JPH07132033A - アルツハイマー病モデルトランスジェニック動物 - Google Patents

アルツハイマー病モデルトランスジェニック動物

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JPH07132033A
JPH07132033A JP5306026A JP30602693A JPH07132033A JP H07132033 A JPH07132033 A JP H07132033A JP 5306026 A JP5306026 A JP 5306026A JP 30602693 A JP30602693 A JP 30602693A JP H07132033 A JPH07132033 A JP H07132033A
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alzheimer
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peptide
seq
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正宏 佐藤
Takashi Kobayashi
隆志 小林
Norihiro Tada
昇弘 多田
Mikio Shoji
幹夫 東海林
Takeshi Kawarabayashi
毅 瓦林
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    • A01K2267/0312—Animal model for Alzheimer's disease

Abstract

(57)【要約】 【構成】 １) ベータアクチンプロモーターのＤＮＡ配
列、 ２) サイトメガロウイルスエンハンサーのＤＮＡ配列、 ３) ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のシグナルペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列、および ４) ヒトベータアミロイド前駆体蛋白の９９ないし１０
３個のアミノ酸残基長のＣ末端ペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を含むことを特徴とする組み換え遺伝子が、体
細胞および生殖細胞に組み込まれた、ヒト以外の哺乳動
物であるアルツハイマー病モデルトランスジェニック動
物。 【効果】 本発明のトランスジェニック動物は、動物脳
内に形成される抗ベータ蛋白抗体反応性物質等のアルツ
ハイマー病特有のパラメーターを減少させる能力に関す
る薬剤の効果検定に利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、一般的に疾患の治療
に関連した薬の開発に有効な動物モデルに関するもので
ある。更に詳しくは、ベータアミロイド前駆体蛋白（β
−amyloid precursor protein, APP：以後、これをＡＰ
Ｐと呼ぶ）の一部をコードする外来性遺伝子構築体を自
らのゲノムに取り込んだトランスジェニック（transgen
ic）動物の作製に関するもので、その中で、外来性遺伝
子構築体をどの細胞タイプでも広く過剰発現させるよう
仕組まれている。
【０００２】
【従来の技術】最近の発生工学の発展により、外来性遺
伝物質（ＤＮＡ）を胚の核内へ注入するか感染させるこ
とにより、胚の染色体にその物質を組み込んだ胚（いわ
ゆる形質転換胚）を作ることができるようになった(Gor
don J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.7
7, p.7380-7384, 1980；Jaenisch R. et al., Cell, vo
l.32, p.209-216, 1983）。この胚は、仮親（里親）に
移植することにより、成長させることができ、得られた
成体動物は外来性DNAを自らの染色体に取り込んでお
り、且つそれを発現することができる。形質転換された
個体は、一般的にトランスジェニック動物と呼ばれる
（Gordon J. and Ruddle F., Science, vol.214,p.1244
-1246, 1981）。取り込まれた外来性DNAは、トランスジ
ーン（transgene）と呼ばれ、一般的にプロモーターと
ｃＤＮＡ等の目的遺伝子とから成る。外来性ＤＮＡの発
現は、成体にならずとも発現させることができ、例え
ば、胚の細胞分裂過程でも発現する場合がある。従っ
て、その発現の結果、外来性DNAによりコードされる蛋
白が生産され、特にその蛋白が生体にとって重要な機能
を果たしているなら、その個体の発生のある時点では、
個体の表現型に何らかの変化を引き起こすこともあり得
る。表現型の変化を与える様式としては、個体で発現さ
せるべき目的蛋白の過剰発現か、内在性の目的蛋白の発
現の抑制があり、それを制御するのは、目的蛋白をコー
ドする遺伝子の上流側に置かれているプロモーターかエ
ンハンサーである。尚、発現抑制の仕方としては、アン
チセンス法 (Katsuki M. et al., Science, vol.241,
p.593-595, 1988）等が挙げられる。
【０００３】個体が外来性DNAで形質転換された、ある
いはその結果、本来の表現型が変わったという報告は、
これまでに多くされており、特にPalmiter R.D. and Br
inster R.L.（Annu. Rev. Genet., vol.20, p.465-499,
1986）や Gordon J.W.（Int. Rev. of Cytobiol., vo
l.115, p.171-229, 1989）等の総説に詳しく述べられて
いる。このトランスジェニック動物は、1）発生過程で
の遺伝子発現のin vivoでの解析、2）遺伝病の克服また
は軽減に向けた研究等の分野で利用されうる。外来性Ｄ
ＮＡによる胚の形質転換は、外来性ＤＮＡを外から与え
ることにより、最終的に胚核内の染色体内のDNA配列の
一部に組み込まれることにより達成される。これを達成
するにはいくつかの方法があるが、例えば、外来性DNA
を微小ピペットに吸入し、これを１細胞期の前核内へ注
入する方法、所謂、顕微注入法(Gordon et al., 1980）
が一般的である。
【０００４】ＤＮＡを注入された胚はついで、偽妊娠雌
の生殖道（輸卵管または子宮）に移植することにより、
１個の生命体へと発生させることができる。この生命体
は後日、外来性ＤＮＡを自らの染色体に取り込んでいる
かどうか、ＰＣＲ法やサザンブロット法等で解析される
こととなる。もしこの取り込みが確認されたら、この動
物はin vivoにおける遺伝子発現解析（例えば、ノーザ
ンブロット法や免疫抗体法等による解析）に利用され
る。この発現により、ヒトのある遺伝病に似た形質を引
き起こすことも可能である。
【０００５】アルツハイマー病には、一説では後に述べ
るように、APPの過剰発現が関連すると考えられている
（Terry R.D. and Katsman R, Ann. Neurol. vol.14,
p.496-506, 1983）。アルツハイマー病患者脳には、ア
ルツハイマー病特有の神経原線維変化 [neurofibrillay
tangles (NFT)、paired helical filaments (PHF) :以
後これをＰＨＦと呼ぶ］、老人斑（neuritic plaque ま
たは senile plaque）及び脳アミロイド（amyloid）の
沈着があり、脳アミロイドはＡＰＰから生じるからであ
る。しかも、最近では、後で述べる家族性アルツハイマ
ー病や遺伝性脳血管アミロイドアンギオパチー（amyloi
d angiopathy）でＡＰＰの遺伝子異常が発見されたこと
や、脳内に沈着したアミロイドの主成分であるアミロイ
ドプラークコア蛋白（amyloid plaque core protein；A
PCP）あるいは、アミロイドコア蛋白（β−amyloid cor
e protein）（後日、このポリペプチドは ベータ蛋白ま
たはβ／Ａ４蛋白と命名される。以後、これをβ／Ａ４
蛋白と呼ぶ）自体が神経毒性を有するという報告（Yank
ner B.A. et al., Science, vol.245, p.417-420, 198
9）等から、ＡＰＰからβ／Ａ４蛋白が代謝され、沈着
する機序の解明がアルツハイマー病の病因解明の最も本
質的なアプローチと考えらている。しかし、残念なが
ら、これまでアルツハイマー病のモデルとなる動物が知
られていないか、あるいは、確立されていないため、こ
のような仮説を立証する手立てがなかった。そこで、人
為的にＡＰＰ遺伝子を組み込ませたトランスジェニック
動物を作り、このＡＰＰをトランスジェニック動物脳内
で過剰発現させ、アミロイド沈着を引き起こした結果、
最終的にアルツハイマー病に似た動物、所謂ヒトアルツ
ハイマー病モデルができる可能性がある。
【０００６】最近、ヒトのＡＰＰｃＤＮＡの全長あるい
はー部分を過剰発現させることにより、脳内のアミロイ
ド沈着を引き起こしたトランスジェニックマウスがいく
つかの研究室から相次いで報告された（Kawabata S. et
al., Nature, vol.345, p.476-478, 1991；Quon D. et
al., Nature, vol.352, p.239-241, 1991；Wirak D.O.
et al., Science, vol.253, p.323-325, 1991）。しか
し、Kawabata らの報告は、その後、追試に成功せず、
論文は撤回された（Nature, vol.356, p.265,1992）。
更に、Ｗｉｒａｋらの報告も、その形質変化はトランス
ジーンによるものではないということである（Science,
28, Feb., 1992）。特許出願でもいくつかのアルツハ
イマー病モデルトランスジェニック動物を確立したとい
う報告が、例えばＷＯ９３／１４２００、ＷＯ９３／０
２１８９、ＷＯ９２／１３０６９、ＷＯ９２／０６１８
７、ＷＯ９１／１９８１０、ＥＰ４５１７００及びＷＯ
８９／０６６８９として公開されているが、いずれも遺
伝子の構築だけであったり、得られたトランスジェニッ
ク動物で単にＡＰＰの沈着がみられたといった間接的な
証拠しかない。従って、現在のところ、はっきりとした
アルツハイマー病モデル動物は確立されていないと思わ
れる。これに対し、本発明で作出されたトランスジェニ
ック動物は、アルツハイマー病に伴う様々な症状と類似
した形質を示しており、この意味では本発明で作出され
たトランスジェニック動物は、アルツハイマー病の発症
原因の解明のための実験系を提供し、また、アルツハイ
マー病発症の阻止、あるいは、アルツハイマー病発症に
伴う神経細胞死等を阻止するようなアルツハイマー病治
療薬をスクリーニングするための系を提供し得るものと
言える。
【０００７】前にも述べたように、アルツハイマー病と
関連した形態学的、病理学的変化としては、ＰＨＦの形
成及び脳アミロイドの沈着の２点がある。ＰＨＦはアル
ツハイマー病以外の神経性疾患にも出現するが、神経と
神経の間に見られるアミロイド沈着、所謂、老人斑及び
脳血管周囲にも沈着するアミロイド沈着は、アルツハイ
マー病特異的と考えられている。特に、老人斑は高齢者
のダウン症候群患者脳（アルツハイマー病も発症させて
いる）でも見られる。老人斑アミロイドを構成する主要
蛋白は、部分的に精製され、約４.２ｋＤの３９〜４２
個のアミノ酸から成るβ／Ａ４蛋白から成ることが判明
した（Glenner G. and Wong C.W., BBRC, vol.120, p.1
131-1135, 1984）。このアミノ酸配列は決定され（Glen
ner G. and Wong C.W., 1984；Masters C.R. et al., P
roc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.82, p.4245-4249, 1
985）、そのアミノ酸配列はこれまで報告されている蛋
白のものと全く異なるものであった。
【０００８】近年、ヒト胎児脳組織ｃＤＮＡライブラリ
ーよりβ／Ａ４蛋白を含む比較的大きなサイズの蛋白
（前駆体）をコードするｃＤＮＡが単離され、そのＤＮ
Ａ配列解析から、６９５個のアミノ酸より成る（この蛋
白をＡ６９５という）こと、β／Ａ４蛋白は、アミノ酸
配列５９７−６９５の位置に相当することがわかった
（Kang J. et al., Nature, vol.325, p.733-736, 198
7）。更に、Ａ６９５以外にも、もっと大きいサイズの
ＡＰＰｃＤＮＡ（A751、A770） が報告された（Kitaguc
hi et al., Nature, vol.331, p.530-532, 1988)。この
Ａ７５１蛋白はＡ６９５に５６個分のアミノ酸が付与さ
れたもので、この特殊なインサートは、クニツファミリ
ー（Kunitz family）のセリンプロテアーゼインヒビタ
ー（serine protease inhibitor）（以下ＫＰＩと呼
ぶ）に非常に高い相同性を示す（Kitaguchi et al., 19
88）。一方、Ａ７７０蛋白は、Ａ７５１の５７個のイン
サートのすぐ後にＭＲＣ ＯＸ−２抗原に相同性の高い
１９個分のアミノ酸が挿入されたタイプである。これら
Ａ７５１、Ａ７７０は、全身臓器に多く発現している。
尚、この３者は、同一の遺伝子（ＡＰＰ）からアルター
ナティブスプライシング（alternative splicing）によ
って生じることが示されており（Kitaguchi et al.,198
8；Ponte P. et al., Nature, vol.331, p.525-527, 19
88; Tanz R. et al.,Nature, vol.331, p.528-530, 198
8）、いずれもＣ末端から９９番目の間にβ／Ａ４蛋白
部分を有すること（２８アミノ酸は細胞膜外に、１１〜
１４アミノ酸は細胞膜内に存在）から、脳内のアミロイ
ド沈着に関係する蛋白をコードするものと考えられる。
【０００９】アルツハイマー病患者脳におけるＡＰＰの
脳内局在を、ＡＰＰのいくつかの部位に対する数種の抗
体を作製し、免疫組織化学的に検討すると、老人斑等が
染められることが解かった（Wong C.W. et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, vol.82, p.8729-8732, 1985；
Allsop D. et al., Neurosci. Letter, vol.68, p.252-
256, 1986; Shoji M. et al., Brain Res., vol.512,
p.164-168, 1990a; Shoji M. et al., Am. J. Patho
l., vol.137, p.1027-1032, 1990b；Shoji M. etal., B
rain Res., vol.530, p.113-116, 1990c）。従って、ア
ルツハイマー病患者脳で見つかった老人斑を構成するア
ミロイド蛋白はこれら抗体により認識されると言える。
これらの抗体を用いて、例えば、ＡＰＰをある動物の脳
内で強制発現させた場合、ＡＰＰとその代謝分画蛋白の
神経における局在性を追跡することができる。
【００１０】ＡＰＰは全身臓器に広範に発現する蛋白で
あり、また、蛋白進化の過程でもよく保存された蛋白で
ある（マウスとヒトでは、アミノ酸レベルで97%の一致
が見られる）ことから、細胞間接着（cell-cell adhesi
on）や細胞分化等に重要な役割を果たしているものと想
定されたが（Shivers B.D. et al., EMBO. J., vol.7,
p.1365-1370, 1988）、正確な役割は未だに不明であ
る。最近、β／Ａ４蛋白が未分化な海馬神経細胞に対
し、低濃度では神経栄養因子として働く一方、成熟した
神経細胞に対しては、高農度では神経毒性として働くこ
とが示され、注目されている（Yankner B.A. et al., 1
989）。この実験系では、栄養因子と神経毒性として働
く部分は、β／Ａ４蛋白の２５〜３５番目のアミノ酸に
相当し、この部分はタヒキニン系のペプチドと相同性が
あることが示された（Yankner B.A etal., 1989）。こ
れに関連して興味深いのは、β／Ａ４蛋白を大脳皮質ま
たは海馬内へ注入すると、この現象がin vivo において
も起こること、及びＰＨＦの構成成分である異常燐酸化
タウ（tau）蛋白の生成が誘導された点である（Kowall
N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.88,
p.7247-7251, 1991）。従って、β／Ａ４蛋白蓄積とＰ
ＨＦ生成の深い関連が示唆された。更に、もっと最近で
は、ＡＰＰのC末端側の細胞内部位は、プロテイキナー
ゼＣやＣａ2+／カルモジュリン依存性プロテイキナーゼ
IIにより燐酸化され (Gandy S. et al.,Proc. Natl. A
cad. Sci., USA, vol.85, p.6218-6221, 1988）、ま
た、細胞膜直下に存在する主要ＧＴＰ結合蛋白であるG0
とAPPが相互作用するという報告（Nishimoto I et al.,
Nature, vol.362, p.75-78, 1993）もあり、ＡＰＰが
シグナル伝達にも関与する可能性が指摘されている。
【００１１】ＡＰＰ遺伝子はヒトの場合、第２１染色体
の長腕に存在することが知られている（Goldgaber D. e
t al., Science, vol.235, p.877-880, 1987）。近年、
家族性アルツハイマー病 (familial Alzheimer's dise
ase)のうち、早期発症型（発症年齢が６５歳以下のも
の）家系において、ＡＰＰのアミノ酸番号６４２(Kang
J. et al., 1987の配列に基づく；以下、ＡＰＰの塩基
配列、アミノ酸配列はKang J. et al., 1987に基づいて
表記してある）にＶａｌからＩｌｅへの突然変異が発見
された（Goate A. et al. , Nature, vol.349, p.704-7
06, 1991；NaruseS. et al., Lancet, vol.337, p.978-
979, 1991; Yoshioka K. et al., BBRC,vol.178, p.114
1- 1146, 1991；Hardy J. et al., Lancet, vol.337,
p.1342-1343, 1991）。更に、同じアミノ酸部位にＰｈ
ｅ、Ｇｌyという他の アミノ酸への突然変異が発見され
（Murrell J. et al., Science, vol.254, p.97-99, 19
91；Chartier-Harlin M-C et al., Nature, vol.353,
p.844-846, 1991）、家族性アルツハイマー病の発症に
このValの変異が重要な役割を果たしていると考えられ
ている。また、オランダ型（Dutch-type）の遺伝性脳出
血に伴うアミロイド沈着の場合、β／Ａ４蛋白の内部、
即ちＡＰＰのアミノ酸番号６１８にＧｌｕからＧｌｎへ
の突然変異がみられる（Levy E. et al., Science, vo
l.248, p.1124-1126, 1990）。更には、β／Ａ４蛋白の
Ｎ末端側の２個のアミノ酸の変異（アミノ酸番号５９５
のＬｙｓがＡｓｎへ、及びアミノ酸番号５９６のＭｅｔ
がＬｅｕへ変換）がスウェーデンの家族性アルツハイマ
ー病と関連することが提唱され(Mullan M. et al., Nat
ure Genet, vol.1, p.345-347, 1992)、このタイプはス
ウェーデン型突然変異と呼ばれる。このようにAPPに関
する分子生物学的解析は進んだが、アルツハイマー病患
者脳で何故アミロイドが蓄積され、沈着するか、そし
て、β／Ａ４蛋白の蓄積によりどのように神経細胞が変
性していくのかというメカニズムについては何ら有効な
情報は未だない。
【００１２】現在、最も問題となっているのは、脳内に
アミロイド沈着が生じるためには、ＡＰＰのどのような
代謝経路に問題があるのかで、詳細に検討され始めてい
る。例えば、ＡＰＰｃＤＮＡを導入したヒト胎児性腎臓
（embryonic kidney）細胞２９３株から、膜結合型C末
端分画９ｋＤを抽出し、そのN末端のアミノ酸配列を決
定した結果、β／Ａ４蛋白部分のＮ末端から１６番目の
ＬｙｓでＡＰＰが切断されていることが解かった（Esch
F.S. et al., Science, vol.248, p.1122-1124,199
0）。しかし、脳アミロイドとして沈着するには、ＡＰ
Ｐはβ／Ａ４蛋白部分のＮ末端とＣ末端で切断され凝集
することが必要であり、Ｅｓｃｈらの明らかにした代謝
系では不溶性のβ／Ａ４蛋白は生成されて来ない。この
点から更に、様々な代謝系の関与やその異常等が推定さ
れているが、未だ明らかな結果は得られていない。現在
のところ、ＡＰＰのプロセッシングには、1) ＡＰＰを
β／Ａ４蛋白部分の１５番目のアミノ酸で終わる分子量
１００ｋＤ以上の分泌性派生体（secretedderivative）
とＣ末端側の低分子産物とに分解される、いわゆる分泌
経路（secretary pathway）と、2) β／Ａ４蛋白の部分
を全長の形で含むC末端側の様々な大きさのペプチドを
生成する、いわゆるエンドゾーマル／リソゾーマル経路
（endosomal/lysosomal pathway）の２つがあると考え
られている（Golde T.E. et al, Science, vol.235, p.
728-730, 1992）。
【００１３】従って、上記家族性アルツハイマー病型、
オランダ型、及びスウェーデン型のＡＰＰ遺伝子上の３
箇所の突然変異が生じた際に、これらの２つの代謝経路
はどのように影響されるのかという点はまだ解決されて
いないが、これらＡＰＰアナログはＡＰＰのプロセッシ
ングの経路をエンドゾーマル／リソゾーマル経路に積極
的に変える構造を持つものと想定される。この意味で
は、これらＡＰＰアナログを過剰発現するトランスジェ
ニック動物システムは、ＡＰＰのプロセッシング機構を
明らかにするための有用な材料を提供するものである。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＡＰＰの合
成に関する分子機構、詳しくは、ＡＰＰ合成後のＡＰＰ
のプロセッシングに関する分子機構解明する方法を提供
するものである。更に重要なことは、β／Ａ４蛋白の合
成と沈着を阻止するための薬剤のin vivoスクリーニン
グ系を提供するものである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】アルツハイマー病に関連
したＡＰＰをコードするＤＮＡ断片を哺乳動物好ましく
はマウスの１細胞期胚の前核に顕微注入し、次いでこの
注入された胚は、偽妊娠メスに移植され、トランスジェ
ニック動物出産へと至る。このトランスジェニック動物
は、アルツハイマー病に関連するＡＰＰ蛋白を過剰発現
すると考えられる。注入されたＤＮＡには、トランスジ
ェニック動物の非特異的で様々なタイプの細胞で目的の
蛋白を発現せしめるようなプロモーターが含まれてい
る。β／Ａ４蛋白はＡＰＰのＣ末端側領域から生成され
るので、ＡＰＰのＣ末端側領域のみの大量発現は、β／
Ａ４蛋白の形成を促進し、その結果として、特有の神経
の退化及び老人斑の形成等が始まると考えられる。
【００１６】本発明の重要な点は、β／Ａ４蛋白を含む
ＡＰＰのＣ末端側領域を強力なプロモーターの制御の
下、神経やそれ以外のどのタイプの細胞でも過剰発現さ
せることができる点である。そして、その結果、アルツ
ハイマー病特有の海馬におけるアミロイドの沈着、燐酸
化タウ蛋白の出現、グリア細胞の増加、海馬付近におけ
る神経細胞死、更には、動物の活発的な行動の低下が引
き起こされる点である。また、内在性のＡＰＰｍＲＮＡ
のアルターナティブスプライシングのパターンの変化も
この発現によって引き起こされる点である。更に、本発
明の重要な点は、β／Ａ４蛋白の中で最底1箇所アミノ
酸の置換を持つアナログをコードするＤＮＡ配列を有す
るトランスジェニック動物を作出した点である。これに
より、ＡＰＰのエンドゾーマル／リソゾーマル経路にお
けるプロセッシングに変化をきたし、プロテアーゼの活
性特異性が変わるような蛋白が生じる可能性があり、そ
の結果、脳内での大量のアミロイドの蓄積が望まれる。
従って、本発明で紹介されたトランスジェニック動物
は、ＡＰＰ蛋白とプロテアーゼとの相互作用、あるい
は、内在性ＡＰＰと導入された外来性蛋白同志の相互作
用等をin vivoで研究するための有用な系を提供するも
のであり、また、アルツハイマー病治療薬の探索にも利
用できるものである。
【００１７】本発明の目的は、β／Ａ４蛋白に相当する
ＡＰＰのＣ末端側領域、及びそのアナログを神経細胞や
他の細胞に強力に発現せしめるために必要なＤＮＡ配
列、所謂、組み換えＤＮＡを有するトランスジェニック
動物を提供することであり、本発明の有用性としては、
このトランスジェニック動物がアルツハイマー病の病因
解析及びアルツハイマー病治療薬のin vivo スクリーニ
ングのために用いることができることである。本発明の
特徴としては、このトランスジェニック動物がＡＰＰの
大量合成、燐酸化タウ蛋白の出現、グリア細胞の増加、
神経細胞死等の一連のアルツハイマー病特有の症状を示
すため、これまで知られているＡＰＰ遺伝子導入トラン
スジェニックマウスに比べ、よりアルツハイマー病に近
い動物モデルであると言える。本発明をより具体的に説
明するため、以下に実施例を示す。
【００１８】
【実施例】次に掲載する実施例は、ＤＮＡ配列、融合
（fusion）構築体、トランスジェニックマウス等をどの
ように作るか等を完全に開示し、記載することを目的と
したものだが、これによって本発明が実施例に限定され
るものではない。
【００１９】実施例１ トランスジェニックマウスで発現されるべきプラスミド
ｐβＡ／ＮＯＲβ、ｐβＡ／ＦＡＤβ、ｐβＡ／Ｄβ、
ｐβＡ／ΔＮＯＲβ及びｐβＡ／ＮＬβの構築マウスで
発現させるべき目的遺伝子は以下のように作成した。正
常なヒトＡＰＰｃＤＮＡのシグナルペプチド（アミノ酸
番号１番目から１７番目）とβ／Ａ４蛋白に相当するＡ
ＰＰのＣ末端側（アミノ酸番号５９７番目から６９５番
目）との融合遺伝子（これをＮＯＲβと呼ぶ）をHorton
R.M. et al (Gene, vol.77, p.61-68, 1989）の方法に
習い合成した。先ず、ヒト脳 ｐｏｌｙ（A）ＲＮＡ（＃
6516-1；Clontech社）を材料とし、ＲＴ−ＰＣＲ法によ
りヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを合成した。用いたプラ
イマー（primer）は、リバースプライマーＢＡＰＰ−６
（配列番号７）、センスプライマーＢＡＰＰ−７（配列
番号８）、センスプライマーＢＡＰＰ−１０（配列番号
９）、 リバースプライマーＢＡＰＰ−１２（配列番号
１０）で、これらを適当に組み合わせて用いることによ
り、ＮＯＲβを合成した。合成されたＮＯＲβは、２％
アガロースゲルによる電気泳動で分画し、単離した。こ
のＮＯＲβは、ＸｂａＩ消化後、ｐＧＥＭ３Ｚ(−)（Pr
omega社）のＸｂａＩ部位へ導入し、この組み替えプラ
スミド（pGEM3Z／NORb）を大腸菌内にて増幅させ、ジデ
オキシ鎖終止法（dideoxy chain-termination）（Sange
r et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol.74, p.5
463-5468, 1977）によるシークエンシングを行い、ＮＯ
Ｒβ配列が目的通り、正しいことを確認した。
【００２０】Ｄβ（配列番号１と配列番号３の結合した
もの）及びＦＡＤβ（配列番号１と配列番号４の結合し
たもの）は、基本的にＮＯＲβと同じ構造であるが、Ｄ
βはＡＰＰアミノ酸番号６１８にＧｌｕからＧｌｎへの
変異を持つオランダ型の遺伝性脳出血アミロイドアンギ
オパチーで、ＦＡＤβはＡＰＰアミノ酸番号６４２にお
いてＶａｌからＩｌｅへの変異を持つ家族性アルツハイ
マー病に各々対応する。また、Ｄβ及びＦＡＤβは、そ
のＡＰＰｃＤＮＡ（Kang J. et al., 1987）３′側の非
コード領域約３０ｂｐを含んでいる。これらは、前記ヒ
ト脳ｃＤＮＡライブラリーを基にＨｏｒｔｏｎらの方法
に従い、ＰＣＲ法で目的の配列を増幅した。Ｄβの場
合、ＢＡＰＰ−１０、 ＢＡＰＰ−６、ＢＡＰＰ−７の
他、リバースプライマーＢＡＰＰ−８（配列番号１
１）、 センスプライマーＢＡＰＰ−２（配列番号１
２）、およびリバースプライマーＢＡＰＰ−１５（配列
番号１３）を用いた。ＦＡＤβの場合、ＢＡＰＰ−１
０、 ＢＡＰＰ−６、ＢＡＰＰ−７の他、リバースプラ
イマーＢＡＰＰ−３（配列番号１４）、センスプライマ
ーＢＡＰＰ−９（配列番号１５）およびＢＡＰＰ−１５
を用いた。
【００２１】ΔＮＯＲβ（配列番号５のペプチドのＮ端
にＭｅｔが付加したもの）は、１７個のアミノ酸から成
るシグナルペプチドがない点を除けば、基本的にＮＯＲ
βと同じ構造である。ΔＮＯＲβはセンスプライマーＢ
ＡＰＰ−１３（配列番号１６）およびＢＡＰＰ−１２を
用い、ｐＧＥＭ３Ｚ／ＮＯＲβに対しＰＣＲを行い、イ
ンサートを増幅させた。増幅された断片はｐＧＥＭ３Ｚ
にクローニングされ、次いで、シークエンシングを行
い、その配列の正しさを確認した。ＮＬβ（配列番号６
のペプチドのＮ端にＭｅｔが付加したもの）はΔＮＯＲ
βと同様、センスプライマーＢＡＰＰ−１４（配列番号
１７）およびＢＡＰＰ−１２を用い、ｐＧＥＭ３Ｚ／Ｎ
ＯＲβに対しＰＣＲを行い、インサートを増幅させた。
増幅された断片はｐＧＥＭ３Ｚにクローニングされ、シ
ークエンシングを行い、その配列の正しさを確認した。
ＮＬβはスウェーデン型の遺伝性アルツハイマー病に対
応するもので、ＡＰＰのアミノ酸番号５９５のＬｙｓが
Ａｓｎへ、及びアミノ酸番号５９６のＭｅｔがＬｅｕへ
変異している。
【００２２】一方、上記標的遺伝子を発現させるための
べクターを以下のように作成した。ニワトリベータアク
チンプロモーターとその上流にサイトメガロウイルスエ
ンハンサーを有する哺乳動物発現ベクターｐＣＡＧＧＳ
（Niwa H. et al., Gene, vol.108, p.193-200, 1991）
より２.３ｋｂ断片をＳａｌＩ／ＰｓｔＩ消化により切
り出し、これをクローニングベクター pBluescript（St
ratagene社)の ＳａｌＩ／ＰｓｔＩ部位へ挿入し、ｐＢ
ｓＣＡＧ−２ベクターを構築した（図１）。この２.３
ｋｂ断片の中には、上記エンハンサー／プロモターの他
に、ウサギベータグロビン遺伝子の一部（第２イントロ
ン、第３エクソン、３′側非コード領域から成る）が含
まれている。通常、ｃＤＮＡ等の発現させたい目的遺伝
子は、第３エクソンのＥｃｏＲＩ部位に挿入される。こ
のｐＢｓＣＡＧ−２のＥｃｏＲＩ部位に上記目的遺伝子
ＮＯＲβ、ＦＡＤβ、Ｄβ、ΔＮＯＲβ、及びＮＬβの
各種ＤＮＡ断片を挿入し、トランスジェニックマウス発
現用プラスミドｐβＡ／ＮＯＲβ、ｐβＡ／ＦＡＤβ、
ｐβＡ／Ｄβ、ｐβＡ／ΔＮＯＲβ、及びｐβＡ／ＮＬ
βを構築した（図２）。マウス１細胞期胚へのＤＮＡ導
入には、これら融合構築体よりＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ消
化によりトランスジーンを単離し、これを用いた。
【００２３】尚、この構築には、ＤＮＡを消化したり、
つなげたり、ＤＮＡ断片を単離する等の操作が行なわれ
たが、このためには Maniatis T. et al (Molecular Cl
oning, A. Laboratory Manual, 1982）の標準的ＤＮＡ
組み換え技術が用いられた。また、インサートの結合部
周辺のＤＮＡ配列は、シークエンシングにより確認され
た。
【００２４】実施例２ １細胞期胚の回収及びそれへの
ＤＮＡ導入 １細胞期胚は、既に雄と交配してあったＢ６Ｃ３Ｆ１雌
マウスの輸卵管より回収した。回収した胚は前核期の初
期ステージにあり、この時点では雄核と雌核とがまだ分
離されており、容易に識別されうる。回収された胚から
は周囲に存在する卵胞細胞 (cumulus cell)等を除去
し、適当に洗浄後、ＤＮＡ注入まで一時、３７℃、５％
ＣＯ2空気条件下で保存される。好ましくは、３０ｍｍ
径バクテリオロジカルディッシュ（bacteriological di
sh ）(No.333656, Nunc社) 上、Ｍ１６培養液（Whittin
gham D.G., J. Reprod. Fert., vol.4, p.7-21, 1971）
５０μｌ ｄｒｏｐ（パラフィン油で覆われる）で保存
される。トランスジーンを含む融合構築体は、上述の方
法で調製した。上述のいかなる融合構築体も、クローニ
ングされ得、ここで述べる方法に習い、１細胞期胚に導
入することができる。
【００２５】次に、主にＮＯＲβ発現ベクター（ｐβＡ
／ＮＯＲβ）から得られるＤＮＡの導入について詳細に
解説するが、ｐβＡ／ＮＯＲβ以外の他の融合構築体に
も通用できる方法である。まず最初に、ｐβＡ／ＮＯＲ
βは宿主大腸菌にクローニングされ、大量増幅の後、抽
出された。更に精製するため、塩化セシウムによる超遠
心、続く 臭化エチジュウム（ethidium bromide）の除
去後、透析処理に付された。こうして精製されたプラス
ミドは、適当な制限酵素による消化（この場合、Ｓａｌ
ＩとＢａｍＨＩが用いられた）、続く０.８％アガロー
スゲル電気泳動により、目的のトランスジーンを単離す
ることができる。こうして得られたトランスジーンは、
外径が約1mmの注入ピペットを使い、１細胞期胚前核へ
顕微注入される（Hogan B. etal., Manipulating the M
ouse Embryo, 1986)。トランスジーンを含む約１０μｌ
のＤＮＡ溶液（約２０００コピーのトランスジーンが含
まれる）を吸引し、雄性前核へこのDNAを注入する。注
入を受けた胚は、数時間か1日間培養に付され、次いで
偽妊娠Ｄａｙ１（プラグ確認日をＤａｙ１と判定する）
のＩＣＲ仮親マウス輸卵管内へ移植される。移植を受け
た仮親マウスは胎仔を出産するまで飼育される。出産
後、新生児は離乳までの１月間、仮親マウスより保育を
受け、次いで、尾DNAのサザンブロット解析に付され
る。トランスジェニック動物と判定されたＦ０マウス
（founder）は、他の非トランスジェニックマウスと交
配させ、そのＦ１子孫を得た後（それらは卵や精子の形
で凍結保存される）、生後１０〜３０週目にてすべて殺
処分し、ノーザンブロット解析、病理学的解析に付し
た。
【００２６】表１には、一つの例として、βＡ−ＮＯＲ
βトランスジーンを マウス１細胞期胚に注入して得ら
れた結果が示されている。この中にはＤＮＡ注入後、移
植されたマウス胚の数、注入された胚の移植後の生存胎
仔の数、実際トランスジェニック動物と判定されたＦ０
マウス胎仔の数、等が表示されている。
【００２７】
【表１】
【００２８】表１に示されるように、生まれた１２０匹
のマウスうち、３５匹は、トランスジェニック動物であ
った。これらのマウスを飼育した結果、１匹（０３０
４）は、生後約１０週目でその活発な動きが低下し、も
う１匹（１１０２）は水頭症を発していた。他のトラン
スジェニック動物は、生後１０〜３０週目までは、正常
様であった。これらは、すべて採材されるまでには、そ
の配偶子が取られ、凍結保存に付された。そして、ノー
ザンブロット、ウエスタンブロットによりスクリーニン
グを行ない、発現の強い５系統（０２０２、０３０４、
１００２、１１０２、１３０１）を選択した、。以下の
解析は、主にこの５系統に関するものである。
【００２９】実施例３ トランスジーン由来のｍＲＮＡ
発現 トランスジーン由来のｍＲＮＡ発現は、０３０４、１１
０２等を含むβＡ−ＮＯＲβトランスジェニックマウス
の系統においてノーザンブロット解析を行なった。トラ
ンスジェニック動物及び非トランスジェニックマウスの
脳を含む各種臓器より、全ＲＮＡを単離し、２０μｇの
全ＲＮＡを１.１％アガロース／１.１Ｍホルムアルデヒ
ドゲル電気泳動に付し、次いで、ナイロン膜フイルター
に移した。プレハイブリダイゼーションは、ハイブリダ
イゼーション液 ［５ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣ＝０.１５Ｍ
ＮａＣｌ、１５mＭ Na-citrate, ｐＨ７.４）、５０％
ホルムアミド、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍｇ／ｍｌの変性
サケＤＮＡ、 ５Ｘ Denhardt試薬等を含む］の中で、４
２℃にて２時間行った。次いで、ランダムにプライミン
グしたｃＤＮＡプローブ（ＮＯＲβ断片）を熱変性させ
た後、これをハイブリダイゼーション液に加え、ハイブ
リダイゼーションを行った。反応は４２℃にて１８時間
行った。洗浄は、０.１ＸＳＳＣ／０.１％ＳＤＳ中、５
６℃、２０分間行った。フィルターは−８０℃にて、２
４〜７２時間暴した（増感スクリーン＋コダックＸＡＲ
−５フイルム使用）。ノーザンブロット解析の一例を図
３に示す。図３には、選択されたトランスジェニック動
物系統のうち、比較的発現の強い０３０４、１１０２、
及び、非トランスジェニック動物のサンプルが示されて
いる。調べた臓器は、脳、肝、腎臓、小腸、精巣であ
る。脳では、０３０４では、内在性のＡ６９５ｍＲＮＡ
（〜３.４ｋｂ)の量に比べ、〜１０倍程高いトランスジ
ーン由来mRNAの発現（〜１ｋｂ）があるが、１１０２は
それと比べると、やや低い。非トランスジェニック動物
は、トランスジーン由来ｍＲＮＡの発現は全く見られな
い。同じ傾向は、他の臓器にも見られる。また、興味深
いことに、トランスジェニックマウスでは、Ａ６９５ｍ
ＲＮＡが増加している（例えば、１１０２及び０３０４
の肝サンプルを参照）とか、Ａ６９５ｍＲＮＡの他にＡ
７５１（〜３.８ｋｂ)、及びＡ７７０（〜３.８５ｋｂ)
ｍＲＮＡも出現しているのが判かる（例えば、１１０２
及び０３０４の脳サンプルを参照）。おそらく、外来性
のＮＯＲβの過剰発現の結果、内在性のＡＰＰｍＲＮＡ
のアルターナティブスプライシングのパターンが何らか
の理由で変化を起こした結果と思われる。
【００３０】実施例４ ウェスタンブロット解析 βＡ−ＮＯＲβトランスジェニック動物及び非トランス
ジェニック動物（コントロール）のマウス脳内のＡＰＰ
蛋白発現様式をウェスタンブロット解析により決定し
た。蛋白ホモジネイトを、Shivers B.D.ら（1988）の方
法に基づき、脳全てあるいは３／４から調製した。５０
μｇ量のサンプルを１０／１６％Tris-Tricine SDSゲル
にて電気泳動に付し、イモビルム−Ｐメンブレン（Immo
bilm-P membrane）へエレクトロブロッティング（elect
roblotting ）により転写させた。ブロットを抗ＡＰＰ
抗体Ｗ６１Ｃ [ＡＰＰのＣ末端側ペプチド（６６０番目
から６９５番目）に対するウサギ抗体；Shoji M. et a
l., 1990c］（1／500希釈）と反応させ、ＥＣＬ（Amers
ham社）システムによる非RI法による検出システムを用
い、ＡＰＰ蛋白の検出を試みた。
【００３１】ウェスタンブロット解析の一例を図４に示
す。図４には、１１系統のトランスジェニックマウスと
非トランスジェニック動物の結果が示されている。即
ち、これまで報告されている哺乳動物ＡＰＰ isoformの
平均的サイズに相当する約１２０−ｋｂ近傍のいくつか
のバンドがコントロール及びトランスジェニックマウス
の脳及び各種臓器の蛋白ホモジネイト中に検出される。
更に、今回発現させたトランスジーン由来の蛋白（１
１.４ｋＤ）がコントロールサンプルと比べ顕著に増加
している。特に、高い発現（５〜６倍）は、０２０２、
１００２、１３０１トランスジェニック動物サンプルに
見られる。しかしながら、この方法では、β／Ａ４蛋白
に相当する〜４.２ｋＤのバンドは検出されず、この蛋
白は調べたトランスジェニック動物脳では作られていな
いか、あっても少ないだろうと考えられる。
【００３２】実施例５ 抗体を用いたマウス脳の免疫組
織化学的解析 トランスジーンの発現を組織、細胞レベルで詳細に解析
するため、トランスジェニック動物及び非トランスジェ
ニック動物から得た脳を含む各種臓器に対し、抗ＡＰＰ
抗体を用いた免疫組織化学的染色を行なった。調べたマ
ウスは、βＡ−ＮＯＲβを有する3系統のトランスジェ
ニックマウス、及び非トランスジェニックマウスであ
る。マウスをペントバルビタールで麻酔後、脳を含む各
種臓器を摘出し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳが
溶媒）にて１日間固定後、パラフィンへ包埋し、５μｍ
厚の切片を作製した。切片は脱パラフィン後、脱水さ
せ、０.５％過ヨーソ酸にて３０分処理後、正常山羊血
清でブロッキングを行い、適当に希釈された抗体（１／
500）と反応させた。反応は、室温、３時間行ない、次
いでビオチン化された抗ウサギＩｇＧと反応させ（室
温、２時間）、更にアビジンービオチンパーオキシダー
ゼ複合体（avidin-biotin peroxidase complex : ABC)
と反応させた。これらの反応は、製造者（ＡＢＣキッ
ト; ベクター社, Burlingame, USA)の推薦する方法で行
なった。パーオキシダーゼは、3,3′-diamino benzidin
e (DAB)／NiCl2にて発色、可視化される。切片の核染色
は、メチルグリーンにて行なった。時に、切片を抗体で
反応させる前に、切片はニッスル（Nissul）染色に付さ
れた。
【００３３】βＡ−ＮＯＲβ−０３０４系統のトランス
ジェニック動物脳切片と非トランスジェニック動物脳切
片とをニッスル染色で観察すると、このトランスジェニ
ック動物系統においては、神経細胞死が見られた。特に
海馬付近のＣＡ３領域を中心とした海馬錐体細胞での神
経の変性、脱落が著しい。図５にその写真を示す。βＡ
−ＮＯＲβ−０３０４系統のトランスジェニック動物脳
切片と非トランスジェニック動物脳切片とを抗ＡＰＰ抗
体の一つＷ６１Ｃで染色すると非トランスジェニック動
物脳切片に比べ、トランスジェニック動物脳では、免疫
反応は、大脳皮質、海馬等の神経細胞に特に強く見られ
た。更に陽性反応は、多数の神経突起に見られた。しか
し、中脳、脳幹、小脳等には、ほとんど見られなかっ
た。同じような所見は、他の抗体 [Ｗ６３Ｎ；ＡＰＰ
のＮ末端側のペプチド（１８番目から３８番目）に反応
する抗体：Shoji M. et al., 1990c］を用いても見られ
た。図６にその写真を示す。
【００３４】βＡ−ＮＯＲβ−０３０４系統のトランス
ジェニック動物脳切片と非トランスジェニック動物脳切
片とをグリア細胞（astrocyte）を特異的に染色する抗
ＧＦＡＰ（glial fibrillary acidic protein）抗体と
反応させると、トランスジェニック動物脳では非トラン
スジェニック動物に比べ、大脳皮質、海馬、前脳基底部
に著明なグリア細胞の増加を認めた。図７にその写真を
示す。グリア細胞の増加は、アルツハイマー病に相関す
るとされ（Beach T．G. et al., Glia, vol.2,p.420-43
6, 1989)、おそらく図５から推測されうるに、神経細胞
の死滅後、グリア細胞がその後を埋める形で増殖したと
考えられる。βＡ−ＮＯＲβ−０３０４系統のトランス
ジェニック動物脳切片と非トランスジェニック動物脳切
片とを異常燐酸化タウ蛋白と特異的に反応する抗体β１
−２８（Ihara Y. et al., Nature, vol.304, p.727-73
0, 1983) で切片を反応させると、トランスジェニック
動物脳では、この抗体と反応する構造物が海馬付近に認
められた［図８(Ａ)］。このような陽性反応は非トラン
スジェニック動物脳では認められない［図８(Ｂ)］。
【００３５】トランスジェニックマウスの全身写真を図
９に示す。図９の(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トラ
ンスジェニックマウス（写真中央）及び非トランスジェ
ニックマウス（写真上方）の全身写真であり、(Ｂ)はβ
Ａ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェニックマウスの全
身写真である。
【００３６】
【発明の効果】本発明のトランスジェニックマウスは、
マウス脳内に形成される抗ベータ蛋白抗体反応性物質、
抗異常燐酸化タウ蛋白抗体反応性物質等のアルツハイマ
ー病特有のパラメーターを減少させる能力に関する薬剤
の効果検定に利用できる。例えば、検定されるべき薬剤
は対照動物、即ち本発明のトランスジェニック動物でな
い動物群及び本発明のトランスジェニック動物に同時に
投与される。この薬剤は、動物の脳内に上記パラメータ
ーに影響を及ぼすのに充分な期間、あるいは神経細胞死
を抑えるのに充分な期間を越えて連続的に投与され得る
だろう。この充分な期間を経て薬剤を投与された後、ト
ランスジェニック動物及び対照の非トランスジェニック
動物は、供試され、脳内の解析が行われる。そして、上
記パラメーターを比較することにより、薬剤の効能につ
いてひとつの決定を下すことができる。
【００３７】
【配列表】
配列番号：１ 配列の長さ：５１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト（homo sapiense） 配列の特徴： 他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のシグナルペプ
チド 配列 ATG CTG CCC GGT TTG GCA CTG CTC CTG CTG GCC GCC TGG ACG GCT CGG 48 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 GCG 51 Ala
【００３８】配列番号：２ 配列の長さ：２９７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト（homo sapiense） 配列の特徴： 他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチ
ド 配列 GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA AAA 48 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA GGT GCA ATC ATT 96 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG ATC GTC ATC ACC 144 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr 35 40 45 TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT CAT CAT GGT GTG 192 Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val 50 55 60 GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC CAC CTG TCC AAG 240 Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys 65 70 75 80 ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG TTC TTT GAG CAG 288 Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln 85 90 95 ATG CAG AAC 297 Met Gln Asn 99
【００３９】配列番号：３ 配列の長さ：２９７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト（homo sapiense） 配列の特徴： 他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチ
ド 配列 GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA AAA 48 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 TTG GTG TTC TTT GCA CAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA GGT GCA ATC ATT 96 Leu Val Phe Phe Ala Gln Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG ATC GTC ATC ACC 144 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr 35 40 45 TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT CAT CAT GGT GTG 192 Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val 50 55 60 GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC CAC CTG TCC AAG 240 Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys 65 70 75 80 ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG TTC TTT GAG CAG 288 Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln 85 90 95 ATG CAG AAC 297 Met Gln Asn 99
【００４０】配列番号：４ 配列の長さ：２９７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト（homo sapiense） 配列の特徴： 他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチ
ド 配列 GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT CAT CAT CAA AAA 48 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA GGT GCA ATC ATT 96 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG ATC ATC ATC ACC 144 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Ile Ile Thr 35 40 45 TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT CAT CAT GGT GTG 192 Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val 50 55 60 GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC CAC CTG TCC AAG 240 Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys 65 70 75 80 ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG TTC TTT GAG CAG 288 Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln 85 90 95 ATG CAG AAC 297 Met Gln Asn 99
【００４１】配列番号：５ 配列の長さ：３０９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト（homo sapiense） 配列の特徴： 他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチ
ド 配列 GAA GTG AAG ATG GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT 48 Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 15 CAT CAT CAA AAA TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA 96 His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 30 GGT GCA ATC ATT GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG 144 Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val 35 40 45 ATC GTC ATC ACC TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT 192 Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile 50 55 60 CAT CAT GGT GTG GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC 240 His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg 65 70 75 80 CAC CTG TCC AAG ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG 288 His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys 85 90 95 TTC TTT GAG CAG ATG CAG AAC 309 Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn 100 103
【００４２】配列番号：６ 配列の長さ：３０９ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ヒト（homo sapiense） 配列の特徴： 他の情報：ヒトベータアミロイド前駆体のＣ末端ペプチ
ド 配列 GAA GTG AAT CTG GAT GCA GAA TTC CGA CAT GAC TCA GGA TAT GAA GTT 48 Glu Val Asn Leu Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val 1 5 10 15 CAT CAT CAA AAA TTG GTG TTC TTT GCA GAA GAT GTG GGT TCA AAC AAA 96 His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys 20 25 30 GGT GCA ATC ATT GGA CTC ATG GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG 144 Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val 35 40 45 ATC GTC ATC ACC TTG GTG ATG CTG AAG AAG AAA CAG TAC ACA TCC ATT 192 Ile Val Ile Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile 50 55 60 CAT CAT GGT GTG GTG GAG GTT GAC GCC GCT GTC ACC CCA GAG GAG CGC 240 His His Gly Val Val Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg 65 70 75 80 CAC CTG TCC AAG ATG CAG CAG AAC GGC TAC GAA AAT CCA ACC TAC AAG 288 His Leu Ser Lys Met Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys 85 90 95 TTC TTT GAG CAG ATG CAG AAC 309 Phe Phe Glu Gln Met Gln Asn 100 103
【００４３】配列番号：７ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―6と名付け
た。 配列 TTCTGCATCC GCCCGAGCCG TCCAGG 26
【００４４】配列番号：８ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―7と名付け
た。 配列 GCTCGGGCGG ATGCAGAATT CCGACATGA 29
【００４５】配列番号：９ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―10と名付け
た。 配列 CTCTAGAGAT GCTGCCCGGT TTGGC 25
【００４６】配列番号：１０ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―12と名付
けた。 配列 GGCTCTAGAG CATGTTCTGC ATCTGCTCAA 30
【００４７】配列番号：１１ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―8と名付け
た。 配列 GTCTTGTGCA AAGAACACCA A 21
【００４８】配列番号：１２ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―2と名付け
た。 配列 TTGGTGTTCT TTGCACAAGA T 21
【００４９】配列番号：１３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―15と名付
けた。 配列 GGATCCAACT TCAGAGGCTG CTGT 24
【００５０】配列番号：１４ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：リバースプライマーDNA。BAPP―3と名付け
た。 配列 GGTGATGATG ATCACTGTCG C 21
【００５１】配列番号：１５ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―9と名付け
た。 配列 GCGACAGTGA TCATCATCAC C 21
【００５２】配列番号：１６ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―13と名付け
た。 配列 GGCTCTAGAG ATGGAAGTGA AGATGGATGC AGAATTCC 38
【００５３】配列番号：１７ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 起源：なし 生物名：なし 株名：なし 配列の特徴：センスプライマーDNA。BAPP―14と名付け
た。 配列 GGCTCTAGAG ATGGAAGTGA ATCTGGATGC AGAATTCC 38
【図面の簡単な説明】
【図１】サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリ
ベータアクチンプロモーターを有するプラスミドｐＢｓ
ＣＡＧ−２のプラスミドマップを表した図である。
【図２】サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリ
ベータアクチンプロモーターとＮＯＲβ、Ｄβ、ＦＡＤ
β、ΔＮＯＲβ及びＮＬβとを結合した各種トランスジ
ーンを表わした図である。
【図３】βＡ−ＮＯＲβトランスジェニックマウス（１
１０２，０３０４）及び非トランスジェニックマウスか
ら採取した各種組織の全ＲＮＡのノーザンブロット解析
結果を示した図である。分子量のサイズはＫで示され、
分子量マーカーは図の右側に記されている。
【図４】βＡ−ＮＯＲβトランスジェニックマウス及び
非トランスジェニックマウスから採取した脳抽出物のウ
ェスタンブロット解析を示した図である。用いた抗体は
抗ＡＰＰ抗体Ｗ６１Ｃである。
【図５】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェ
ニック動物脳、そして(Ｂ)は非トランスジェニックマウ
ス脳の海馬領域におけるニッスル染色を表わした写真で
ある。
【図６】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェ
ニック動物脳、そして(Ｂ)は非トランスジェニックマウ
ス脳における抗ＡＰＰ抗体Ｗ６１Ｃによる免疫反応産物
の顕微鏡写真である。
【図７】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェ
ニック動物脳、そして(Ｂ)は非トランスジェニックマウ
ス脳における抗ＧＦＡＰ抗体による免疫反応産物の顕微
鏡写真である。
【図８】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェ
ニック動物脳、(Ｂ)は非トランスジェニックマウス脳に
おける抗タウ抗体β１−２８による免疫反応産物の顕微
鏡写真である。
【図９】(Ａ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジェ
ニックマウス及び非トランスジェニックマウスの全身写
真であり、(Ｂ)はβＡ−ＮＯＲβ−０３０４トランスジ
ェニックマウスの全身写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 東海林 幹夫 群馬県群馬郡群馬町北原599番地 (72)発明者 瓦林 毅 群馬県前橋市青梨町1345番地19号

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 １) ベータアクチンプロモーターのＤＮ
    Ａ配列、 ２) サイトメガロウイルスエンハンサーのＤＮＡ配列、 ３) ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のシグナルペプチ
    ドをコードするＤＮＡ配列、および ４) ヒトベータアミロイド前駆体蛋白の９９ないし１０
    ３個のアミノ酸残基長のＣ末端ペプチドをコードするＤ
    ＮＡ配列を含むことを特徴とする組み換え遺伝子が、体
    細胞および生殖細胞に組み込まれた、ヒト以外の哺乳動
    物であるアルツハイマー病モデルトランスジェニック動
    物。
  2. 【請求項２】 ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のシグ
    ナルペプチドが、配列表の配列番号１のペプチドである
    請求項１のアルツハイマー病モデルトランスジェニック
    動物。
  3. 【請求項３】 １) ベータアクチンプロモーターのＤＮ
    Ａ配列、 ２) サイトメガロウイルスエンハンサーのＤＮＡ配列、
    および ３) ヒトベータアミロイド前駆体蛋白の９９ないし１０
    ３個のアミノ酸残基長のＣ末端ペプチドをコードするＤ
    ＮＡ配列を含むことを特徴とする組み換え遺伝子が、体
    細胞および生殖細胞に組み込まれた、ヒト以外の哺乳動
    物であるアルツハイマー病モデルトランスジェニック動
    物。
  4. 【請求項４】 ヒトベータアミロイド前駆体蛋白のＣ末
    端ペプチドが、 １) 配列番号２のアミノ酸配列を有する、正常ヒトベー
    タアミロイド前駆体蛋白のペプチド、 ２) 配列番号３のアミノ酸配列を有する、２２番目のグ
    ルタミン酸がグルタミンに変換した変異体ペプチド、 ３) 配列番号４のアミノ酸配列を有する、４６番目のバ
    リンがイソロイシンに変換した変異体ペプチド、 ４) 配列番号５のアミノ酸配列を有する正常ヒトベータ
    アミロイド前駆体蛋白のペプチド、または ５) 配列番号６のアミノ酸配列を有する、３番目のリジ
    ンがアスパラギンに、４番目のメチオニンがロイシンに
    変換した変異体ペプチドから選ばれる請求項１〜３のア
    ルツハイマー病モデルトランスジェニック動物。
  5. 【請求項５】 海馬領域において以下の組織病理学的特
    徴、 １) ベータアミロイド前駆体蛋白質Ｃ末端ペプチドの大
    量合成、 ２) ＣＡ領域の海馬錐体細胞での神経細胞死、 ３) グリア細胞の増加、および ４）異常リン酸化タウ蛋白質の沈着を有する、請求項１
    〜４のアルツハイマー病モデルトランスジェニック動
    物。
  6. 【請求項６】 マウスである請求項１〜５のアルツハイ
    マー病モデルトランスジェニック動物。
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