK5 키나제 억제제 LY2109761 및 범-TGFβ 항체와 비교하여 감소된 독성을 나타낸다

소분자 TGF-β 유형 I 수용체 (ALK5) 키나제 억제제 LY2109761 (CAS 번호 700874-71-1) 및 범-TGFβ 항체 (hIgG4; 모든 3종의 TGFβ 성장 인자를 중화시킴)와 비교하여 Ab3 및 Ab2의 잠재적 생체내 독성을 평가하기 위해, 래트에서 독성 연구를 수행하였다. 이러한 독성학 연구를 위한 종으로서 래트의 선택은 래트가 마우스와 비교하여 TGFβ 억제에 보다 감수성이라는 이전 보고에 기초하였다. 래트에서 관찰된 유사한 독성은 또한 다른 포유동물 종, 예컨대 개, 비-인간 영장류, 뿐만 아니라 인간에서 관찰되었다.

암컷 피셔344 래트 (도 12a 및 12b) 또는 스프라그 돌리 (SD) 래트에게 Ab3 3 mg/kg (1개의 군, n=5), 10 mg/kg (1개의 군, n=5), 30 mg/kg (1개의 군, n=5), 또는 100 mg/kg (1개의 군, n=5); Ab2 10 mg/kg (1개의 군, n=5), 30 mg/kg (1개의 군, n=5), 또는 100 mg/kg (1개의 군, n=5); 범-TGFβ 항체 3 mg/kg (1개의 군, n=5), 10 mg/kg (1개의 군, n=5), 30 mg/kg (1개의 군, n=5), 또는 100 mg/kg (1개의 군, n=5); LY2109761 200 mg/kg (1개의 군, n=5) 또는 300 mg/kg (1개의 군, n=5); 또는 PBS (pH 7.4) 비히클 대조군 (1개의 군, n=5)을 투여하였다.

범-TGFβ 항체를 제공받는 동물에게 10 mL/kg의 부피로 1회 정맥내로 (제1일에) 투여하고, 제8일에 희생시키고, 부검을 수행하였다. Ab3 또는 Ab2를 제공받는 동물에게 10 mL/kg의 부피로 4주 동안 매주 1회 투여하였다. LY2109761을 제공받는 동물에게 경구 위관영양에 의해 5일 또는 7일 동안 1일 1회 투여하였다. 동물을 희생시키고, 부검을 수행하였다.

도 12a 및 표 25에 제시된 바와 같이, 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 번호 WO/2018/129329에 기재된 바와 같은 LY2109761이 투여된 동물에서 기재된 것과 유사한 독성을 나타내었다. 구체적으로, ≥ 3 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 LY2109761이 투여된 동물에서 기재된 것과 유사한 심장 판막 소견 (예를 들어, 판막증)을 나타내었다. ≥30 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 LY2109761이 투여된 동물에서 기재된 것과 유사한 심방 소견을 나타내었다. 100 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 LY2109761이 투여된 동물에서 기재된 것과 유사한 심근 소견을 나타냈고, 30 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 동물은 심근에서 출혈이 있었다. 100 mg/kg의 범-TGFβ 항체가 투여된 1마리의 동물은 관상 동맥에서 출혈을 동반한 중간 정도의 벽내 괴사를 가졌으며, 이는 경미한 혈관주위 혼합 염증 세포 침윤과 연관되었다. 범-TGFβ 항체 및 LY2109761이 투여된 동물에서의 골 소견은 육안상 비정상적으로 형상화된 흉골, 및 현미경상 흉골의 종말판 및 대퇴골 및 경골의 성장판에서의 비대성 구역의 증가된 두께로 이루어졌다. 도 12c에 제시된 바와 같은 LY2109761 및 범-TGFβ를 사용한 상이한 래트 계통 (SD 래트)에서의 후속 연구도 또한 유사한 독성을 입증하였다.

표 25. 범-TGFβ 항체를 제공받은 동물에서의 현미경상 심장 소견

그러나, 범-TGFβ 항체 또는 LY2109761-처리된 동물과 달리, 4주 동안 Ab3 또는 Ab2가 투여된 동물은 어떠한 래트 계통에서도 관찰가능한 시험 물품-관련 독성을 나타내지 않았고, Ab3 및 Ab2 둘 다에 대한 NOAEL은 시험된 최고 용량인 100 mg/kg 매주 용량이었다 (도 12b 및 12d).

요약하면, 4주의 기간에 걸쳐 시험된 모든 용량 (10 mg/kg, 30 mg/kg 또는 100 mg/kg)의 Ab3 또는 Ab2로 처리된 동물은 하기 파라미터 중 어떠한 것에서도 배경을 초과하는 독성 효과를 나타내지 않았다: 심근 변성 또는 괴사, 심방 출혈, 심근 출혈, 판막 출혈, 판막 내피 증식증, 판막 기질 증식증, 심장 판막에서의 혼합 염증 세포 침윤, 무기질화, 관상 동맥에서의 출혈을 동반한 괴사, 대동맥 근부에서의 염증을 동반한 괴사, 심근세포에서의 괴사 또는 염증 세포 침윤, 및 판막증. Ab3 (피셔 래트에서 및 SD 래트에서) 및 Ab2 (SD 래트에서) 둘 다에 대한 NOAEL은 시험된 최고 용량인 100 mg/kg의 매주 용량이었다. 따라서, TGFβ1 활성화의 이소형-특이적 억제제로의 처리는 놀랍게도 범-TGFβ 억제와 비교하여 유의하게 개선된 안전성 프로파일, 예를 들어 감소된 사망률, 감소된 심장독성, 및 감소된 골 소견을 발생시켰다.

실시예 11: TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3의 상대 발현의 생물정보학적 분석

암성 종양에서 TGFβ 이소형의 발현을 평가하기 위해, 공중 이용가능한 데이터세트로부터 유전자 발현 (RNAseq) 데이터를 검사하였다. 더 캔서 게놈 아틀라스 (TCGA)에서 TGFβ 이소형의 발현을 검사하기 위해 공중 입수가능한 온라인 인터페이스 툴 (파이어브라우즈(Firebrowse))를 사용하여, 정상 및 암성 조직 둘 다에서 TGFβ 이소형을 코딩하는 RNA의 차등 발현을 먼저 검사하였다. 정상 조직 비교자가 존재하는 TCGA 데이터베이스에서의 모든 종양 RNAseq 데이터세트를 선택하고, TGFB1, TGFB2, 및 TGFB3 유전자의 발현을 검사하였다 (도 13a). 파이어브라우즈 인터페이스로부터의 데이터는 백만개 킬로염기당 판독물 (RPKM)의 log2로서 나타내어진다.

이들 데이터는 대부분의 종양 유형 (회색)에서, TGFB1이 TGFβ 이소형의 가장 풍부하게 발현된 전사체이며, log2 (RPKM) 값은 일반적으로 TGFB2의 경우 0-2 및 TGFB3의 경우 2-4 vs. 4-6의 범위라는 것을 시사한다. 본 발명자들은 또한 여러 종양 유형에서, TGFB1 및 TGFB3 발현 둘 다의 평균 수준이 정상 비교자 샘플 (흑색)에 비해 상승된다는 것에 주목하며, 이는 이들 TGFβ 이소형의 증가된 발현이 암성 세포와 연관될 수 있다는 것을 시사한다. 암 미세환경에서 숙주 면역계를 억제하는데 있어서 TGFβ 신호전달의 잠재적 역할 때문에, 본 발명자들은 TGFB1 전사체가 항-PD-1 또는 항-PD-L1 요법이 승인된 암 유형에서 상승되었다는 것에 관심을 갖고 주목하였고 - 이들 적응증은 도 13a에서 회색으로 라벨링한다.

RPKM > 1은 일반적으로 생물학적으로 관련된 유전자 발현과 연관된 최소 값인 것으로 간주되지만 (Hebenstreit et al., Molecular Systems Biology (2011) 7:497; Wagner et al., Theory Biosci. 2013 Sep;132(3):159-64), 후속 분석에서는 가양성을 피하기 위해 RPKM (또는 관련된 측정 FPKM (문헌 [Conesa et al., Genome Biology vol. 17: 13 (2016)] 참조)의 > 10 또는 > 30의 보다 엄격한 컷오프를 사용하였음에 주목한다. 비교를 위해, 이러한 역치 3개 모두를 도 13a에 나타낸다.

도 13a에서의 큰 사분위간 범위는 개별 환자 사이의 TGFβ 이소형 발현에서의 유의한 가변성을 나타낸다. 적어도 환자 집단의 하위세트가 TGFβ1 이소형을 차등 발현하는 종양을 갖는 암을 확인하기 위해, TCGA 데이터세트에서 개별 종양 샘플로부터의 RNAseq 데이터를 분석하여, 백만개 킬로염기당 단편 (FPKM)의 수를 계산하였다. FPKM은 동일한 전사체의 대향 말단에서 이중-계수 판독물을 교정하지만, RPKM 및 FPKM은 대략 등가이다 (Conesa et al., Genome Biology vol. 17: 13 (2016)). 전사체의 FPKM 값이 >30인 경우에 종양 샘플을 TGFβ1, TGFβ2, 또는 TGFβ3 발현에 대해 양성으로서 점수화하고, 각각의 TGFβ 이소형을 발현하는 각각의 암 유형의 환자의 분율 (%로서 표현됨)을 계산하였다 (도 13b).

도 13b에 제시된 바와 같이, TGCA 데이터세트에서의 대부분의 종양 유형은 TGFβ1 양성인 개별 샘플의 유의한 백분율을 보여주며, 급성 골수성 백혈병, 미만성 대 B-세포 림프종, 및 두경부 편평 세포 암종을 포함한 일부 암 유형은 모든 종양 샘플의 80% 초과에서 TGFβ1을 발현한다. 도 13a의 데이터와 일치하게, 보다 적은 암 유형이 TGFβ2 또는 TGFβ3에 대해 양성이지만, 유방 침습성 암종, 중피종, 및 육종을 포함한 여러 암이 동등하거나 보다 큰 백분율의 TGFβ3 양성인 종양 샘플을 나타낸다. 이들 데이터는 암 유형이 TGFβ 이소형 발현에 대해 계층화될 수 있고, 이러한 계층화가 TGFβ 이소형-특이적 억제제를 사용한 치료를 위한 후보인 환자를 확인하는데 유용할 수 있다는 것을 시사한다.

이러한 가설을 추가로 조사하기 위해, 개별 종양 샘플의 하위세트로부터의 log2(FPKM) RNAseq 데이터를 열 지도에 플롯팅하고 (도 13c), FPKM > 30을 TGFβ 이소형-양성으로 점수화될 최소 전사체 수준으로서 반영하도록 컬러 역치를 설정하였다.

각각의 샘플은 열 지도에서 단일 행으로서 제시되고, 샘플은 TGFβ1 발현 수준별로 배열된다 (상단이 가장 높은 발현 수준). 도 13b에서의 분석과 일치하게, 각각의 암 유형에서 유의한 수의 샘플이 TGFβ1 발현에 대해 양성이다. 그러나, 이러한 표현은 또한 많은 종양이 특히 식도 암종, 방광 요로상피, 폐 선암종, 및 피부 흑색종 암 유형에서 TGFβ1 전사체만을 발현한다는 사실을 강조한다. 흥미롭게도, 이러한 TGFB1 편중은, 유방 침습성 암종으로부터의 샘플이 TGFβ1 양성인 샘플보다 TGFβ3-양성인 샘플의 수가 훨씬 더 많다는 것을 나타내었기 때문에, 모든 암의 특색은 아니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 분석은 β1 이소형이 다수의 암 환자로부터의 종양에 존재하는 우세한, 대부분의 경우에 유일한 TGFβ 패밀리 구성원이라는 것을 나타낸다. TGFβ 신호전달이 암 미세환경에서 면역억제에 유의한 역할을 한다는 것을 시사하는 데이터와 함께, 이들 발견은 또한 이들 종양의 치료에서의 TGFβ1-특이적 억제의 유용성을 가리킨다.

암 치료제로서 TGFβ1-특이적 억제의 효능을 시험하기 위한 마우스 모델을 확인하기 위해, 마우스 동계 종양 모델에서 사용된 다양한 세포주로부터의 RNAseq 데이터에서 TGFβ 이소형 발현을 분석하였다. 이러한 분석을 위해, 2종의 데이터 표현을 생성하였다. 먼저, 도 3의 데이터와 유사하게, 본 발명자들은 각각의 세포주로부터 유래된 종양에 대한 log2(FPKM) 값의 열 지도를 생성하였다 (도 13d, 좌측). 이러한 분석을 사용하여 TGFB2 및 TGFB3 음성인 높은 TGFB1을 발현하는 동계 모델을 확인하였기 때문에, 본 발명자들은 주로 가음성을 피하는 것에 관심을 가졌고, 본 발명자들은 본 발명자들의 "양성" 역치를 도 13b 및 13c의 표현에서의 것보다 훨씬 낮게 FPKM>1로 설정하였다.

도 13d (좌측)의 데이터 표현이 명백해짐에 따라, 통상적으로 MC-38, 4T-1, 및 EMT6을 포함한 다수의 동계 종양은 유의한 수준의 TGFβ1 및 TGFβ3 둘 다를 발현한다. 대조적으로, A20 및 EL4 모델은 TGFβ1을 거의 독점적으로 발현하고, S91 및 P815 종양은 TGFB1 발현에 대한 강한 편향을 나타낸다.

TGFβ1 vs TGFβ2 및/또는 TGFβ3의 차등 발현을 추가로 평가하기 위해, log2(FPKM_TGFB1) - log2(FPKM_TGFB2) 또는 log2(FPKM_TGFB1) - log2(FPKM_TGFB3)의 보다 작은 값으로 정의되는 minΔTGFβ1을 계산하였다. 각각의 모델에 대한 minΔTGFB1이 도 13d (우측)에 열 지도로서 제시되고, 이는 A20, EL4, S91, 및/또는 P815 세포주로부터의 동계 종양이 TGFβ1-특이적 억제제의 효능을 시험하기 위한 탁월한 모델을 나타낼 수 있다는 도 13d (좌측)로부터의 결론을 강조한다.

실시예 12. MBT2 동계 방광암 마우스 모델에서 종양 진행에 대한 항-PD-1 항체와 조합된 Ab3 및 Ab2의 효과

방광 암종 종양 진행을 감소시키는 항-PD-1 항체와 조합된 Ab3 및 Ab2의 효과를 평가하기 위해, MBT2 동계 방광암 마우스 모델을 사용하였다. 이는 매우 공격적이고 빠르게 성장하는 종양 모델이고, 약물 치료로 종양 진행을 극복하기가 매우 어렵다.

종양 세포 배양

MBT-2는 암컷 C3H/He 마우스에서 이식가능한 N-[4-(5-니트로-2-푸릴)-2-티아졸릴] 포름아미드-유도된 방광암으로부터 유래된 불량하게 분화된 뮤린 방광암 세포주이다. 세포를 37℃에서 5% CO2 분위기 하에 10% 태아 소 혈청 및 100 μg/ml 스트렙토마이신을 함유하는 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트 (RPMI)-1600 배지에서 배양하였다. 배양 배지를 격일로 교체하고, 세포 전면생장률이 90%에 도달하였을 때 계대배양을 수행하였다. 세포를 전면생장 미만 배양물로부터 트립신처리에 의해 수거하고, 무혈청 배지에서 세척하였다. >90% 세포 생존율을 갖는 단일 세포 현탁액을 트리판 블루 배제에 의해 결정하였다. 세포를 주사 전에 포스페이트-완충 염수 (PBS) 중에 재현탁시켰다.

생체내 이식 및 종양 성장

이식에 사용되는 MBT2 세포를 대수기 성장 동안 수거하고, 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에 재현탁시켰다. 종양 이식 당일에, 각각의 시험 마우스의 측복부에 5 x 10⁵개 세포 (0.1 mL 세포 현탁액)를 피하로 주사하고, 종양 성장을 모니터링하였다. 종양이 평균 40-80 mm³에 도달하였을 때, 마우스를 15마리의 군으로 무작위화하였다. 종양을 캘리퍼를 사용하여 2차원으로 측정하고, 하기 식을 사용하여 부피를 계산하였다:

종양 부피 (mm³) = w² x l / 2

여기서 w = 종양의 폭이고, l = 종양의 길이, mm이다. 종양 중량은 1 mg이 1 mm³의 종양 부피와 등가라는 가정 하에 추정할 수 있다.

처리

제1일에 피하 MBT2 종양 (40 내지 80mm³)을 보유하는 마우스 (n=15)에게 29일 동안 1주 1회 복강내로 (i.p.) Ab3 10 mg/kg을 10 mL/kg의 투여 부피로, Ab3 30 mg/kg을 10mL/kg의 투여 부피로, Ab2 3 mg/kg을 10 mL/kg의 투여 부피로 또는 Ab2 10 mg/kg을 10 mL/kg의 투여 부피로 투여하였다. 래트 항 마우스 PD-1 항체 (RMP1-14-rIgG2a, 바이오엑셀(BioXCell)®)를 29일 동안 10 mL/kg의 투여 부피로 10 mg/kg으로 1주 2회 i.p. 투여하였다.

군 1은 항-PD-1 항체만을 제공받았다. 군 2는 Ab3 (10 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 제공받았다. 군 3은 Ab3 (30 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 제공받았다. 군 4는 Ab2 (3 mg/kg)를 항-PD-1 항체와 조합하여 제공받았다. 군 5는 Ab2 (10 mg/kg)를 항-PD-1 항체와 조합하여 제공받았다. 이소형 대조군으로의 처리를 대조군으로서 사용하였다 (데이터는 제시되지 않음).

종점 및 종양 성장 지연 (TGD) 분석

종양을 캘리퍼를 사용하여 1주에 2회 측정하고, 각각의 동물을 그의 종양이 1,200 mm³의 종점 부피에 도달하였을 때 안락사시켰다. 종양 부피 종점으로 인해 연구를 마친 마우스는 종양 진행 (TP)으로 인해 안락사된 것으로 안락사 날짜와 함께 기록하였다.

처리로 인한 부분 반응 (PR)은 종양 부피가 연구 과정 동안 3회 연속 측정에 대해 그의 제1일 부피의 50% 이하이고, 이들 3회 측정 중 1회 이상에 대해 13.5 mm³ 이상인 것으로 정의된다. 완전 반응 (CR)에서, 종양 부피는 연구 과정 동안 3회 연속 측정에 대해 13.5 mm³ 미만이었다. 10mg/kg의 항-PD-1/Ab3은 연구 종료 시에 0개의 PR 및 4개의 CR을 가졌다. 30mg/kg의 항-PD-1/Ab3은 연구 종료 시에 1개의 PR 및 1개의 CR을 가졌다. 3mg/kg의 항-PD-1/Ab2는 1개의 CR을 가졌고, 10mg/kg에서는 다른 반응이 없었다. 퍼센트 종양 성장 지연 (%TGD)은 대조군의 종점까지의 시간 (TTE)의 중앙값의 백분율로서 표현되는, 비처리 대조군과 비교한 처리군에서의 종점까지의 시간의 중앙값의 증가로서 정의된다:

T= 처리군에 대한 TTE 중앙값

C=대조군에 대한 TTE 중앙값

%TGD = ((T-C)/C)*100

항-PD-1/Ab2%TGD는 3mg/kg에서 11.4였고, 10mg/kg에서 13.6이었다. 항-PD-1/Ab3은 10mg/kg에서 191%TGD를 가졌고, 30mg/kg에서 196이었다.

도 14에 제시된 바와 같이, 항-PD-1과 조합된 10 mg/kg 및 30 mg/kg 용량 둘 다로의 Ab3의 투여, 및 항-PD-1과 조합된 3 mg/kg 및 10 mg/kg 용량 둘 다로의 Ab2의 투여는 항-PD-1 단독으로의 처리와 비교하여 종양 성장을 지연시켰다. 도 14에 제시된 바와 같이, 항-PD-1 단독으로 처리된 대부분의 마우스는 약 제8일 내지 제20일 사이에 1024 mm³의 종양 부피에 도달한 반면에 (점선으로 표시된 바와 같음), Ab3 10mg/kg, Ab3 30 mg/kg, Ab2 3mg/kg, 또는 Ab2 10 mg/kg으로 처리된 마우스는 1024 mm³의 종양 부피에 도달하는데 최대 약 28일이 소요되었다.

도 15는 항-PD-1과 조합하여 Ab3 30mg/kg 또는 10 mg/kg 또는 Ab2 3 mg/kg 또는 10 mg/kg을 투여한 마우스에서의 제15일의 중앙 종양 부피 (mm³)를 보여주는 그래프이다. 도 15에 제시된 바와 같이, Ab3 10mg/kg, Ab3 30 mg/kg, 또는 Ab2 10 mg/kg으로 처리된 마우스에서의 제15일의 중앙 종양 부피는 약 700 mm³ 이하인 반면에, Ab2 3 mg/kg 또는 항-PD-1 단독으로 처리된 마우스에서의 제15일의 중앙 종양 부피는 1000 mm³ 이상이었다.

실시예 13. 클라우드만S91 흑색종 암 마우스 모델에서 종양 진행에 대한 항-PD-1 항체와 조합된 Ab3 및 Ab2의 효과

흑색종 종양 진행을 감소시키는 항-PD-1 항체와 조합된 Ab3 및 Ab2의 효과를 평가하기 위해, 클라우드만S91 마우스 흑색종 모델을 사용하였다.

종양 세포 배양

클론 M3 [클라우드만 S91 흑색종] (ATCC® CCL-53.1™) 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)으로부터 입수하고, 씨알 디스커버리 서비시즈(CR Discovery Services)에서 2.5% 태아 소 혈청, 15% 말 혈청, 2 mM 글루타민, 100 유닛/mL 페니실린 G 나트륨, 100 μg/mL 스트렙토마이신 술페이트 및 25 μg/mL 겐타미신이 보충된 카인 변형 햄 F12 배지에서 지수적으로 성장하는 현탁 배양물로서 유지시켰다. 종양 세포를 5% CO₂ 및 95% 공기의 분위기 하에 37℃에서 가습 인큐베이터 내의 조직 배양 플라스크에서 성장시켰다.

생체내 이식 및 종양 성장

종양 이식 당일에, 각각의 암컷 DBA/2 시험 마우스의 측복부에 50% 매트리겔® 중 5 x 10⁶개 클라우드만S91 세포를 피하로 주사하고, 종양 성장을 모니터링하였다. 종양이 125-175 mm³의 부피에 도달하였을 때, 마우스를 동일한 평균 종양 부피를 갖는 12마리의 군으로 무작위화하고, 투여를 시작하였다. 종양을 캘리퍼를 사용하여 2차원으로 측정하고, 하기 식을 사용하여 부피를 계산하였다:

종양 부피 (mm³) = w² x l / 2

여기서 w = 종양의 폭이고, l = 종양의 길이, mm이다. 종양 중량은 1 mg이 1 mm³의 종양 부피와 등가라는 가정 하에 추정할 수 있다.

처리

제1일에 피하 클라우드만S91 종양 (125-175 mm³)을 보유하는 마우스 (n=12)에게 60일 동안 1주 1회 복강내로 (i.p.) Ab3 10 mg/kg을 10 mL/kg의 투여 부피로; Ab3 30 mg/kg을 10 mL/kg의 투여 부피로; Ab2 10 mg/kg을 10 mL/kg의 투여 부피로; 또는 Ab2 30 mg/kg을 10 mL/kg의 투여 부피로 투여하였다. 래트 항 마우스 PD-1 항체 (RMP1-14-rIgG2a, 바이오엑셀(BioXCell)®)를 60일 동안 10 mL/kg의 투여 부피로 10 mg/kg으로 1주 2회 i.p. 투여하였다.

군 1은 항-PD-1 항체만을 제공받았다. 군 2는 Ab3 (10 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 제공받았다. 군 3은 Ab3 (30 mg/kg)을 항-PD-1 항체와 조합하여 제공받았다. 군 4는 Ab2 (10 mg/kg)를 항-PD-1 항체와 조합하여 제공받았다. 군 5는 Ab2 (30 mg/kg)를 항-PD-1 항체와 조합하여 제공받았다. 비처리 대조군을 사용하였고, 데이터는 제시되지 않는다.

종점 및 종양 성장 지연 (TGD) 분석

종양을 캘리퍼를 사용하여 1주에 2회 측정하고, 각각의 동물을 그의 종양이 2,000 mm³의 종점 부피에 도달하였을 때 또는 연구 종료 시 (제60일) 중 더 일찍 일어난 시점에 안락사시켰다. 종양 부피 종점으로 인해 연구를 마친 마우스는 종양 진행 (TP)으로 인해 안락사된 것으로 안락사 날짜와 함께 기록하였다. 분석을 위한 종점까지의 시간 (TTE)을 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 공개 번호 WO 2018/129329에 기재된 방법에 따라 각각의 마우스에 대해 계산하였다.

도 16은 항-PD-1 항체와 조합된 Ab3 또는 Ab2로의 처리 후의 중앙 종양 진행을 보여준다. 도 16에 제시된 바와 같이, 항-PD-1과 조합된 Ab3 또는 Ab2 10 mg/kg 및 30 mg/kg의 투여는 종양 성장을 지연시켰다. 도 17a 및 17b는 CD8+ 세포 마커로 염색된, 클라우드만S91 종양 모델의 대표적인 면역조직화학 절편을 제공한다. 도 18a 및 18b는 대식세포 마커인 F4/80으로 염색된, 클라우드만S91 종양의 대표적인 면역조직화학 절편을 제공한다. 도 17b 및 18b에 제시된 바와 같이, 항-PD-1 억제제 및 이소형-특이적 TGFb1 억제제로의 처리는 S91 종양에서 CD8+ T 세포 침윤 및 대식세포 침윤을 증가시켰다.

실시예 14: 프로TGFb1 C4S에 대한 Ab2 결합에 대한 pH의 효과

포르테바이오® 옥테트® 레드384를 사용하여 Ab2 (인간 IgG4), 및 또한 pH-비감수성 (pH-비의존성) 물질에서 잠재성 복합체에 결합하는 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제인 대조군 ("R1") (인간 IgG4)으로서 참조 항체의 pH-감수성을 시험하였다. 제시 분자에의 디술피드 연결 없이 프로TGFβ1 발현을 용이하게 하는 프로도메인 내의 돌연변이를 함유하는 센서-고정된 인간 프로TGFβ1 C4S에 대해 항체를 시험하였다. 폴리스티렌 96-웰 흑색 절반 면적 플레이트 (그라이너 바이오-원®) 및 아민 반응성 제2 세대 (AR2G) 바이오센서 (포르테바이오)를 본 실험에 이용하였다.

아민 반응성 제2 세대 (AR2G) 시약 키트 (포르테바이오 파트 번호 18-5095)는 인간 프로TGFβ1 C4S에 대한 Ab2 및 R1 결합의 pH 감수성의 평가를 위해 제조업체의 설명서에 따라 이용하였다. AR2G 바이오센서를 먼저 실험 개시 전에 적어도 10분 동안 오프라인으로 물 중에서 수화되도록 하였다. 실험 개시 시, AR2G 팁을 물 중에서 1분 동안 평형화시켰다. 이어서, 팁을 활성화 용액으로 5분 동안 이동시켰다. 활성화 용액은 18부의 물, 1부의 400 mM EDC (1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필] 카르보디이미드 히드로클로라이드), 및 1부의 200 mM s-NHS (N-히드록시술포숙신이미드)로 이루어졌다. 활성화 용액은 실험에 사용하기 직전에 제조하였다. 팁 활성화 후에, 팁을 3분 동안 10 mM 아세트산나트륨 완충제 pH 5 중 인간 프로TGFβ1 C4S의 10 μg/mL 용액으로 로딩하였다. 로딩 후, 팁을 에탄올아민 pH 8.5 중에서 15분 동안 켄칭하였다. 이어서, 팁을 1x 증진된 동역학 완충제 중에서 20분 인큐베이션으로 기준선/차단하였다. 1x 증진된 동역학 완충제 (1xEKB)는 2% BSA (시그마(Sigma) A3059-100G), 0.5 M NaCl (피셔 S671-10), 및 0.09% 트윈™-20 (P7949-500M)이 첨가된 1x 동역학 완충제 (포르테바이오® 파트 번호 18-1105, PBS로 10x로부터 희석됨)이다. 이어서, 팁을 최종 10분 해리 단계 전에 10분 동안 1xEKB (pH 7.3) 중 Ab2 또는 R1의 10 μg/mL 용액에서 회합되도록 하였다. 1xKB 중 pH 7 및 pH 5에서 해리를 수행하였다.

도 19는 상이한 pH에서의 Ab2 및 R1의 결합 동역학을 보여준다. R1은 pH 7 또는 pH 5에서 최소의 해리를 보여주었다 (각각 K_dis = 4.38e^-3 및 K_dis = 3.69e^-3). Ab2는 pH 7에서 일부 해리를 보여주었다 (K_dis = 2.78e^-3). 그러나, Ab2는 pH 5에서 현저한 해리를 보여주었고 (K_dis = 5.61e^-3), 이는 Ab2가 pH-감수성임을 나타낸다.

실시예 15: 마우스 섬유증 모델에서 TGFβ1-선택적 활성화 억제제의 항섬유화 효과

지방간 상태의 측면을 재현하는 콜린-결핍 고지방 식이 (CDHFD)-유도된 간 섬유증 모델을 마우스에서 사용하여 Ab2의 효과를 검사하였다. 마우스에게 12주 동안 콜린-결핍 고지방 식이 (CDHFD)를 공급함으로써 섬유증을 유도하였다. 항체 처리는 섬유증 유도 4주 후에 시작하였고, 8주 동안 계속하였다. 연구를 2회 반복하였고, 이를 도 20에 연구 1, 좌측 그래프, 및 연구 2, 우측 그래프로서 제시한다. 도 20은 둘 다의 연구로부터의 데이터를 요약한다.

피크로시리우스 레드 (PSR) 염색에 의해 제시된 섬유화 조직 면적의 감소에 의해 입증된 바와 같이, Ab2의 항섬유화 효과가 둘 다의 연구에서 관찰되었다 (도 21). Ab2의 관찰된 항섬유화 효과는 히드록시프롤린 ("HYP") 함량의 감소 (도 22) 및 정량적 IHC에 의한 유형 I 콜라겐 ("Col1") 염색의 감소 (도 23)를 비롯한, 섬유증을 평가하는데 사용된 다른 섬유화 파라미터와 일치한다. 또한, Ab2의 항섬유화 효능을 입증한 이전의 데이터 (UUO, CCl4, 알포트)와 함께, 이들 결과는 이들 전임상 섬유증 마우스 모델에서 Ab2의 재현가능한 생체내 활성을 보여준다.

마우스 CDHFD 표적 결속 연구를 수행하여 Ab46의 생체내 활성을 결정하였다. 마우스에게 10주 동안 CDHF 식이를 공급하였다. 제1 용량의 Ab46 (3, 10, 및 30 mg/kg) 또는 음성 대조군 ("HuNEG" IgG4, 30 mg/kg)을 제1일 및 제3일에 제공하였다. 조직 수집은 제5일에 수행하였다. 도 28은 ELISA에 의해 측정된 바와 같은 CDHFD 마우스 간의 정중엽에서의 인산화된 것 대 총 SMAD2/3의 비를 보여주는 그래프를 제공한다. 정중엽에서 Ab46의 시험된 모든 용량에서 pSMAD2/3의 유의한 감소가 관찰되었다 (p < 0.05 (t 검정)). 데이터는 Ab46이 CDHFD-유도된 간 섬유증 모델의 동물에서 TGFβ 신호전달 경로의 활성을 효과적으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 29는 상기 기재된 마우스의 좌측엽에서의 퍼센트 (%) 양성 포스포-SMAD2 (pSMAD2) 핵을 보여주는 그래프를 제공한다. 30 mg/kg 용량의 Ab46으로 처리된 마우스에서 % 양성 pSMAD2 핵의 유의한 감소가 관찰되었다. 따라서, 이들 결과는 pSMAD2 신호전달의 실질적인 분율이 TGFβ1 이소형에 의해 구동된다는 것을 보여준다. 마지막으로, % pSMAD2 핵의 감소는 Ab2의 대등한 용량과 비교하여 Ab46으로 처리된 CDHFD의 10주 후의 마우스의 간에서 더 컸으며 (데이터는 제시되지 않음), 이는 보다 느린 오프 레이트를 갖는 이소형-선택적 억제제가 보다 빠른 오프 레이트를 갖는 것과 비교하여 증진된 생체내 효력을 제공할 수 있다는 개념을 지지한다.

유사한 연구를 10-12주령 수컷 위스타-한 래트에서 하기와 같이 실행하였다: 래트에게 CDHF 식이를 12주 동안 공급한 다음, 무작위화하였다. 제1 용량의 음성 대조군 ("HuNEG" IgG4, 30 mg/kg, n=6) 또는 Ab46 (3, 10, 및 30 mg/kg, n=8)을 제1일에 제공하고, 제2 용량을 제3일에 제공하였다. TGF-β 유형 1 수용체 (ALK5) 키나제 억제제 (ALK5i, 10 mg/kg)로의 처리를 양성 대조군으로서 사용하였다. 조직 수집 (좌측엽)을 제5일에 수행하였다. 모든 래트는 검출가능한 혈청 항체 노출을 가졌다. 도 30에 제시된 바와 같이, 모든 용량 수준의 Ab46이 SMAD2의 인산화를 억제할 수 있었다. 마우스 연구에서 관찰된 바와 같이, pSMAD2-양성 핵의 백분율의 감소는 Ab2보다 Ab46의 경우에 더 컸다. 연구를 보다 넓은 용량 범위로 반복하였다: 래트에게 CDHF 식이를 12주 동안 공급한 다음, 무작위화하였다. 단일 용량의 0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 또는 30 mg/kg의 Ab46을 제1일에 제공하고, 조직 수집을 48시간 후에 수행하였다. 도 31에 제시된 바와 같이, pSMAD2-양성 핵의 유의한 감소가 용량 10 mg/kg 및 30 mg/kg에서 관찰되었으며, 이는 양성 대조군 (ALK5i)에서 관찰된 억제와 대등하였다.

실시예 16: 래트 섬유증 모델에서 TGFβ1-선택적 활성화 억제제의 항섬유화 효과

Ab2에 의해 관찰된 항섬유화 효과가 또 다른 종에서 재현될 수 있는지 검사하기 위해, 신장 섬유증의 래트 모델을 사용하였다. 래트의 아데닌 처리는 신장에서 신속하고 공격적인 섬유증을 유도하였다. 도 24에 제시된 바와 같이, Ab2, 뿐만 아니라 2종의 양성 대조군 (중화 항체 1D11 및 소분자 ALK5 길항제)은 PSR에 의해 측정된 바와 같은 유의한 항섬유화 효과를 나타내었다.

실시예 17: 간 섬유증 모델에서 TGFβ3-선택적 활성화 억제제의 섬유화유발 효과

간은 TGFβ1 및 TGFβ3 이소형 둘 다를 발현한다. CDHFD 모델에서 둘 다의 이소형의 억제가 간 섬유증을 추가로 완화시킬 것인지 조사하기 위해, CDHFD 마우스를 Ab2 (TGFβ1-선택적 활성화 억제제) 및 TGFβ3-선택적 활성화 억제제로 단독으로 또는 조합하여 처리하였다. TGFβ3 억제제로 처리된 마우스에서, PSR 분석 및 추가의 조직병리학 분석에 의해 입증된 바와 같이, 질환의 악화가 관찰되었다 (도 25). 아데닌 처리는 이전에 보고된 바와 같이 섬유증을 촉발하였다. 12주, 예를 들어 연구 종료 시에, Ab2를 제공받은 동물은 IgG-처리된 동물 (음성 대조군)과 비교하여 유의하게 더 적은 섬유증을 나타내었다. 대조적으로, TGFβ3-선택적 억제제로 처리된 동물은 대략 12% PSR 양성 면적을 갖는 유의하게 더 많은 섬유증을 나타내었다. TGFβ3-선택적 억제제 및 TGFβ1-선택적 억제제 (Ab2) 둘 다의 조합을 제공받은 동물은 중간 수준의 섬유증을 나타내었으며, 이는 Ab2의 항섬유화 효과가 TGFβ3 억제에 의해 완화되었음을 나타낸다.

상기 개별 섹션에서 언급된 본 발명의 다양한 특색 및 실시양태는 적절한 경우에 필요한 변경을 가하여 다른 섹션에 적용된다. 그 결과, 한 섹션에 명시된 특색은 다른 섹션에 명시된 특색과 적절하게 조합될 수 있다.

관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험만을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 또는 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> SCHOLAR ROCK, INC. <120> TGFBETA INHIBITORS AND USE THEREOF <130> 127036-03920 <140> <141> <150> 63/038,413 <151> 2020-06-12 <150> 63/033,904 <151> 2020-06-03 <150> 62/959,925 <151> 2020-01-11 <160> 316 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <400> 1 000 <210> 2 <400> 2 000 <210> 3 <400> 3 000 <210> 4 <400> 4 000 <210> 5 <400> 5 000 <210> 6 <400> 6 000 <210> 7 <400> 7 000 <210> 8 <400> 8 000 <210> 9 <400> 9 000 <210> 10 <400> 10 000 <210> 11 <400> 11 000 <210> 12 <400> 12 000 <210> 13 <400> 13 000 <210> 14 <400> 14 000 <210> 15 <400> 15 000 <210> 16 <400> 16 000 <210> 17 <400> 17 000 <210> 18 <400> 18 000 <210> 19 <400> 19 000 <210> 20 <400> 20 000 <210> 21 <400> 21 000 <210> 22 <400> 22 000 <210> 23 <400> 23 000 <210> 24 <211> 361 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: proTGFBETA1 sequence" <400> 24 Leu Ser Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg 1 5 10 15 Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu 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<221> VARIANT <222> (5)..(5) <223> /replace="Q" <220> <221> VARIANT <222> (8)..(8) <223> /replace="F" <220> <221> SITE <222> (1)..(9) <223> /note="Variant residues given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 283 Val Ser Ser Gly His Trp Asp Tyr Asp 1 5 <210> 284 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 284 Ala Ala Ser Gly Leu Glu Ser 1 5 <210> 285 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 285 Gln Gln Thr Tyr Gly Val Pro Leu Thr 1 5 <210> 286 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 286 Ala Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu 1 5 10 <210> 287 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 287 Val Ser Ser Gly His Trp Asp Tyr Asp 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Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Ala Ala Thr Tyr Phe Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Val Ser Ser Gly His Trp Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 298 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 298 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Gly Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Gly Val Pro Leu 85 90 95 Thr 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given in the sequence have no preference with respect to those in the annotations for variant positions" <400> 303 Ala Ala Ser Gly Leu Glu Ser 1 5 <210> 304 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 304 Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Glu Glu Val Pro Pro Glu Val Ile Ser Ile 1 5 10 15 Tyr Asn Ser Thr 20 <210> 305 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 305 Met Glu Lys Asn 1 <210> 306 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 306 Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala Gly 1 5 <210> 307 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 307 Glu Pro Thr Val Met Thr His Val Pro Tyr Gln Val Leu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Asn Ser Thr <210> 308 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 308 Val Glu Lys Asn 1 <210> 309 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 309 Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser Gly 1 5 <210> 310 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 310 Ser Pro Pro Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Glu Glu Val Pro Pro Glu Val 1 5 10 15 Ile Ser Ile Tyr Asn Ser Thr 20 <210> 311 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 311 Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr Asn Ala Asn Phe Cys Ala 1 5 10 15 Gly <210> 312 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 312 Ser Pro Pro Glu Pro Thr Val Met Thr His Val Pro Tyr Gln Val Leu 1 5 10 15 Ala Leu Tyr Asn Ser Thr 20 <210> 313 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 313 Trp Lys Trp Val His Glu Pro Lys Gly Tyr Tyr Ala Asn Phe Cys Ser 1 5 10 15 Gly <210> 314 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 314 Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly 1 5 10 15 Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu 20 <210> 315 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 315 Lys Leu Lys Leu Thr Ser Pro Pro Glu Asp Tyr Pro Glu Pro Glu Glu 1 5 10 15 Val Pro Pro Glu Val Ile 20 <210> 316 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 316 Lys Leu Arg Leu Thr Ser Pro Pro Glu Pro Thr Val Met Thr His Val 1 5 10 15 Pro Tyr Gln Val Leu 20

Claims (38)

1. TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하는 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 TGFβ1 활성화의 이소형-선택적 억제제이며;
   여기서 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 각각의 인간 LTBP1-프로TGFβ1 및/또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 표면 플라즈몬 공명 (SPR)-기반 검정에 의해 측정된 바와 같이 10.0e-4 (1/s)의 1가 해리율로, 임의로 < 1.0 nM의 K_D로 결합하고;
   여기서 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기 6개의 CDR:
   i) GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하는 H-CDR1;
   ii) ISGSG(X₁)AT를 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 A 또는 K인 (서열식별번호: 277) H-CDR2;
   iii) VSSG(X₁)WD(X₂)D를 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 H, D 또는 Q이고; 여기서 추가로 임의로 X₂는 F 또는 Y인 (서열식별번호: 278) H-CDR3;
   iv) QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하는 L-CDR1;
   v) AAS(X₁)(X₂)(X₃)(X₄)를 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 N, G 또는 V이고; 여기서 추가로 임의로 X₂는 L, N 또는 E이고; 여기서 추가로 임의로 X₃은 Q 또는 E이고; 여기서 추가로 임의로 X₄는 S 또는 T인 (서열식별번호: 280) L-CDR2; 및
   vi) QQTY(X₁)VPLT를 포함하며, 여기서 임의로 X₁은 T 또는 G인 (서열식별번호: 281) L-CDR3
   을 포함하는 것인
   TGFβ1 활성화의 이소형-선택적 억제제.
2. 제1항에 있어서,
   i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
   ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
   iii) H-CDR3은 VSSG(X₁)WD(X₂)D를 포함하고, 여기서 임의로 X₁은 H 또는 Q이고, X₂는 Y 또는 F (서열식별번호: 283)이고;
   iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
   v) L-CDR2는 AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함하고;
   vi) L-CDR3은 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함하는 것인
   이소형-선택적 억제제.
3. 제1항에 있어서,
   i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
   ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
   iii) H-CDR3은 VSSGHWDFD (서열식별번호: 289)를 포함하고;
   iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
   v) L-CDR2는 AASNLES (서열식별번호: 292)를 포함하고;
   vi) L-CDR3은 QQTYTVPLT (서열식별번호: 296)를 포함하는 것인
   이소형-선택적 억제제.
4. 제1항에 있어서,
   i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
   ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
   iii) H-CDR3은 VSSGHWDFD (서열식별번호: 289)를 포함하고;
   iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
   v) L-CDR2는 AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함하고;
   vi) L-CDR3은 QQTYTVPLT (서열식별번호: 296)를 포함하는 것인
   이소형-선택적 억제제.
5. 제1항에 있어서,
   i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
   ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
   iii) H-CDR3은 VSSGHWDFD (서열식별번호: 289)를 포함하고;
   iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
   v) L-CDR2는 AASVNES (서열식별번호: 293)를 포함하고;
   vi) L-CDR3은 QQTYTVPLT (서열식별번호: 296)를 포함하는 것인
   이소형-선택적 억제제.
6. 제1항에 있어서,
   i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
   ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
   iii) H-CDR3은 VSSGHWDFD (서열식별번호: 289)를 포함하고;
   iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
   v) L-CDR2는 AASNEET (서열식별번호: 294)를 포함하고;
   vi) L-CDR3은 QQTYTVPLT (서열식별번호: 296)를 포함하는 것인
   이소형-선택적 억제제.
7. 제1항에 있어서,
   i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
   ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
   iii) H-CDR3은 VSSGHWDFD (서열식별번호: 289)를 포함하고;
   iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
   v) L-CDR2는 AASNLES (서열식별번호: 292)를 포함하고;
   vi) L-CDR3은 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함하는 것인
   이소형-선택적 억제제.
8. 제1항에 있어서,
   i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
   ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
   iii) H-CDR3은 VSSGHWDFD (서열식별번호: 289)를 포함하고;
   iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
   v) L-CDR2는 AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함하고;
   vi) L-CDR3은 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함하는 것인
   이소형-선택적 억제제.
9. 제1항에 있어서,
   i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
   ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
   iii) H-CDR3은 VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)를 포함하고;
   iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
   v) L-CDR2는 AASNLES (서열식별번호: 292)를 포함하고;
   vi) L-CDR3은 QQTYTVPLT (서열식별번호: 296)를 포함하는 것인
   이소형-선택적 억제제.
10. 제1항에 있어서,
    i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
    ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
    iii) H-CDR3은 VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)를 포함하고;
    iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
    v) L-CDR2는 AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함하고;
    vi) L-CDR3은 QQTYTVPLT (서열식별번호: 296)를 포함하는 것인
    이소형-선택적 억제제.
11. 제1항에 있어서,
    i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
    ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
    iii) H-CDR3은 VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)를 포함하고;
    iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
    v) L-CDR2는 AASNLES (서열식별번호: 292)를 포함하고;
    vi) L-CDR3은 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함하는 것인
    이소형-선택적 억제제.
12. 제1항에 있어서,
    i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
    ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
    iii) H-CDR3은 VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)를 포함하고;
    iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
    v) L-CDR2는 AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함하고;
    vi) L-CDR3은 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함하는 것인
    이소형-선택적 억제제.
13. 제1항에 있어서,
    i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
    ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
    iii) H-CDR3은 VSSGDWDYD (서열식별번호: 290)를 포함하고;
    iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
    v) L-CDR2는 AASNLES (서열식별번호: 292)를 포함하고;
    vi) L-CDR3은 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함하는 것인
    이소형-선택적 억제제.
14. 제1항에 있어서,
    i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
    ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
    iii) H-CDR3은 VSSGDWDYD (서열식별번호: 290)를 포함하고;
    iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
    v) L-CDR2는 AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함하고;
    vi) L-CDR3은 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함하는 것인
    이소형-선택적 억제제.
15. 제1항에 있어서,
    i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
    ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
    iii) H-CDR3은 VSSGQWDYD (서열식별번호: 291)를 포함하고;
    iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
    v) L-CDR2는 AASNLES (서열식별번호: 292)를 포함하고;
    vi) L-CDR3은 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함하는 것인
    이소형-선택적 억제제.
16. 제1항에 있어서,
    i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
    ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
    iii) H-CDR3은 VSSGQWDYD (서열식별번호: 291)를 포함하고;
    iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
    v) L-CDR2는 AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함하고;
    vi) L-CDR3은 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함하는 것인
    이소형-선택적 억제제.
17. 제1항에 있어서,
    i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
    ii) H-CDR2는 ISGSGKAT (서열식별번호: 288)를 포함하고;
    iii) H-CDR3은 VSSGDWDYD (서열식별번호: 290)를 포함하고;
    iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
    v) L-CDR2는 AASNLQS (서열식별번호: 295)를 포함하고;
    vi) L-CDR3은 QQTYTVPLT (서열식별번호: 296)를 포함하는 것인
    이소형-선택적 억제제.
18. 제1항에 있어서,
    i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
    ii) H-CDR2는 ISGSGKAT (서열식별번호: 288)를 포함하고;
    iii) H-CDR3은 VSSGDWDYD (서열식별번호: 290)를 포함하고;
    iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
    v) L-CDR2는 AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함하고;
    vi) L-CDR3은 QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함하는 것인
    이소형-선택적 억제제.
19. 제1항에 있어서,
    i) H-CDR1은 GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하고;
    ii) H-CDR2는 ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하고;
    iii) H-CDR3은 VSSG(H/D/Q)WD(F/Y)D (서열식별번호: 278)를 포함하고;
    iv) L-CDR1은 QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하고;
    v) L-CDR2는 AAS(G/N)LES (서열식별번호: 303)를 포함하고;
    vi) L-CDR3은 QQTY(G/T)VPLT (서열식별번호: 281)를 포함하는 것인
    이소형-선택적 억제제.
20. TGFβ1 활성화의 이소형-선택적 억제제를 포함하는 제약 조성물을 제조하는 방법이며,
    i) 시험관내 결합 검정 (예를 들어, BLI- 또는 SPR-기반 기술)에 의해 Fab 단편을 사용하여 측정된 바와 같이 나노몰-미만의 친화도 (K_D < 1.0 nM) 및 < 10 x 10^-4 (k_오프 < 10.0E-4)의 해리율로 인간 잠재성 TGFβ1 복합체에 선택적으로 결합하고, 세포-기반 효력 검정에서 TGFβ1의 활성화를 억제하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 선택하는 단계;
    ii) 세포 배양물에서 항체 또는 항체의 항원-결합 단편을 포함하는 조작된 구축물을 생산하는 단계이며, 여기서 임의로 세포 배양물은 포유동물 세포 배양물이고, 여기서 추가로 임의로 세포 배양물은 ≥250L의 부피를 갖는 것인 단계;
    iii) 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 억제제 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물로 제제화하는 단계
    를 포함하는 방법.
21. 제20항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 인간 LTBP1-프로TGFβ1 또는 인간 LTBP3-프로TGFβ1에 결합하는 것인 방법.
22. 제20항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 인간 LTBP1-프로TGFβ1, 인간 LTBP3-프로TGFβ1, 인간 GARP-프로TGFβ1 및 LRRC33-프로TGFβ1에 결합하는 것인 방법.
23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 과정에 의해 제조된 제약 조성물.
24. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 섬유화 장애의 치료에 사용하기 위한 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제.
25. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 순환 잠재성 TGFβ의 수준을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제.
26. 제25항에 있어서, 순환 잠재성 TGFβ의 수준이 대상체로부터 수득된 샘플에서 결정되는 것인 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제.
27. 제26항에 있어서, 샘플이 전혈 샘플 또는 혈액 성분인 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제.
28. 제25항에 있어서, 여기서 순환 잠재성 TGFβ가 순환 잠재성 TGFβ1인 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제.
29. 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 의약의 제조에서의 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 TGFβ1의 이소형-선택적 억제제의 용도.
30. TGFβ1을 억제하지만 TGFβ2 및/또는 TGFβ3 중 하나 또는 둘 다는 억제하지 않는 TGFβ 억제제를 선택하는 단계;
    세포외 매트릭스 (ECM) 조절이상을 수반하는 질환을 갖는 대상체에게 TGFβ 억제제를 질환을 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계이며, 여기서 임의로 질환은 섬유증 또는 암이고, 여기서 추가로 임의로 암은 고형 종양을 포함하거나 또는 암은 골수증식성 장애인 단계
    를 포함하는, 대상체에서 ECM 조절이상을 수반하는 질환을 치료하는 방법.
31. TGFβ1을 억제하지만 TGFβ2 및 TGFβ3 중 하나 또는 둘 다는 억제하지 않는 TGFβ 억제제를 선택하는 단계;
    섬유화 상태를 갖는 대상체에게 TGFβ 억제제를 섬유화 상태를 치료하는데 효과적인 양으로 투여하는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 섬유증을 치료하는 방법.
32. 제31항에 있어서, 섬유화 상태가 간 섬유증, 신장 섬유증, 심장 섬유증 또는 폐 섬유증인 방법.
33. 제32항에 있어서, 섬유화 상태가 NASH와 연관된 간 섬유증인 방법.
34. 제33항에 있어서, 간 섬유증이 3기 또는 4기 섬유증인 방법.
35. 제31항에 있어서,
    (i) TGFβ 억제제를 투여하기 전에 대상체에서 순환 잠재성 TGFβ의 수준을 결정하는 단계; 및
    (ii) TGFβ 억제제를 투여한 후에 대상체에서 순환 잠재성 TGFβ의 수준을 결정하는 단계
    를 추가로 포함하며,
    여기서 투여 전의 순환 잠재성 TGFβ와 비교하여 억제제 투여 후의 순환 잠재성 TGFβ의 증가는 치료 효능을 나타내는 것인 방법.
36. GFTFADYA (서열식별번호: 276)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRH1);
    ISGSGAAT (서열식별번호: 282)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 2 (CDRH2);
    VSSGHWDYD (서열식별번호: 287)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역 3 (CDRH3);
    QSISSY (서열식별번호: 279)를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 1 (CDRL1);
    AASGLES (서열식별번호: 284)를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 2 (CDRL2); 및
    QQTYGVPLT (서열식별번호: 285)를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역 3 (CDRL3)
    을 포함하는, TGFβ1 활성화를 선택적으로 억제하는 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
37. 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하며, 여기서 VH는 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYAMTWVRQAPGKGLEWVSAISGSGAATYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSSGHWDYDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 297)에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하고, VL은 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASGLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYGVPLTFGGGTKVEIK (서열식별번호: 298)에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
38. 제36항 또는 제37항에 있어서, VH가 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFADYAMTWVRQAPGKGLEWVSAISGSGAATYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSSGHWDYDYWGQGTLVTVSS (서열식별번호: 297)를 포함하고, VL이 DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASGLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYGVPLTFGGGTKVEIK (서열식별번호: 298)를 포함하는 것인 단리된 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 단편.

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