DE60211711T2

DE60211711T2 - Tiermodell mit krebs, lungenemphysem und kardiomyopathie

Info

Publication number: DE60211711T2
Application number: DE60211711T
Authority: DE
Inventors: Harald Von Melchner; Irmgard Thorey; Frank Wempe; Institut für Veterinärspatholo Anja STERNER-KOCK; Jorma Keski-Oja
Original assignee: Frankgen Biotechnologie AG
Current assignee: Frankgen Biotechnologie AG
Priority date: 2001-08-14
Filing date: 2002-08-12
Publication date: 2007-02-22
Anticipated expiration: 2022-08-13
Also published as: AU2002331232A1; US20040250303A1; DE60211711D1; US20100077490A1; WO2003015505A3; EP1416791A2; WO2003015505A2; EP1416791B1; ATE326837T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein nichthumanes Tiermodell und auf Zellen, die kein funktionelles latentes Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 produzieren oder die suboptimale Mengen an latentem Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 produzieren. Weiterhin bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren zum ex-vivo-Diagnostizieren von Krebs, Lungenemphysem oder Kardiomyopathie und zum Analysieren, ob Krebs und/oder Lungenemphysem und/oder Kardiomyopathie durch eine unterschiedliche Expression von LTBP-4 oder durch einen Defekt im LTBP-4-Gen verursacht werden. Außerdem bezieht sich die vorliegende Erfindung auf das Auswählen eines Mittels zur Behandlung eines Symptoms, das im Tiermodell der Erfindung auftritt.
Hintergrund der Erfindung
Transformierender Wachstumsfaktor β (TGF-β) gehört zu einer Proteinsuperfamilie, deren Mitglieder für die normale Entwicklung notwendig sind. Sie steuern auch das Zellwachstum und die Differenzierung bei einer Vielzahl von Geweben des Erwachsenen und sind an einem breiten Spektrum von Immunreaktionen beteiligt (Übersichtsartikel von Massague, J. et al. (2000), Cell 103, 295-309, Massague, J. & Wotton, D. (2000), Embo J. 19, 1745-1754). Die meisten Zellen sezernieren TGF-β als funktionell inaktives (latentes) Vorläufercytokin, das erst nach proteolytischer Aktivierung mit seinen Rezeptoren in Wechselwirkung tritt. Es gibt zwei bekannte, strukturell unterschiedliche latente Komplexe von TGF-β. Ein kleiner latenter Komplex besteht aus einem reifen TGF-β-Dimer, das an den N-terminalen Teil des TGF-β-Vorläufers, d.h. des latenzassoziierten Peptids (LAP), gebunden ist. Der große latente Komplex enthält außer TGF-β-LAP noch das latente TGF-β-Bindungsprotein (LTBP). Wenn es nach der Sekretion nicht proteolytisch von LTBPs abgespalten wird, wird TGF-β als hochmolekularer Komplex mit LTBP und LAP in der extrazellulären Matrix (ECM) abgelagert (Übersichtsartikel von Koli, K. et al. (2001), Microsc. Res. Tech. 52, 354-362, Taipale, J. et al. (1998) Adv. Cancer Res. 75, 87-134).
LTBPs sind Glycoproteine, die zur Familie der Fibrilline gehören. Mehr als 60% der Proteinstruktur der LTBP-Familie bestehen aus repetitiven EGF-artigen Domänen und 8-Cystein-Repeats, die beide vermutlich Protein-Protein-Wechselwirkungen vermitteln. Wie Fibrilline sind LTBPs Strukturkomponenten der extrazellulären Matrix (ECM) und binden an elastische Fasern. Obwohl LTBPs nicht direkt an der TGF-β-Latenz beteiligt sind, sezernieren die meisten Zellen TGF-β im Komplex mit LTBP und bilden durch die Bindung von TGF-β an die ECM extrazelluläre Ablagerungen von TGF-β. Dies ergibt vermutlich Gewebe mit einem rasch induzierbaren und hochgradig lokalisierten TGF-β-Signal (Koli, K. et al. (2001), Microsc. Res. Tech. 52, 354-362). Vier Isoformen von LTBPs (LTBP 1-4) wurden bisher kloniert (Tsuji, T. et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8835-8839, Moren, A. et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 32469-32478, Yin, W. et al. (1995), J. Biol. Chem. 270, 10147-10160, Giltay, R. et al. (1997), FEBS Lett. 411, 164-168, Saharinen, J. et al. (1998), J. Biol. Chem. 273, 18459-18469). Jede hat mehrere Spleißvarianten, und wenigstens eine (LTBP1) hat zwei alternative Promotoren (Koski, C. et al. (1999), J. Biol. Chem. 274, 32619-32630). Die Expression sowohl von Isoformen als auch von Spleißvarianten scheint in gewebespezifischer Weise streng reguliert zu sein. Die Funktion von LTBPs auf der Ebene des Organismus ist weitgehend unbekannt (Shipley, J. et al. (2000), Mol. Cell. Biol., 4879-4887, Öklü, R. et al. (2000), Biochem. J., 601-610).
Weiterhin beschreibt EP-A-1 092 768 Gen-Einfangverfahren.
Wie aus dem Stand der Technik hervorgeht, gibt es ein Bedürfnis nach Tiermodellen, um die Funktion von LTBPs und insbesondere LTBP-4 aufzuklären. Ein weiteres Ziel besteht darin, Zellen bereitzustellen, denen LTBP-4-Protein fehlt.
Um dieses Ziel zu erreichen, werden ein nichthumanes Tiermodell und Zellen, die kein funktionelles latentes Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 (LTBP-4) produzieren oder die suboptimale Mengen an latentem Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 (LTBP-4) produzieren, bereitgestellt.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein nichthumanes Tiermodell, das kein funktionelles latentes Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 (LTBP-4) produziert oder das suboptimale Mengen an latentem Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 (LTBP-4) produziert, wobei das Tiermodell Krebs (z.B. ein Kolonkarzinom), Lungenemphysem oder Kardiomyopathie aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Genom des Tiers eine homozygote Zerstörung des LTBP-4-Gens. Vorzugsweise ist diese homozygote Zerstörung durch eine Mutation entstanden, und diese Mutation kann eine Insertions-, Deletions- oder Substitutionsmutation sein. Weiterhin ist die Mutation vorzugsweise durch Gen-Targeting, Genfallenintegration oder -mutagenese entstanden und ist in einem Exon, Intron, regulatorischen Bereich oder einer Spleißstelle des LTBP-4-Gens, vorzugsweise im Intron 5 des LTBP-4-Gens, aufgetreten.
Weiterhin ist das Tier vorzugsweise ein Säuger, besonders bevorzugt eine Maus oder eine Ratte.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf eine Zelle, die aus einem nichthumanen Tiermodell isoliert wurde, dessen Genom eine homozygote Zerstörung des LTBP-4-Gens umfasst, so dass dieses Gen kein funktionelles latentes Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 produziert oder suboptimale Mengen an latentem Transformierender-Wachstumsfaktor-β- Bindungsprotein 4 produziert. Vorzugsweise stammt die Zelle aus einem Kolon, einer Lunge oder einem Herzen.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine nichthumane Zelle, deren Genom eine homozygote Zerstörung des LTBP-4-Gens umfasst. Die Zelle ist vorzugsweise eine embryonale Stammzelle.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Auswählen eines Mittels zur Behandlung eines Symptoms, das im Tiermodell der Erfindung auftritt, umfassend: a) Anwenden von einem oder mehreren zu testenden Mitteln auf das Tiermodell der Erfindung; und b) Bestimmen, ob ein oder mehrere Symptome, die in dem Tiermodell der vorliegenden Erfindung auftreten, sich infolge der Anwendung des oder der Mittel verändert haben. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Symptom aus der Gruppe ausgewählt, die aus Krebs, Lungenemphysem und Kardiomyopathie besteht.
Das Mittel, das zur Behandlung eines Symptoms, das im Tiermodell der Erfindung auftritt, geeignet ist, kann als Pharmakon verwendet werden. Weiterhin kann das Mittel, das zur Behandlung eines Symptoms, das im Tiermodell der Erfindung auftritt, geeignet ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs, Lungenemphysem und Kardiomyopathie verwendet werden. Außerdem kann die Behandlung von Krebs, Lungenemphysem oder Kardiomyopathie unter Verwendung des Mittels, das zur Behandlung eines Symptoms, das im Tiermodell der vorliegenden Erfindung auftritt, geeignet ist, möglich sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Analysieren, ob Krebs, Lungenemphysem oder Kardiomyopathie durch ein unterschiedliches LTBP-4-Gen oder unterschiedliche Proteinexpression oder ein unterschiedliches Expressionsniveau oder durch einen Defekt im LTBP-4-Gen verursacht wird, umfassend: a) Charakterisieren des LTBP-4-Gens oder der Proteinexpression oder des Expressionsniveaus oder des LTBP-4-Gen-Allelstatus eines Individuums, das Krebs und/oder Lungenemphysem und/oder Kardiomyopathie hat; und b) Charakterisieren des LTBP-4-Gens oder der Proteinexpression oder des Expressionsniveaus oder des LTBP-4-Gen-Allelstatus einer Kontrolle; wobei das Verfahren nicht am menschlichen oder tierischen Körper praktiziert wird und wobei ein Unterschied im LTBP-4-Gen oder in der Proteinexpression oder im Expressionsniveau oder im LTBP-4-Gen-Allelstatus darauf hinweist, dass Krebs und/oder Lungenemphysem und/oder Kardiomyopathie durch ein unterschiedliches LTBP-4-Gen bzw. unterschiedliche Proteinexpression bzw. ein unterschiedliches Expressionsniveau bzw. durch einen Defekt im LTBP-4-Gen verursacht wird.
Weiterhin bezieht sich ein Aspekt der Erfindung auf ein Verfahren zum Diagnostizieren von Krebs, Lungenemphysem oder Kardiomyopathie, umfassend: a) Charakterisieren des LTBP-4-Gens oder der Proteinexpression oder des Expressionsniveaus oder des LTBP-4-Gen-Allelstatus eines Individuums; b) Charakterisieren des LTBP-4-Gens oder der Proteinexpression oder des Expressionsniveaus oder des LTBP-4-Gen-Allelstatus einer Kontrolle; wobei das Verfahren nicht am menschlichen oder tierischen Körper praktiziert wird und wobei ein Unterschied im LTBP-4-Gen oder in der Proteinexpression oder im Expressionsniveau oder im LTBP-4-Gen-Allelstatus auf Krebs und/oder Lungenemphysem und/oder Kardiomyopathie bei dem Individuum hinweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Verfahren zum Analysieren, ob Krebs und/oder Lungenemphysem und/oder Kardiomyopathie durch LTBP-4 verursacht wird, und zum Diagnostizieren von Krebs, Lungenemphysem oder Kardiomyopathie werden das LTBP-4-Gen und die LTBP-4-Expression oder das LTBP-4-Expressionsniveau durch RT-PCR, Northern-Analyse, Mikroarray-Analyse (DNA-Chip-Analyse) oder gegen LTBP-4-Protein gerichtete Antikörper nachgewiesen, und der LTBP-4-Gen-Allelstatus wird durch Mutations-Screening nachgewiesen.
Der Ausdruck "produziert kein funktionelles latentes Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 (LTBP-4)" bezeichnet das Fehlen einer Translation eines effektiven LTBP-4-Proteins.
Der Ausdruck "produziert suboptimale Mengen an latentem Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 (LTBP-4)" umfasst die Translationsmenge des LTBP-4-Proteins, die unzureichend ist, um eine effektive Konzentration von LTBP-4 zu produzieren. Vorzugsweise ist die Menge um wenigstens 50%, besonders bevorzugt 70% und am meisten bevorzugt 95% reduziert.
Der Ausdruck "homozygote Zerstörung des LTBP-4-Gens" bezieht sich auf eine identische Mutation in beiden LTBP-4-Allelen.
Der Ausdruck "Mutation" bezieht sich auf eine Veränderung von einem oder mehreren Nucleotidpaaren eines DNA-Moleküls.
Der Ausdruck "Insertion" betrifft eine Mutation, die durch die Anwesenheit von einem oder mehreren zusätzlichen Basenpaaren in der DNA identifiziert wird. Der Ausdruck "Deletion" bezieht sich auf eine Mutation, die durch Entfernung einer DNA-Sequenz (ein oder mehrere Basenpaare) entsteht, wobei die beiderseitigen Bereiche miteinander verbunden sind. Der Ausdruck "Substitutionsmutation" betrifft einen Nucleotidaustausch. Die Substitutionsmutation kann zu einer Aminosäureänderung führen oder kann ein vorzeitiges Translations-Stopcodon einführen. Weiterhin kann eine Substitutionsmutation das Spleißen oder die Expression des Gens beeinflussen, wenn sie in den zum Spleißen notwendigen Stellen oder den regulatorischen Bereichen des Gens auftritt.
Der Ausdruck "Gen-Targeting" bezieht sich auf eine Art der homologen Rekombination, die auftritt, wenn ein Fragment genomischer DNA in eine Zelle eingeführt wird und dieses Fragment sich mit homologen Sequenzen lokalisiert und rekombiniert. Der Ausdruck "Genfallenintegration" betrifft die Insertion eines Vektors, der ein Reporter-Gen umfasst und der nach seiner Insertion in eine aktive Transcriptionseinheit aktiviert wird, in eine chromosomale Stelle. Der Ausdruck "Mutagenese" bezeichnet eine chemische oder physikalische Behandlung, die Nucleotide im Genom eines Organismus verändert. Ein Beispiel für eine chemische Mutagenese ist N-Ethyl-N-nitrosoharnstoff(ENU)-Mutagenese.
Der Ausdruck "Exon" umfasst ein Segment eines Gens, das decodiert wird und dabei ein mRNA-Produkt oder ein reifes RNA-Produkt ergibt. Einzelne Exons können proteincodierende DNA und/oder nichtcodierende DNA enthalten. Der Ausdruck "Intron" bezeichnet nichtcodierende DNA, die benachbarte Exons in einem Gen voneinander trennt. Während der Genexpression werden Introns wie Exons zu RNA transcribiert, aber die transcribierten Intronsequenzen werden anschließend durch RNA-Spleißen entfernt und sind in mRNA nicht vorhanden. Der Ausdruck "regulatorischer Bereich" bezieht sich auf die Nucleotidsequenz, die Bereiche umfasst, die für die Regulation der Transcription des Gens notwendig sind. Diese Bereiche umfassen zum Beispiel Promotoren und Enhancer, und sie können im 5'-Bereich der Exons oder in Introns lokalisiert sein. Der Ausdruck "Spleißstelle" umfasst die Nucleotide a) am Ende eines Exons und Beginn des Introns und b) am Ende des Introns und Beginn des Exons, die zur Verknüpfung von zwei Exons und zur Entfernung eines Introns während der Prozessierung eines primären Transcripts zu einer funktionellen mRNA erforderlich sind.
Der Ausdruck "Krebs" bezieht sich auf eine neoplastische Krankheit. Im Unterschied zu gutartigen Tumorzellen weisen Krebszellen die Eigenschaften der Invasion und Metastasierung auf und sind hochgradig entdifferenziert. Der Ausdruck "Lungenemphysem" bezeichnet einen Zustand der Lunge, der durch eine über den Normalwert hinausgehende Größenzunahme von Lufträumen distal zu den terminalen Bronchiolen gekennzeichnet ist, die entweder durch Erweiterung von Alveolen oder durch Zerstörung ihrer Wände verursacht ist. Der Ausdruck "Kardiomyopathie" bezeichnet eine primäre nichtinflammatorische Krankheit des Herzmuskels, die nicht das Ergebnis einer ischämischen, hypertonischen, kongenitalen, valvulären oder perkardialen Krankheit ist.
Der Ausdruck "embryonale Stammzelle" bezeichnet eine Zelllinie, die von undifferenzierten, totipotenten Zellen aus einem nichthumanen Embryo stammt.
Der Ausdruck "Auswählen eines Mittels zur Behandlung eines Symptoms" umfasst das Auswählen einer Zusammensetzung zur Behandlung des Zustands.
Der Ausdruck "Symptom" bezieht sich auf ein subjektives Anzeichen einer Krankheit im Zustand eines Individuums.
Der Ausdruck "Anwenden von einem oder mehreren Mitteln" bezieht sich auf die Verabreichung von einer oder mehreren Zusammensetzungen. Die Zusammensetzungen können oral, durch Inhalation, parenteral, z.B. intravenös, subkutan, intraperitoneal oder intramuskulär, oder topisch, z.B. ophthalmisch, vaginal, rektal oder intranasal, verabreicht werden.
Der Ausdruck "unterschiedliches LTBP-4-Gen oder unterschiedliche Proteinexpression oder unterschiedliches Expressionsniveau" bezeichnet die Transcription oder Translation eines LTBP-4-Gens, die reduziert oder erhöht ist. Vorzugsweise tritt ein Mangel an Transcription oder Translation auf.
Der Ausdruck "Defekt im LTBP-4-Gen" bezieht sich auf eine Mutation, d.h. eine Nucleotidänderung, im LTBP-4-Gen.
Der Ausdruck "LTBP-4-Gen-Allelstatus" bezeichnet den Zustand der DNA-Sequenz in beiden Allelen von LTBP-4, d.h. ob das LTBP-4-Gen eine Mutation enthält und ob diese Mutation heterozygot oder homozygot ist.
Der Ausdruck "RT-PCR" umfasst eine zweistufige Vorschrift zum Synthetisieren von cDNA-Molekülen, wobei cDNA-Stränge durch Reverse Transcriptase mit mRNA als Matrize synthetisiert werden und der spezifische cDNA-Strang durch PCR amplifiziert wird. Der Ausdruck "Northern-Analyse" bezieht sich auf ein molekulares Hybridisierungsverfahren, bei dem das Ziel aus RNA-Molekülen besteht, die durch Gel-Elektrophorese nach Größe fraktioniert und anschließend auf eine Membran übertragen wurden. Der Ausdruck "Mikroarray-Analyse" bezieht sich auf Expressionsanalysen im großen Maßstab, bei denen Zehntausende von mRNAs von einem Individuum auf einer festen Oberfläche, vorzugsweise Glas, immobilisiert sind und mit einer LTBP-4-spezifischen Sonde hybridisiert werden. Der Ausdruck "gegen LTBP-4-Protein gerichteter Antikörper" bezeichnet ein Protein, das von einem B-Lymphocyten synthetisiert wird und spezifische Epitope auf einem LTBP-4-Protein erkennt.
Der Ausdruck "Mutations-Screening" bezieht sich auf die Suche nach Nucleotidveränderungen in der DNA oder cDNA eines Individuums. Dies kann zum Beispiel durch Sequenzierung erfolgen.
Der Ausdruck "Mittel zum Nachweisen des LTBP-4-Gens oder der Proteinexpression oder des Expressionsniveaus oder des LTBP-4-Gen-Allelstatus" bezeichnet Ressourcen zur Charakterisierung, ob ein LTBP-4-Gen transcribiert wird oder ein LTBP-4-Protein translatiert wird und ob das Niveau der Transcription/Translation normal, erniedrigt oder erhöht ist oder ob das LTBP-4-Gen eine Nucleotidveränderung trägt. Die Ressourcen umfassen gegen LTBP-4-Protein gerichtete Antikörper, eine Sonde, die mit LTBP-4-Gen hybridisiert, und Primerpaare, die geeignet sind, um Bereiche des LTBP-4-Gens oder LTBP-4-cDNA zu amplifizieren.
In der vorliegenden Erfindung wurde ein starkes hypomorphes Allel des Maus-LTBP-4-Gens durch Genfallenmutagenese bei embryonalen Stammzellen erzeugt. Mäuse, die in Bezug auf die Genfallenintegration homozygot sind, exprimierten nur Spuren von LTBP-4 und entwickelten schweres Lungenemphysem, Kardiomyopathie und Kolorektalkarzinom. Die Abnormalitäten wurden durch einen Defekt im Zusammenbau von elastischen Fasern und durch einen defekten TGF-β-Transport zum extrazellulären Raum verursacht.
Interessanterweise wurde das hypomorphe Allel durch eine Exonfalleninsertion in inverser Orientierung in ein Intron des LTBP-4-Gens erzeugt, das die Genexpression theoretisch nicht stören sollte. Es hat sich jedoch schon früher gezeigt, dass Introninsertionen Mutationen verursachen. Beispiele dafür sind die ob2J-Mutation, die durch eine Retrotransposon-Insertion in das erste Intron des Maus-Leptin-Gens induziert wird (Moon, B.C. & Friedman, J.M. (1997), Genomics 42, 152-156), die mdr-3-Mutation, die durch eine retrovirale LTR-Insertion in das 22. Intron des Maus-Multidrug-Resistenz-Gens 3 induziert wird (Jun, K. et al. (2000), Mamm. Genome 11, 843-848), und die Mbp-Mutation, die durch eine Retrotransposon-Insertion in das 3. Intron des Ratten-Myelin-Basic-Protein-Gens induziert wird (O'Connor, L.T. et al. (1999), J. Neurosci. 19, 3404-3413).
In jedem Fall verhinderte anomales Spleißen die Expression eines vollständig prozessierten Transcripts in voller Länge. In Zellen der vorliegenden Erfindung wurden multiple atypische LTBP-4-Transcripte durch RT-PCR nachgewiesen, was darauf hinweist, dass die Mutation durch anomales Spleißen verursacht wurde.
Das Krankheitsmodell der vorliegenden Erfindung beweist eine doppelte Funktion der TGF-β-Bindungsproteine. Während das Fehlen von elastischen Fasern in der Lunge und im Kolon die strukturelle Notwendigkeit von LTBP-4 unterstreicht, impliziert das Fehlen von extrazellulärem TGF-β die Rolle von LTBP-4 im TGF-β-Signalweg. Da TGF-β die Proliferation von Epithelzellen, insbesondere im Kolon, hemmt, kann geschlossen werden, dass seine Abwesenheit in der ECM des Kolons der wahrscheinlichste onkogene Auslöser für die Entwicklung von Kolonkarzinom bei Mäusen der vorliegenden Erfindung ist. Tatsächlich wurde in mehreren Studien ein Zusammenhang zwischen Defekten im TGF-β-Signalweg und Kolorektalkarzinom festgestellt. Zum Beispiel entwickeln Mäuse mit Nullmutationen im TGF-β-Signaltransduktionsprotein, Smad 3, Tumoren, die den in 3C7-Mäusen wachsenden Tumoren ähnlich sind (Zhu, Y. et al. (1998), Cell 94, 703-714). Weiterhin sind Mutationen in den TGF-β-Signaltransduktionsproteinen Smad 2 und Smad 4 oder Mutationen in den TGF-β-II-Rezeptoren bei humanen Kolorektalkarzinomen sehr häufig, was vermuten lässt, dass TGF-β und seine nachgeschalteten Zielmoleküle tumorsupprimierende Funktionen haben (Markowitz, S. et al. (1995), Science 268, 1336-1338, Riggins, G.J. et al. (1997), Cancer Res. 57, 2578-2580, Zhou, S. et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2412-2416). Die vorliegende Erfindung beweist also, dass LTBP-4 für die Integrität der ECM wichtig ist und onkogene Transformation, Krebszellinvasion und metastatische Ausbreitung verhindert.
Eine der vorteilhaftesten Beobachtungen, die in dieser Erfindung gemacht wurden, ist die Gewebeselektivität der LTBP-4-Mutation. Nur die Lunge, das Herz und das Kolon entwickelten bei mutanten Mäuse der Erfindung eine Krankheit, was darauf hinweist, dass LTBP-4 ein hochgradig gewebespezifisches Protein ist. Außerdem zeigt diese Gewebespezifität auch, dass latente TGF-β-Bindungsproteine trotz der ausgedehnten strukturellen Ähnlichkeiten, wenn überhaupt, nur wenig überlappende Funktionen haben. Dementsprechend exprimieren die mutanten Mäuse normale Mengen von LTBP-1 und LTBP-2, was beweist, dass diese Isoformen nicht an die Stelle von LTBP-4 treten können (3C). Außerdem wurden LTBP-2 und LTBP-3 in Gen-Knockout-Studien völlig anderen Funktionen zugeordnet. Zum Beispiel sterben Mäuse, die Nullallele von LTBP-2 exprimieren, sehr früh in der Entwicklung, höchstwahrscheinlich aufgrund einer fehlerhaften Implantation (Shipley, J.M. et al. (2000), Mol. Cell. Biol. 20, 4879-4887). Dagegen entwickeln LTBP-3-Knockout-Mäuse aufgrund einer fehlerhaften Knochenbildung ausgedehnte Skelettabnormalitäten.
Alles in allem stellt die vorliegende Erfindung ein nichthumanes Tiermodell einer humanen Krankheit bereit, das einige entscheidende Funktionen von LTBP-4 erkennen lässt. In Anbetracht dieser Funktionen kann das Tiermodell der Erfindung verwendet werden, um neue Behandlungen für Bindegewebsstörungen, Lungenemphyseme, Kardiomyopathie und Krebs anzugeben und um Informationen über Krebs und über die normale und fehlerhafte Funktion von Bindegewebe, Lunge und Herz zu erhalten. Weiterhin kann das Tiermodell der vorliegenden Erfindung auch zur Analyse der molekularen Mechanismen von LTBP-4 und des TGF-β-Signalwegs und für die Identifizierung und Klonierung von Modifikator-Genen, die den mit Krebs, Lungenemphysem, Kardiomyopathie oder anderen Zuständen, die in dem Tiermodell der Erfindung vorkommen, zusammenhängenden Phänotyp modifizieren, verschlimmern, reduzieren oder hemmen können, verwendet werden. Außerdem kann das Tiermodell für die Identifizierung von frühen diagnostischen Markern für Krebs und/oder Lungenemphysem und/oder Kardiomyopathie oder andere Zustände, die in dem Tiermodell der Erfindung vorkommen, verwendet werden. Außerdem kann das Tiermodell der vorliegenden Erfindung auch zur Überwachung der Aktivität von Mitteln, die für die Prävention oder Behandlung von Krebs und/oder Lungenemphysem und/oder Kardiomyopathie oder anderen Zuständen, die in dem Tiermodell der Erfindung vorkommen, geeignet sind, und als Testmodellsystem für Mittel, von denen man annimmt, dass sie Krebs und/oder Lungenemphysem und/oder Kardiomyopathie oder andere Zustände, die in dem Tiermodell der Erfindung vorkommen, fördern oder verschlimmern, verwendet werden.
Beschreibung der Figuren
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Figuren veranschaulicht:
1: Kolorektalkarzinom bei Mäusen der vorliegenden Erfindung (die Mäuse der vorliegenden Erfindung, die hier als 3C7-Mäuse bezeichnet werden). A. Rektalprolaps (linkes Bild) und Verdauungstraktpräparat mit Kolorektaltumor (Pfeil) (rechtes Bild) einer 4 Monate alten Maus. B. Histologische Schnitte durch den Kolorektalbereich von Wildtyp- (+/+) und homozygoten 3C7-Mäusen (–/–). Oben: PAS-Anfärbung bei 200facher Vergrößerung. Unten: Immunfärbung für das proliferationsassoziierte Antigen Ki-67. Der Pfeil zeigt auf eine anomale dysplastische Krypte. Der Phänotyp –/– war über 6 Generationen von Rückkreuzungen gegenüber einem genetischen C57BL/6-Hintergrund stabil.
2: Lungenemphysem und Kardiomyopathie bei 3C7-Mäusen. A. Herz/Lungen-Präparate von Wildtyp- (+/+) und homozygoten 3C7-Mäusen (–/–). B. Lungen. Hämatoxylin/Eosin-Färbung bei 200facher Vergrößerung. C. Herzen. Hämatoxylin/Eosin-Färbung bei 200facher Vergrößerung. Der Phänotyp –/– war über 6 Generationen von Rückkreuzungen gegenüber einem genetischen C57BL/6-Hintergrund stabil.
3: Genfallenzerstörung des LTBP-4-Genlocus. A. Vorausgesagte Intron/Exon-Struktur des Maus-LTBP-4-Gens mit der Genfallenintegrationsstelle. Die Exon/Intron-Struktur wurde zusammengestellt, indem man die volle Länge der Maus-cDNA-Sequenz (SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2), die volle Länge der humanen cDNA-Sequenz und die verfügbare genomische Sequenz des zum humanen Chromosom 11 syntänen Mauschromosoms 7 verwendete. B. Struktur des U3Cre-Genfallen-Provirus (oben) und Northern-Blot-Analyse von 3C7-ES-Zellen (unten). Polyadenylierte mRNAs von sich differenzierenden ES-Zellen wurden durch Blotting auf Nylonfilter übertragen und mit ³²P-markierten Cre- oder L32-spezifischen Sonden hybridisiert. C. LTBP-4-Expression bei Wildtyp- (+/+) und homozygoten 3C7-Mäusen (–/–). Oben: Northern-Blot-Analyse. Polyadenylierte RNAs aus ausgewählten Mausgeweben wurden durch Blotting auf Nylonfilter übertragen und mit ³²P-markierter LTBP-4-Sonde hybridisiert. Die Sonde war ein 505-kb-Fragment, das sich zwischen den Nucleotiden 862 und 1367 der LTBPS-4-cDNA (SEQ ID Nr. 2) erstreckt (wegen der Lokalisierung siehe A). Unten: Immunblotting mit humanen Anti-LTBP-4- und Anti-LTBP-1-Antikörpern. Proteine von ausgewählten Gewebeaufschlüssen wurden auf denaturierenden Polyacrylamid-Gelen getrennt, auf Nitrocellulosemembranen übertragen und mit polyklonalen Anti-LTBP-1- oder Anti-LTBP-4-Antikörpern umgesetzt.
4: Sequenz von Intron 5 des Maus-LTBP-4-Gens. Ein Pfeil weist auf die Genfallen-Integrationsstelle hin. Spleißdonor- und Spleißakzeptorstellen wurden unterstrichen.
5: Elastische Fasern in ausgewählten Geweben von homozygoten 3C7-Mäusen. Die Schnitte wurden mit Weigerts Resorcin-Fuchsin angefärbt und unter 200facher Vergrößerung analysiert (+/+ Wildtypmäuse; –/– 3C7-Mäuse).
6: Intrazelluläres vs. extrazelluläres TGF-β1 in ausgewählten Mausgeweben. Gewebeschnitte wurden mit polyklonalen TGF-β-Antikörpern angefärbt, die spezifisch für die intrazelluläre (LC) oder extrazelluläre (CC) Form von TGF-β1 sind.
Beispiele
Die Erfindung wird beispielhaft durch die folgenden veranschaulichenden, aber nichteinschränkenden Beispiele beschrieben:
Beispiel 1. Ein Stammzellklon, der aus einem Genfallen-Screening gewonnen wurde, erzeugt bei transgenen Mäusen einen komplexen Krankheits-Phänotyp
Aus einem größeren Screening nach Genfallenintegrationen in Gene, die während der ES-Zelldifferenzierung induziert werden (Thorey, I.S. et al. (1998), Mol. Cell Biol. 18, 3081-3088), wurde eine Integration erhalten (hier als 3C7 bezeichnet), die einen komplexen Krankheitsphänotyp erzeugte, wenn sie in transgenen Mäusen bis zur Homozygotie gezüchtet wurde.
Vom 129/Sv-Stamm abgeleitete (D3) ES-Zellen wurden auf bestrahlten (32 Gy) MEF-Feeder-Schichten in DMEM, das mit 15% (v/v) vorselektiertem und hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS) (Linaris, Bettingen, Deutschland), 100 mM nichtessentiellen Aminosäuren (Gibco), 0,1 mM Mercaptoethanol (Sigma), 1000 E/ml leukämiehemmendem Faktor (LIF) (Esgro^®, Gibco/BRL) und 5 mg/ml Penicillin und Streptomycin ergänzt war, gezüchtet. Die Differenzierung wurde durch Entzug von LIF und Feeder-Schichten während 4 Tagen induziert (Thorey, I.S. et al. (1998), Mol. Cell. Biol. 18, 3081-3088). Eine Infektion von ES-Zellen mit dem U3Cre-Genfallenvirus wurde durchgeführt, indem man 150 ES-Zellen 2 Stunden lang mit 50 μl des zuvor beschriebenen virushaltigen Überstands inkubierte (Thorey, I.S. et al. (1998), Mol. Cell. Biol. 18, 3081-3088).
Von 129/Sv(D3)-ES-Zellen abgeleitete Chimären wurden durch Injizieren von C57BL/6-Blastocysten erzeugt. Die resultierenden männlichen Chimären wurden mit C57BL/6-Weibchen gepaart, und die Aguti-Nachkommen wurden durch Schwanz-Blotting auf Transgen-Transmission getestet. Mäuseschwanz-DNA wurde mit BglII gespalten, das kein Provirus schneidet. Die DNA wurde auf 1%-Agarose-Gelen fraktioniert, durch Blotting auf Hybond-N-Nylonfilter (Amersham/Pharmacia, Piscataway, NJ) übertragen und mit einer ³²P-markierten Sonde mit einer provirusflankierenden Sequenz hybridisiert. Tiere, die in Bezug auf die Genfalleninsertion heterozygot waren, wurden über wenigstens sechs Generationen mit C57BL/6-Mäusen rückgekreuzt, bevor die Phänotypen in den heterozygoten und homozygoten Nachkommen analysiert wurden.
Bis zum Alter von vier Wochen entwickelten 3C7-Mäuse einen Rektalprolaps, der durch ein ausgedehntes Ödem in der Schleimhautschicht des Kolorektalbereichs induziert wurde (1A, linkes Bild). Paraffinschnitte von Mäusegeweben wurden hergestellt und gemäß den Standard-Histopathologieverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, angefärbt. Mikroskopisch zeigte der Bereich dysplastische und/oder kollabierte Krypten mit einer erhöhten Zahl von Becherzellen (Daten nicht gezeigt). Läsionen dieses Typs stehen mit einem präneoplastischen Stadium von Kolonkarzinom im Einklang, und tatsächlich entwickelten 3C7-Mäuse bis zum Alter von 4-6 Monaten sichtbare Tumoren mit Durchmessern von 0,7 bis 1,5 cm (1A, rechtes Bild). Histologisch bestanden die Tumoren aus unregelmäßigen Krypten, die durch hochproliferative anaplastische Zellen gebildet wurden, die die Schleimhautschicht und die Schicht der glatten Muskelzellen der Kolonwand infiltrierten (1B). Diese Pathologie ist typisch für aggressive Adenokarzinome und ist ähnlich wie bei den Karzinomen, die sich bei Smad-3-Knockout-Mäusen entwickeln (Zhu, Y. et al. (1998), Cell 94, 703-714). Da Smad 3 ein stromabwärts gelegener Angriffspunkt von TGF-β ist, ließ die Ähnlichkeit zwischen den Tumoren vermuten, dass sich die Tumoren sowohl bei Smad-3-Knockout- als auch bei 3C7-Mäusen als Folge eines fehlerhaften TGF-β-Signalwegs entwickelten.
Neben den Tumoren entwickelten 3C7-Mäuse ein Lungenemphysem, das im Unterschied zu den Tumoren bereits bei der Geburt vorhanden war. Das Emphysem verschlimmerte sich mit der Zeit, so dass die Lungen von 3C7-Mäusen bis zum Alter von 4-6 Monaten die normale Größe vierfach übertrafen (2A, B). Histologisch waren die Alveolarräume erweitert, aufgebläht und zahlenmäßig erheblich reduziert. Sie waren von dünnen, dysplastischen und häufig unvollständigen Septumwänden umgeben (2B). Das lobuläre Bindegewebe war reduziert und durch multifokale atelektatische Bereiche ersetzt. Dies führte zu einem fast vollständigen Verlust der Lungenelastizität. Das Emphysem war mit einer Kardiomegalie verbunden, die biventrikuläre Dilatation und myofibrilläre Hypertrophie beinhaltete (2C). In den meisten Fällen überstieg der Herz/Körpergewicht-Index den normalen Wert um 30%.
Klinisch waren die Tiere bis zu einem Alter von 4-6 Monaten gesund, aber danach verschlechterte sich ihr allgemeiner Zustand. In diesem Stadium wurden die Mäuse aufgrund von schwerer Dyspnoe und Prolapsinfektionen, die häufig bis zu einer ulzerativen Proktitis fortschritten, getötet. Die Autopsie zeigte eine massive inflammatorische Infiltration der Kolonwand, die mit einer reaktiven Splenomegalie verbunden war. (Alle anderen Organe und Gewebe waren mikroskopisch normal. Die Analyse beinhaltete die Leber, Niere, den Darm, die Lymphknoten, das Gehirn, Knochenmark, den Thymus, die Nebennieren, die Hypophyse, Schilddrüse, Bauchspeicheldrüse, Eierstöcke, Gebärmutter und Hoden.)
Da heterozygote Mäuse von Wildtypmäusen nicht unterscheidbar waren und die Transgen-Vererbung mit einem Mendelschen Muster im Einklang stand, wurde geschlossen, dass die Genfalle die Funktion eines autosomalen rezessiven Gens zerstört hatte.
Beispiel 2. Die Genfallenintegration bei 3C7-Mäusen ist im 5. Intron des LTBP-4-Gens lokalisiert
Um das für den 3C7-Phänotyp verantwortliche Gen zu identifizieren, wurde 5'RACE verwendet, um eine zelluläre Sequenz zu isolieren, die mit dem Provirus cotranscribiert wird (Genfallensequenzmarker, GTST) (Wiles, M.V. et al. (2000), Nat. Genet. 24, 13-14). Normalerweise selektiert der bei diesen Experimenten eingesetzte Typ der retroviralen Genfalle nach Integrationen in Exons (Exonfalle), und in den meisten Fällen werden Sequenzen stromaufwärts der Integrationsstelle als Zelle-Provirus-Fusionstranscripte transcribiert, die leicht durch RT-PCR identifiziert werden können (Wempe, F. et al. (2001), Genome Biol. 2, Research 0023.1-0023.10). Da 5'RACE und Northern-Blotting keine Zelle-Provirus-Fusionstranscripte zeigten (3B), wurde geschlossen, dass in diesem Fall die Genfalle, die normalerweise ausgehend von einem stromaufwärts gelegenen zellulären Promotor transcribiert wird, stattdessen durch einen nahegelegenen zellulären Enhancer aktiviert wurde. Enhancer-Aktivierungen mit dieser Art von Genfalle wurden beobachtet, da sie noch einen minimalen Promotor im 5'LTR enthält (3B) (Thorey, I.S. et al. (1998), Mol. Cell. Biol. 18, 3081-3088). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass die Genfalle in ein Intron integriert worden war und daher für das Klonieren durch RT-PCR nicht zugänglich war. Inverse PCR und Genome-Walking wurden verwendet, um die genomische Sequenz zu isolieren, die die Provirus-Integrationsstelle überspannt.
Inverse PCR ausgehend von genomischer DNA wurde unter Verwendung des glatte Enden erzeugenden Restriktionsenzyms SspI und von Cre-spezifischen Primern durchgeführt (Wempe, F. et al. (2001), Genome Biol. 2, Research 0023.1-0023.10). Ein 210-nt-Amplifikationsprodukt wurde in den p-GEMT-Vektor (Promega, Madison, WI) kloniert und unter Verwendung eines ABI 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer, Foster, CA) sequenziert. Die stromaufwärts gelegene Provirus-flankierende Sequenz wurde durch Genome Walking verlängert, wobei man den Maus-GenomeWalker-Kit (Clontech, Palo Alto, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers und die spezifischen, auf die flankierende Sequenz gerichteten Vorwärtsprimer 5'-AAGAGGGAGAAGAAACTGGGCTGG-3' (SEQ ID Nr. 3) und 5'-TCCTGTAGTGTTTGCCCCTG-3' (SEQ ID Nr. 4) verwendete. Ein 781 bp großes genomisches Contig, das die Provirus-Integrationsstelle überspannt, wurde ausgehend von der EcoRV-Bibliothek des Kits amplifiziert und als Sonde verwendet, um die Lambda-TripleEx-5'-Stretch-PLUS-Mausnieren-cDNA-Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) und die genomische Lambda-EMBL3-Mausleber-Bibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) zu durchmustern. Positive Plaques wurden mit Standardmethoden gereinigt, und Inserts wurden nach Subklonieren in Bluescript-Vektoren sequenziert.
Das 781-nt-Contig wurde kloniert und sequenziert und verwendet, um Übereinstimmungen in den öffentlichen Datenbanken zu finden. Zelluläre Sequenzen, die Provirus-Integrationen benachbart sind (Genfallensequenzmarker, GTSTs), wurden in den genomischen NCBI/NIH-Datenbanken (http://www.ncbi.nlm.nih) unter Verwendung des Blast-Algorithmus gesucht. Da nach ausgedehnter Suche keine Übereinstimmungen gefunden wurden, wurde geschlossen, dass das gefangene Gen noch unbekannt ist. Um das Gen zu identifizieren, wurden cDNA- und genomische Bibliotheken mit Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, mit dem genomischen Contig durchsucht, was zur Isolierung eines 12 kb großen genomischen Fragments mit zwei kurzen Stücken mit Homologie mit der humanen cDNA, die das latente Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 (LTBP-4; Genbank Zugriffs-Nr. AF051344; ref. NM/003573.1; AF051345) codiert, führte. Die übereinstimmenden Segmente entsprachen den Exons 6 und 7, die das 5'-Ende des ersten EGF-Repeats codieren, welches bekannten Spleißvarianten gemeinsam ist (Saharinen, J. et al. (1998), J. Biol. Chem. 273, 18459-18469) (3A). Die Spleißvarianten LTBP-4L (lange Spleißvariante) und LTBP-4S (kurze Spleißvariante) der Maus-LTBP-4-cDNA sind in SEQ ID Nr. 1 bzw. SEQ ID Nr. 2 gezeigt.
3A zeigt, dass die Genfallenintegration in das 5. Intron des Maus-LTBP-4-Gens in einer reversen Transcriptionsorientierung relativ zu dem Gen stattgefunden hatte. Diese umgekehrte Orientierung erklärt das Fehlen eines Zelle-Provirus-Fusionstranscripts und spricht für eine Genfallenaktivierung durch einen zellulären Enhancer. Die Sequenz von Intron 5 des Maus-LTBP-4, die die Genfallenintegration enthält, ist in 4 und in SEQ ID Nr. 5 gezeigt.
Beispiel 3. Die Integration des Provirus in LTBP-4 unterbricht die Genexpression in schwerwiegender Weise
Um zu untersuchen, ob die Zerstörung des proviralen Introns die Genexpression stört, wurde mRNA aus einer Vielzahl von Mäusegeweben auf Northern-Blots mit einer LTBP-4-spezifischen Sonde hybridisiert. Für Northern-Blots wurden 2,5 μg Poly(A)⁺-mRNAs, die mit dem FastTrack-2.0-mRNA-Reinigungskit (Invitrogen, Carlsbad, CA) gereinigt worden waren, in 1%-Formaldehyd-Agarose-Gelen fraktioniert, auf Hybond-N-Nylonfilter übertragen und mit einer ³²P-dCTP-markierten LTBP-4-spezifischen Sonde hybridisiert. Die Sonde war ein 505-bp-Fragment, das in der Maus-LTBP-4S-cDNA zwischen den Nucleotiden 862 und 1367 lokalisiert ist (SEQ ID Nr. 2). Alle Sonden wurden durch statistisches Primen unter Verwendung des Rediprime-Kits (Amersham/Pharmacia, Piscataway, US) hergestellt. Blots wurden auf Kodak-Biomax-Autoradiographie-Film einwirken gelassen. Wie in 3C (oben) gezeigt ist, exprimierten Mäuse, die in Bezug auf die Genfallenintegration homozygot waren, weniger als 2% normale LTBP-4-mRNA. Die Transcriptionsniveaus bei Wildtypmäusen waren in der Lunge, im Herzen und im Kolon signifikant höher als in anderen Geweben, was eine Verknüpfung zwischen dem Phänotyp und der LTBP-4-Expression beweist (3C).
Um zu testen, ob die Proteinmengen in ähnlicher Weise reduziert waren, wurde derselbe Bereich von Geweben durch Immunoblotting unter Verwendung eines spezifischen Anti-LTBP-4-Antikörpers analysiert (Saharinen, J. et al. (1998), J. Biol. Chem. 273, 18459-18469). Gleiche Mengen von ausgewählten Geweben wurden in eiskaltem RIPA-Puffer homogenisiert (150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% Natriumdesoxycholat in 50 mM Tris-HCl, pH 7,2). Nach der Zentrifugation wurde das unlösliche Desoxycholat-Sediment in PBS gewaschen und mit Plasmin verdaut (Taipale et al. (1992), J. Biol. Chem. 267: 25378-25384). Nach der Zugabe von Protease-Inhibitoren (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) wurden die Überstände in Microcon-30-Konzentratoren (Amicon, Millipore Corp., Bedford, MA) konzentriert. Proteine wurden auf 7%-SDS/PAGE-Gelen fraktioniert und auf Protran-Nitrocellulosemembranen (Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) übertragen. Nach der Behandlung mit polyklonalen Anti-LTBP-1- oder Anti-LTBP-4-Antikörpern wurde ein Immunnachweis durchgeführt (Saharinen et al. (1998), J. Biol. Chem. 273, 18459-18469). Wie in 3C (unten) gezeigt ist, war in 3C7-Mäusen kaum Protein nachweisbar, und die Mengen folgten eng dem Muster der mRNA-Expression in den Wildtypmäusen. Zusammengenommen zeigten die Ergebnisse, dass die Genfallenintegration in das 5. Intron des LTBP-4-Gens fast zu einem Nullallel führte.
Beispiel 4. Elastische Fasern in der Lunge und im Kolon erfordern LTBP-4
Zusammen mit Fibrillinen bilden LTBPs eine Hülle von Mikrofibrillen, die den Elastinkern der elastischen Faser umgibt. Fibrilline sind für die Integrität von elastischen Fasern essentiell, und Mutationen in den Fibrillin-Genen sind bei Bindegewebsstörungen, wie Marfan-Syndrom, häufig. Da sich gezeigt hat, dass 3C7-Mäuse keine elastischen Fasern zusammensetzen können, insbesondere in der Lunge und im Kolon, ist das Tier der vorliegenden Erfindung ein geeignetes Modell, um die Rolle von LTBP-4 für das Zusammensetzen von elastischen Fasern zu untersuchen. Um dies zu testen, wurden elastische Fasern unter Verwendung eines elastinspezifischen histologischen Farbstoffs sichtbar gemacht. Gewebe wurden in 4%igem gepuffertem Formalin fixiert, durch eine abgestufte Reihe von Alkohol geführt, in Xylol geklärt und 8 Stunden lang in einen Gewebeprozessor gelegt. Paraffinschnitte von 5 μm wurden mit einem Rotationsmikrotom hergestellt und auf lysinbeschichtete Objektträger gelegt. Nach 45 Minuten Inkubation bei 65°C wurden die Objektträger in Xylol entparaffiniert. Nach dem Rehydratisieren in doppelt destilliertem H₂O wurden die Objektträger 6 Stunden lang bei Raumtemperatur in Weigerts Resorcin-Fuchsin-Lösung (70% v/v Ethanol, 1% v/v konz. Salzsäure und 0.2% v/v Resorcin-Fuchsin [Chroma, Münster, Deutschland]) eingetaucht. Nach dem Waschen in doppelt destilliertem H₂O wurden die Objektträger in Alkohol dehydratisiert und in Permount montiert.
5 zeigt, dass die Lunge und das Kolon von 3C7-Mäusen keine elastischen Fasern aufwiesen und stattdessen multiple Flecken von fragmentiertem und kondensiertem Elastin aufwiesen (5). Überraschenderweise erschienen elastische Fasern im Herzen durch die Mutation unverändert, was darauf hinweist, dass die schwere Kardiomyopathie wenigstens zum Teil sekundär bezüglich des Emphysems ist (5). Zusammengenommen zeigen die Ergebnisse, dass LTBP-4 für das Zusammensetzen von elastischen Fasern essentiell ist.
Beispiel 5. Der Export von TGF-β1 zur ECM erfordert LTBP-4
Vor kurzem wurde gezeigt, dass von allen TGF-β-Isoformen in vitro nur TGF-β1 an LTBP-4 bindet (Saharinen, J. & Keski-Oja, J. (2000), Mol. Biol. Cell. 11, 2691-2704). Weiterhin sind LTBPs für den Export von TGF-β zur ECM verantwortlich. Um zu testen, ob Mäusen, denen LTBP-4 fehlt, auch extrazellulärer TGF-β1 fehlt, wurden Anti-TGF-β1-Antikörper verwendet, die TGF-β1-Epitope erkennen, welche sich selektiv innerhalb (LC) oder außerhalb (CC) der Zelle zeigen (Flan ders, K.C. et al. (1989), J. Cell Biol. 108, 653-660, Thompson, N.L. et al. (1989), J. Cell Biol. 108, 661-669). Für Immunfärbungen wurden Objektträger mit deparaffiniertem und rehydratisiertem Gewebe zuerst 30 Minuten lang mit 30%igem H₂O₂ behandelt, um die endogene Peroxidase zu blockieren. Nach Abspülen in doppelt destilliertem H₂O und 5-10 Minuten Tränken in PBS wurden die Objektträger mit 10% (w/v) BSA in PBS behandelt, um unspezifische Proteinbindungsstellen zu entfernen. Dann wurden die Objektträger über Nacht bei 4°C dem polyklonalen Anti-TGF-β1-CC(1-30)- und Anti-TGF-β1-LC(1-30)-Antikörper in Konzentrationen von 1 μg/ml bzw. 4 μg/ml ausgesetzt (Flanders, K.C. et al. (1989), J. Cell Biol. 108, 653-660). Nach dem Entfernen von überschüssigem Antikörper wurden die Objektträger 30 Minuten lang bei 37°C mit biotinmarkiertem Anti-Maus-Antikörper (Dianova, Hamburg) und schließlich 20 Minuten lang bei 37°C mit Meerrettich-Peroxidase(HRP)-markiertem Streptavidin (Zymed, CA) behandelt. Nach dem Waschen wurden die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur in Diaminobenzidin (Sigma, St. Louis, MO) inkubiert. Die Objektträger wurden nach Entfernen des überschüssigen Substrats in doppelt destilliertem H₂O unter einem herkömmlichen Mikroskop untersucht.
Die immunhistochemische Analyse zeigte, dass die Lunge, das Kolon und das Herz bei 3C7-Mäusen keinen extrazellulären TGF-β1 enthielten. Da die intrazellulären Mengen normal waren, beweisen die Ergebnisse einen Defekt beim Exportieren von TGF-β1 zur ECM. Dieser Defekt ist gewebespezifisch, da die Nieren von 3C7-Mäusen normale extrazelluläre TGF-β1-Mengen aufwiesen (6).
Sequenzprotokoll

Claims

Nichthumanes Tiermodell, das kein funktionelles latentes Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 (LTBP-4) produziert oder das suboptimale Mengen an latentem Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 (LTBP-4) produziert, wobei das Tier Krebs, Lungenemphysem oder Kardiomyopathie aufweist.
Tiermodell gemäß Anspruch 1, wobei das Genom des Tiers eine homozygote Zerstörung des LTBP-4-Gens umfasst.
Tiermodell gemäß Anspruch 2, wobei die homozygote Zerstörung durch eine Mutation entstanden ist.
Tiermodell gemäß Anspruch 3, wobei die Mutation eine Insertions-, Deletions- oder Substitutionsmutation ist.
Tiermodell gemäß Anspruch 3, wobei die Mutation durch Gen-Targeting, Genfallenintegration oder -mutagenese entstanden ist.
Tiermodell gemäß Anspruch 3, wobei die Mutation in einem Exon, Intron, regulatorischen Bereich oder einer Spleißstelle des LTBP-4-Gens aufgetreten ist.
Tiermodell gemäß Anspruch 6, wobei die Mutation in Intron 5 des LTBP-4-Gens aufgetreten ist.
Tiermodell gemäß Anspruch 7, wobei der Krebs ein Kolonkarzinom ist.
Tiermodell gemäß Anspruch 1, wobei das Tier ein Säuger ist.
Tiermodell gemäß Anspruch 9, wobei der Säuger eine Maus oder eine Ratte ist.
Zelle, die aus einem nichthumanen Tiermodell isoliert wurde, dessen Genom eine homozygote Zerstörung des LTBP-4-Gens umfasst, so dass dieses Gen kein funktionelles latentes Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 (LTBP-4) produziert oder suboptimale Mengen an latentem Transformierender-Wachstumsfaktor-β-Bindungsprotein 4 (LTBP-4) produziert.
Zelle gemäß Anspruch 11, wobei die Zelle aus einem Kolon, einer Lunge oder einem Herzen stammt.
Nichthumane Zelle, deren Genom eine homozygote Zerstörung des LTBP-4-Gen umfasst.
Zelle gemäß Anspruch 13, wobei die Zelle eine embryonale Stammzelle ist.
Verfahren zum Auswählen eines Mittels zur Behandlung eines Symptoms, das im Tiermodell von Anspruch 1 auftritt, umfassend: a) Anwenden von einem oder mehreren zu testenden Mitteln auf das Tiermodell von Anspruch 1; b) Bestimmen, ob ein oder mehrere Symptome, die in dem Tiermodell von Anspruch 1 auftreten, sich infolge der Anwendung des oder der Mittel verändert haben.
Verfahren gemäß Anspruch 15, wobei das Symptom aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus Krebs, Lungenemphysem und Kardiomyopathie besteht.
Verfahren zum Analysieren, ob Krebs und/oder Lungenemphysem und/oder Kardiomyopathie durch ein unterschiedliches LTBP-4-Gen oder unterschiedliche Proteinexpression oder ein unterschiedliches Expressionsniveau oder durch einen Defekt im LTBP-4-Gen verursacht wird, umfassend: a) Charakterisieren des LTBP-4-Gens oder der Proteinexpression oder des Expressionsniveaus oder des LTBP-4-Gen-Allelstatus eines Individuums, das Krebs, Lungenemphysem oder Kardiomyopathie hat; b) Charakterisieren des LTBP-4-Gens oder der Proteinexpression oder des Expressionsniveaus oder des LTBP-4-Gen-Allelstatus einer Kontrolle; wobei das Verfahren nicht am menschlichen oder tierischen Körper praktiziert wird und wobei ein Unterschied im LTBP-4-Gen oder in der Proteinexpression oder im Expressionsniveau oder im LTBP-4-Gen-Allelstatus darauf hinweist, dass Krebs und/oder Lungenemphysem und/oder Kardiomyopathie durch ein unterschiedliches LTBP-4-Gen bzw. unterschiedliche Proteinexpression bzw. ein unterschiedliches Expressionsniveau bzw. durch einen Defekt im LTBP-4-Gen verursacht wird.
Verfahren zum Diagnostizieren von Krebs und/oder Lungenemphysem und/oder Kardiomyopathie, umfassend: a) Charakterisieren des LTBP-4-Gens oder der Proteinexpression oder des Expressionsniveaus oder des LTBP-4-Gen-Allelstatus eines Individuums; b) Charakterisieren des LTBP-4-Gens oder der Proteinexpression oder des Expressionsniveaus oder des LTBP-4-Gen-Allelstatus einer Kontrolle; wobei das Verfahren nicht am menschlichen oder tierischen Körper praktiziert wird und wobei ein Unterschied im LTBP-4-Gen oder in der Proteinexpression oder im Expressionsniveau oder im LTBP-4-Gen-Allelstatus auf Krebs und/oder Lungenemphysem und/oder Kardiomyopathie bei dem Individuum hinweist.
Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, wobei die LTBP-4-Expression oder das LTBP-4-Expressionsniveau durch RT-PCR, Northern-Analyse, Mikroarray-Analyse oder gegen LTBP-4-Protein gerichtete Antikörper nachgewiesen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 17 oder 18, wobei der LTBP-4-Gen-Allelstatus durch Mutations-Screening nachgewiesen wird.